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WO2001011351A1 - Method for detecting single nucleotide polymorphism (snp) and point mutation in gene, detection apparatus and detection chip - Google Patents

Method for detecting single nucleotide polymorphism (snp) and point mutation in gene, detection apparatus and detection chip Download PDF

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WO2001011351A1
WO2001011351A1 PCT/JP2000/005093 JP0005093W WO0111351A1 WO 2001011351 A1 WO2001011351 A1 WO 2001011351A1 JP 0005093 W JP0005093 W JP 0005093W WO 0111351 A1 WO0111351 A1 WO 0111351A1
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WO
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single nucleotide
gene
gold
point mutation
detection chip
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PCT/JP2000/005093
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Takatoshi Miyahara
Kazuhiko Uchida
Shigeori Takenaka
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Original Assignee
Individual
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    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the present invention relates to a single nucleotide substitution SNP (single-nucleotide 'polymorphism: a variant in human genetic code) such as gene expression and the like, which can detect and analyze point mutations.
  • SNP single nucleotide substitution SNP
  • the present invention relates to a method for detecting base substitution SNPs and point mutations, a detection device and a detection chip device.
  • a single nucleotide substitution SNP is a single nucleotide change in the nucleotide sequence of human DNA that is said to be one in 200 bp, and it is useful for both normal and sick people. Is thought to have hundreds of thousands to millions of SNPs, and is expected to be an effective marker for elucidation of pathogenesis and prevention.
  • Point mutations are single base changes in the base sequence of a known gene, which can result in abnormal function of the translated protein and can cause disease.
  • Means for detecting and analyzing differences in the base sequence of the gene DNA include DNA sequencing (base sequencing), PCR-SSCP (Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism), and phenol-specific methods.
  • DNA sequencing base sequencing
  • PCR-SSCP Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism
  • phenol-specific methods phenol-specific methods.
  • the z-digestion method, DNA chip method and the like are used.
  • DNA sequencing methods include the Maxam's Gilbert method and the Sanger (dideoxy) method, but currently the dideoxy method is mainly used.
  • the PCR method polymerase chain reaction
  • the sequence is amplified using the primers used in the PCR method or the primers set in the amplified DNA. Then, the gene sequence in this region is determined. Performing this operation using different sample DNAs will detect single nucleotide substitution SNPs and point mutations in the gene.
  • PCR—Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism (SSCP) method the region of the human gene to be analyzed is amplified by the PCR method, converted into a single strand by heat denaturation, and electrophoresed in a nondenaturing polyacrylamide gel.
  • a secondary structure is formed in each strand of the double-stranded DNA amplified by the PCR method. Since the secondary structure (intramolecular hydrogen bond) is different depending on the single nucleotide sequence, single nucleotide substitution SNPs and point mutations are detected based on the difference in electrophoretic distance.
  • a region to be analyzed is amplified by the pCR method, and a PCR product or an oligonucleotide probe of about 20 bases is created in a region of a membrane (nylon filter), and a radioisotope is formed there. It hybridizes sample DNA (DNA to be detected) labeled with the element 32 P or the like. By adjusting the hybridization conditions such as temperature at that time, the monobasic SNP of the gene and the point mutation are detected based on the difference in the intensity of the radioisotope.
  • the DNA chip method is basically the same as the allele-specific hybridization method, except that a PCR product or oligonucleotide probe of about 20 bases is arranged on the stationary phase (on the base), and fluorescent labeling is performed there.
  • the sample DNA (DNA to be detected) is hybridized.
  • the hybridization conditions such as temperature, single nucleotide substitution SNP and point mutation in the human gene are detected based on the difference in fluorescence intensity.
  • the problem is that since the DNA is labeled with a radioisotope, the handling and management of the radioisotope is very expensive.
  • the fluorescence intensity of the fluorescent-labeled probe is high because fluorescence is not incorporated into DNA frequently enough due to the large molecular structure of the fluorescent dye.
  • probe DNA is immobilized on the electrode as a simple and sensitive method for detecting DNA hybrid formation and double-stranded DNA.
  • a method is disclosed in which the probe DNA is reacted with a sample DNA in the presence of an intercalator to detect double-stranded DNA and to detect a hybrid-forming substance electrochemically.
  • An object of the present invention is to solve the conventional problems described above, and it is possible to detect and analyze a large amount of single nucleotide substitution SNPs and point mutations in a plurality of sample DNAs. That is, the present invention provides an apparatus for identifying single nucleotide substitution SNPs and point mutations that can process high throughput (high-speed large-volume) and that can detect and analyze with high sensitivity. In short, the present invention provides a method for detecting a double-stranded DNA and a hybrid-forming substance described in JP-A-9-188080 in a large amount based on the principle of electrochemically detecting the same. It is intended to be realized as a highly sensitive single nucleotide substitution SNP and point mutation detection / analysis device. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a sealed internal space capable of filling and removing sample DNA, a large number of gold electrodes serving as measurement electrodes formed on the bottom surface of the space,
  • a single-base substitution SNP of a gene and a point mutation detection chip comprising: a common electrode which is a counter electrode disposed so as not to contact the gold electrode in the section.
  • a chip for detecting a point mutation comprising: a common electrode which is a counter electrode disposed so as not to contact the gold electrode in the section.
  • the present invention provides a method for filling and removing a sample DNA to solve the above problems.
  • a closed internal space that can be removed, a large number of gold electrodes formed on the bottom surface of the space, a common electrode that is arranged so as not to contact the gold electrode in the space, and the common electrode A single-base substitution SNP and a point mutation detection device for a gene, comprising: a measurement device capable of detecting a current by applying a voltage between the gold electrodes, wherein the gold electrode comprises a different gene sequence.
  • a device for detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation characterized in that a PCR product or an oligonucleotide is fixed.
  • the internal space, the gold electrode and the common electrode may be formed so as to be included in a detection chip, and the detection chip may be detachably attached to the detection and measurement device and electrically connected thereto. Good.
  • the temperature of the detection chip may be changed by using a Peltier element to control the temperature condition of the hybridization.
  • the present invention fills a space with a sample DNA or a DNA gene-amplified from the sample DNA, performs hybridization, forms a double strand, Filling the space with an electrolyte containing electrochemically active molecules, controlling the temperature to bind the electrochemically active molecules to the double strand, and applying a voltage between the common electrode and the gold electrode
  • the present invention provides a method for detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation, which is characterized by detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation in a sample DNA by detecting a current value flowing through the sample.
  • FIG. 1 is a perspective view illustrating the overall configuration of an embodiment of a detection device for detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation according to the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view illustrating the overall configuration of an embodiment of a detection chip used for detecting single nucleotide substitution SNP and point mutation according to the present invention.
  • FIG. 3 is a perspective view illustrating a use state of the detection chip of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a configuration of a device for detecting single nucleotide substitution SNPs and point mutations of the gene according to the present invention and electrodes, wirings and the like of a detection chip.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a method for detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation of a gene according to the present invention, and an embodiment of a detection device and a detection chip.
  • the detection device 1 includes a detection chip 2 for hybridization, and a measurement device 3 that inserts the detection chip 2 to detect and analyze double-stranded DNA generated by hybridization. Consists of
  • the detection chip 2 is formed as a forcepable or cassette-like chip made of ceramics, synthetic resin, or the like, and is attached to the main body 4 and the main body 4 from above.
  • Upper cover 5 (shown by imaginary lines in the figure).
  • the detection chip 2 is formed of a material having resistance to acids and alkalis, and in particular, it is preferable that the upper cover 15 is transparent so that it can be observed from the outside.
  • a rectangular recess 6 is formed at a substantially center of the main body 4.
  • the recessed portion becomes a sealed space S.
  • gold spots are arranged in a matrix shape and deposited, and an array-like gold electrode 9 composed of a large number of gold electrodes 8 is formed. I have.
  • the enlarged view of the gold electrode 8 is shown on the right side of FIG. 2, and as shown in this enlarged view, a PCR product and a oligonucleotide are placed on the 5 ′ end of the oligonucleotide on the gold electrode 8.
  • SH-modified oligonucleotide 10 which has been converted to a SH group is fixed.
  • the PCR product is double-stranded DNA
  • this oligonucleotide having the thiolated 5 ′ end of one strand and the introduction of an SH group has a length containing 20 to 50 bases. It is fixed on the gold electrode 8 via a thiol group introduced at the base end.
  • a large number of terminal terminals 12 are juxtaposed at the tip 11 of the detection chip 2.
  • the gold electrodes 8 are respectively connected to the wirings 13, and the other ends of the wirings are extended so as to be connected to the respective terminal terminals 12.
  • the wiring to the gold electrode 9 is In response to this, one by one may be connected to each of the terminal terminals 12, but as shown in FIG. 4 (b), a number of vertical and As a grid-like wiring composed of horizontal conductors 14 and 15, a matrix wiring structure is used in which the gold electrodes 9 arranged in an array are connected to adjacent vertical and horizontal conductors, respectively. In this case, one ends of the vertical and horizontal conductors are connected to the terminal terminal 12.
  • a common electrode 16 as a counter electrode is arranged at a position on the bottom surface of the depression 6 where the gold electrode 9 is not in contact with the matrix-arranged gold electrodes 9.
  • the wiring of the common electrode 16 is formed by vapor deposition of gold similarly to the gold electrode.
  • the common electrode 16 is extended so as to be connected to the common electrode terminal 17. Furthermore, the current value between each gold electrode 9 and the common electrode 16 as a counter electrode is measured with reference to the value of the reference electrode 28 wired in contact with the space inside the recess 6, and is accurate for each measurement. It has a structure that can obtain a large current value.
  • Injection holes 18 and 19 on the left and right communicating with the dents 6 on both sides of the main body 4 of the detection chip 2 and on both sides of the upper cover 5 are formed, and are usually closed by a cap stopper to form a closed space S. With the cap removed, the disposable syringes 20 and 21 can be inserted into the injection holes 18 and 19, respectively. As a result, the solution can be injected into the sealed space S defined by the recess 6 and the upper cover 5, or the solution in the space S can be exchanged or mixed quickly.
  • the measuring device 3 has an insertion port 22 into which the detection chip 2 is inserted. As shown in Fig. 4 (c), the inside of the insertion slot 22 is connected to the common electrode terminal 17 and each gold electrode terminal 12, and the common electrode terminal 17 and each A circuit 23 for applying a voltage is provided between the gold electrode terminal terminals 12. When a voltage is applied between the common electrode terminal 17 and each gold electrode terminal 12, the current flowing between the common electrode 16 and each gold electrode 8 is applied to the circuit 23.
  • the detector 24 is provided so as to be able to detect and measure.
  • the measured data based on the detected current is digitized by the A / D converter 25 connected to the detector 24 and used by the personal computer 26 as processing data for sample analysis and identification. You. Furthermore, the measuring device 3 has a temperature core consisting of a Peltier element. Control device is provided.
  • the detection chip 2 is hermetically sealed with the upper cover of the main body 4. Then, as shown in FIG. 3, the syringes 20 and 21 are inserted into the injection holes 18 and 19, and the solution containing the sample DNA is injected.
  • sample DNA DNA extracted from a biological material, which is degraded by DNase or sonication, or DNA amplified from a specific gene by PCR (polymerase chain reaction) is used. These sample DNAs are denatured by heat treatment immediately before the hybridization.
  • sample DNA in the form of a strand
  • DNA of the oligonucleotide in the form of a strand
  • PCR products or oligonucleotides having complementary nucleotide sequences to each other are added.
  • the DNA and the sample DNA are subjected to hybridization.
  • the detection chip 2 is inserted into the insertion port 22 in the measuring device 3 and attached, and the temperature is controlled by the Peltier element provided in the measuring device 3 to meet the temperature condition of the high pre-division. Control.
  • the detection chip 2 is removed from the measuring device 3, the washing liquid is injected from one injection hole 18 with a syringe, and the liquid in the space S is injected from the other injection hole 19. Aspirate and wash off the unhybridized sample DNA by washing.
  • an electrolyte solution containing electrochemically active molecules is injected into the space S ⁇ from the injection holes 18 and 19 by a syringe.
  • the electrochemically active molecule has a function of changing electrical characteristics such as the resistance value of the double-stranded DNA by hybridization. This point is described in detail in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-128080.
  • the detection chip 2 that has been subjected to such processing is attached to the measuring device 3 again, and the common electrode terminal terminals 17 and the gold electrode terminal terminals 12 of the detection chip 2 are connected to the voltage circuit 23, and the common terminal is connected.
  • the weak voltage is applied between the electrode 16 and each gold electrode 8
  • the weak current is applied to the gold electrode 8 connected to the double-stranded DNA generated by the hybridization through the voltage circuit 23 and the common electrode 16.
  • Flows. Equipped in measuring device 3 The temperature is controlled by a Peltier element, and the current value at different temperatures is measured.
  • the measuring device 3 automatically switches the scanning terminals 27 for each of the gold electrode terminals 12 so that the double strands after the hybridization are sequentially turned on.
  • the p53 codon 72nd power ⁇ DNA collected from the peripheral blood of a normal human, which is Arg, and a PCR product that amplifies the region containing codon 72 present in exon 4 of p53 from this DNA was similarly subjected to a hybridization reaction.
  • dT20 Seven types of oligonucleotides, dT20, dT10dAdT9, dT8dA4dT8, dAdT19, dA3dT17, dT19dA, and dT17dA3, were immobilized by spotting on each gold electrode. To this, dA20 was subjected to a hybridization reaction.
  • the method for detecting a single nucleotide substitution SNP and a point mutation and the detection device and the detection chip according to the present invention are configured as described above. And point mutations can be detected and analyzed with high sensitivity.
  • the detection apparatus which can perform high-sensitivity, high-throughput (high-speed, large-volume) processing, is an effective means for analyzing correlations with genes and phenotypes in the fields of biology and medicine.
  • the present invention can also be used in the field of gene diagnosis. .
  • the detection device since the detection device according to the present invention is capable of high-sensitivity, high-throughput (high-speed, large-volume) processing, it collects data on Japanese single nucleotide substitution SNPs and point mutations, It can identify single nucleotide substitution SNPs and point mutations associated with, and can be used to prevent adult diseases such as cancer and hypertension.

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Description

明 細 書 遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出する方法、 並びに検出装置及び検 出チップ 技術分野
本発明は、 遺伝子の発現など、 遺伝子 DNAの一塩基置換 S NP (シングル - ヌク レオチ ド ' ポリモフイ ズム ： 人の遺伝コー ド中の変種） と点突然変異を検出 し解析可能とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出する方法、 並び に検出装置及び検出チップ装置に関する。 背景技術
一塩基置換 S N Pとは、 ヒ ト DNAの l O O O b p力、ら 2 0 00 b pに 1つあ ると言われている塩基配列の一塩基変化であり、 正常人、 病気の人問わず人には 数十万から数百万の S N Pがあると考えられており、 病因の解明、 予防に有効な マーカ一と期待されている。
点突然変異とは、 すでに既知である遺伝子における塩基配列の一塩基の変化で あり、 これにより翻訳されるタンパク質の機能異常がみられ、 疾患の原因になる 場合がある。
遺伝子 DN Aの塩基配列の違いを検出、 解析する手段としては、 DNAシ一ケ ンス法 （塩基配列決定法）、 P CR- S S C P (Polymerase chain reaction-si ngle stranded polymorphism)法、 ァ レノレ特異的 zヽィブリダィゼーシヨ ン法、 D N Aチップ法等が用いられている。
DNAシーケンス法は、 マキサム ' ギルバート法とサンガー （ダイデォキシ） 法があるが、 現在は主にダイデォキシ法が用いられている。 ヒ 卜の遺伝子の解析 したい領域を P C R法 （ポリ ミラ一ゼ連鎖反応法） で増幅したのち、 P CR法で 用いたプライマー若しくは増幅 DN A内に設定したプライマ一を用いてシ一ケン スを行い、 当領域内の遺伝子配列を決定する。 この操作を異なるサンプル D N A を用いて行うことで、 遺伝子の一塩基置換 S NPと点突然変異を検出する。 P C R— S S C P (Polymerase chain reaction-single stranded polymorphi sm)法はヒ 卜の遺伝子の解析したい領域を P C R法で増幅した後、 熱変性で一本 鎖にし、 これを非変性ポリアク リルアミ ドゲル中で電気泳動を行う ことで、 P C R法で増幅した 2本鎖 DNAのそれぞれの鎖に 2次構造 （分子内水素結合） を形 成させる。 一塩基配列の違いによってとる 2次構造 （分子内水素結合） がことな るため、 電気泳動距離の違いによって遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を 検出する。
ァレル特異的ハイブリダイゼーション法では、 解析したい領域を p C R法で增 幅した後、 メンブレン （ナイロンフィルター） の領域内に 2 0塩基程度の P C R 産物もしくはオリ ゴヌクレオチドプローブを作成し、 そこに放射性同位元素 3 2 Pなどで標識したサンプル D N A (被検出 DNA) をハイブリダィゼ一シヨンさ せるものである。 その際の温度等のハイブリダイゼーション条件を調節すること で、 遺伝子の一塩基性 S N Pと点突然変異を放射性同位元素の強度の差で検出す る。
DN Aチップ法は、 原理的にはァレル特異的ハイブリダイゼ一ショ ン法とほぼ 同じであるが、 20塩基程度の P C R産物もしくはオリゴヌク レオチドプロ一ブ を固定相 （基盤上） に並べ、 そこに蛍光標識したサンプル DNA (被検出 DNA) をハイプリダイゼ一ションさせるものである。 温度等のハイプリダイゼ一ション 条件を調節することで、 ヒ 卜の遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を蛍光強 度の差によって検出するものである。
ァレル特異的ハイブリダイゼーシヨン法におけるハイブリダィゼーションの場 合は、 DNAを放射性同位元素で標識するために、 放射性同位元素の取り扱いと 管理に多大な費用が有することが問題である。 又、 DN Aチップ法の場合は、 蛍 光色素で標識すると、 蛍光色素の大きな分子構造のために十分な頻度で蛍光が D N Aにと り こまれないために、 蛍光標識プローブの蛍光強度が高くないこと、 さ らに蛍光の退色及びガラス等の基盤の有する蛍光 （背景部分の蛍光） が問題にな る。
このような問題点を解決するために、 簡単で感度の優れた D N Aハイプリ ッ ド 形成の検出、 二本鎖 D N Aを検出する方法と して、 プローブ DNAを電極に固定 し、 このプロ一ブ D N Aを、 インタ一カ レータ存在下においてサンプル D N Aと 反応させて、 二本鎖 D N Aの検出、 ハイブリ ッ ド形成体の検出を電気化学的に行 う方法が開示されている （特開平 9一 2 8 8 0 8 0号公報及び第 5 7回分析化学 討論会予稿集、 P 1 3 7— 1 3 8 、 1 9 9 6年、 参照）。
しかしながら、 遺伝子の一塩基置換 S N Pや遺伝子の突然変異の数は莫大であ り、 例えばヒ トの場合 1 5 KBの密度 （解像度） の一塩基置換 S N P地図を作成す るためには、 すくなく とも 2 0 0万の一塩基置換 S N Pを同定しなければならな レ、。 又、 既知の疾患に関係する遺伝子の点突然変異の数もきわめて多い。 一塩基 置換や点突然変異を網羅的に解析することは従来の方法では現実的に不可能に近 レ、。
本発明は、 上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、 複数の サンプル D N Aを対象に、 大量の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出、 解析す ることが可能な、 すなわちハイスル一プッ ト （高速大量） の処理ができ、 しかも 高感度に検出と解析が可能な一塩基置換 S N Pと点突然変異の同定装置を提供す る。 要するに、 本発明は、 特開平 9一 2 8 8 0 8 0号公報に記載された二本鎖 D N Aの検出、 ハイブリ ッ ド形成体の検出を電気化学的に行う原理に基づいて、 大 量かつ高感度な一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出 ·解析装置と して実現しよ うとするものである。 発明の開示
本発明は、 上記課題を解決するために、 サンプル D N Aを充填及び除去可能と する密閉された内部空間部と、 該空間部の底面に形成された測定極である多数の 金電極と、 上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された対極で ある共通電極とを備えた、 遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チッ プであって、 上記金電極には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはォ リゴヌクレオチドが固定されており、 上記共通電極と上記金電極間に電圧が印加 され、 電流が検出されることが可能であることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップを提供する。
さらに、 本発明は、 上記課題を解決するために、 サンプル D N Aを充填及び除 去可能とする密閉された内部空間部と、 該空間部の底面に形成された多数の金電 極と、上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された共通電極と、 上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加し電流を検出可能とする測定装置とを 備えた遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置であって、 上記金電極 には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリ ゴヌク レオチドが固定 されていることを特徴とすることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突 然変異の検出装置を提供する。
上記内部空間、 上記金電極及び上記共通電極を検出チップ内に含まれるように 形成し、 上記検出チップを、 上記検出測定装置に着脱自在に装着し電気的に接続 できるような構成と してもよい。
上記検出チップの温度をペルチェ素子を用いて変化させ、 上記ハイプリダイゼ ーションの温度条件をコントロール可能と してもよい。
さらに、 本発明は、 上記課題を解決するために、 空間部内に、 サンプル D N A 又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N Aを充填し、 バイブリダイゼーシ ヨンを行わせて二本鎖を形成し、 その後、 上記空間部内に、 電気化学活性分子を 含む電解質を充填して、 温度をコントロールして上記二本鎖に電気化学活性分子 を結合させ、 そして、 上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加して流れる電流 値を検出することにより、 サンプル D N Aの一塩基置換 S N Pと点突然変異を検 出することを特徵とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出方法を提 供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出する検 出装置の実施例の全体構成を説明する斜視図である。
第 2図は、 本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出に利用 される検出チップの実施例の全体構成を説明する斜視図である。
第 3図は、 第 2図の検出チップの使用状態を説明する斜視図である。
第 4図は、 本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置及 び検出チップの電極、 配線等の構成を説明するための図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説述するために、 実施例に基づいて添付の図面を参照して 説明する。
本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出方法、 並びに検出 装置及び検出チップの実施の形態を第 1図において、 本発明に係る遺伝子の一塩 基置換 S N Pと点突然変異の検出装置 1は、 ハイブリダィゼーシヨン用の検出チ ップ 2と、 この検出チップ 2を差し込んで、 ハイブリダィゼーシヨンにより生じ る二本鎖 D N Aを検出し解析可能とする測定装置 3とから構成される。
第 2図において、 検出チップ 2は、 セラミ ックスや合成樹脂材等により、 力一 ドあるいはカセッ ト状のチップと して形成されており、 本体部 4と、 該本体部 4 に上方から装着される上部カバ一 5 (図中想像線で示される） とから構成される。 この検出チップ 2は、 酸及びアルカリに耐性を有する材料で形成されており、 特 に、 上部カバ一 5はする外部から観察できるように透明であることが好ましい。 本体部 4のほぼ中央には、 矩形の窪み 6が形成されている。 これにより、 本体 部 4に上部カバー 5を装着して一体とすると、 その窪みの部分が、 密閉された空 間部 Sとなる。 空間部 Sの底面、 即ち、 窪み 6の底面 7には、 金のスポッ トをマ トリ ツタス状に配列して蒸着し、 多数の金電極 8から構成されるァレー状金電極 9が形成されている。
第 2図の右側に金電極 8の拡大図を示しているが、 この拡大図で示されている ように、 金電極 8上には、 P C R産物、 オリ ゴヌク レオチ ドの 5 ' 末端にチォ一 ル化して S H基を導入した S H化オリ ゴヌク レオチ ド 1 0が固定されている。 P C R産物は二本鎖 D N Aであるが、 一方の鎖の 5 ' 末端をチオール化し、 S H基 を導入してあるこのオリ ゴヌクレオチドは、 2 0〜 5 0塩基含む長さを有し、 そ の基端に導入したチオール基を介して金電極 8上に固定されている。
検出チップ 2の先端部 1 1には、多数のターミナル端子 1 2が並設されている。 金電極 8は、 夫々配線 1 3に結合され、 該配線の他端は、 ターミナル端子 1 2の 夫々と結合するように伸設されている。
なお、 第 4図 （ a ) に示すように、 金電極 9に対する配線は、 金電極 8それぞ れに対応して一本づっ接続してそれぞれターミナル端子 1 2に接続してもよい が、 第 4図 （ b ) に示すように、 液晶表示装置等に利用されている、 多数の縦及 び横の導線 1 4、 1 5から成る格子状の配線と して、 アレー状に配置した金電極 9を夫々近接する縦及び横の導線に接続するマ ト リ ックス配線構造とする。 この 場合、 縦及び横の導線の一端がターミナル端子 1 2に接続されること となる。 本実施例では、 窪み 6の底面でマトリ ツクス状に配列してある金電極 9と接し ない位置に対極である共通電極 1 6が配列されている。 共通電極 1 6の配線は金 電極同様に金の蒸着によって形成される。 共通電極 1 6は、 共通電極用タ一ミナ ル端子 1 7に接続されるように伸設されている。 さらに、 それぞれの金電極 9と 対極である共通電極 1 6の間の電流値は、 窪み 6内の空間に接する形で配線され た参照電極 2 8の値を基準に測定され、 測定ごとに正確な電流値が得られる構造 となっている。
検出チップ 2の本体部 4の及び上部カバー 5の両側部に、 窪み 6に連通する左 右の注入孔 1 8、 1 9 (第 2図中の上方に示された要部拡大図参照。） が形成さ れており、通常はキャップ栓により閉鎖されており、密閉空間 Sを形成している。 キャップをはずし、 この注入孔 1 8、 1 9にデイスポーザルの注射器 2 0、 2 1 を揷入できる。 これにより、 窪み 6 と上部カバー 5により画成される密封された 空間部 S内へ溶液を注入したり、 あるいは空間部 S内の溶液の交換や混合を迅速 に行うことができる。
測定装置 3は、 検出チップ 2を差し込む挿入口 2 2を有している。 挿入口 2 2 の内部には、 第 4図 （ c ) で示すように、 共通電極用ターミナル端子 1 7及び各 金電極用ターミナル端子 1 2に接続して、 共通電極用ターミナル端子 1 7及び各 金電極用ターミナル端子 1 2間に電圧を印加する回路 2 3が配設されている。 そ して、 共通電極用ターミナル端子 1 7と各金電極用ターミナル端子 1 2間に電圧 が印加された際に、 共通電極 1 6 と各金電極 8の間に流れる電流を、 回路 2 3に 設けられた検出器 2 4で検出して測定できるように構成とされている。
この検出した電流に基づく測定データは、 検出器 2 4に接続する A— D変換器 2 5等でデジタル化され、 パソコン 2 6によりサンプルの解析、 同定等の処理デ —タと して利用される。 さらに、 測定装置 3には、 ペルチェ素子から成る温度コ ン トロール装置が装備されいる。
以上のよ うな構成から成る本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変 異の検出装置 1の作用について説明する。 検出チップ 2は、 本体部 4に上部カバ —がー体に結合され密閉されている。 そして、 第 3図に示すように、 注入孔 1 8 、 1 9に注射器 2 0 、 2 1を挿入してサンプル D N Aを含む溶液を注入する。
なお、 サンプル D N Aは、 生物材料から抽出した D N Aを、 D N A分解酵素も しくは超音波処理で分解したもの、 又は特定の遺伝子から P C R (ポリメラ一ゼ 連鎖反応法） によって増幅した D N Aを用いる。 これらのサンプル D N Aは、 ノヽ イブリダイゼ一ションの直前に熱処理によって変性しておく。
固定された P C R産物もしくはオリ ゴヌク レオチ ドの D N A (—本鎖の状態） にサンプル D N A (—本鎖の状態） が添加されると、 互いに相補的な塩基配列を 持つ P C R産物もしくはオリ ゴヌク レオチ ドの D N Aとサンプル D N Aは、 ハイ ブリダィゼ一シヨンが行われる。 この際、 検出チップ 2を測定装置 3内の挿入口 2 2に挿入して装着し、 測定装置 3内に装備されたペルチェ素子により、 温度を コン トロールし、 ハイプリ ダイゼ一ショ ンの温度条件にコン トロールする。
このハイプリダイゼ一ショ ンが行われた後、 検出チップ 2を測定装置 3から抜 いて、 一方の注入孔 1 8から注射器で洗浄液を注入し、 他方の注入孔 1 9から空 間部 S内の液を吸引して、 ハイブリダィゼ一シヨンしなかったサンプル D N Aを 洗い流して洗浄する。
このような洗浄を行った後に、 電気化学活性分子を含む電解質溶液を注射器に より注入孔 1 8 、 1 9から空間部 S內に注入する。 電気化学活性分子は、 ハイブ リダィゼ一シヨ ンにより二本鎖 D N Aの抵抗値等の電気的特性を変化させる機能 を奏する。 この点については、 特開平 9一 2 8 8 0 8 0号公報に詳細に説明され ている。
このよ うな処理を行った検出チップ 2を測定装置 3に再度装着し、 検出チップ 2の共通電極用ターミナル端子 1 7及び各金電極用ターミナル端子 1 2を電圧回 路 2 3に接続し、 共通電極 1 6と各金電極 8の間に弱い電圧をかけると、 ハイブ リダィゼーシヨ ンにより生じた二本鎖 D N Aと接続された金電極 8には、 電圧回 路 2 3及び共通電極 1 6を通して微弱電流が流れる。 測定装置 3内に装備された ペルチェ素子により温度をコントロールし、 異なる温度での電流値を測定する。 測定装置 3では、 第 4図 （ c ) に示すように、 各金電極用端子 1 2に対して走 查端子 2 7が自動的に切り替えられることにより、 順次ハイブリダイゼ一ション の後の二本鎖 D N Aに電流が流れて検出され、 この検出結果が、 A— D変換器等 によりデジタルデータに変換されて、 パソコンで測定データと してメモリ等に蓄 積される。 この測定データにより、 サンプル D N Aの同定や解析が行われる。 例 えば、 予め蓄積されている各種類の D N Aデータ等と比較することにより、 サン プル D N Aの解析や同定が可能となる。
次に本発明に係わる遺伝子の塩基置換、 点突然変異等の電気化学的検出装置の 実験例を説明する。
まず実験例 1について説明する。
遺伝子 p53の 72番目のコ ドンにおける一塩基置換 SNPの検出の実験例を示す。 以 下の 2種類のポリモルフィズム （遺伝的多型） に相当する塩基配列をもつオリゴ ヌクレオチドを金電極それぞれにスポッ トすることにより固定化した。
p53Pro (コ ドン 72番目力；ΡΓΟ)
p53Arg (コ ドン 72番目力； Arg)
これに p53のコ ドン 72番目力 S Proであるの正常人の末梢血から採取した DNA、 及 びこの DNAから p53のェキソン 4に存在するコ ドン 72を含む領域を増幅した PCR産 物を熱変性後ハイプリダイゼ一ション反応を行った。 測定電解質溶液と して 0. 1M AcOH-AcOK (pH5. 6) , 0. 1M KC 1 , 0. 05mM NFc中で 20度で 470 mV (Ag/AgCl参照電 極基準）のハイプリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。
末梢血から採取した DNA
p53Proの電流変化（％) 52%
P53Argの電流変化（％) 15 %
PCR産物
P53Proの電流変化（％) 65 %
p53Argの電流変化（％) 13 %
さらに p53のコ ドン 72番目力 ^ Argである正常人の末梢血から採取した DNA、 及び この DNAから p53のェキソン 4に存在するコ ドン 72を含む領域を増幅した PCR産物 を同様にハイプリダイゼ一ショ ン反応を行った。
末梢血から採取した DNA
p53Proの電流変化（％) 46 %
p53Argの電流変化（％) 17%
PCR産物
p53Proの電流変化（％) 53 %
p53Argの電流変化（％) 1 1 %
これらの電流変化は、 完全にマツチした塩基配列の場合と ミスマツチの場合で は明らかな差が認められた。
次に実験例 2について説明する。
塩基置換の数によって測定する電流値が異なり、 これにより ミスマッチの量が 測定できることを示した実験例を説明する。 dT20, dT10dAdT9, dT8dA4dT8, dAdT 19， dA3dT 17, dT 19dA, dT 17dA3の 7種のオリ ゴヌク レオチ ドを金電極それぞれに スポッ 卜することにより固定化した。 これに dA20をハイブリダイゼ一ション反応 を行った。
測定電解質溶液と して 0. 1 M AcOH-AcOK ( pH 5 . 6 )、 0. 1M KC 1 , 0. 05mM NFc 中、 2 0度で、 4 7 0 mV (Ag/AgCl参照電極基準）で、 ハイブリダィゼ一シヨ ン前 後の電流値変化を測定した。 この測定結果を表 1に示す。
(表 1 )
Figure imgf000011_0001
表 1における電流変化は、 ほぼミスマツチ塩基の量に依存した変化であった。 特に末端部にミスマッチが存在する場合は、 Tm値より大きな変化が見られた。 従 来の SSCPでは、 このような系は検出できなかったが本手法で初めて明らかとなつ た。 産業上の利用可能性
本発明に係る遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出する方法、 並びに 検出装置及び検出チップは、 以上のような構成であるから、 複数のサンプル D N Aを対象に、 大量の一塩基置換 S N Pと点突然変異を高感度でもって、 検出、 解 析することが可能になる。
このように、 高感度、 ハイスループッ ト （高速大量） の処理ができる本発明に 係る検出装置は、 生物学、 医学分野での遺伝子、 表現形質との相関の解析に有効 な手段である。 薬剤代謝酵素、 がん抑制遺伝子などの特定の遺伝子を、 本発明に 係る一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出 ·解析装置よつて、 解析することによ り、 遺伝子診断の分野にも利用できる。
例えば、 本発明に係る検出装置では、 高感度、 ハイスル一プッ ト （高速大量） の処理が可能であるから、 日本人の一塩基置換 S N Pと点突然変異のデータを収 集し、 病気の発症と関連する一塩基置換 S N Pと点突然変異を同定し、 がん、 高 血圧などの成人病の予防等に役立てることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . サンプル D N Aを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部と、 該空間部の底面に形成された測定極である多数の金電極と、
上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された対極である共通 電極とを備えた、 遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップであつ て、
上記金電極には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌク レ ォチドが固定されており、
上記共通電極と上記金電極間に電圧が印加され、 電流が検出されることが可能 であることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チッ プ。
2 . サンプル D N Aを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部と、 該空間部の底面に形成された測定極である多数の金電極と、
上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された対極である共通 電極と、
上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加し電流を検出可能とする測定装置と を備えた遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置であって、
上記金電極には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリ ゴヌクレ ォチドが固定されていることを特徴とすることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置。
3 . 上記内部空間、 上記金電極及び上記共通電極を検出チップ内に含まれるよう に形成し、 上記検出チップを、 上記検出測定装置に着脱自在に装着し電気的に接 続できるように構成されていることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の遺伝子 の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置。
4 . 上記検出チップの温度をペルチェ素子を用いて変化させ、 上記ハイブリダィ ゼ一シヨンの温度条件をコントロール可能と したことを特徴とする請求の範囲第 2又は 3項記載の遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置。
5 . 請求の範囲第 2 、 3又は 4項記載の空間部内に、 サンプル D N A又はサンプ ル D N Aから遺伝子増幅された D N Aを充填し、 ハイブリダイゼ一ションを行わ せて二本鎖鎖を形成し、
その後、 上記空間部内に、 電気化学活性分子を含む電解質を充填して、 温度を コントロールして上記二本鎖に電気化学活性分子を結合させ、
そして、 上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出す ることにより、 サンプル D N Aの一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出すること を特徵とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出方法。
捕正書の請求の範囲
[ 2 0 0 0年 1 2月 6日 （0 6 . 1 2 . 0 0 ) 国際事務局受理：出願当初の請 求の範囲 2及び 1 0は補正された；他の請求の範囲は変更なし。 （2頁）]
1 . サンプル D N Aを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部と、 該空間部の底面に形成された測定極である多数の金電極と、
上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された対極である共通 電極とを備えた、 遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップであつ て、
上記金電極には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレ ォチドが固定されており、
上記共通電極と上記金電極間に電圧が印加され、 電流が検出されることが可能 であることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チッ プ。
2 . (補正後） 多数の上記金電極が夫々配線に結合されており、 該配線は、 多数 の上記金電極それそれに対応して—本づっ接続しているか、 又は多数の縦及び横 の導線から成る格子状の配線として、 アレー状に配置した上記金電極を夫々近接 する縦及び横の導線に接続するマト リ ックス構造とされている、 請求の範囲第 1 項記載の検出用チップ。
3 . (補正後） 電流を検出可能とする測定装置に着脱自在に装着され、 電気的に 接続できるように構成されている、請求の範囲第 1又は 2項記載の検出用チップ。
4 . (補正後） カード又はカセッ ト状のチップである、 請求の範囲第 1 ~ 3の何 れか一項記載の検出用チッブ。
5 . (補正後） 本体部と、 該本体部に上方から装着される上部カバ一とからなる、 請求の範囲第 1 ~ 4の何れか一項記載の検出用チッブ。
6 . (補正後） サンプル D N Aを充填及び除去可能とする密閉された内部空間部 と、
該空間部の底面に形成された測定極である多数の金電極と、
上記空間部において上記金電極と接触しないように配置された対極である共通 電極と、
上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加し電流を検出可能とする測定装置と
-13- 補正された用紙 第 19条） を備えた遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置であって、 上記金電極には、 異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレ ォチドが固定されていることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変 異の検出装置。
7 . (補正後） 上記内部空間、 上記金電極及び上記共通電極を検出チップ内に含 まれるように形成し、 上記検出チップを、 上記検出測定装置に着脱自在に装着し 電気的に接続できるように構成されていることを特徴とする請求の範囲第 6項記 載の遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出装置。
8 . (補正後） 上記検出チップとして、 請求の範囲第 2〜 5の何れか一項記載の 検出用チップを使用する、 請求の範囲第 7項記載の検出装置。
9 . (補正後） 上記検出チップの温度をペルチェ素子を用いて変化させ、 上記ハ イブリダイゼ一ションの温度条件をコントロール可能としたことを特徴とする請 求の範囲第 6〜 8の何れか一項記載の遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の 検出装置。
1 0 . (補正後） 請求の範囲第 6 ~ 9の何れか一項記載の空間部内に、 サンプル D N A又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N Aを充填し、 ハイブリダィ ゼ一ションを行わせて二本量を形成し、
その後、 上記空間部内に、 電気化学活性分子を含む電解質を充填して、 温度を コントロールして上記二本鎖に電気化学活性分子を結合させ、
そして、 上記共通電極と上記金電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出す ることにより、 サンプル D N Aの一塩基置換 S N Pと点突然変異を検出すること を特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出方法。
- 14- 補正された用紙 (条約第 19条) 条約 1 9条 （ 1 ) に基づく説明書 請求の範囲第 2〜 5項は、 それそれ請求の範囲第 1項に係る本発明の 遺伝子の一塩基置換 S NPと点突然変異の検出用チップの構造を一層明 確にした。 弓 I用例は、 〔 1〕 Patrick N. Gilles et al. , Nature Biotechnology, 17(4) 365-370 (1999 April), 〔 2〕 特開平 1 0— 146 1 83号公報、 並びに 〔3〕 E P 2 273 98号公報及び特開平 7— 22729 9号公 報に記載の発明である。 本発明の検出用チップは、請求の範囲第 1項に記載の構成であるから、 複数のサンプル D N Aを対象に、 大量の一塩基置換 S NPと点突然変異 を高感度でもって、 検出、 解析することが可能になるという効果を得た ものである。 特に、 本発明の検出用チップは、 請求の範囲第 2〜5項に 記載の構成とすることにより、 上記効果を顕著に奏する。 請求の範囲第 6、 7、 9及び 1 0項は、 請求の範囲第 2 ~ 5項を新た に加入したことに伴い、 それそれ原請求の範囲第 2、 3、 4及び 5項の 項番号が繰り下がったもので、 発明の内容に変更はない。 また、 請求の 範囲第 6及び 10項においては、 記載の一部について誤記を訂正した。 また、請求の範囲第 8項は、請求の範囲第 7項に係る検出装置において、 請求の範囲第 2〜 5の何れか一項に係る検出用チップを使用することを 明確にした。
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