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WO2002034239A1 - Utilisation de particules hydrophiles associees a des antigenes pour la preparation de compositions de vaccin - Google Patents

Utilisation de particules hydrophiles associees a des antigenes pour la preparation de compositions de vaccin Download PDF

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Publication number
WO2002034239A1
WO2002034239A1 PCT/FR2001/003340 FR0103340W WO0234239A1 WO 2002034239 A1 WO2002034239 A1 WO 2002034239A1 FR 0103340 W FR0103340 W FR 0103340W WO 0234239 A1 WO0234239 A1 WO 0234239A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
use according
bvsm
iel
particles
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2001/003340
Other languages
English (en)
Inventor
Roger Kravtzoff
Didier Betbeder
Christian Davrinche
Jocelyn Vaz Santiago
Jacqueline Lule
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Biovector Therapeutics SA
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Biovector Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Biovector Therapeutics SA filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority to AU2002214120A priority Critical patent/AU2002214120A1/en
Publication of WO2002034239A1 publication Critical patent/WO2002034239A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61K2039/55583—Polysaccharides
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    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Definitions

  • the subject of the present invention is a method of inducing, stimulating or increasing a cytotoxic cellular immune response in a mammal. More particularly, the invention relates to the preparation of a therapeutic vaccine composition for combating malignant cells or cells infected with pathogenic or infectious agents.
  • BVSM TM synthetic particulate vectors
  • non-liquid hydrophilic central core consisting of a matrix of naturally or chemically cross-linked polysaccharides or oligosaccharides, which can be modified by various ionic groups;
  • lipid layers made up in particular of phospholipids.
  • Patent applications published under the numbers WO 94/20078, WO 96/06638 and EP 782 851 describe these BVSMs, their manufacture, their association with various active ingredients and their use for the preparation of pharmaceutical compositions.
  • BVSMs are formed from a crosslinked hydrophilic polymer, preferably polysaccharides, in the form of nanoparticulate gel, these BVSMs are said to be of PSC type (or NPS in French).
  • This polymer can optionally carry positive ionic ligands, BVSM said cationic, or negative, BVSM said anionic.
  • This charged or uncharged polymer is optionally covered with a layer of amphiphilic compounds, preferably phospholipids, BVSM known as the Light type described in PCT patent application WO94 / 20078.
  • the size of the BVSM is between 20 and 200 nm, preferably between 50 and 100 nm and more preferably between 60 and 80 nm.
  • the BVSMs can be sterilized by filtration and their association with the active ingredients is made on fully manufactured BVSMs (Major et al., Biochem. & Biophys. Acta (1997), 1327, 32-40). This allows biological molecules, which are particularly fragile, to be worked under optimal conditions.
  • BVSM protects biological molecules from degradation (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, N ° 6 pp. 511-520, “Combination of HCMV recombinant IEl protein ith 80 nm cationic biovectors: protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4 + T-cell clones In vitro ”).
  • BVSM has also been shown to increase the biological activity of peptides and proteins such as enzymes, antigens, etc.
  • BVSM are known to be used as carriers of active substances, for example peptides, antigens or oligonucleotides.
  • active substances for example peptides, antigens or oligonucleotides.
  • the active substance / BVSM ratio is 5 to 10% and the measured association yield is greater than 90%.
  • the mechanism of action supporting this property relates to the improvement of cell penetration in particular in antigen presenting cells by the endocytosis pathway, pathway mainly described as a pathway for presentation by the molecules of the major histocompatibility complex, CMH II.
  • BVSM allow to induce, stimulate and increase the expansion of TCD8 lymphocytes specific for an antigen, and are therefore of remarkable interest for the preparation of therapeutic vaccines.
  • induction also called restimulation
  • restimulation is meant the increase in the number of specific TCD8s in an individual who, naturally or by previous vaccination, already has TCD8s.
  • increase also known as potentiation, is understood to mean the case where the association of an antigen with the BVSM makes it possible to increase the number of these TCD8 effectors compared to the number obtained with this same free antigen. It may be recalled that the immune response is relayed by lymphocyte cells, in particular B cells and T lymphocytes.
  • TCD4 cells are generally involved in the helper functions. In particular, they secrete cyto ines which induce the proliferation and maturation of other lymphocyte cells.
  • TCD8 cells correspond (mostly expressed, compared to TCD4) to cells involved in a cytotoxic cellular immune response called CTL type. In particular, direct cytotoxic activity has been described for certain TCD4 + lymphocytes.
  • cytotoxic response There are two types of effector immune response: the humoral response due to antibodies and the cytotoxic response mainly due to TCD8 lymphocytes.
  • An effective cytotoxic response requires the presentation of antigens to cytotoxic CD8 + T lymphocytes (CTL) in association with molecules of the major histocompatibility complex MHC class I, but also to helper T lymphocytes CD4 + in association with class II molecules of MHC .
  • CTL cytotoxic CD8 + T lymphocytes
  • CTL cytotoxic T lymphocyte response
  • TCD8 lymphocytes recognize peptide fragments, resulting from intracellular degradation of the antigen, in the form of a complex with MHC class I molecules expressed on the surface of the cell. This recognition leads to the lysis of cells carrying the MHC-antigenic peptide complex. CTLs also generate different lymphokines (IFN- ⁇ and TNF- ⁇ ) which can also be directly cytolytic.
  • CTL The induction of CTL is therefore considered an essential component of vaccines designed for the prevention and treatment of these diseases.
  • the aim of therapeutic vaccination is to induce or restimulate in vivo a specific immune response capable of destroying infected cells or tumor cells.
  • the immune response of patients must be modulated so that it becomes effective and induces a cell-mediated response specific to antigens expressed, for example, by the tumor and capable of eliminating cancer cells (Chestnut RW & al. "Design and testing of peptide-based cytotoxic T-cell-mediated immunotherapeutics to treat infectious diseases and cancers" in: Vaccine design, Vol 6 (Eds Powell MF and New an MJ) Plénum Press, New York, 1995, pp. 847-874).
  • CTLs The induction, re-stimulation and expansion of CTLs can be obtained by various approaches, including immunization with optimal epitope peptides which will bind to MHC class I molecules and be presented to specific T cell receptors expressed by TCD8 cells.
  • immunization with optimal epitope peptides which will bind to MHC class I molecules and be presented to specific T cell receptors expressed by TCD8 cells.
  • this method only addresses one peptide at a time and requires knowledge of the dominant epitopes for a given antigen.
  • lipopeptides are an alternative approach which allows, in addition to the TCD8 + epitope, the introduction of an epitope peptide TCD4 + in order to provide an auxiliary T response which can play a direct role in control.
  • an infection for example (anti-viral cytokines, direct cytotoxic activity) or to improve the TCD8 + CTL response, as described in European patent applications No. 491 628 and PCT No. WO 99/51 630.
  • Chemical synthesis such lipopeptides is however complex and expensive.
  • the CTL response can be further improved by using adjuvants, viral or synthetic vectors.
  • the subject of the invention is therefore a therapeutic vaccine composition comprising particles having a size between 20 and 200 n and comprising a non-liquid hydrophilic nucleus consisting of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides, said particles being associated in the composition with one or more antigens.
  • the invention relates more particularly to a therapeutic vaccine composition.
  • Such a composition can of course also comprise one or more suitable excipient or adjuvants.
  • compositions of the invention are remarkable in that, unexpectedly, the particles make it possible to induce, stimulate or increase a mainly cytotoxic cellular immune response TCD8.
  • TCD4 TCD4 + responses
  • MHC class II molecules MHC class II molecules
  • TCD8 + responses are possible if the antigens are picked up by immature dendritic cells.
  • the peptides must be presented by the MHC class I molecules, which requires the degradation of the antigens in the cell cytosol. It is surprising that the BVSM are capable of inducing these two responses which call upon two different mechanisms
  • the mechanism of action of the BVSM seems to be, on the one hand, the increase in the cellular penetration of the antigens by the endocytosis pathway, the concentration of the antigen in the endosomes but also an improvement in the transfer of the endosomes to the cell cytosol, this allowing a better presentation of the epitopes obtained by cytoplasmic and / or endosomal degradation of the antigen, to the molecule of the major histocompatibility complex class I present on the endoplasmic reticulum.
  • the invention therefore relates very particularly to the use of particles having a size of between 20 and 200 nm comprising a non-liquid hydrophilic nucleus consisting of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides, associated with identical antigens or different, for the preparation of a vaccine composition, said particles inducing, stimulating or increasing a cytotoxic T cell immune response.
  • the invention particularly relates to a therapeutic vaccine composition.
  • the therapeutic vaccine composition according to the invention can be useful in methods for preventing and / or treating chronic infections of viral origin, such as for example HSV, HIV, hepatitis B and C, HPV, EBV, etc. or of bacterial origin, such as Heliobacter pylori, tuberculosis, etc. or also due to protozoa, as in the case of malaria.
  • the therapeutic vaccine composition according to the invention is also useful for treat tumors, in the case of cancers (melanoma, breast, colon, ovarian cancer, etc.).
  • the size of the particles used in the context of the invention is between 20 and 200 nm, preferably between 50 and 100 nm and more preferably between 60 and 80 nm.
  • the non-liquid hydrophilic core of the particles consists of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides. These polysaccharides are chosen from the group comprising dextran, starch, cellulose, their derivatives and substituted, their hydrolysis products and their salts and esters.
  • ionic ligands are grafted onto the nucleus.
  • the ionic ligands relate at least to a function chosen from the group comprising: phosphates, sulfates, carboxylic acids, quaternary ammonium, secondary amines, primary amines.
  • a particular form of particles used according to the invention comprises a non-liquid hydrophilic core as defined above, covered in whole or in part with at least one layer of amphiphilic compounds.
  • the amphiphilic compounds are chosen from natural or synthetic lipids and phospholipids, ceramides, fatty acids, glycolipids, lipoproteins and surfactants.
  • particles used according to the invention comprises a non-liquid hydrophilic core as defined above, covered in whole or in part with two layers of amphiphilic compounds.
  • the non-liquid hydrophilic core is covered in whole or in part with a first layer of fatty acids, itself covered in whole or in part with a lipid layer.
  • the antigens used in the compositions of the invention are associated with the particles by ionic bonds or by hydrophobic bonds.
  • the antigens can be associated with the nucleus of the particles or with the outer layer thereof.
  • the invention is very particularly suitable for the preparation of compositions for mucosal administration, in particular nasal administration, but any other mode of administration, for example parenteral, can be envisaged.
  • Example 1 the association of the chimeric protein IEl-pp65 with BVSM.
  • FIG. 1 represents the sensorgram obtained during the injection of an HBS antigen suspension on a saturated BVSM sensorship aiming to prove the association between the BVSM and the antigen
  • 1 injection of 20 ⁇ l of BVSM KY to 50 ⁇ g / ml
  • 2 injection of 20 ⁇ l of rHBsAg at 7.5 ⁇ g / ml
  • Example 3 the in vitro stimulation of CD8 + T lymphocytes specific for IE1 or pp65, where reference will be made to the appended drawings in which:
  • FIG. 2 represents the results of a cytotoxicity test obtained for the splenocytes originating from mice having been immunized twice with ALVAC-IEl and re-stimulated in vitro either by vaccinia-IEl, or by the formulation IEl-pp65 / BVSM, i.e. the chimera IEl-pp65.
  • FIG. 3 represents the results of a cytotoxicity test obtained for the splenocytes originating from of mice having been immunized twice with ALVAC-p ⁇ 65 and re-stimulated in vitro either by vaccinia-pp65, or by the formulation IEl-pp65 / BVSM or the chimera IEl-pp65.
  • FIG. 4 represents the results of a cytotoxicity test obtained for the splenocytes originating from mice having been immunized with ALVAC-pp65 and ALVAC-IE1 and “boosted” either by the formulations IE1- pp65 / SMBV, or by the free protein IEl-pp65.
  • the in vitro stimulation is carried out by the formulations IEl-pp65 / SMBV.
  • the results presented are the percentages of specific lysis (delta percentage of lysis L929-vacc-IE1 (FIG. 4A) L929-vacc-pp65 (FIG. 4B) / lysis L929-vacc-wt.).
  • FIG. 5 represents the CTL anti-IEl response, in a cytotoxicity test obtained for the splenocytes originating from mice having been immunized with ALVAC-IEl and ALVAC-pp65 and “boosted” either by the formulations IEl-pp65 / SMBV (FIG. 5A), or by the ALVAC-IEl and ALVAC-pp65 ( Figure 5B).
  • In vitro stimulation is carried out either by the formulations IEl-pp65 / SMBV, or by the vaccines IEl, pp65 or gB.
  • the results presented are the percentages of specific lysis (delta percentage of lysis L929-vacc-IE1 / lysis L929-vacc-wt.).
  • FIG. 6 represents the CTL anti-pp65 response, in a cytotoxicity test obtained for the splenocytes originating from mice having been immunized with ALVAC-IE1 and ALVAC-pp65 and “boosted” either by the formulations IEl-pp65 / SMBV (FIG. 6A), or by the ALVAC-IEl and ALVAC-pp65 ( Figure 6B).
  • In vitro stimulation is carried out either by the formulations IEl-pp65 / SMBV, or by the vaccines IEl, pp65 or gB.
  • the results presented are the percentage of specific lysis (delta percentage of lysis L929-vacc-pp65 / lysis L929-vacc-wt.).
  • FIG. 7 represents the re-stimulation of anti-I9Y CTL from PBMC of a seropositive HLAB35 donor in the presence of either the BVSM / IE1-pp65 formulation or of the chimera IEl-pp65, by comparison with the results obtained by administration i. m. HBS DNA (reference).
  • FIG. 8 represents the specific HBS CTL response in mice immunized intranasally with the Rhbs antigen free or associated with BVSM.
  • Example 1 Association of the chimeric protein IEl-pp65 with the BVSM.
  • the chimeric protein IEl-pp65 is described in patent WO 98/26074.
  • the two proteins IE1 and pp65 belong to the human cytomegalovirus (HCMV).
  • the recombinant protein IE1-pp65 was produced and purified from Sf9 insect cells infected with a recombinant baculovirus encoding the chimeric protein IE1-pp65.
  • Cationic BVSMs are described in patent WO 94/20078. They are composed of a crosslinked and functionalized polysaccharide core (NPS) (with a load of 2mEq / g) associated with a lipid bilayer, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) and cholesterol (70/30 w / w), in a lipid ratio / NPS of 30/100 (w / w).
  • NPS polysaccharide core
  • DPPC Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline
  • cholesterol 70/30 w / w
  • the chimera is diluted in PBS (Phosphate Buffered Saline with a composition of 2.5 mM NaH 2 P0 4 and Na 2 HP0 4 , 30 mM NaCl, 0.7 mM KCl, pH 7.4) + 10% glycerol at a concentration of 1224 ⁇ g / ml.
  • PBS Phosphate Buffered Saline with a composition of 2.5 mM NaH 2 P0 4 and Na 2 HP0 4 , 30 mM NaCl, 0.7 mM KCl, pH 7.4
  • the BVSM are diluted in water to a concentration of 20.4 mg / ml in NPS and 6.06 mg / ml in lipids.
  • the formulations IEl-pp65 / BVSM are complexes formed by association of cationic BVSM (type KY) and of the antigen IEl-pp65 for parenteral administration.
  • the formulation is carried out by a mixture of 81.7 ⁇ l (ie 10 ⁇ g) of IEl-pp65 at 1224 ⁇ g / ml with BVSM KY7125 (1 mg of NPS or 49 ⁇ l).
  • the formulations are diluted at a rate of 19.3 ⁇ l of PBS buffer + 10% glycerol in order to administer a final volume of 150 ⁇ l per mouse.
  • the formulations IEl-pp65 / BVSM are complexes formed by association of cationic BVSM (type KY) and of the antigen IEl-pp65. These are carried out for in-vitro studies.
  • the formulation is carried out by a mixture of 81.7 ⁇ l (ie 10 ⁇ g) of IEl-pp65 at 1224 ⁇ g / ml with BVSM (10 ⁇ g of NPS or 5 ⁇ l of BVSM at 2 mg / ml)
  • the formulations are diluted at a rate of 913.3 ⁇ l of PBS buffer + 10% glycerol, ie 10 ⁇ g / ml (67nM) in protein.
  • the characterization of the association is carried out either by electrophoresis in native condition or by surface plasmon resonance (Biacore X, Pharmacia). In these two techniques an association greater than 85% can be demonstrated.
  • Example 2 As sociation of a recombinant protein, the HBS antigen, with BVSM.
  • the recombinant protein corresponds to the surface protein of the virus. hepatitis B.
  • the recombinant protein was produced and purified from Hansenula polymorpha cells by a recombinant DNA technique encoding the surface protein.
  • the protein is supplied at 1310 ⁇ g / ml in 154 mM NaCl, sodium phosphate pH 7.0 10 mM.
  • Cationic BVSMs are described in patent WO 94/20078. They are composed of a cross-linked and functionalized polysaccharide core (NPS) with a load of 2mEq / g associated with a lipid bilayer, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) and cholesterol (70/30 w / w), in a lipid / NPS ratio 30/100 (w / w).
  • NPS polysaccharide core
  • DPPC Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline
  • cholesterol 70/30 w / w
  • the preparation is "vortexed" after each addition.
  • the formulations are characterized by measuring the size of the particles obtained on the formulations diluted in PBS so that their concentration of BVSM TM KY is 1 g / 1, on a suspension of rHBsAg diluted in water or in 150 mM NaCl that the concentration of rHBsAg is 0.19 g / 1.
  • Table I below represents the measurements of the average particle sizes of two formulations.
  • the average particle sizes are around 200 nm (Table 1) for the rHBsAg / BVSM formulation.
  • the formulations are characterized by surface plasmon resonance.
  • rHBsAg / BVSM TM KY interactions is demonstrated during injections of rHBsAg solutions on the HPA sensor chip (Sensor chip HPA, BR-1000-30, BIAcore, Uppsala, Sweden) saturated in BVSM TM KY.
  • HPA sensor chip Silicone chip HPA, BR-1000-30, BIAcore, Uppsala, Sweden
  • FIG. 1 It clearly appears that the rHBsAg interacts with the BVSM TM KY immobilized on the HPA sensor chip.
  • the evaluation of the rate of association of rHBsAg with BVSM TM KY is carried out by the same technique. Injections of rHBsAg suspensions at different concentrations (2.5 to 12.5 ⁇ g / ml) on Sensor chip HPA saturated with BVSM TM KY were carried out. The equation of the regression line is used to calculate the association rate from the conversion of the signals obtained into a concentration of free rHBsAg during injections of formulations.
  • the association rates determined by this technique are greater than 95%.
  • Injections of formulations at 500 ⁇ g rHBsAg / ml having rHBsAg / BVSM TM KY weight ratios of 1 / x with x varying from 40 to 0.1 were carried out on an HPA sensor chip saturated with BVSM TM KY in order to verify that the presence of free rHBsAg in a formulation can be detected and quantified by surface plasmon resonance.
  • the technique used therefore makes it possible to observe and quantify the free rHBsAg in a formulation.
  • Example 3 In vitro stimulation of CD8 + T lymphocytes specific for IEl or pp65.
  • mice Female CBA mice (haplotype H-2 K ) (January breeding) were immunized on D0 and possibly D15 with recombinant canarypox ALVAC-IEl or ALVAC-pp65 (Virogenetics).
  • the dose administered intraperitoneally (IP) per mouse is 2 ⁇ 10 8 pfu diluted in a final volume of 100 ⁇ l per mouse.
  • the spleen is removed and then placed in a sterile 45ml tube (Falcon) kept in ice and containing culture medium: RPMI 1640 (Gibco), 5% Fetal Calf Serum (SVF), 2.10 "5 M 2- mercaptoethanol, 10mM Hepes, 2mM glutamine, Penicillin, streptomycin, Sodium Pyruvate.
  • the splenocytes are extracted sterile, purified and taken up at a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 splenocytes / ml. The splenocytes thus recovered are used for a cytotoxicity test (release of chromium 51 by the target cells).
  • the feeder antigen presenting cells used are naive splenocytes taken from non-immunized CBA mice. After extraction and purification, these naive splenocytes are incubated (5 ⁇ 10 6 splenocytes / well) for 90 min in 500 ⁇ l of medium without SVF in the presence:
  • the IEl-pp65 / BVSM formulations with an IEl-pp65 / NPS ratio of 1/1 (w / w) to 67nM (10 ⁇ g / ml) in protein are formed by combination of BVSM cationic (type KY) and antigen IEl-pp65 in PBS buffer (Phosphate Buffered Saline composition 2.5 mM NaH 2 P0 4 and Na 2 HP0 4, 30 mM NaCl, 0, 7 mM KC1, pH 7 , 4) + 10% glycerol; After incubation, 500 ⁇ l of medium are removed and replaced with 2 ml / well of medium with SVF. Incubate for 18 h at 37 ° C and 5% C0 2 . The splenocytes are harvested and then they are irradiated at 4000R.
  • PBS buffer Phosphate Buffered Saline composition 2.5 mM NaH 2 P0 4 and Na 2 HP0 4, 30 mM NaCl, 0, 7 m
  • the stimulation is carried out by mixing 2.5 ⁇ 10 6 splenocytes / ml per well with 1.25 ⁇ 10 6 feeders / ml. Incubation takes place for 5 days at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • the cytotoxic activity of non-adherent cells is tested by a 51 Cr release test.
  • the target cells used are either L929 (H-2 K ) or P815 (H-2 d ) used as a control infected with vaccinia-IE1, or vaccinia-pp65 or vaccinia-WT at one month 2.5 for 4 hours. After washing in culture medium, they are labeled with chromium (100 ⁇ Ci) for 1 h. These chromated cells are washed 3 times in culture medium, then mixed with the effector cells at different effector / target ratios by producing triplicates. The 4h incubation is carried out at 37 ° C and 5% C0 2 . The radioactivity contained in the collected supernatant is counted in a cobra counter (Packard).
  • the percentage of specific lysis corresponds to the ratio [cpm experimental release - cpm spontaneous release / cpm total release - cpm spontaneous release] xl00.
  • Spontaneous release was measured in the supernatant of the target cells incubated alone.
  • the standard deviation (SD) of the triplicates is less than 10% and the spontaneous release is less than 25%.
  • FIG. 2 gives the cytotoxicity results obtained for the mice immunized with ALVAC-IE1 and restimulated in vitro either by vaccinia-IEl, or by the formulation IEl-pp65 / BVSM, or by the soluble chimera.
  • FIG. 3 gives the cytotoxicity results obtained for the mice immunized with ALVAC-pp65 and restimulated in vitro either by vaccinia-pp65, or by the formulation IE1-pp65 / BVSM, or by the soluble chimera.
  • cytotoxicity results are obtained for the splenocytes originating from mice immunized 1 or 2 times with ALVAC-IE1 or pp65 depending on the mode of re-stimulation in vitro (effector / target ratio 100/1).
  • the results presented are the percentages of specific lysis (delta percentage of lysis L929-vacc-IEl or L929-vacc-pp65 / lysis L929-vacc-wt.)
  • This table also makes it possible to compare the results obtained when the mice received one or two immunizations with ALVAC-pp65 or IE1. In all cases, a better percentage of specific lysis is obtained by in vitro stimulation carried out with the formulation IE1-pp65 / BVSM or vaccinia (IEl or pp65). However, this percentage remains low during stimulation with the soluble chimeric protein IEl-pp65 alone.
  • IEl-pp65 / BVSM formulations allow in vitro stimulation of CD8 + T lymphocytes specific for IEl or pp65 in a similar manner to living systems (vaccine IEl or pp65).
  • a primary immunization of CBA mice female CBA mice (haplotype H-2 K ) (January breeding) is carried out by intraperitoneal administration of a mixture of two recombinant poxviruses ALVAC-IEl and ALVAC-pp65 (Virogenetics).
  • IP intraperitoneally administered intraperitoneally (IP) per mouse is lxl0 8 pfu / strain diluted in a final volume of lOO ⁇ l per mouse.
  • the formulations are complexes formed by association of cationic BVSM (type KY) and the chimeric antigen IEl-pp65 for IP administration, these complexes are in suspension in PBS + 10% glycerol.
  • Two formulations are used.
  • the chimera / lipids ratio is 1/3 and chimera / NPS of 1/10.
  • the dose is 100 ⁇ g of IE1-pp65 protein in a final volume of 150 ⁇ l per mouse.
  • the chimera / lipids ratio is 1/15 and chimera / NPS of 1/50.
  • the dose is 100 ⁇ g of IE1-pp65 protein in a final volume of 100 ⁇ l per mouse,
  • the TCD8 response is evaluated on the splenocytes collected 15 days after the last administration. This cytotoxicity test by the 51 Cr release technique is carried out as described in the previous example.
  • In vitro stimulation is carried out either with the formulations IEl-pp65 / BVSM, or with the chimeric protein IEl-pp65, or with the vaccine-IEl, -pp65 and -gB.
  • FIG. 4 summarizes the results obtained for the mice having been immunized with the two ALVACs (IE1 and pp65) on D0, then having received two reminders on D28 and D56 with various antigens: either the formulation IEl-pp65 / BVSM at 100 ⁇ g / mouse or 20 ⁇ g / mouse corresponding to protein / NPS ratios of 1/10 or 1/50 respectively, either the soluble chimera IE1-pp65 to 100 ⁇ g / mouse or 20 ⁇ g / mouse, or the BVSM.
  • the results obtained are presented according to the specificity of the response: IEl or pp65.
  • mice are immunized with the formulation IEl-pp65 / BVSM at a ratio 1/10 and 1/50 (w / w).
  • This is observed in particular during the in vitro stimulation by the formulation IEl-pp65 / BVSM (specific lysis of 45 and 40% respectively for the mice immunized by the formulation at 1/10 and 1/50 (w / w) while mice immunized with the free IE1-pp65 chimera at lOO ⁇ g or 20 ⁇ g give 20% specific lysis, this result being equivalent to the negative control (BVSM)) (FIG. 4A).
  • This result is confirmed during in vitro stimulation with the free IEl-pp65 chimera (15% and 3% respectively for the IEl-pp65 / SMBV formulation and the IEl-pp65 chimera).
  • FIG. 5 compares the results obtained for the mice having been immunized with the two ALVACs (IE1 and pp65) on D0, then having received two reminders on D28 and D56 either the formulation IEl-pp65 / BVSM at 100 ⁇ g (FIG. 5A), or both ALVAC-IEl and -pp65 ( Figure 5B).
  • the results obtained are presented according to the type of stimulation carried out in vitro (formulation IEl-pp65 / SMBV, vaccine-IEl, pp65 or gB). Under these somewhat saturated conditions, no significant difference can be observed between ALVAC and the formulations IE1-pp65 / SMBV.
  • the IEl-pp65 / BVSM formulation stimulates in vivo CD8 + T cells specific to IEl after priming with ALVAC in a similar way to the stimulation obtained by a living system (ALVAC). Conversely, the free IEl-pp65 chimera does not make it possible to obtain this stimulation in vivo whatever the amount administered (100 ⁇ g or 20 ⁇ g per mouse).
  • FIG. 6 compares the results obtained for the mice having been immunized with the two ALVACs (IE1 and pp65) at D0, then having received two reminders at D28 and D56 either with the formulation IEl-pp65 / BVSM at 100 ⁇ g (FIG. 6A), either with the two ALVAC-IEl and -pp65 ( Figure 6B).
  • the results obtained are presented according to the type of stimulation carried out in vitro (IEl-pp65 / SMBV formulation, vaccine-IEl, pp65 or gB).
  • the ALVAC unlike the IEl-pp65 / SMBV formulations do not allow obtaining a specific lysis whatever the in vitro stimulation mode (in particular with the formulation IEl-pp65 / BVSM and the vaccinia-pp65 ).
  • Example 5 Re-stimulation of anti-pp65 cytotoxic TCD8 + cells from the PBMC of donors seropositive with respect to CMV.
  • HLA-A2 or HLA-B35 or HLA-B7 donors of known HLA phenotype (HLA-A2 or HLA-B35 or HLA-B7) were incubated in 24-well plates in the presence of RPMI supplemented in human serum with different sources of antigens: either an epitope peptide known from the pp65 protein (CMV AD169) NLVPMVATV (N9V, HLA-A2) IPSINVHHY (I9Y, HLA-B35) RPHERNGFTV (R10V, HLA-B7), either a non-epitope peptide, or the chimeric protein IEl-pp65 either the formulation consisting of the association between the BVSM and the protein IE1-pp65 or the BVSM alone.
  • CMV AD169 NLVPMVATV
  • IPSINVHHY I9Y, HLA-B35
  • RPHERNGFTV R10V, HLA-B7
  • the chimeric protein IEl-pp65 either the formulation
  • IL-7 is added (lOOU / ml, Biosource). On day 12, the restimulation is carried out using irradiated allogenic PBMCs (2000Rad) in the presence of the same antigens. On days 13 and 15, IL-2 (20U / ml, Sanofi-Synthelabo, Labège) and IL-7 (100U / well) are added.
  • a chromium 51 release test is carried out 5 days later using as target B / EBV cells of identical HLA phenotype.
  • 5 x 10 5 target cells in 24 wells are incubated in RPMI-10% SVF for 18 h with a relevant or non-relevant peptide.
  • the cells are labeled with ( 51 Cr) Na 2 Cr0 4 (100 ⁇ Ci per well, ICN) for 2 h and washed 3 times in RPMI-SVF.
  • the effector cells are incubated with 5 ⁇ 10 3 target cells at effector / variable target, in triplicate in 96-well plates and incubated for 5 h.
  • the percentage of lysis is calculated according to the formula: (cpm of the experiment minus cpm released spontaneously) divided by (maximum cpm released minus spontaneous cpm) x 100. Spontaneous release always represents less than 25% of maximum release. The standard deviation was less than 5%.
  • FIG. 7 shows the results obtained when PBMCs from an HLA-B35 donor were used to restimulate anti-pp65 CTLs using either the peptide relevant I9Y, or the non-relevant peptide N9V, or the protein IE1-pp65, or the IEl-pp65 / BVSM formulation, ie BVSM alone.
  • the specificity of the CTLs obtained was tested using as targets B lymphocytes transformed by EBV of the HLA-B35 haplotype incubated in the presence of the peptide I9Y.
  • the results of a chromium 51 re-release test by the targets reveal that CTLs were re-stimulated in the presence of the relevant peptide I9Y and not with the peptide N9V.
  • the soluble protein IEl-pp65 has enabled improved restimulation when it is included in the formulation since 4 times fewer effector cells are required to obtain an equivalent level of lysis. This result suggests that the IEl-pp65 / BVSM formulation made it possible to re-stimulate and expand a number of anti-I9Y CTLs more than with the soluble protein and with the peptide alone.
  • the use of the formulation would offer, in addition to the advantage of protecting the antigen from proteolysis, of re-stimulating CTLs specific for several epitopes corresponding to different HLA haplotypes, unlike a peptide.
  • Example 6 Induction in vivo of TCD8 + lymphocytes specific for hepatitis B by nasal administration.
  • mice BALB / c mice (5 mice per group) are used in hepatitis B immunization experiments.
  • the hepatitis B recombinant antigen (Rhein Biotech) is administered via the nasal route either in free form or in combination with BVSM.
  • the dose is 8 ⁇ g / mouse on D0.
  • a boost is made with the same material on D21 and D42.
  • Another group of mice is immunized intramuscularly with the HBs plasmid (50 ⁇ g). This group is used as a positive control.
  • Another group also administers the BVSM alone.
  • a last group consists of naive mice playing the role of negative control.
  • mice Two weeks after the last immunization, the mice are killed, the spleens are taken which will be analyzed for the cytotoxic T lymphocyte response (TCD8 +).
  • TCD8 + cytotoxic T lymphocyte response
  • the spleen cells of immunized mice and control mice are re-stimulated in vitro for 5 days.
  • the cytotoxic activity of non-adherent cells is tested by a Cr 51 re-release test (as described in the previous examples).
  • P815 cells (cells having the same haplotype) incubated with a specific CTL epitope are used as target cells.
  • the percentage of specific lysis corresponds to the ratio: (experimental re-release cpm - spontaneous re-release cpm / total re-release cpm - spontaneous re-release cpm)
  • FIG. 8 represents the results obtained. It clearly shows the capacity of BVSM formulations to induce a strong TCD8 response after intranasal immunization.
  • the rHBs / BVSM formulations are capable of inducing T lymphocytes HBs specific cytotoxics in 5 of the 5 immunized mice.
  • the level of activity of cytotoxic T lymphocytes seems strong compared to the positive control (intramuscular administration of free plasmid HBs). On the contrary, the free antigen does not induce any significant cytotoxic response.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de particules ayant une taille comprise 20 et 200 nm comprenant une noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, associés à des antigènes identiques ou différents, pour la préparation d'une composition de vaccin, lesdites particules induisant, stimulant ou augmentant une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique. La composition de vaccin thérapeutique selon l'invention est utile pour prévenir et/ou traiter des infections chroniques d'origine virale ou bactérienne, dues à des protozoaires, ou encore des cancers.

Description

UTILISATION DE PARTICULES HYDROPHILES
ASSOCIÉES À DES ANTIGÈNES IDENTIQUES OU DIFFÉRENTS
POUR LA PRÉPARATION DE COMPOSITIONS DE VACCIN.
La présente invention a pour objet une méthode d'induction, de stimulation ou d'augmentation d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxigue chez un mammifère. Plus particulièrement, l'invention concerne la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique permettant de lutter contre des cellules malignes ou des cellules infectées par des agents pathogènes ou infectieux.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après "BVSM™" . Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. Il s'agit de particules comprenant de 1 ' intérieur vers 1 ' extérieur :
- un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers;
- une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau, - une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.
Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux types, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.
Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM, leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de ces vecteurs.
Des BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français). Ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT WO94/20078.
La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm. Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys. Acta (1997), 1327, 32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520, « Combination of HCMV recombinant IEl protein ith 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of présentation to CD4+ T-cell clones In vitro » ) .
Il a aussi été montré que les BVSM augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc.... Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucleotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et 1 'oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport substance active / BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 % .
La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de 1 ' immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM. L'antigène est là aussi associé aux particules par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM utilisé (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, N°6 pp 511-520). Il faut noter que dans cette demande l'augmentation de 1 ' immunogénicité d'un antigène concerne l'augmentation de la réponse CD4, T helper et/ou cytotoxique. Le mécanisme d'action soutenant cette propriété concerne l'amélioration de la pénétration cellulaire notamment dans les cellules présentatrice d'antigène par la voie de 1 ' endocytose, voie majoritairement décrite comme une voie de présentation par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, CMH II. La Demanderesse a maintenant découvert que les
BVSM permettent d'induire, de stimuler et d'augmenter l'expansion des lymphocytes TCD8 spécifiques d'un antigène, et présentent donc un intérêt remarquable pour la préparation de vaccins thérapeutiques. On entend par induction, l'apparition de TCD8 spécifiques chez un individu naïf. On entend par stimulation, aussi désigné restimulation, l'augmentation du nombre de TCD8 spécifiques chez un individu qui de façon naturelle ou par vaccination antérieure possède déjà des TCD8. Enfin, on entend par augmentation, aussi désignée potentialisation, le cas où l'association d'un antigène avec les BVSM permet d'augmenter le nombre de ces effecteurs TCD8 par rapport au nombre obtenu avec ce même antigène libre. On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base entre autres de leur expression des antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules TCD4 sont généralement impliquées dans les fonctions « helper ». En particulier, ils sécrètent des cyto ines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Les cellules TCD8 correspondent (majoritairement exprimés, par rapport au TCD4) aux cellules impliquées lors d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique dite de type CTL. En particulier une activité cytotoxique directe a été décrite pour certains lymphocytes TCD4+.
Il existe deux types de réponse immunitaire effectrice : la réponse humorale due aux anticorps et la réponse cytotoxique due majoritairement aux lymphocytes TCD8. Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL) en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité CMH de classe I, mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ en association avec les molécules de classe II du CMH.
Bien que les anticorps mucosaux et systémiques soient considérés comme jouant un rôle majeur dans la prévention de certaines infections, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire, incluant l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique (CTL) est particulièrement nécessaire pour lutter contre les pathogènes intracellulaires (virus, bactéries ou parasites) et pour le contrôle des processus tumoraux. L'induction et la régulation des CTL sont dépendantes des cytokines (IL-2, etc) produites par la sous-population Thl des cellules helper CD4. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouent un rôle critique dans la « clearance » des pathogènes intracellulaires aussi bien que dans le contrôle des tumeurs. Les lymphocytes TCD8 reconnaissent les fragments peptidiques, issus de la dégradation intracellulaire de l'antigène, sous forme d'un complexe avec les molécules du CMH de classe I exprimé à la surface de la cellule. Cette reconnaissance entraîne la lyse des cellules portant le complexe CMH-peptide antigénique. Les CTL génèrent également différentes lymphokines ( IFN-γ et TNF-α ) qui peuvent en complément être directement cytolytiques.
L'induction de CTL est donc considérée comme une composante essentielle de vaccins conçus pour la prévention et le traitement de ces maladies .
Parmi les traitements actuellement proposés pour lutter contre les cancers et les infections virales chroniques, la vaccination prend une place de plus en plus importante. L'objectif d'une vaccination thérapeutique est d'induire ou de restimuler in vivo une réponse immunitaire spécifique capable de détruire des cellules infectées ou des cellules tumorales. La réponse immune des patients doit être modulée de telle sorte qu'elle devienne efficace et induise une réponse à médiation cellulaire spécifique d'antigènes exprimés par exemple par la tumeur et capable d'éliminer les cellules cancéreuses (Chestnut R. W. & al. « Design and testing of peptide-based cytotoxic T-cell- mediated immunotherapeutics to treat infectious diseases and cancers » in : Vaccine design, Vol 6 (Eds Powell M. F. and New an M.J.) Plénum Press, New York, 1995, pp. 847- 874).
L'induction, la re-stimulation et l'expansion des CTL peuvent être obtenues par différentes approches, parmi lesquelles l'immunisation avec des peptides épitopes optimaux qui vont se lier aux molécules CMH classe I et être présentés aux récepteurs spécifiques des cellules T exprimés par les cellules TCD8. Cependant cette méthode ne s'adresse qu'à un seul peptide à la fois et nécessite la connaissance des épitopes dominants pour un antigène donné.
L'inclusion de ces épitopes dans des lipopeptides est une approche alternative qui permet, en plus de l'épitope TCD8+ l'introduction d'un peptide épitope TCD4+ dans le but d'apporter une réponse T auxiliaire pouvant jouer un rôle direct dans le contrôle d'une infection par exemple (cytokines anti-virales, activité cytotoxique directe) ou d'améliorer la réponse TCD8+ CTL, comme décrit dans les demandes de brevet européen No. 491 628 et PCT No. WO 99/51 630. La synthèse chimique de tels lipopeptides est cependant complexe et coûteuse.
L'injection d'un plasmide contenant un ADN codant, un antigène contre lequel une réponse immune est attendue est une nouvelle approche qui peut induire la stimulation de réponses humorales et cellulaires. Des réponses immunes chez l'animal ont été induites avec les gènes d'une variété d'agents infectieux. On peut citer par exemple un ADN plasmidique contenant un gène codant l'hemagglutinine d'influenza (Robinson H. L. and al. « Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a hemagglutinin-expressing plasmid DNA » , Vaccine, 1993, 11, pp. 957-960), mais l'efficacité des vaccins ADN chez l'homme reste à prouver.
On peut encore améliorer la réponse CTL en utilisant des adjuvants, des vecteurs viraux ou synthétiques .
Le seul adjuvant actuellement autorisé chez l'homme du fait de sa relative innocuité est l'alu . Des études comparatives ont montré qu'il est un adjuvant relativement peu efficace pour la production d'anticorps, mais également pour l'induction d'une immunité cellulaire (Gupta & al : « Adjuvant properties of aluminium and calcium compounds » in : Vaccine design, the subunit and adjuvant approach. Powell,M.F., Newman, M. J. Plénum Press pp 229-248.) . Un autre adjuvant est actuellement autorisé chez l'homme en Italie et pourrait faire l'objet d'une autorisation plus large : il s'agit du MF59. Il semble cependant que cet adjuvant ne permette pas une induction des TCD8. Les vecteurs viraux bien que les plus efficaces pour induire une réponse cellulaire TCD8+, présentent de nombreux désavantages. D'une part, il est difficile d'obtenir un stock viral complètement non-réplicatif . Les risques de recombinaison avec des séquences virales endogènes peuvent potentiellement rendre le vecteur réplicatif et hautement pathogène. D'autre part, il existe des risques non négligeables de cancérogénèse par mutagénèse insertionnelle. De plus ces vecteurs viraux induisent une réponse immunitaire contre les protéines virales les rendant relativement inefficace lors d'une administration ultérieure.
L'utilisation de particules synthétiques pour l'induction d'une réponse CTL a été testée. Les résultats semblent cependant non homogènes. Ainsi Cahill obtient des résultats équivalents lors de l'administration intranasale de FHA (Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin) en solution saline ou encapsulée dans des particules biodégradables. Cependant ces auteurs n'ont pas évalué la réponse CTL dans leurs essais, seule la présence d'une sécrétion d'IL-2 lors des contrôles de prolifération laisse penser à un profil Thl nécessaire à l'induction de CTL (Cahill E. S. & al. « Immune responses and protection against Bordetella pertussis infection after intranasal immunization of mice with filamentous haemagglutinin in solution or incorporated in biodégradable microparticles », Vaccine, 1995, 13 (5), pp. 455-62). Partidos encapsule un épitope CTL du measles virus dans des particules de PLGA (poly ( lactide-co-glycolide) ) . La réponse CTL obtenue lorsque 1 'épitope est encapsulé est inférieure à celle obtenue avec l'épitope administré dans une solution saline ou avec la CTB comme adjuvant (Partidos C. D. & al. « Mucosal immunization with a measles virus CTL épitope encapsulated in biodégradable PLG microparticles », J. Immun. Methods 1996, 195 (1-2), pp. 135-8).
Pour Moore, par contre, les résultats obtenus en encapsulant une protéine recombinante HIV dans du PLGA également semblent positifs. Cependant ces auteurs n'ont pas réalisé de contrôle avec l'antigène (Gpl20) libre, rendant difficile l'évaluation de l'apport des microparticules dans la réponse CTL obtenue (Moore A. & al « Immunization with a soluble recombinant HIV protein entrapped in biodégradable microparticles induce HIV- specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes and CD4 Thl cells » Vaccine 1995, 13 (8), pp. 1741-9).
Il a aussi été décrit dans la demande de brevet PCT No. WO 96/01647, l'utilisation de BVSM pour augmenter 1' immunogénicité d'un antigène vis-à-vis de la stimulation de clones de lymphocytes TCD4. Or, comme indiqué précédemment, la Demanderesse a mis en évidence que les mêmes BVSM sont capables d'induire et de stimuler la production de lymphocytes TCD8 spécifiques d'un antigène qui leur est associé. L'invention a donc pour objet une composition de vaccin thérapeutique comprenant des particules ayant une taille comprise 20 et 200 n et comprenant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, lesdites particules étant associées dans la composition à un ou plusieurs antigènes. L'invention concerne tout particulièrement une composition de vaccin thérapeutique. Une telle composition peut bien entendu comprendre également un ou plusieurs excipient ou adjuvants appropriés.
Les compositions de l'invention sont remarquables en ce que de manière inattendue, les particules permettent d'induire, de stimuler ou d'augmenter une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique majoritairement TCD8.
En effet, les systèmes particulaires sont plutôt connus pour induire une réponse TCD4 par le mécanisme de l'endocytose (présentation aux molécules du CMH de classe II). Cependant des réponses TCD8+ sont possibles si les antigènes sont captés par des cellules dendritiques immatures. Pour obtenir une induction de lymphocytes TCD8, les peptides doivent être présentés par les molécules du CMH de classe I ce qui nécessite la dégradation des antigènes dans le cytosol cellulaire. Il est surprenant que les BVSM soient capables d'induire ces deux réponses qui font appel à deux mécanismes différents
Ainsi, le mécanisme d'action des BVSM semble être d ' une part 1 ' augmentation de la pénétration cellulaire des antigènes par la voie de l'endocytose, la concentration de l'antigène dans les endosomes mais aussi une amélioration du transfert des endosomes vers le cytosol cellulaire, celui-ci permettant une meilleure présentation des épitopes obtenus par dégradation cytoplasmique et/ou endosomale de l'antigène, au molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I présent sur le reticulum endoplasmique .
Il n'est pas évident qu'un système choisi pour stimuler la production de TCD4 permette également la stimulation des TCD8. Ainsi, 1 ' alum ne permet pas de stimuler la production de TCD8.
L'invention se rapporte donc tout particulièrement à l'utilisation de particules ayant une taille comprise 20 et 200 nm comprenant une noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, associées à des antigènes identiques ou différents, pour la préparation d'une composition de vaccin, lesdites particules induisant, stimulant ou augmentant une réponse immunitaire cellulaire T cytotoxique. L'invention a tout spécialement pour objet une composition de vaccin thérapeutique.
Les antigènes sont spécifiques de la ou des pathologies pour lesquelles une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique TCD8 est recherchée. Ainsi, la composition de vaccin thérapeutique selon l'invention peut être utile dans des méthodes pour prévenir et/ou traiter des infections chroniques d'origine virale, comme par exemple HSV, HIV, hépatite B et C, HPV, EBV, etc.. ou d'origine bactérienne, comme Heliobacter pylori, tuberculose, etc.. ou encore dues à des protozoaires, comme dans le cas de la malaria. La composition de vaccin thérapeutique selon l'invention est également utile pour traiter des tumeurs, dans le cas de cancers (mélanome, cancer du sein, du colon, des ovaires etc..) .
La taille des particules utilisées dans le cadre de l'invention est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.
Le noyau hydrophile non liquide des particules est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés. Ces polysaccharides sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.
Avantageusement, des ligands ioniques sont greffés sur le noyau. Les ligands ioniques portent au moins sur une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques , ammonium quaternaires, aminés secondaires, aminés primaires.
Une forme particulière de particules utilisées selon l'invention, comprend un noyau hydrophile non liquide tel que défini ci-dessus, recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles. Les composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs.
Une autre forme particulière de particules utilisées selon l'invention, comprend un noyau hydrophile non liquide tel que défini ci-dessus, recouvert en totalité ou en partie de deux couches de composés amphiphiles. Avantageusement, le noyau hydrophile non liquide est couvert en totalité ou en partie d'une première couche d'acides gras, elle-même recouverte en totalité ou en partie d'un couche lipidique. Les antigènes entrant dans les compositions de l ' invention sont associés aux particules par des liaisons __> ioniques ou par des liaisons hydrophobes . Les antigènes peuvent être associés au noyau des particules ou à la couche externe de celles-ci .
L ' invention est tout particulièrement adaptée à la préparation de compositions pour l ' administration mucosale , notamment nasale , mais tout autre mode d ' administration, par exemple parentérale , peut être envisagé .
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant :
- Exemple 1 : l'association de la protéine chimérique IEl-pp65 aux BVSM.
- Exemple 2: l'association de l'antigène HBS aux BVSM, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
. La figure 1 représente le sensorgramme obtenu lors de l'injection d'une suspension d'antigène HBS sur une sensorship saturé en BVSM visant à prouver l'association entre le BVSM et l'antigène (1 : injection de 20 μl de BVSM KY à 50 μg/ml ; 2 : injection de 20 μl de rHBsAg à 7,5 μg/ml) . - Exemple 3 : la stimulation in vitro de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
. La figure 2 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées 2 fois par l'ALVAC-IEl et re-stimulés in vitro soit par la vaccine-IEl, soit par la formulation IEl-pp65/BVSM, soit la chimère IEl-pp65.
. La figure 3 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées 2 fois par l'ALVAC-pρ65 et re-stimulés in vitro soit par la vaccine-pp65, soit par la formulation IEl-pp65/BVSM soit la chimère IEl-pp65.
Exemple 4 : la stimulation in vivo de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
. La figure 4 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par l'ALVAC-pp65 et l'ALVAC- IEl et « boostées » soit par les formulations IE1- pp65/SMBV, soit par la protéine libre IEl-pp65. La stimulation in vitro est réalisée par les formulations IEl- pp65/SMBV. Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IEl (figure 4A) L929-vacc-pp65 (figure 4B)/lyse L929-vacc-wt. ) .
. La figure 5 représente la réponse CTL anti- IEl, dans un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par les ALVAC-IEl et ALVAC-pp65 et« boostées » soit par les formulations IEl-pp65/SMBV (figure 5A) , soit par les ALVAC- IEl et ALVAC-pp65 (Figure 5B) . La stimulation in vitro est réalisée soit par les formulations IEl-pp65/SMBV, soit par les vaccines IEl, pp65 ou gB. Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IEl / lyse L929-vacc-wt. ) .
. La figure 6 représente la réponse CTL anti- pp65, dans un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par les ALVAC-IEl et ALVAC-pp65 et« boostées » soit par les formulations IEl-pp65/SMBV (figure 6A) , soit par les ALVAC- IEl et ALVAC-pp65 (Figure 6B) . La stimulation in vitro est réalisée soit par les formulations IEl-pp65/SMBV, soit par les vaccines IEl, pp65 ou gB. Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-pp65 / lyse L929-vacc-wt. ) .
- Exemple 5 : la re-stimulation de cellules TCD8+ cytotoxiques anti-pp65 de donneurs séropositifs vis à vis du CMV, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
. La figure 7 représente la re-stimulation de CTL anti-I9Y à partir de PBMC d'un donneur HLAB35 séropositif en présence soit de la formulation BVSM / IE1- pp65, soit de la chimère IEl-pp65, par comparaison aux résultats obtenus par administration i. m. d'un ADN HBS (référence) .
Exemple 6 : l'induction in vivo de lymphocytes TCD8+ spécifiques de l'hépatite B par administration nasale, où il sera fait référence au dessins en annexe dans lesquels :
La figure 8 représente la réponse CTL spécifique HBS chez les souris immunisées par voie intranasale avec l'antigène Rhbs libre ou associé au BVSM.
Exemple 1 : Association de la protéine chimérique IEl-pp65 aux BVSM.
La protéine chimérique IEl-pp65 est décrite dans le brevet WO 98/26074. Les deux protéines IEl et pp65 appartiennent au cytomégalovirus humain (HCMV) . La protéine recombinante IEl-pp65 a été produite et purifiée à partir de cellules d'insectes Sf9 infectées par un baculovirus recombinant codant la protéine chimère IEl-pp65.
Les BVSM cationiques sont décrits dans le brevet WO 94/20078. Ils sont composés d'un noyau polysaccharidique (NPS) réticulé et fonctionnalisé (avec une charge de 2mEq/g) associé à une bicouche lipidique, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) et cholestérol (70/30 w/w) , dans un rapport lipide/NPS de 30/100 (w/w) . La chimère est diluée en PBS (Phosphate Buffered Saline de composition 2.5 mM de NaH2P04 et Na2HP04, 30 mM NaCl, 0,7 mM de KCl, pH 7,4) + 10%glycérol à une concentration de 1224μg/ml. Le BVSM sont dilués en eau à une concentration de 20,4mg/ml en NPS et de 6.06mg/ml en lipides. Plusieurs formulations ont été réalisées:
Les formulations IEl-pp65/BVSM (rapport 1/10 en NPS) sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IEl-pp65 pour une administration parentérale. La formulation est réalisée par un mélange de 81,7μl (soitlOμg) de IEl-pp65 à 1224μg/ml avec le BVSM KY7125 ( lmg de NPS soit 49μl) . Les formulations sont diluées à raison de 19,3μl de tampon PBS + 10% glycérol afin d'administrer un volume final de 150μl par souris.
Les formulations IEl-pp65/BVSM (rapport 1/1 en NPS) sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IEl-pp65. Celles-ci sont réalisées pour les études in-vitro. La formulation est réalisée par un mélange de 81,7μl (soit lOμg) de IEl-pp65 à 1224μg/ml avec le BVSM (lOμg de NPS soit 5μl de BVSM à 2mg/ml) Les formulations sont diluées à raison de 913, 3μl de tampon PBS + 10%glycérol soit lOμg/ml (67nM) en protéine. La caractérisation de l'association est réalisée soit par électrophorèse en condition native soit par résonance plasmonique de surface (Biacore X, Pharmacia) . Dans ces deux techniques une association supérieure à 85% peut-êre démontrée.
Exemple 2 ; As soc iation d ' une protéine recombinante , l ' antigène HBS , aux BVSM.
La protéine recombinante ( rHBsAg de Rhein Biotech ) correspond à la protéine de surface du virus de l'hépatite B. La protéine recombinante a été produite et purifiée à partir de cellules de Hansenula polymorpha par une technique de DNA recombinant codant pour la protéine de surface. La protéine est fournie à 1310 μg/ ml en NaCl 154mM, phosphate de sodium pH 7,0 10 mM.
Les BVSM cationiques sont décrits dans le brevet WO 94/20078. Ils sont composés d'un noyau polysaccharidique (NPS) réticulé et fonctionnalisé avec une charge de 2mEq/g associé à une bicouche lipidique, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) et cholestérol (70/30 w/w), dans un rapport lipide/NPS de 30/100 (w/w).
Deux types de formulation ont été réalisées par ajouts successifs:
- suspension de BVSM™ KY,
- suspension de rHBsAg.
La préparation est "vortexée" après chacun des ajouts.
Ces deux formulations permettent d'obtenir un ratio rHBS/BVSM de 1/40 etl/72 (W:W) respectivement.
Les formulations sont caractérisées par mesure de taille des particules obtenues sur les formulations diluées en PBS de façon à ce que leur concentration en BVSM™ KY soit de 1 g/1, sur une suspension de rHBsAg diluée en eau ou en NaCl 150 mM de façon que la concentration en rHBsAg soit de 0,19 g/1.
Le tableau I ci-dessous représente les mesures des tailles moyennes des particules de deux formulations.
Tableau 1
Figure imgf000017_0001
Les mesures réalisées sur Granulomètre Zetasizer 3000 (MALVERN) montrent que la taille moyenne des particules est de 40 nm environ pour l'antigène libre.
A l'inverse les tailles moyennes de partcicules sont d'environ 200nm (Table 1) pour les formulation rHBsAg/BVSM.
Les formulations sont caractérisées par résonance plasmonique de surface. Dans un premier temps l'existence d'interactions rHBsAg/ BVSM™ KY est mise en évidence lors d'injections de solutions de rHBsAg sur sensor chip HPA (Sensor chip HPA, BR-1000-30, BIAcore, Uppsala, Suède) saturée en BVSM™ KY. Un exemple de tracé obtenu est présenté en figure 1. II apparaît clairement que la rHBsAg interagit avec les BVSM™ KY immobilisés sur la sensor chip HPA.
L'évaluation du taux d'association de rHBsAg aux BVSM™ KY est effectué par la même technique. Des injections de suspensions de rHBsAg à différentes concentrations (de 2,5 à 12,5 μg/ml) sur Sensor chip HPA saturée en BVSM™ KY ont été réalisées. L'équation de la droite de régression est utilisée pour opérer un calcul du taux d'association à partir de la conversion des signaux obtenus en concentration de rHBsAg libre lors d'injections de formulations.
Les taux d'association déterminés par cette technique sont supérieurs à 95%.
Des injections de formulations à 500 μg rHBsAg/ ml présentant des rapports pondéraux rHBsAg/ BVSM™ KY de 1/x avec x variant de 40 à 0,1 ont été réalisées sur sensor chip HPA saturée en BVSM™ KY dans le but de vérifier que la présence de rHBsAg libre dans une formulation peut être détectée et quantifiée par résonance plasmonique de surface. Pour x inférieur ou égal à 1 le taux d'association déterminé devient inférieur à 100% (40% environ pour x = 0,1 contre 99% pour x = 0,5).
La technique employée permet donc bien d'observer et de quantifier le rHBsAg libre dans une formulation.
Dans les formulations aux ratios pondéraux rHBsAg/ BVSM™ KY de 1/72 et 1/40, le nombre de "sites" disponibles sur les BVSM™ KY semble être très supérieur au nombre de "sites" nécessaires à l'association de la totalité du rHBsAg.
Ces études ont permis de montrer que l'antigène rHBsAg peut être formulé avec les BVSM™ KY. Les taux d'association déterminés par résonance plasmonique de surface dans des formulations rHBsAg / BVSM™ KY présentant des rapports pondéraux de 1/40 et 1/72 sont supérieurs à 95% et restent inchangés après 45 jours de conservation à 4°C.
Exemple 3 : Stimulation in vitro de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IEl ou de pp65.
1) Méthode .
Des souris femelles CBA (haplotype H-2K) (élevage Janvier) ont été immunisées à J0 et éventuellement J15 avec des canarypox recombinant ALVAC-IEl ou ALVAC-pp65 (Virogenetics ) . La dose administrée en intrapéritonéale (IP) par souris est de 2xl08pfu diluée dans un volume final de lOOμl par souris .
15 jours après chaque immunisation, la rate est prélevée puis déposée dans un tube stérile de 45ml (Falcon) maintenu dans la glace et contenant du milieu de culture : RPMI 1640 (Gibco), 5% Sérum Veau Fœtal (SVF), 2.10"5M 2- mercaptoethanol, lOmM Hépés, 2mM glutamine, Pénicilline, streptomycine, Pyruvate de Sodium. Les splénocytes sont extraits stérilement, purifiés et repris à une concentration de 2.5xl05 splénocytes/ml . Les splénocytes ainsi récupérés sont utilisés pour un test de cytotoxicité (relargage de chrome 51 par les cellules cibles).
Les cellules présentatrices d'antigènes « feeders » utilisées sont des splénocytes naïfs prélevés sur des souris CBA non immunisées. Après extraction et purification, ces splénocytes naïfs sont incubés (5xl06 splénocytes/puits ) pendant 90mn dans 500μl de milieu sans SVF en présence :
- soit de vaccine-IEl (Virogenetics) ;
- soit de vaccine-pp65 (Virogenetics) ;
- soit de chimère soluble IEl-pp65 Une solution est préparée : 67nM (lOμg/ml) en tampon PBS (Phosphate
Buffered Saline de composition 2,5 mM de NaH2P04 et Na2HP04, 30 mM NaCl, 0,7 mM de KC1, pH 7,4) + 10%glycérol ;
- soit avec la formulation IEl-pp65/BVSM : Les formulations IEl-pp65/BVSM à un rapport IEl-pp65/NPS de 1/1 (w/w) à 67nM (lOμg/ml) en protéine sont formées par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IEl-pp65 en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline de composition 2,5 mM de NaH2P04 et Na2HP04, 30 mM NaCl, 0 , 7 mM de KC1, pH 7,4) + 10% glycérol ; Après l'incubation, 500μl de milieu sont enlevés et remplacés par 2ml/ puits de milieu avec SVF. On incube pendant 18h à 37°C et 5%C02. Les splénocytes sont récoltés puis ils sont irradiés à 4000R.
La stimulation est réalisée en mélangeant par puits 2.5xl06 splenocytes/ml avec l,25xl06 feeders/ml. L'incubation se déroule pendant 5 jours à 37°C et 5% de C02.
L'activité cytotoxique des cellules non adhérentes est testée par un test de relargage de 51Cr. Pour ce test, les cellules cibles utilisées sont soit des L929 (H-2K) soit des P815 (H-2d) utilisées comme contrôle infectées par la vaccine-IEl, ou la vaccine-pp65 ou la vaccine-WT à une moi de 2,5 pendant 4h. Après lavage dans du milieu de culture, elles sont marquées au chrome (lOOμCi) pendant lh. Ces cellules chromées sont lavées 3 fois dans du milieu de culture, puis mélangées avec les cellules effectrices à différents rapports effecteurs/ cibles en réalisant des triplicates. L'incubation de 4h est réalisée à 37°C et 5% C02. La radioactivité contenue dans le surnageant prélevé est comptée dans un compteur _ cobra (Packard) .
Le pourcentage de lyse spécifique correspond au rapport [cpm relargage expérimental - cpm relargage spontané/ cpm relargage total - cpm relargage spontané ]xl00.
La radioactivité totale a été comptée sur la suspension de cellules cibles incubées seules.
Le relargage spontané a été mesuré dans le surnageant des cellules cibles incubées seules. La déviation standard (SD) des triplicates est inférieure à 10% et le relargage spontané est inférieur à 25%.
2 ) Résultats. La figure 2 donne les résultats de cytotoxicité obtenus pour les souris immunisées par l'ALVAC-IEl et restimulés in vitro soit par la vaccine-IEl, soit par la formulation IEl-pp65/BVSM, soit par la chimère soluble.
La figure 3 donne les résultats de cytotoxicité obtenus pour les souris immunisées par l'ALVAC-pp65 et restimulés in vitro soit par la vaccine-pp65 , soit par la formulation IEl-pp65/BVSM, soit par la chimère soluble.
Les résultats rassemblés dans le tableau 2 ci- dessous montrent l'apport des BVSM sur la stimulation des CTL in~vitro avec une lyse spécifique anti IEl de 39,9% lorsque les splénocytes sont restimulés in vitro par la formulation IEl-pp65/BVSM, 11,7% par la protéfne chimère soluble et 34.9% par la vaccine-IEl (figure 1).
Ces résultats sont confirmés avec une lyse spécifique anti pp65 de 31,9%, 12,2% et 22,3% respectivement lorsque les splénocytes provenant d'animaux immunisés avec ALVAC-pp65 sont stimulés in vitro par la formulation IEl-pp65/BVSM, par la protéine chimère soluble et par la vaccine-pp65 (figure 2).
Tableau 2
Figure imgf000022_0001
Dans le tableau 2, les résultats de cytotoxicité sont obtenus pour les splénocytes provenant de souris immunisées 1 ou 2 fois par l 'ALVAC-IEl ou pp65 en fonction du mode de re-stimulation in vitro (ratio effecteurs/cibles 100/1). Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IEl ou L929-vacc-pp65 /lyse L929-vacc-wt. )
Ce tableau permet également de comparer les résultats obtenus lorsque les souris ont reçu une ou deux immunisations avec ALVAC-pp65 ou IEl. Dans tous les cas on obtient un meilleur pourcentage de lyse spécifique par une stimulation in vitro réalisée avec la formulation IE1- pp65/BVSM ou la vaccine (IEl ou pp65). Par contre, ce pourcentage reste faible lors de la stimulation avec la protéine chimère soluble IEl-pp65 seule.
Ces résultats montrent la capacité des formulations IEl-pp65/BVSM à permettre une présentation des épitopes de IEl et de pp65 par les molécules du CMH de classe I et donc la capacité de ces formulations à stimuler et à expandre in vitro des effecteurs T CD8+ spécifiques de IEl et pp65 induits in vivo par l'ALVAC-IEl et -pp65.
On peut également conclure de ces résultats que ces formulations IEl-pp65/BVSM permettent la stimulation in vitro des lymphocytes T CD8+ spécifiques de IEl ou de pp65 de manière similaire à des systèmes vivant (vaccine IEl ou pp65).
Exemple 4 : Stimulation in vivo de lymphocytes
T CD8+ spécifiques de IEl ou de pp65.
1) Méthode .
Une primo immunisation des souris CBA (souris femelles CBA (haplotype H-2K) (élevage Janvier) est réalisée par une administration par voie intrapéritonéale d'un mélange de deux poxvirus recombinants ALVAC-IEl et ALVAC-pp65 (Virogenetics). La dose administrée en intrapéritonéal (IP) par souris est de lxl08pfu/souche diluée dans un volume final de lOOμl par souris.
Deux rappels identiques in vivo par voie IP sont réalisés après la primo immunisation à J28 et J56 :
- soit avec la protéine IEl-pρ65 libre à raison de lOOμg/souris ou de 20μg/souris dans un volume final de lOOμl/souris,
- soit avec la formulation IEl-pp65/BVSM: Les formulations sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène chimérique IEl-pp65 pour une administration IP, ces complexes sont en suspension dans du PBS + 10% glycérol. Deux formulations sont utilisées. Pour la première, le rapport chimère/lipides est de 1/3 et chimère/NPS de 1/10. La dose est de lOOμg de protéine IEl-pp65 dans un volume final de 150μl par souris. Pour la seconde formulation, le rapport chimère/lipides est de 1/15 et chimère/NPS de 1/50. La dose est de lOOμg de protéine IEl-pp65 dans un volume final de lOOμl par souris,
- soit avec les deux ALVAC recombinants (témoin positif),
- soit avec du BVSM (témoin négatif). Celui-ci est administré à raison de lmg de BVSM (équivalent NPS) dans un volume final de lOOμl par souris.
La réponse TCD8 est évaluée sur les splénocytes prélevés 15 jours après la dernière administration. Ce test de cytotoxicité par la technique de relargage de 51Cr est réalisé comme décrit dans 1 ' exemple précédent .
La stimulation in vitro est effectuée soit avec les formulations IEl-pp65/BVSM, soit avec la protéine chimère IEl-pp65, soit avec la vaccine-IEl, -pp65 et -gB.
2 ) Résultats.
La figure 4 résume les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IEl et pp65) à J0 , puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 avec divers antigènes : soit la formulation IEl-pp65/BVSM à lOOμg/souris ou 20μg/souris correspondant à des rapports protéine/NPS de 1/10 ou 1/50 respectivement, soit la chimère soluble IEl-pp65 à lOOμg/souris ou 20μg/souris, soit le BVSM. Les résultats obtenus sont présentés en fonction de la spécificité de la réponse : IEl ou pp65.
2.1) Réponse contre la protéine IEl :
Les résultats obtenus montrent qu'une réponse spécifique contre la protéine IEl est observée lorsque les souris sont immunisées par la formulation IEl-pp65/BVSM à un rapport 1/10 et 1/50 (w/w) . Ceci s'observe notamment lors de la stimulation in vitro par la formulation IEl- pp65/BVSM (lyse spécifique de 45 et 40% respectivement pour les souris immunisées par la formulation à 1/10 et 1/50 (w/w) alors que les souris immunisées par la chimère IE1- pp65 libre à lOOμg ou 20μg donnent 20% de lyse spécifique. Ce résultat étant équivalent au témoin négatif (BVSM)) (Figure 4A) . Ce résultat est confirmé lors de la stimulation in vitro avec la chimère IEl-pp65 libre (15% et 3% respectivement pour la formulation IEl-pp65/SMBV et la chimère IEl-pp65 ). Ces résultats ne sont pas montrés.
La figure 5 compare les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IEl et pp65) à J0, puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 soit la formulation IEl-pp65/BVSM à lOOμg (figure 5A) , soit les deux ALVAC-IEl et -pp65 (figure 5B) . Les résultats obtenus sont présentés en fonction du type de stimulation réalisée in-vitro (formulation IEl-pp65/SMBV, vaccine-IEl, pp65 ou gB). Dans ces conditions un peu saturantes, aucune différence significative ne peut être observée entre 1'ALVAC et les formulations IEl-pp65/SMBV.
Ainsi pour la réponse TCD8 dirigée contre la protéine IEl, les résultats permettent de conclure que :
- La formulation IEl-pp65/BVSM stimule in vivo des T CD8+ spécifiques de IEl après un priming par l'ALVAC de façon similaire à la stimulation obtenue par un système vivant (les ALVAC). A l'inverse, la chimère IEl-pp65 libre ne permet pas d'obtenir cette stimulation in vivo quelle que soit la quantité administrée (lOOμg ou 20μg par souris) .
- On observe une meilleure stimulation in vitro de T CD8+ spécifiques de IEl par la formulation IEl- pp65/BVSM par comparaison avec la chimère IEl-pp65 libre ainsi qu'avec la vaccine-IEl.
2.2) Réponse contre la protéine pp65 : Les résultats obtenus montrent qu'une réponse spécifique contre la protéine pp65 est observée lorsque les souris sont immunisées par la formulation IEl-pp65/BVSM à un rapport 1/10 et 1/50 (w/w). Ceci s'observe notamment lors de la stimulation in vitro par la formulation IE1- pp65/BVSM (lyse spécifique de 20 et 15% respectivement pour les souris immunisées par la formulation à 1/10 et 1/50 (w/w) alors que les souris immunisées par la chimère IE1- pp65 libre à lOOμg ou 20μg ne permette pas d'obtenir de lyse significative (<10%) (figure 4B).
La figure 6 compare les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IEl et pp65) à J0, puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 soit avec la formulation IEl-pp65/BVSM à lOOμg (figure 6A) , soit avec les deux ALVAC-IEl et -pp65 (figure 6B) . Les résultats obtenus sont présentés en fonction du type de stimulation réalisée in vitro (formulation IEl-pp65/SMBV, vaccine-IEl, pp65 ou gB) . Dans ces conditions les ALVAC à l'inverse des formulations IEl-pp65/SMBV ne permettent pas l'obtention d'une lyse spécifique quelque soit le mode de stimulation in vitro (notamment avec la formulation IEl-pp65/BVSM et la vaccine-pp65 ) .
Ces résultats démontrent l'apport du BVSM pour la stimulation du système immunitaire et notamment la réponse cellulaire T CD8+ spécifique de 2 protéines cibles majeures du HCMV, IEl et pp65. Exemple 5 : Re-stimulation de cellules TCD8+ cytotoxiques anti-pp65 à partir des PBMC de donneurs séropositifs vis à vis du CMV.
1 ) Méthodes .
1.1) Re-stimulation des CTL.
4 x 106 PBMC de donneurs de phénotype HLA connu (HLA-A2 ou HLA-B35 ou HLA-B7 ) ont été incubées en plaques 24 puits en présence de RPMI complémente en sérum humain avec différentes sources d'antigènes: soit un peptide épitope connu issu de la protéine pp65 (CMV AD169) NLVPMVATV (N9V, HLA-A2 ) IPSINVHHY (I9Y, HLA-B35) RPHERNGFTV (R10V, HLA-B7), soit un peptide non-épitope, soit la protéine chimère IEl-pp65 soluble soit la formulation constituée de l'association entre le BVSM et la protéine IEl-pp65 soit les BVSM seuls. Aux jours 3 et 7 de l'IL-7 est ajoutée (lOOU/ml, Biosource). Au jour 12, la restimulation est effectuée en utilisant des PBMC allogéniques irradiées (2000Rad) en présence des mêmes antigènes. Aux jours 13 et 15, de l'IL-2 (20U/ml, Sanofi- Synthelabo, Labège) et de l'IL-7 ( 100U/puits)sont ajoutés.
1.2) Test de cytotoxicité.
Un test de relargage de chrome 51 est effectué 5 jours plus tard en utilisant comme cible des cellules B/EBV de phénotype HLA identique. 5 x 105 cellules cibles en 24 puits sont incubées en RPMI-10%SVF pendant 18 h avec avec un peptide relevant ou non relevant. Les cellules sont marquées avec du (51Cr )Na2Cr04 (lOOμCi par puits, ICN) pendant 2 h et lavées 3 fois en RPMI-SVF.Les cellules effectrices sont incubées avec 5 x 103 cellules cibles à des rapports effecteur/cible variable, en triplicate dans des plaques 96 puits et incubées pendant 5h. Le pourcentage de lyse est calculé selon la formule : (cpm de l'expérience moins cpm relarguês spontanément) divisé par (cpm maximal relargués moins cpm spontanés) x 100. Le relargage spontané représente toujours moins de 25% du relargage maximal. La déviation standart était inférieure à 5%.
2 ) Résultats.
La figure 7 montre les résultats obtenus lorsque des PBMC d'un donneur HLA-B35 ont été utilisés pour restimuler des CTL anti-pp65 en utilisant soit le peptide relevant I9Y, soit le peptide non relevant N9V, soit la protéine IEl-pp65, soit la formulation IEl-pp65/BVSM, soit le BVSM seul. La spécificité des CTLs obtenus a été testée en utilisant comme cibles des lymphocytes B transformés par EBV d'haplotype HLA-B35 incubés en présence du peptide I9Y. Les résultats d'un test de re-largage de chrome 51 par les cibles révèlent que des CTL ont été re-stimulés en présence du peptide relevant I9Y et pas avec le peptide N9V. De plus, la protéine soluble IEl-pp65 a permis une restimulation améliorée lorsqu'elle est incluse dans la formulation puisque 4 fois moins de cellules effectrices sont nécessaires pour obtenir un niveau de lyse équivalent. Ce résultat suggère que la formulation IEl-pp65 / BVSM a permis de re-stimuler et d'expandre un nombre de CTL anti- I9Y de façon plus important qu'avec la protéine soluble et qu'avec le peptide seul.
Des résultats similaires ont été obtenus à partir de PBMC de donneurs possédant des haplotyppes HLA-A2 et HLA-B7 pour lesquels des peptides épitopes sont connus (voir protocole expérimental) . II faut noter que cette potentialisation semble dépendre de la fréquence d'effecteurs présents au moment du test. En particulier, elle est d'autant plus importante que l'activité de re-stimulation de la protéine IEl-pp65 soluble est faible. Outre cet effet potentialisateur, il est remarquable de noter que la formulation IEl-pp65 a permis la délivrance de la protéine dans le cytosol des cellules présentatrices contenues dans les PBMCs du donneur et la génération du peptide I9Y capable de se lier aux molécules du CMH de classe I.
De plus, l'utilisation de la formulation offrirait outre l'avantage de protéger l'antigène de la protéolyse, de re-stimuler des CTL spécifiques de plusieurs épitopes correspondant à des haplotypes HLA différents, contrairement à un peptide.
Exemple 6 : Induction in vivo de lymphocytes TCD8+ spécifiques de l'hépatite B par administration nasale.
1) Méthode.
Des souris BALB/c (5 souris par groupe) sont utilisées dans les expériences d'immunisation contre l'hépatite B. On administre par voie nasale l'antigène recombinant Hépatite B( Rhein Biotech) soit sous forme libre, soit en association avec les BVSM . La dose est de 8μg/souris à J0. Un boost est réalisé avec le même matériel à J21 et J42. Un autre groupe de souris est immunisé par voie intramusculaire avec le plasmide HBs (50μg). Ce groupe est utilisé comme contrôle positif. A un autre groupe, on administre également le BVSM seul. Enfin un dernier groupe est constitué de souris naïves jouant le rôle de contrôle négatif. Deux semaines après la dernière immunisation, les souris sont tuées, on prélève les rates qui seront analysées pour la réponse lymphocytaire T cytotoxique (TCD8+) . Dans ce but, les cellules de rate des souris immunisées et des souris contrôle sont re-stimulées in vitro pendant 5 jours. L'activité cytotoxique des cellules non adhérentes est testée par un test de re-largage de Cr51 (comme décrit dans les exemples précédents). On utilise comme cellules cibles des cellules P815 (cellules possédant le même haplotype) incubées avec un épitope spécifique CTL.
Le pourcentage de lyse spécifique correspond au rapport : (cpm re-largage expérimental — cpm re-largage spontané / cpm re-largage total — cpm re-largage spontané)
* 100.
2) Résultats.
La figure 8 représente les résultats obtenus. Elle montre clairement la capacité des formulations de BVSM à induire une forte réponse TCD8 après immunisation intranasale. En particulier, quelque soit le ratio utilisé entre l'antigène et le BVSM (1/40 et 1/72 w/w correspondant respectivement à rHBsAg / SMBVl et rHBsAg / SMBV2 ) les formulations rHBs / BVSM sont capables d'induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques HBs chez 5 des 5 souris immunisées. Le niveau d'activité des lymphocytes T cytotoxiques semble fort comparé au contrôle positif (administration intramusculaire de plasmide libre HBs). Au contraire l'antigène libre n'induit aucune réponse cytotoxique significative.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation de particules ayant une taille comprise 20 et 200 nm comprenant une noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, associés à des antigènes identiques ou différents, pour la préparation d'une composition de vaccin, lesdites particules induisant, stimulant ou augmentant une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique.
2) Utilisation de particules selon la revendication 1 pour la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique.
3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite composition est utile pour prévenir et/ou traiter des infections chroniques d'origine virale ou bactérienne, ou encore dues à des protozoaires.
4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite composition est utile pour prévenir et/ou traiter une infection HIV, hépatite, herpès, ou la tuberculose.
5) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce que ladite composition est utile pour prévenir et/ou traiter des cancers.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite composition est utile pour prévenir et/ou traiter un cancer du sein, des ovaires ou du colon. 7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la taille des particules est entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.
8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide des particules est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que les polysaccharides sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.
10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que des ligands ioniques sont greffés sur le noyau.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les ligands ioniques portent au moins sur une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques , ammonium quaternaires, aminés secondaires, aminés primaires.
12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les particules comprennent un noyau hydrophile non liquide recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles . 13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que les composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs.
14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le noyau hydrophile non liquide est couvert en totalité ou en partie d'une première couche d'acides gras, elle-même recouverte en totalité ou en partie d'une couche lipidique.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les antigènes sont associés aux particules par des liaisons ioniques ou par des liaisons hydrophobes.
16) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les antigènes sont liés au noyau des particules ou à la couche externe de celles-ci.
17) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite composition est adaptée pour une administration par voie mucosale de préférence nasale .
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