WO2002067977A1

WO2002067977A1 - Gouttes ophtalmiques

Info

Publication number: WO2002067977A1
Application number: PCT/JP2002/001563
Authority: WO
Inventors: Haruhiko Naruse; Misato Sano; Yasuo Shinoda; Toshio Inagi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kowa Co Ltd
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kowa Co Ltd
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2002-09-06
Anticipated expiration: 2003-08-26
Also published as: CN1267150C; CN1610555A; EP1364654A4; JPWO2002067977A1; JP3695657B2; CA2439100A1; KR20030076705A; US20040067909A1; EP1364654A1

Description

明細書

点眼剤技術分野

本発明は、点眼時に眼に対する不快な刺激がなく、かつ C P B— Iの長期保存安定性の良い点眼剤、及びその製造法に関する。背景技術

CPB- I (別名「ァネキシン V」）はヒト胎盤をはじめとする生体内の組織及び分泌液に広く分布し（Chem. Pha rma. Bul l, 38、 1957 — 1960、 1990) 、細胞内では細胞質に存在する抗血液凝固作用等の生理活性を有する物質である。 CPB— Iをヒトあるいは動物の臓器から抽出することができること（特開昭 62 - 174023号公報）、及び遺伝子組換え技術により発現させることができることが（特開昭 64— 20095号公報）報告されている。また、 CPB—Iを角膜疾患治療剤として用いることが報告されている (WO 92/08475号）。

ところで、点眼剤では、点眼時の眼に対する不快な刺激をなくすため、等張化剤として塩化ナトリゥムまたは塩化力リゥム等の塩類を配合することが一般的である。しかし CPB—Iを含有した点眼剤とした場合、先の塩類を配合させると CPB— Iの長期保存安定性が問題となり、好ましくない。また、 CPB— Iの安定化のために抗酸化剤であるエチレンジァミン四酢酸（EDTA) またはその塩、ァスコルビン酸の配合が考えられるが、 EDTAまたはその塩は、 CPB— Iの創傷治癒作用を阻害するおそれがあり、一方ァスコルビン酸は、安定な pH 域が C P B— Iとァスコルビン酸では異なるため好ましくない。

これまでに塩基性ァミノ酸や糖類を配合する事により CPB— Iを分離精製、凍結乾燥等を行う際に安定化させる方法（特開平 4一 198195号公報、特閧平 4一 198196号公報）が知られているが、点眼剤の長期保存安定性については検討されていない。すなわち点眼時に眼に対する不快な刺激がなく、かつ C PB— Iの長期保存安定性の良い点眼剤を調製する事は困難であり、いまだ満足の行くものは得られていないのが現状である。発明の開示

本発明は、上記観点からなされたものであり、 CPB— I含有の点眼剤であつて、点眼時に眼に対する不快な刺激がなく、かつ C P B— Iの長期保存安定性の良い点眼剤及びその製造法を提供することを課題とする。

本発明者らは、以上の点を考慮して鋭意研究を重ねた結果、点眼時に不快な刺激がなく、かつ CPB— Iの長期保存安定性の良い点眼剤の処方を見出した。即ち、 CPB— Iを含有した点眼剤において、等張化剤として多価アルコールを含有させることにより、点眼時に不快な刺激がなく、かつ CPB— Iの長期保存安定性の良い点眼剤が提供できることを見出し本発明を完成した。さらには、多価アルコールをカルボニル価の低い多価アルコールとすることにより、 CPB— I の長期保存安定性が更にすぐれた点眼剤が提供できることを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下のとおりである。

(1) CPB—Iと多価アルコールとを含有することを特徴とする点眼剤。

(2) (1) の多価アルコールがグリセリン、プロピレングリコ一ル、マンニト —ル及びソルビトールの中から選ばれることを特徴とする（1) に記載の点眼剤

(3) ( 1 ) の多価アルコールのカルボニル価が 5〃mo 1/g以下である（1 ) 又は（2)記載の点眼剤。

(4) CPB— Iを含有する点眼剤の製造法において、 CPB— Iとともに、力ルポニル価が 5 mo 1/g以下である多価アルコールを点眼剤に配合することを特徴とする方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の点眼剤は、 CPB— Iを有効成分として含有する。 CPB— Iとしては、ヒト由来の CPB— Iが挙げられる。ヒト CPB— Iのアミノ酸配列は、すでに報告されている（特閧昭 64— 20095号公報）。ヒト CPB— Iは配列表の配列番号 1で表されるァミノ酸配列を有する。また、 CPB— Iは、典型的には以下の性質を有する。

<性質 >

①分子量（ S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動法、還元状態） 34, 00 0± 2 , 000

② 等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電気泳動法） 4. 7±0. 1

③ 安定性

(ィ） 50° (、 30分加熱処理で失活

(口） pH4— 10で安定

(ハ）血漿中 37°C、 30分で安定

④血液凝固系に対する作用

(ィ）カルシウム再加凝固時間を延長

(口）プロトロンビン時間を延長

(ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長

⑤ アミノ酸分析で、ァスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プ口リン、グリシン、ァラニン、 1/2シスチン、バリン、メチォニン、イソ口イシン、ロイシン、チロシン、フエ二ルァラニン、ヒスチジン、リジン及びアルギニンの存在が認められる。

本発明に用いる CPB— Iは、点眼剤の有効成分としての効果、例えば角膜疾患治療等の効果を有する限り、その由来、糖鎖の有無等は特に制限されない。また、前記効果を有する限り、アミノ酸置換等の改変、修飾を施された誘導体であつてもよい。

本発明に用いられる CPB— Iは好ましくはヒト CPB— Iであるが、前記有効成分としての効果を有する限り、配列番号 1のアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列、又は C 末端あるいは N末端に置換基を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。

CPB— Iは、 CPB— Iを含有するヒトあるいは動物の臓器から抽出、精製することによって取得することも可能であるが（特開昭 62— 174023号）、大量生産の観点からは、 CPB— Iをコードする DNAを用いた組換え DNA 技術によって製造することが好ましい。 CP B— Iタンパク質をコ一ドする DN Aは、すでにクローニングされ、その塩基配列が明らかにされている（特開昭 6 4— 20095号）。また、同 DNAを用いた CPB— Iを産生させる方法が記載されており、この方法によって生産される CPB— Iは、本発明に好適に用いることができる。

本発明の CPB— Iをコードする DNAは、コードされるアミノ酸配列が、上記条件をみたすものであれば特に制限されないが、具体的には例えば特開昭 64 -20095号公報に記載された塩基配列を有する DNAが挙げられる。

上記のような CP B— Iタンパク質をコードする DNAは、すでに CPB— I タンパク質のアミノ酸配列及びそれらをコードする D N Aの塩基配列が明かとなつているため、その配列に基づいて作製したプライマ一を用いた P C Rによって、ヒト又は動物の染色体 DN A又は染色体ライブラリーから取得することができる。

CPB— Iをコ一ドする DN Aの調製、組換え DNA技術を用いた CP B— I の製造において、染色体 DNAの調製、染色体 DN Aライブラリーの作製、ハイブリダィゼ一シヨン、 PCR、プラスミド DNAの調製、 DNAの切断及び連結、形質転換等の方法は、特閧昭 64- 20095号に記載されている。

本発明に用いる CPB— Iの含有量は、点眼剤の全量に対して 0. 0001〜 1重量％、好ましくは 0. 001〜0. 1重量％、特に好ましくは 0. 003〜 0. 03重量％であるとよい。

本発明の点眼剤には、上記 CPB— Iと併せて多価アルコールを含有させる。多価アルコールとしては、好ましくは 2価〜 6価のアルコール、具体的にはグリセリン、プロピレングリコール、マンニトール及びソルビトール等があげられ、好ましくはグリセリンが挙げられる。多価アルコールの含有量は、点眼剤組成物が等張となる程度の量、具体的には点眼剤の全量に対して 0. 1〜20重量％、好ましくは 1〜10重量％、特に好ましくは 1. 5〜5重量％であるとよい。多価アルコール中に含まれるアルコール酸化物、具体的にはカルボニル化合物の含量が高いと、点眼剤の保存中に CP B—Iの活性が低下することがある。したがって、多価アルコールはカルボニル化の低いものを使用することが好ましい。具体的には、カルボ二ル価は後記実施例に示した値よりも低い値、例えば 5 mo l/g以下、より好ましくは 3 /Π101/g以下、さらに好ましくは l〃m 01/g以下であることが望ましい。

ここで、本発明で用いる多価アルコールのカルボニル価とは、例えば試料を一定条件下で、 2, 4—ジニトロフエニルヒドラジンで発色させ、吸光度法で求めたときの、試料 1 g中のカルボニル化合物の〃m o 1数をいう（A. S. He i ck， M. F. B e n c a, J r. Mi t che l l, JAOCS 31, 88 ( 1954) 、光永新二、島村馬次郎、油化学； 7， 275 (1958) ) 。以下にカルボニル価の一般的な測定方法を示す。

<カルボニル価の測定法 >

濃グリセリン 1 gを秤取し、アルデヒドフリーエタノールを加え全量を 50m 1とする。調製した液 5mlを 25 mlメスフラスコに採り、 3. 6% (W/V ) トリクロ口酢酸溶液（トルエンに溶解） 2 mlと 0. 05% (W/V) 2, 4 ージニトロフヱニルヒドラジン溶液（トルエンに溶解） 3mlを加え攪拌し、 6 0± 1°Cの恒温槽で 30分間反応させた後、室温まで放冷する。更に、 4% (W /V) 水酸化力リゥム ·アルデヒドフリーエタノール溶液 5 mlを加え、トルェンを加えて 25mlとする。水酸化カリウム溶液を加えてから 10分後に 435 nmで吸光度を測定する。濃グリセリンを加えないで、空試験を行い補正する。検量線の作成は、アルデヒド標準原液（ノナナール [和光純薬] 0. 142 gをトルェンに溶かして 100mlとし、この液 5 mlにトルエンを加えて 100ml としたもの）を 1、 3、 5及び 7ml採取し、アルデヒドフリーエタノールを加えて各々 25mlとする。各 5mlを 25mlメスフラスコに採り、前記の標準試験法と同様の操作を行う。

本発明の点眼剤は、一般的に用いられる添加剤、例えば緩衝剤、粘稠剤、安定化剤及び非イオン界面活性剤等を含有することが可能である。

緩衝剤としては、ホウ酸、ホウ砂、クェン酸、リン酸第一塩、酢酸塩、リン酸第二塩、炭酸水素塩及び炭酸塩等があげられる。緩衝剤の含有量は、点眼剤の全量に対して 0. 01〜2重量％、好ましくは 0. 05〜1重量％、特に好ましくは 0. 1〜0. 5重量％であるとよい。点眼剤の pHは、好ましくは 5〜10、より好ましくは 6〜9である。

粘稠剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びカルボキシビニルポリマ一等があげられる。粘稠剤は点眼液の眼外流出を防ぎ、かつ、眼内滞留時間を延長して薬効を高める。また、 CPB— I点眼剤を振とうすると C PB-Iの析出が生じる恐れがあるが、粘稠剤を含有することにより CPB— I の析出が抑制される。粘稠剤の含有量は、点眼剤の全量に対して 0. 01〜2重量％、好ましくは 0. 025〜1重量％、特に好ましくは 0. 05〜0. 5重量 %であるとよい。

安定化剤としては、力プリル酸ナトリウム、アルギニン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等があげられる。安定化剤の含有量は、点眼剤の全量に対して 0. 01〜2重量％、好ましくは 0. 05〜1重量％、特に好ましくは 0. 1〜0. 5重量％であるとよい。

非イオン界面活性剤としては、脂肪酸多価アルコール、ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル、ポリォキシエチレン硬化ヒマシ油等のポリォキシェチレンェ一テル、アルキルポリオキシエチレンエーテル、アルキルカルボニルポリォキシエチレン、 Ν,Ν' —ジ（ポリオキシエチレン）アルカンアミドなどのェチレンォキシド付加体、脂肪酸ショ糖エステル、 Ν,Ν' —ジ（アル力ノール）アルカンアミド及びポリオキシエチレンブロックコポリマ等があげられる。非ィオン界面活性剤の含有量は、点眼剤の全量に対して 0. 01〜5重量％、好ましくは 0. 02〜2重量％、特に好ましくは 0. 03〜1重量％であるとよい。尚、 CP Β— Iの長期保存安定性の観点から、一般に点眼剤の等張剤として用いられる塩化ナトリゥムまたは塩化力リゥム等の塩類は使用しないか、又は含有量を安定性を損なわない程度に低くすることが好ましい。

本発明の点眼剤は、点眼溶液製剤である。同製剤は、用時溶解製剤または用時希釈製剤とすることもできる。用時溶解製剤とする場合は、 CPB— Iと多価ァルコールを別包としてもよい。図面の簡単な説明

図 1は、多価アルコールのカルボニル価が C P B— Iの安定性に与える影響を示す c 発明を実施するための最良の形態

本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

尚、以下に記載の実施例及び比較例で示す点眼剤は、全て pHを 7. 5に調節する為に、ホウ酸とホウ砂又はリン酸 1水素 2ナトリウムとリン酸 2水素 1ナトリウム ' 2水をそれそれ調整して配合した。また全ての浸透圧を 286 mO sm に調整するように、濃グリセリン、プロピレングリコ一ル、ソルビトール、塩化ナトリゥム及び塩化力リゥムを調整して配合した。

実施例 1

CPB— Iを 0. 01 g、濃グリセリン 2. 3 g、ホウ酸 0. 11 g、ホウ砂 0. 085 g、ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル 0. 05 g、ポリビニルピロリドン 0. l gを滅菌精製水に加え、全量を l O OmLとし、撹拌溶解した。

実施例 2

濃グリセリン 2. 3 gのかわりにプロピレングリコール 2. l g、ホウ砂 0. 085 gのかわりにホウ砂 0. 016 gを含有したほかは、実施例 1と同様の方法で調製を行った。

実施例 3

濃グリセリン 2. 3 gのかわりにソルビトール 4. Ogを、ホウ酸及びホウ砂のかわりにリン酸 1水素 2ナトリウム 0. 26 g及びリン酸 2水素 1ナトリウム - 2水0. 05gを含有したほかは、実施例 1と同様の方法で調製を行った。

実施例 4〜 6

カルボニル価の異なる濃グリセリンを使用したほかは、実施例 1と同様の方法で調製を行った。

比較例 1

濃グリセリン 2. 3 gのかわりに塩化ナトリウム 0. 8 g、ホウ砂 0. 085 gのかわりにホウ砂 0. 011 gを含有したほかは、実施例 1と同様の方法で調製を行った。比較例 2

濃グリセリン 2. 3 gのかわりに塩化カリウム 1. 0g、ホウ砂 0. 085 g のかわりにホウ砂 0. 011 gを含有したほかは、実施例 1と同様の方法で調製を行った。

<実施例及び比較例の点眼剤の評価 >

実施例 1〜 6及び比較例 1〜 2の点眼剤について、 C P B— Iの安定性の検討を行った。 CPB— Iの安定性は、 45°Cで 2週間保存した時の CPB— Iの残存率（製造直後を 100%とした）を測定した。

結果を表 1、表 2及び図 1に示す。尚、図 1は表 2の結果をグラフに表したものである。表 1

実讓 1 実脑 2 実施例 3 纖 1 比較例 2

CPB-I 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 濃グリセリン 2.3

プロピレングリコ-ル 2, 1

リルビト-ル 4.0

塩化ナトリウム 0.8

塩化カリウム 1.0 リン酸は素 2ナトリウム 0.26

リン酸 2水素けトリウム' 2水 0.05

ホウ酸 0.11 0, 11 0.11 0.11

ホウ砂 0.0S5 0.016 0.011 0.011

ポリオキシエチレンリルビタン脂肪酸エステル 0.05 0, 05 0.05 0.05 0.05

ボリビニルピ Dリドン 0. ί 0.1 0.1 0.1 0.1

滅菌騸水全 lOOmL 全 lOOmL 全 lOOmL 全 lOOmL 全 lOOmL

45Ϊ-2職の CPB- 1残存率 (%) 95 95 93 44 39 表 2

以上のように、実施例 1〜3及び比較例 1〜2の結果より、点眼剤に等張化剤として多価アルコールを含有させれば、 C P B— Iの長期安定性の良い点眼剤が得られることが確認できた。

また、実施例 4〜 6の結果より、多価アルコールのカルボニル価が低いほど、 C P B— Iの長期安定性の良い点眼剤が得られることが確認できた。産業上の利用の可能性

本発明により、点眼時に不快な刺激がなく、かつ C P B— Iの長期保存安定性の良い点眼剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. C P B— Iと多価アルコールとを含有することを特徴とする点眼剤。

2. 前記多価アルコールがグリセリン、プロピレングリコール、マンニトール及びソルビトールからなる群から選ばれることを特徴とする請求項 1記載の点眼剤。

.

3. 前記多価アルコールのカルボニル価が 5〃mo 1/g以下である請求項 1 又は 2記載の点眼剤。

4. CPB—Iを含有する点眼剤の製造法において、 CPB— Iとともに、力ルポニル価が 5〃mo 1/g以下である多価アルコールを点眼剤に配合することを特徴とする方法。