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WO2002016035A1 - Multiwell filtrationsplatte und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Multiwell filtrationsplatte und verfahren zu ihrer herstellung Download PDF

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WO2002016035A1
WO2002016035A1 PCT/DE2001/003137 DE0103137W WO0216035A1 WO 2002016035 A1 WO2002016035 A1 WO 2002016035A1 DE 0103137 W DE0103137 W DE 0103137W WO 0216035 A1 WO0216035 A1 WO 0216035A1
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WO
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filtration plate
plate according
multiwell
multiwell filtration
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French (fr)
Inventor
Hans-Jürgen Hoffmann
Timo Hillebrand
Peter Bendzko
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Invitek GmbH
AHN Biotechnologie GmbH
Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
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Invitek GmbH
AHN Biotechnologie GmbH
Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
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Ceased legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B01L3/50255—Multi-well filtration

Definitions

  • the invention relates to a new multiwell filtration plate, preferably in 96-well or in 384-well format, consisting of two individual parts which are firmly and tightly connected to one another.
  • the first part represents a sample receiving part with filter plates, and the second part functions as an outlet part after filtration.
  • This plate according to the invention is particularly suitable for high-throughput applications in nucleic acid technology and for protein purification and analysis.
  • the invention was therefore based on the object of providing a multiwell filtration plate which affords protection against cross-contamination of the samples, which can be produced cost-effectively and can be used in multiple layers, e.g. for high-throughput applications in nucleic acid technology and in protein technology.
  • the new multiwell filtration plate consists of two tightly connected individual parts.
  • the upper part of the plate is defined as a sample receiving part 1, the lower part of the plate as an outlet part 2 with a filter 3.
  • This outlet part 2 comprises outlet nozzles 4 according to the invention for each well, via which the filtrate flows into a collecting vessel, e.g. a deep well plate is running for further determination.
  • the outlet part is thus by the correspondingly shaped outlet nozzle 4, depending on the plate vzw. 96 or 384.
  • outlet nozzles have an inner angle of inclination of 15-25 °, preferably 20 ° and each have an approximately 1.0-1.5 mm, preferably 1.0 mm thick support shoulder (sealing shoulder) 5 at the connection point to the upper part for stabilizing the filter insert 3 , Their length is approximately 5-15mm.
  • 96-well plates have outlet connections with a length of 10-15 mm, vzw. they have a length of 12 mm.
  • 384-well plates have outlet connections with a length of approximately 5-8 mm, vzw. they have a length of 5 to 6 mm. Possibly. the filtration plate is coupled to the outlet vessel.
  • outlet nozzles are generally round, in a further embodiment variant they can be designed at the outlet end or in a star shape with at least 8 openings.
  • the inner inclination angle of 15-25 °, preferably 20 °, and the special outlet design enable the filtered sample to be easily and completely discharged into the collecting vessel, e.g. the deep-well plate (minimizing the dead volume, almost 0). Due to the length of the outlet nozzle with vzw. approx. 12 mm for 96-well plates and with vzw. 5 to 6 mm for 384 well plates (known microtiter plates have spouts with a maximum length of 9 mm (96 well) and ⁇ 5 mm (384 well), the highly problematic cross-contamination can be avoided Multiwell filtration plate according to the invention can also be used for applications in PCR-based infection diagnosis.
  • the extension of the outlet connection further has the consequence that, in contrast to previously known filtration plates, the filtration plate according to the invention has an increased capacity capacity with a chamber volume of over 1 ml for 96 well plates and approx. 300 ⁇ l for 384 well plates, ie it larger sample volumes can be processed than usual. This also leads to more reproducible results. This is particularly true for the 384-well plates, which the specialist is very much looking for, and whose throughput has been increased sixfold.
  • the invention also relates to the process for producing the new multiwell filtration plate.
  • Both parts of the multiwell filtration plate are firmly connected to one another in a special production process using hydraulic pressing.
  • the compression takes place in each case on the recesses with the outlet connections (96 or 384).
  • the inner pressing edges are sharpened so that during pressing, in which the filter insert 3, such as. B. a filter mat is placed between the upper 1 and lower part 2, the wells corresponding filters are punched clean.
  • These punched out filter inserts are pressed with the upper part into the lower part and lie on the support step 5 in the lower part.
  • the upper part of the plate, the filter plate and the lower part of the plate are pressed firmly and tightly together by hydraulic pressure.
  • the multiwell filtration plate is preferably produced using the injection molding process with carefully set injection molding parameters.
  • the filtration plates according to the invention consist of materials known per se, such as polystyrene or polypropylene.
  • the injection molding material used is preferably a high quality polystyrene. Since only perfectly fitting injection molded parts are used, the pressing takes place without sealing lips etc.
  • the invention ideally solves all existing problems.
  • the plate is manufactured using a new technological process, which enables a filter material to be placed in the multiwell filtration plate in a highly efficient and inexpensive manner.
  • the new multiwell filtration plate is constructed in its constructive dimensions so that previously known cross-contamination can be eliminated via the shape of the outlet connection.
  • External dimensions (width and length) of the plate and the arrangement of the wells correspond to a normal microtitration plate, with a further advantage in increasing the volumes of the reaction cavities to approx. 1 ml (96 well) or to approx. 300 ⁇ l (384 well) exists.
  • all standard applications for automated isolation and purification of nucleic acids can be easily implemented with one plate.
  • the plate can also be used in protein purification and analysis without any problems.
  • FIG. 1 general view of a 96-well device
  • Fig. 2 a longitudinal section of the individual device parts

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue Multiwell-Filtrationsplatte, vorzugsweise im 96-Well- oder im 384-Well-Format, bestehend aus zwei Einzelteilen, die fest und dicht miteinander verbunden sind. Der erste Teil stellt einen Probeaufnahmeteil (1) mit Filterplättchen (3) dar, und der zweite Teil fungiert als Auslaufteil (2) nach erfolgter Filtration. Diese erfindungsgemässe Platte ist insbesondere für Hochdurchsatzapplikationen in der Nukleinsäuretechnik sowie zur Proteinaufreinigung und -analytik geeignet.

Description

Multiwell Filtratϊonsplatte und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft eine neue Multiwell-Filtrationsplatte, vorzugsweise im 96-Well- oder im 384-Well-Format, bestehend aus zwei Einzelteilen, die fest und dicht miteinander verbunden sind. Der erste Teil stellt einen Probeaufnahmeteil mit Filterplättchen dar, und der zweite Teil fungiert als Auslaufteil nach erfolgter Filtration. Diese erfindungsgemäße Platte ist insbesondere für Hochdurchsatzapplikationen in der Nukleinsauretechnik sowie für die Proteinaufreinigung und -analytik geeignet.
In den letzten Jahren zeichnete sich ein zunehmender Trend zur Automatisierung bei der Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren ab. Die Ursachen liegen darin begründet, dass sich in allen Forschungsfeldern der modernen Biotechnologie molekularbiologische Nerfahren immer stärker etablieren. Nicht zuletzt durch die DNA-Sequenzierung innerhalb weltweiter Genomprojekte (z.B. Humanes Genomprojekt) ist eine Automatisierung der Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA eine zwingende Voraussetzung geworden. Die Notwendigkeit der Entwicklung von Automatisierungsvarianten beschränkt sich dabei nicht nur auf den Bereich der Plasmid-DNA-Isolierung. Mehr und mehr gewinnt auch die automatisierte Isolierung genomischer DNA aus unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien und Mengen sowie die Isolierung von RNA an Bedeutung. Dies umfasst alle Bereiche der molekularen Basisforschung und zunehmend auch den Diagnostikbereich. Nerfahren der automatisierten Isolierung von Nukleinsäuren werden z.Z. über Mikrotestplatten mit eingebauten Filtermaterialien realisiert. Dabei sind z.Z. Verwendung findende Formate sog. 96-Well bzw. 384-Well-Mikrotestplatten.
Die z.Z. verfügbaren 96-Well-Mikrotestplatten mit Filtermaterial sind allerdings für Hochdurchsatzapplikationen extrem teuer. Dies resultiert aus den relativ komplizierten Herstellungsverfahren zur Einbringung des Filtermaterials in die Mikrotestplatte (US-A 4,948,442). Darüber hinaus realisiert bisher keine der bekannten Mikrotestplatten mit Filtereinsatz einen ausreichend hohen Schutz vor Kreuzkontaminationen von Proben bei Anwendung zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren. Die Ursache liegt in den viel zu kurzen Auslaufstutzen am Boden der Multiwell-Filtrationsplatten. Ein weiteres Problem sind die geringen Volumina der Reaktionskavitäten, z.B. beschrieben im EP-AI 0,098,534. Auch die bekannten 384-Well-Platten des Standes der Technik gestatten nur den Durchsatz geringer Volumina im jeweiligen Analyseverfahren, diese Volumina liegen bei ca. 50-80 μl. Für die Durchführung von Analysen, insbesondere zur automatischen Analyse, und für den Einsatz in Kombination mit Laborrobotern sind in den meisten Fällen jedoch Testplatten, die einen Durchsatz mit großen Volumina erlauben, erforderlich.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Multiwell-Filtrationsplatte bereitzustellen, die Schutz vor Kreuzkontaminationen der Proben gewährt, die kostengünstig herstellbar und vielschichtig einsetzbar ist, wie z.B. für Hochdurchsatzapplikationen in der Nukleinsauretechnik und in der Proteintechnik.
Die neue Multiwell-Filtrationsplatte besteht aus zwei dicht verbundenen Einzelteilen. Der obere Teil der Platte wird als Probenaufnahmeteil 1 definiert, der untere Teil der Platte als Auslaufteil 2 mit Filter 3. Dieser Auslaufteil 2 umfaßt für jedes Well erfindungsgemäß geformte Auslaufstutzen 4, über die das Filtrat in ein Auffanggefäß, wie z.B. eine Deep- Well-Platte, zur weiteren Bestimmung läuft. Im wesentlichen ist der Auslaufteil also durch die entsprechend besonders geformten Auslaufstutzen 4, je nach Platte vzw. 96 oder 384, gekennzeichnet.
Diese Auslaufstutzen besitzen einen inneren Neigungswinkel von 15-25°, vorzugsweise 20° und weisen an der Anschlußstelle zum Oberteil jeweils einen ca. 1,0- 1,5mm, vorzugsweise 1,0mm starken Auflageabsatz (Dichtungsabsatz) 5 zur Stabilisierung des Filtereinsatzes 3 auf. Ihre Länge beträgt ca. 5- 15mm. 96-Well-Platten weisen erfϊndungsgemäß Auslaufstutzen mit einer Länge von 10-15 mm auf, vzw. besitzen sie eine Länge von 12 mm. 384- Well-Platten weisen erfindungsgemäß Auslaufstutzen mit einer Länge von ca. 5-8 mm auf, vzw. besitzen sie eine Länge von 5 bis 6 mm. Ggf. ist die Filtrationsplatte an das Auslaufgefäß gekoppelt.
Desweiteren sind die Auslaufstutzen in der Regel rund, in einer weiteren Ausführungsvariante können sie am Auslaufende oder ganz sternenförmig mit mindestens 8 Öffnungen ausgebildet sein.
Der innere Neigungswinkel von 15-25°, vorzugsweise 20°, und das besondere Auslaufdesign ermöglichen ein problemloses und vollständiges Auslaufen der gefilterten Probe in das Auffanggefäß, z.B. die Deep-Well Platte (Minimierung des Todvolumens, nahezu 0) . Durch die Länge der Auslaufstutzen mit vzw. ca. 12 mm für 96-Well-Platten und mit vzw. 5 bis 6 mm für 384 Well-Platten (bekannte Mikrotiterplatten besitzen Ausläufe mit einer maximalen Länge von 9 mm (96 Well) und < 5 mm (384 Well) können die hochproblematischen Kreuzkontaminationen vermieden werden. Damit ist die erfindungsgemäße Multiwell-Filtrationsplatte auch für Anwendungen in der PCR- basierenden Infektionsdiagnostik nutzbar.
Die Verlängerung der Auslaufstutzen hat desweiteren zur Folge, dass im Gegensatz zu bislang bekannten Filtrationsplatten die erfindungsgemäße Filtrationsplatte eine vergrößerte Aufnahmevolumen-Kapazität mit einem Kammervolumen von über 1 ml für 96 Well Platten und ca. 300 μl für 384 Well-Platten besitzt, d.h., es können insgesamt größere Probenvolumina als bislang üblich verarbeitet werden. Das führt somit auch zu reproduzierbareren Ergebnissen. Besonders gilt dies für die vom Fachmann sehr gewünschte Anwendung der 384-Well-Plarten, deren Durchsatz damit um das — 6 fache gesteigert werden konnte.
Gegenstand der Erfindung ist auch das Verfahren zur Herstellung der neuen Multiwell- Filtrationsplatte. Beide Teile der Multiwell-Filtrationsplatte werden in einem besonderen Produktionsablauf fest miteinander über eine hydraulische Verpressung verbunden. Die Verpressung erfolgt jeweils an den Vertiefungen mit den Auslaufstutzen (96 bzw. 384). Werkzeugmäßig sind die inneren Verpressungskanten so geschärft, dass bei der Verpressung, bei der der Filtereinsatz 3 , wie z. B. eine Filtermatte, zwischen Ober- 1 und Unterteil 2 gelegt wird, den Vertiefungen entsprechende Filter sauber gestanzt werden. Diese ausgestanzten Filtereinsätze werden mit dem Oberteil in das Unterteil gepresst und legen sich auf den Auflageabsatz 5 im Unterteil auf. Durch hydraulischen Druck werden Plattenoberteil, Filterplättchen und Plattenunterteil fest und dicht miteinander verpresst.
Eine solche Verpressung wird erfindungsgemäß möglich, da Unterteil und Oberteil der neuen Multiwell-Filtrationsplatten in zwei absoluten Präzisionswerkzeugen (Heißkanaltechnik), die exakt aufeinander abgestimmt sind, mit einer maximalen Toleranz von 1/1000 mm, gefertigt werden. Scharfe Schneidkanten an den Verpressungsteilen der beiden Plattenteile ermöglichen das Ausstanzen von Einzelfiltern aus einer Filterplatte in einem Arbeitsgang mit dem eigentlichen Verpressen. Das Verpressen erfolgt direkt, d.h. es sind gemäß der Erfindung weder Nut noch Feder (wie aus dem allgemeinen Stand der Technik bekannt) erforderlich, was einen erheblichen technologischen Vorteil bedeutet. Die Herstellung der Multiwell-Filtrationsplatte erfolgt bevorzugt im Spritzgußverfahren mit sorgfältig eingestellten Spritzgußparametern. Die erfindungsgemäßen Filtrationsplatten bestehen aus an sich bekannten Materialien, wie z.B. Polystyrol oder Polypropylen. Das eingesetzte Spritzgußmaterial ist bevorzugt ein hochwertiges Polystyrol. Da nur passgenaue Spritzgussteile verwendet werden, erfolgt die Verpressung ohne Dichtungslippen u.a..
Die Erfindung löst in idealster Weise alle bestehenden Probleme. Die Herstellung der Platte erfolgt mittels eines neuen technologischen Verfahrens, welches hocheffizient und preiswert die Verbringung eines Filtermaterials in die Multiwell-Filtrationsplatte ermöglicht. Weiterhin ist die neuartige Multiwell-Filtrationsplatte in ihrer konstruktiven Dimensionierung so aufgebaut, dass über die Form der Auslaufstutzen bisher bekannte Kreuzkontaminationen beseitigt werden können. Außenmaße (Breite und Länge) der Platte und die Anordnung der Vertiefungen (vorzugsweise 8 x 12 Matrix) entsprechen einer normalen Mikrotitrationsplatte, wobei ein weiterer Vorteil in der Erhöhung der Volumina der Reaktionskavitäten auf ca. 1 ml (96 Well) bzw. auf ca. 300 μl (384 Well) besteht. Damit können prinzipiell alle Standardapplikationen der automatisierten Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren problemlos mit einer Platte realisiert werden. Des weiteren ist die Platte ebenfalls in der Proteinaufreinigung und - analytik problemlos einsetzbar.
Anschließend wird die Erfindung an den folgenden Beispielen näher erläutert.
Fig. 1 Gesamtansicht einer 96-Well-Vorrichtung
Fig. 2a Längsschnitt der einzelnen Vorrichtungsteile
Fig. 2b Längsschnitt mit Filtermembran
Fig. 3 Auslaufstutzen als Querschnitt
Bezugszeichenliste
1 Probeaufnahmeteil (Oberteil)
2 Auslaufteil (Unterteil)
3 Filtereinsatz
4 Auslaufstutzen
5 Auflageabsatz
6 Auslaufende (rund oder sternenförmig)

Claims

Patentansprüche
1. Multiwell Filtrationsplatte gekennzeichnet durch einen Probeaufnahmeteil (1) und einen Auslaufteil (2), der für jedes Well einen Auslaufstutzen (4) aufweist, welcher einen inneren Neigungswinkel von 15-25° besitzt und der mindestens 10mm lang ist, wobei sich an seiner Anschlußstelle von Probeaufnahmeteil und Auslaufteil ein Auflageabsatz (5) befindet, der einen Filtereinsatz (3) trägt.
2. Multiwell Filtrationsplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslaufstutzen (4) einen Neigungswinkel von 20° besitzt.
3. Multiwell Filtrationsplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslaufstutzen (4) rund aufgebaut ist oder ein sternenförmiges Auslaufende (6) aufweist.
4. Multiwell Filtrationsplatte nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das sternenförmige Auslaufende (6) acht Öffnungen aufweist.
5. Multiwell Filtrationsplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslaufstutzen (4) 5 bis 15mm lang ist.
6. Multiwell Filtrationsplatte nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine 96-Well-Platte ist, wobei der Auslaufstutzen (4) eine Länge von 5-10 mm aufweist, vorzugsweise 7 mm.
7. Multiwell Filtrationsplatte nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es eine 384-Well-Platte ist, wobei der Auslaufstutzen (4) eine Länge von 5-8 mm aufweist, vorzugsweise 5 bis 6 mm.
8. Verfahren zur Herstellung einer Multiwell Filtrationsplatte nach einem der Anspüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Probeaufnahmeteil (1) und den Auslaufteil (2) mit den Auslaufstutzen (4) mittels Heißkanaltechnik direkt so exakt aufeinander abgestimmt herstellt, dass sie eine maximale Toleranz von 1/1000 mm besitzen, und dass man sie an den Vertiefungen mit den Auslaufstutzen hydraulisch verpresst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass werkzeugmäßig die inneren Verpressungskanten so geschärft sind, dass bei der Verpressung ein Filtereinsatz (3) zwischen Probeaufnahmeteil (1) und dem Auslaufteil (2) gelegt wird und den Vertiefungen entsprechende Filter gestanzt werden, die mit dem Probeaufnahmeteil (1) in den Auslaufteil (2) gepresst und auf den Auflageabsatz (5) aufgelegt werden.
10. Verwendung einer Mutiwell-Filtrationsplatte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für Hochdurchsatzapplikationen in der Nukleinsauretechnik.
11. Verwendung einer Mutiwell-Filtrationsplatte gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in der Proteinaufreinigung und -analytik.
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