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WO2001019395A1 - Compositions acellulaires immunogenes et compositions acellulaires vaccinales contre bacillus anthracis - Google Patents

Compositions acellulaires immunogenes et compositions acellulaires vaccinales contre bacillus anthracis Download PDF

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WO2001019395A1
WO2001019395A1 PCT/FR2000/002494 FR0002494W WO0119395A1 WO 2001019395 A1 WO2001019395 A1 WO 2001019395A1 FR 0002494 W FR0002494 W FR 0002494W WO 0119395 A1 WO0119395 A1 WO 0119395A1
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WO
WIPO (PCT)
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anthracis
spores
acellular
vaccine
strain
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2000/002494
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English (en)
Inventor
Michèle Mock
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur
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Publication date
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Priority to CA2384437A priority patent/CA2384437C/fr
Publication of WO2001019395A1 publication Critical patent/WO2001019395A1/fr
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Priority to US12/341,114 priority patent/US20090110700A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)

Definitions

  • the present invention relates to immunogenic acellular compositions as well as acellular vaccine compositions against Bacillus anthracis, and their applications in human medicine and veterinary medicine.
  • Bacillus anthracis (B. anthracis), the agent responsible for anthrax or anthrax, is a Gram-positive, aerobic and spore-forming bacteria.
  • This agent induces an infection either by intradermal inoculation, or by ingestion or inhalation of the spores (Klein F. et al, (1966), J. Infect. Dis., 116, 1213-138; Friedlander AM et al, (1993), J. Infect. Dis., 167, 1239-1242), the transformation of which into vegetative cells, encapsulated and toxinogenic forms, allows the bacteria to proliferate and synthesize its virulence factors.
  • the inventors have recently shown in a mouse model of a pulmonary infection with B. anthracis, that the alveolar macrophages are the primary site of germination, which is quickly followed by the expression of the genes of the toxins, confirming that the meeting of the spore with the host is crucial for the pathogenicity of B. anthracis (Guidi-Rontani E; et al, Molecular Biology, (1999), 31, 9-17).
  • the main virulence factors are: - the anti-phagocytic capsule consisting of poly- ⁇ -_ - glutamic acid (Avakyan A. A. et al. (1965), J. of Bacteriology, 90, 1082-1095) and
  • PA-EF edematous toxin
  • PA-LF lethal toxin
  • the factor present in the two combinations is the protective antigen (PA) which intervenes in the binding of toxins on the target cells.
  • PA protective antigen
  • the other two factors, the edematogenic factor (EF) and the Lethal factor (LF) are responsible for the manifestation of the toxic effect.
  • the simultaneous production of the capsule and toxins is essential for the manifestation of pathogenicity.
  • the genes coding for the enzymes synthesizing the capsule are carried by the plasmid pXO2 (Green B. D. et al, (1985), Infect. Immun., 49, 291-297;
  • the inventors constructed various mutants. Thus, they characterized a strain devoid of the plasmid pXO2 and devoid of PA by modification of the plasmid pXOl. Due to the absence of PA, this strain no longer has a lethal character (Cataldi A. et al. (1990), Molecular Microbiology, 4, 1111-1117).
  • mutants devoid of at least one of the toxicity factors responsible for the pathogenicity, it is that is to say deficient in PA, in EF or in LF, or even devoid of the plasmid pXOl and devoid in addition of the plasmid pXO2.
  • veterinary vaccine is a live vaccine composed of a suspension of spores of the tern strain of B. anthracis. Its protective efficacy in animals varies from batch to batch, without the causes of these variations being able to be determined.
  • the vaccination protocol is binding, since it requires six injections in eighteen months, followed by a reminder per year,
  • the present invention therefore relates to an acellular immunogenic composition, capable of inducing an immune response against B. anthracis infections, characterized in that it comprises:
  • PA protective antigen
  • mutant strains of B. anthracis carrying one or more mutations chosen from among the mutations in at least one gene coding for a protein responsible for a toxic effect in B. anthracis , or from mutant strains of B. anthracis devoid of at least one of the plasmids pXOl and pXO2, associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said acellular immunogenic composition is capable of producing antibodies against B. anthracis.
  • the present invention also relates to an acellular vaccine composition against B. anthracis, characterized in that it comprises:
  • PA protective antigen
  • mutant strains of B. anthracis carrying one or more mutations chosen from among the mutations in at least one gene coding for a protein responsible for a toxic effect in B. anthracis , or from mutant strains of B. anthracis devoid of at least one of the plasmids pXOl and pXO2, associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle and at least one adjuvant.
  • acellular means that the immunogenic or vaccine composition no longer contains viable cells (killed spores).
  • the adjuvants used are conventionally used adjuvants and will in particular be either saponin in the case of the veterinary vaccine, or advantageously chosen from the group consisting of alumina hydroxide and squalene, in the case of the human vaccine.
  • the spores can be killed by any physical or chemical means leading to their inactivation.
  • the term “mutation” means a deletion, a modification or an addition to the level of the gene concerned, which results either in a gene lacking its capacity to produce the corresponding protein, or capable of producing an inactive protein .
  • the immunogenic compositions and the vaccine compositions can also comprise at least one detoxified exotoxin chosen in particular from the group consisting of the lethal factor (LF) and the detoxified edematogenic factor (EF), c that is, having lost their toxic properties.
  • LF lethal factor
  • EF edematogenic factor
  • These inactivated protein factors can in particular be obtained by expression of the mutated genes at the level of the sequence coding for the active site of said protein factors (cya or lef).
  • the immunogenic and vaccine compositions according to the invention have, surprisingly, a strong protective power, of the order of 100%, markedly greater than that obtained with the PA alone or the spores killed alone, which makes it possible to have a full immunization with a single injection under the conditions of the veterinary vaccine and two injections under the conditions of the vaccine for human use.
  • the spores come from a strain of B. anthracis chosen from the group consisting of the following strains: Sterne 7702 (M. Sterne J. Vet. Sci Anima. Indust., (1939), 13, 315-317), RPLC2 (National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Institut Pasteur under the number 1-2270 dated July 28, 1999) and RP42 (National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Institut Pasteur under the number 1-2271 dated July 28, 1999).
  • the protective antigen is chosen from the group consisting of purified protective antigens, originating from any wild or mutated Tern strain of B. anthracis, and recombinant protective antigens, in particular that produced by B. subtilis.
  • the protective antigen comes from the strain RP42 (National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Pasteur Institute under the number 1-2271 dated July 28, 1999).
  • the present invention also relates to the strain RPLC2 deposited with the National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Pasteur Institute under the number 1-2270 dated July 28, 1999.
  • the present invention also relates to the use of at least one antibody directed against spores originating from strains, obtained either from mutant strains of B. anthracis carrying one or more mutations chosen from among the mutations at least a gene coding for a protein responsible for a toxic effect in B. anthracis, ie from mutant strains of B. anthracis devoid of at least one of the plasmids pXOl and pXO2, for the manufacture of a medicament capable of inducing a passive immunization.
  • antibiotics are the only current treatment against anthrax and must be administered early, before the onset of toxic shock. Consequently, a serotherapy targeting both toxins and the germination of spores would be a good complement.
  • the antibodies can be polyclonal antibodies obtained by immunization of an appropriate animal with the spores originating from strains used for the preparation of the compositions according to the invention, under usual conditions for the preparation of such antibodies.
  • the antibodies can be monoclonal antibodies obtained in a manner known per se, in particular by fusion of the spleen cells of immune mice nises with an antigen consisting of spores from strains used for the preparation of the compositions according to the invention.
  • the present invention also relates to purified antigenic preparations, characterized in that they come from spores of B. anthracis, and comprise for example one or more of the exoantigens (proteins of spores and of exosporium) of respective molecular weights 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa and greater than 200 kDa, said molecular weights being determined by using the Amersham kit ® LMWElectrophoresis Calibration Kit.
  • these antigenic compositions are obtained by conventional techniques known to those skilled in the art.
  • the present invention further relates to polyclonal or monoclonal antibodies directed against said antigenic compositions.
  • immunogenic and vaccine compositions according to the invention can be administered, alone or in combination with other vaccines, by injection or by any route usually used for vaccination.
  • the doses to be administered will be determined according to the animal or the person we are trying to protect.
  • FIG. 2 shows the immunoblot analysis of the proteins of exosporium (A) revelation by a polyclonal antibody and a monoclonal antibody (35B8) (B) analysis according to the procedure described in Example 5, - Figure 3 represents the different strains of B. anthracis used to prepare the strain RPLC2.
  • the strain RPLC2 produces the components of toxins inactivated by point mutations in the active sites of the proteins LF (LF686; H686- »A) and EF (EF346 / 353; K346 ⁇ Q and K353 ⁇ Q).
  • the numbers following ⁇ indicate the nucleotides at which the deletions begin and end; Erm, Kan and Sps indicate the insertion of cassettes of resistance to erythromycin, kanamycin and spectinomycin; 0 corresponds to an organism which does not show resistance to these antibiotics.
  • EXAMPLE 1 Material and method for the preparation of the compositions according to the invention. 1.1. Construction of the RPLC2 strain
  • the strain RPLC2 National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Institut Pasteur under the number 1-2270 dated 28 July 1999
  • the strain RPLC2 (National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Institut Pasteur under the number 1-2270 dated 28 July 1999) is constructed from the strains indicated in FIG. 3, according to the operating principles described by Pezard C. et al. (1993) (reference cited).
  • the PA protein is prepared from the mutant strain of B. anthracis RP42 (National Collection of Cultures and Microorganisms kept by the Pasteur Institute under the number 1-2271 dated July 28, 1999).
  • the medium culture supernatants R (Ristroph JD et al. (1983), Infection and Immunity, 39, 483-486) are filtered and then concentrated on a ® Minitan system (Millipore ® membrane CGRP OMP). The PA antigen is then purified by ultra-fast chromatography
  • the spores are prepared from the Sterne 7702 strain according to the procedure described by Guidi-Rontani E et al (1999) (reference cited).
  • the spores are prepared on a solid NBY medium, then washed with distilled water. They are inactivated by treatment with formalin, at a final concentration of 4%, for 3 hours at 37 ° C.
  • the spores are taken up in the initial volume of physiological saline (final concentration of 10 9 spores / ml).
  • This suspension is used to carry out immunization. If necessary, especially when we want to prepare a vaccine for human use, the spores can be purified before formalin treatment on a gradient Radioselectran ® (Schering AG) from 50% to 76%. 1.4. Preparation of vaccine compositions
  • compositions are prepared either from killed spores alone prepared according to the procedure described in 1.3, or from a mixture of PA (at a concentration such that one injectes 0 ⁇ g per mouse) and of killed spores (10 8 spores per mouse), to which is added as an adjuvant either aluminum hydroxide at a final concentration of 0.3%, or saponin at a final concentration of 0.05%.
  • the animals are divided into groups of six and fed ad libitum.
  • the injections are made subcutaneously in the groin in a volume of 200 ⁇ l. 1.6. Measurement of antibody levels
  • the injection protocol for each group is as follows:
  • test injection is carried out on the 43rd day with the virulent 17JB strain of B. anthracis (Pasteur reference strain No. 2) supplied by the Rhône-Mérieux Company.
  • the first group receives the aluminum hydroxide alone (control group)
  • the second group receives a dose of PA of 10 ⁇ g per mouse
  • the third group receives the spores alone at 10 8 spores per mouse and
  • the fourth group receives the mixture PA + spores killed so as to have 10 ⁇ g of PA and 10 8 spores per mouse.
  • All the groups receive at 43 ' emc day, as specified above, a test dose corresponding to 30 times the LD50, or 1.5 x 10 4 spores per mouse.
  • the injection protocol for each group is as follows:
  • test injection is carried out on the 32nd day with the virulent 17JB strain of B. anthracis (Pasteur reference strain No. 2) supplied by the Rhône-Mérieux Company.
  • the first group receives the aluminum hydroxide alone
  • the second group receives a dose of PA of 10 ⁇ g per mouse
  • the third group receives the spores alone at the rate of 10 8 spores per mouse and
  • the fourth group receives the mixture PA + spores killed so as to have 10 ⁇ g of PA and 10 8 spores per mouse.
  • All the groups receive, at day 32 , as specified above, a test dose corresponding to 100 times the LD50, ie 1.5 ⁇ 10 4 spores per mouse.
  • the rates of antico ⁇ s directed against the spores are high, of the order of 10 000 to 15 000, and identical in the two groups which received them, whether these spores are alone or associated with PA.
  • test injection is carried out on the 32 nd day with the virulent 17JB strain of B. anthracis (Pasteur reference strain No. 2) supplied by the Rhône-Mérieux Company.
  • the second group receives a dose of PA of 10 ⁇ g per mouse
  • the third group receives the spores alone at the rate of 10 8 spores per mouse
  • the fourth group receives the mixture PA + spores killed so as to have 10 ⁇ g of PA and 10 8 spores per mouse and
  • the fifth group receives the live Sterne vaccine prepared at the Institut Pasteur.
  • a polyclonal serum of mice immunized with killed spores originating, for example, from there strain RPLC2 (National Collection of Cultures and Microorganisms held by the Pasteur Institute under the number 1-2270 dated July 28, 1999) is prepared according to conventional techniques known to those skilled in the art.
  • the specific monoclonal antico ⁇ s of the surface of the spore (35B8) is prepared according to the technique described by Kohler et a, (1975), Nature, 296, 495-497.
  • the spore proteins are solubilized by treating the spores with a Tris-HCl buffer at pH 9.8 containing 8 M urea and 2% SDS or with a TrislO mM buffer at pH 9.5 containing 10 mM EDTA and 1% SDS, according to the technique described by Garcia-Patrone, (1995), Molecular and Cellular Biochem., 145,
  • the polyclonal mouse serum recognizes 3 protein species of respective molecular weight 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa and one protein species of molecular weight greater than 200 kDa. ( Figure 1).
  • the heaviest species is also recognized by monoclonal antibody 35B8 and seems to belong to the exosporium ( Figure 2 A). Indeed, the immunoblot analysis of the proteins of the exosporium shows that the various monoclonal antico ⁇ s used, including 35B8, recognize a protein species of molecular weight greater than 200 kDa ( Figure 2A).
  • the vaccine compositions according to the invention are capable of providing complete protection both under the conditions of the human vaccine and of the veterinary vaccine.
  • the injection protocol for each group is as follows:
  • a test injection is carried out 35 days me with the virulent strain 9602 (Berthier et al, Lancet, 1996, 347, 9004: 828) isolated from a fatal case of human anthrax and whose virulence has ten times greater than that of the strain 17JB used in the previous examples; said strain is injected subcutaneously.
  • the experiments were carried out 2 times, on batches of 5 guinea pigs.
  • the protocol is similar to that used in mice, with the exception of the following points: - the doses of PA are 40 ⁇ g per animal, - the test injection is carried out intramuscularly.
  • the test was carried out on Swiss mice (under the conditions described in Example 4).
  • the test injection is carried out with the strain 9602 (M. Berthier et al., Cited above) in mice having received a single injection, either of live spores (RPLC2), or of the combination according to the invention, spores killed + PA.
  • the protection efficiency of 83% is identical for the two batches.
  • mice and guinea pigs with a vaccine combination comprising killed spores and the PA antigen.

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Abstract

Composition immunogène ou composition vaccinale acellulaire pour la production d'anticorps contre <i>B. anthracis</i> comprenant un antigène protecteur (PA) et des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues à partir de souches mutantes de <i>B. anthracis</i> et leurs applications.

Description

COMPOSITIONS ACELLULAIRES IMMUNOGENES ET COMPOSITIONS ACELLULAIRES VACCINALES CONTRE BACILLUS ANTHRACIS
La présente invention concerne des compositions acellulaires immunogènes ainsi que des compositions acellulaires vaccinales contre Bacillus anthracis, et leurs applications en médecine humaine et en médecine vétérinaire.
Bacillus anthracis (B. anthracis), agent responsable de l'anthrax ou charbon est une bactérie Gram-positive, aérobie et formant des spores.
Cet agent induit une infection soit par inoculation intradermique, soit par ingestion ou inhalation des spores (Klein F. et al, (1966), J. Infect. Dis., 116, 1213-138 ; Friedlander A.M. et al, (1993), J. Infect. Dis., 167, 1239-1242), dont la transformation en cellules végétatives, formes encapsulées et toxinogènes, permet à la bactérie de proliférer et de synthétiser ses facteurs de virulence.
Les Inventeurs ont récemment montré dans un modèle murin d'une infection pulmonaire par B. anthracis, que les macrophages alvéolaires sont le site primaire de la germination, qui est rapidement suivie par l'expression des gènes des toxines, confirmant que la rencontre de la spore avec l'hôte est cruciale pour la patho- génicité de B. anthracis (Guidi-Rontani E ; et al, Molecular Biology, (1999), 31, 9- 17).
Les principaux facteurs de virulence sont : - la capsule anti-phagocytique constituée d'acide poly-γ-_ - glutamique (Avakyan A. A. et al. (1965), J. of Bacteriology, 90, 1082-1095) et
- trois facteurs protéiques agissant en combinaison par deux. La toxine oedématogène (PA-EF) induit un oedème après une injection sous-cutanée alors que la toxine létale (PA-LF) est responsable de la mort des animaux après injec- tion intraveineuse (J. W. Ezzell et al, (1984), Infect. Immun., 45, 761-767. Le facteur présent dans les deux combinaisons est l'antigène protecteur (PA) qui intervient dans la fixation des toxines sur les cellules cibles. Les deux autres facteurs, le facteur oedématogène (EF) et le facteur létal (LF) sont responsables de la manifestation de l'effet toxique. La production simultanée de la capsule et des toxines est indispensable pour la manifestation du pouvoir pathogène.
Les gènes codant pour les enzymes synthétisant la capsule sont portés par le plasmide pXO2 (Green B. D. et al, (1985), Infect. Immun., 49, 291-297 ;
Uchida I. et al, (1985), J. Gen. Microbiol, 131, 363-367) et les trois gènes pag, cya, et lef, codant respectivement pour les facteurs PA, EF et LF sont portés par le plasmide pXOl, qui a été décrit par Mikesell P. et al. (Infect. Immun, (1983), 39, 371- 376).
Alors que de nombreux travaux ont montré que PA est le principal antigène responsable de la protection dans le cadre d'une immunisation naturelle ou acquise par vaccination, les Inventeurs ont montré que LF est également un immuno- gène puissant (Mock M. Annales de l'Institut Pasteur décembre 1990).
Afin de clarifier le rôle des composants des toxines dans la toxicité de B. anthracis, les Inventeurs ont construit divers mutants. Ainsi, ils ont caractérisé une souche dépourvue du plasmide pXO2 et dépourvue de PA par modification du plasmide pXOl. Du fait de l'absence de PA, cette souche ne présente plus de caractère létal (Cataldi A. et al. (1990), Molecular Microbiology, 4, 1 111-1117).
Pour rechercher les éléments susceptibles d'intervenir dans l'immunisation contre l'infection par B. anthracis, les Inventeurs ont construit des mutants, dépourvus d'au moins l'un des facteurs de toxicité responsable de la patho- génicité, c'est-à-dire déficient en PA, en EF ou en LF, voire dépourvus du plasmide pXOl et dépourvus en plus du plasmide pXO2. Bien que dépourvus de toxicité ou présentant une toxicité atténuée, les mutants simples, notamment RP9 (EF') (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-1094 en date du 2 mai 1991) et RP 10 (LF') (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-1095 en date du 2 mai 1991), et le double mutant RP 42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999), se sont révélés aptes à produire des anticorps immunoprotecteurs contre une infection par une souche Sterne sauvage. Ces mutants sont décrits dans la demande Internationale n° 92/19720, et dans les articles de Pezard C. et al, (Infection and lmmunity, (1991), 59, 3472-3477 et J. General Microbiology, (1993), 139, 2459- 2463).
Actuellement, le vaccin vétérinaire commercialisé (Mérial®) est un vaccin vivant composé d'une suspension de spores de la souche Sterne de B. anthracis. Son efficacité protectrice chez l'animal varie selon les lots, sans que les causes de ces variations puissent être déterminées.
Cette efficacité aléatoire, des effets secondaires ainsi que le risque de dissémination potentielle de germes vivants dans l'environnement rendent son utilisation chez l'homme impossible. En médecine humaine, deux vaccins contre la maladie du charbon, essentiellement développés en Angleterre et aux Etats-Unis sont utilisés. Il s'agit de vaccins acellulaires constitués principalement de l'antigène protecteur (PA), préparé à partir de surnageants de culture de la souche toxinogène Sterne de B. anthracis et d'un adjuvant pouvant être utilisé en médecine humaine, l'hydroxyde d'alumine.
Des étude récentes sur ces deux vaccins ont montré que le vaccin anglais, contenant des traces de EF et de LF induisant une réponse anticorps en ELISA, était plus efficace sur le cobaye que le vaccin américain, apparemment dépourvu de ces deux composants (Turnbull P.C. et al. (1991), Vaccine, 9, 533-539).
Toutefois ces deux vaccins présentent un certain nombre d'inconvénients :
- le protocole de vaccination est contraignant, car il nécessite six injections en dix-huit mois, suivies d'un rappel par an,
- ils induisent des effets secondaires néfastes qui rendent leur utilisation limitée,
- la protection induite par ces vaccins acellulaires chez l'animal, envers un test d'épreuve avec une souche virulente, n'est jamais totale, contrairement à celle obtenue avec le vaccin vivant.
Compte tenu de l'importance des infections causées par B. anthracis, de nombreux travaux sont actuellement consacrés à l'amélioration du vaccin afin qu'il ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus, tout en présentant la même protection que le vaccin vivant. Dans ce cadre, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à un vaccin acellulaire fiable, efficace, dépourvu d'effets secondaires qui pallie les inconvénients des vaccins existants et dont les propriétés vaccinales soient faciles à contrôler.
La présente invention a en conséquence pour objet une composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite composition immunogène acellulaire est apte à produire des anticorps contre B. anthracis. La présente invention a également pour objet une composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
Au sens de la présente invention, le terme acellulaire signifie que la composition immunogène ou vaccinale ne contient plus de cellules viables (spores tuées).
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés et seront notamment, soit la saponine dans le cas du vaccin vétérinaire, soit avantageusement choisis dans le groupe constitué par l'hydroxyde d'alumine et le squalène, dans le cas du vaccin humain.
Dans le cadre de la présente invention, les spores peuvent être tuées par tout moyen physique ou chimique conduisant à leur inactivation. A titre d'exemple on peut citer le traitement au formaldéhyde ou l'irradiation.
Au sens de la présente invention, on entend par mutation une délé- tion, une modification ou une addition au niveau du gène concerné, qui résulte soit en un gène dépourvu de sa capacité à produire la protéine correspondante, soit apte à produire une protéine inactive. Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, les compositions immunogènes et les compositions vaccinales peuvent comprendre en outre au moins une exotoxine détoxifiée choisie notamment dans le groupe constitué par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés, c'est-à-dire ayant perdu leurs propriétés toxiques. Ces facteurs protéiques inactivés peuvent notamment être obtenus par expression des gènes mutés au niveau de la séquence codant pour le site actif desdits facteurs protéiques (cya ou lef).
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'Invention possèdent, de manière surprenante, un fort pouvoir protecteur, de l'ordre de 100 %, nettement supérieur à celui obtenu avec le PA seul ou les spores tuées seules, ce qui permet d'avoir une immunisation complète avec une seule injection dans les conditions du vaccin vétérinaire et deux injections dans les conditions du vaccin à usage humain.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, les spores sont issues d'une souche de B. anthracis choisie dans le groupe constitué par les souches suivantes : Sterne 7702 (M. Sterne J. Vet. Sci. Anima. Indust., (1939), 13, 315-317), RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
Dans un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, l'antigène protecteur est choisi dans le groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe quelle souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs recombi- nants, notamment celui produit par B. subtilis.
De manière avantageuse, l'antigène protecteur est issu de la souche RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
La présente invention a également pour objet la souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre les spores issues de souches, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive. En effet les antibiotiques sont le seul traitement actuel contre le charbon et doivent être administrés précocement, avant l'apparition du choc toxique. En conséquence une sérothérapie visant à la fois les toxines et la germination des spores serait un bon complément.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un animal approprié avec les spores issues de souches utilisées pour la préparation des compositions selon l'invention, dans des conditions habituelles de préparation de tels anticorps.
Les anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immu- nisées avec un antigène consistant en des spores issues de souches utilisées pour la préparation des compositions selon l'invention.
La présente invention a également pour objet des préparations anti- géniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues de spores de B. anthracis, et comprennent par exemple un ou plusieurs des exoantigenes (protéines de spores et de Fexosporium) de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa, lesdits poids moléculaires étant déterminés par l'utilisation de la trousse AMERSHAM® LMWElectrophoresis Calibration Kit.
Conformément à l'invention, ces compositions antigéniques sont obtenues par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
La présente invention a de plus pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre lesdites compositions antigéniques.
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention peuvent être administrées, seules ou en combinaison avec d'autres vaccins, par injec- tion ou par toute voie habituellement utilisée pour la vaccination.
Les dose à administrer seront déterminées en fonction de l'animal ou de la personne que l'on cherche à protéger.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 représente l'analyse par immunoblot des protéines de la spore selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5,
- la figure 2 représente l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium (A) révélation par un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal (35B8) (B) analyse selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5, - la figure 3 représente les différentes souches de B. anthracis utilisées pour préparer la souche RPLC2. La souche RPLC2 produit les composants des toxines inactivés par mutations ponctuelles dans les sites actifs des protéines LF (LF686 ; H686-»A) et EF (EF346/353 ; K346→Q et K353→Q). Dans cette figure, les nombres qui suivent Δ indiquent les nucleotides auxquels les délétions commencent et finissent ; Erm, Kan et Sps indiquent l'insertion de cassettes de résistance à l'érythromycine, à la kanamycine et à la spectinomycine ; 0 correspond à un organisme qui ne présente pas de résistance à ces antibiotiques.
EXEMPLE 1 : Matériel et méthode pour la préparation des compositions selon l'invention. 1.1. Construction de la souche RPLC2
La souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) est construite à partir des souches indiquées dans la figure 3, selon les principes opératoires décrits par Pezard C. et al. (1993) (référence citée).
1.2. Préparation du PA
La protéine PA est préparée à partir de la souche mutante de B. anthracis RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
Les surnageants de culture en milieu R (Ristroph J. D. et al. (1983), Infection and Immunity, 39, 483-486) sont filtrés puis concentrés sur un système Minitan® (membrane Millipore® PLGC OMP). L'antigène PA est ensuite purifié par chromatographie ultra-rapide
(FPLC) sur colonne monoQ® selon le protocole décrit par Pezard C. et al. (1993) (référence citée).
1.3. Préparation et inactivation des spores
Les spores sont préparées à partir de la souche Sterne 7702 selon le mode opératoire décrit par Guidi-Rontani E et al (1999) (référence citée).
Les spores sont préparées sur un milieu solide NBY, puis lavées à l'eau distillée. Elles sont inactivées par traitement au formol, à une concentration finale de 4 %, pendant 3 heures à 37 °C.
Après lavage par centrifugation, les spores sont reprises dans le volume initial de sérum physiologique (concentration finale de 109 spores/ml).
Cette suspension est utilisée pour réaliser l'immunisation. Si nécessaire, notamment lorsque l'on veut préparer un vaccin à usage humain, les spores peuvent être purifiées avant le traitement au formol sur un gradient de Radioselectran® (Schering S.A.) de 50 % à 76 %. 1.4. Préparation des compositions vaccinales
Les compositions sont préparées soit à partir de spores tuées seules préparées selon le mode opératoire décrit en 1.3, soit à partir d'un mélange de PA (à une concentration telle qu'on injectelO μg par souris) et de spores tuées (108 spores par souris), auxquels on ajoute comme adjuvant soit de l'hydroxyde d'alumine à une concentration finale de 0,3 %, soit de la saponine à une concentration finale de 0,05 %.
1.5. Protocole de traitement des souris
On utilise des souris Swiss femelles de six semaines fournies par la Société Iffa-Credo (BP0102 - 69592 L'ARBRESLE-Cedex).
Les animaux sont répartis en groupe de six et nourris ad libitum. Les injections sont faites par voie sous-cutanée au niveau de l'aine sous un volume de 200 μl. 1.6. Mesure des taux d'anticorps
Les taux d'anticoφs sont mesurés par un test ELISA classique. EXEMPLE 2 : Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin acellulaire humain (protocole n° 1)
2.1. Traitement des animaux
Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 28 jours d'intervalles et
- une injection d'épreuve est réalisée au 43 ιeme jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n° 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule (groupe témoin), le second groupe reçoit une dose de PA de 10 μg par souris, le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 μg de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent au 43'emc jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
2.2. Résultats
Les taux de survie sont donnés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Figure imgf000009_0001
Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vaccinales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète. EXEMPLE 3 : Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin à usage humain (protocole n° 2)
3.1. Traitement des animaux
Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 21 jours d'intervalles et
- une injection d'épreuve est réalisée au 32 ιeme jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n° 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule,
- le second groupe reçoit une dose de PA de 10 μg par souris,
- le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 μg de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent, au 32,e e jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
3.2. Résultats
3.2.1. Taux de survie
Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Figure imgf000010_0001
Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vaccinales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
3.2.2. Taux d'anticorps
Les taux d'anticoφs dirigés contre les spores sont élevés, de l'ordre de 10 000 à 15 000, et identiques dans les deux groupes qui les ont reçues, que ces spores soient seules ou associées à PA.
Ces résultats confirment l'effet de synergie des compositions selon l'invention, qui, avec un taux d'anticoφs identique à celui obtenu par injection des spores tuées seules, permettent une protection complète. EXEMPLE 4 : Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage vétérinaire (une seule injection en utilisant la saponine comme adjuvant) : épreuve avec souche 17JB.
4.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- une injection de compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4. ou de saponine est réalisée à J0 et
- une injection d'épreuve est réalisée au 32 ιemc jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n° 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Cinq groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit :
- le premier groupe reçoit la saponine seule (groupe témoin),
- le second groupe reçoit une dose de PA de 10 μg par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris,
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 μg de PA et 108 spores par souris et
- le cinquième groupe reçoit le vaccin vivant Sterne préparé à l'Institut Pasteur.
Tous les groupes reçoivent une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 105 spores au 32 ième jour.
4.2. Résultats
Ils sont donnés dans le Tableau III ci-dessous. TABLEAU III
Figure imgf000012_0001
Ces résultats montrent clairement que les compositions vaccinales selon l'invention sont aussi efficaces que le vaccin vivant et pourraient par conséquent être avantageusement utilisées comme vaccin vétérinaire. EXEMPLE 5 : Analyse par immunoblot des protéines de spores de B. anthracis
5.1. Matériel et méthode
5.1.1. Préparation des anticorps polyclonaux et monoclonaux. Un sérum polyclonal de souris immunisées avec des spores tuées issues, par exemple, de là souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) est préparé selon des techniques classiques et connues de l'homme du métier. L'anticoφs monoclonal spécifique de la surface de la spore (35B8) est préparé selon la technique décrite par Kohler et a , (1975), Nature, 296, 495-497.
5.1.2. Extraction des spores
Les protéines de la spore sont solubilisées par traitement des spores avec un tampon Tris-HCl à pH 9,8 contenant 8 M d'urée et 2 % de SDS ou avec un tampon TrislO mM à pH 9,5 contenant 10 mM d'EDTA et 1 % de SDS, selon la technique décrite par Garcia-Patrone, (1995), Molecular and Cellular Biochem., 145,
29-37).
5.2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2. Le sérum polyclonal de souris reconnaît 3 espèces protéiques de poids moléculaire respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa et une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa. (Figure 1).
L'espèce la plus lourde est également reconnue par l'anticoφs monoclonal 35B8 et semble appartenir à l'exosporium (Figure 2 A). En effet l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium montre que les différents anticoφs monoclonaux utilisés, dont 35B8, reconnaissent une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa (Figure 2A).
Il ressort de ce qui précède que les compositions vaccinales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète aussi bien dans les conditions du vaccin humain que du vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 6 : Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention administrées selon le protocole n° 1 de l'Exemple 2, avec l'antigène PA seul, chez la souris ou chez le cobaye : épreuve avec la souche 9602. A. Souris Swiss
6.1. Traitement des animaux :
Le protocole d'injection pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections des compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4 dans l'exemple 1 sont réalisées à 15 jours d'intervalle (J0 et J15), et
- une injection d'épreuve est réalisée au 35 me jour avec le souche virulente 9602 (M. Berthier et al, Lancet, 1996, 347, 9004:828) isolée à partir d'un cas mortel de charbon humain et dont la virulence est dix fois supérieure à celle de la souche 17JB utilisée dans les exemples précédents ; ladite souche est injectée en sous- cutanée.
4 groupes d'animaux tels que définis à l'exemple 2 sont immunisés selon ce protocole.
Tous les groupes reçoivent au 35eme jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
6.2. Résultats
Les expériences ont été répétées 3 fois, avec des préparations différentes, sur des lots de 6 à 8 souris par point (pour raison de confinement P3). Les taux de survie sont illustrés dans le Tableau IV ci-après. TABLEAU IV
Figure imgf000013_0001
B. Cobayes.
Les expériences ont été réalisées 2 fois, sur des lots de 5 cobayes. Le protocole est similaire à celui utilisé chez la souris, à l'exception des points suivants : - les doses de PA sont de 40 μg par animal, - l'injection d'épreuve est réalisée par voie intramusculaire.
On obtient 100 % de survivants pour la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA, contre 40 % chez les animaux recevant PA seul, composition du vaccin classique.
6.3. Taux d'anticoφs. Ces expériences (souris et cobayes) ont été accompagnées du suivi de la réponse en anticoφs par ELISA sur des échantillons de sérum de souris et de cobayes. Les titres en anticoφs envers PA sont élevés (> 5000) ; une réponse du même ordre est détectée envers des antigènes spécifiques de la spore. EXEMPLE 7 : Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage vétérinaire telles que décrites à l'Exemple 4 (épreuve avec souche 9602).
Le test a été réalisé sur souris Swiss (dans les conditions décrites à l'Exemple 4). L'injection d'épreuve est réalisée avec la souche 9602 (M. Berthier et al., précité) chez des souris ayant reçu une seule injection, soit de spores vivantes (RPLC2), soit de la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA. L'efficacité de protection, de 83 %, est identique pour les deux lots.
Ces résultats montrent clairement qu'il est possible de protéger à 100 % des souris et des cobayes avec une combinaison vaccinale comportant des spores tuées et de l'antigène PA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à _5. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition immunogène acellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est apte à produire des anticoφs contre B. anthracis.
3. Composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
4. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une exotoxine détoxifiee choisie dans le groupe constitué par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés.
5. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce que les spores sont issues d'une souche de B. anthracis choisie dans le groupe cons- titué par les souches suivantes : Sterne 7702, RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
6. Composition immunogène ou composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'antigène protecteur est choisi dans le groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe quelle souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs recombinants.
7. Composition immunogène ou composition vaccinale selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'antigène protecteur est issu de la souche RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
8. Souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
9. Utilisation d'au moins un anticoφs dirigé contre les spores issues de souches obtenues, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOl et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
10. Préparations antigéniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues de spores de B. anthracis- et comprennent un ou plusieurs des exoantigenes de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
11. Anticoφs dirigés contre les préparations antigéniques selon la revendication 10.
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