WO2002002815A1

WO2002002815A1 - Method of detecting nucleotide polymorphism

Info

Publication number: WO2002002815A1
Application number: PCT/JP2001/005792
Authority: WO
Inventors: Yutaka Takarada; Toshiya Aono; Masaya Segawa; Satoko Yoshiga
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2002-01-10
Anticipated expiration: 2003-01-05
Also published as: JP2002017399A; US20040121344A1; EP1300473A4; JP4310599B2; DE60135751D1; EP1300473B1; EP1300473A1

Description

塩基多型を検出する方法

技術分野

本発明は、核酸配列の分析法に関する。さらに詳しくは、特定の核酸配列中に含まれる塩基多型を検出することができる核酸配列分析法に関する。本発明の核酸配列分析法は、遺伝子工学や分子生物学及びこれらに関連する産業分野において有用である。

背景技術

本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる配列を有する遺伝子型であつて、多型遺伝子は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たしている。また体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マ一力一としての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとつて特に ί¾奨される (Gramおよひ Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics . Commission oi the European Communities, Luxembourg, 1990, ρρ87·96; Balantら， Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554、 1989)。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。

従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列^定法（シークェンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、铸型核酸の調製、ポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークェンサ一を用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。

他の方法として、サザンハイブリダィゼーシヨン法がある（村松正實編「ラボマニュアル遺伝子工学増補版」丸善株式会社発行、第 7 0〜7 5頁)。この方法によれば、標識された D N Aプローブと相補的な塩基配列を持つ D NAの領域を同定することができる。即ち、サザンハイブリダィゼ一シヨン法では、核酸断片をァガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で電気泳動させ、断片の大きさ（長さ）によって分離した後、変性させて一本鎖とし、その平板にニトロセルロースやナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電気泳動パターンそのままにトランスファーし、固定した後、 R I (放射性同位体）等で標識した塩基多型特異的 D NAプローブとハイプリッドを形成させ、プローブに相補的なメンブラン上の核酸断片をオートラジオグラフィ一等により検出する。

サザンハイブリダィゼーション法によれば、目的とする核酸断片の電気泳動位置や分子量を決めることができるが、電気泳動ゃォ一トラジオグラフィー等の操作に長時間を要し、迅速に分析を行うことができないこと、塩基多型特異的 D N Aプローブとハイブリダィゼーションしたか否かだけで検出するため、プローブの特異性を厳密にしないと、塩基多型の有無を検出するための類似配列を識別することが困難である等の問題があった。

近年、酵素を用いた核酸配列の識別方法として、 ligaseを用いた方法（特公平 6 - 4 4 8 8 0号公報、特許第 2 6 2 2 2 5 5号）や、ヌクレアーゼを用いた方法（特開平 2— 2 0 2 9 8号、特開平 3— 4 3 0 9 8号）が知られている。本発明の目的は、試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列中に塩基多型の種類を容易に検出できる核酸配列分析法を提供することにある。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施例で使用したォリゴヌクレオチドの位置を示す。

発明の開示

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、リガ一ゼ活性と、ヌクレア一ゼ活性を逐次及ぴン又は同時に用いることによって、塩基多型を容易に検出することができることを見出した。

具体的には、特定の塩基多型部位を含む染色体又は核酸断片（以下、単に核酸ということがある。）の 1つのストランドに相補的で、（1 ) 塩基多型部位で野生型の塩基と相補的な配列（塩基）を有する第一野生型オリゴヌクレオチドと、第一野生型ォリゴヌクレオチドに隣接してハイプリダイズし、塩基多型部位で野生型の塩基と相補的でない塩基配列を有する第二ォリゴヌクレオチドと、（ 2 )塩基多型部位で多型の塩基と相補的な配列（塩基）を有する一種以上の第一多型オリゴヌクレオチドと、第一多型オリゴヌクレオチドに隣接してハイプリダイズし、塩基多型部位で多型の塩基と相補的でない塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチドとを、特定の塩基多型を含む染色体又は核酸断片とハイブリダィズさせ、ヌクレア一ゼ活性とリガーゼ活性を用い、ヌクレア一ゼ活性とリガーゼ活性を検出することによって、塩基多型を検出することができることを見出した。

より具体的には、第二オリゴヌクレオチド中の塩基多型部位の相補的でない部分のみを 5 ' ェキソヌクレアーゼ又は 3 ' ェキソヌクレア一ゼで正確に削除したときにのみリガーゼで結合できることを見出し、本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。

項 1 . 試料中に含まれる塩基多型を検出する方法において、ヌクレア一ゼ活性と、リガーゼ活性を逐次及び Z又は同時に用いる方法。

項 2 . 試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列の塩基多型を検出する方法において、ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素を逐次及び/又は同時に用いる項 1に記載の方法。

項 3 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が、同一である項 1記載の方法。

項 4. ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌクレァーゼ、ェキソヌクレアーゼ I〜VIIからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 1に記載の方法。

項 5 . リガーゼ活性を含む酵素が T4DNA リガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 2に記載の方法。

項 6 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項 1に記載の方法。

項 7 . 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfoに由来する項 6に記載の方法。項 8 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラ一ゼである項 1に記載の方法。

項 9 . D N Aポリメラーゼが、 Tth、 Taq、 KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である項 8に記載の方法。項 1 0 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)該染色体又は核酸断片の野生型及び Z又は塩基多型の配列部分を含む第一ォリゴヌクレオチドを調製し、該第一ォリゴヌクレオチドが八ィブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイブリダイズしない配列を含む第二ォリゴヌクレオチドを調製する工程、

(2)該第一才リゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドを、該染色体又は核酸断片とハイブリダィズさせる工程、及び

(3)各々のォリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレア一ゼ活性により除去した後、リガ一ゼ活性を作用させる工程、を包含する方法。

項 1 1 . 各々のオリゴヌクレオチドが結合することによって得られる 1本のォリゴヌクレオチドを、検出用プローブを用いて検出する項 1 0に記載の方法。項 1 2 . 該塩基多型の配列部分が、 1塩基であつて、該塩基が塩基多型が予測されるものである項 1 0に記載の方法。

項 1 3 . 各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダィズした時に生じる塩基多型の配列部分で塩基対を形成しない塩基をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のォリゴヌクレオチドが結合することにより 1本のォリゴヌクレオチドとすることを、繰り返して行う項 1 0に記載の方法。

項 1 4. 第一ォリゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドの少なくとも 1 つが、予め標識されている項 1 0に記載の方法。

項 1 5 . 標識が酵素、ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団および特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法である項 1 4に記載の方法。

項 1 6 . 第二オリゴヌクレオチドの塩基多型配列部分で塩基対を形成しない配列部分と標的配列にハイブリダィズしている第一オリゴヌクレオチドに各異なる標識が結合してあり、ヌクレアーゼ活性により塩基対を形成していない部分の配列が除去されたとき、該 2種類の標識により除去されたか否かを検出できる第 2 ォリゴヌクレオチドを含む項 1 1に記載の方法。項 1 7 . 塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む項 1に記載の方法。

項 1 8 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を 3 '末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイプリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの 3 ' 側に隣接して位置して該染色体又は核酸断片とハイブリダィズし、 5 '末端の 1塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製する工程、

(2)該第一ォリゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドを、特定核酸とハイブリダィズさせる工程、及び

(3)各々のォリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二ォリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチド皇結合する工程、を包含する方法。

項 1 9 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び Ζ又は同時に用いる項 1 8に記載の方法。

項 2 0 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が、同一である項 1 8記載の方法。

項 2 1 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1 ヌクレアーゼ、ェキソヌクレア一ゼ1〜\ 11からなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 1 8に記載の方法。

項 2 2 . リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 1 8に記載の方法。

項 2 3 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項 1 8に記載の方法。

項 2 4. 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfuに由来する項 2 3に記載の方法。

項 2 5 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラ一ゼである項 1 8に記載の方法。

項 2 6 . D NAポリメラ一ゼが、 Tth、 Taq、 KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である項 2 5に記載の方法。

項 2 7 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を 5 '末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイプリダイズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側に隣接して位置して、該染色体又は核酸断片とハイブリダィズし、 3 '末端の 1塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイプリダイズしない配列を含む第二ォリゴヌクレオチドを調製する工程、

(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のォリゴヌクレオチド ¾結合する工程、を包含する方法。

項 2 8 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同時に用いる項 2 7に記載の方法。

項 2 9 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が、同一である項 2 7記載の方法。

項 3 0 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌクレア一ゼ、ェキソヌクレアーゼ I〜 VIIからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 2 7に記載の方法。

項 3 1 . リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である項 2 7に記載の方法。項 3 2 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である項 2 7に記載の方法。

項 3 3 . 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfuに由来する項 3 2に記載の方法。

項 3 4. ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラーゼである項 2 7に記載の方法。

項 3 5 . D N Aポリメラーゼが、 Tth、 Taq, KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である項 3 4に記載の方法。

項 3 6 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定するためのキットであって、（i)野生型第一オリゴヌクレオチド及び 1種又は 2 種の多型第一ォリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一オリゴヌクレオチド、（ii)該第一オリゴヌクレオチドがハイプリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイプリダィズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、（iii)ヌクレアーゼ活性及びリガ —ゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び (iv)検出プローブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドが八ィプリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一ォリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるキット。

項 3 7 . 塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む項 1 8に記載の方法。

以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、 Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のェキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧として A C E遺伝子が挙げられる。

本発明において、染色体又は核酸断片の多型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも 1つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される多型を有しているか否かを検査する方法である。

本発明における塩基多型を検出する方法においては、ヌクレア一ゼ活性とリガーゼ活性を逐次及び/又は同時に用いることを特徴とする。該活性は、例えば、酵素によって行うことができ、両活性を備えた酵素を使用することも可能である。具体的には、ヌクレア一ゼ活性を有する酵素としては、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌクレアーゼ、ェキソヌクレアーゼ I〜VII等を例示することができ、リガーゼ活性を含む酵素としては、 T4DNA リガーゼ、 E.coH DNA リガ一ゼ、 RNA リガーゼ等を例示することができる。

上記ヌクレア一ゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素は、耐熱性酵素であることが好ましい。好ましくは、耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KOD、 Pfuに由来するのがよい。

また、ヌクレアーゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラ一ゼ、より具体的には、 D N Aポリメラーゼが、 Tth、 Taq、 KOD、 Pfu 由来の耐熱性酵素であるのが好ましい。

本発明の塩基多型の検出方法の具体的態様としては、試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)該染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を含む第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一ォリゴヌクレオチドが八ィプリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分が重なる配列を含む第二ォリゴヌクレオチドを調製し、

(2)該第一才リゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドを、該染色体又は核酸断片とハイブリダィズさせ、

(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に生じる塩基多型の配列部分で塩基対を形成しない塩基をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同定する方法である。

具体的には、第一オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的な塩基を含むオリゴヌクレオチドである。好ましくは、該塩基多型が予想される部分は、第一ヌクレオチドの 3 ' 又は 5 ' 末端がよい。

第一オリゴヌクレオチドが第二オリゴヌクレオチドよりも 5 '側にある場合には、該塩基多型の部位は、第一オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端にあり、第一オリゴヌクレオチドが、第二オリゴヌクレオチドよりも 3 ' にある場合には、該塩基多型の部位は、第一ヌクレオチドの 5 ' 末端にあり、更に、 5 ' にリン酸基を有する。

第二オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的でない塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、少なくとも 1塩基で第一オリゴヌクレオチドとオーバ一ラップする。

本発明における各オリゴヌクレオチドの長さとしては、 1 3〜3 5塩基、好ましくは、 1 6〜3 0塩基である。

例えば、第一オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端塩基が塩基多型部位の予想されるォリゴヌクレオチドになるように設計し、野生型第一ォリゴヌクレオチドは野生型核酸の該塩基と相補的な塩基、及び多型第一オリゴヌクレオチドは多型核酸の該塩基と相補的な塩基を配置させる。さらに、第二オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端が第一ォリゴヌクレオチドと 1塩基オーバーラップするよう設計する場合は、該第二オリゴヌクレオチドのォ一バ一ラップする塩基は、野生型、多型とも、相補的な塩基以外のもの選択する。野生型、多型共に相補的でない塩基を選択することによって、第二オリゴヌクレオチドは 1種類調製するのみでよい。その組み合わせの例は以下の通りである。表 1

この原理によって、このように設計した場合野生型第一ォリゴヌクレオチド Z 第二ォリゴヌクレオチド Z野生型核酸の組み合わせ及び多型第一ヌクレオチド / 第二オリゴヌクレオチド z多型核酸の組合せにおいてのみ、第二オリゴヌクレオチドのオーバ一ラップする部分を除いて、完全に一致する為ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性によって、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドは連結して 1本になるが、野生型第一オリゴヌクレオチド /第二オリゴヌクレオチド /多型核酸の組み合わせ及び多型第一ヌクレオチドノ第二ォリゴヌクレオチドノ野生型核酸の組合せにおいては、第一オリゴヌクレオチドの 3 '末端が相補的にならないので、ヌクレアーゼ活性が働かず、第二ォリゴヌクレオチドのオーバーラップ部分が除去されないので、リガーゼ活性による連結が起こらない。

ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性

本発明においては、上記野生型第一オリゴヌクレオチドと多型第一オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。

i)上記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを塩基多型を含む染色体又は核酸断片にハイブリダィズさせる。ハイブリダィズさせる条件は、通常行われる条件でよい。例えば、モレキュラークローニングに記載の方法に従って、行うことができる。

ii)次に第二ォリゴヌクレオチドのオーバーラップした部分を、ヌクレア一ゼ活性を用いて切断する。使用できる酵素活性としては、上述したとおりである。好ましくは、ェキソヌクレア一ゼ活性が好ましく、 DNAポリメラーゼ等のェキソヌクレアーゼが好ましい。

第二ォリゴヌクレオチドの 5 '末端が第一ォリゴヌクレオチドとオーバーラップしている場合には、 5 ' ェキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのォ一バーラップしている部分を切断し、リン酸基が突出する。

.一方、第二オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端が第一オリゴヌクレオチドとオーバ —ラップしている場合には、 3，ェキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのォ一パーラップしている部分を切断する。

iii)同時に、 5 '側にあるオリゴヌクレオチドと 3 ' 側にあるオリゴヌクレオチドをリガーゼ活性を用いて結合させ、 1本のォリゴヌクレオチドにする。

本発明において、第一オリゴヌクレオチド中の塩基多型に対応する部位が相補的でないと、エンドヌクレアーゼで切断されても、塩基多型に対応する部位が相補的でないため、リガーゼ活性によって 1本のオリゴヌクレオチドに結合することができない。

野生型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性及びリガ —ゼ活性を用いた場合、試料核酸が野生型であれば 1本鎖となるが、多型では反応が起きない。逆に、多型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を用いた場合、試料核酸が多型であれば 1本鎖となるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型を用いて反応を行い、他方は多型を用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか多型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、 1種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ 1つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、多型のホモか、ヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と多型遺伝子が共に存在するから野生型を用いた場合も多型を用いた場合も反応が起きる。

野生型と多型第一オリゴヌクレオチドに別々に異なる標識を付加しておくことで、試料を二つに分ける必要はない。

標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、上記ハイプリダイゼーションをする前に、前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によつて、増幅しておくことも可能である。

上記増幅法としては特に限定されるものではないが、 P C R (Polymerase chain reaction；特公平 4 -67960号公報、特公平 4一 67957号公報）、 A S B A (Nucleic acid sequence-based amplincation method； N a t U r e 第 350巻、第 91頁 (1991))、 LCR (WO89/12696, 特開平 2-2934号など）、 S D A (Strand Displacment Amplincation； !Siucleic Acids Res. 第二 0巻、一 691頁 (1992))、 RCR (WO90/01069 ) TMA (Transcription Mediated amplification Method； J.CUn.Microbiol.第 31巻、第 3270頁 (1993)) などが挙げられ、いずれにおいても適用することが可能である。

検出

上記反応によって得られる 1本鎖のオリゴヌクレオチドを、プローブを用いて以下の様にして検出する。

本発明で使用されるプロ一ブは、塩基多型を含みその種類により検出シグナルが異なれば良いが、好ましくは連続した少なくとも 15塩基以上、より好ましくは連続した少なくとも 18塩基以上からなる塩基配列が必要である。好ましくは、第一オリゴヌクレオチドの塩基多型部位と含む一部と第二オリゴヌクレオチドの一部共に相補的な配列を含むものがよい。プローブは特定核酸配列と相補鎖を形成すれば DNAでも RNAでも PNAでもよく、化学合成または生物学的な方法により調製することができる。例えば、パ一キンエルマ一社の DN Aシンセサイザ一 391型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製は F PLCで MONO— Qカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスファイト法等がある。

また、第一オリゴヌクレオチド又は第二オリゴヌクレオチドに予め標識を賦することが好ましい。その場合は、合成時にピオチン、リンカ一アーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴ dGTP、オリゴ dATP、オリゴ dTT P、オリゴ dCTP等を 5' 末端または 3' 末端に付加し修飾基を導入しても良い。あるいはピオチン、リンカ一アーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをォリゴヌクレオチド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。あるいは合成したヌクレオチドに後から³² P、 ³⁵sなどの放射性物質、 ALP、 PODなどの酵素、 FITC、 HEX、 6_FAM、 TETなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標識物を導入しても良い。

具体的には、例えば、ピオチン等で標識した第一オリゴヌクレオチドと第二ォリゴヌクレオチドを用いて特定核酸とハイブリダィズさせた後、解離させ、例えば、マイクロタイタープレートのような固相に結合させた多型特異的プローブとハイブリダィズさせ、ハイブリダィズしなかった核酸を洗いだし、プローブとハィプリダイズした核酸の第一ォリゴヌクレオチドの標識によりハイプリダイズしたか否かを検出し、各プローブの検出シグナルの比により塩基多型が野生型か変異型もしくは混合型であるのかを同定する方法が挙げられる。

野生型と多型のオリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば色の異なる蛍光標識を付与することで、野生型及び多型の検出を 1つのプレートのゥエルで行うことができる。

干ッ卜

本発明において、キットとしては、（i)野生型第一オリゴヌクレオチド及び 1種又は 2種の多型第一ォリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一ォリゴヌクレオチド、（ii)該第一才リゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、（ϋί)ヌクレアーゼ活性及びリガ一ゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び (iv)検出プローブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるという特徵を有する。該第一及び第二オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質および発光団などによって標識されていてもよい。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。

実施例 1 ACE遺伝子の塩基多型検出

( D ACE遺伝子断片増幅用プライマ一及び多型検出用オリゴヌクレオチドの合成

パーキンエルマ一社 D N Aシンセサイザー 3 9 2型を用いて、ホスホアミダイト法にて、ヒト A C E遺伝子の配列と相同な配列を有する配列番号 1及び 2に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマ一 1、 2 )および配列番号

3、 4及び 5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（検出用フ°ロ -フ' 3、

4、 5 ) を合成した。検出用フ。口-フ' 3及び 4は、ヒト A C E遺伝子の配列と相補的な配列を有するが、各々 3 ' 末端に塩基多型部位に対応する野生型又は多型に対応する塩基を有し、各々 5 '側にピオチンを連結している。検出プローブ 5は、検出用プローブ 3及び 4の 3 ' 末端に隣接するヒト A C E遺伝子の配列と相補的な配列を有するが、その 5 ' 末端の 1塩基が塩基多型部位に対応し、野生型又は多型とも相補的でない塩基を有する。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で 5 5 °C、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマ一社〇 P Cカラムにて実施した。

( 2 ) リンカ一アームを有するオリゴヌクレオチドの合成

パ一キンエルマ一社 D N Aシンセサイザ一 3 9 2型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号 6に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Aプローブ）および配列番号 7に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（Tプ口一ブ）を合成した。 Aプローブ及び Tプローブとも、ヒト A C E遺伝子の配列と相補的であり、塩基多型部位で特異的である

この際、特表昭 6 0 - 5 0 0 7 1 7号公報に開示された合成法により、デォキシゥリジンから化学合成により調製した、 5位にリンカ一アームを有するゥリジンを上記オリゴヌクレオチドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で 5 0 ° (、一夜脱保護処理を施した後、パーキンエルマ一社 O P Cカラムにて実施した。

( 3 ) プローブオリゴヌクレオチドのマイクロタイ夕一プレ一トへの結合上記（2 ) で合成したプローブオリゴヌクレオチドについて、そのリンカ一ァームを介して、マイクロタイ夕一プレート内面へ結合した。オリゴヌクレオチドを 5 OmM硼酸緩衝液（pHl 0)、 10 OmM MgC l₂の溶液に 0. 05 p mo 1Z 1になるように希釈し、マイクロタイタープレート（MicroFLUORB、ダイナテック社）に各 1 0 O 1ずつ分注し、 1 5時間程度室温に放置することで、リンカーォリゴヌクレオチドをマイクロタイ夕一プレート内面に結合させた。その後、 0. l pmo l dNTP、 0. 5 PVP (ポリビニルピロリドン）、 5XS S Cに置換して、非特異反応を抑えるためのブロッキングを室温で 2時間程度行った。最後に 1XSSCで洗浄して乾燥させた。

(4) PCR法によるヒト ACE遺伝子断片の増幅

ヒト白血球より抽出した DN A溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒト ALDH 2遺伝子断片を増幅した。

試薬：以下の試薬を含む 25 l溶液を調製した。

プライマー 1 10 pmo 1

プライマ一 2 10 pmo 1

X 10緩衝液 2. 5 l

2mM dNTP 2. 5 l

Tth DNAポリメラーゼ 1U

抽出 DNA溶液 10 Ong

増幅条件

94 · 2分

94。C ' l分、 57°C ' 2分、 75Τλ 1. 5分（35サイクル)。

(5) 検出用オリゴヌクレオチドによる検出反応

(4) の増幅反応液を 5 lにェビ由来アルカリフォスファタ—ゼ U添加し 37°Cで 15分、 8 で 15分保温した後、以下の試薬を含む 20 l溶液を調製した。

検出用オリゴ 3または 4 10 pmo 1

検出用オリゴ 5 10 pmo 1

X 10緩衝液 2 m

Tth DNAポリメラーゼ 1 U Tth DNAリガ一ゼ 1U

増幅反応溶液 5 l

検出条件

94。C · 2分

94 l分、 65°C · 2分（5サイクル)。

(6) マイクロ夕イタ一プレート中でのハイブリダィゼ一ション

(5) の検出反応液 10 1に、 0. 6N Na〇Hを 10 U添加して DN Aを変性させ、 20 OmMクェン酸一リン酸緩衝液（pH6. 0)、 2%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）、 75 OmM NaC l、 0. l%NaN₃の溶液 80 1に加えて、上記（3) の捕捉プローブが結合したマイクロタイ夕一プレートに投入した。蒸発を防ぐため流動パラフィンを重層し、 50°Cで 30分間振盪させた。これによつて、検出反応で核オリゴヌクレオチドがハイブリダィズし、一部ヌクレア一ゼで除去されたのち、リガ一ゼにより結合された核酸断片が、固定化されたプローブによって特異的にマイクロタイ夕一プレートに捕捉される。

次に、 2XSSC (pH7. 0)、 1 %SDSに置換し同様に蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、 55 °Cで 20分間振盪させた。その後、アルカリフォスファタ一ゼを標識したストレプトアビジン（DAKO製: D0396) を 5 OmMトリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 1 BS Aの溶液で 2000倍に希釈した溶液 100^ 1と置換し、 37 で 15分間振盪させた。これによつて、捕捉された D N Aのピオチンにアル力リ性ホスファターゼ標識したストレブトァビジンが特異的に結合した。 250 1の 5 OmMトリス—塩酸緩衝液（PH7. 5)、 0. 025% Tween20溶液で 3回洗浄後、アル力リ性ホスファターゼの発光基質であるジォキセ夕ン化合物（商品名： Lmniphos480； Lumigen社） 50 1を注入し、 37°Cで 15分間保温後に暗室中でホトンカウンタ一（浜松ホトニクス社）で発光量を測定した。

これらの工程はすべて、 DNAプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会会誌第 20巻、第 728頁（1995年）を参照）により自動で行われ、所要時間は約 2.5時間であつた。

(7) ヒト A C E遺伝子塩基多型測定検討結果上記（5 ) にて反応し、（6 ) にて検出されたヒト ACE遺伝子の塩基多型検出結果を表 1に示す。数値は発光量（cps： count/second) で表示される。 Asignal は Aプローブと反応した増幅核酸断片の検出シグナルを、 Tsignalは Tプローブと反応した核酸断片の検出シグナルを示す。

表 2

表 1から判るように各プローブで得られたシグナルにより A C E遺伝子の 1塩基多型が同定できる。

本発明により、試料核酸中の多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、偽陽性が生じず、従来法では困難であったホモ接合とヘテロ接合の識別も容易になった。

Claims

請求の範囲

1 . 試料中に含まれる塩基多型を検出する方法において、ヌクレア一ゼ活性と、リガーゼ活性を逐次及び z又は同時に用いる方法。

2 . 試料中に含まれる塩基多型を含む特定の核酸配列の塩基多型を検出する方法において、ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素を逐次及び/又は同時に用いる請求項 1に記載の方法。

3 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が、同一である請求項 1記載の方法。

4. ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレア一ゼ、 S1 ヌクレア —ゼ、ェキソヌクレア一ゼ I〜VIIからなる群から選択される少なくとも 1 種の酵素である請求項 1に記載の方法。

5 . リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNA リガーゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である請求項 2 に記載の方法。

6 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である請求項 1に記載の方法。

7 . 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfuに由来する請求項 6に記載の方法。

8 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラーゼである請求項 1に記載の方法。

9 . D N Aポリメラ一ゼが、 Tth、 Taq、 KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である請求項 8に記載の方法。

0 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)該染色体又は核酸断片の野生型及び/又は塩基多型の配列部分を含む第一才リゴヌクレオチドを調製し、該第一ォリゴヌクレオチドがハイプリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製する工程、 (2)該第一ォリゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドを、該染色体又は核酸断片と Λイブリダィズさせる工程、及び

(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレァーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させる工程、

を包含する、方法。

1 . 各々のオリゴヌクレオチドが結合することによって得られる 1本のオリゴヌクレオチドを、検出用プローブを用いて検出する請求項 1 0に記載の方法。

2 . 該塩基多型の配列部分が、 1塩基であって、該塩基が塩基多型が予測されるものである請求項 1 0に記載の方法。

3 . 各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダィズした時に生じる塩基多型の配列部分で塩基対を形成しない塩基をヌクレア一ゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のオリゴヌクレオチドが結合することにより 1本のォリゴヌクレオチドとすることを、繰り返して行う請求項 1 0に記載の方法。 4. 第一ォリゴヌクレオチド及び第二ォリゴヌクレオチドの少なくとも 1つが、予め標識されている請求項 1 0に記載の方法。

5 . 標識が酵素、ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団および特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法である請求項 1 4に記載の方法。

6 . 第二オリゴヌクレオチドの塩基多型配列部分で塩基対を形成しない配列部分と標的配列にハイプリダイズしている第一オリゴヌクレオチドに各異なる標識が結合してあり、ヌクレアーゼ活性により塩基対を形成していない部分の配列が除去されたとき、該 2種類の標識により除去されたか否かを検出できる第 2オリゴヌクレオチドを含む請求項 1 1に記載の方法。

7 . 塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む請求項 1に記載の方法。

8 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、 (1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を 3 '末端に有する第一オリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダィズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの 3 ' 側に隣接して位置して該染色体又は核酸断片とハイブリダィズし、 5 '末端の 1塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製する工程、

(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、特定核酸とハイブリダィズさせる工程、及び

(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレァーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のォリゴヌクレオチドが結合する工程、を包含する方法。

9 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素を逐次及び/又は同時に用いる請求項 1 8に記載の方法。

0 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一である請求項 1 8記載の方法。

1 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1 ヌクレアーゼ、ェキソヌクレア一ゼ I〜VIIからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である請求項 1 8に記載の方法。

2 . リガーゼ活性を含む酵素が T4DNA リガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNA リガ一ゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である請求項 1 8 に記載の方法。

3 . ヌクレア一ゼ活性を含む酵素と、リガ一ゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である請求項 1 8に記載の方法。

4. 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfuに由来する請求項 2 3に記載の方法。

5 . ヌクレアーゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラーゼである請求項 1 8に記載の方法。 D N Aポリメラーゼが、 T h、 Taq、 KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である請求項 2 5に記載の方法。

試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法であって、

(1)染色体又は核酸断片の塩基多型の配列部分を 5 '末端に有する第一ォリゴヌクレオチドと該第一オリゴヌクレオチドが該染色体又は核酸断片とハイブリダィズした時に、該第一オリゴヌクレオチドの 5 '側に隣接して位置して、該染色体又は核酸断片と八イブリダィズし、 3 '末端の 1塩基以上が該染色体又は核酸断片にハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製する工程、

(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で第二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しない配列部分をヌクレァーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性により各々のォリゴヌクレオチド結合する工程、を包含する方法。

試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定する方法において、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同時に用いる請求項 2 7に記載の方法。

ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一である請求項 2 7記載の方法。

ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、 Mungbeanヌクレア一ゼ、 S1 ヌクレアーゼ、ェキソヌクレア一ゼ I〜VIIからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である請求項 2 7に記載の方法。

リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガ一ゼ、 EcoU DNAリガーゼ、 RNA リガ一ゼからなる群から選択される少なくとも 1種の酵素である請求項 2 7 に記載の方法。 '

ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である請求項 2 7に記載の方法。

3 . 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfuに由来する請求項 3 2に記載の方法。

4. ヌクレア一ゼ活性を含む酵素が D N Aポリメラーゼである請求項 2 7に記載の方法。

5 . D N Aポリメラーゼが、 Tth、 Taq、 KODまたは Pfu由来の耐熱性酵素である請求項 3 4に記載の方法。

6 . 試料中に含まれる塩基多型を含む染色体又は核酸断片の塩基多型を同定するためのキットであって、（0野生型第一オリゴヌクレオチド及び 1種又は

2種の多型第一ォリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる少なくとも一種の第一ォリゴヌクレオチド、（ii)該第一ォリゴヌクレオチドがハイブリダイズするストランド鎖の該染色体又は核酸断片と相補的で、該塩基多型の配列部分でハイプリダイズしない配列を含む第二オリゴヌクレオチド、（iii)ヌクレア —ゼ活性及びリガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素及び (iv)検出プロ一ブを含み、該検出プローブは各々のオリゴヌクレオチドがハイプリダイズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌクレアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるキット。

7 . 塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む請求項 1 8に記載の方法。