WO2001032863A1

WO2001032863A1 - Nouveau polypeptide, proteine humaine 12 associee a l'apoptose (sag), et polynucleotide codant pour ce polypeptide

Info

Publication number: WO2001032863A1
Application number: PCT/CN2000/000406
Authority: WO
Inventors: Yumin Mao; Yi Xie
Original assignee: Shanghai BioDoor Gene Technology Ltd
Current assignee: Shanghai BioDoor Gene Technology Ltd
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2001-05-10
Anticipated expiration: 2002-04-29
Also published as: AU1378701A; CN1302886A

Description

一种新的多肽——人细胞凋亡相关蛋白 12和编码这种多肽的多核苷酸

抟术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——人细胞凋亡相关（SAG)蛋白 12，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

技术背景

细胞与外界关系十分密切，细胞需要外界提供养料，同时又可能由于外界条件的毒害而死亡。在细胞内部有许多防护体系可以减缓这种毒害作用，最近发现的 SAG蛋白就是其中一种。

SAG在进化中高度保守，人与线虫的 SAG蛋白同源性可达 75%，人与酵母的 SAG 蛋白同源性也可达到 55%。在人组织中， SAG在骨骼肌、心脏、肝脏、胰脏和睾丸中表达量较高，并且在细胞质和细胞核中都有表达。在细菌中表达并纯化的人 SAG 蛋白可以与锌、铜等金属离子结合，阻止由铜等金属导致的脂类过氧化。在几种人细胞系中过量表达时， SAG 蛋白可以阻止由于氧化还原剂导致的细胞凋亡 [Duan H，et al, Mol Cell Biol 1999 Apr; 19 (4): 32145-55]. 因此， SAG是一种细胞保护分子。

对 SAG 蛋白结构的分析发现， SAG 蛋白包含两个假想的血红素结合位点和一个 RING锌指结构。但研究发现 SAG并没有结合血红素的能力，也缺乏转录因子活性 [Swaroop M et al, Free Radic Biol Med 1999 Jul; 27 (1-2): 193-202] ₀ 最近发现 SAG可以与蛋白激酶 CKII的 P亚基结合，结合位点在 RING锌指结构域。

SAG 蛋白的突变会使骨骼肌、心肌、肝脏、胰脏和睾丸等组织和器官的细胞失去 SAG 蛋白对铜、锌等金属氧化还原剂的缓冲作用，从而导致这些组织和器官细胞中毒而坏死。 SAG蛋白的提纯有助于生产有效的药剂治疗或预防由于上述原因而产生的各种疾病，如局灶性胞浆坏死、凝固性坏死、气性坏疽、液化性坏死、固缩坏死等。

1999年 4 月， Duan H等人发现的 SAG蛋白包括一个 RING锌指结构，由 113 个氨基酸组成，分子量为 12.6kDa。他们发现这种 SAG蛋白可能通过阻止或减缓金属离子诱导的细胞色素 C的释放而防止细胞凋亡。本发明的多肽与 Duan等发现的 SAG蛋白在蛋白水平上从 1到第 59个氨基酸残基有 1 00%的同源性，并且同样具有 RING锌指结构。以上各点表明本发明是一种新的 SAG蛋白，并具有相似的生物学功能，并命名为人 SAG蛋白 12 ,

发明目的

本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——人 SAG蛋白 12 以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码人 SAG蛋白 12的多核苷酸的重组载体。本发明的另一个目的是提供含有编码人 SAG蛋白 1 2 的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供生产人 SAG蛋白 12的方法。

本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——人 SAG蛋白 1 2的抗体。本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——人 SAG 蛋白 1 2 的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。

本发明的另一个目的是提供诊断治疗与人 SAG 蛋白 1 2 异常相关的疾病的方法。

发明概要

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的人 SAG蛋白 12，该多肽是人源的，它包含：具有 SEQ I D NO: 2 氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。较佳地，该多肽是具有 SEQ I D NO: 2 氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 1 00%相同性：（a)编码上述人 SAG 蛋白 1 2 的多核苷酸；（b)与多核苷酸（a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有 SEQ I D NO: 2 所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种： )具有 SEQ I D NO: 1 中 1 25-45 1 位的序列；和（b)具有 SEQ I D NO: 1 中 1-1 1 52位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图 1是本发明人 SAG蛋白 12和 SAG蛋白的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人 SAG蛋白 12，下方序列是 SAG蛋白。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用 "+" 表示。

图 2为分离的人 SAG蛋白 12的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（SDS-PAGE )。 12kda 为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。

发明内容

如本发明所用， "分离的" 是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用， "分离的人 SAG蛋白 12" 是指人 SAG蛋白 12基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人 SAG蛋白 12。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。人 SAG蛋白 1 2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明提供了一种新的多肽——人 SAG蛋白 12，其基本上是由 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人 SAG 蛋白 12 的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语 "片段" 、 "衍生物" 和 "类似物" 是指基本上保持本发明的人 SAG 蛋白 1 相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：（ I ) 这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基（优选的是保守氨基酸残基）取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者（ Π ) 这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者（ Π Ι ) 这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合；或者（ IV ) 这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列）通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明提供了分离的核酸（多核苷酸），基本由编码具有 SEQ I D NO: 2 氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括 SEQ I D N0: 1 的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的 cDNA 文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为 1152个碱基，其开放读框 125-451 编码了 1 08个氨基酸。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与 SAG 蛋白有 1 00%的同源性，可推断出该新的人 SAG蛋白 12具有 SAG蛋白家族相似的结构和功能。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或是 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、基因组 DNA 或人工合成的 DNA。 DNA 可以是单链的或是双链的。 DNA 可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ I D NO: 1 所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用， "简并的变异体" 在本发明中是指编码具有 SEQ ID NO: 2的蛋白质或多肽，但与 SEQ ID NO: 1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码 SEQ I D NO: 2的成熟多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列）以及非编码序列。

术语 "编码多肽的多核苷酸" 是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸（两个序列之间具有至少 50%，优选具有 70%的相同性）。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中， "严格条件" 是指：（υ在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如 0.2xSSC， 0.1%SDS，60'C;或（2)杂交时加用变性剂，如 50%(v/v)甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0. l%Ficoll， 42°C等；或 (3)仅在两条序列之间的相同性至少在 95%以上，更好是 97%以上时才发生杂交，并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO: 2 所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用， "核酸片段"的长度至少含 10个核苷酸，较好是至少 20- 30个核苷酸，更好是至少 50-60个核苷酸，最好是至少 100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术（如 PCR)以确定和 /或分离编码人 SAG蛋白 12的多核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。本发明的编码人 SAG 蛋白 12 的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于： 1) 用探针与基因组或 cDNA 文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和 2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。

本发明的 DNA片段序列也能用下列方法获得： 1)从基因组 DNA分离双链 DNA 序列； 2)化学合成 DNA序列以获得所述多肽的双链 DNA。

上述提到的方法中，分离基因组 DNA 最不常用。 DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是 cDNA序列的分离。分离感兴趣的 cDNA 的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离 mRNA 并进行逆转录，形成质粒或噬菌体 cDM文库。提取 mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得（Qiagene)。而构建 cDNA 文库也是通常的方法（Sambrook, et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。还可得到商业供应的 cDNA文库，如 Clontech公司的不同 cDM 文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些 cDNA 文库中筛选本发明的基因。这些方法包括（但不限于）：（l)DNA-DNA 或 DNA-RM 杂交；（2)标志基因功能的出现或丧失；（3)测定人 SAG蛋白 12 的转录本的水平；（4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第（1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少 10 个核苷酸，较好是至少 30个核苷酸，更好是至少 50个核苷酸，最好是至少 100 个核苷酸。此外，探针的长度通常在 2000 个核苷酸之内，较佳的为 1000 个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的 DNA 序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。 DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶（如碱性磷酸酶）等。

在第（4)种方法中，检测人 SAG蛋白 12基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如 Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法（ELISA)等。

应用 PCR 技术扩增 DNA/RNA 的方法（Saiki, et al. Science 1985; 230: 1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的 cDNA时，可优选使用 RACE法（RACE- cDNA末端快速扩增法），用于 PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种 DNA 片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法（Sanger et al. PNAS, 1977, 74： 5463- 5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的 cDNA 序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的 cDNA 序列，才能拼接成全长的 cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用人 SAG 蛋白 12 编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

本发明中，编码人 SAG 蛋白 12 的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语 "载体" 指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于 T7 启动子的表达载体（Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56: 125)；在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND表达载体（Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521, 1988) 和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码人 SAG蛋白 12 的 DNA序列和合适的转录 /翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、体内重组技术等（Sambroook, et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导 mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的 lac 或 trp 启动子； λ噬菌体的 PL 启动子；真核启动子包括 CMV 立即早期启动子、 HSV 胸苷激酶启动子、早期和晚期 SV40启动子、反转录病毒的 LTRs 和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是 DNA表达的顺式作用因子，通常大约有 10到 300 个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一恻的 100 到 270 个碱基对的 SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白（GFP) , 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体 /转录调控元件（如启动子、增强子等）和选择性标记基因。

本发明中，编码人 SAG 蛋白 12 的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语 "宿主细胞" 指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；毘虫细胞如果蝇 S2或 Sf9; 动物细胞如 CH0、 COS或 Bowes黑素瘤细胞等。用本发明所述的 D 序列或含有所述 DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaC l ₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用 MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等.

通过常规的重组 D 技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人 SAG蛋白 12 (Sc ience , 1984 ; 224： 1431) . 一般来说有以下步骤：

(1) .用本发明的编码人人 SAG蛋白 12 的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2) .在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤（ 2 ) 中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在步骤（ 3 ) 中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、肾上腺缺乏症、皮肤病、各类炎症、 H I V 感染和免疫性疾病等。

SAG蛋白在骨骼肌、心肌、肝脏、胰脏和睾丸等组织和器官中有较高表达，保护细胞不因铜、锌等金属离子的氧化还原作用而死亡。因此，本发明的蛋白多肽或其一部分可以治疗或预防由于这些组织或器官中的细胞坏死而导致的疾病，包括但不限于：局灶性胞浆坏死、凝固性坏死、气性坏疽、液化性坏死、固缩坏死等。

本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高（激动剂）或阻遏（拮抗剂）人 SAG 蛋白 12 的药剂的方法。激动剂提高人 SAG蛋白 12刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人 SAG蛋白 12的膜制剂与标记的人 SAG蛋白 12 一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

人 SAG 蛋白 12 的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人 SAG蛋白 12的拮抗剂可以与人 SAG蛋白 12结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人 SAG 蛋白 12 加入生物分析测定中，通过测定化合物对人 SAG 蛋白 12 和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与人 SAG 蛋白 12 结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对人 SAG蛋白 12分子进行标记。

本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对人 SAG 蛋白 12 抗原决定簇的抗体。这些抗体包括（但不限于）：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、 Fab片段和 Fab表达文库产生的片段。

多克隆抗体的生产可用人 SAG蛋白 12直接注射免疫动物（如家兔，小鼠，大鼠等）的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备人 SAG蛋白 12 的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术（Kohler and Milstein. Nature, 1975, 256: 495-497) , 三瘤技术，人 Β-细胞杂交瘤技术， EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产（Morrison et al ， PNAS， 1985， 81: 6851)。而已有的生产单链抗体的技术（U. S. Pat No.4946778)也可用于生产抗人 SAG蛋白 12的单链抗体。

抗人 SAG 蛋白 12 的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人 SAG蛋白 12。

与人 SAG 蛋白 12 结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人 SAG 蛋白 12 高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素（如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等）共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如 SPDP , 攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人 SAG 蛋白 12阳性的细胞。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人 SAG 蛋白 12 相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人 SAG蛋白 12的产生或活性.

本发明还涉及定量和定位检测人 SAG 蛋白 12 水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括 F I SH 测定和放射免疫测定。试验中所检测的人 SAG蛋白 12水平，可以用作解释人 SAG蛋白 12在各种疾病中的重要性和用于诊断人 SAG蛋白 12起作用的疾病。

本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。

编码人 SAG 蛋白 12 的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于人 SAG蛋白 12 的无表达或异常 /无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常重组的基因治疗载体（如病毒载体）可设计用于表达变异的人 SAG 蛋白 1 2，以抑制内源性的人 SAG蛋白 1 2 活性。例如，一种变异的人 SAG蛋白 12 可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人 SAG 蛋白 12，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗人 SAG 蛋白 12 表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码人 SAG 蛋白 12 的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码人 SAG蛋白 12 的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献（Sambrook，e t a l. )。另外重组编码人 SAG 蛋白 12的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内。

多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体（如病毒、噬菌体或质粒等）先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。抑制人 SAG蛋白 12 mRNA的寡核苷酸（包括反义 RNA和 DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定 RNA的酶样 RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶 RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的 RNA 和 DNA及核酶可用已有的任何 RNA或 DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义 RNA分子可通过编码该 RNA的 DNA 序列在体外或体内转录获得。这种 DNA序列已整合到载体的 R 聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯鍵或肽键而非磷酸二酯键。

编码人 SAG蛋白 12的多核苷酸可用于与人 SAG蛋白 12的相关疾病的诊断。编码人 SAG蛋白 12的多核苷酸可用于检测人 SAG蛋白 12的表达与否或在疾病状态下人 SAG蛋白 12的异常表达。如编码人 SAG蛋白 12的 DM序列可用于对活检标本进行杂交以判断人 SAG蛋白 12 的表达状况。杂交技术包括 Southern 印迹法， Nor thern 印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列（Mi croarray)或 DNA 芯片（又称为 "基因芯片" ）上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人 SAG 蛋白 12 特异的引物进行 RNA-聚合酶链反应（RT-PCR)体外扩增也可检测人 SAG蛋白 12的转录产物。

检测人 SAG蛋白 12基因的突变也可用于诊断人 SAG蛋白 12相关的疾病。人 SAG蛋白 12突变的形式包括与正常野生型人 SAG蛋白 12 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如 Sou thern 印迹法、 DNA 序列分析、 PCR 和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用 Nor thern印迹法、 Wes tern印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据（重复多态性）的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些 DNA序列定位于染色体上。

简而言之，根据 cDNA制备 PCR引物（优选 15-35bp) , 可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于 PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的 PCR定位法，是将 DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的 cDNA库。

将 cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交（FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见 Verma等， Human Chromosomes: a Manua l of Bas ic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如， V. Mckus i ck, Mende l ian Inher i tance i n Man (可通过与 Johns Hopk ins Un ivers i ty We l ch Med i ca l Li bra ry联机获得）。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

接着，需要测定患病和未患病个体间的 cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结抅的变化，如从染色体水平可见的或用基于 cDNA序列的 PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的 cDNA, 可以是 50至 500个潜在致病基因间之一种 (假定 1兆碱基作图分辨能力和每 20kb对应于一个基因）。

可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人 SAG蛋白 12 以有效地治疗和 /或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人 SAG 蛋白 12 的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1 人 SAG蛋白 12的克隆

用异硫氰酸胍 /酚 /氯仿一步法提取人胎脑总 RNA。用 Quik mRNA Isolation Kit (Qiegene 公司产品）从总 RNA中分离 poly (A) mRNA。 2ug poly (A) mRNA经逆转录形成 cDNA。用 Smart cDNA克隆试剂盒（购自 Clontech )将cDNA片段定向插入到 pBSK (+) 载体（Clontech公司产品）的多克隆位点上，转化 DH5a，细菌形成 cDNA文库。用 Dye terminate cycle react ion sequencing ki t (Perkin-Elmer公司产品) 和 ABI 377 自动测序仪（Perkin-Elmer公司）测定所有克隆的 5'和 3'末端的序列。将测定的 cDNA 序列与已有的公共 DNA序列数据库（Genebank) 进行比较，结果发现其中一个克隆 0135c07的 cDNA序列为新的 DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入 cDNA片段进行双向测定。结果表明， 0135c07克隆所含的全长 cDNA为 2272bp (如 Seq IDN0: 1 所示），从第 125bp至 451bp有一个 327bp的开放阅读框架（ 0RF ) ，编码一个新的蛋白质（如 Seq ID NO: 2所示）。我们将此克隆命名为 pBS - 0135c07 , 编码的蛋白质命名为人 SAG蛋白 12。实施例 2 cDNA 克隆的同源检索

将本发明的人 SAG蛋白 12的序列及其编码的蛋白序列，用 Blast程序（Basic local alignment search tool) [Al tschul , SF et a 1. J.Mol. Biol.1990; 215: 403-10] , 在 Genbank、 Swissport等数据库进行同源检索。与本发明的人 SAG蛋白 12同源性最高的基因是一种已知的 SAG蛋白，其编码的蛋白在 Genbank的准入号为 AF092878。蛋白质同源结果示于图 1，两者高度同源，其相同性为 100%; 相似性为 100%。实施例 3 用 RT-PCR方法克隆编码人 SAG蛋白 12的基因

用胎脑细胞总 RNA为模板，以 oligo-dT为引物进行逆转录反应合成 cDNA，用 Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行 PCR扩增：

Primer 1: 5'- ACGGCTGCGAGAAGACGAAGCTT -3' (SEQ ID NO: 3)

Primer2: 5'- GTTTTAAACTGCACTTTATTTGT -3' (SEQ ID NO: 4)

Primerl为位于 SEQ ID NO: 1的 5，端的第 lbp开始的正向序列;

Primer2为 SEQ ID NO: 1的中的 3'端反向序列。

扩增反应的条件: 在 50μ 1的反应体积中含有 50瞧 ol/L KC1, 10mmol/L Tris- Cl, (pH8.5), 1.5mraol/L MgCl₂， 200 μ mol/L dNTP, lOpmol引物， 1U的 Taq DNA聚合酶（Clontech公司产品）„ 在 PE9600型 DM热循环仪（Perkin-Elmer公司）上按下列条件反应 25个周期： 94°C 30sec; 55°C 30sec; 72°C 2min„ 在 RT-PCR时同时设 β -act in 为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用 QIAGEN公司的试剂盒纯化，用 TA 克隆试剂盒连接到 pCR载体上（ Invitrogen公司产品）。 DM序列分析结果表明 PCR 产物的 DM序列与 SEQ ID NO: 1所示的 1- 1152bp完全相同。实施例 4 Northern 印迹法分析人 SAG蛋白 12基因的表达

用一步法提取总 RNA [Anal. Biochem 1987, 162, 156-159] ₀ 该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用 4M异硫氰酸胍- 25mM柠檬酸钠， 0.2M乙酸钠（ pH4.0 ) 对组织进行匀浆，加入 1倍体积的苯酚和 1/5体积的氯仿-异戊醇（49: 1 ) ，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇（0.8体积）并将混合物离心得到 R 沉淀。将得到的 RNA沉淀用 70%乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用 20 g RNA, 在含 20mM 3- (N- 吗啉代）丙磺酸（pH7.0) - 5mM乙酸钠 -ImM EDTA-2.2M甲醛的 1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用 a- ³²P dATP通过随机引物法制备 ³²P-标记的 DNA探针。所用的 DNA探针为图 1所示的 PCR扩增的人 SAG蛋白 12编码区序列（125bp 至 451bp)。将 32P-标记的探针（约 2x l0⁶cpm/ml ) 与转移了 RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于 ⁴2。C杂交过夜，该溶液包含 50%甲酰胺 -25mM KH₂P0₄ ( pH7.4 ) -5 χ SSC- 5xDenhardt's溶液和 200 g/ml鲑精 DNA。杂交之后，将滤膜在 1 x SSC- 0.1%SDS中于 55。C洗 30min。然后，用 Phosphor Imager进行分析和定量。实施例 5 重组人 SAG蛋白 12的体外表达、分离和纯化

根据 SEQ ID N0: 1和图 1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下：

Primer3: 5'- CCCCATATGATGGCCGACGTGGAAGACGGAGAG -3， ( Seq ID No: 5 ) Primer4: '- CCCGGATCCTTTGTATGCTTCCAATAGGTTGCT -3' (Seq ID No: 6 ) 此两段引物的 5'端分别含有 Ndel和 BamHI酶切位点，其后分别为目的基因 5，端和 3'端的编码序列， Ndel 和 BamHI 酶切位点相应于表达载体质粒 _PET - 28b(+) (Novagen公司产品， Cat. No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的 pBS- 0135c07质粒为模板，进行 PCR反应。 PCR反应条件为：总体积 50 μ 1中含 pBS-0135c07质粒 10pg、引物 Primer- 3和 Primer- 4分别为 lOpmol、 Advantage polymerase Mix ( Clontech公司产品） 1 μ 1。循环参数： 94°C 20s, 60°C 30s, 68°C 2 min,共 25个循环。用 Ndel 和 BamHI分别对扩增产物和质粒 pET- 28 (+)进行双酶切，分别回收大片段，并用 T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌 DH5 α，在含卡那霉素（终浓度 30 g/ml ) 的 LB平板培养过夜后，用菌落 PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆（pET- 0135C07 )用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品）。在含卡那霉素（终浓度 30μ^1 ) 的 LB液体培养基中，宿主菌 BL21 ( pET-0135c07 ) 在 37°C培养至对数生长期，加入 IPTG至终浓度 lmmol/L, 继续培养 5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与 6个组氨酸 His- Tag) 结合的亲和层析柱 His. Bind Quick Cartridge ( Novagen公司产品）进行层析，得到了纯化的目的蛋白人 SAG蛋白 12。经 SDS-PAGE电泳,在 12kda处得到一单一的条带（图 2 )。将该条带转移至 PVDF 膜上用 Edams水解法进行 N-端氨基酸序列分析，结果 N-端 15个氨基酸与 SEQ ID NO: 2 所示的 N-端 15个氨基酸残基完全相同。实施例 6 抗人 SAG蛋白 12抗体的产生用多肽合成仪（PE公司产品）合成下述人 SAG蛋白 12特异性的多肽：腿一 Me t-A 1 a-Asp-Va 1-G 1 u-As p-G 1 y-G 1 u-G 1 u-Thr-Cys-A 1 a-Leu-A 1 a-Ser-COOH (SEQ ID NO: 7)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见： Avrameas，et al. Immunochemi s t ry, 1969; 6: 43。用 4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔， 15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经 15 p g/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做 ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白 A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总 IgG。将多肽结合于溴化氰活化的 Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总 IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与人 SAG蛋白 12结合。

Claims

1、一种分离的多肽-人细胞凋亡相关（SAG)蛋白 12 , 其特征在于它包含有： SEQ I D NO: 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。

2、如权利要求 1 所述的多肽，其特征在于所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与 SEQ I D NO: 2所示的氨基酸序列至少 95%的相同性。

3、如权利要求 2 所述的多肽，其特征在于它包含具有 SEQ I D NO: 2 所示的氨基酸序列的多肽。

4、一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：

(a) 编码具有 SEQ I D NO: 2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；

(b) 与多核苷酸（a ) 互补的多核苷酸；或

(c) 与（a ) 或（b ) 有至少 1 00%相同性的多核苷酸。

5、如权利要求 4 所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含编码具有 SEQ I D NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。

6、如权利要求 4 所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有 SEQ I D NO: 1 中 128-1 078位的序列或 SEQ I D NO: 1 中 1-2272位的序列。

7、一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求 4 - 6 中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。

8、一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：

(a) 用权利要求 7所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或

(b) 用权利要求 4-6中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞

9、一种具有人 SAG蛋白 1 2活性的多肽的制备方法，其特征在于所述方法包括：

(a) 在表达人 SAG蛋白 12条件下，培养权利要求 8所述的工程化宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出具有人 SAG蛋白 1 2活性的多肽。

1 0、一种能与多肽结合的抗体,其特征在于所述抗体是能与人 SAG蛋白 12 特异性结合的抗体。

11、一类模拟或调节多肽活性或表达的化合物，其特征在于它们是模拟、促进、拮抗或抑制人 SAG蛋白 12的活性的化合物。

12、如权利要求 11 所述的化合物，其特征在于它是 SEQ I D N0: 1 所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。

1 3、一种权利要求 1 1 所述化合物的应用，其特征在于所述化合物用于调节人 SAG蛋白 12在体内、体外活性的方法。

14、一种检测与权利要求 1-3中的任一权利要求所述多肽相关的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括检测所述多肽的表达量，或者检测所述多肽的活性，或者检测多核苷酸中引起所述多肽表达量或活性异常的核苷酸变异。

15、如权利要求 1-3中的任一权利要求所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选人 SAG 蛋白 12 的模拟物、激动剂，拮抗剂或抑制剂；或者用于肽指紋图谱鉴定。

16、如权利要求 4-6 中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

Π、如杈利要求 1 -6 及 1 1 中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂以安全有效剂量与药学上可接受的载体组成作为诊断或治疗与人 SAG 蛋白 12异常相关的疾病的药物组合物。

1 S、权利要求 1-6 及 1 1 中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制备用于治疗恶性肿瘤，血液病， H IV感染和免疫性疾病和各类炎症的药物。