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WO2003061692A2 - Antígeno de superficie del virus de la hepatitis b como inmunopotenciador mucosal, formulaciones resultantes. - Google Patents

Antígeno de superficie del virus de la hepatitis b como inmunopotenciador mucosal, formulaciones resultantes. Download PDF

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WO2003061692A2
WO2003061692A2 PCT/CU2003/000001 CU0300001W WO03061692A2 WO 2003061692 A2 WO2003061692 A2 WO 2003061692A2 CU 0300001 W CU0300001 W CU 0300001W WO 03061692 A2 WO03061692 A2 WO 03061692A2
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hbsag
antigens
nasal
nasal administration
antigen
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Julio César AGUILAR RUBIDO
Regis ALEMÁN ZALDÍVAR
Yadira Lobaina Mato
Rolando PAJÓN FEYT
Verena Lucila MUZIO GONZÁLEZ
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Julio César ALVAREZ OBREGÓN
Daymir GARCÍA GONZÁLEZ
Enrique IGLESIAS PÉREZ
Gretel Sardiñas García
Eugenio Hardy Rando
Eduardo PENTÓN ARIAS
Dioslaida Urquiza Noa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
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Original Assignee
Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
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    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the field of vaccine development, specifically, to the development of immunopotentiators and the vaccine formulations resulting from their use.
  • the technical objective of the proposed invention is to promote an increase in the immune response against antigens administered in nasal formulations and to develop new formulations for vaccine use by this route.
  • This invention is also related to obtaining multivalent vaccine formulations for nasal administration, which have as their central antigen the Hepatitis B virus surface antigen, capable of enhancing the immunogenicity of the antigens contained therein after nasal co-administration of the antigens of interest described in the formulations object of the invention.
  • the formulations of the present invention are multivalent formulations that contain the Hepatitis B Virus surface antigen and other antigens, including soluble antigens such as toxoids, their conjugates, as well as inactivated or attenuated vaccine microorganisms.
  • Other antigens routinely used in commercial immunization have been used in these formulations with identical results and with immunogenicity levels similarly similar to those obtained after parenteral administration in conventional formulations, both from the humoral and cellular point of view, and with the additional advantage of inducing a strong mucosal response from mucosal immunization, which is a unique feature of this type of formulations.
  • Another important aspect is the economy of components of these formulations, which allow avoiding the use of nasal adjuvants, turning the formulation's own antigens into elements capable of favoring the increased response to the other co-administered antigens.
  • the mucosal surface of the gastrointestinal, respiratory, and genitourinary tracts occupies a surface area of at least 400 m 2 (McKenzie SJ, Halsey J A. 1984; J. Immunol., 53: 1818). Furthermore, a highly specialized immune system protects the mucosal surfaces. In a healthy adult, this local immune system contains at least 80% of all lymphocytes, which can be found there, or transiting between various lymphoid tissues associated with mucosa (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology. 1996. Vaccine; 14: 644).
  • the mucosal immune system divides into local inducer sites, called mucosal-associated organized lymphoid tissues (O-MALT), and into effector sites (Kraehenbuhl JP and Neutra M N. 1992. Physiol. Rev.; 72: 853).
  • O-MALT mucosal-associated organized lymphoid tissues
  • Most of the O-MALT studies have been conducted on lymphoid tissues associated with the gastrointestinal tract (GALT), including Peyer's patches (PP), the appendix, and isolated lymph nodes that abound in the rectum.
  • GALT gastrointestinal tract
  • PP Peyer's patches
  • NALT nasal lymphoid tissue
  • the epithelium ranges from pseudostratified to simple. In the bronchi, the area of the simple epithelium, the intercellular spaces are sealed by tight junctions and the main mechanism for taking antigens is through M cells. At the level of the tonsils, the predominant epithelium is stratified, where the absorption mechanism of the antigen is closely associated with a network of macrophages and mobile dendritic cells from the bone marrow, up to 700 cells per mm 2 . These cells are capable of migrating to O-ALTs and lymph nodes presenting the processed antigen that was phagocytized on the surface of the tonsils.
  • Mucosal inoculation of vaccine antigens offers multiple advantages over vaccines administered parenterally; among them: increasing safety and minimizing adverse effects (Editorial. Typhoid vaccination: Weighing the options. 1992. Lancet: 340-341; Redhead K and Griffiths E. 1990. Curr. Opin. Infect. Dis. 3 : 380), the reduction of qualified personnel and the logistics of vaccination, and the increase in the effectiveness of vaccination in the elderly and newborns.
  • the human systemic immune system has been shown to depress with age, while studies in mice have shown non-depression of mucosal immune functions with advancing age (Bergman KC and Waldman R H. Rev. 1988. Infect. Dis.
  • Mucosal immunization in addition, can facilitate the eradication of some diseases caused by pathogens that remain colonizing, asymptomatically the mucosal surfaces (Kraehenbuhl J P and Neutra M N. 1992. Physiol Rev.72: 853). This is because this type of immunization can not only generate systemic, but also mucosal responses, which is not achieved through inoculations by the parenteral route.
  • the required amount of antigen for mucosal immunizations may be greater than that required for parenteral immunizations, probably due to various factors such as: the relative inefficiency of the entry of the intact antigen to the mucosal lymphoid tissue, the acidic and proteolytic barriers, intestinal peristalsis, among others. From this derives the necessary development of adjuvants or adjuvant strategies for mucosal use (Faden H, et al. 1990. J. Infect. Dis. 162: 1291; Shahin RD, et al. 1990. Infect. Immun. 58: 4063 ; O ⁇ agan D T. 1990. Curr Opin Infect Dis. 3: 393).
  • Adjuvants are substances or procedures that accelerate, prolong, or enhance the specific immune response against antigens inoculated by mucosal or parenteral routes (Vogel FR. Adjuvants in perspective. In: Brown F, Haaheim LR, editors. Modulation of the immune response to vaccine antigens. Dev. Biol. Stand. Basel. Karger; 1998; 92: 241-248).
  • Mucosal adjuvants are those that enhance the immune response against antigens administered mucosally.
  • mucosal adjuvants include V. cholerae enterotoxin (CT), and E. coli heat-labile toxin (LT).
  • CT V. cholerae enterotoxin
  • LT E. coli heat-labile toxin
  • the adjuvant activity of CT is related to the ribosylation of ADP (adenosine diphosphate) and the induction of cAMP (cyclic adenosine monophosphate) that has various cellular effects (Lycke N, et al. 1991. Scand. J. Immunol. 33 : 691).
  • CT subunit B has the ability to increase epithelial permeability to heterologous antigens administered by the nasal route, not so for those administered orally (Lycke N, et al. 1991. Scand. J. Immunol. 33: 691 ; Gizurarson S, et al. 1991. Vaccine 9: 825; Gizurarson S, et al. 1992. Vaccine. 10: 101). Furthermore, CT has been shown to induce long-lasting immunological memory in the intestinal lamina intestinal of mice (Vajdy M and Lycke NH. 1992. Immunology. 75: 488). To date, it has been impossible to selectively separate the adjuvant and toxic effects of CT (Lycke N. et al. 1992.
  • Some adjuvants used parenterally have also been evaluated mucosally; including: immunostimulatory complexes (ISCOMs), liposomes, lysophosphatidyl glycerol, Avridine (a lipoidal amine), and cytokines (Ruby J, et al. 1992. Vaccine. Res. 1: 347; O ⁇ agan DT, et al. . 1992. J Gen Virol; 73: 2141). Immunostimulatory complexes have been shown to be efficient adjuvants via the nasal route.
  • ISCOMs immunostimulatory complexes
  • liposomes lysophosphatidyl glycerol
  • Avridine a lipoidal amine
  • cytokines cytokines
  • Liposomes are nothing more than aqueous suspensions of spheroidal vesicles, in which the phospholipids they contain are organized in lipid bilayers. Antigens can be transported within the vesicles as well as on their surface, according to their hydrophilic or hydrophobic character, respectively (Childers NK, Michalek S M. Liposomes, in: DT Hagan (Ed.), Novel Delivery Systems for Oral Vaccines, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1994). Its adjuvanticity depends on the number of layers (Susuki M, et al. 1994. Clin Immunother. 2: 121-125), loading (Hadden JW. 1993.
  • Microcapsules are nothing more than spheres consisting of a shell and a core.
  • the shell may be made of one or more polymers, whether biodegradable or not, while the core is made of antigen. If the polymer is not biodegradable, the microcapsule acts as a reservoir through whose pores the antigen escapes slowly. If the polymer is biodegradable, the antigen is released as the microsphere degrades.
  • microspheres encapsulated with the copolymer of lactic acid and glycolic acid.
  • the microspheres have been used intranasally (Eyles JE, et al. 1999. Int J Pharm. 189 (1): 75-9), orally and parenterally (Gupta RK, et al. 1997. Vaccine; 15 (16): 1716- 1723).
  • VLPs Virus-like particles
  • HPV VLP human papilloma virus
  • CpG ODN Intranasal immunization of BALB / c mice with HBsAg and as adjuvant oligodeoxynucleotides with CpG motifs (CpG ODN) has been shown. produces an immune response of antibodies against the viral antigen, of equal magnitude to that produced by CT or LT with HBsAg, and greater than the combination of CTB or LTK63 (mutated variant of LT) with HBsAg. Furthermore, the simultaneous use of the CpG ODN, CT (or LT) and HBsAg by the nasal route produces a synergistic effect on the immune response against the latter antigen, not manifesting itself when CTB or LTK63 are used instead of toxins (McCIuskie MJ, ef al.
  • acemannan an acetylated mannose polymer, extracted from the Aloe barbadensis Miller plant
  • HBsAg a serum IgG antibody response similar to that obtained with administration of the adjuvant antigen alumina, as well as an IgA response in vaginal secretions, comparable to that obtained with intranasal application of HBsAg adjuvant with cholera toxin (Aguilar JC et al. 1998. WO 9839032).
  • HBcAg hepatitis B virus nucleocapsid antigen
  • Diphtheria toxoid has an important space in the current vaccine literature, mainly by parenteral routes. There are some works that have used it by the nasal route. Primary parenteral immunization with diphtheria toxoid in alumina, followed by secondary intranasal immunization with CRM - I97 - constitutes a highly effective immunization method in mice, capable of inducing high levels of anti-DT IgG and neutralizing antibodies in serum and secretory IgA in the respiratory tract (McNeela EA, et al. 2000. Vaccine. Dec 8; 19 (9-10): 1188-98). When administered intranasally to mice, the recombinantly obtained E.
  • rLTB heat-labile enterotoxin B subunit
  • CTB recombinantly
  • sufficiently high titers of diphtheria antitoxin greater than 0.1 IU / mL, were obtained in mice showing high levels of DT-specific serum IgG antibody responses.
  • the tetanus toxoid also stands out for having an important space in the current vaccine literature, mainly in parenteral immunization strategies, like DT.
  • IL-6, IL-12 interleukins 6 and 12
  • TT tetanus toxoid
  • IL-12 administered intranasally in conjunction with TT not only induced sharp increases in serum IgG, but also elevated IgA antibody responses in mucosa.
  • Co-administration of IL-6, IL-12, and TT did not increase serum or mucosal antibody responses, relative to those produced by the combination of IL-12 with TT (Boyaka PN, et al. 1999. J Immunol. Jan 1 ; 162 (1): 122-8).
  • Intranasal administration of IL-12 to mice previously nasally immunized with TT antigens and CT adjuvant resulted in an increase in levels of TT-specific IgG2a and IgG3 antibodies, while IgG1 and IgE antibody responses were markedly reduced .
  • intranasally applied IL-12 increased CT-induced serum IgG1 and IgE antibody responses in mice given the mixture of TT and CT orally (Marinaro M. et al. 1999. J Immunol. Jan 1; 162 (1): 114-21).
  • TT formulations the systemic and mucosal responses of mice immunized with TT adsorbed on alumina and mixed with rCTB were examined.
  • 5 Lf were necessary to stimulate, only in the presence of rCTB (10 ⁇ g), high responses of TT-specific serum IgG antibodies in all the mice examined, and moderate or light IgA antibody responses.
  • TT has also been used as a model in the testing of new adjuvants such as the non-toxic variant of CT: CTS61 F. Comparative studies of the immune responses generated by intranasal administration of this protein with several separate antigens have been performed. (among them the TT), and those obtained following a similar protocol with native CT and with rCTB.
  • TT-specific serum IgG, IgA, and IgM responses, as well as IgA antibody response in mucosal secretions were significantly increased in both the native CT formulation and the mutated CT formulation; rCTB did not show good adjuvant activity (Yamamoto S. ef al. 1997. Proc Nati Acad Sci US A. May 13; 94 (10): 5267-72).
  • Nasal administration to guinea pigs of the tetanus toxoid adsorbed on poly-L-lactic acid microspheres increased the immune response with respect to that obtained with the free antigen; the latter was similar to that of non-immunized animals (Almeida AJ, et al. 1993. J Pharm Pharmacol.
  • Another of the antigens that are universally used in human vaccines is formaldehyde-inactivated Bordetella pertussis (Bp).
  • Bp Bordetella pertussis
  • This bacterin administered by the nasal route to BALB / c mice, induces high levels of IgG antibodies in serum and bronchioalveolar fluids, as well as IgA in serum, saliva, bronchioalveolar fluids, and stool extracts.
  • IgG responses against Bp do not increase, while IgA responses are significantly reduced in all secretions analyzed (Berstad AK, ef al. 1997. Vaccine. Aug-Sep; 15 (12-13): 1473-8).
  • mice In order to test the immunogenicity and nasal adjuvanticity of Bp, an investigation was carried out in mice in which this antigen was administered intranasally, together with the inactivated influenza virus.
  • the virus administered alone it induced low levels of serum influenza-specific IgG antibodies, although these were significantly higher than those of the non-immunized controls, while there were no differences between the serum and saliva IgA responses.
  • serum IgA and IgG responses and virus-specific salivary IgA were substantially increased (P ⁇ 0.005).
  • this adjuvant effect was not significant for responses of the same type in the intestine (measured as antibodies in faeces).
  • Bp has also been tested in humans. Six adults were given pertussis cell vaccines four times, via the nasal route, with a weekly interval. All of the vaccinates responded with increases in IgA antibodies in nasal fluids against the Bp whole cell antigen. Three of those vaccinated with high nasal antibody responses also developed increased serum IgA and IgG antibody titers against Bp. Antibody responses in saliva against whole cell antigen, as well as serum antibodies and secretions against pertussis toxin (PT) and hemagglutinin filamentous (FHA) were negligible, with the exception of a moderate increase in antibodies against FHA in the nasal fluid.
  • PT pertussis toxin
  • FHA hemagglutinin filamentous
  • CPME administered in the form of nasal drops or nasal spray 4 times, with a weekly interval between each application, has been shown to lead to the development of IgA responses in nasal and salivary secretions in humans.
  • modest increases in serum IgG have been observed in several of the immunized individuals (Haneberg B, ef al. 1998. Infec ⁇ Immun Apr; 66 (4): 1334-41).
  • the additional use of CT by mucosal routes increases the responses of serum antibodies compared to the CPME vaccine administered by the same routes.
  • the most effective immunizations have been nasal, from which it is derived that the mucosal responses are not dependent on the use of CT.
  • the antibody response to the HBsAg, DT, TT and Bp animens is not affected when a vaccine containing Haemophilus influenzae type B (PRP) capsular polysaccharide (PRP-TT), HBsAg is parenterally administered to infants. , DT, TT and Bp anigenic or when two vaccines were administered by the same route, one with HBsAg, DT, TT and Bp anigenic, and heard with PRP-TT only.
  • the antibody response against the first four antigens mentioned is not affected when a formulation obtained from the mixture of the HBsAg, DT, TT vaccine and Bp antigens is applied to reconstruct the lyophilized PRP-TT.
  • the antibody response against the PRP is significantly lower in the latter case (Greenberg DP, ef al. 2000. Pedia ⁇ r Infec ⁇ Dis J. Dec; 19 (12): 1135-40).
  • Vaccination with a formulation containing only HBsAg and PRP (the latter conjugated to the CPME of N. meningitidis) from healthy adults who have been previously exposed to these aniodors, increased the levels of antibodies. serum con ⁇ ira the an ⁇ genes (Bulkow LR, ef al. 1993. Arc ⁇ ic Med Res Jul; 52 (3): 118-26).
  • the formulations of the present invention are multi-formulations that contain the surface anigenic of Hepali ⁇ is B virus and other anigens, including soluble antigens such as toxoids, their conjugates, as well as inactivated or attenuated vaccine microorganisms.
  • Other antigens routinely used in commercial immunization have been used in this type of formulations where the potentiating effect of HBsAg was evidenced and with levels of immunogenicity equally similar to those obtained after parenteral administration in conventional formulations, since the humoral and cellular point of view, and with the additional advantage of inducing from mucosal immunization a strong response at the mucosa level, a unique characteristic of this type of formulations.
  • Another aspect of importance is the economy of the components of these formulations, which allow the use of nasal adjuvants to be avoided, turning the anigens of the formulation into elements capable of promoting increased response to co-administered amphotogenic drugs.
  • HBsAg used in the present invention is novel since there are no mulfivaleni formulations for nasal administration of the surface anigenic in which an enhancing effect is evidenced from the coadminiration of the surface antigen and the anigenic types described in the present invention.
  • the present invention is related to the use of the Hepai ⁇ isis Virus B surface anigen as immunopotentiator in nasal immunizations, with the vaccine formulations resulting from the combination of this antigen and other vaccine antigens that benefit from this property and with the application of this use of the Hepatitis B Virus surface antigen and formulations in the field of vaccines.
  • mulfivalen ⁇ es formulations specifically for nasal administration, that result from the application of this property of HBsAg, which favors the increase of the immune response to the an ⁇ genous viruses present in them.
  • the vaccine formulations for nasal administration of the present invention may contain one or more protein anigens of soluble nature, which receives an immunopotentiating effect by its co-administration with HBsAg.
  • They can be: the ileal loxoid, the diphtheria or protein-polysaccharide conjugates, the saccharide portion of which corresponds to an anti-Haemophilus influenzae type b vaccine candidate, Neisser ⁇ a meningitidis polysaccharide C, pneumococcus pneumoniae vaccine polysaccharides, or in general one or more proteins. Recombinantly purified or soluble vaccines of interest.
  • sulfivalenid formulations for nasal administration in which a vaccine candidate from the group of the inactivated microorganisms is added to the surface antigen of Hepailil B virus and that it receives an immuno-potentiating effect by its co-administration with the HBsAg.
  • the vaccine antigen can be, the Bordetella pertussis bacterin, which receives an immunopotentiating effect by its co-administration with HBsAg or another vaccine antigen of this nature alone or as part of complex antigen combinations.
  • Other vaccine antigens that may be contained are current inactivated or attenuated vaccine candidates.
  • the formulations of the present invention can be solubilized in PBS, saline, water for injections or in any buffer solution for use in medical practice and that allow the stability of the anigens, in concentrations of anigens that are in the order of the possible combinations. of mass and volume described above.
  • the anigenic components can be mixed with the HBsAg according to candidates of interest by age of the vaccination or by multivariate candidates based on any other premise, where one, two or more anigenic types of those previously described are represented and that can be targeted. lyophilized and administered by gofas, spray or pulverization.
  • the vaccine formulations of the present invention can be used to achieve effective immunization of human or animals in a preventative or therapeutic manner.
  • FIG. 1 Cinematic of the IgG response of an immunization scheme with inoculations on days 0, 14, 28 and 87. Blood draws were performed on days -10, 21, 35, 42, 84 and 97.
  • A Kinetics the serum IgG anti HBsAg response
  • B Kinetics of the anti-TT response in serum
  • C Cinefica of the anii response DT in serum
  • D Cinefica of the anlii response Bp in serum.
  • Tables 1A, B, C and D results of the statistical analyzes of the comparisons between groups of the respective figures.
  • the animal HBsAg titers generated by the group immunized with the Heberbiovac HB® vaccine (group 12) were significantly higher than those obtained with the immunization of any of the nasal groups. This result is due to the higher immunogenicity of HBsAg when it is inoculated by the IP route compared to the intramuscular and subcutaneous routes. This characteristic of the IP route has been evidenced in our experiments.
  • the inoculation of 250 ⁇ L of the vaccine per mouse corresponding to the 5 ⁇ g dose of HBsAg -equivalent with the nasal dose-, required the use of the IP roller.
  • a response that equates the response obtained by nasal inoculation with that obtained by IP inoculation has been found in older animals. An example of this was evident in the second scheme (see example 2), although the nasal candidates were different.
  • HBsAg has a strong potentiating effect on both soluble proteins and vice versa, also showing in the case of DT a synergistic acitivity in terms of cross-potentiation of the immune response to antigens in mixtures, since as previously explained, the surface anigenic IgG anii response was enhanced when DT was added.
  • the importance of adding Bp to the mixture could also be demonstrated once again, which allowed the anti-DT response to be increased hundreds of times, placing it at levels similar to those obtained after IP administration. It should be remembered at this point that the response is similar to that obtained by the IP route, despite the fact that in this way a quantity of DT five times higher was used.
  • Example 2 Determination of the response in mucosa of the multivalent nasal formulations of HBsAg.
  • blood titers were also no different in terms of IgG anti HBsAg as a result of the group's strong booster dose response with HBsAg in PBS.
  • 20% more seroconversion was found for the first group. Although no differences were found, it is important that so much quantity of antigens does not affect the response in the vagina anfi HBsAg.
  • the response generated by the group that received the four antigens via the nasal route was also higher than that generated in the teravalenia vaccine group intraperitoneally, similar behavior as with TT.
  • the mucosally immunized groups developed significantly higher vaginal IgA levels compared to the group containing the four antigens by IP route.
  • the levels of IgA anti DT for group 1 did not differ from those obtained by the groups that had higher immunogenicity, evidencing what was previously verified for TT, that HBsAg induced a highly significant potentiation of the anti DT response in the vagina. with respect to group 9, in which the toxoid was administered in PBS (Fig. 2C).
  • Example 3 Comparison of the antibody response against FHA proteins and pertussis toxin after nasal and systemic administration of the formulations of groups 7 and 13 of Example 1.
  • Lymphoproiferative response in the spleen after nasal administration In order to study the proliferative response generated in the spleen by the anigens of Example 1, groups 7 to 13 were selected on day 100, performing the spleen extraction of at least four mice per group, with which a pool of lymphocytes grown in the presence of the antigens with which they had been immunized.
  • Figure 5 highlights the results of the evaluation of the proliferative capacity of the antigens administered by the nasal route in a tetravalent formulation, individually.
  • the intraperioneal groups were used as a syrup for the rufa.
  • Example 5 HBsAg also It acts as an immunopotentiator of the immuno-genicity of the Neisseria meningiiidis outer membrane vesicle protein complex (CPME).
  • CPME Neisseria meningiiidis outer membrane vesicle protein complex
  • Antigens can be selected that would be formulated by application according to age groups, according to their inoculation in the elderly, adolescents or newborns. Also for the interest of the type of mucosal diseases, here you can find antigens that penetrate through mucosa in which mucosal immunity is important. Among these, they can be selected according to the use of mixtures of anigens to prevent sexual, respiratory, or intestinal diseases. Serving risk groups, or the needs of travelers. Attending to organ (ex: HBV, HCV and HAV). Addressing type of disease (eg chronic sexually transmitted diseases, sexually transmitted viral diseases, ele).

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Abstract

Antígeno de superficie por vía mucosal con el objetivo de favorecer un incremento en la respuesta inmune contra los antígenos coadministrados en las formulaciones que se describen.Estas nuevas formulaciones se obtienen a partir del doble uso del antígeno de superficie como agente inmunopotenciador y al mismo tiempo como antígeno vacunal. De este modo, es posible obtener formulaciones múltiples del antígeno de superficie de la Hepatitis B y antígenos heterólogos, con niveles de inmunogenicidad similares a los obtenidos luego de administración parenteral y con una economía de componentes capaz de dispensar el uso de adyuvantes nasales, convirtiendo a los mismos antígenos en elementos capaces de favorecer el incremento de la respuesta a los otros antígenos coadministrados.Este nuevo uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B y las formulaciones antigénicas resultantes son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales preventivas o terapéuticas.

Description

ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B COMO INMUNOPOTENCIADOR MUCOSAL, FORMULACIONES RESULTANTES.
Sector Técnico La presente invención se relaciona con el campo del desarrollo de vacunas, específicamente, con el desarrollo de inmunopotenciadores y las formulaciones vacunales resultantes de su uso.
El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es favorecer un incremento en la respuesta inmune contra los antígenos administrados en formulaciones nasales y desarrollar nuevas formulaciones para uso vacunal por esta ruta.
Esta invención se relaciona además con la obtención de formulaciones vacunales multivalentes para administración nasal, que tienen como antígeno central al antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B, capaz de potenciar la inmunogenicidad de los antígenos contenidos en la misma luego de la coadministración nasal de los antígenos de interés descritos en las formulaciones objeto de la invención.
Las formulaciones de la presente invención son formulaciones múltivalentes que contienen al antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B y otros antígenos, entre ellos, antígenos solubles como los toxoides, sus conjugados, así como microorganismos vacunales inactivados o atenuados. Otros antígenos utilizados rutinariamente en la inmunización comercial se han usado en estas formulaciones con idénticos resultados y con niveles de inmunogenicidad igualmente similares a los obtenidos luego de su administración parenteral en las formulaciones convencionales, tanto desde el punto de vista humoral como celular, y con la ventaja adicional de inducir a partir de la inmunización mucosal una fuerte respuesta a nivel de mucosas, lo que es una característica única de este tipo de formulaciones. Otro aspecto de importancia es la economía de componentes de estas formulaciones, que permiten evadir el uso de adyuvantes nasales, convirtiendo a los propios antígenos de la formulación en elementos capaces de favorecer el incremento de la respuesta a los otros antígenos coadministrados. Técnica Anterior
La generación de respuestas inmunes potentes contra antígenos inoculados por vía mucosal es uno de los retos actuales de la investigación en el campo de las vacunas. Se ha demostrado que para patógenos que permanecen en las superficies mucosales o tienen en ellas una puerta de entrada, una respuesta local fuerte correlaciona con la protección (American Academy of Pediatrics. Cholera. Report of the Committee on Infectious Diseases. American Academy of Pediatrics, Elk Grove Village, 1991 ; IL, 170).
La superficie mucosal de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genitourinario, ocupa un área superficial de al menos 400 m2 (McKenzie S J, Halsey J A. 1984; J. Immunol., 53:1818). Por otra parte, un sistema inmune grandemente especializado protege las superficies mucosales. En un adulto sano este sistema inmune local contiene al menos el 80% del total de los linfocitos, los cuales pueden encontrarse en ese sitio, o transitando entre varios tejidos linfoides asociados a las mucosas (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology. 1996. Vaccine;14: 644). El sistema inmune mucosal se divide en sitios inductores locales, denominados tejidos linfoides organizados asociados a mucosas (O-MALT), y en sitios efectores (Kraehenbuhl J P and Neutra M N. 1992. Physiol. Rev.;72:853). La mayoría de los estudios de los O-MALT se han realizado en tejidos linfoides asociados al tracto gastrointestinal (GALT), entre los cuales se encuentran las placas de Peyer (PP), el apéndice, y nodulos linfáticos aislados que abundan en el recto. Las PP constituyen un buen modelo del funcionamiento de estos tejidos, aunque debe tenerse en cuenta que existen diferencias entre el GALT y el tejido linfoide nasal (NALT) (Walker R I. 1994. Vaccine.;4:387).
En las vías respiratorias, el epitelio varía desde pseudoestratificado a simple. En los bronquios, zona de epitelio simple, los espacios intercelulares están sellados por uniones estrechas y el mecanismo principal de toma de antígenos es a través de las células M. A nivel de las amígdalas el epitelio predominante es el estratificado, donde el mecanismo de absorción del antígeno está muy asociado a una red de macrófagos y células dendríticas móviles provenientes de la médula ósea, de hasta 700 células por mm2. Estas células son capaces de migrar a los O- ALT y a los linfonodos presentando al antígeno procesado que fue fagocitado en la superficie de las amígdalas. Bajo condiciones normales, éste constituye el principal mecanismo de presentación de antígenos por MHC-II del tracto respiratorio (Neutra R M., Pringault E and Kraehenbuhl J P. 1996. Annu. Rev. Immunol. 14: 275). Luego del procesamiento y presentación del antígeno en los sitios inductores, los linfocitos B y T estimulados abandonan los sitios inductores a través de los conductos eferentes, y entran a la circulación sanguínea vía conducto torácico, alcanzando los sitios efectores (tejidos glandulares, la lámina propia de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genitourinario) donde son retenidos selectivamente. En estos sitios efectores, las células B continúan proliferando y se diferencian en células plasmáticas de tipo IgA secretoras, con la producción subsiguiente de anticuerpos IgA en las secreciones externas. Este sistema de distribución celular descrito anteriormente se denomina sistema inmune mucosal común (Walker R I. 1994. Vaccine.;4:387).
La inoculación mucosal de antígenos vacunales ofrece múltiples ventajas con respecto a las vacunas administradas por vía parenteral; entre ellas: el aumento de la seguridad y la minimización de los efectos adversos (Editorial. Typhoid vaccination: Weighing the options. 1992. Lancet: 340-341 ; Redhead K and Griffiths E. 1990. Curr. Opin. Infect. Dis. 3:380), la reducción del personal calificado y la logística de la vacunación, y el incremento de la efectividad de la vacunación en ancianos y recién nacidos. Se ha comprobado que el sistema inmune sistémico humano se deprime con la edad, mientras que estudios en ratones han mostrado la no depresión de las funciones inmunes mucosales con el avance de la edad (Bergman K-C and Waldman R H. Rev. 1988. Infect. Dis. 10: 939; Szewczuk M R, Campbell R J and Jung L K. 1981. J. Immunol. 126: 2200). En recién nacidos, la persistencia de los anticuerpos maternos interfiere con las vacunas administradas parenteralmente, lo cual ha sido un problema en la reducción de la edad de vacunación (Szewczuk M R, Campbell R J and Jung L K. 1981. J. Immunol. 126: 2200; Weiss R. 1992. Science. 258: 546).
La inmunización mucosal, además, puede facilitar la erradicación de algunas enfermedades causadas por patógenos que permanecen colonizando, asintomáticamente las superficies mucosales (Kraehenbuhl J P and Neutra M N. 1992. Physiol Rev.72:853). Esto se debe a que este tipo de inmunización no solo puede generar respuestas sistémicas, sino también mucosales, lo cual no se logra mediante las inoculaciones por la vía parenteral.
No obstante a las ventajas previamente enumeradas, la cantidad requerida de antígeno para inmunizaciones mucosales puede ser mayor a la que se necesita para inmunizaciones parenterales, probablemente, debido a varios factores tales como: la relativa ineficiencia de la entrada del antígeno intacto al tejido linfoide mucosal, las barreras acídica y proteolítica, el peristaltismo intestinal, entre otros. De aquí se deriva el necesario desarrollo de adyuvantes o estrategias de adyuvación para uso mucosal (Faden H, et al. 1990. J. Infect. Dis. 162: 1291 ; Shahin RD, et al. 1990. Infect. Immun. 58: 4063; OΗagan D T. 1990. Curr Opin Infect Dis. 3: 393).
Los antígenos puros, recombinantes o sintéticos en nuevas generaciones de vacunas han resultado ser más seguros que aquellos en el organismo a partir del cual se obtuvieron, sin embargo son menos inmunogénicos (Alving C R, 1992. AIDS Research and Human Retroviruses.8:1427). Por tanto, la búsqueda de nuevos adyuvantes representa una necesidad en el campo de las vacunas. Los adyuvantes son sustancias o procedimientos que aceleran, prolongan, o potencian la respuesta inmune específica contra los antígenos inoculados por vía mucosal o parenteral (Vogel FR. Adjuvants in perspective. In: Brown F, Haaheim LR, editors. Modulation of the inmune response to vaccine antigens. Dev. Biol. Stand.. Basel. Karger; 1998;92:241-248). Con su utilización se genera o potencia el tipo de respuesta deseada y disminuye el número de inoculaciones y la cantidad de antígeno necesaria para obtener y mantener la protección. Los adyuvantes mucosales son aquellos que mejoran la respuesta inmune contra antígenos administrados por vía mucosal. Entre los adyuvantes mucosales más estudiados se encuentran la enterotoxina de V.cholerae (CT), y la toxina termolábil de E.coli (LT). La actividad adyuvante de la CT está relacionada con la ribosilación de ADP (difosfato de adenosina) y la inducción de AMPc (monofosfato cíclico de adenosina) que posee variados efectos celulares (Lycke N, et al. 1991. Scand. J. Immunol. 33: 691). La subunidad B de la CT (CTB) tiene la capacidad de incrementar la permeabilidad epitelial a antígenos heterólogos administrados por vía nasal, no ocurriendo así para aquellos administrados oralmente (Lycke N, et al. 1991. Scand. J. Immunol. 33: 691 ; Gizurarson S, et al. 1991. Vaccine. 9: 825; Gizurarson S, et al. 1992. Vaccine. 10:101). Se ha visto, además, que la CT induce una memoria inmunológica de larga duración en la lámina propia intestinal de ratones (Vajdy M and Lycke NH. 1992. Immunology. 75: 488). Hasta la fecha ha sido imposible separar selectivamente los efectos adyuvante y tóxico de la CT (Lycke N. et al. 1992. Eur. J. Immunol.; 22: 2277). Algunos adyuvantes usados por vía parenteral también han sido evaluados por vía mucosal; entre ellos: los complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), los liposomas, el lisofosfatidil glicerol, la Avridina (una amina lipoidal), y las citoquinas (Ruby J, et al. 1992. Vaccine. Res.1 :347; OΗagan DT, et al. 1992. J Gen Virol;73: 2141). Los complejos inmunoestimulantes han demostrado ser eficientes adyuvantes por la vía nasal. Estos son partículas relativamente estables, de 30 a 40 nm, cuya formulación más ampliamente utilizada es la que contiene Quil A (una mezcla de saponinas extraídas de la Quillaja saponaria), colesterol y fosfolípidos en una relación molar de 1 :1 :1 (Tomasi M, et al. 1996. Mucosal vaccines. 13:175-186). Se ha reportado que los ISCOMs modulan la expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II y podrían actuar estimulando la liberación de interferón gamma (IFN-γ) (Byars N E and AHison A C. Immunologic Adjuvants: General Properties, Advantages, and Limitations, ¡n Laboratory Method in Immunology, Zola, H., Ed., 39, 1990). También se ha establecido que son capaces de estimular a las células T CD8+ restringidas al MHC clase I (Bomford RHR. The differential adjuvant activity of Al(OH)3 and saponin, in Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific resistance, Madje, J., Ed., Alan R. Liss, New York, 65, 1987). No obstante a las bondades de los ISCOMs, aspectos relacionados a costo, estabilidad y naturaleza del antígeno a insertar en la membrana continúan siendo problemas de esta estrategia de inmunopotenciación.
Los liposomas, sistemas de entrega de antígenos, no son más que suspensiones acuosas de vesículas esferoidales, en las cuales los fosfolípidos que contienen están organizados en bicapas lipídicas. Los antígenos pueden ser transportados lo mismo en el interior de las vesículas, que en su superficie, de acuerdo con su carácter hidrofílico o hidrófobico, respectivamente (Childers N K, Michalek S M. Liposomes, in: D.T. Hagan (Ed.), Novel Delivery Systems for Oral Vaccines, CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1994). Su adyuvanticidad depende del número de capas (Susuki M, et al. 1994. Clin Inmunother. 2:121-125), carga (Hadden JW. 1993. Immunology Today. 14: 274), composición (McAnalley BH, et al. inventors. Carrigton Laboratories Inc, assignee. Use of acemannan. US patent 229164. 1988 Aug 5; Giles CH, et al. J. Soc. Dyers Colour 1958; 74: 647) y método de preparación (Giles CH, et al. J. Soc. Dyers Colour 1958; 74: 647, Walkers GJ, 1978. Biochem. Carbohydr. 16:75-126). Su uso potencia tanto la inmunidad humoral como la mediada por células para antígenos de naturaleza proteica y polisacarídica (Hadden JW. 1993. Immunology Today. 14: 274; Walkers GJ, 1978. Biochem. Carbohydr. 16:75-126, Han YW. 1990. Adv. Appl. Microbial. 35:171-174; Cote G L and Ahegren J A. Metabolism in microorganisms Pert I. Levan and levansucrase. Science and technology of fructans.1993. pp. 141-168. Edited by M. Susuki &N.J Charton. Boca Ratón, FL:CRC Press). Por otra parte, la administración oral de un antígeno en liposomas produce una respuesta mucosal mayor a la obtenida administrando al antígeno solo por dicha vía (Janeway CA. 1992. Immunol Today. 5: 3; Paolo C, et al. 1999. Vaccine. 17: 12-1263). Una gran desventaja que presentan los liposomas es que son destruidos por las lipasas intestinales y las sales biliares (Okada J, et al. 1995. Pharm. Res.12:576-582). También se plantean la estabilidad de los lípidos y el costo de producción como problemas a resolver. Por su efectividad vacunal, se ha destacado también el uso de antígenos microencapsulados. Las microcápsulas no son más que esferas formadas por una cubierta y un núcleo. La cubierta puede estar constituida por uno o más polímeros, ya sean biodegradables o no, mientras que el núcleo está constituido por el antígeno. Si el polímero no es biodegradable, la microcápsula actúa como un reservorio por cuyos poros escapa el antígeno lentamente. Si el polímero es biodegradable, el antígeno es liberado a medida que se degrada la microesfera. Este último caso es el más frecuente, y un ejemplo de ello lo constituyen las muy utilizadas microesferas encapsuladas con el copolímero de ácido láctico y ácido glicólico. Las microesferas han sido utilizadas intranasal (Eyles JE, et al. 1999. Int J Pharm. 189(1):75-9), oral y parenteralmente (Gupta R K, et al. 1997. Vaccine; 15(16):1716-1723).
Las partículas semejantes a virus (VLP) también han sido usadas como sistemas de entrega de antígenos en las estrategias de inmunización mucosal. Las VLP están formadas por cápsidas y envolturas virales u otras proteínas que al ensamblarse en estructuras supramoleculares se asemejan a los virus. Estas tienen como ventajas que son relativamente fáciles de producir y purificar, y que como antígenos particulados, son mejores que los solubles para inducir respuestas inmunes mucosales (André FE. 1990. Vaccine; 8 (S74)). La administración intranasal de partículas del virus del papiloma humano (HPV VLP) ha mostrado buenos resultados en la generación de respuestas humoral y celular (Dupuy C, ef al. 1999. Journal of virology; 73:11 :9063-9071 ; Liu XS, et al. 1999. Virology. 252:39-45, Balmelli C, et al. 1998. J of Virol. 72:8220-8229). Aunque existen varios sitios inductores de respuesta inmune mucosal, el más conveniente ha sido el NALT. La vacunación por vía nasal con vacunas vivas de influenza ha tenido buenos resultados en niños y adultos. Esta ruta puede ser aplicable a otras vacunas sensibles a las condiciones gastrointestinales a que se enfrentan en casos de administración oral (Walker R I. 1994. Vaccine. 4:387). En 1997 se realizó el primer estudio en humanos que demostró que la vacunación por la ruta nasal con la subunidad B de la toxina colérica recombinante (rCTB) induce anticuerpos IgA e IgG específicos en las secreciones vaginales (Bergquist, Ch. 1997. Infection and Immunity. 65, 2676). La inmunización de animales por esta vía, además, ha generado una respuesta de IgA en secreciones vaginales, incluso mayor que la inmunización por la vía intravaginal (Di Tommaso A. 1996. Infecí. lmmun.64: 974; Galuchan W S and Rosenthal K L. 1995. Vaccine. 5:1589; Hopkins S, 1995. Infecí. Immun. 63:3279).
Todos los antígenos uíilizados en esfa invención tienen en común, entre otros aspectos, el que hayan sido ampliamente investigados con fines vacunales, incluso utilizados por ruta nasal muchos de ellos. Sin embargo, aunque parezcan numerosos los estudios realizados con ellos, estos han sido utilizados por la vía parenteral fundamentalmente y nunca antes han sido utilizados por vía nasal con el HBsAg.
La administración conjunta del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) (1 o 5 μig) con la subunidad B de la toxina del cólera usada como adyuvante y obtenida de forma recombinante (10 μg) a ratones por la vía nasal, genera no solo respuestas inmunes sistémicas contra el HBsAg, sino también mucosales, en las cavidades nasales, los pulmones, la saliva, el intestino delgado y la vagina. Con esta combinación se obtuvieron altos niveles de lgG1 , lgG2a e lgG2b séricas específicas contra el antígeno viral. Los títulos séricos en casi todos los ratones, medidos con EIA sandwich usando un kit comercial, fueron mayores de 1000 miliunidades internacionales (mlU/ml) (Isaka M. et al. 2001. Vaccine. 19(11- 12):1460-1466).
Se ha demostrado que la inmunización intranasal de ratones BALB/c con el HBsAg y como adyuvante los oligodesoxinucleótidos con motivos CpG (CpG ODN) produce una respuesta inmune de anticuerpos contra el antígeno viral, de igual magnitud a la producida por la CT o la LT con HBsAg, y mayor que la combinación de la CTB o LTK63 (variante mutada de la LT) con HBsAg. Además, el empleo simultáneo por la vía nasal de los CpG ODN, la CT (o LT) y el HBsAg produce un efecto sinérgico sobre la respuesta inmune contra este último antígeno, no manifestándose el mismo cuando se utilizan la CTB o la LTK63 en lugar de las toxinas (McCIuskie MJ, ef al. 2000. Mol Med Oct; 6(10):867-877). Los isotipos que predominan con la administración de CpG ODN y HBsAg son lgG1/lgG2a, mientras que con la administración adicional de la CT se obtiene lgG2a fundamentalmente (McCIuskie MJ, ef al. 1998. J Immunol. Nov 1 ; 161(9): 4463- 4466).
Se ha encontrado que la administración de acemanano (un polímero acetilado de mañosa, extraído de la planta Aloe barbadensis Miller) conjuntamente con el HBsAg por la vía nasal, genera una respuesta de anticuerpos IgG séricos similar a la obtenida con la administración del antígeno adyuvado con alúmina, así como una respuesta de IgA en secreciones vaginales, comparable con la obtenida con la aplicación intranasal del HBsAg adyuvado con la toxina del cólera (Aguilar JC et a. 1998. WO 9839032). Se ha comprobado también el fuerte efecto adyuvante ejercido por el antígeno de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (HBcAg) sobre el HBsAg cuando ambos son inoculados por la vía nasal. Este efecto ha resultado ser de similar magnitud al logrado por la CT en igualdad de condiciones, e incluso, superior al mostrado por la alúmina (administrada por la vía intramuscular) en la inducción de respuestas de anticuerpos IgG en el suero con esta formulación de partículas semejantes a virus (Aguilar JC, et al. PCT/CU/99/00006).
El toxoide diftérico (DT) posee un importante espacio en la literatura actual de vacunas, fundamentalmente por rutas parenterales. Existen algunos trabajos que lo han utilizado por ruta nasal. La inmunización primaria parenteral con toxoide diftérico en alúmina, seguida de una inmunización secundaria intranasal con CRM-I97- constituye un método de inmunización muy efectivo en ratones, capaz de inducir altos niveles de IgG anti DT y anticuerpos neutralizantes en el suero e IgA secretoria en el tracto respiratorio (McNeela EA, et al. 2000. Vaccine. Dec 8; 19(9- 10):1188-98). Al administrarse intranasalmente a ratones, la subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli obtenida de forma recombinante (rLTB) conjuntamente con DT, produjo una estimulación sustancial de anticuerpos IgG séricos específicos para el DT y una inducción moderada de respuestas de anticuerpos IgA mucosales específicos para el DT en las cavidades nasales y en los pulmones (Kozuka S, et al. 2000. Vaccine. Mar 6;18(17):1730-7).
La inmunización íntranasal con 5 Lf de toxoide diftérico, conjuntamente con la subunidad B de la toxina del cólera, obtenida de forma recombinante (CTB) indujo elevadas respuestas de anticuerpos IgG séricos específicos para el DT, elevadas o moderadas respuestas de IgA específica en todos los ratones y solo ligeras respuestas de anticuerpos IgE en algunos ratones. Además, se obtuvieron títulos suficientemente altos de antitoxina diftérica, más de 0.1 UI/mL en ratones que mostraron altos niveles de respuestas de anticuerpos IgG sérica específica para el DT. Bajo las mismas condiciones experimentales, la inducción de significativas respuestas de anticuerpos mucosales IgA específicos para el DT ocurrió en las cavidades nasales, los pulmones, la saliva, las secreciones vaginales y en los intestinos grueso y delgado de todos los ratones (Isaka M, et al. 1999. Vaccine. Nov 12;18(7-8):743-51). Se ha reportado que el empleo de una nueva suspensión que contiene vesículas de monooleína/ácido oleico mezcladas con DT, administrada parenteral o intranasalmente, incrementa la inmunogenicidad del toxoide en ratones al mismo nivel que cuando este se adsorbe en alúmina, o se administra con el adyuvante completo de Freund. Este estudio evidencia una relación entre la inmunogenicidad y la longitud de la cadena acílica (Schroder U, ef al. 1999 Vaccine. Apr 9;17(15- 16):2096-103).
También el toxoide tetánico se destaca por poseer un importante espacio en la literatura actual de vacunas, en estrategias de inmunización parenteral fundamentalmente, al igual que el DT. Con el objetivo de evaluar la inducción de respuestas de anticuerpos IgA mucosal utilizando a las interleuquinas 6 y 12 (IL-6, IL-12) conjuntamente con el toxoide tetánico (TT) administradas intranasalmente, se llevó a cabo un estudio que arrojó como resultado que la administración simultánea de IL-6 con TT a ratones indujo respuestas de anticuerpos IgG séricos específicos para el TT (fundamentalmente lgG1 e lgG2b) superiores a la de los controles, pero pequeñas respuestas de anticuerpos IgA secretoria y ninguna de IgE. En contraste, la IL-12 administrada intranasalmente conjuntamente con TT, no solo indujo agudos incrementos de IgG sérica, sino que también elevó las respuestas de anticuerpos IgA en mucosas. La coadministración de IL-6, IL-12 y TT no aumentó las respuestas de anticuerpos séricos o mucosales, con respecto a las producidas por la combinación de IL-12 con TT (Boyaka PN, et al. 1999. J Immunol. Jan 1;162(1 ):122-8). La administración intranasal de IL-12 a ratones previamente inmunizados nasalmente con los antígenos de TT y el adyuvante CT resultó en un incremento en los niveles de anticuerpos lgG2a e lgG3 específicos para el TT, mientras que las respuestas de anticuerpos lgG1 e IgE se redujeron marcadamente. En contraste, la IL-12 aplicada intranasalmente incrementó las respuestas de anticuerpos lgG1 e IgE séricos inducidas por la CT en ratones a los cuales se les dio la mezcla de TT y CT oralmente (Marinaro M. et al. 1999. J Immunol. Jan 1 ;162(1):114-21). En experimentos de inmunización nasal con formulaciones del TT, se examinaron las respuestas sistémica y mucosal de ratones inmunizados con el TT adsorbido en alúmina, y mezclado con rCTB. En el caso de la administración intranasal del TT no adsorbido fueron necesarios 5 Lf para estimular, solamente en presencia de rCTB (10μg), elevadas repuestas de anticuerpos IgG séricos específicos para TT en todos los ratones examinados, y moderadas o ligeras respuestas de anticuerpos IgA específicos para TT en los lavados nasales, pulmonares e intestinales de unos pocos ratones, lo que evidencia que su inmunogenicidad por vía nasal es pobre. No obstante una vez lograda, es posible a partir de ésta resistir retos con la toxina tetánica (Isaka M, et al. 1998 Vaccine. Oct; 16(17): 1620-6). El TT también ha sido usado como modelo en el testaje de nuevos adyuvantes como lo es la variante no toxica de la CT: CTS61 F. Se han realizado estudios comparativos de las respuestas inmunes generadas por la administración intranasal de esta proteína con varios antígenos por separado (entre ellos el TT), y de las obtenidas siguiendo un protocolo similar con la CT nativa y con una rCTB. Las respuestas de IgG, IgA e IgM séricas específicas para el TT, así como la respuesta de anticuerpos IgA en secreciones mucosales aumentaron significativamente tanto en la formulación con la CT nativa, como en la que contenía a la CT mutada; la rCTB no mostró una buena actividad adyuvante (Yamamoto S. ef al. 1997. Proc Nati Acad Sci U S A. May 13;94(10):5267-72). La administración nasal a cobayos del toxoide tetánico adsorbido en microesferas de poli-ácido-L-láctico aumentó la respuesta inmune con respecto a la obtenida con el antígeno libre; esta última fue similar a la de los animales no inmunizados (Almeida AJ, et al. 1993. J Pharm Pharmacol. Mar;45(3): 198-203). La determinación de las respuestas inmunológicas, particularmente las reacciones inmunopatológicas asociadas a la administración intranasal con el adyuvante mucosal CT, fue el propósito de un estudio en el cual se combinaron el TT y la CT y se administraron a ratones BALB/c. Después de la inmunización nasal, los ratones produjeron una respuesta de anticuerpos en suero principalmente del isotipo IgG, con predominio de la subclase lgG1 , tanto contra el TT como contra la CT. Con las respuestas de anticuerpos, también se encontraron reacciones inflamatorias en pulmones que pudieron ser potencialmente fatales. Además, se indujeron respuestas de IgE, las cuales fueron asociadas con la detección de interleuquina 5 (IL-5) en el suero, por lo que se sugirió que la inmunización nasal de TT y CT probablemente resulta en la activación de células Th2, las cuales pueden contribuir a serias reacciones inmunopatológicas en los pulmones (Simecka JW, ef al. 2000. Infect Immun. Feb;68(2):672-9). Este punto resalta la importancia que tiene el diseño racional de estrategias de inmunización que conlleven una economía de recursos, entre otros la necesidad de buscar estrategias mediante las cuales se sustituyan los adyuvantes tóxicos que se utilizan como modelos para estudiar la inmunogenicidad y eficacia de las diferentes rutas, pero cuyas combinaciones no son aplicables a humanos. Otro de los antígenos que se utilizan universalmente en vacunas humanas es la Bordetella pertussis inactivada (Bp) con formaldehído. Esta bacterina, administrada por la ruta nasal a ratones BALB/c, induce altos niveles de anticuerpos IgG en suero y fluidos bronquioalveolares, así como también de IgA en suero, saliva, fluidos bronquioalveolares y extractos de heces. Sin embargo, cuando se administra conjuntamente con la CT, no aumentan las respuestas de IgG contra Bp, mientras que las respuestas de IgA se reducen significativamente en todas las secreciones analizadas (Berstad AK, ef al. 1997. Vaccine. Aug-Sep;15(12- 13):1473-8).
Con el fin de probar la inmunogenicidad y la adyuvanticidad nasal de Bp, se desarrolló una investigación en ratones en la cual se administró intranasalmente este antígeno, conjuntamente con el virus inactivado de la influenza. El virus administrado solo, indujo bajos niveles de anticuerpos IgG específicos para la influenza en suero, aunque estos fueron significativamente mayores que los de los controles no inmunizados, mientras que no existieron diferencias entre las respuestas de IgA en suero y saliva. En cambio, cuando se administró Bp junto con el virus inactivado de la influenza, aumentaron sustancialmente (P<0.005) las respuestas séricas de IgA e IgG, y la IgA salival específica para el virus. Sin embargo, este efecto adyuvante no fue significativo para las respuestas del mismo tipo en el intestino (medida como anticuerpos en las heces). Por otro lado, las respuestas de anticuerpos contra Bp fue inhibida por la mezcla con la vacuna viral. Los anticuerpos generados contra Bp que fueron secretados en la saliva mostraron reactividad cruzada con Neissería meningitidis (Berstad AK et al. 2000. Vaccine. Mar 17;18(18): 1910-9).
También Bp ha sido probada en humanos. A seis adultos les administraron vacunas celulares de pertussis en cuatro ocasiones, por la vía nasal, con un intervalo semanal. Todos los vacunados respondieron con incrementos de anticuerpos IgA en fluidos nasales contra el antígeno de célula entera de Bp. Tres de los vacunados con altas respuestas de anticuerpos nasales también desarrollaron títulos incrementados de anticuerpos IgA e IgG séricos contra Bp. Las respuestas de anticuerpos en saliva contra el antígeno de célula entera, así como los anticuerpos en el suero y secreciones contra la toxina de pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) fueron despreciables, con excepción de un incremento moderado de anticuerpos contra la FHA en el fluido nasal. Inesperadamente, en los mismos vacunados se desarrollaron significativos aumentos de anticuerpos nasales y salivales contra antígenos de la membrana externa meningocóccica, mientras que los anticuerpos IgA e IgG séricos correspondientes permanecieron inalterados (Berstad AK, et al. 2000, J Med Microbiol. Feb;49(2): 157-63). Por lo que una formulación nasal contra este patógeno debe tener en cuenta el aspecto de la respuesta contra las proteínas individuales en el estudio de inmunogenicidad. Aunque la presencia de anticuerpos bactericidas en el suero ha sido correlacionada con la inmunidad a enfermedades meningocóccicas, la inmunidad mucosal en la puerta de entrada también desempeña un importante papel. Por esta razón, se encaminó un estudio para evaluar la inmunogenicidad de un complejo de proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis del grupo B (CPME) en una formulación vacunal aplicada intranasalmente en ratones. En dicha investigación se evidenció una fuerte respuesta sistémica de anticuerpos bactericidas, así como una fuerte respuesta local de IgA en los pulmones. Sin embargo, se requirieron dosis de 8 a 10 veces mayores en la inmunización intranasal que en la intraperitoneal para lograr una respuesta equivalente de anticuerpos bactericidas en el suero (Saunders NB, et al. 1999. Infecí Immun Jan;67(1): 113-9).
Se ha comprobado la capacidad de la vacuna noruega de proteínas de membrana externa de meningococos del grupo B para inducir una respuesta de células T en humanos, tras la administración intranasal de la misma sin adyuvante. Para esto,( un grupo de 12 individuos fue inmunizado con cuaíro dosis de CPME (250 μg de proíeínas/dosis) con un hiérvalo semanal y oíra dosis de refuerzo al cabo de 5 meses. La proliferación de células T en respuesía a la vacuna de CPME, proíeína purificada PorA (clase 1), proteína PorB (clase3), y un antígeno conlrol no relacionado (Mycobacterium bovis) fue medida por la incorporación de [3H] íimidina a células mononucleares sanguíneas periféricas obtenidas antes y después de las inmunizaciones. Las inmunizaciones nasales con CPME indujeron respuestas de células T específicas al antígeno en la mayoría de los vacunados, cuando se probó contra CPME (7 a 12) y contra el antígeno PorA (11 a 12); ninguno de los vacunados mostró respuesta de células T inducida por la vacuna al antígeno de PorB después de las 4 dosis iniciales (Oftung F, et al. 1999. Infect Immun. Feb;67(2): 921-7).
Se ha demostrado en humanos que el CPME administrado en forma de gotas nasales o de spray nasal 4 veces, con un intervalo semanal entre cada aplicación, conduce al desarrollo de respuestas de IgA en secreciones nasales y salivales. Además, se han observado modestos incrementos de IgG séricas en varios de los individuos inmunizados (Haneberg B, ef al. 1998. Infecí Immun Apr;66(4): 1334- 41). En ratones, por su parte, la utilización adicional de CT por vías mucosales (nasal y rectal) incrementa las respuestas de anticuerpos séricos en comparación con la vacuna de CPME administrada por las mismas vías. Sin embargo, las inmunizaciones más efectivas han sido las nasales, de lo que se deriva que las respuestas mucosales no son dependientes del uso de la CT. Además, la actividad bactericida sérica, de manera similar, no aumenía con el uso de la CT, indicando que el efecfo posiíivo sobre el nivel de IgG sérica no incluye a la acíividad bacíericida (Dalseg R, et al. 1999. Vaccine, May 14; 17(19): 2336-45). Se ha visto que la utilización de el CPME acomplejado con el lipopolisacárido (LPS) de Brucella melitensis genera en ratones, tras su administración intranasal, alíos niveles de IgG e IgA aníi LPS en mucosas pulmonares, así como alfós niveles de células secretoras de IgG e IgA en los pulmones y el bazo, luego de la inoculación de dos dosis. Por otro lado, en suero se desarrollan elevados niveles de IgG y moderados de IgA. Se ha sugerido, dada la prominente respuesta de la subclase lgG1 obtenida, que el CPME puede favorecer la respuesía de íipo Th2 frente al LPS (Van De Verg LL, et al. 1996. Infecí Immun Dec;64(12):5263-8).
La posibilidad de coníar con vacunas que contengan varios aníígenos procedentes de diferentes agentes patógenos ha sido fundamental en el desarrollo del Programa Extensivo de Inmunización impulsado por la Organización Mundial de la Salud, y dentro de estas, se ha tratado de integrar a la vacuna de hepaíiíis B (Chiu HH, et al. 1998. Pediaír Infecí Dis J Mar;17(3):206-11).
Se ha demosírado que la adminisiración a niños sanos a los 1,5; 3,5 y 6 meses de vida de una vacuna que contenga HBsAg, DT, TT y Bp (entre 5 y 10 μg de HBsAg), si estos fueron inmunizados al nacer con una vacuna de HBsAg (10 μg), produce fífulos de aníicuerpos séricos aníi HBsAg protectores (mayores que 10 mUI/ml) (Chiu HH, et al. 1998. Pediaír Infecí Dis J Mar;17(3):206-11).
La respuesfa de aníicuerpos coníra los aníígenos HBsAg, DT, TT y aníígenos de Bp no se afecía cuando se administra parenteralmeníe a infantes una vacuna que coníiene al polisacárido capsular de Haemophilus influenzae íipo B (PRP) conjugado al TT (PRP-TT), HBsAg, DT, TT y aníígenos de Bp o cuando se adminisíran por la misma vía dos vacunas, una con HBsAg, DT, TT y aníígenos de Bp, y oíra con PRP-TT solamente. Tampoco se afecía la respuesía de aníicuerpos coníra los primeros cuaíro antígenos mencionados cuando se aplica una formulación obtenida de la mezcla de la vacuna de HBsAg, DT, TT y antígenos de Bp para reconsíiíuir al PRP-TT liofilizado. Por su parte, la respuesía de aníicuerpos coníra el PRP es significaíivamente menor en el último caso (Greenberg DP, ef al. 2000. Pediaír Infecí Dis J. Dec;19(12):1135-40).
La vacunación con una formulación que contenga solamente HBsAg y PRP (este úlfimo conjugado a el CPME de N. meningitidis) de adultos sanos que hayan sido expuestos anteriormente a estos aníígenos, incremenía los niveles de aníicuerpos séricos coníra los aníígenos (Bulkow LR, ef al. 1993. Arcíic Med Res Jul;52(3): 118-26).
La adición de PRP a una vacuna que coníiene HBsAg, DT, TT, aníígenos de Bp y al virus de la poliomielitis inactivado, no produce una disminución de la inmunogenicidad de los segundos, ni un aumento de la reaciogenicidad en humanos. Por oíra parte, los íífulos de anficuerpos aníi PRP que se alcanzan con la nueva formulación son similares a los logrados con vacunas monovalentes de PRP, o combinaciones de PRP con DT, TT y anfígenos de Bp, licenciadas en algunos países europeos (Schmiií HJ, et al. 2000. J Pediaír Sep;137(3):304-12). Hasfa el momento no existe ninguna referencia de esludio de combinaciones aníigénicas para adminisíración nasal del HBsAg y aníígenos de DT, TT, CPME, Bp, Hib u oíros anfígenos solubles o resulíaníes de un proceso de inacíivación viral o bacteriano en la que se evidencie el efecto poíenciador del HBsAg. Deníro de las veníajas de la adminisíración de vacunas combinadas por la vía nasal enconíramos la posibilidad de reducir el número de adminislraciones, teniendo en cuenla que se adminisfrarían más aníígenos de una vez y no cada uno por separado; la posibilidad de no emplear adyuvantes, basado esto en la propiedad de algunos antígenos de incrementar la inmunogenicidad de oíros sin afecíar considerablemente de forma negaíiva la suya, la posibilidad de prescindir de personal especializado y maíeriales médicos, lo cual dificulfa la aplicación de las vacunas y encarece la vacunación; el hecho de no ufilizar un método invasivo, lo cual aumenía la calidad de vida de los individuos a inmunizar, fundamenlalmenfe niños; y la posibilidad de lograr igual o mejor prolección que la proporcionada por las vacunas parenferales, incluso en edades crííicas como la niñez y la vejez, al generarse respuesías a nivel de mucosas, principal puerta de enírada para muchos agentes patógenos.
Las formulaciones de la presente invención son formulaciones múltivalenfes que coníienen al aníígeno de superficie del Virus de la Hepaliíis B y oíros aníígenos, eníre ellos, antígenos solubles como los toxoides, sus conjugados, así como microorganismos vacunales inactivados o atenuados. Otros antígenos utilizados rutinariamente en la inmunización comercial se han usado en este tipo de formulaciones donde se evidenció el efecto potenciador del HBsAg y con niveles de inmunogenicidad igualmente similares a los obtenidos luego de su adminisíración pareníeral en las formulaciones convencionales, íanío desde el punto de visía humoral como celular, y con la venlaja adicional de inducir a partir de la inmunización mucosal una fuerte respuesía a nivel de mucosas, caracíerísíica única de este tipo de formulaciones. Oíro aspecto de importancia es la economía de componentes de esías formulaciones, que permiten evadir el uso de adyuvantes nasales, convirtiendo a los propios aníígenos de la formulación en elementos capaces de favorecer el incremento de la respuesía a los oíros anfígenos coadministrados.
El uso del HBsAg descrito en la presente invención resulta novedoso a partir de que no existen formulaciones mulfivaleníes para adminislración nasal del aníígeno de superficie en las que se evidencie un efecto potenciador a partir de la coadminisíración del antígeno de superficie y los tipos aníigénicos descritos en la presente invención.
Para solucionar el problema de la potenciación de la respuesfa a estos lipos aníigénicos, se invesíiga la iníroducción de adyuvantes de nuevo tipo, que por lo general son sustancias costosas, tóxicas, inmunogénicas y no siempre efectivas. En nuestro caso, se puede incremeníar y diversificar la respuesla inmune a partir de una esíraíegia de inmunopofenciación relaíivameníe sencilla y de bajo riesgo íoxicológico respecto al esíado del arte en el que abundan adyuvantes reacíogénicos (Byars N E and Allison A C. Immunologic Adjuvanls: General Properties, Advaníages, and Limitaíions, in Laboralory Melhod in Immunology, Zola, H., Ed., 39, 1990).
No existen reportes en la literatura que permitan predecir este comportamiento del HBsAg en los tipos antigénicos descritos. Al contrario existen referencias previas que demuesíran que pueden exisíir combinaciones en que la inmunogenicidad de alguno de sus componentes resulte afectada, aspectos que son sobrepuesíos en la presente invención como es el caso de la pertussis (Bersfad AK, ef al. 1997. Vaccine. Aug-Sep; 15(12-13): 1473-8; Bersíad AK et al. 2000. Vaccine. Mar 17; 18(18): 1910-9), hacia cuyas proteínas individuales hemos demosírado que se producen respuesías fan fuertes como las obtenidas por vía sistémica cuando se coadminisíra la Bp en formulación íeíravaleníe nasal, conírario a lo enconírado para la adminisíración nasal sola de la Bp en humanos (Bersíad AK, ef al. 2000, J Med Microbiol. Feb;49(2): 157-63). Descripción detallada de la invención
La presente invención se relaciona con el uso del anlígeno de superficie del Virus de la Hepaíiíis B como inmunopotenciador en inmunizaciones nasales, con las formulaciones vacunales resultantes de la combinación de este antígeno y otros antígenos vacunales que se benefician de esta propiedad y con la aplicación de este uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatiíis B y de las formulaciones en el campo de las vacunas.
Se relaciona además con las formulaciones mulfivaleníes, específicamente para adminisíración nasal, que resulten de la aplicación de esía propiedad del HBsAg, favorecedor del incremento de la respuesía inmune a los oíros aníígenos presentes en las mismas.
Las formulaciones vacunales para adminisíración nasal de la presente invención, junio al aníígeno de superficie del virus de la Hepaíilis B pueden contener uno o más aníígenos proteicos de naturaleza soluble, que recibe un efecto inmunopofenciador por su coadminisíración con el HBsAg. Ellos pueden ser: el loxoide íeíánico, el diftérico o conjugados proteína - polisacárido, cuya porción sacarídica se corresponde con un candidato vacunal anti Haemophilus influenzae íipo b, polisacárido C de Neissería meningitidis, polisacáridos vacunales de Pneumococcus pneumoniae, o en general una o más proteínas solubles de interés vacunal purificadas u obtenidas de manera recombinaníe.
Es fambién un objeto de la presente invención las formulaciones mulfivaleníes para adminisíración nasal en la que junio al anlígeno de superficie del virus de la Hepaíilis B se adiciona un candidato vacunal del grupo de los microorganismos inacíivados y que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg. El antígeno vacunal puede ser, la bacterina de Bordetella pertussis, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg u otro antígeno vacunal de esta naturaleza solo o formando parte de combinaciones complejas de antígenos. Oíros antígenos vacunales que pueden estar contenidos son los actuales candidatos vacunales inactivados o atenuados.
Las formulaciones vacunales para adminisíración nasal relacionadas con la presente invención pueden contener un número n de antígenos de microorganismos de especies diferentes entre n=1 hasta n=20, de naturaleza antigénica eníre las descritas anteriormente, con un volumen final y cantidades de aníígeno a inocular que están en el rango entre 50 microlitros y 2 mililitros, y entre 0.1 microgramos y 2 mg, respectivamente, en dependencia del tamaño y la especie a inmunizar.
Las formulaciones de la presente invención pueden solubilizarse en PBS, solución salina, agua para inyecciones o en cualquier solución tampón de uso en la prácfica médica y que permiten la estabilidad de los aníígenos, en conceníraciones de aníígenos que están en el orden de las posibles combinaciones de masa y volumen descritas con anterioridad. También los componentes aníigénicos pueden mezclarse con el HBsAg de acuerdo a candidatos de interés por edad de la vacunación o por candidatos mulíivaleníes basados en cualquier oíra premisa, donde esíén represeníado uno, dos o más íipos aníigénicos de los descritos previamente y que pueden esíar en esfado liofilizado y adminisírarse mediante gofas, spray o pulverización. Las formulaciones vacunales de la presente invención se pueden utilizar para lograr una inmunización efectiva de humano o animales de modo preveníivo o íerapéuíico.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Cinefica de la respuesta IgG de un esquema de inmunización con inoculaciones los días 0, 14, 28 y 87. Las extracciones de sangre se realizaron los días -10, 21 , 35, 42, 84 y 97. (A) Cinética de la respuesta de IgG anti HBsAg en suero; (B) Cinética de la respuesta anti TT en suero; (C) Cinefica de la respuesfa aníi DT en suero y (D) Cinefica de la respuesía anli Bp en suero. Tablas 1A, B, C y D: resulfados de los análisis estadísticos de las comparaciones entre grupos de las respectivas figuras. Figura 2. Respuesía de IgA en lavados vaginales el día 97. (A) Respuesía de IgA aníi HBsAg; (B) Respuesía de IgA aníi TT; (C) Respuesía de IgA aníi DT y (D) Respuesfa de IgA anti Bp (célula entera). Tablas 2A, B, C, D: análisis estadísíicos. Figura 3. Respuesía de IgA en lavados pulmonares el día 97. (A) Respuesía de IgA anti HBsAg; (B) Respuesta de IgA anti TT; (C) Respuesta de IgA anti DT y (D) Respuesta de IgA anti Bp (célula entera). Tablas 3A, B, C, D: análisis estadísíicos. Figura 4. Evaluación de la respuesía de IgG en suero coníra proteínas individuales de Bp luego de administración de combinaciones teíravalentes por vías IP e IN. Se muesíran los niveles de densidad ópfica generados por sueros individuales de los grupos inmunizados con las formulaciones íefravalenles de adminisíración nasal e iníraperiíoneal, grupos 7 y 13 respecíivamente, luego de (A) tercera inoculación y (B) cuarta inoculación.
Figura 5. Evaluación de la actividad proliferativa coníra los aníígenos presentes en la formulación nasal tetravalente del ejemplo 1 , administrados individualmente y en la formulación tetravalente.
Figura 6. Actividad potenciadora del HBsAg sobre el CPME de Neisseria meningiíidis. La combinación de ambos aníígenos favoreció significaíivameníe la respuesía aníi CPME.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1
Con el objeíivo de evaluar la respuesta de anticuerpos generada luego de la administración nasal de varias formulaciones conteniendo antígenos de diferente naíuraleza junto al HBsAg o solos, se diseñó un esquema de 126 ratones BALB/c hembras de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 13 grupos; los grupos del 1 al 11 con 10 animales cada uno, y los grupos 12 y 13 con 8 animales cada uno. Todos fueron inmunizados los días 0, 14, 28 y 87, mientras que las exfracciones de sangre se realizaron los días -10, 21 , 35, 42, 84 y 97. La dosis de cada uno de los antígenos que se administró a cada ratón se muesfra a continuación:
Grupo Ruta Cantidad de Antígeno por grupo
Grupo 1 IN)1 5μg de HBsAg + 10μg de DT Grupo 2 IN) 5μg de HBsAg + 3,2 UOP de Bp* Grupo 3 IN) 5μg de HBsAg + 10μg de TT Grupo 4 IN) 5μg de HBsAg + 10μg de DT + 3,2 UOP de Bp* Grupo 5 IN) 5μg de HBsAg + 10μg de DT + 10μg de TT Grupo 6 N) 5μg de HBsAg + 3,2 UOP de Bp*+ 10μg de TT Grupo 7 IN) 5μg de HBsAg + 10μg de DT + 10μg de TT + 3,2 UOP de Bp* Grupo 8 IN) 5μg de HBsAg Grupo 9 IN) 10μg de DT Grupo 10: IN) 3,2 UOP de Bp* Grupo 11: IN) 10μg de Grupo 12: (IP)2 5μg de HBsAg + 0,125 mg de AI(OH3)
Grupo 13Ψ:(IP) 5μg de HBsAg + 49,26 μg de DT + 29,07 μg de TT + 8,0 UOP de
Bp* + 0,125 mg de AI(OH3)
(IN)1 Grupo inmunizado inmunizado intranasalmeníe (IP)2 Grupo inmunizado inmunizado iníraperiíonealmente
* UOP: Unidades de opacidad; en cada caso se ulilizaron iguales cantidades de UOP de ambas cepas de Bp previamente descritas. ψ Como se puede apreciar, al grupo 13 le fue administrado la misma dosis de HBsAg que a los grupos nasales. Sin embargo, las dosis administradas al resto de los antígenos de dicho grupo fueron superiores debido a que se utilizó como control una formulación vacunal de uso comercial, la que contiene dosis específicas de cada uno de los antígenos que no pueden variarse, pero que se corresponden con las cantidades de microgramos que se representan en la tabla, de manera que por vía nasal se utiliza una cantidad inferior en 3, 5 y 2.5 veces para TT, DT y Bp respectivamente. Se utilizó el igualamiento en cuanto a cantidad de HBsAg.
Respuesta de anticuerpos IgG anti HBsAg en suero El resultado de las determinaciones de las respuesías de anticuerpos IgG contra el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B arrojó que, a la semana de la tercera administración, el grupo inmunizado iníranasalmeníe con HBsAg, DT, TT y Bp (grupo 7) fue significativamente superior comparado con el grupo 8, que recibió solamente HBsAg en PBS por la misma ruta, este comportamiento se repitió el día 42 (Figura 1A). El resto de los grupos inmunizados por la vía nasal, grupos 1-6, siguieron el mismo comportamiento que el grupo 7, desarrollando niveles de IgG significaíivameníe superiores a los obtenidos con el HBsAg en PBS luego de tres dosis, con la excepción del grupo 2, que en el día 35 tuvo una respuesta más elevada, pero que no llegó a ser significativa (p>0,05). No obstante, este grupo si tuvo una diferencia muy significativa el día 42, comportamiento que se puede explicar por una mayor dispersión de los títulos en el día 35.
Los grupos que fueron inmunizados por la vía nasal con formulaciones que contenían HBsAg y Bp; HBsAg, Bp y DT; y HBsAg, Bp y TT (grupos 2, 4 y 6 respecfivamente), desde la segunda dosis preseníaron respuestas de IgG superiores significativamente a las mostradas por el grupo 8. Es bueno destacar que el grupo inmunizado con la mezcla HB-DTP por vía nasal no difirió significativamente del grupo homólogo inmunizado por la vía IP -grupo 13-, el día 35. De la misma forma, luego de la cuarta dosis, se obíuvieron valores esíadísíicameníe similares eníre los grupos inmunizados por vía nasal y el grupo inmunizado con la combinación de aníígenos por vía IP (Fig. 1). Los íítulos aníi HBsAg generados por el grupo inmunizado con la vacuna Heberbiovac HB® (grupo 12) fueron significaíivamenfe superiores a los obtenidos con la inmunización de cualquiera de los grupos nasales. Este resultado se debe a la mayor inmunogenicidad del HBsAg cuando es inoculado por vía IP en comparación con las rutas intramuscular y subcutánea. En nuestros experimentos se ha evidenciado esta caracterísíica de la rute IP. No obstante a conocerse esta caracterísíica de la respuesta anti HBsAg, la inoculación de 250 μL de la vacuna por ratón, correspondiente a la dosis de 5 μg de HBsAg -equivalente con la dosis nasal-, hizo necesaria la uíilización de la rula IP. Sin embargo, se ha enconfrado en animales de mayor edad una respuesía que iguala la respuesía obtenida por inoculación nasal con la obtenida por inoculación IP. Un ejemplo de esto se evidenció en el segundo esquema (ver ejemplo 2), aunque los candidatos nasales fueron distintos.
A pesar de la menor intensidad de los títulos por la vía nasal, se pudo observar recientemente que los niveles de respuesta anti lgG2a fueron significativamente superiores para el grupo 2 con respecto a los generados por el grupo 12 (resultado no mostrado), lo cual demuestra que Bp generó un efecto modulador en la respuesta de anticuerpos anti HBsAg e introdujo un cambio cualitaíivo en la respuesía evidenciado en el perfil de subclases de IgG, favoreciendo el tipo de respuesta asociado a Th1. Esta respuesta se caracteriza por una mayor producción de anticuerpos de tipo lgG2a con respecto al perfil habitual generado por la vacuna adyuvada en alúmina. Como se puede apreciar en la Fig. 1 , las cinéticas de aparición y sostenimiento de la respuesta intranasal e intraperitoneal anti HBsAg son muy similares, con un incremento y caída en el tiempo similares. Respuesta de anticuerpos IgG anti toxoide tetánico en suero
Se pudo evidenciar el fuerte efecto ¡nmunopotenciador sobre el loxoide íelánico del resto de los antígenos: HBsAg, DT y Bp en la mezcla del grupo 7 luego de la inmunización intranasal. Como resultado de la evaluación de la segunda, tercera y cuarta inoculaciones, se evidenció un incremento en los niveles de aníicuerpos IgG aníi TT para dicho grupo, que fueron alíamenfe significalivos con respecto a los generados por el grupo 11 , inmunizado por la misma rufa con el toxoide tefánico en PBS. El resto de los grupos vacunados intranasalmeníe con mezclas que contenían TT, al igual que el grupo 7, específicamente los grupos 3, 5 y 6, mostraron niveles de anticuerpos superiores significativamente a los inducidos en el grupo 11 para todas las extracciones. En el caso del grupo 3 se alcanzó un nivel de anticuerpos que desde la segunda dosis fué aproximadamente 100 veces superior al del grupo 11 , lo que es de gran significación, puesto que ésta es la primera demostración de la actividad pofenciadora del HBsAg sobre un antígeno soluble, como lo es el TT. Como se pudo apreciar en la respuesta anli HBsAg, el íoxoide íeíánico fambién incrementó la respuesta anti HBsAg, por lo cual podemos afirmar que estamos en presencia de una interacción sinérgica en cuanto a potenciación cruzada de la inmunogencidad. Este tipo de fenómeno se había observado previamente para la interacción del HBsAg con el HBcAg y otros aníígenos de nucleocápsida viral pero nunca con un antígeno soluble, que como se evidencia en el grupo 11 en que el TT es inmunizado en PBS, no es inmunogénico por la ruta nasal, por lo que no habría de esperarse un efecto de este tipo entre el HBsAg y el TT. La respuesta anti TT se fortaleció aún más, y de forma significativa, cuando los antígenos HBsAg, TT y Bp se formularon juntos (grupo 6), generándose respuestas anti TT que llegaron a ser 1000 veces más fuertes que las generadas por el TT en PBS por vía IN (grupo 11). Este incremento adicional no se logró por la mezcla del DT, el HBsAg y el TT (grupo 5). Dicha formulación no provocó ningún cambio significativo en la respuesta aníi TT sino que se comportó similar esíadísficamente en cuanto a respuesta anti TT a la combinación del HBsAg y el TT (Fig. 1 B).
El grupo 6 no difirió significativamente en tííulos del grupo 7, ambos grupos indujeron respuestas 1000 veces superiores, teniendo en común la presencia de Bp y de HBsAg. Este análisis nos permite afirmar que tanto el antígeno de superficie como Bp producen una inmunopotenciación de la respuesfa aníi TT que incremente los títulos a niveles muy significativos en el primer caso y altamente significativos con la mezcla de ambos. Sería importante definir si el efecto polenciador de Bp es independiente del HBsAg o si ambos sinergizan en actividad potenciadora, ya que todos los grupos de combinaciones nasales en el experimento tuvieron HBsAg. Se puede afirmar que con respecto al TT, el aumento del número de antígenos presente en todas las formulaciones esíudiadas no afectó su inmunogenicidad, sino que pudo incrementarla aún más hasta niveles altamente significativos (Fig. 1 B). La comparación de los niveles de IgG anti TT entre los grupos 7 y 13, que fueron inmunizados con los 4 antígenos por las vías intranasal e intraperiíoneal, respecfivamenfe, no mosíró diferencias significaíivas. Incluso se pudo obtener por la vía nasal respuestas que para determinados grupos fueron superiores, aunque no significaíivamente, con respecto a las obtenidas por el grupo 13 (Fig. 1 B). Los grupos que fueron inmunizados con HBsAg y TT (grupo 3) y con HBsAg, DT y TT (grupo 5), aunque experimentaron títulos de IgG que una semana después de la segunda dosis no se diferenciaban de los obtenidos por el grupo 13, luego de las administraciones tercera y cuarta mostraron una respuesta significativamente inferior al mismo. Este resulfado evidencia la importancia de adicionar Bp a la mezcla para incrementar la respuesía anti TT hasta niveles similares a los obtenidos luego de una administración IP, no obstante se debe tener en cuenta en este análisis que por la ruta IP se está administrando 3 veces más toxoide teíánico con respecto al que se utiliza por la vía IN. Respuesta de anticuerpos IgG anti toxoide diftérico en suero La administración intranasal del DT, conjuntamente con HBsAg, TT y Bp (grupo 7) condujo a un incremento considerable en la inmunogenicidad del mismo, en comparación con la respuesía alcanzada por el grupo 9, en el cual el DT se adminisíró en PBS (Fig 1 C). Este mismo comportamiento se manifestó en los restantes grupos inmunizados intranasalmente con mezclas del DT (grupos 1 , 4 y 5), donde se evidenció un incremento muy significativo o altamente significativo en los niveles de IgG anti DT. Incluso desde la segunda dosis solo el grupo 1 no mostró un comportamiento significativamente superior, pero luego de la tercera dosis, para los días 35 y 42, la respuesta del grupo 1 fue altamente significativa con respecto al grupo inmunizado con el toxoide diftérico en PBS (Fig 1C).
La comparación de los niveles de IgG anti DT entre los grupos inmunizados intranasalmente con formulaciones que contenían DT y el grupo al cual se le adminisíró iníraperiíonealmeníe la vacuna íeíravalenfe (grupo 13), mostró un patrón de comportamiento similar al de la respuesta anti TT, es decir, los grupos que tenían HBsAg pero no Bp potenciaron la respuesta hasta un nivel de 100 veces, con la adición de Bp fue posible incrementar las respuesta aun más, a niveles incluso superiores a los generados por la vacuna DPT-HB por vía IP, este comportamiento reproduce lo enconírado con la oíra proíeína soluble, el TT, pero en este caso con el DT. Por lo que podemos afirmar que el HBsAg íiene un fuerte efecto poíenciador sobre ambas proteínas solubles y viceversa, evidenciándose fambién en el caso del DT una acíividad sinérgica en cuanto a la potenciación cruzada de la respuesta inmune a los antígenos en las mezclas ya que como se explicó previamente, la respuesta de IgG aníi aníígeno de superficie se potenció al adicionarse el DT. También pudo demostrarse una vez más la importancia de adicionar Bp a la mezcla, lo que permitió incrementar cientos de veces la respuesta anti DT situándola a niveles similares a los obtenidos luego de la administración IP. Se debe recordar en este punto que la respuesía es similar a la obtenida por vía IP no obstante a que por esta vía se utilizó una cantidad de DT cinco veces superior. Respuesta de anticuerpos IgG anti B pertussis (célula entera) en suero Todas las respuestas anti Bp se caracterizaron por su fortaleza y rápido incremento a niveles cercanos a la saturación (Fig. 1 D). No obstante a la aparente homogeneidad de los resultados, los análisis estadísticos evidenciaron la posibilidad de generación de diferencias significativas entre los grupos.
Después de la tercera administración, se generó en el grupo inmunizado inlranasalmeníe con la mezcla tetravalente, una repuesta significativamente superior a la del grupo que había sido inmunizado con Bp solamente por la misma vía (grupo 10). Este efecto desapareció luego de la cuarta inoculación por el rápido alcance del estado de saturación de los tííulos.
Los restantes grupos inmunizados iníranasalmente con formulaciones que contenían Bp conjuntamente con uno o más antígenos, tuvieron fuertes respuestas, que el día 35 fueron desde significativamente superiores hasta altamente significativas para el caso del grupo administrado con HBsAg y Bp, lo cual evidenció que el efecto potenciador del HBsAg también se produce sobre células inactivadas, en adición al efecto sobre las proteínas solubles. Tanto el grupo 2 como el grupo 4 maníuvieron esta superioridad estadísíica el día 42, para los grupos 6 y 7 -que poseen las combinaciones más complejas, no se observaron diferencias el día 42 con respecto al grupo 10.
La comparación de todos los grupos nasales con el grupo IP no mostró diferencias significativas luego de segunda y tercera dosis evidenciando los altos íííulos que se pueden obtener inmunizando por vía nasal con la célula entera. Ejemplo 2. Determinación de la respuesta en mucosas de las formulaciones nasales multivalentes del HBsAg.
Teniendo en cuenta que un aspecto de interés que determina la superioridad de la respuesta a los antígenos administrados por vía nasal es el hecho de que se puede generar una fuerte respuesta tanto a nivel mucosal como sistémico, determinamos las respuesías de aníicuerpos IgA en lavados vaginales y en lavados pulmonares a los grupos inmunizados y descritos en el ejemplo 1. Respuesta anti HBsAg en lavados vaginales
La respuesía de IgA específica para HBsAg en los lavados vaginales del día 100 luego de la cuarta administración en los ratones del grupo que recibieron la combinación tetravalente por la vía nasal, aunque superior, no difirió significativamente de la hallada en los ratones que fueron tratados exclusivamente con HBsAg por idéntica vía. Es importante destacar el hecho de que para este día, los tííulos en sangre tampoco fueron diferentes en cuanto a IgG anti HBsAg producto de la fuerte respuesta a la dosis de refuerzo del grupo con HBsAg en PBS. Sin embargo, se encontró para el primer grupo un 20% más de seroconversión. Si bien no se encontraron diferencias es importante el hecho de que tanta caníidad de antígenos no afecte la respuesta en vagina anfi HBsAg. Por otra parte, al comparar los niveles de IgA inducidos eníre los grupos que recibieron la combinación de los cuaíro antígenos por las vías ¡ntranasal e intraperiíoneal (grupo 7 y 13 respectivamente) se demostró que los niveles de los anticuerpos predominantes en las secreciones vaginales desarrollados en el grupo inmunizado por la ruta mucosal resultaron significativamente mayores a los del grupo inmunizado por la vía parenteral. Es bueno destacar que la inoculación con formulaciones del HBsAg por la ruta IP resulta en un nivel de IgA en vagina que, aunque bajos, son superiores a los obtenidos por vías como la SC y la IM (resultado no mostrado). Es por ello que las respuestas halladas en el caso de los lavados vaginales luego de inmunización 1P fueron significativas. En general la inmunización nasal superó a la IP como era de esperar. Respuesta anti toxoide tetánico en lavados vaginales
La determinación de los niveles de IgA específicos para el TT en secreciones vaginales luego de cuatro administraciones evidenció que el grupo inmunizado intranasalmeníe con la combinación de HBsAg, DT, Bp y TT (grupo 7) generó una respuesía superior y altamente significativa con respecto a la inducida por el grupo inoculado con TT únicamente que tuvo un 0% de seroconversión. Esfe mismo comportamiento lo tuvieron los demás grupos inmunizados con TT en las diferentes mezclas antigénicas. A partir de este resultado, y teniendo en cuenta la respuesta del grupo 3 que contiene al HBsAg y al TT, es posible afirmar que el HBsAg potenció la respuesta de IgA anti TT en vagina al nivel de las otras mezclas (Fig 2B).
Todos los grupos adminisírados por vía IN mosíraron respuesías altamente significativas con respecto al grupo inmunizado con HB-DTP en alúmina por vía IP, este grupo solo tuvo un 14% de seroconversión, por lo que se puede afirmar que no todos los antígenos que se inmunizan por vía IP logran tener respuesta a nivel de vagina, al parecer esta es una propiedad exclusiva de algunos antígenos, eníre ellos el HBsAg.
Respuesta anti toxoide diftérico en lavados vaginales
Las respuesías de IgA aníi DT en secreciones vaginales en el grupo de la formulación íeíravalente nasal, así como en los grupos que fueron inmunizados con las demás formulaciones combinadas que contenían al DT, fueron superiores (p<0,001) con respecto a los niveles generados en el grupo 9, que se inmunizó con una preparación control de DT en PBS (Fig. 2C).
Además, la respuesta generada por el grupo que recibió los cuatro antígenos por la vía nasal también fue superior a la generada en el grupo de la vacuna teíravaleníe por vía intraperitoneal, similar comportamiento que con TT. Se pudo observar en general que los grupos inmunizados mucosalmente, desarrollaron niveles de IgA vaginal significativamente superiores respecto al grupo que contiene a los cuatro antígenos por vía IP. Los niveles de IgA anti DT para el grupo 1, no se diferenciaron de los obtenidos por los grupos que tuvieron mayor inmunogenicidad, evidenciando lo que anteriormente se comprobó para el TT, que el HBsAg indujo una potenciación de la respuesta anti DT en vagina altamente significativa con respecto al grupo 9, en el cual se adminisíró el toxoide en PBS (Fig. 2C). Es posible, como comentamos anteriormente, que este resultado no implique un beneficio directo sobre la protección contra la difteria, o el tétanos, pero a partir de la evaluación de los modelos TT y DT se puede hipoteíizar que la combinación del HBsAg por vía nasal, con anfígenos de semejante nafuraleza -no particulados sino solubles- de oíros patógenos, libres o ancladas a estas proteínas, pudieran generar un incremento en los niveles de respuesta inmune a nivel de vagina. Respuestas anti Bordetella pertussis en lavados vaginales La respuesta aníi Bp en lavados vaginales se dividió en dos esíratos, uno inferior en el que se siíuó el grupo inmunizado con Bp en PBS, y el oíro superior, correspondiente a los grupos inmunizados con todas las combinaciones estudiadas. Cuando ambos estratos se analizaron de conjunto, resultó superior de manera altamente significaíiva la respuesfa obtenida aníi Bp por inmunización con las combinaciones, todas ellas conteniendo al HBsAg, no obstante a ello, es bueno destacar que la respuesta generada por Bp solamente, indujo niveles cercanos a 1/100, a diferencia de los toxoides tetánico y diftérico que apenas seroconvirtieron y que sólo lograron fuertes respuestas cuando se inmunizaron en las mezclas de antígenos.
Para el caso de Bp, no se observó que la inoculación IP generara respuestas de IgA vaginal, por tanto su comportamiento fue semejante al del TT, que generó, por vía IP, una respuesta de IgA imperceptible en lavados vaginales. Los otros dos antígenos, HBsAg y DT, generaron por si solos respuestas que fueron débiles pero significativas y que tuvieron 70 y 60% de seroconversión respectivamente. Respuestas de IgA en lavados pulmonares Del mismo modo que las respuestas a nivel de vagina son importantes para la protección contra uno de los paíógenos, la generación de una respuesía a nivel de fracío respiratorio es fundamentalmente importante para los paíógenos Bp y Corynebacteríum diphtheriae. Este aspecío no excluye el esíudio de las respuestas anti TT y anti HBsAg para el conocimiento general del nivel de activación inmunológica a nivel mucosal movilizado por la inmunización nasal de la mezcla feíravaleníe representada en el grupo 7. Respuestas anti HBsAg en lavados pulmonares
Luego de determinarse las respuestas de IgA específica para HBsAg obtenidas en los lavados pulmonares, se pudo concluir que no existieron diferencias significativas entre la generada por el grupo que fue inmunizado con la combinación tetravalente por la vía nasal (grupo 7) y la generada en el grupo que solo recibió HBsAg por igual vía (grupo 8). Es importante destacar que en el momento en que se realiza la evaluación de los niveles de IgA en pulmones, se producen niveles similares de IgG en suero para los grupos inmunizados con la mezcla y con el HBsAg en PBS. Este efecto de la cuarta inoculación disparó los niveles de la IgA anti HBsAg en el grupo 8. No obstante, la respuesta fue fuerte y no se afectó con respecto a la generada por el HBsAg en PBS por la administración de una gran cantidad de antígenos (DT, TT y Bp), evidenciando la alta capacidad de la ruta (Fig 3A). En esta misma figura se puede observar que la vía IP, contrario a lo que sucede a nivel de vagina, no induce una respuesta significativa en lavados pulmonares, y la comparación con los grupos nasales es ampliamente favorable para estos úlíimos (p<0,001). Respuestas anti toxoide tetánico en lavados pulmonares La respuesía de anticuerpos IgA anti toxoide tetánico, resultó ser mucho mayor (p<0,001) para la formulación nasal tetravalente con respecto a la administración del TT en PBS por la misma ruta o cuando se adminisíró adyuvado en alúmina junto a HBsAg, DT y Bp por la vía intraperitoneal. Se detectaron respuestas casi imperceptibles en estos dos últimos grupos coníroles (Fig. 3B). Respuestas anti toxoide diftérico en lavados pulmonares
La combinación del toxoide diftérico con HBsAg, TT y Bp administrada intranasalmeníe incrementó enormemente su inmunogenicidad. Tal afirmación se basa en que los resultados de las determinaciones de las respuestas de anticuerpos IgA anti DT indicaron que existían diferencias altamente significativas (p<0,001) entre el grupo inmunizado con la combinación de los cuatro antígenos por la rufa mucosal (grupo 7) y los grupos 9 y 13, que se corresponden con el DT en PBS por vía nasal y el conlrol de la vacuna leíravalente por vía iníraperiíoneal, respecíivameníe. En el caso del grupo 9, para una dilución 1/100 no hubo ningún ratón positivo anti IgA específico para DT. En el grupo IP, solo se detectó un ratón positivo, por lo que esta pobre respuesta conírasta fuertemente con las obtenidas por la mezcla íeíravalente, del mismo modo que contrasta la respuesta obtenida contra el TT en los grupos homólogos (Figs. 3C y 3B). Respuesta anti Bordetella pertussis en lavados pulmonares Al compararse entre sí las respuestas de IgA anti Bp desarrolladas en el grupo inmunizado con la combinación cuádruple por la ruta nasal (grupo 7) y en el grupo inmunizado exclusivamente con las células inacfivadas de Bp por igual vía (grupo 10), pudo consfafarse que no exisíían diferencias significafivas eníre ellas. Sin embargo, cuando las respuestas de los grupos analizados anteriormente fueron comparadas cada una con la generada en el grupo que recibió intraperitonealmente la mezcla antigénica de cuatro elementos adyuvada con alúmina, la superioridad de ambas respuestas de IgA fue altamente significativa, demosfrándose una vez más que únicamente con la inoculación mucosal se favorecen los fuertes incrementos en la respuesfa IgA detectada en lavados pulmonares (Fig. 3D).
Aunque la respuesta en lavados pulmonares anti Bp no fue potenciada con la mezcla como ocurrió en lavados vaginales, tampoco se apreció que el incremento del número de antígenos haya repercutido negaíivameníe en la inmunogenicidad. Es bueno señalar que ya la respuesta anti Bp tuvo niveles muy altos en los grupos 7 y 10, con tííulos para ambos cuya media geoméfrica estuvo por encima de 104. Este resultado evidencia que Bp es un excelente inmunógeno por la vía nasal para la inducción de respuestas de IgA en pulmones. El efecto que se observó en los niveles de anticuerpos fue de estrechamiento máximo de los intervalos, lo que evidencia un efecto de saturación para los mismos. Debido a que sólo se hizo lavados pulmonares de los grupos 7 en adelante no se pudo esíudiar el grupo 2 en comparación con el 10 para ver el efecto de la combinación del HBsAg y Bp, pero presumimos, por el nivel de los íííulos y la caracferísíica de la respuesía, que de exisíir diferencias, estas hubiesen sido muy estrechas. Ejemplo 3. Comparación de la respuesta de anticuerpos contra las proteínas FHA y toxina de pertussis luego de la administración nasal y sistémica de las formulaciones de ios grupos 7 y 13 del ejemplo 1.
Debido a que reportes previos señalados en la Memoria Descriptiva sugieren la menor capacidad de la ruta nasal para promover una respuesta contra las proteínas independientes de Bp: la FHA y la toxina de pertussis, se realizó la evaluación de la respuesta contra las mismas para los grupos 7 y 13, que son los grupos que se corresponden con la formulación teíravaleníe adminisírada por vía nasal y parenteral respectivamente. Esta evaluación se realizó luego de tercera y cuarta inoculaciones. El análisis estadístico de la respuesta demosfró que no existieron diferencias significativas entre los grupos nasales y los parenterales de las exíracciones evaluadas. De modo que pudimos concluir que en la formulación nasal íeíravaleníe se sigue induciendo, incluso luego de la inoculación de una caníidad 2.5 menor de Bp (Fig.4). Ejemplo 4.
Respuesta linfoproiiferativa en bazo luego de administración nasal. Con el objetivo de estudiar la respuesta proliferativa generada en bazo por los aníígenos del ejemplo 1 , se seleccionaron el día 100 los grupos 7 al 13, realizando la extracción del bazo de al menos cuatro ratones por grupo, con los cuáles se hizo un pool de linfociíos que se cultivaron en presencia de los antígenos conque se habían inmunizados. En la figura 5 se destacan los resultados de la evaluación de la capacidad proliferativa de los antígenos adminisírados por vía nasal en formulación tetravalente, individualmente. Los grupos iníraperiíoneales fueron usados como conírol de la rufa. Como resultado de este experimento se pudo evidenciar que es posible obfener a partir de administración intranasal de formulaciones múltiples de antígenos, respuestas celulares significativas contra todos los antígenos presentes en la preparación, incluso superiores para algunos de ellos, figura 5. Ejemplo 5 El HBsAg también actúa como inmunopotenciador de la inmuno-genicidad del complejo proteico de vesículas de membrana externa (CPME) de Neisseria meningiiidis.
Con el objetivo de explorar si el anfígeno de superficie es capaz de potenciar la respuesía a antígenos coadministrados, se realizó un experimento en el que se inocularon grupos de 8 ratones BALB/c hembras enfre 8 y 10 semanas de edad con antígeno de superficie, CPME y los correspondientes controles de los antígenos solos. Este experimento evidenció que el anfígeno de superficie fue capaz de potenciar significativamente la respuesta contra el CPME, y viceversa (Figura 6). Oíros aníígenos coinoculados recibieron un efecto similar sobre su inmunogenicidad, debido a la actividad poíenciadora del anfígeno de superficie, eníre ellos, aparte de las proteínas solubles y bacterinas, se hallan virus inacíivados, microorganismos atenuados, y proteínas de superficie viral. Ejemplo 6.
Algunas combinaciones reales. Potencialidades y modos de combinación. Entre las combinaciones múltiples que han demostrado la inmunogenicidad de los componentes individuales donde se pudo obtener respuestas incrementadas contra un alto porcentaje de los antígenos presentes en las mismas y que pueden ser formuladas de conjunío en formulaciones líquidas o liofilizadas para administración nasal se encuentran las presentadas en la siguiente tabla: 1- Hb - D 6- Hb - PT 11- Hb - DPT - Hib
2- Hb - P 7- I-Ib - DPT 12- Hb - (IPV)
3- Hb - T δ- Hb - (Hib) 13- Hb - DPT - Hib - (IPV) 4- Hb - DP 9- Hb - (CPME)
5- Hb - DT 10- Hb - (Virus atenuados o inactivados, naturales o recombinantes)
Eníre las combinaciones de aníígenos que pudieran mezclarse con el HBsAg se pueden seleccionar antígenos que se formularían por aplicación de acuerdo a grupos de edades, atendiendo a su inoculación en ancianos, adolescentes o recien-nacidos. Además por interés de íipo de enfermedades mucosales, aquí se pueden encontrar antígenos que penetran por mucosas en los cuales la inmunidad de mucosas es importante. Entre estos pueden seleccionarse de acuerdo a la uíilización de mezclas de aníígenos para prevenir enfermedades sexuales, respiratorias, buco - intestinales. Atendiendo a grupos de riesgo, o a necesidades de viajeros. Atendiendo a órgano (ej: HBV, HCV y HAV). Atendiendo a tipo de enfermedad (Ej. enfermedades crónicas de transmisión sexual, enfermedades virales de transmisión sexual, ele).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Formulación vacunal multivalente para adminisíración nasal caracterizada porque contiene el antígeno de superficie del Virus de la Hepatiíis B como inmunopoíenciador mucosal de aníígenos solubles, bacferinas y virus inacíivados.
2. Formulación vacunal mulíivaleníe para adminislración nasal según la reivindicación 1 , caracterizado porque uno de los antígenos de la formulación es el propio antígeno de superficie del virus de la Hepaíiíis B.
3. Formulación vacunal multivalente para adminisfración nasal según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque junio al antígeno de superficie del virus de la Hepatifis B se adiciona un número n de oíros antígenos que reciben un efecto inmunopotenciador por su coadminisíración con el HBsAg donde n puede ser n=1 hasta n=20.
4. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende el antígeno toxoide teíánico, que recibe un efecto inmunopoíenciador por su coadminisfración con el HBsAg.
5. Formulación vacunal mulíivalenfe para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende el antígeno toxoide diftérico, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
6. Formulación vacunal multivalenfe para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende un antígeno conjugado proíeína - polisacárido correspondiente a un antígeno vacunal anti Haemophilus influenzae tipo b, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
7. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende un aníígeno conjugado proteína - polisacárido que se corresponde con el polisacárido C de Neissería meningitidis conjugado a una proíeína portadora, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
8. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende un aníígeno conjugado proteína - polisacárido cuya porción polisacarídica se corresponde con un polisacárido vacunal de Pneumococcus pneumoniae, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
9. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende microorganismos inactivados como antígenos vacunales que reciben un efecío inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
10. Formulación vacunal mulíivalenfe para adminisíración nasal según la reivindicación 9, caracterizado porque un antígeno vacunal puede ser la bacterina de Bordetella pertussis, que recibe un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
11. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende virus inactivados como antígenos vacunales, que reciben un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
12. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende virus atenuados como antígenos vacunales, que reciben un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
13. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque n comprende uno o más de los antígenos descritos en las reivindicaciones de la 4 a la 12 o mezclas de estos y otros tipos aníigénicos, que reciben un efecto inmunopotenciador por su coadministración con el HBsAg.
14. Formulación vacunal mulfivaleníe para adminisíración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracíerizado porque el volumen de la formulación final está en el rango de los 50 microlitros a los 2 mililitros, en dependencia del tamaño y la especie a inmunizar.
15. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque las cantidades de antígeno a inocular están en el rango de los 0.1 microgramos a los 2 mg en dependencia del tipo de aníígeno y de la especie a inmunizar.
16. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracíerizado porque la mezcla antigénica se solubiliza en PBS, solución salina, agua para inyecciones o en cualquier solución fampón de uso en la prácíica médica o que permiían la estabilidad de los aníígenos.
17. Formulación vacunal mulíivaleníe para adminisfración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 16, caracíerizado porque los componentes esíán en estado líquido o liofilizados.
18. Formulación vacunal mulfivalenfe para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 17, caracterizado porque la adminisíración se realiza por gotas, spray o pulverización.
19. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 18, caracterizado porque se emplea en humanos o animales.
20. Formulación vacunal multivalente para administración nasal según las reivindicaciones de la 1 a la 19, caracterizado porque se emplea para uso preventivo o terapéutico.
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