WO2002033068A1

WO2002033068A1 - Method of analyzing nucleic acid base sequence

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Description

明細書核酸の塩翻 ¹ Jの方法技術分野

される DN Aチップを用いた核酸塩翻己列を特定する方法に関する。

背景抆術

核酉等の物質の酉 ¹ Jを決定し、或いはその酉 ¹ Jをチェックする手法のひヒつに DNAァレイ利用する方法ある。 USP5445934には、 1ィンチ角に 1 0万個 Lのオリゴヌタレォチドプローブき合した DNAアレイの開示がある。このような DNAアレイは、少量の検体で一度に多項目を儉査できるという利点ある。このような DNAチップ上に、蛍識した檢体を流すヒ、 i N Aチッブ上のプローブど相補的な酉び' Jを有する D N A 断片はブローブど結合し、その部分おけ h ^;¾[：より鄰' Jでき、 D N At¾l 中の D N A断 f の Sび' Jを解明するこどできる。

Sequencing by Hybridization (S B H) 法は、このような DNAアレイを利用し: ¾I己列を調べる方法で、 USP5202231にその詳細が ¾ されている。 S B H法では、ある長さについて可能な才リゴヌクレオチドの^己列を基 fej に並べ、検体 DNAとのハイプリダイゼーションによって形成される完全にネ的なハイプリッド体を検出するもので、完全に相補的なハイブリッド体のセットを得れば、そのセットはある配列について 1塩基ずつずれた配列の集合になるはずであり、それら斤することにより判定を行うものである _α

原理的には、検体 DNA中に、ある特定の酉 ¹ jがあるどうを調べるためには、その配列ど相補的な配列をプローブどしてハイブリタ"ィゼーション^ 行って結合の有無を調べるこどどなる。しかし、実際には、 1種類のプローブでハイプリッドの有無を調べ、それ基にひどつの檢直項目どして判定するこどは非常に難しい。なぜなら、完全に相補的なハイプリッ卜"体を比べるヒ、ハイブリッド体由来の光はそれぞれの配列によ ')強度異なる。特に、塩截 e ^中の G C舍量はハイプリッド体の安定性に大きな影響を羊える。しかも、完全に相補的ではなく 1塩基のミスマッチを舍む §び¹ Jでも、ハイブリッド体を形成し、蛍光をする。そのハイブリッド体は、同じ配列間で tt^するど、完全マッチのものより安定す生が低く蛍光は弱くなるが、完全にネ目補的な他のハイプリッド体よりも蛍光強度が高いというこヒはよく見られる現象である。また、 1塩基ミスマッチどはいっても、ハイブリツド体のヒ'の位置にミスマッチを含むかによっズその安定性は大きく変化する。末端にミスマッチを会む場合には、 tt^的安定なハイブリッド体が得られるが、ハイプリッド体の真ん中に会む場合には相補鎖の逸统部分が分割されるために不安定になる。このように、ハイブリッド体の安定性に関してはいろいろな要因が絡み合い、完全にネ g#的か否かを判定する蛍光 ¾t の, 直（¾iW直）どいうのが得られな、のかえである。また、 1塩基ミスマッチを ¾ ^に排除し、完全マッチからのみの蛍光を検出しうる条件というものも齊られていないといえる。

配列によるハイブリツド体の安定す生の遠、を解消するための工夫どして、 Proc . Natl . Acad. Sci. USA Vol.82, ppl585-1588 (1985)には tetramethylammonium chlorideを用いる方法がされている。しし、上己問題点を完全に解-;肖するには至っていない。

そこで、完全マッチか否を判定する方法どして、 Science vol.274 ρβΐθ- 614, 1996には 15merのオリゴヌクレオチドのプローブ 1己列の真ん中に 1塩基ミスマッチを配した酉己列を用意し、完全マッチど 1塩基ミスマッチどのハイブリッド由來の蛍光強度を t ^し、完全マッチの方が ¾ ^が強いときにポジティブど列定するような方法がされている。さらに、 USP5733729には上記方法に加えてより正確な判定を行うための方法どして、コンピューターを用いて、得られたハイプリッド体の蛍光強度の tt|交ら検体の塩基配列を知るための方法が開示されている。

これらの方法では、調べたい位置の核酸堍基部分をブ'ローブの真ん中に ¾ し、その位置に必ず 4種類のヌクレオチドセットを用意するこど、及びそのようなプローブのセット 1塩基ずつずれた酉 ' Jについて用意するこどが必要どされる。そしてのような 15mer の才リゴヌクレオチドを用い、真ん中に 1煤基ミスマッチを有する他の 3種類のプローブヒの tb^を行って完全マッチ、否を判定するという方法で、それぞれの安定性、理論勺に或いは » ^に ffiし、より精度を得ることできるどされている。また、調べたい領域の塩基の長さが Lであれば、プローブ数は 4 X L (5塩基であれば 2 0種）になる。上己のミスマッチを利用する方法は同じ ¾ ^の同じ位置の 1塩基ミスマッチとのを行うこどで判定が ty¾的容易である点、及びブローブ数が少なくて良い（S B Hでは同樣な斤に 1 0 2 4種のプローブが必要）点において優れた方法ではあるが、同じ領烕に 2 塩基ミスマッチがある場合、或いは、塩基の欠損、挿入がある場合には正確な情報が得られないどいう重大な欠点がある。

一方、 S BH法は、上記問 ¾ ^を解決し、原理勺にはヒ'のような变異にも对可食な方法ではあるが、その判定はかなり難しい。それは、ある酉 ' Jの完全マッチよりも別の酉 ' J の 1塩基ミスマッチの方が強度が強いこヒや、 1 基ミスマッチどはいつズも、酉 ' j中のどのィ立置にミスマッチがあるかによって、そのハイプリッド体の安定性が大き〈異なるこどによる。その結果、 ^マッチ、 1塩基ミスマッチ、 2塩基ミスマッチ（繞、不速统）は蛍光酸ら草純 (こ判断することはできず、理勺な予測、配列どの、 «ΐι勺なパラメーターの蓄積どいつた複雑な解析を必要ヒする。

さらに、ひどつひとつのプローブに Μしてそのハイブリッド体の強度を則し、その値を斤して遺伝子を決定、判定するためには、アレイを読みどる検出裝置の他に大がりなコンピューター裝置を必要ビし、 DNAアレイを利用した簡便な遺伝子 «を行う上で大きな障害どなる。

このような問題点に鑑み、本明では、複雑な斤を必要とせず、正確に遺伝子の ffi^'J を決定する方法を提供する。

^ 明の開示

J iiのようにハイプリッド沐の強度は種々の要因によって支配されており、 15mer 、ら 20mer程度の長さのプローブを用いた場合に、 1塩基ミスマッチ有するハイブリツド体の蛍光強度を完全に除くことは事実上困難である。それに対し、 2塩基ミスマッチを有する配列は、 2¾基ミスマッチの位置、逸绕、不逸统にかわらず、ハイブリッド体の形成抑制する条件を得ることが tbfe勺容易である。

本^明は、このような見に基づいてなされたものであって、完全マ.ソチ S己列のスボッ卜に力。えて、所定のミスマツチ数、例えば 1 ¾ミスマツチの酉 ¹ Jを有するハイブリヅド体のスポットも、ポジティブど見なす点にひとつの特徴を有する。

つまり、本明の一実拖態樣にる標的一本鎖核酸の、所定の部位の、未知の塩己列を特定する方法は、

( a ) 該未知の塩 ¾3己列の予想される複数の塩己列の各々に対してネ議的な塩基酉び' j を有する 1春〜 n畚 (n≥2) の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に玄いに隔離されるように酉されているプローブアレイを用意する: m ;

( b ) 該一本鎖 «ブローブの内の 1つが有する塩び' Jに対して ¾^栖捕的な塩 ¾g己列を有し、、つ蛍識施された標識化一本鎖«を舍む第 1のサンプルど該ブローブアレイどを亙いにネ的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で^^させ、未の標識化一本鎖核酸を除去したのらに、該アレイ、らされる蛍光強度該プロ一ブアレイ上の各々の一本鎖ネ滅ブローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の 1 本鎖核酸ブ口一ブの位置どその蛍光特性どの関係を示す第 1のテンプレートパターン得る:! ^里；

( c ) 他の全ての一本鎖核酸プローブのそれぞれについて、該ステップ（b ) ど同一の橾作を行ない、該プロープアレイ上の 1 ^核酸ブ口―ブ ^f各々の塩翻び Jに対して相補的な一本鎖核酸と二本鎖核酸を形成したときの該プローブアレイ上の各々の 1本鎖核酸プローブの位置ヒその泶光樹生どの関係示す第 2〜第 nのテンプレートパターンを得る： ^呈；

( d) 該プローブアレイど該標的一本鎖核酸を舍む第 2のサンプルどを該テンプレートパターンを得た条件と同じ条件の下で^ iさせ、次いで蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の; ¾S己列の一 ^J核酸プローブについて測定し、該プロ一ブァレイ上の各々の 1本鎖御プローブの位置とその蛍光特性との閣係を示すサンプルパターンを得る呈：

( e ) 該サンプルパターンを上 ( b ) 及び（c ) で得た n個のテンプレートパタ一ンど对比し、該バターンと宾質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンの作成に用いた一本鎖核酸の塩を該標的一本鎖核酸の、未知 o^SS^'iどして特定する呈、

を有するこどを待徵とするものである。また、本明の他の実施態樣は、例えば 1塩基ミスマッチと 2塩基ミスマッチハイブリッド体の蛍光強度との間にしきい悛 (threshold) を設け、ポジティブどネガティブに区別する点にひとつの特徵を有する。係る他の宾態樣は、標的一本鎖核酸の所定の部位の、未知の^！を特定する方法であって、

( a ) 該未知の塩 ¾1己列の予想される複数の塩^!己列の各々に対して栢捕的な塩基 ¾?'J を有する 1畚〜 n春 ( n≥2 ) の複数種の一本鎖核酸プロ一ブの各々が基体上に亙いに隔離されるように酉^されているプローブアレイを用意する

( b ) 該一本鎖核酸プローブの内の 1泰目の塩 ¾S己列に対して ¾ ^相補的な塩 ¾g己列を有し、かつ標識かされた一本鎖核酸を舍む第 1のサンプルど該プローブアレイどを亙いにネ S#的な一本鎖ネ¾¾同士二ネを形成する条件下で;^させ、！ ^される蛍光を該プロ一ブアレイ上の各々の塩び' Jの一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の 1本鎖プローブの位置とその蛍光待す生との関係を示すテンプレー卜ノ、'ターン I 得る呈；

( c ) 得られた第 1のテンプレートパターンを嫩斤し、各位置のプローブどミスマッチ煤数（i ) を有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値（Fi) 算出する： ^里；

( d ) ミスマッチのない完全相補的な二本鎖核酸の蛍光量 ) ど、 1塩基ミスマッチを有する二本鎖の蛍光量の平均値 (F,) との差 (F_li0) を求め、さらに、 (i+1) 塩基ミスマッチ有する二本鎖ネ¾1 の蛍光量 (F_i+]) ど i塩基ミスマツチの蛍光量 (F;) の差（F_i+U) を求め、 Fi, _i+1 <く F iとなるような iを¾ ^する呈；

( e ) 第 2春目のプローブの埴絲 ' Jに対して、ミスマッチ塩 ¾#ォの数が i以下になる

有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置をポジティブとし、ミスマツチを有する塩基配列のプローブの基体上の位置をネガティブとし、ボジティブの位置が形成するテンブレ一トパターン IIを得る呈；

( f ) ( e ) と同一の係作を他のすべての一本鎖核酸プロ一ブについて行い、ミスマツチ塩^^の数が i以下になる塩基配列を有する一本鎖核酸プローブの基休上の位置が形成するテンブレー卜パターン Π Ι〜ηを得る；

( g ) 該プローブァレィと該標的一本鎖核酸を舍むサンプルと該苐 1のテンブレー卜パターンを得た条件と同じ条件の下で^^させ、蛍光の有無及び強度該ブ σ—プアレィ上の各々の塩蘇己列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該ブローブアレイ上の各々の

1本鎖核酸プローブの位置どその蛍光待 f生どの関係を示すパターンを得る；

( h ) 該パターンを上 i ^呈 ( b ) ( e ) 及び（ί ) で得た η個のテンプレートパターンと对比し、該パターンと実質的に"^するテンプレートパターンがある場合に、そのテンブレートパターン ίこ対する一本鎖核酸の塩基酉 ¹ Jを該檫的一本鎖核酸の、未知の塩基配列としズ特定する ^圼、

を有することを特徵どするものである。

そしてこのような態樣を採用するこどで、上己ポジティブと区別されたスポ 'ソトが基板上で形成するパターンを象として得、それ予想パターンど tt^することによりその配列を斤することができ、未知の遺伝子酉 ¹ Jを容易 ίこ特定するこどができる。

また、本明においては、さらにこのような 1塩基ミスマッチと 2塩基ミスマッチを完全に区別するためのハイプリダイゼーション ¾^条件を提示する。

更に、本^明にかかるハイブリダィゼーシヨン^方法は、標的一; Φ^ί核酸を舍むサンプルどプローブアレイどを^ ^させる ίΙにおい、プローブアレイ基板をサンプルを舍む ϋ中で熱変性し、その後基板をサンプル^ ¾に¾したまま、二 ¾形成に適した温度に降下させてを行なうこどを特徵どするものである。

上記の方法において熱变性を行なう温度は 6 0°ひが好ましい。更に、二本鎖形成反を行なう温度は 4 0°C i-であるこど好ましい。更に、熱変性に要する時間は 1 0分 >^_Lであるこど予ましい ₀

一方、本明の检出方法は、上記のハイブリダィゼーシヨン^^方法用いたサンプルの検出方法であつて、显度を降下させて^^を行なう呈の後、温度を上异させた状態で洗浄行なうことを特徴どするものである。

また、上記方法において前記サンブルを含む溶液の二本鎖形成^^における ¾¾i農度を高くし、前先浄における農度を低くするこどが好ましい。更に、 ¾ ^本鎖形成反における^ ¾中にホルムアミドを舍有させることか'好ましい。図面の簡革な説明

図 1は、 6 4種のブ'ローブを用いた場ノ、の ffi^ 例を示す。図 2は、標的核酸の配列に対して基ネのポジティブど剡断される領 i或の配置のパタ一ン示す図である。

図 3は、標的核酸に対する変異酉】において基ネ^ Lでポジティブど判断される領 i或の配置のパターンを示す図である。

図 4は、実例 1で得られた蛍光量のノ、"ターンを示す図である。

図 5は、宾例 2において予想されるパターンを示す図である。

図 6は、実抱例 2で得られた蛍光量のしきい值 1 0%でのパターンを示す図である。図 7は、宾拖例 3で得られた蛍光量のノ、'ターンを示す図である。

図 8は、ゲノム DNAを用レ、たハイプリダイゼ一ション «の,き果を示す図である。

明を実拖するための最良の形態

以下本明につ、て具勺 [こ説明する。

(蛍光像による判定）

本明のー实拖態樣では、ミスマッチを起こす可能性のある核酸塩基が近接して存在する場合に特に有効である。ここでは、癌抑制遺伝子 p 5 3の 2 3 8春目、 2 3 9畚目のァミノ ifeg己列に対する塩基酉び' J 含む⁵' GATGGGNCTC顧 GTTCAT ^例どして说明する。上記例は、^明のを説明するためのひとつの形態であり、いかなる形態のアレイにおいても、本明は^象どして^ ¾するどいう点では同樣な概念を提示しており、何らアレイの形態、プローブの ¾ ^をするものではない。また、当然のことながら、 S BH法も本發明の斤对象である。

上 ' Jにおいて、 Nで記した各基部分を 4種の塩基（A、 G、 C、 T) に置き換えたプローブの完^ Ητノトを用意した場合、つまり、 3力所绕している必要はない）の塩基について調べる場合には、 4³= 6 4種の、 5力所の場合には 4⁵= 1 0 2 4種のプロ一ブ '基ネに並ぶ。

6 4種のブローブを用いた場合の配置例図 1に示す。

6 4種プローブアレイを 4分割した左上の領¾には、最初の Νが Αであるプローブ（プロ —ブ春号 1〜： L 6) ¾己置され、左下には Gであるようなプローブ（プローブ春号 1 7〜 3 2) ¾己置される。同樣に、右上は C (ブローブ舂号 3 3〜4 8) 、右下は T (プロ一ブ春号 4 9〜6 4) となる。各領战の中で、 2春目の Nが Aであるようなプローブは左から数えて 1歹¹ J目、 Gは 2列目、 Cは 3列目、そして Tは 4列目に位置する。また、 3眷目の Nが Aであるようなプローブは上から数えて 1行目、 Gであるような酉 ¹ jは 2行目、同樣に Cが 3行目、 T 4行目に配置される。その結果、例えば、 s'GATGGGACTCMGTTCAfどいった酉 ' jは最も左上のスボッ卜に対する。また、正常な遺伝子に相当する酉 ' Jである s'ATGAACCGGAGGCCCATC³'は、右から 3列目、上から 3行目の位置にあるプローブ DNA ⁵'GATGGGCCTCCGGTTCAf'とハイブリッドを形成することが期待される。

以下、 1塩基ミスマッチをポジティブスポットどして极ぅ場合についズ説明する。この場合に、完全マッチ酉 ' Jか' 4 2春のプローブ（正常遺伝子）であるとするど、ポジティブヒ判断される 1塩基ミスマッチ配列は、塗りつぶされた 9カ所ヒなり、完全マ'ソチど合わせて図 2に示されるようなパターンを形成するこど予想される。

これに対し、標的御の特定すべき配列に対する ^では例えば図 3に示すようなパターンの变^ 見られる。

本!^明では、このような完全マッチど 1塩基ミスマッチらなる予想される蛍^ 、。ターン像を予めコンピュータ等の己憶装置に入力しておき、所定の方法で得られる蛍光像との tt^により判定を行う。この時、それぞれのポジティブスポッ卜の蛍光強度の詳細な定量データは必要ない。单にあるしきい儘に対するポジティブ、ネガティブの判定のみで良く、簡便つコンビユータ等ィした自動化された判定可能どなる。

(しきい値の

18merfl^のプローブを用いる場合 (：:は、そのしきい值を通常 1塩基ミスマツチの蛍光強度ど 2塩基ミスマッチによる蛍光強度どの間に設定するの好ましい。蛍光強度はそれぞれの酉 ¹ j組成、 ^条件により異なるが、最も高い蛍光強度（通常は完全マッチのもの）の 5 0%から 2 5 %の il より好適には 30%から 20%をしきい値として ¾：定するど良い。プローブ長が短い場合には、しきい値はさらに低くなる。

3塩基ミスマッチを舍むものは;^値の 1割以下の蛍光量であり、完全に区別できる。しきい値を蛍光量の 1 /4 (こ¾¾した場合、完全マッチ酉 ' J及び 1塩基ミスマッチ配列を 4 , 2塩基ミスマッチ δ ¹ Jを 1 、 3塩基ミスマッチ酉び¹ Jを 0どして蛍光強度の分布を予想するど図 4のようになる。より具 ώ勺な判定方法について上につい説明する。

ハイブリダイゼーションが極めズ選 ί尺的に進行した場合には、強い蛍光は 1点（完全マッチ）に集中する。次に惑度を徐々に上げるど、

3から予想されるように、 1塩基ミスマッチは完全マッチを中心に縦横のライン状に並ぶはずである。しかし、宾際の蛍光像は必ずしも強いスポッ卜中心に縦横それぞれ 3個ずつライン狀に並ぶどは限らない。 1度基ミスマッチ間の安定す生の達いにより、 6個がすべて同じ禾!^のを有するどは限らないため、検出されないスポットもあるが、少なくどもこれらのライン|えにいくつかスポットが見えるはずである。その時、残る 3個の 1塩基ミスマッチも予想される位置に強度の濃淡はあるものの検出できる。

また時には、完全マッチど 1塩基ミスマッチが同程度の蛍光強度を冬え、最初から^ マッチど 1塩基ミスマッチどの 1 0スボッ卜からなる予想される像に近い象が得られる。

2塩基ミスマッチは、時ヒしズしきい值を越える場合があるが、そのような場合でも、予想、。ターンからのずれどして容易に判別できる。

このように予想パターンと実際に得られる蛍光像との t により判定する本発明の方法は、檢伝子中の異の有無を容易に判定でき、さらにどの塩基（複数でもが何に変異している、変異の内容を同時に判定可能であるどいう特徵を持つ。

また、 6 4種のプローブによるハイブリダィゼーシヨンの結果を、 'ターンてするどいう考えは、 1スポ'ソ卜のみで判断する場合に比べ、より確実な判断どいう点で有利である。 6 4種の DNAプローブどのハイブリッドは、それぞれの酉 2^により定性異なるため、必ずしも完全マッチの場合圧倒的に安定で強、蛍光をするヒいう保はない。ま^ 基 ¾Jのゴミゃハイブリダィゼーシヨン時のアーティファクトどいつたこど、'原因で、どれ h：'最強のスポットで完全マツチのスボットである、列断できないことも多い。その点バターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきあってもそれを補える。

(プローブ

本^明に用いられるプローブ長は 8merから 30meril度、より好ましくは、 12merから 25mer である。 8mer以下では 1塩基ミスマッチ有するハイプリッド体の安定性は低く、完全マツチ由来の蛍光量の方憂位である。また、 30merより長いプローブでは 2塩基ミスマッチ体の蛍光が、場合によっては（例えば、丙にミスマッチ窗所存在する場合） 1 ¾ ミスマッチよりも強くなる。

(ハイブリダィゼーシヨン条件）

上記良好なしきい值孚えるハイブリダィゼーシヨンの条件としては、基板^ f本を検 ¾¾中に浸したままカ^ ¾し、基 feJの DNAプローブど検体 DNAの双方を同時に熱変す生し、その後徐々してやや高めの温度でハイブリダィゼーシヨン^^を行う。 ^時の ¾i級は ΙΟΟπιΜ以下が望ましい。

熱変性を亍ぅための温度ヒしては、 6 0°CvVLL、好ましくは 8 0°O iが適当である。熱変す生のための温度の設定は、 DN Aアレイ基板自体の安定性、検体の長さ、濃度、標識化合物の種類 ί：して決められる。例えば、樹脂塗布しその樹脂ど DNAど ^^させて結合したような基板では、高温にすることにより、 ¾ "脂層が石皮壞されるこどがある。それに対し、シランカツプリング剤を作製過程で用いた基板は、熱に対し tt^的安定であり、さらに高温にするこどができる。検体 DNAがー本鎖の場合には、 7 0°C _Lで分子内二^ ^構造はほぼ解消されるど考えられるが、二本鎖の場合或いは検体 DNA 長い一本鎖 DNAの場合には、さらに溫度を上げたり、ホルムアミド等の变性剤を加えて一 ^i i への解離を ¾ する必要ある。熱变性に要する時間は 1 0分 y 、好ましくは 3 o i 度が良い。

ハイブリダィゼーシヨン^^の条件は、プローブ長、 m 検体の種類を考慮し、常法にい温度や変えるこどによって行われる。本明のような、極めて類似した配列を区別して認識するめの条件どして好適に用いられるのは、 100π を含む^ ¾中、 4 5°Cで 3時間である。しかし、時間は検 ί により大きな影響を受け、上記条件に限らな、。高の検体ならば 3時間以内で充分判定能であり、また、検体が希薄であれば、 1 0時間ン ±·の^^時間必要である。ホルムアミドをカロえる場合 (二はを高める必要 >'ある。

(DN Αアレイ基板の製法）

本ハイブリダィゼーション^^を良好に進めうる DN Aアレイの作製方法として、以下にその例示す。しかし、本！^明の趣旨は、基ネ^のハイブリダィゼーシヨンパターンを t iffiし、検体の塩 '〗を決めるための簡便な^法を示すことであり、勺に、基板の作製方法にはこおわらない。 DNAアレイでは、 DNAプローブを基ネ^:面にある官能基ヒの JSJSにより共有結合により固定する。該官基と DNAとの、結合 # ^どして、例えば、ガラス表面のマレイミド基ど DNA«の S H基との結合を行わせる方法について示す。

マレイミド基の導入方法どしては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリンダ剂をさせ、次にそのアミノ基と EMC S試藥 ( -(6-Maleimidocaproyloxy) succinimide： D o j i n社！）との^によりマレイミド基導入する。 DNAへの S H基の導入は、 DNA自動合 «J 5，- ThioHfodifierC6 (Glen Research社船を用いる事により行うことができる。

該 DNA¾¾をィンクジエツト法により基ネ^ にスポット形成させ、該 DNA基ネ^ L のマレイミド基と DNA^¾の S H基どのにより、プローブ DN Aを固定化する。ィンクジエツ卜法によるマレイミド基を有するガラス基板への吐出に適したどしては、グリセリン、尿亲、チォジグリコール又はエチレングリコール、ァセチレノール EH (川村ファインケミカル社、イソプロピルアルコールを舍む^ ¾が好ましい。特にグリセリン 7 . 5 %、尿素 7 . 5 %、チォジグリコール 7 . 5 %、ァセチレノール E H 1 % ( 、ずれも質量％) を会む、'好ましい。

DN Aが結合したアレイ基板は、 2%ウシ^青アルブミン水〉中に 2時間浸し、プロッキングを行った灸、ハイブリダィゼーシヨン ^に用いられる。

【実囊

以下 ίこ実施例により、より詳細に説明する。

1 ：パターン M I )

1 . プローブの計

癌抑制遣伝子である p 5 3遺伝子の 248春目、 249泰目のアミノ酉 fe§己列に对する塩己列 CGGAGGの中での異の中で頻度高いのは、 1春目の Cが Tに、 2眷目の Aが Gに、そして 249泰目のアミノ酸 3春目の Gが Tに異している場合であること知られている。そこで、この 3力所の塩己列に着目して 6 4種のプローブを設計し卢:。

つまり、プローブ^:を 18merどし、その真ん中にこの变異を舍む 6 基を位置させ、その前後を^ で抉んお構造で、 5'ATGMC匪 GAGNCCCATC³'である。ここで、 Nと表し/ i部分が 4種の核酸塩基である A、 G、 G、 Tに対する。プローブ DN Aは、份出したい配列（上

L 1 i ) と的な酉び¹ Κ· 'あるので、実際には、 ⁵'GATGGGNCTCNNGTTCAfどなる。

図 1には 64種 DNAプローブの DNAアレイ上での酉^図を示した。己列（配列畚号： 1-64) を勺に表 1に示す。

【表 1】表 1

正常な遺伝子に相当する酉 ¹ Jである⁵' ATGAACCGGAGGCCCATC³'は、右から 3列目、上から 3 行目の位置にある 4 2春のプローブ DNA^GATGGGCCTCCGGT CA どハイプリッドを形成するこどか^待される。

6 4種の実驗でも、完全マッチ以外に 1塩基ミスマッチのハイブリッド体らの蛍光が予想される。 ¾ ^マッチと 1 基ミスマッチとらなる予想される ¾ 、°ターンを図 2に示す。

2 . マレイミド基導入基板の作製

(基《淨）

1インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に"^ ¾した。その後、洗剤中で 20分間超音波洗洚を行い、その後、 ⁷ 先により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、留水のはいった容器中でさらに超音波^ 5里 20分間行った。次に、あらじめ力 π¾してあった 1 N相化ナトリウム溶液に 10分間 ¾した。引き统きァ先、留, i先浄を行った。

(表面里）

1 %シランカップリング剤水溶液（信学工業社製、商品名 KBM6 0 3 ) に室温で 20分浸し、その後、窒素ガスを丙 Sに吹き付けて、水分を飛ばし、 $ させた。 1 2 0°C にカ^したオーブンで 1時間べークしシランカツプリンク ¾y里を完結させた。统いて、 EM C S (N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide D o j i n社を 2.7in g秤量し、 DMSO Zエタノールの 1 ： 1溶液に溶解した（最終 ^/炙 0.3mg/ml) 。シランカップリング剂処理を行ったガラス基板この EMC S¾¾に 2時間浸し、シラン力ップリング剤のアミノ基と EMC S のカルボキシル基をさせた。この狀態でガラス表面には EMC S由来のマレイミド基が表面に存在することになる。 EMC S¾i¾ど^!させたガラス板は蒸留水で洗浄後、玄素ガスで ¾ ^させ、 D N Aどの結合;^に用いられる。

3 . DNAの基板への合反

( 6 4種 D Ν Αブローブの合^)

5'末端に S H基（チオール基）を有する上己 6 4種のプローブ DNAは、（ネぉべックス（こ ί¾¾し合成した。

(DN Αプローブの吐出）

上己 6 4種の D N Aそれぞれ用、 X以下の吐出操作を行なっ。各 D N Aを水に溶解し、 SGクリア（グリセリン 7. 5% 尿素 7. 5%、チォジグリコール 7. 5%、ァセチレノール EH1%を舍む水を用いて最終^^ 8 μΜになるよう希尺した。少量のサンプルが吐出できるように改造した B Jブリンター用ヘッド BC62 (キャノン社 |ϋ のノズルにこの DNAの^ ¾を 100 μ 1充填した。各へッドあたり 6種の DNAか'吐出できるようにしズ 2つへッドを用い、一度に 12種の DNA 吐出し、へッドを 65；交換しズ、 64種の DNAのそれぞれのスポットか 3虫立して形成されるように吐出させた。

各プローブを、スポット径が 70/im、ピッチか 200μΐΏどなるようにま ¾ し、 8X8のマトリクス;！えに 64種を並べてスポッティングした。その後、 30 显チャンバ一中に «し、プローブ DN Aを基板に結合させるを行つた。

-ハイブリダイゼーシヨン^

(ブロッキング^)

終了後、 lM a C 1Z5 OmMリン酸緩敲 ( H7.0) にて基板を洗い、ガラス表面の DNA; を完全に洗い流した。その後、 2%ウシ^青アルブミン水溶液中に漫し、 2時間 »し、ブロッキング^を行った。

(モデル检体 DN Aの合^)

p 53遺伝子の正常な酉 ' 持ら、プローブ DNAど同じ領域で同じ長さの標識 DNA No.lを作製した。酉 ' Jは下に示す通りで、 5' にはローダミン結合してある。

No.l： ^B o-ATGAACCGGAGGCCCATC³'

(ハイブリタ'ィゼーシヨン条件）

DN Aアレイ基板の入ったハイブリダイゼーション J^用の袋に lOOnM NaClを舍む 10 nMモデル検体 D Ν Α>¾¾を Eml入れ、最初に 80 °Cで 10 ^ ¾ 、インキュベーターの溫度を 45°Cに下げ、そのまま 15時間^ させた。

5. 検出

は法）

検出は、蛍: (ニコン社に画 ί^|斤^ y里置 ARGUS (浜おホ卜ニタス社 1) を接統して行っ^。

(結果）

モデル系である 18merの標識 DNA No.lとのハイブリダイゼーションの結果得られた蛍光量、図 4に示す。蛍光量の最大值は完全にネ affi的である 4 2春のプローブである。その蛍光量を ( 1 0 0%) として、その 2 0%にしきい值を設け、それ Xjiのヒころを黒く塗りつぶしてある。

N o l O , 2 6 , 5 8の部分のスポットも蛍光をもら、予想パターン図 2ど良〈一致しズいることわかる。更にしきい値下げるこどにより、予想パターンと"^する。つまり、上記 3スポットに加え、マツチを中心に 1塩基ミスマッチ配列の部分が縱横のラィンに並ぶ。

2 ：パターン

実糊ど同樣 ί： 6 4種のプローブらなる DN Αアレイ基板を作製し、モデル検体どしズ No. 2の配列を持つローダミン標識 DNAどのハイプリダイゼーシヨン ¾ ^を行った。 No. 2の酉 ' Jは図 1の No.46プローブど相補的である。

No. 2 ： o - ATGAACCAGAGGCCCAT

ハイプリダイゼ一シヨン ^条件も実施例 1ど同樣である。

宾 ' J 1と同樣、予想されるパターンを求めたのか'、図 5である。それに対し、得られた結果を図 6に示す。しきい值を最大値の 1 0 %に¾¾してハイブリダィゼ一シヨン反応の結果を黒ぬりで示す。予想どの对がよ、。

(宾施例 3 ：パターンで III)

宾旄例 2と同じモデル検体 DNAを用いて宾施例 2ど同樣な宾驗を行った。但し、ハイブリタ"ィゼーシヨン^!に用いる検体 DNA を 5nMとし、 4 0°Cで ^ ^させた。得られた結果を図 7に示す。 .

しきい值を 5 0 %にすると、 1 ¾基ミスマッチの 3 4及び 6 2畚のブローブの位置（斜線部）に蛍光现れ、さらに 3 0%にまでしきい值を下げるど、予想パターンに合う結果となる。この場合、 NO. 6と 2 2の 2塩基ミスマッチも檢出されるが、 1塩基ミスマッチが構成するパターンらのずれとして、基ミスマッチであるこど列別でき、完全マッチのスポ 'ゾ卜が 46 # "であること J定可能である。

実施例 (ゲノ厶検体 D NA H S C 5の調

実 ' 1 Ί におけるプローブの設計、らプロッキング^^までの橾作を同樣に行な I、、測定用の D N Aアレイ基板を得た。この D N Aアレイ基板を用いて以下の橾作を行なつた。 1) HSC5の p53遺伝子のェキソンの增中 ¾

フランキングイントロンの塩基酉をもどに PCRプライマーを下己のように合成した。

E5S： 5'-TGTTCAC1TGTGCCCTGACT-3'( exon 5, sense)

E5A: 5'-TGAGGAATCAGAGGCCTGG-3'(exon 5， antisense)

E6S： 5'-GCCTCTGAnCCTCACTGAT-3' ( exon 6, sense)

E6A: 5'-nAACCCCTCCTCCCAGAGA-3'( exon 6, antisense)

E7S： 5'-ACTGGCCTGACTrTGGGCGT-3' ( exon 7， sense)

E7A： 5'-TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3'( exon 7, antisense)

E8S:5'-TAAATGGGACAGGTAGGACC-3'(exon 8， sense)

E8A: 5'-TCCACCGCTTCTTGTCCTGC-3'(exon 8， antisense)

PCR^は、 50〃Lの： PCR i^ ^に 10〜25ngのゲノム DNA、 0.4 1^のそれぞれのェキソンプライマーのセットをカロえ、 94°C(30秒)、 60。C(45秒）を 40 サイクル #桑り返し^^を行なった。

增幅された產物はェキソン 5〜8に对し、それぞれ 269、 181、 171、 229塩 ^"長であった。

2)ェキソンの標識化

4つのェキソンに対するテトラメチルローダミン標一本鎖 DN Aを得るために上記增幅されたェキソン DNAの"^を铸型として、 0.2/ Mのセンスプライマーど、 10M Mのテトラメチルローダミン標識 dUTP(FIuoro Red, Amersham Pharmacia B iotech社製）を用い、 96°C(30秒)、 50。C(30秒)及び 60。C(4分)のサイクルの PC R^^25サイクルなった。

得られた一^^ D Ν Αはゲル濾過 (こより精製した。

3)標 ¾Lェキソン用いズのハイブリダイゼーシヨン ^

上記テトラメチルローダミン標一本鎖ェキソン DNA 20%ホルムアミドを会む 6 X S S PE(0.9M NaCL 60 ,リ M NaH₂PCV 6 M EDT A ¾¾に ¾ ^年し、 D NAアレイ基板の入ったハイブリダィゼーション^^用の袋に 2mL入れ、最初に 80°C 2〜10 ^Η¾ί灸ィンキュベータ一の温度を 45。Cに下げそのまま 1 5時間^^させた„ その上 iDNAアレイを、 2 X S S P E( 0. 3M NaCL 2 0 NaH₂ P〇₄、 2 ί Μ EDTA)¾¾に浸し、 5 5°Cに温度上げて洗いの操作を行なった。

検出

実例 1ど同樣(こしズ檢出操作を行なつた。

結果

No. 1 0 , 2 6、 5 8の部分のスポットも蛍光をもら、予想パターン（図 8) ど良く一致しているこどがわかる（図 8 ¾)

実拖例 5 (HS C 4の p 5 3遺伝子の検出）

実例 1ど同樣に 6 4種のプローブからなる DNAアレイ基板を得た。以下、ローダミン標識 DNAの代わりにモデル検体として N o . 2の酉 ' 有する H S C 4を用い実例 2ど同樣にハイブリダイゼ一ション^^を行なった。なお、条件は実抱例 4と同樣とした。その結果、 N o . 1 4の位置に蛍光見られ予想パターンどの対応が良い結果が得られた。

產業上の利用可能性

このように、単にハイブリッドの有無のみで剡定する從來の方法に!;匕べ、本明の方法はさらに 1塩基ミスマッチの蛍光量を考慮 (こ入れることにより精度の良い檢出；可能ヒなつた。

DNAプローブどのハイブリヅドは、それぞれの配列によ ') 定性が異なるため、必ずしも完全マッチの場合が圧倒的に安定で強い蛍光をするという係 ί£はない。パターンでの判定は、 1スポッ卜のみで判断する場合に比べ、より確宾な判断どいう点で有利である。

基ネのゴミ.やハイブリダイゼーション^^時のァ一ティファクトといったこどが原因で、どれが最強のスポッ卜で完全マッチのスポヅ卜であるか剡断できないこども多い。その点、本發明におけるパターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきあってもそれを補えるこどか^! どなる。

従って、本明によって、遺伝子の变異を、簡便つ ί力率的にスクリ一ニングできる検直方法をォ是供するこどできる。

Claims

請求の範囲

1 . 標的一本鎖核酸の所定の部位の、未知の塩蘇 ¹ Jを特定する方法であって、

( a ) 該未知の塩己列の予想される複数の塩列の各々に対して相捕的な塩基 ¾^ を有する 1春〜 n春 (n≥2) の複数種の一本鎖ネ ¾S プローブの各々が基ネにいに隔離されるように酉^されているプローブアレイを用意する

(b ) 該ー本鎖核酸プローブの内の 1つが有する塩 ^¹ Jに対して ¾^ネ0¾的な塩 ¾@己列を有し、かつ蛍 «識抱された標識化一本鎖核酸を舍む第 1のサンプルヒ該プローブアレイとを亙いに ¾M的な一本鎖核酸同士が二本鎖核跛を形成する条件下でさせ、未 ^^の標識化一 ^Ji核酸を除去したのらに、該アレイから！される蛍光強度を該ブローブァレィ上の各々の一本鎖¾S ^プロ一ブについて測定し、該プローブァレィ上の各々の 1 本鎖核酸プ口一ブの位置どその蛍光; m生との関係を示す第 1のテンプレートパターンを得る ®；

( c ) 他の全ての一本鎖核酸プローブのそれぞれについて、該ステップ（b ) と同一の操作を行ない、該プローブアレイ上の 1本鎖核酸ブローブ ^f各々の塩び' Jに対して完全相補的な一本鎖核酸ど二本鎖核酸形成したどきの該プロ一プアレィ上の各々の 1本鎖核酸プローブの位置どその蛍光特性どの関係示す第 2〜第 nのテンプレートパターンを得る II；

( d ) 該プローブアレイど該標的一本鎖 ¾Ι を舍む第 2のサンブルとを該テンプレートパターンを得た条件ど同じ条件の下で^させ、次いで蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の;^！己列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブァレイ上の各々の 1本鎖プローブの位置どその蛍光特性どの間係を示すサンプルパターンを得る

( e ) 該サンプルパターンを上 ^ ^里 ( b ) 及び（c ) で得た n個のテンプレ一卜パタ一ンど对比し、玆パターンと宾質的に一致するテンプレ一卜パターンがある場合に、そのテンプレー卜パターンの作成に用いた一本鎖核酸の塩蘇 ' 該標的一本鎖核酸の、未知の塩 ' Jどして特定する呈、

を有するこど特揿どする標的一本鎖核豉の、所定の部位の、未知の塩^^列を特する方法。

2. 標的一本鎖核酸の所定の部位の、未知の塩びを特定する方法であって、

( a ) 該未知の塩己列の予想される複数の塩己列の各々に対してネ S#的な塩基酉 ' J を有する 1春〜 n畚 (n≥2) の複数種の一本鎖核酸プローブの各々基体上に亙いに隔離されるように酉2 ^されているプローブアレイを用意する ;

( b ) 該一本鎖ネ劾プローブの内の 1畚目の塩 ¾S己列に対して完全ネ Sffi的な塩 ¾g己列有し、かつ標識が施された一本鎖核酸を舍む第 1のサンプルど該プローブアレイとを亙いにネ a«的な一本鎖ネ劾同士が二本鎖核酸を形成する条件下でさせ、觀察される蛍光該ブローブアレイ上の各々の塩基酉び¹ Jの一本鎖核酸ブローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の 1本鎖核酸プローブの位置どその蛍光待 (·生との関係を示すテンプレー卜ハ 'ターン Iを得る；

( c ) 得られた第 1のテンプレートパターンを嫩斤し、各位置のブローブとミスマッチ塩数（0 を有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値 (F;) を算出する： ^呈；

( d ) ミスマッチのない完全相補的な二 ^i iネ滅の蛍光量と、 1塩基ミスマッチを有する二;^核酸の蛍光量の平均値 (F_;) どの差 (F_lit)) を求め、さらに、 (i+1) 基ミスマッチ有する二本鎖 «の蛍光量 (F_i+1) ど i塩基ミスマッチの蛍光量 (Fi) の差 (F_i+U) を求め、 Fi, _i+1 くく F_H, iどなるようなする:！ ^呈；

( e ) 第 2眷目のプローブの塩叙 2 ^に対して、ミスマッチ塩^の数が i以下になる塩 ¾S己列を有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置をボジティブとし、 i + l v'X_Lのミスマッチを有する塩己列のプローブの基体上の位置をネガティブどし、ポジティブの位置が形成するテンプレー卜パターン IIを得る： ι ίΕ；

( f ) ( e ) ど同一の橾作を他のすべての一 ^J i核酸プローブについて行い、ミスマツチ塩

するテンブレートパターン ΠΙ〜ηを得る里；

( g) 該ブローブアレイと該標的一本鎖ネ劾を舍むサンブルどを該第 1のテンプレートバターンを得た条件と同じ条件の下で^^させ、蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の塩翻己列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該ブローブァレィ上の各々の

1本鎖 ¾a¾プ口一ブの位置どその蛍光特性どの関係を示すノぐターンをる #： (h) 該パターンを上 ( b) ( e ) 及び（ί ) で得た η個のテンプレートパターンと对 t匕し、該パターンヒ宾質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンブレートパターン ίこ対する一本鎖核酸の塩基酉び¹ Jを該標的一本鎖核酸の、未知の塩基酉^ して特定する J¾、

を有するこどを待徵とする標的一本鎖核酸の、所定の部位の、未知の塩 ¾| ' Jを特定する方法。

3 . 該プローブアレイヒ該標的一本鎖ネ¾¾を含むサンプルとを該第 1のテンブレートパターンを得た条件ど同じ条件の下でさせた結果得られる該アレイの各々のサイ卜ら得られる蛍光の強度を Fiをしきい値ヒして二 ί直ィし、該プローブアレイ上の各々の 1本鎖核酸ブ口一ブの位置とその蛍光特性どの関係を示すパターンを得る呈を更にを備えている請求項 2にの方法。

4.該プローブァレィ上のプローブの長さが ¾nerから 30merの長さである請求項 2 & ^の方法。

5 . 該プローブアレイ上のプローブの長さが; L2mer ら 25merの長さである請求項 4¾¾ の方法。

6 . 前記ミスマヅチの数（ i ) が 1である請求項 2にの方法。

7 . 第 1のテンプレー卜パターン得るために 1春目の塩基酉び]に対して完全ネ的な塩 ¾S ' Jを有し、つ蛍 ¾ 、識をされた一本鎖核酸を含む第 1のサンブル及び標的一本鎖核酸を合むサンブルとプローブアレイヒを^させる I里において、プローブアレイ基扳をサンブルを合む^^中で熱变性し、その後基板をサンブル^ ：浸したまま、ニ^ ί 形成^!に適した温度に降下させてハイブリダィゼーシヨンを行う工程を更に有する請求項:！〜 6の、ずれにの。

8 . ブロープアレイ上のプローブの長さが I8merであり、熱変性を行う温度が 7 0。ひ XJ であ ')、二本鎖形成を行う温度が 4 0。O^J であ ')、その時のサンブル溶液に 1 0 0 mMのが舍まれて、る請求項 7にの方法。

9 . 標的一本鎖核酸を舍むサンブルどプローブァレイどを ½させるこおいて、ブローブァレィ基板をサンブルを舍む中で熱変性し、その後基板をサンブル溶液に浸したまま、二本鎖形成^^に適した温度に降下させて ^を行なうこと特徵どするハイブリダイゼーション方法。

1 0 . 前ま己熱変性 ¾·行なう温度が 6 0。ひである請求項 9 I i のハイブリダィゼーション SJ 法。

1 1 . 前本鎖形成^^ 行なう温度が 4 0。ひである請求項 9 (このハイプリダイゼーション方法。

1 2 . 己熱変性に要する時間は 1 0分-Aiである請求項 9にのハイプリダイゼーショ、ノ 1 ]^Τ: 。

1 3 . 請求項 9〜1 3にのハイブリダィゼーシヨン方法を用いたサンプルの検出方法であって、前显度降下させて ^を行なう：1 ^里の後、温度を上弄させた状態で洗淨行なうこどを特徵とする檢出方法。

1 4 . 前記サンプルを舍む)'^ ¾の二本鎖形成^！における溶¾¾を高くし、先淨における^ を低くする請求項 1 3にの検出方法。

1 5 . ifrte^^ i形成^^における溶液中がホルムアミドを舍有する請求項 9〜ι 4のいずれかにの検出方法。