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WO2003056005A1 - Promoteur homologue de sglt humain et utilisation dudit promoteur - Google Patents

Promoteur homologue de sglt humain et utilisation dudit promoteur Download PDF

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Publication number
WO2003056005A1
WO2003056005A1 PCT/JP2002/013651 JP0213651W WO03056005A1 WO 2003056005 A1 WO2003056005 A1 WO 2003056005A1 JP 0213651 W JP0213651 W JP 0213651W WO 03056005 A1 WO03056005 A1 WO 03056005A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
salt
dna
human sglt
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2002/013651
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Keiji Iwamoto
Nozomi Katayama
Mihoko Kawamura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to AU2002367140A priority Critical patent/AU2002367140A1/en
Publication of WO2003056005A1 publication Critical patent/WO2003056005A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a novel promoter for gene expression and its use. More specifically, the present invention relates to DNA containing the promoter region of the human SGLT homolog gene, a transformant transformed with the DNA, a method of screening for a compound that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter, or a salt thereof, and the like. . Background art
  • a membrane protein called a sugar transporter is required on the cell membrane.
  • the glucose transporter is Na + /, an active transporter that transports glucose against a concentration gradient by conjugating with the passive transporter, facilitated diffusion glucose transporter (GLUT) and Na + ion transporter.
  • GLUT facilitated diffusion glucose transporter
  • Na + ion transporter Na + ion transporter.
  • Glucose transporter (SGLT) GLUT has eight isoforms and has a common structure that penetrates a cell membrane with a molecular weight of about 50,000 12 times.
  • SGLT has a common structure that penetrates the cell membrane with a molecular weight of 750,000 14 times.
  • Human SGLT1 is specifically expressed in the small intestine and kidney and has high affinity for glucose and has low transport ability.
  • Human SGLT2 is specifically expressed in kidney and has low affinity for glucose and has high transport ability. It has been known. SGLT plays a role in absorbing glucose from the small intestine and reabsorbing darcos once excreted in urine from the kidney.
  • GLUT2 a passive transporter, has been mainly expressed in 3 cells and hepatocytes. Have been considered. GLUT2 is characterized by a low affinity for glucose and a high maximum transport capacity. It is thought that Teng / 3 cells take up glucose in response to blood glucose levels and, together with dalcokinase, function as a dalcose sensor for glucose-dependent insulin secretion. In hepatocytes, glucose is taken up into cells during postprandial hyperglycemia according to the glucose concentration gradient inside and outside the cell, and glucose produced inside cells by glycogenolysis or gluconeogenesis is released into blood during fasting. It functions as a sugar transporting carrier.
  • the SGLT homolog function By activating the SGLT homolog function, it can be expected that glucose uptake into ⁇ / 3 cells is promoted and blood glucose level-dependent insulin secretion is enhanced. In addition, it is expected that the SGLT function activator does not cause the above-mentioned side effects of the insulin secretagogue (SU agent) currently used.
  • SU agent insulin secretagogue
  • GLUT2 releases glucose from the liver into the blood during fasting
  • the SGLT homolog promotes glucose uptake from the blood to the liver regardless of the glucose concentration gradient inside and outside the cell. Therefore, it can be expected to suppress the release of glucose from the liver into the blood, and to suppress the fasting hyperglycemia observed in diabetic patients without causing side effects such as hypoglycemia.
  • SGLT inhibitors can lower blood sugar by suppressing reabsorption of sugar from the kidneys, and are expected to suppress fat synthesis by suppressing sugar uptake in the liver. I can wait.
  • a human SGLT homolog genomic gene As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in obtaining a human SGLT homolog genomic gene with the aim of establishing a screening method for searching for a human SGLT homolog gene-expressing substance.
  • This gene was subjected to PCR to obtain 2.3 kb DNA upstream of the structural gene encoding the human SGLT homolog, and a plasmid DNA was constructed downstream of which a luciferase gene was ligated as a repo overnight gene.
  • a human SGLT homolog promoter By measuring the luciferase activity in HepG2 cells transformed with the above, a human SGLT homolog promoter could be found in the 2.3 kb DNA upstream of the human SGLT homolog structural gene.
  • a regulator sequence that seems to regulate the expression of the human SGLT homolog.
  • the regulator sequence is a sequence containing a PPRE (Peroxisome Proliferator Response Element);
  • sequence containing the PPRE is a sequence containing the 1334th to 1339th nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5;
  • the regulator sequence is a sequence containing a HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4) binding sequence.
  • HNF4 Hepatocyte Nuclear Factor 4
  • sequence containing the HNF4 binding sequence is a sequence containing the 1720th to 1731rd base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
  • the sequence containing the Isll (Islet 1) binding sequence is a sequence containing the 687th to 692th or the 2149th to 2154th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the sequence of the Regile contains an HNF5 (Hepatocyte Nuclear Factor 5) binding sequence.
  • the DNA according to (2) which is a sequence having
  • a method for screening for a diabetic drug or an antihyperlipidemic drug which comprises using the transformant according to the above (15).
  • a promoter or inhibitor of sugar uptake comprising a compound having a promoting or inhibiting activity of human SGLT homolog promoter activity or a salt thereof,
  • an antidiabetic or antihyperlipidemic agent comprising a compound having an activity of promoting or inhibiting human SGLT homolog promoter activity or a salt thereof;
  • the present invention relates to a method for preventing and treating diabetes or hyperlipidemia, which comprises administering a compound having a promoting or inhibiting effect or a salt thereof.
  • FIG. 1 is a drawing showing a hydrophobicity plot of a human SGLT homolog.
  • FIG. 2 is a drawing showing SNPs present in the upstream region of the human SGLT homolog gene.
  • FIG. 3 is a drawing showing a deletion mutant of the upstream region of the human SGLT homolog gene.
  • FIG. 4 is a drawing showing a graph of the value of promoter activity in the upstream region of the human SGLT homolog gene when the activity of sea pansy luciferase is set to 1.
  • Figure 5 shows the upstream region of the human SGLT homologue gene, which is promoted by the addition of dexamethasone 0 to 3 M in HepG2 cells and Huh-7 cells transfected with the human SGLT homologue gene upstream region.
  • 3 is a drawing showing a graph of the value of promoter activity (the amount of light emitted by luciferase) in Example 1.
  • human SGLT homolog containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (hereinafter sometimes referred to as human SGLT homolog) used in the present invention is human ⁇ Cells of warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, hidges, horses, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney cells, bone marrow) Cells, mesangial cells, Langer's cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chon
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 includes about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 Amino acid sequences having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of human SGLT homologs containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 include, for example, those substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 14
  • a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and having substantially the same activity as a human SGLT homolog containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 is preferred.
  • the activity of substantially the same quality includes, for example, an active transport activity of glucose.
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, the active transport activity of glucose It is preferably equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times), but the degree of these activities, the molecular weight of the protein, etc. May be different.
  • Activity such as glucose active transport activity can be measured according to a known method.
  • the human SGLT homolog used in the present invention includes, for example, 1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; Amino acid sequence in which the number (1 to 5) amino acids have been deleted, and more preferably 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which about 10 or more, more preferably a number (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or a protein containing an amino acid sequence combining them is also used. included.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the human SGLT homolog used in the present invention including the human SGLT homolog containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, has a C-terminal lipoxyl group (one COOH), carboxylate (one COO-) Or an amide (1-C ⁇ NH 2 ) or an ester (—COOR).
  • R in the ester for example, methyl, ethyl, n-propyl, Isopropyl, ( ⁇ _ 6 alkyl groups such as n- butyl, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, C 6, such as ⁇ - naphthyl Le - 1 2 ⁇ Li Ichiru group, for example, benzyl, C 7 such as phenylene Lou C ⁇ 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • the human SGLT homolog need, the N-terminal amino acid residue (eg, Mechionin residues)
  • Amino group protecting groups e.g., formyl group, C ⁇ such Arukanoiru such Asechiru groups - such as 6 Ashiru group
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule for example, --OH, --SH, amino group, imidazo , An indole group, a guanidino group, etc.
  • an appropriate protecting group for example, an acyl group such as a 6- alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • a sugar chain is bound. It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins.
  • human SGLT homolog used in the present invention include, for example, a human SGLT homolog derived from human kidney and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the salts of human SGLT homologs used in the present invention include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metals), especially physiologically acceptable salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metals
  • physiologically acceptable salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid,
  • the human SGLT homolog or a salt thereof used in the present invention may be a human SGLT as described above. It can be produced from known cells or tissues by a known protein purification method, or by culturing a transformant containing DNA encoding a human SGLT homolog. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can usually be used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • the protected amino acids described above various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides include DCC, ⁇ , ⁇ ′-diisopropyl carbodiimide, ⁇ -ethyl- ⁇ ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HOOB t), or the protected amino acid may be pre-formed as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester. It can be added to the resin after activation has taken place.
  • Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include proteins It can be appropriately selected from solvents known to be usable for the condensation reaction. For example,
  • Acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; Sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the ninhydrin reaction when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group.
  • unreacted amino acids can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, ⁇ - ⁇ , Br_Z, adamantyl Oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 212-trophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxy It can be protected by carbonylation, t-butoxycarbonylhydrazide, tritylhydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cycl
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower-alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinylyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz l, C l 2 - Bz l, 2 - nitrobenzyl, Br-Z, t _ butyl is used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carbonyl groups of the raw material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Phenol cyanomethyl alcohol
  • paranitrophenol H0NB
  • N-hydroxysuccinimide N-hydroxyphthalimide
  • esters with HOB t esters with HOB t
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or the like.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as toluene, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • a cation scavenger such as toluene, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above.
  • dilute sodium hydroxide It is also removed by alkali treatment with a lithium solution or diluted ammonia.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating the a; -hydroxyl group of the carboxy terminal amino acid and protecting it, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain. After lengthening the protein chain, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal amino group of the peptide chain is removed, and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group are removed, These proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • a desired crude protein After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained.
  • This crude protein can be purified by various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain an amide of the desired protein.
  • an ester of the protein for example, a-force After condensing a ropoxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired protein can be obtained in the same manner as the amide of a protein.
  • the human SGLT homolog or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known protein synthesis method.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target protein can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein used in the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the human SGLT homolog used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the human SGLT homolog obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto. Can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the human SGLT homolog used in the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the human SGLT homolog used in the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cDNA derived from cells and tissues, the above-mentioned cDNA library derived from cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT_PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell'tissue.
  • RT_PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the human SGLT homolog used in the present invention for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: A DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by 16 and encoding a protein having substantially the same properties as the human SGLT homolog used in the present invention. Any one may be used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 under high stringent conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 Or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95%.
  • DNA containing a base sequence having the above homology is used.
  • Examples of a DNA which can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 More preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be done. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be performed under high stringency conditions.
  • High stringency conditions refer to, for example, conditions where the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. . In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the human SGLT homolog containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 includes a DN containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16. A or the like is used.
  • the PCR method is performed by using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the human SGLT homolog of the present invention.
  • Hybridization can be selected by the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). And so on. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR or a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) or Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.). It can be carried out according to a known method such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned human SGLT homolog can be used as it is, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the DNA containing the promoter overnight region of the human SGLT homolog of the present invention may contain a regulator sequence described below, and may be any MA having human SGLT homolog promoter activity. Good.
  • any nucleotide sequence may be used as long as it contains the nucleotide sequence represented by the first to second nucleotides of SEQ ID NO: 5 or a part thereof.
  • human or other mammalian cells eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts , Fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, obese cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes Spheres, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells, or cancer cells), or any of these cells Tissues, for example, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla
  • the recombinant DNA containing the promoter region of the human SGLT homolog of the present invention is specifically described below. Can be obtained as follows.
  • a human gene library integrated into EMBL3 vector is screened by a known method, and the ⁇ phage that reacts with this probe is screened.
  • DNA is extracted from this phage clone, a restriction enzyme map of the incorporated human gene is prepared, and a DNA fragment obtained by digestion with a restriction enzyme that reacts with a probe at the uppermost stream of the cDNA is not particularly limited. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573-8577), retroviral vectors (Cone, RD and Mulligan, RC (1984) Proc. Natl.
  • the obtained DNA can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme, if desired, or added with a linker.
  • a detectable structural gene may be ligated downstream of the promoter.
  • Various reporter genes are used as the structural gene linked downstream of the promoter region.
  • the repo overnight gene in addition to the luciferase gene, CAT (Chloramphenicol acetyl transferase) gene, and al riphosphatase gene, the j8-galactosidase gene is widely used. Any other structural gene can be used as long as it has a method for detecting its gene product.
  • an appropriate restriction site downstream of the promoter region is used. Then, the above-mentioned structural genes may be ligated in such a direction as to be transcribed correctly.
  • Examples of the host transformed with the recombinant vector include, for example, Escherichia sp. Bacteria, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12, DH1 [Processings of the National Academy of Sciences, Obs-Sciences of Ob-The-Usc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (198 1)], J 109, JA 2 21 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 10 1 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969) )] And C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis M 111 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry). 95, 87 (1 98 '4)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces, Schizosaccharomyces pombe NCY CI 913 , NC YC 2036, Pichia pastoris, etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from Trichoplusia ni midgut, Trichoplusia ni Egg-derived High Five TM cells, Mamestra brassicae-derived cells, Estigmena acrea-derived cells, and the like are used.
  • Sf cell a cell line derived from silkworm (Bombyxmori N; BmN cell) is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae and the like are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ (dhfr-) cell).
  • Mouse L cells Mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, mouse fibroblasts 3T3-L1, human liver cancer cells HepG2 (hereinafter abbreviated as HepG2 cells), Human osteosarcoma cells MG-63 (hereinafter abbreviated as MG-63 cells), human FL cells, white adipocytes, egg cells, ES cells (Evans, MJ and Kaufman, K. ⁇ . (1981) Nature, 292, 154), and cells that have been induced to differentiate under appropriate differentiation conditions are used. Among them, animal cells, especially white fat cells, can be used. Egg cells or ES cells (Evans, MJ and Kaufman, K. ⁇ . (1981) ature., 292, 154) are also used as a step in the transfer of DNA into animal individuals.
  • Transformation methods for these cells include the calcium phosphate method (Graham et al. (1973) Virology, 52, 456), the electroporation method (Ishizaki et al. (1986) Cell Science, 5, 577), and the microinjection method. Are used.
  • biotechnology To transform insect cells or insects, for example, biotechnology
  • the transformant is cultured in the presence of a specific compound, and by measuring and comparing the amount of the gene product in the culture, the ability of the compound to control the promoter overnight activity can be known.
  • the transformant is cultured by a method known per se.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources, inorganic substances and others. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen source examples include ammonium salts, nitrates, corn chip, liqueur, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic or organic substances such as potato extract and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experimen, in Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, a drug such as, for example, 33-indolyl acrylic acid can be added to make the promo work efficiently. If the host is a bacterium of the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 4 for about 6 to 24 hours.
  • the culture medium used was Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used. It is preferable to adjust ⁇ of the culture medium to about 6., 2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal calf serum [Seience, 122, 501 (1952)] , DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPM I 1640 medium (Journal of the American Medical Associatation) ion) 199, 519 (1 967)], 199 Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], 73 , 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a transcription control factor of a human SGLT homolog may be used. Any sequence can be used as long as it can bind.
  • a PPRE Peroxisome Proliferator Response Element
  • PPRE Peroxisome Proliferator Response Element
  • DNA of the present invention may contain the Regiyure Isseki one sequence may contain a plurality of said regulator aerator sequence.
  • the nucleotide sequence containing a part of the nucleotide sequence of the 1st to 2254th nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is any nucleotide sequence containing the above-mentioned all-over-one sequence. More specifically, it may be, for example, the 1806th to 2254th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or the 958th to 2254th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. And the like.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (1) the 698th C is converted to T, (2) the 824th A (3) a nucleotide sequence having a nucleotide sequence in which C at position 698 has been converted to T and nucleotide 824 at position A has been converted to T (SEQ ID NOS: 8, 9, and 10) Or a part thereof can also be used as the promoter region of the present invention.
  • the DNA of the present invention is a DNA containing the promoter region of a human SGLT homolog, a compound that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter (eg, (A compound that promotes or inhibits) or a salt thereof.
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter eg, (A compound that promotes or inhibits) or a salt thereof.
  • the screening method, the screening kit, the screening method, and a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter obtained using the screening kit will be specifically described.
  • a method for screening for a compound that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter eg, a compound that promotes or inhibits sugar uptake
  • a transformant transformed with the above-described DNA of the present invention Is useful for searching for or determining a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter of the present invention.
  • the transformant of the present invention is contacted with a test compound. And comparing a transformant not containing the human SGLT homologous promoter region of the present invention with a test compound and measuring the expression level of the polypeptide.
  • test compound examples include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • polypeptide to be expressed a polypeptide encoded by the above structural gene (preferably, a repo overnight gene) or the like is used.
  • Examples of a method for measuring the expression level of a polypeptide include measuring luciferase activity by a method according to the method described in Brasier, A.R. et al. (1989) Biotechniques vol. 7, 1116-1122.
  • a screening kit used to screen for compounds that promote or inhibit the activity of the human SGLT homolog promoter for example, compounds that promote or inhibit sugar uptake
  • salts thereof for example, compounds that promote or inhibit sugar uptake
  • kits for determining a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the human SGLT homolog promoter of the present invention is characterized by using the above-mentioned transformant.
  • kits for determining a compound or its salt that promote or inhibit include the following.
  • Dulbbecco's modified Eagle's MEM (manufactured by Gibco) supplemented with 5% of egosum serum (manufactured by Gibco).
  • PGV-B2 (Nitsuho Nishi) plasmid DNA having a human SGLT homolog promoter sequence and a structural gene (eg, luciferase gene) inserted downstream of the human SGLT homolog promoter according to the present invention 4.t main cell line
  • HepG2 cells human hepatoma cell line: ATCC HB 8065
  • Huh-7 cells human hepatoma cell line
  • a host cell strain was seeded by lxlO 5 / well in 96-well microplate, over ⁇ 37 ° (:, cultured in 5% C0 2 hatching eggs device.
  • the plasmid for measuring overnight activity of the human SGLT homolog promoter of the present invention is introduced into cells at 1 g / well. After the introduction, the test compound in 1 hour was added in O.Lml / well, for 48 hours at 37 ° C, 5% C0 2 incubator.
  • a compound that promotes or inhibits human SGLT homolog promoter activity for example, a compound that promotes or inhibits sugar uptake
  • a salt thereof obtained by using the screening method of (1) or the screening kit of (2).
  • the compound when it reduces or inhibits the promoter activity, it can be used as an antihyperlipidemic agent or the like because it inhibits lipid production.
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like is used as a salt of the compound obtained by using the above-described screening method or screening kit.
  • examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the salt with an inorganic base include an alkali metal salt such as a sodium salt and a potassium salt, an alkaline earth metal salt such as a calcium salt and a magnesium salt, and an aluminum salt and an ammonium salt.
  • Preferred examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-alutidine, ethanolamine, genoaluminamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. Salts with min, N, N, dibenzylethylenediamine and the like are included.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And the like.
  • salts with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, or oltinine
  • salts with the acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like. can give.
  • the compound or a salt thereof When used as a prophylactic and / or therapeutic agent for the above-mentioned diseases, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound or a salt thereof may be orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with sugar or water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the compound can be formulated in a unit dosage form required for generally accepted formulation practice with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid Leavening agents such as, for example, lubricating agents such as magnesium stearate, sucrose, lactose or saccharin And sweeteners such as peppermint, cacao oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 (TM), HCO-50) You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum It may be combined with preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against human mammals (eg rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • human mammals eg rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for an adult (as 60 kg), the dose is about 0.1 per day. 100100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually one dose for adults (60 kg).
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of Primer XI used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the DNA of the upstream region of 8 bp from 2261 bp upstream of the translation start point of the human SGLT homologue gene obtained in Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer for P1 mutation introduction used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer for P2 mutation introduction used in Example 2.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of DNA having a base substitution of P2 obtained in Example 2.
  • [SEQ ID NO: 9] 3 shows the nucleotide sequence of DNA having a P1 base substitution obtained in Example 2.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of DNA having both P1 and P2 base substitutions obtained in Example 2.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a human SGLT homolog protein.
  • Fig. 3 shows the nucleotide sequence of DNA encoding a human SGLT homolog protein containing a 3 'untranslated region (2026-3140).
  • [SEQ ID NO: 22] 8 shows the base sequence of 8 used in Reference Example 2.
  • the transformant Escherichia coli XL / Blue / pTB2254 obtained in Example 1 described below was used from December 6, 2001 (Heisei 13), Tsukuba, Ibaraki Pref. 6 (Postal code 305-8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent No. FERM BP-7178, 2001 No. 1 January 20 Osaka, Osaka, Japan It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the number 7-85 (zip code 532-8686), 2-3-1 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Ichikawa.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant, Escherichia coli XL BIue / pTB2255, obtained in Example 2 has been used since December 6, 2001 (Heisei 13), 1-1 Tsukuba, Higashi 1-chome, 1 Chuo No. 6 (Ibaraki Prefecture) Submitted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) with the postal code 305-8566) as the accession number FERM BP-78 19, 2001. 1 January 20 Osaka, Osaka -Fermentation Research Institute (IF 0) of Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Yokohama, 2-1-7-85 (zip code 532-8686) Deposit No. IF # 16730.
  • IF 0 Osaka -Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli XU-Blue / pTB2256 obtained in Example 2 was obtained from December 6, 2001, at 1-1, Tsukuba, Higashi 1-chome, Chuo 6 Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) with a zip code of 305-8566) as the deposit number FERM BP-7820 as a deposit number of FERM BP-7820 from January 20, 2001. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) of the 2-7-1 Mihonmachi 7-85 (zip code 532-8686) under the accession number IF ⁇ 1673-1.
  • IF ⁇ Fermentation Research Institute
  • Example 2 The transformant Escherichia coli DH5Q! / PTB2257 obtained in Example 2 was obtained from December 19, 2001 at Tsukuba East 1-chome 1 Chuo No. 6 Submitted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) with a zip code of 305—8566) as a deposit number FERM BP—7832 as a deposit number FERM BP—7832. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) of Mihonmachi 2-1-7-85 (zip code 532-8686) under the accession number IF ⁇ 16732.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • PCR reaction was performed using two primers, Primer 3 (SEQ ID NO: 17) and Primer 4 (SEQ ID NO: 18).
  • the composition of the reaction solution in the reaction was as follows, using the above cDNA 1 ⁇ 1 as type I, 11 volumes of Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE), primer 1 (SEQ ID NO: 17) and primer 4 (SEQ ID NO: 18) was added to each of 0.5 M, dNTPs was added to 200 ⁇ l, and the buffer attached to the enzyme was added to 51 to make a liquid volume of 501.
  • PCR reaction is performed at 94 ° C A cycle of 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 minutes for 2 minutes was repeated 35 times, and a final extension reaction for 72 minutes was performed. Further, the PCR reaction product was designated as type ⁇ , and a PCR reaction was performed using two primers, primer 5 (SEQ ID NO: 19) and primer 6 (SEQ ID NO: 20).
  • the composition of the reaction solution was prepared by using the above PCR reaction product (1 zl) as type III, 1 ⁇ 1 amount of Hu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE), primer 5 (SEQ ID NO: 19) and primer 16 ( SEQ ID NO: 20) was added to each of 0.5 iM, dNTPs was added to 200 M, and buffer attached to the enzyme was added to 5 ⁇ 1, to obtain a liquid volume of 501.
  • PCR reaction repeat the cycle at 94 ° C for 1 minute, 96 ° C for 20 seconds, 60 hours, 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes 35 times, and finally perform the extension reaction at 72 ° C for 7 minutes.
  • STRATAGENE Hu Turbo DNA Polymerase
  • the PCR reaction product and the plasmid vector PME18S were digested with restriction enzymes EcoRI and Spel 37 overnight. 1% agarose gel electrophoresis to cut out 2 Kbp DNA fragment (SGLT homolog) and 3 Kbp DNA fragment (pME18S)
  • the SGLT homolog was subcloned into PME18S according to the prescription of the company. This was introduced into E. coli DH5Q !, and clones having cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin.
  • a cDNA sequence SEQ ID NO: 15
  • SEQ ID NO: 14 novel NaV Dalco-Stranspo overnight proteins containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) were designated as human SGLT homologs.
  • the transformant was named Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2193.
  • a cDNA sequence (SEQ ID NO: 16) encoding the SGLT homolog protein containing The transformant was named Escherichia coli DH5 / TKD-l.
  • Example 1 Cloning of Human SGLT Homolog Gene Upstream Region and Determination of Nucleotide Sequence
  • the human genomic gene (CL0NTECH) was used as type III, and two primers 1 (SEQ ID NO: 1) and primer 1 2 (SEQ ID NO: 2) were used. PCR reaction was performed. In the reaction, the genomic DNA 11 was used as type III, the amount of Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE) 11, primer 1 (SEQ ID NO: 1) was 0.5 M, and the 2 (SEQ ID NO: 2) was added at 0.5 ⁇ , dNTPs at 200 ⁇ , and the buffer attached to the enzyme to give a volume of 501.
  • STRATAGENE Pfu Turbo DNA Polymerase
  • PCR reaction a cycle of 94 ⁇ 1 minute, 96 ⁇ 20 seconds, 65 ⁇ 30 seconds, 72 ° C ⁇ 4 minutes was repeated 40 times, and finally an extension reaction at 72 ° C ⁇ 7 minutes was performed. Further, using the PCR reaction product as type III, a PCR reaction was performed using two primers, Primer-1 K1 (SEQ ID NO: 3) and Primer-1 XI (SEQ ID NO: 4).
  • the composition of the reaction solution was prepared using the above PCR reaction product 11 as type III, 11 amounts of Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE), primer 1 K1 (SEQ ID NO: 3) and primer XI (SEQ ID NO: 4) was added to each of 0.5 M, dTs was 200 M, and the buffer attached to the enzyme was 51 to make a liquid volume of 501.
  • the PCR reaction is repeated at 94 ° C for 1 minute, followed by 40 cycles of 96 ° C for 20 seconds, 65 ⁇ 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes, and finally 72 ° C for 7 minutes. The reaction was performed.
  • the PCR reaction product and firefly and luciferase expression plasmid vector PGV-B2 were digested with restriction enzymes KpnI (10U) and Xhol (10U) at 37 ° C. overnight. Perform 1% agarose gel electrophoresis, cut out a 2.3 Kbp DNA fragment (upstream region of the human SGLT homolog gene) and a 4.8 Kbp DNA fragment (pGV-B2), and convert the DNA using a gel extraction kit (Qiagen). It was extracted and the human SGLT homolog gene upstream region was subcloned into PGV-B2 according to the recipe of the Reigeshon Kit (Takara Shuzo).
  • a search of Celela's SNP database revealed two SNPs in the upstream region of the human SGLT homolog gene (Figure 2).
  • C698 (translation start point 1564 bp upstream) T was named SNP_P1
  • A824 (translation start point 1438 bp upstream) T was named SNP-P2.
  • PGV-B2-human SGLT homolog gene upstream region PGV2254 DNA using the QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE).
  • PTB2254 10ng, reaction buffer 51, primer for PI mutagenesis (SEQ ID NO: 6) or primer for P2 mutagenesis (SEQ ID NO: 7) 125ng, dNTP mix 1 ⁇ I, distilled water into QuickSolution 31 This was added to make 501, and 11 of Pfu Turbo DNA Polymerase (2.5 U / 1) was added.
  • the PCR reaction was repeated at 95 ° C for 1 minute, followed by a cycle of 95 ° C for 50 seconds, 50 seconds and 68/12 minutes 18 times, and finally an extension reaction at 68 ° C for 7 minutes was performed.
  • Restriction enzyme Dpnl (1OU) was added to the PCR reaction product and reacted at 37 ° C. for 1 hour to cleave the methylated parent strand DNA. This was introduced into Escherichia coli XL-1 Blue, and a clone having the plasmid was selected on LB agar medium containing ampicillin. The sequence of each clone was analyzed to obtain a DNA sequence containing P2 base substitution (SEQ ID NO: 8).
  • the transformant was named Escherichiacoli XL1-Blue / pTB2255.
  • a DNA sequence containing the base substitution of P1 (SEQ ID NO: 9) was obtained.
  • the transformant was named Escherichia coli XLl_Blue / pTB2256.
  • a DNA sequence (SEQ ID NO: 10) containing both PI and P2 base substitutions was obtained.
  • the transformant was named Escherichiacoli DH5o; / pTB2257.
  • the human SGLT homolog gene upstream region (PTB2254) DNA was type III, and two primers, primer K2 (SEQ ID NO: 11) and primer XI (SEQ ID NO: 4), primer K3 (SEQ ID NO: 12) and PCR using primer XI (SEQ ID NO: 4), primer K1 (SEQ ID NO: 3) and primer X2 (SEQ ID NO: 13), primer K2 (SEQ ID NO: 11) and primer X2 (SEQ ID NO: 13) The reaction was performed.
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows: PTB2254 DNA lOng was used as type II, 11 volumes of Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE), 0.5 M of each primer set, 200 M of dNTPs, and enzyme. 51 of the attached buffer was added to make a liquid volume of 50 ⁇ 1.
  • the PCR reaction is After 94 ° C for 1 minute, a cycle of 96.20 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes was repeated 40 times, and finally an extension reaction at 72 ° C for 7 minutes was performed.
  • the PCR reaction product and the luciferase expression plasmid vector pGV-B2 were digested overnight with restriction enzymes KpnI (10U) and XhoI (lOU) at 37 ° C.
  • Promoter-less firefly Luciferase expression plasmid vector PGV-B2 (Futtsu Gene), SV40 virus early enhancer / promo + firefly Luciferase expression plasmid vector PGV-C2 (Futtsu Gene), human SGLT homolog gene upstream region + repo overnight plasmid K1X1 (CA), K1XKCT), KlXl (TA), KIXKTT), K2X1, 3X1, K1X2, K2X2
  • Each of pRL-TK as a control for internal standardization (Expression of sea pansy luciferase downstream of the thymidine kinase promoter of simple herpes virus, Nippon Gene) 0.5 g and FuGENE 6 (Roche) 31 with Opt i-MEM (Gibco_BRL) After adding to Step 1 and allowing to stand at room temperature for 15 minutes, add 10 I / wel 1 of each sample 4 wel 1 to human
  • Promoter activity was measured using Pitka Gene Dual 'Sea Pansy (Futtsu Gene). HepG2 cells were washed twice with PBS (200 ⁇ 1), the attached cell lysing agent was added to each well, and shaken at room temperature for 15 minutes. The cell lysate was transferred to a 96-well fluoro black plate (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). LuminoskanRS (Labsystems) was used to measure the amount of luminescence by Luciferase. E Tal 'luciferase activity was determined by adding 50 ⁇ l of each of the pikacadin luminescence reagents 11 to each well, and measuring the amount of luminescence for 5 seconds 1 second after the measurement delay time.
  • the luminescence reagent was added to each well, and the luminescence was measured for 1 second and 5 seconds after the measurement delay time.
  • the overnight activity of the promoter was shown as the ratio of the activity of the luciferase in each well to the activity of the luciferase in the pansy (Fig. 4). It was found that the X1K3 region is essential for the promoter activity of the human SGLT homolog, and that the presence of the K1K3 region further enhances the promoter activity. SNP showed no difference in promoter activity among the CA, CT, and TA types, but the TT type was found to have reduced activity.
  • Human SGLT homolog gene upstream region + repo overnight plasmid pTB2254 0.5 g and FuGENE 6 (Roche) 1.51 were added to Opti-MEM (Gibco_BRL) 501 and left at room temperature for 15 minutes.
  • Cells, Huh-7 cells (1 X 10 5 cells / 0.2 ml 10% FBS-supplemented DMEM medium / 48 well plate) by adding 4 zs 1 / wel 1 of each sample 10 z 1 / wel 1 and dexamethasone (Wako) was added at 0 to 3 M and cultured for 3 days. Promoter activity was measured using the Pizza Gene Luciferase assay system (Nippon Gene).
  • HepG2 and Huh-7 cells were washed twice with PBS (2001), and the attached cell lysing agent was added to each well, and shaken at room temperature for 15 minutes.
  • the cell lysate was transferred to a 96-well fluoro black plate (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) with 10 xl of each well.
  • the luminescence by luciferase was measured using a 1420 ARVO SX multilabel counter (Wallac), adding a Pitka Gene luminescence reagent to each well, and measuring the luminescence for 10 seconds (Fig. 5).
  • Dexamethasone was found to promote the activity of the upstream region of the human SGLT homolog gene.
  • the human SGLT homolog promoter of the present invention contains a sequence of regulae, it usually has an activity that reflects the expression mode of the human SGLT homolog that is closer to the human body as compared to those that do not contain them. Therefore, it can be used as a mouth motor to be incorporated into a vector used for treatment of human diseases, setting of a drug screening system, and the like under conditions closer to the human body.

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Description

明細書 ヒト SGLT ホモログプロモ一夕一およびその用途 技術分野
本発明は遺伝子発現用新規プロモー夕一およびその用途に関する。具体的には、 ヒト SGLT ホモログ遺伝子のプロモータ一領域を含有する D N A、当該 D N Aで形 質転換された形質転換体、 ヒト SGLTホモログプロモータ一活性を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。 背景技術
グルコースが細胞内外を移行するには、 細胞膜上に糖輸送担体と呼ばれる膜夕 ンパクが必要である。
グルコースの輸送担体は、 受動輸送担体である促通拡散型グルコーストランス ポー夕一 （GLUT)と Na+イオン輸送と共役することでグルコースを濃度勾配に逆ら つて輸送する能動輸送担体である Na+/グルコーストランスポ一ター （SGLT)に大 別される。 GLUTは、 8種類のァイソフォームが存在し、 分子量約 5万の細胞膜を 12 回貫通する共通構造を有している。
SGLT は、 分子量 7. 5万の細胞膜を 14回貫通する共通構造を有している。
日本臨床 55， 1997、 増刊号、 糖尿病 I、 59-64には SGLT1および 2の機能や発現 部位が概説されている。
ヒト SGLT1 は、 小腸、 腎臓に特異的に発現しグルコースに対して高親和性で輸 送能は小さく、 ヒト SGLT2 は、 腎臓特異的に発現しグルコースに対して低親和性 で輸送能は大きい事が知られている。 SGLTは、 グルコースの小腸からの吸収と、 腎臓から一旦尿中に排出されたダルコ一スを再吸収する役割を担っている。
糖尿病モデルラットにおいて、 SGLTを阻害することで、 腎臓におけるダルコ一 スの再吸収を抑制し、 尿中にグルコースを排出することで血糖を降下する作用が 示されている。 (Di abetes 48 : 1794-1800, 1999)
これまで、 滕 ]3細胞、 肝細胞では、 受動輸送担体である GLUT2 が主に発現して いると考えられてきた。 GLUT2 はグルコースに対する低い親和性と高い最大輸送 能を特徴とする。 滕 /3細胞では、 血糖値に応じてグルコースを取り込み、 ダルコ キナーゼと共にグルコース濃度依存性のィンスリン分泌作用を示すためのダルコ ースセンサーとして機能していると考えられている。 肝細胞では、 細胞内外のグ ルコース濃度勾配に従って、 食後高血糖時には血中グルコースを細胞内に取り込 み、 空腹時にはグリコーゲン分解、 あるいは糖新生によって細胞内で作られたグ ルコースを血中に放出する糖輸送担体として機能している。
ヒト SGLT1は、小腸細胞において消化管ホルモンである GLP- 2の作用で細胞内か ら膜表面に移行し、 糖取 り込み活性が 3倍に増加する とい う報告 (Am. J. Phys i o l . 273 R1965-R1 971 , 1997)がある。 発明の開示 .
現在使用されているインスリン分泌促進薬 （SU剤） は、 塍 細胞の KATPチャネル を閉鎖することにより、 血糖値に関わらず強制的にインスリンを分泌させる。 従 つて、 血糖コントロールが難しく低血糖を起こしたり、 過剰なインスリン分泌に より肥満を誘発したりする副作用があると考えられている。 また、 平均して 10年 で薬が効かなくなる SU剤の二次無効と呼ばれる現象が起きるが、 滕 0細胞に疲弊 を起こすのが原因とも考えられている。
SGLTホモログ機能を賦活化することにより、塍 /3細胞への糖取り込みを促進し、 血糖値依存性のインスリン分泌を亢進することが期待できる。 また、 SGLT機能の 賦活化薬には、 現在使用されているインスリン分泌促進薬 （SU剤） の前記副作用 は起きないものと期待される。
肝細胞においては、 GLUT2が空腹時は肝臓から血中へグルコースを放出するのに 対して、 SGLTホモログは細胞内外のグルコース濃度勾配に関わらず血中から肝臓 への糖取り込みを促進するものと考えられ、 肝臓から血中への糖放出を抑制する ことが期待でき、 糖尿病患者に認められる空腹時高血糖を低血糖などの副作用を 起こさずに抑制することが期待できる。
さらに、 SGLT阻害薬は、 腎臓からの糖の再吸収を抑制することで血糖を下げる ことができ、 肝臓への糖取り込みを抑制することで脂肪合成を抑制することが期 待できる。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト SGLTホモログ遺伝子発現作用物質を 探索するスクリ一エング方法の確立を目指して、ヒト SGLTホモログゲノム遺伝子 を取得することに成功した。この遺伝子を PCR処理してヒト SGLTホモログをコ一ド している構造遺伝子の上流部分 2.3kb DNAを取得し、 下流にレポ一夕一遺伝子 としてルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミド DNAを構築し、該 DNAで 形質転換された HepG2細胞でのルシフェラーゼ活性を測定することにより、ヒト SGLTホモログ構造遺伝子上流部分 2.3kb DNAに、ヒト SGLTホモログプロモータ —を見出すことが出来た。 さらに詳細な解析の結果、 ヒト SGLTホモログの発現を 制御していると思われるレギュレーター配列を見いだした。
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究した結果、本発明を完成した。 すなわち本発明は、
(1) ヒト SGLT ホモログのプロモ一夕一領域を含有する DNA、
(2) ヒト SGLTホモログのレギユレ一夕一配列を含むプロモータ一領域を含有す る DNA、
(3) レギュレーター配列が PPRE (Peroxisome Prol iferator Response Element) を含有する配列である上記 （2) 記載の DNA、
(4) PPREを含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1334番目ない し第 1339番目の塩基配列を含有する配列である上記 （3) 記載の DNA、
(5) レギュレーター配列が HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4) 結合配列を含 有する配列である上記 （2) 記載の DNA、
(6) HNF4結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1720 番目ないし第 1731番目の塩基配列を含有する配列である上記（5)記載の DNA、
(7) レギユレ一ター配列が IsllUslet 1)を含有する配列である上記 （2) 記載 の DNA、
(8) Isll (Islet 1) 結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配 列の第 687番目ないし第 692番目または第 2149番目ないし第 2154番目の塩基配列を 含有する配列である上記 （7) 記載の DNA、
(9) レギユレ一夕一配列が HNF5 (Hepatocyte Nuclear Factor 5) 結合配列を含 有する配列である上記 （2) 記載の DNA、
(10) HNF5結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1123 番目ないし第 1128番目の塩基配列を含有する配列である上記（9)記載の DNA、
(1 1) プロモー夕一領域が配列番号： 5の第 1番目ないし第 2254番目で表され る塩基配列またはその一部を含有する塩基配列である上記 （1) または （2) 記 載の DNA、
(1 ) ヒト SGLTホモログが配列番号： 14で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である上 記 （1) または （2) 記載の DNA、
(13) 上記 （1) または （2) 記載の DNAを含有する組換えべクタ一、
(14) ヒト SGLTホモログのプロモーター領域の発現制御下に構造遺伝子を有す る DNAを含有する上記 （1 3) 記載の組換えべクタ一、
(1 5) 上記 （14) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(16) 上記 （1 5) 記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒト SGLTホモ ログプロ ΐ—夕一活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(17) 上記 （1 5) 記載の形質転換体を用いることを特徴とする糖取り込みを 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(18) 上記 （1 5) 記載の形質転換体を用いることを特徴とする坊糖尿病薬ま たは抗高脂血症薬のスクリーニング方法、
(19) 上記 （1 5) 記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒト SGLTホモ ログプロモータ一活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ用キッ卜、
(20) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （19) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られるヒ卜 SGLT ホモログプロモーター活性を促 進または阻害する化合物またはその塩、
(21) 上記 （1 7) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる糖取り込みを 促進または阻害する化合物またはその塩、
(22) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （19) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られるヒト SGLT ホモログプロモーター活性を促 進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物、
( 2 3 ) 上記 （1 7 ) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる糖取り込みを 促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物、
( 2 4 ) ヒト SGLTホモログプロモーター活性の促進または阻害作用を有する化合 物またはその塩を含有してなる糖取り込みの促進または阻害剤、
( 2 5 ) ヒト SGLTホモログプロモータ一活性の促進または阻害作用を有する化合 物またはその塩を含有してなる抗糖尿病薬または抗高脂血症薬、
( 2 6 )糖取り込みの促進または阻害剤を製造するためのヒト SGLTホモログプロ モーター活性の促進または阻害作用を有する化合物またはその塩の使用、
( 2 7 )抗糖尿病薬または抗高脂血症薬を製造するためのヒト SGLTホモログプロ モーター活性の促進または阻害作用を有する化合物またはその塩の使用、
( 2 8 ) ヒ卜 SGLTホモログプロモーター活性の促進または阻害作用を有する化合 物またはその塩を投与することを特徴とする糖取り込みの促進または阻害方法、 ( 2 9 ) ヒト SGLTホモログプロモー夕一活性の促進または阻害作用を有する化合 物またはその塩を投与することを特徴とする糖尿病または高脂血症の予防 ·治療 方法、 などに関する。 図面の簡単な説明
図 1はヒト SGLTホモログの疎水性プロット図を示す図面である。
図 2はヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域に存在する SNPを示す図面である。 図 3はヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域の欠失変異体を示す図面である。' 図 4はシーパンジー ·ルシフェラーゼ活性を 1としたときのヒト SGLTホモログ 遺伝子上流領域におけるプロモーター活性の値のグラフを示す図面である。
図 5はヒト SGLTホモ口グ遺伝子上流領域 +レポ一夕一を導入した HepG2細胞およ び Huh- 7細胞において、デキサメタゾン 0〜3 Mの添加により促進される、ヒト SGLT ホモ口グ遺伝子上流領域におけるプロモーター活性の値 （ルシフェラーゼによる 発光量） のグラフを示す図面である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するヒト SGLTホモログ （以下、 ヒト SGLTホモ口 グと称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マ ウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝 細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細 胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、杯細胞、 内皮細胞、平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T 細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細 胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部 位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由 来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1 4で表わされるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するヒト SGLTホモログとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1 4で表されるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 4で表されるァ ミノ酸配列を含有するヒト SGLTホモログと実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 グルコースの能動輸送活性などが挙げ られる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または 薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 グルコースの能動輸送活性が 同等 （例、 約 0. 0 1〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜 10倍、 より好ましく は 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
グルコースの能動輸送活性などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行うこと が出来るが、 例えば、 Cloning and functional expression of an SGLT-l-like protein from the Xenopus laevis intestine (Am. J. Phisiol. 76: G1251-G1259, 1999)に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。 また、 本発明で用いられるヒト SGLTホモログとしては、 例えば、 ①配列番号： 14で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程 度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 14で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好 ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が揷 入されたアミノ酸配列、 ④配列番号： 14で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好 ましくは数（ 1〜 5 )個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆ るムティンも含まれる。
前記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、 欠失または置換の位置は、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 14で表わ されるアミノ酸配列を含有するヒト SGLTホモログをはじめとする、 本発明で用い られるヒト SGLTホモログは、 C末端が力ルポキシル基 （一 COOH) 、 カルポキ シレート（一 COO-) 、 アミド (一 C〇NH2) またはエステル (-COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、 メチル、ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの（^ _ 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチ ルなどの C 6— 1 2ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C ^ 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C 2アルキ ル基などの C 7— 1 4 7ラルキル基、 ピバロィルォキシメチル基などが用いられる。 本発明で用いられるヒト SGLTホモログが C末端以外にカルボキシル基 （または カルポキシレー卜) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステ ル化されているものも本発明で用いられるヒト SGLTホモログに含まれる。 この場 合のエステルとしては、 例えば前記した C末端のエステルなどが用いられる。 さらに、本発明で用いられるヒト SGLTホモログには、 N末端のアミノ酸残基（例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノィルなどの C^— 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内 で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば— O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダ ゾ一ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などの 6アルカノィル基などの ァシル基など） で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合夕 ンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログの具体例としては、 例えば、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列を含有するヒト塍臓由来のヒト SGLTホモログなどが あげられる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログの塩としては、 生理学的に許容される酸 (例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属） などとの塩が用いられ、 と りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例 えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログまたはその塩は、 前述したヒトゃ温血動 物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもで きるし、 ヒト SGLTホモログをコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養する ことによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製 造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ 卜グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログまたはその塩、 またはそのアミド体の合 成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹 脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル榭脂、 ベンズヒドリ ルァミン樹脂、アミノメチル榭脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール榭脂、 4 _メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフ ェニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2 ' , 4' -ジメト キシフエ二ル―ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 - (2 ' , 4' -ジメトキシフ ェニル— Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このよ うな樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的 とするタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させ る。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイ ド結合形成反応を実施し、 目的のタンパ ク質またはそれらのアミド体を取得する。
前記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特にカルポジイミド類がよい。 カルポジイミ ド類としては、 DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル - Ν' - (3-ジメ チルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性化には ラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t , HOOB t ) と共に保護アミノ酸を直接樹脂に添 加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは HOOB tエステルとして あらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。 保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、
N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないように することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 t一ペンチルォキシカル ポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシカルボ二 ル、 Π-Ζ、 Br_Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタ ロイル、 ホルミル、 2一二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニルホスフィノチ オイル、 Fmocなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シク口へキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t 一ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 — アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラ二ル基、 t _ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 C l 2- Bz l、 2 —ニトロベンジル、 Br-Z、 t _ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、例えば、 Tos、 4 -メトキシ- 2， 3, 6 - トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmocなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、アジド、活性エステル〔アルコール (例えば、ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5- トリクロ口フエノール、 2， 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パ ラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたも のとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d -炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 前記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C 〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエ ノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフィ ド、 1， 4-ブタンジチォ一ル、 1， 2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファン のィンドール保護基として用いられるホルミル基は前記の 1， 2-エタンジチオール、 1 , 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末 端アミノ酸の a;—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドと C末端のカル ポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを前記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については前記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク 質を精製した後、 前記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質 を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる タンパク質のエステル体を得るには、 例えばカルポキシ末端アミノ酸の a—力 ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質 のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。 本発明で用いられるヒト SGLTホモログまたはその塩は、 公知のタンパク質の合 成法に従って製造することができる。 タンパク質の合成法としては、 例えば、 固 相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用いられる タンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質を 製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
① M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti、ペプチド 'シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年）
② Schroederおよび Luebke、ザ'ぺプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） ④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 'カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ るヒト SGLTホモログを精製単離することができる。 前記方法で得られるヒト SGLT ホモログが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法ある いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 本発明で用いられるヒト SGLTホモログをコードする DNAとしては、 前述した 本発明で用いられるヒト SGLTホモログをコ一ドする塩基配列を含有するものであ ればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラ リー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 '組織由来の c DNA ライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリ一に使用するべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total R N Aまたは mR N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T_P C R法と略称する） によって増幅することもできる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 5または配列番号： 1 6で表される塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 1 5または配列番号： 16で表される塩基配列とハイストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明で用いられるヒト SGLTホモログと実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aであ れば何れのものでもよい。
配列番号： 1 5で表される塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 5で表される塩基配列と 約 50 %以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 より 好ましくは約 80 %以上、特に好ましくは約 90 %以上、最も好ましくは約 95 % 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 16で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八イブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 16で表される塩基配列と 約 50%以上、 好ましくは約 60 %以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 より 好ましくは約 80%以上、特に好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95 % 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー'クロ一ニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に 従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60 〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65 °Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するヒト SGLT ホモログをコードする DNAとしては、 配列番号： 1 5または配列番号： 16で 表される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられるヒト SGLTホモログを完全にコードする DN Aのクロ一ニン グの手段としては、 本発明のヒト SGLTホモログをコードする塩基配列の一部分を 有する合成 DNAプライマーを用いて P CR法によって増幅するか、 または適当 なべクタ一に組み込んだ DN Aを本発明のヒト SGLTホモログの一部あるいは全領 域をコードする DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブ リダイゼ一シヨンによつて選別することができる ハイブリダイゼーシヨンの方 法は、例えば、モレキュラー 'クロ一ニング（Molecular Cloning) 2nd(J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書 に記載の方法に従って行なうことができる。 DNAの塩基配列の変換は、 P CRや公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LAPCR 法や Gapped duplex法や Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に 従って行なうことができる。
クローン化されたヒト SGLTホモログをコ一ドする DNAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。該 DN Aはその 5 '末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のヒト SGLTホモログのプロモ一夕一領域を含有する DNAは、後述のレギュ レーター配列を含んでいてもよく、 ヒト SGLTホモログのプロモーター活性を有す る MAであればいかなるものであってもよい。
具体的には、配列番号： 5の第 1番目ないし第 2254番目で表される塩基配列また はその一部を含有するものであればいかなるものであってもよい。
また、 ヒトまたは他の哺乳動物の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免 疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細 胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細 胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組 織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視 床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脬臓、 腎臓、 肝臓、 生殖 腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋などに由来のゲノム DNA、 c DNA, 合成 DNAのい ずれでもよい。
本発明のヒト SGLTホモログのプロモーター領域を含有する組換え DNAは、具体的 には、 次のようにして得ることができる。
まず、ヒト SGLTホモログ cDNAのアミノ酸配列に対応する塩基配列をプローブと して例えば、 EMBL3べク夕一に組み込まれたヒト遺伝子ライブラリ一を公知の方法 でスクリーニングし、このプローブと反応する λファージのクローンを得る。この ファージクローンより DNAを抽出し、組みこまれているヒト遺伝子部分の制限酵素 地図を作成し、 cDNAの最上流域プローブと反応する制限酵素消化による DNA断片を、 特に限定されないが、 PCDベクタ一、 cDM8ベクタ一（ Aruffo， A.と Seed, B. ( 1987 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8573— 8577 )、レトロウイルスベクター （ Cone, R. D.と Mulligan, R. C. ( 1984 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81， 6349-6353 ) など動物細胞用のもの、 pUCベクタ一 （ Vieira, J.と Messing, J. ( 1987 )， Methods in Enzymology, 153, 3-11 )、 pCR- bluntベクタ一（Ausubel, F. M.ら ( 1994 ), Current Protocols in Molecular Biology )など大腸菌用のプラスミ ドなどに再クロ一ニングする。 クローニングした DNAの塩基配列を決定し、例えば cDNAの塩基配列と比較検討することにより遺伝子上の翻訳開始コドンの位置を知 ることができる。 また、既知の cDNAの 5' 末端と塩基配列を比較することにより該 遺伝子の転写開始点を知ることもできる。 また、 全シーケンスのモチーフ検索を 行うことで、 既知の転写制御因子の結合部位を知ることができる。
得られた DNAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化した り、 リンカ一を付加したりして使用することができる。
さらにプロモータ一の活性を調べるためにはプロモータ一の下流に検出可能な 構造遺伝子を連結すればよい。 プロモータ一領域の下流に連結される構造遺伝子 としては、種々のレポ一ター遺伝子が用いられる。 レポ一夕一遺伝子としては、ル シフェラ一ゼ遺伝子、 CAT (ク 口ラムフエニコ一ルァセチル転移酵素 (Chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子、アル力リフォスファターゼ遺伝子 の他に、 j8-ガラクトシダーゼ遺伝子が汎用されているが、他のいかなる構造遺伝 子であっても、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。上記構造遺伝子を ベクターに組み込むには、プロモー夕一領域の下流に存在する適当な制限酵素切 断部位に、上記構造遺伝子が正しく転写される方向に連結すればよい。
上記組換えベクターにより形質転換する宿主としては、例えば、ェシエリヒア属 菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ - サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1 968)〕 ， J M 1 03 〔ヌクイレック ·ァシッズ . リサーチ (Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (198 1)〕 ， J Μ 109 , J A 2 21 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) , 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ ·モ レキユラ一 ·バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネテ イツクス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サチルス （Bacillus subtilis) M 1 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207 - 2 1 〔ジャーナル · ォブ ·バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 98' 4)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22 R—， NA 87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B - 12 , シゾサッ力,ロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCY C I 91 3, NC YC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) などが 用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NP Vの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™ 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N； BmN細胞） など が用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞（以上、 Vaughn, J.L.ら、イン ·ヴイボ (In Vivo) ,13, 213-217 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 3 1 5巻， 592 (1 985)〕 。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハムス ター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CH〇 (d h f r-) 細胞と略記） ， マウス L細 胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3， マウス繊維芽 細胞 3 T 3— L 1，ヒト肝臓ガン細胞 He pG2 (以下、 He p G 2細胞と略記）、 ヒト骨肉腫細胞 MG— 63 (以下、 MG— 63細胞と略記） 、 ヒト FL細胞、 白 色脂肪細胞、 卵細胞、 ES細胞 ( Evans, M. J。と Kaufman, K. Η. ( 1981 ) Nature, 292, 154 )、 また適当な分化条件により分化誘導された細胞などが用いられる。 なかでも、 動物細胞、特に白色脂肪細胞が用いられ得る。 また動物個体への DNA 移入への一過程としての卵細胞、あるいは ES細胞 （Evans, M. J.と Kaufman, K. Η. ( 1981 ) ature, 292, 154 )も使用される。
これらの細胞への形質転換の方法としては、リン酸カルシウム法（ Grahamら (1973)Virology, 52， 456 )、エレクトロボレ一シヨン法（石崎ら （ 1986 ) 細胞ェ 学， 5， 577 )、マイクロインジェクション法などが用いられる。
より具体的には、 ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジ ングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 2 1 10 (1972) やジーン （Gene) ， 1 7巻， 1 07 (1982 )などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル ·ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 (1
979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ 'イン'ェンザィモロジ一（Methods inEnzymology) , 1 94巻， 1 82— 187 (1 991) 、 プロシ一ジングズ ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) など に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ テクノロジー
(Bio/Technology), 6, 47-55 (1988))等に記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 ( 1 995) (秀潤社発行）、ヴィロロジ一（Virology) , 52巻， 456 (1 973 )に記載の方法に従って行なうことができる。
上記形質転換体は、特定の化合物の存在下に培養し、培養物中の遺伝子産物の量 を測定し比較することにより、該化合物のプロモ一夕一活性のコントロール能を 知ることができる。
該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法で行なう。宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に使用される培地としては液 体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキ ストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、，例えば、 アンモニゥム塩 類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ' リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆 粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩 化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M9培地 〔ミラー (Miller) ， ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ · イン ·モレキユラ一 ·ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19 72〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモ一夕一を効率よく働かせるために、 例えば、 33—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿 主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間行な レ 、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜4 で約 6〜24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングズ'ォブ ' ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 % カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 プロシージングズ 'ォブ - ザ ·ナショナル。アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1巻， 5330 (1984) 〕 が挙げら れる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20° (〜 3 5°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C.，ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の ρΗは約 6. 、2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Seience) ， 122巻， 5 0 1 (1 952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8巻， 396 (1 959)) , RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メデ イカ レ ·ァソシェ——ション (The Journal of the American Medical Associat ion) 1 99巻， 51 9 (1 967)〕 ， 1 99培地 〔プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー'ザ'バイオロジカル ·メディスン （Proceedingof the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 ( 1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30 〜 40°Cで約 1 5〜60 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
, 本発明のプロモー夕一領域に含まれるレギュレーター配列としては、 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列の第 1番目ないし第 2254番目の塩基配列中、 ヒ ト SGLTホモログの転写制御因子が結合し得る配列であれば、 いかなるものであつ てもよいが、例えば、配列番号： 5で表される塩基配列の第 1334番目ないし第 1339 番目の塩基配列を有する PPRE (Peroxisome Proliferator Response Element)を含 有する配列、 配列番号： 5で表される塩基配列の第 1720番目ないし第 1731番目の 塩基配列を有する HNF4(Hepatocyte Nuclear Factor 4)結合配列を含有する配列、 配列番号： 5で表される塩基配列の第 687番目ないし第 692番目または第 2149番目 ないし第 2154番目の塩基配列を有する Isll (Islet 1) 結合配列を含有する配列、 配列番号： 5で表される塩基配列の第 1123番目ないし第 1128番目の塩基配列を有 する HNF5(Hepatocyte Nuclear Factor 5)結合配列を含有する配列等があげられる c 即ち、 本発明の DNAは該レギユレ一夕一配列を含んでいてもよく、 該レギュ レーター配列を複数個含有していてもよい。
配列番号： 5で表される塩基配列の第 1番目ないし第 2254番目の塩基配列の一部 を含有する塩基配列としては、 上記のレギユレ一夕一配列を含有する塩基配列で あれば、 いかなるものでもよいが、 具体的には、 配列番号： 5で表される塩基配 列の第 1806番目ないし第 2254番目の塩基配列、 配列番号： 5で表される塩基配列 の第 958番目ないし第 2254番目の塩基配列などがあげられる。
なお、配列番号： 5で表される塩基配列の第 1番目ないし第 2254番目の塩基配列 のうち、 （1) 第 698番目の Cが Tに変換した塩基配列、 （2) 第 824番目の Aが こ 変換した塩基配列、 （3) 第 698番目の Cが Tに、 第 824番目の Aが Tに変換した塩基 配列を有する塩基配列 （配列番号： 8、 9、 1 0で表される塩基配列） またはそ の一部も本発明のプロモー夕一領域として使用することができる。
本発明の DNAは、 ヒト SGLTホモログのプロモーター領域を含有する DNAで あるため、 上記の形質転換体を用いることによって、 ヒト SGLTホモログプロモ一 ターの活性を促進または阻害する化合物 （例えば、 糖取り込みを促進または阻害 する化合物） またはその塩をスクリーニングすることが可能となる。 以下に該ス クリーニング方法、 スクリーニング用キットおよびこれらスクリーニング方法、 スクリーニング用キットを用いて得られるヒト SGLTホモログプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩について具体的に説明する。
(1) ヒ卜 SGLTホモログプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物（例え ば糖取り込みを促進又は阻害する化合物） 又はその塩をスクリーニングする方法 上述の本発明の DNAで形質転換された形質転換体は、 本発明のヒト SGLTホモ ログプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩を探索し、 ま たは決定するために有用である。
本発明のヒト SGLTホモログプロモーターの活性を促進または阻害する化合物ま たはその塩の決定方法においては、 本発明の形質転換体を試験化合物と接触させ た場合と本発明のヒト SGLTホモログプロモー夕一領域を含有しない形質転換体を 試験化合物と接触させた場合のポリペプチドの発現量を測定し比較することなど を特徴とする。
該試験化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよい し、 公知の化合物であってもよい。
発現されるポリペプチドとしては、 上記の構造遺伝子 （好ましくはレポ一夕一 遺伝子） がコードするポリペプチドなどが用いられる。
ポリペプチドの発現量の測定方法としては、 例えば、 Brasier, A.R.ら （1989) Biotechniques vol.7, 1116-1122の記載に準じた方法により、 ルシフェラ一ゼ活 性を測定することなどがあげられる。
(2) ヒト SGLTホモログプロモーターの活性を促進または阻害する化合物'（例え ば、 糖取り込みを促進または阻害する化合物） またはその塩をスクリーニングす るために用いるスクリーニング用キッ卜
本発明のヒト SGLTホモログプロモーターの活性を促進または阻害する化合物ま たはその塩の決定用キットは、 上述の形質転換体を用いることを特徴とするが、 本発明のヒト SGLTホモログプロモーターの活性を促進または阻害する化合物また はその塩の決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。
①スクリーニング試薬
1.細胞培養用培地
Dulbbecco' s modified Eagle' s MEM (ギブコ社製）にゥシ胎仔血清（ギブコ社製） を 10%添加したもの。
2.細胞分化用培地
Dulbbecco' s modified Eagle' s MEM (ギブコ社製）にゥサギ血清（ギブコ社製）を 5%添加したもの。
3. ヒト SGLTホモログプロモータ一活性測定用プラスミド
本発明のヒト SGLTホモログプロモータ一配列およびヒト SGLTホモログプロモータ 一の下流に構造遺伝子 （例、 ルシフェラーゼ遺伝子） を挿入した pGV- B2(二ツホ。ンシ' -ン社製）プラスミド DNA 4. t主細胞株
HepG2細胞（ヒト肝癌細胞株： ATCC HB 8065), Huh- 7細胞（ヒト肝癌細胞株）， ヒト初代培養肝細胞
5.試験化合物
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 2 0°Cにて保存し、 用時に細胞分化培養用 培地にて 1 xMに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチル ホルムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
②スクリーニング法
宿主細胞株を 96穴マイクロプレートに lxlO5/穴ずつ播種し、 ー晚 37° (：、 5% C02孵 卵器で培養する。
本発明のヒト SGLTホモログプロモ一夕一活性測定用プラスミドを 1 g/穴ずつ、 細胞内に導入する。 導入後、 1時間で試験化合物を O.lml/穴ずつ添加し、 37°C、 5% C02孵卵器で 48時間培養する。
培養後、 ピツカジーン LT (東洋インキ社製）を O. lml/穴ずつ加え 5分撹拌後、 96穴プ レート測定装置（アマシャム-フアルマシア社製） で発光活性を測定する。
(3) 上記 (1) のスクリーニング方法または (2) のスクリーニング用キット を用いて得られるヒト SGLTホモログプロモーター活性を促進または阻害する化合 物 （例えば、 糖取り込みを促進または阻害する化合物） またはその塩。
上記 (1) のスクリーニング方法または (2) のスクリーニング用キットを用 いて得られるヒト SGLTホモログのプロモーター活性を上昇 .促進する化合物が見 いだせれば、該化合物は糖取り込みを上昇'促進させることからいわゆる生活習慣 病 （糖尿病など） などの予防 ·治療剤としても用いられる。 即ち、 抗糖尿病薬な どとして用いることができる。
また、該化合物がプロモーター活性を低下 '阻害させるものであれば、該化合物 は脂質産生を低下'阻害することから抗高脂血症薬等として用いることができる。 上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化 合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または 酸性アミノ酸との塩などがあげられる。 無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などの アルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 な らびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6ールチジン、 エタノールァミン、 ジェ夕ノー ルァミン、 トリエタノ一ルァミン、 シク口へキシルァミン、 ジシクロへキシルァ ミン、 N , N， 一ジベンジルェチレンジァミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
該化合物またはその塩を上記の疾患の予防および Zまたは治療剤として使用す る場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、 該化合物またはその塩は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知 の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般 に認められた製剤実埯に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量 が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること ができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナト リウムなど） 等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタ ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコ一ル、 ポリエチレングリコー ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80 (TM) 、 HCO- 50) 等と併用してもよい。油性液としては、例えば、 ゴマ油、大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等と併用してもよい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど）、安定剤 (例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレンダリコールなど)、. 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （60 k gとして） におい ては、 一日につき約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好 ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与 量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注 射剤の形では通常成人 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 0 1〜 3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、 I U P A C - I U B Commission on Biochemical Nomenclature 【こよる田各号あるレ ま 当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ 酸に関し光学異性体があり得る場合、特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C ： シ卜シン
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 1で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
実施例 1で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 1で用いられたプライマ一 K1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いられたプライマ一 XIの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1で得られたヒト SGLTホモ口グ遺伝子翻訳開始点の 2261bp上流から 8bp上 流領域の DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 2で用いられた P 1変異導入用プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 2で用いられた P 2変異導入用プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 2で得られた P 2の塩基置換の入った DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕 実施例 2で得られた P 1の塩基置換の入った DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
実施例 2で得られた P 1および P 2の両方の塩基置換の入った DNAの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 11〕
実施例 3で用いられたプライマ一 K2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
実施例 3で用いられたプライマ一 K3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 3で用いられたプライマ一 X2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
ヒト SGLTホモログタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 15〕
配列番号： 14で表されるアミノ酸配列を有するヒト SGLTホモログタンパク質を コードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
3' 非翻訳領域（2026-3140)を含むヒト SGLTホモログタンパク質をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
参考例 1で用いられたプライマ一 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
参考例 1で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
参考例 1で用いられたプライマー 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
参考例 1で用いられたプライマー 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
参考例 2で用いられたプライマー 7の塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕 参考例 2で用いられた 8の塩基配列を示す。
後述の参考例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH5a/pTB2193は、 2000年（平成 12年） 12月 22日から日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命ェ 学工業技術研究所： N I BH) に受託番号 F ERM BP— 7410として、 2 000年 （平成 12年） 12月 14日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 1 7 - 85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に受託 番号 I FO 1 651 6として寄託されている。
後述の参考例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichiacoli) DH5o!/TKD_lは、 200 1年（平成 13年） 6月 14日から日本国茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一に受託番号 FERM BP— 7629と して、 200 1年 （平成 13年） 6月 5日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17 - 85 (郵便番号 532 - 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I FO) に 受託番号 I FO 16648として寄託されている。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) XL卜 Blue/pTB2254は、 2001年 （平成 1 3年） 12月 6日から茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP— 781 8と して、 200 1年 （平成 13年） 1 1月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2- 1 7-85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に受託番号 I FO 16729として寄託されている。
実施例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) XL卜 BIue/pTB2255は、 2001年 （平成 1 3年） 12月 6日から茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センタ一に受託番号 FERM BP— 78 1 9と して、 200 1年 （平成 13年） 1 1月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2 - 1 7- 8 5 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F 0) に受託番号 I F〇 1 6730として寄託されている。
実施例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) XU- Blue/pTB2256は、 200 1年 （平成 13年） 12月 6日から茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 7820と して、 2001年 （平成 13年） 1 1月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2- 1 7-85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F〇） に受託番号 I F〇 1673 1として寄託されている。
実施例 2で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH5Q! /pTB2257は、 200 1年 （平成 13年） 12月 19日から茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP— 7832として、 200 1年 （平成 13年） 1 1月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 1 7 - 85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に受 託番号 I F〇 16732として寄託されている。 実施例
以下に、 参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本 発明はそれに限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いた遺伝子操作法は、 モレキュラー 'クローニング （Mo 1 e c u 1 a r c l o n i ng) に記載さ れている方法に従った。
参考例 1 ヒト塍臓由来 Na+/グルコーストランスポ一夕一タンパク質をコードす る cDNAのクローニングと塩基配列の決定
ヒト滕臓 cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマ一、 プライマー 3 (配 列番号： 17)およびプライマー 4 (配列番号： 18)を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成は前記 cDNA 1 ^ 1を铸型として使用し、 Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1 1量、 プライマ一 3 (配列番号： 17) およびプ ライマ一 4 (配列番号： 18) を各 0.5 M、 dNTPsを 200 Μ、 および酵素に添付の バッファ一を 5 1加え、 50 1の液量とした。 PCR反応は、 94°C · 1分の後、 96°C · 20秒、 60°C · 30秒、 72 · 2分のサイクルを 35回繰り返し、 最後に 72 · 7分の伸 長反応を行った。 さらに、 該 PCR反応産物を錶型とし、 2個のプライマ一、 プライ マー 5 (配列番号： 1 9) およびプライマー 6 (配列番号： 2 0) を用いて PCR 反応を行った。 該反応における反応液の組成は前記 PCR反応産物 1 zlを铸型とし て使用し、 Hu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1^1量、 プライマー 5 (配 列番号： 1 9) およびプライマ一 6 (配列番号： 20) を各 0.5 iM、 dNTPsを 200 M、および酵素に添付のバッファ一を 5^ 1加え、 50 1の液量とした。 PCR反応は、 94°C · 1分の後、 96°C · 20秒、 60 · 30秒、 72°C · 2分のサイクルを 35回繰り返し 最後に 72°C · 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応産物およびプラスミドベクター PME18Sを制限酵素 EcoRI, Spelで 37 、 一夜切断処理した。 1% ァガロースゲル電 気泳動し、 2 Kbp DNA断片（SGLTホモログ）， 3Kbp DNA断片（pME18S)を切り出し、 ゲ ルェクストラクシヨンキット （Qiagen社） を用いて DNAを抽出し、 ライゲ一シヨン キット (宝酒造社) の処方に従い、 SGLTホモログを PME18Sへサブクローニングし た。 これを大腸菌 DH5Q!に導入し、 cDNAを持つクロ一ンをアンピシリンを含む LB 寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 Na+ /ダルコ —ストランスポ一タ一タンパク質をコードする cDNA配列 （配列番号： 1 5) を得 た。 これらの,アミノ酸配列 （配列番号： 14) を含有する新規 NaVダルコ一スト ランスポ一夕一タンパク質をヒト SGLTホモログとした。 また形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli) DH5 α/ρΤΒ2193と命名した。
ヒト SGLTホモログの疎水性プロット図を図 1に示す。
参考例 2 ヒト肝臓由来 Na+/グルコーストランスポ一夕一タンパク質をコ一ドす る cDNAのクロ一ニングと塩基配列の決定
ClonCapture cMA Select ion Ki t (CL0NTECH社）の処方に従い、 ヒト肝臓 cDNAラ イブラリー（CL0NTECH社）からクローニングした。 ピオチン化プローブは、 ヒト SGLT ホモログ cDNAを铸型として、 プライマ一 7 (5' -ggtctgcgggggctgatgattg - 3，） （配列番号： 2 1) , プライマ一 8 (5' -aggctggcgctgggtatgagaac-3' ) (配 列番号： 2 2) を用いて PCR反応で増幅した 403 b 断片を使用した。 SGLT ホモ ログ cDNA の入った大腸菌の選択は、 プライマ— 3， 4 を用いてコロニー PCR で 行った。得られたクローンの塩基配列を解析した結果、 3'非翻訳領域 （2026-31 0) を含む SGLTホモログタンパク質をコードする cDNA配列（配列番号： 1 6 )を得た。 また形質転換体を大腸菌 （Escher ichi a col i) DH5ひ/TKD-lと命名した。
実施例 1 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域のクローニングと塩基配列の決定 ヒトゲノム遺伝子 （CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー 1 (配列番号： 1) およびプライマ一 2 (配列番号： 2) を用いて PCR反応を行った。 該反応におけ る反応液の組成は前記ゲノム DNA 1 1を铸型として使用し、 Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1 1量、 プライマー 1 (配列番号： 1) を 0. 5 M、 プ ライマー 2 (配列番号： 2) を 0· 5 Μ、 dNTPsを 200 Μ、 および酵素に添付のバッフ ァ一を 加え、 50 1の液量とした。 PCR反応は、 94 · 1分の後、 96 · 20秒、 65Τ · 30秒、 72°C · 4分のサイクルを 40回繰り返し、 最後に 72°C · 7分の伸長反応 を行った。 さらに、 該 PCR反応産物を铸型とし、 2個のプライマー、 プライマ一 K1 (配列番号： 3) およびプライマ一 XI (配列番号： 4) を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成は前記 PCR反応産物 1 1を铸型として使用し、 Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1 1量、 プライマ一 K1 (配列番号： 3) お よびプライマー XI (配列番号： 4) を各 0. 5 M、 d Tsを 200 M、 および酵素に添 付のバッファーを 5 1加え、 50 1の液量とした。 PCR反応は、 94°C ' 1分の後、 96°C · 20秒、 65^ · 30秒、 72°C · 3分のサイクルを 40回繰り返し、 最後に 72°C · 7分の伸 長反応を行った。該 PCR反応産物およびホタルつレシフェラ一ゼ発現プラスミドべ クタ一 PGV-B2 (二ツボンジーン社） を制限酵素 KpnI (10U)、 Xhol (10U)で 37°C、一 夜切断処理した。 1%ァガロースゲル電気泳動し、 2. 3 Kbp DNA断片（ヒト SGLTホモ ログ遺伝子上流領域）、 4. 8Kbp DNA断片（pGV- B2)を切り出し、 ゲルェクストラクシ ヨンキット （Qiagen社）を用いて DNAを抽出し、 ライゲ一シヨンキット （宝酒造社） の処方に従い、 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域を PGV-B2へサブクローニングし た。 これを大腸菌 DH5ひに導入し、 cDNAを持つクローンをアンピシリンを含む LB 寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 ヒト SGLTホモ口 グ遺伝子翻訳開始点の 2261bp上流から 8bp上流領域の DNA配列 （配列番号： 5) を得 た。 また形質転換体を大腸菌 (Escherich ia col i) XL1- BIue/pTB2254と命名した。 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域 DNA配列には、 Is l l, HNF5, PPAR, HNF4 等の 転写因子の認識結合配列、 RNAポリメラ一ゼが結合する TATA boxが存在した（図 2)。 実施例 2 SNPを有するヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域の作製
Celela社 SNPデータべ一スを検索すると、ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域に 2ケ所の SNPが見つかった （図 2) 。 C698 (翻訳開始点 1564bp上流） Tを SNP_P1、 A824(翻訳開始点 1438bp上流） Tを SNP-P2と命名した。
SNP PI, P2の塩基置換は、 PGV-B2-ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域（PTB2254) DNAに QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社） を用い て導入した。 PTB2254 10ng、 反応 buf f er 5 1、 PI変異導入用プライマ一 （配列 番号： 6) あるいは P2 変異導入用プライマ一 （配列番号： 7) 125ng、 dNTP mix 1 β I、 QuickSolution 3 1に蒸留水を添加して 50 1とし、 Pfu Turbo DNA Polymerase (2.5U/ 1)を 1 1添加した。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 50秒、 · 50秒、 68 · 12分のサイクルを 18回繰り返し、 最後に 68°C · 7分の伸長反応 を行った。 該 PCR反応産物に制限酵素 Dpnl(lOU)を添加し、 37°Cで 1時間反応し、 メ チル化された親鎖 DNAを切断した。 これを大腸菌 XL-1 Blueに導入し、 プラスミド を持つクローンを、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。 個々のクロー ンの配列を解析し、 P2 の塩基置換の入った DNA配列 （配列番号： 8) を得た。 ま た形質転換体を大腸菌 （Escherichiacoli) XL1 - Blue /pTB2255と命名した。 P1の 塩基置換の入った DNA 配列 （配列番号： 9) を得た。 また形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli) XLl_Blue /pTB2256と命名した。 PI ,P2両方の塩基置換の入 つた DNA配列（配列番号： 10)を得た。また形質転換体を大腸菌（Escherichiacoli) DH5o;/pTB2257と命名した。
実施例 3 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域の欠失変異体の作製
ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域 （PTB2254) DNAを铸型とし、 2個のプライマ一 セット、 プライマー K2 (配列番号： 11) およびプライマー XI (配列番号： 4) 、 プ ライマー K3 (配列番号： 12) およびプライマ一 XI (配列番号： 4) 、 プライマー K1 (配列番号： 3)およびプライマ一 X2 (配列番号： 13) , プライマー K2 (配列番号： 11) およびプライマー X2 (配列番号： 13) を用いて PCR反応を行った。 該反応にお ける反応液の組成は前記 PTB2254 DNA lOngを铸型として使用し、 Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 1 1量、各プライマ一セットを各 0.5 M、 dNTPsを 200 M、および酵素に添付のバッファーを 5 1加え、 50^ 1の液量とした。 PCR反応は、 94°C · 1分の後、 96 .20秒、 65°C · 30秒、 72°C · 3分のサイクルを 40回繰り返し、 最後に 72°C · 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応産物およびホ夕ル ·ルシフェラ —ゼ発現プラスミドベクター pGV- B2 (二ツボンジーン社） を制限酵素 KpnI(10U)、 XhoI(lOU)で 37°C、一夜切断処理した。 1%ァガロースゲル電気泳動し、 1.3KbpDNA 断片（K2X1)、 450 bp DNA断片（K3X1)、 1.8 Kbp DNA断片（K1X2)、 0.8 Kbp DNA断片 (ΚΠ2)、 4.8 Kbp DNA断片（PGV-B2)を切り出し、 ゲルェクストラクシヨンキット (Qiagen社） を用いて DNAを抽出し、 ライゲーシヨンキット （宝酒造社） の処方に 従い、 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域を pGV- B2へサブクロ一エングした。 これ を大腸菌 DH5aに導入し、 DNAを持つクローンを、 アンピシリンを含む LB寒天培地 中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 ヒト SGLTホモログ遺伝子 上流領域 DNA配列 Xl， K3X1, K1X2, ΚΠ2を得た（図 3)。
実施例 4 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域 +レポ一夕一プラスミド導入細胞の作 製
プロモーターを含まないホタル ·ルシフェラ一ゼ発現プラスミドベクター PGV-B2 (二ツボンジーン社) 、 SV40ウィルス初期ェンハンサ一/プロモー夕一 + ホタル ·ルシフェラ一ゼ発現プラスミドベクタ一 PGV-C2 (二ツボンジーン社) 、 ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域 +レポ一夕一プラスミド K1X1(CA)， K1XKCT), KlXl(TA), KIXKTT), K2X1, 3X1, K1X2, K2X2 各 0. と内部標準化するため のコン卜ロールとして pRL-TK (単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼプロモ 一夕一下流にシーパンジー ·ルシフェラ一ゼを発現する、 二ツボンジーン社） 0.5 gと FuGENE 6 (Roche社） 3 1を Opt i-MEM (Gibco_BRL社） 1に添加し 15分間 室温で放置した後、 ヒト肝癌細胞株 HepG2細胞（1X105細胞 /0.2ml 10%FBS添加 DMEM 培地 /48 well plate) に各サンプル 4wel 1ずつ 10 I/wel 1添加することにより導入 処理し、 2日間培養した。
プロモータ一活性は、 ピツカジーンデュアル 'シーパンジー （二ツボンジーン 社） を用いて測定した。 HepG2 細胞を PBS(200^1)で 2回洗浄し、 添付の細胞溶解 剤を各ゥエルに ずつ添加し、室温で 15分間振とうした。細胞溶解液を各ゥェ ル 10 1ずつ 96ゥエルフルォロブラックプレート （大日本製薬） に移した。ルシフ エラーゼによる発光量の測定は、 LuminoskanRS (Labsystems社） を用いた。 ホ タル'ルシフェラーゼ活性はピツカジ一ン発光試薬 11を各ゥエル 50 x lずつ添加し、 測定遅延時間 1秒後、 5秒間発光量を測定した。 その後シーパンジー ·ルシフェラ ーゼ活性は、 シーパンジー発光試薬を各ゥエル ずつ添加し、 測定遅延時間 1 秒後、 5秒間発光量を測定した。 プロモ一夕一活性は、 各ゥエルのホ夕ル ·ルシフ エラ一ゼ活性のシ一パンジー'ルシフェラ一ゼ活性に対する比率で示した（図 4)。 X1K3領域がヒト SGLTホモログのプロモータ一活性に必須であること、 K1K3領域が あればさらにプロモーター活性が高まることがわかった。 SNP は、 CA, CT, TA型 の間ではプロモーター活性に差はないが、 TT型は活性が低下することがわかった。 実施例 5 デキサメタゾンによるヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域の活性促進
ヒト SGLTホモログ遺伝子上流領域 +レポ一夕一プラスミド pTB2254 0.5 gと FuGENE 6 (Roche社) 1.5 1を Opti-MEM (Gibco_BRL社） 50 1に添加し 15分間室温 で放置した後、 ヒト肝癌細胞株 HepG2細胞， Huh-7細胞 （1 X 105細胞 /0.2ml 10%FBS 添加 DMEM培地 /48 well plate) に各サンプル 4wel 1ずつ 10 z 1/wel 1添加すること により導入処理し、 デキサメタゾン（和光）を 0〜3 M 添加し、 3日間培養した。 プロモーター活性は、 ピツカジーン ルシフェラ一ゼアツセィシステム (ニッ ポンジ一ン社）を用いて測定した。 HepG2， Huh- 7細胞を PB S ( 200 1 )で 2回洗浄し、 添付の細胞溶解剤を各ゥエルに 30 1ずつ添加し、室温で 15分間振とうした。細胞 溶解液を各ゥエル 10 x lずつ 96ゥエルフルォロブラックプレート （大日本製薬） に 移した。 ルシフェラーゼによる発光量の測定は、 1420 ARVO SXマルチラベルカウ ン夕 （Wallac社）を用い、 ピツカジーン発光試薬を各ゥエル 50 1ずつ添加し、 10 秒間発光量を測定した （図 5) 。 デキサメタゾンによるヒト SGLTホモログ遺伝子上 流領域の活性促進作用が認められた。 産業上の利用可能性
本発明のヒト SGLTホモログプロモーターは、レギユレ一夕一配列を含むので、通 常それらを含まないものに比べ、 よりヒト生体内に近いヒト SGLTホモログの発現 様式を反映した活性を有する。 よって、 よりヒト生体内に近い条件でヒトの疾患 の治療、薬剤のスクリ一ニング系の設定などにおいて用いるベクターに組込むプ 口モータ—として使用できる。

Claims

請求の範囲
1. ヒト SGLT ホモログのプロモーター領域を含有する DNA。
2. ヒト SGLTホモログのレギユレ一夕一配列を含むプロモータ一領域を含有する DNA。
3. レャユレ一夕一配列が PPRE (Peroxisome Prol i ferator Response Element)を 含有する配列である請求項 2記載の DNA。
4. PPREを含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1334番目ないし 第 1339番目の塩基配列を含有する配列である請求項 3記載の DNA。
5. レギュレーター配列が HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4) 結合配列を含有 する配列である請求項 2記載の DNA。
6. HNF4結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1720番 目ないし第 1731番目の塩基配列を含有する配列である請求項 5記載の DNA。
7. レギユレ一夕一配列が Isll (Islet 1)を含有する配列である請求項 2記載の D NA。
8. Isll (Islet 1) 結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列 の第 687番目ないし第 692番目または第 2149番目ないし第 2154番目の塩基配列を含 有する配列である請求項 7記載の DNA。
9. レギユレ一ター配列が HNF5 (Hepatocyte Nuclear Factor 5) 結合配列を含有 する配列である請求項 2記載の DNA。
1 0. HNF5結合配列を含有する配列が配列番号： 5で表される塩基配列の第 1123 番目ないし第 1128番目の塩基配列を含有する配列である請求項 9記載の DNA。
1 1. プロモーター領域が配列番号： 5の第 1番目ないし第 2254番目で表される 塩基配列またはその一部を含有する塩基配列である請求項 1または 2記載の DN A。
1 2. ヒト SGLTホモログが配列番号： 14で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である請求 項 1または 2記載の DNA。
1 3. 請求項 1または 2記載の DNAを含有する組換えベクター。
14. ヒト SGLTホモログのプロモーター領域の発現制御下に構造遺伝子を有する D N Aを含有する請求項 1 3記載の組換えベクター。
1 5 . 請求項 1 4記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
1 6 .請求項 1 5記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒト SGLTホモログ プロモータ一活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法。
1 7 . 請求項 1 5記載の形質転換体を用いることを特徴とする糖取り込みを促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 8 . 請求項 1 5記載の形質転換体を用いることを特徴とする抗糖尿病薬または 抗高脂血症薬のスクリーニング方法。
1 9 .請求項 1 5記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒト SGLTホモログ プロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用 干ッ卜。
2 0 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 9記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られるヒト SGLT ホモログプロモー夕一活性を促進また は阻害する化合物またはその塩。
2 1 . 請求項 1 7記載のスクリーニング方法を用いて得られる糖取り込みを促進 または阻害する化合物またはその塩。
2 2 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 9記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られるヒト SGLT ホモログプロモ一ター活性を促進また は阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物。
2 3 . 請求項 1 7記載のスクリーニング方法を用いて得られる糖取り込みを促進 または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物。
2 4 . ヒト SGLTホモログプロモーター活性の促進または阻害作用を有する化合物 またはその塩を含有してなる糖取り込みの促進または阻害剤。
2 5 . ヒト SGLTホモログプロモーター活性の促進または阻害作用を有する化合物 またはその塩を含有してなる抗糖尿病薬または抗高脂血症薬。
2 6 .糖取り込みの促進または阻害剤を製造するためのヒト SGLTホモログプロモ 一夕一活性の促進または阻害作用を有する化合物またはその塩の使用。
2 7 .抗糖尿病薬または抗高脂血症薬を製造するためのヒト SGLTホモログプロモ 一夕一活性の促進または阻害作用を有する化合物またはその塩の使用。
2 8 . ヒト SGLTホモログプロモーター活性の促進または阻害作用を有する化合物 またはその塩を投与することを特徴とする糖取り込みの促進または阻害方法。
2 9 . ヒト SGLTホモログプロモータ一活性の促進または阻害作用を有する化合物 またはその塩を投与することを特徴とする糖尿病または高脂血症の予防 ·治療方 法。
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