[go: up one dir, main page]

WO2001092322A1 - Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus - Google Patents

Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus Download PDF

Info

Publication number
WO2001092322A1
WO2001092322A1 PCT/FR2001/001629 FR0101629W WO0192322A1 WO 2001092322 A1 WO2001092322 A1 WO 2001092322A1 FR 0101629 W FR0101629 W FR 0101629W WO 0192322 A1 WO0192322 A1 WO 0192322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
cells
use according
aquatic
blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2001/001629
Other languages
English (en)
Inventor
Valérie ANDRE
Nabil Abdul Malak
Alain Huc
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Beauty Care Solutions France SAS
Original Assignee
Coletica SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/616,282 external-priority patent/US6541023B1/en
Application filed by Coletica SA filed Critical Coletica SA
Priority to KR20027015990A priority Critical patent/KR100646046B1/ko
Priority to DE10196235T priority patent/DE10196235B4/de
Priority to JP2002500933A priority patent/JP3747412B2/ja
Publication of WO2001092322A1 publication Critical patent/WO2001092322A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the invention essentially relates to the use of collagen of aquatic origin for the production of supports intended for tissue engineering, as well as such supports and biomaterials.
  • Collagen is a particularly favorable substrate for cell development. This is why this protein is widely used in several forms: matrices, gels, or films to produce reconstructed tissues comprising living cells.
  • matrices, gels, or films to produce reconstructed tissues comprising living cells.
  • collagen In the field of tissue engineering, a technique with a promising future, collagen has led in particular to the production of artificial skins or cartilages. To achieve a satisfactory result, collagen must be protected from enzymatic degradation originating from cell metabolism either by physical or chemical crosslinking processes or by the presence of natural macromolecules having strong interactions with the protein, or finally by a combination of the two. systems.
  • Document EP-0 753 313 A1 describes a skin substitute using marine organisms based on a laminate comprising a layer or sheet of chitin extracted from mollusk or squid.
  • the use of chitin is critical because when the chitin solution has been lyophilized, a chitin structure is obtained which constitutes an insoluble sponge which is not bio-degradable, the chitin not being degraded by the enzymes present in human skin.
  • a fish skin collagen gel can be poured over the layer or sheet of chitin, which is left to dry in the refrigerator for about a week. As a result, the collagen layer is dense and is not porous. It cannot therefore be seeded with living cells.
  • the laminate described in this document is an inert laminate and it is not intended that it can be seeded with living cells and keep the living character of these cells unlike the present invention described below.
  • human cells develop very well on or inside certain supports made of fish collagen, preferably crosslinked.
  • This marine collagen is preferably derived from the skin of fish of the teleost family, more particularly from fish having depigmented skin areas, even more particularly from flat fish, in particular those which are sinned industrially such as for example sole. , flounder, turbot, catfish and whose preparation of fillets involves butchering.
  • the more preferred flatfish is sole, from which it is easy to cut the ventral part of non-pigmented skin.
  • the inventors have been able to demonstrate that the human cells cultivated in these biomaterials maintain a normal metabolism.
  • the bio-compatibility which allows conservation and proliferation capacity of living human cells with collagen extracted from the skin of fish of the teleost family was particularly not obvious to a person skilled in the art, and even more so when collagen is crosslinked and in particular chemically crosslinked, because in general the crosslinking of the collagen makes or risks making the crosslinked collagen non-bio-compatible, toxic with regard to living cells and in particular living human cells.
  • biomaterials prepared according to the invention from fish collagen can be either films, or compressed sponges, or porous matrices which will be described as well as their methods of preparation in the examples given below.
  • the present invention aims to solve the new technical problem consisting in the supply of new supports intended for tissue engineering capable of forming new biomaterials, that is to say capable of allowing a good proliferation of living, normal cells. or changed genetically, or malignantly to be cultured on said support and to be used in the context of these new biomaterials containing said living cells, for subsequent proliferation in vitro or in vivo.
  • the present invention also aims to solve the new technical problem consisting in the supply of new supports intended for tissue engineering, at a low manufacturing cost and, moreover, at low risk of contamination, thus making them particularly suitable for provide new biomaterials.
  • the main object of the present invention is also to solve the new technical problem consisting in the supply of new supports intended for tissue engineering, particularly well adapted to allow the cellular multiplication of living cells, normal or genetically modified, or malignant, in vitro. or in vivo, and whose structure is sufficiently compatible with an in vivo use in a mammal, in particular an animal or better a human being, while being different from the constitution of the tissues of such a mammal, such as an animal , or better and preferably a human being, in order to subsequently allow a differentiation between the newly synthesized tissues, and the old tissues of said mammal, preferably a human being.
  • the present invention relates to the use of collagen of aquatic origin for the production of supports intended for tissue engineering.
  • collagen of aquatic origin means a collagen derived from tissues containing collagen of living beings of aquatic origin, these living beings are well known to those skilled in the art and include, for example, without limitation, aquatic mammals, especially marine mammals, jellyfish, and sea or freshwater fish. Those skilled in the art know, moreover, that these living beings have a skin which essentially contains collagen.
  • the "collagen of aquatic origin” is extracted from the skin of fish from the teleost family, more particularly from fish having depigmented skin areas, even more particularly from flat fish and in particular fish mentioned above, the most preferred flat fish being sole.
  • the collagen is obtained from the skin of fish, preferably in its native form.
  • collagen has its reinforced mechanical resistance where its resistance to enzymatic digestion increased either by chemical and / or physical crosslinking, or by the addition of a natural macromolecule having strong interactions with collagen, either by a combination of the two processes.
  • the collagen is used in the form of a porous matrix prepared from a collagen gel preferably subjected to a lyophilization step.
  • the aforementioned porous matrix is crosslinked by physical crosslinking, preferably by hydrothermal dehydration or DHT.
  • the above-mentioned porous matrix is crosslinked by chemical crosslinking, preferably with diphenylphosphorylazide or DPPA or with a carbodiimide and / or N-hydroxysuccinimide or with glutaraldehyde.
  • the above-mentioned collagen can be in the form of a porous matrix prepared from preferably native marine collagen, mixed with chitosan and optionally at least one glycosaminoglycan, preferably chondroitin sulfate.
  • the abovementioned collagen can be in the form of a porous matrix prepared from a collagen gel, said porous matrix being coated on at least one face with a membrane essentially compact collagen produced either by a collagen film prepared by drying, preferably in air or in a gaseous fluid, of a collagen gel, or by a very strongly compressed collagen sponge.
  • the aforementioned compression of the very strongly compressed collagen sponge is carried out at a minimum pressure equal to approximately 50 bars (approximately 50.10 5 Pascal (Pa)), preferably between 50 bars (50.10 5 Pa ) and 200 bars (200.10 5 Pa), this compression having possibly been carried out at a temperature between 20 ° C and 80 ° C, even better between 40 ° C and 60 ° C.
  • at least one of the two layers, respectively the porous layer and the essentially compact membrane comprises living cells, normal or genetically modified, or malignant, in particular from young or old subjects.
  • the living cells are chosen from the group consisting of fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, langerhan cells of blood origin, endothelial cells of blood origin, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, langerhan cells of blood origin, endotelial cells of blood, blood cells, adipocytes, sebocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, Merkel cells of blood origin, normal or genetically modified or malignant.
  • the porous layer contains normal, genetically modified or malignant fibroblasts
  • the essentially compact membrane contains normal or genetically modified or malignant living cells, in particular chosen from keratinocytes, melanocytes, cells of Merkel of blood origin, langerhans cells of blood origin, sebocytes, cells of blood origin, nerve cells.
  • the above-mentioned essentially compact membrane is prepared before combining with the porous layer, preferably comprising a collagen sponge, in particular by preparing the membrane and depositing it on a collagen gel before the the whole is frozen and freeze-dried.
  • the present invention also covers a support intended for tissue engineering, characterized in that it comprises collagen of aquatic origin as defined above or as it results from the following description taken as a whole , and integrating the examples which form an integral part of the present invention in their generality and with regard to any characteristic which appears to be new compared to a state of the art any technique, this characteristic being taken in its function and in its generality independently of the context of the example.
  • the present invention also covers a biomaterial, for example in the form of a reconstituted connective tissue, or of reconstituted skin, characterized in that it has been prepared from collagen of aquatic origin as previously defined in all these aspects and as it also results from the following description as for the support of the second aspect above.
  • supports intended for tissue engineering means a support which will be used to carry out the culture and the proliferation of living cells, normal or genetically modified, or malignant, whether either in vitro or in vivo, this proliferation preferably being applied in vivo to a mammal, comprising an animal, better still and preferably a human being. It is understood that the invention finds a particularly preferred use in the context of tissue engineering for the manufacture of biomaterials, for example in the form of reconstituted connective tissues or reconstituted skins.
  • a first step will generally be a culture of the support with said living cells in vitro to result in a biomaterial, for example in the form of a reconstituted connective tissue or of reconstituted skin, then, in a second step, the use of this biomaterial as reconstituted connective tissue or skin reconstituted in vivo on a mammal, for example animal and preferably and better still a human being, in order to reconstitute a connective tissue damaged or removed by surgery, or similarly for a skin reconstructed replacing a damaged or surgically removed area of skin for any medical reason.
  • a mammal for example animal and preferably and better still a human being
  • the support intended for tissue engineering or better still the biomaterial, which is for example in the form of a reconstituted connective tissue, or of reconstituted skins, comprises cells either obtained substantially exclusively from young subjects, or obtained substantially exclusively from elderly subjects, in particular to study the process of tissue aging and in particular skin aging and possibly test the effectiveness of active ingredients or principles on this process.
  • the invention makes it possible to solve on the whole new technical problems stated above in a particularly simple manner, at low cost, with low risk of contamination and with a differentiation capacity of aquatic collagen relative to collagen of the mammal, and preferably of the collagen of a human being, newly synthesized during use in vivo.
  • the raw material fish skin generally used can be obtained in abundance under very clean conditions.
  • fish collagen has an amino acid composition relatively distant from that of human collagen, the two proteins can be relatively easily differentiated by means of specific antibodies.
  • marine collagen will make the immunostaining very effective and allow the differentiation of marine collagen relative to the newly synthesized collagen.
  • Fish collagen has a native structure which protects it from enzymatic degradation due to proteases and which gives it a large part of its mechanical properties. It will therefore be very important during the extraction and purification operations that the treatments used alter the structure of the protein as little as possible. This means that the helical structure as well as the inter and intramolecular crosslinks are preserved as much as possible.
  • the protection of fish collagen will be all the more important as its natural stability is weaker than that of mammalian collagen. This last characteristic is due to a lower rate of hydroxyproline.
  • biomaterials previously described can be seeded with living cells and will thus give rise to living artificial tissues which can be used either in the field of "in vitro" tests or in the pharmaceutical field for repairing damaged tissue.
  • Other objects, characteristics and advantages of the invention will become clear in the light of the explanatory description which follows, given with reference to the embodiments of a form of collagen of aquatic origin which can be used in the context of the invention for the production of supports intended for tissue engineering, and thus constituting such supports as well as biomaterials, given simply by way of illustration and which therefore cannot in any way limit the scope of the invention.
  • Examples 1 to 13 naturally constitute examples of collagen preparation which can be used as a tissue engineering support according to the invention.
  • Examples 14 to 16 constitute in particular comparative tests, in the context of the use of this collagen of aquatic origin, in the forms prepared in some of Examples 1 to 13, in the context of the production of supports intended for tissue engineering.
  • FIG. 1 represents the proliferation of normal human fibroblasts in equivalent dermis, with the time expressed in days and on the abscissa and the optical density x 1000 on the ordinate with units increasing by 100;
  • the curve with the diamonds is that obtained using a porous matrix of aquatic collagen, in this case fish, as support, and the curve with squares is obtained with bovine collagen;
  • FIG. 2 represents a similar proliferation curve of fibroblasts in equivalent dermis with the time expressed in days on the abscissa and the fluorescence expressed in international units on the ordinate, starting at 15,000 with units increasing by 10,000; the curve with the solid diamonds represents the fluorescence obtained in the context of test 1; the curve with the square that obtained with test 2; the curve with the empty triangles being obtained with test 3 and finally the curve with the crosses being that obtained with test 4.
  • a collagen gel is prepared from ground ventral sole skins, then washed with a phosphate buffer pH 7.8, the composition of which is: 0.78 g / 1 of potassium dihydrogen phosphate and 21.7 g 1 of disodium monohydrogen phosphate.
  • the washing is carried out with stirring for one hour at a rate of 5 l of buffer for 1 kg of ground material.
  • the phosphate is then removed by two successive washes with deionized water, then by continuous centrifugation at 4000 rpm (Rousselet decanter), at the rate of 5 l of water per 1 kg of ground material.
  • the ground product is then acidified with a 0.25 M acetic acid solution at a rate of 1 kg of ground material for 10 1 of solution.
  • the gel is then centrifuged at
  • the gel which will be used consists of the supernatant obtained whose collagen concentration is between 0.5 and 2%.
  • This gel is poured into a lyophilization tray at a rate of 20 g / cm 2 . It is then lyophilized after freezing at -30 ° C and heating to + 32 ° C. The lyophilization lasts a total of 16 hours under a pressure of 400 microbars. The matrix obtained is then crosslinked by hydrothermal dehydration
  • Example 1 The collagen matrix of Example 1 is incubated for 24 h in a solution containing 5 to 250 ⁇ l of DPPA / g of collagen contained in. 100 ml of dimethylformamide (DMF). The collagen is then freed from DPPA by rinsing in 100 ml of DMF. The DMF is then eliminated by rinsing in 100 ml of a borate buffer solution pH 8.9 (sodium tetraborate
  • the collagen is finally incubated overnight in the same borate buffer. Finally, the borate buffer is removed by rinsing with continuous permuted water for 6 h.
  • the aquatic collagen matrix of Example 1 is crosslinked with EDC (Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) at the concentration of 0.23 to 0.69 g / g of collagen, and with NHS (N-hydroxysuccinimide) at the concentration of 0.42 g / g of collagen.
  • EDC Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the collagen After rinsing with deionized water, the collagen is again lyophilized.
  • the porous aquatic collagen matrix of Example 1 is crosslinked for 24 to 96 h in a solution containing 0.6 to 1% of GTA at 20 ° C. After rinsing with deionized water, the collagen is again lyophilized.
  • Porous matrix prepared with the native aquatic collagen of example 1 in combination with chitosan and a glycosaminoglycan as described in the European patent of May 29, 1991 N ° 296078 To 600 g of gel with 1.5% of collagen, are added 2.5 g of chitosan dissolved in 356 ml of water and 1.9 ml of acetic acid, then a solution containing 1 g of chondroitin 4 sulfate contained in 400 ml of deionized water. The mixture, the pH of which is approximately 4.0, is then stirred and then lyophilized. The sponge obtained is crosslinked by DHT.
  • Porous matrix described in Example 1 surfaced with a collagen film
  • Collagen gel has a dry matter is between 0.3 and '0.8% is dried in an oven at 30 ° C or under a hood at a rate of 0.5 g of gel / cm tray.
  • the collagen gel it is possible to add 10 to 40% glycerol.
  • the collagen dried under these conditions forms a transparent film.
  • the native aquatic collagen gel of 0.5% to 2% in dry matter is deposited at the rate of 0.5 g per cm 2 in a lyophilization tray, then the collagen film is deposited on this gel and the whole is lyophilized.
  • the lyophilisate obtained is crosslinked with DHT.
  • Porous matrix prepared with an acid-soluble collagen gel surfaced with a collagen film
  • Example 6 The process is that indicated in Example 6, the only difference being the nature of the gel cast on the film which is made of acid-soluble collagen prepared according to a technique well known to those skilled in the art.
  • Porous matrix prepared with an atelocoUagene gel or surfaced with a collagen film
  • Example 6 The process is that indicated in Example 6, the only difference being the nature of the gel cast on the film which is made atelocoUagen, that is to say collagen without telopeptide prepared according to a technique well known to those skilled in the art.
  • Porous matrix consisting of collagen associated with chitosan and a glycosaminoglycan surfaced with a collagen film.
  • Example 6 The process is that indicated in Example 6, but in this case the gel poured onto the collagen film consists of collagen, chitosan, a glycosaminoglycan. The preparation of this gel is described in Example 5.
  • porous matrices surfaced with a collagen film described above can be crosslinked according to the techniques described in Examples 2, 3 and 4.
  • Porous collagen alone matrix described in Example 1 surfaced with a compressed collagen sponge.
  • the collagen gel prepared as in Example 1 and having a dry matter of between 0.3 and 1.5% is lyophilized so as to obtain a sponge having a weight of between 0.5 and 2 g / cm 2 .
  • the lyophilisate is compressed for 5 to 60 seconds, at a temperature between 20 and 60 ° C and a pressure between 50 and 200 bars (50 to 200.10 5 Pa).
  • the collagen gel described in Example 1 is deposited at a rate of 0.5 g per
  • Porous matrix consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycan as described in Example 5 and surfaced with the compressed sponge.
  • the collagen, chitosan and glycosaminoglycan gel prepared according to the method of Example 5, is deposited at a rate of 0.5 g per cm in a freeze-drying tray, then the compressed sponge is deposited on this gel and the assembly is lyophilized. The lyophilisate is then crosslinked by DHT as described in Example 1.
  • bovine matrix a comparative porous matrix with collagen of bovine origin, known as bovine matrix, also crosslinked with DPPA, under the same conditions as those of Example 2.
  • bovine matrix collagen of bovine origin
  • DPPA DPPA
  • the culture of these aquatic and bovine matrices is carried out respectively in medium composed of DMEM / HAM F 12 in a 50/50 (v / v) ratio supplemented with 10% fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin, 25 ⁇ g / ml gentamycin, 1 ⁇ g / ml amphotericin B, 50 ⁇ g / ml vitamin C.
  • This culture is carried out for 1 month by changing the culture medium 3 times a week.
  • MTT that is to say 3- (4- (dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) is added to the culture medium.
  • Incubation is carried out for 2.5 hours at 37 ° C.
  • the optical density of the transformation product (formazan blue) is read at 550 nm after solubilization in DMSO.
  • the optical density obtained is proportional to the activity of the succinate dehydrogenases which are capable of carrying out the transformation of the light yellow tetrazolium MTT salt into blue crystals of formazan.
  • the aquatic matrix not only constitutes a support allowing the survival of normal human fibroblasts but also the cell proliferation of these normal human fibroblasts, while even constituting a much better culture support during first three weeks. It can therefore be concluded from these tests that the aquatic collagen is, surprisingly, particularly suitable for producing a tissue engineering support in particular for applications in vitro and even and especially in vivo to constitute biomaterials containing living cells and in particular and preferably living cells of human beings.
  • the assay is carried out by the Pierce microBCA method.
  • fibroblasts could be observed in matrices of bovine and aquatic origin. In both types of matrices, we note the presence of an abundant neosynthesized extracellular matrix.
  • the neosynthesized extracellular matrix can be differentiated by the periodic striation of the deposited collagen fibers compared to the collagen clusters forming the three-dimensional matrix of the starting sponge.
  • Various collagen supports or matrices are prepared by using various proportions of collagen in the collagen gel used to make the porous layer or matrix and optionally using a different crosslinking agent, as follows:
  • a porous matrix is produced in the form of a porous sponge from an aquatic collagen gel prepared from 1.3% by weight of aquatic collagen, which is frozen at -80 ° C. and that it is subjected to a standard lyophilization in accordance with Example 2 and which is then subjected to crosslinking with DPPA in a proportion of 250 ⁇ l / g of sponge in the dry state.
  • Test 2 For this test, a porous support is prepared in the form of an aquatic sponge from an aquatic collagen gel comprising 0.7% by weight of aquatic collagen, which is subjected to freezing at -80 ° C, then standard lyophilization and crosslinking with DPPA at 250 ⁇ l / g dry as in test 1.
  • a porous support comprising an aquatic collagen sponge obtained from an aquatic collagen gel comprising 1.1% by weight of aquatic collagen, which is subjected to freezing at -80 ° C., then to lyophilization standard and crosslinking with DPPA at 250 ⁇ l / g dry as in test 2, the difference residing in a proportion of 1.1% by weight of aquatic collagen.
  • the aquatic collagen is derived, as in Example 2, from the ventral sole skin. b) Culture of fibroblasts on these matrices
  • Example 14 Is used as in Example 14, normal human fibroblasts but which are taken at 8 th passage.
  • the culture medium is composed of DMEM / HAM F12 50/50 (v / v) added with 10% by weight of fetal calf serum, 100 IU 7 ml of penicillin, 25 ⁇ g / ml of gentamycin, 1 ⁇ g / ml of amphotericin B , 50 ⁇ g / ml of vitamin C.
  • the culture is carried out for 1 month by changing the medium 3 times a week.
  • 4 matrices are used in order to carry out an average for each type of test and to measure the mean standard deviation.
  • Alamar Blue is added at a rate of 2% by weight of a culture medium used, when it is desired to measure the cell viability on a sample taken from the culture medium.
  • the fluorescence is read, on the basis of an excitation at 530 nm and an emission at 590 nm).
  • the intensity of the fluorescence obtained is proportional to the metabolic activity of the cells.
  • the cell viability measurement is carried out on 10 samples after 1, 4 6, 11 17 days of culture. The results are expressed in the table or below.
  • Table 3 show the fibroblastic proliferation curves in equivalent dermis.
  • the solid diamond curve is that performed with test 1; the curve in full square is that carried out with test 2; the triangle curve is that carried out with test 3 and the curve with the crosses is that carried out with test 4.
  • the different matrices prepared can allow good fibroblastic growth after 17 days of culture.
  • the fibroblasts adhere well to their three-dimensional support and divide very quickly in order to colonize the matrix.
  • the proliferation profile is very slightly variable from one type of matrix to another, but after 17 days of culture, the fibroblastic density is comparable regardless of the manufacturing process.
  • This test is similar to that of Example 14, except that a histology with immunostaining is carried out.
  • Example 14 These are equivalent dermes from Example 14, the culture being carried out under the conditions of Example 14.
  • This culture is therefore carried out for three weeks by changing the medium three times a week, the seeding of normal human fibroblasts having taken place at 300,000 cells per cm 2 as was indicated in Example 14.
  • the fixation is carried out with paraformaldehyde at a content of 4% by weight, then a dehydration and a paraffin inclusion are carried out.
  • Tissue Tek OCT compound is carried out, that is to say an inclusion liquid supplied by Miles, Elkhart, Indiana, USA, and a cold cut at 7 ⁇ m.
  • Immunostaining is performed as follows: i. With a first rabbit human anti-collagen type I antibody (dilution 1/40) ii. A second anti-rabbit antibody FITC (Fluorescein Iso ThioCyanate) (dilution 1/160)
  • the supports constituted respectively by an aquatic matrix and a bovine matrix form more or less loose pores in which the fibroblasts adhere.
  • On the surface there is a higher proportion of fibroblasts forming a favorable surface treatment of the equivalent dermis for producing reconstructed skin.
  • the distribution of fibroblasts is homogeneous in aquatic and bovine sponges.
  • the matrix of aquatic origin is only very weakly marked by the human anti-collagen antibody.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire. Le collagène étant avantageusement obtenu à partir de la peau de poisson, de préférence sous sa forme native. L'invention conduit à la production de nouveaux supports d'ingénierie tissulaire à faible risque de contamination.

Description

Utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire, et supports et biomatériaux obtenus.
L'invention concerne essentiellement l'utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire, ainsi que de tels supports et des biomatériaux.
Le collagène constitue un substrat particulièrement favorable pour le développement cellulaire. C'est pourquoi, cette protéine est très utilisée sous plusieurs formes : matrices, gels, ou films pour réaliser des tissus reconstruits comportant des cellules vivantes. Dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, technique promise à un grand avenir, le collagène a conduit en particulier à la réalisation de peaux ou de cartilages artificiels. Pour parvenir à un résultat satisfaisant, le collagène doit être protégé de la dégradation enzymatique provenant du métabolisme cellulaire soit par des procédés de réticulation physiques ou chimiques soit par la présence de macromolécules naturelles ayant de fortes interactions avec la protéine soit enfin par une combinaison des deux systèmes.
Jusqu'à maintenant, pour ces applications d'ingénierie tissulaire, le collagène utilisé dans les supports destinés à recevoir les cellules était extrait de mammifères et le plus souvent de la peau de bovin. Le choix de cette source était dû aux bonnes propriétés mécaniques de la protéine obtenue après extraction, à sa résistance à la dégradation enzymatique et enfin à sa composition en acides aminés très proche de celle du collagène humain. Pour toutes ces raisons, il était légitime de penser que ce collagène était le seul qui pouvait convenir à la culture de cellules humaines. L'article de Yeh et al dans Faseb Journal, Vol. 14, N°4, du 15 mars
2000 intitulé "a novel native matrix for tissue engineering. Analysis of cell-matrix interaction." Invoque l'emploi de matrice de collagène acellulaire de requin baleine pour l'étude de son interaction avec des kératinocytes et des fïbroblastes de peau humaine afin d'étudier la bio-compatibilité. L'abrégé Derwent XP 002161598 fait référence a une demande de brevet japonais JP 07/075566 de Marino Forum publié le 20 mars 1995 relative à une méthode utilisant du collagène dérivé de poisson comme base de culture. Cependant, cette culture concerne des cellules de poisson.
Le document EP-0 753 313 Al décrit un substitut de peau utilisant des organismes marins à base d'un laminé comprenant une couche ou feuille de chitine extrait de mollusque ou de calamar. Ici, l'emploi de chitine est critique car lorsque la solution de chitine a été lyophilisée, on obtient une structure de chitine qui constitue une éponge insoluble non bio-dégradable, la chitine n'étant pas dégradée par les enzymes présentes dans la peau humaine. Un gel de collagène de peau de poisson peut être versé sur la couche ou feuille de chitine, que l'on laisse sécher au réfrigérateur pendant environ une semaine. De ce fait, la couche de collagène est dense et n'est pas poreuse. Elle ne peut donc pas être ensemencée de cellules vivantes. Le laminé décrit dans ce document est un laminé inerte et.il n'est pas prévu qu'il puisse être ensemencé de cellules vivantes et garder le caractère vivant de ces cellules contrairement à la présente invention décrite ci-après. Or les inventeurs se sont aperçus de façon inattendue que lés cellules humaines se développaient très bien sur ou à l'intérieur de certains supports constitués de collagène de poisson, de préférence réticulé. Ce collagène marin est de préférence issu de la peau de poisson de la famille des téléostéens, plus particulièrement des poissons présentant des zones de peau dépigmentées, encore plus particulièrement des poissons plats, en particulier ceux qui sont péchés de façon industrielle comme par exemple la sole, la limande, le turbot, le barbue et dont la préparation des filets implique un dépeçage. Le poisson plat davantage préféré est la sole dont il est aisé de découper la partie ventrale de peau non pigmentée. De plus, les inventeurs ont pu mettre en évidence que les cellules humaines cultivées dans ces biomatériaux conservaient un métabolisme normal. La bio-compatibilité qui permet une conservation et une capacité de prolifération des cellules humaines vivantes avec du collagène extrait de la peau de poisson de la famille des téléostéens était particulièrement non évidente pour un homme de l'art et cela encore plus, lorsque le collagène est réticulé et notamment réticulé chimiquement, car en général la réticulation du collagène rend ou risque de rendre le collagène réticulé non bio-compatible, toxique vis à vis de cellules vivantes et en particulier de cellules humaines vivantes.
Ces biomatériaux préparés selon l'invention à partir de collagène de poisson peuvent être soit des films, soit des éponges comprimées, soit des matrices poreuses qui seront décrits ainsi que leurs modes de préparation dans les exemples donnés ci-dessous.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire apte à former de nouveaux biomatériaux, c'est-à-dire apte à permettre une bonne prolifération des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes à cultiver sur ledit support et à utiliser dans le cadre de ces nouveaux biomatériaux contenant lesdites cellules vivantes, pour une prolifération ultérieure in vitro ou in vivo.
La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire, à un faible coût de fabrication et, en outre, à faible risque de contamination, les rendant ainsi particulièrement aptes à fournir de nouveaux biomatériaux.
La présente invention a encore pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de nouveaux supports destinés à l'ingénierie tissulaire, particulièrement bien adaptés à permettre la multiplication cellulaire de cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, in vitro ou in vivo, et dont la structure est suffisamment compatible avec une utilisation in vivo chez un mammifère, en particulier un animal ou mieux un être humain, tout en étant différent de la constitution des tissus d'un tel mammifère, tel qu'un animal, ou mieux et de préférence un être humain, afin de permettre ultérieurement une différenciation entre les tissus nouvellement synthétisés, et les tissus anciens dudit mammifère, de préférence un être humain. L'ensemble de ces problèmes techniques est résolu pour la première fois avec la présente invention d'une manière satisfaisante, à faible coût, à faible risque de contamination ou sans contamination, tout en permettant une mise en évidence aisée des tissus nouvellement synthétisés, ce qui est particulièrement non évidente et inattendu pour un homme de l'art. Ainsi, la présente invention, selon un premier aspect, concerne l'utilisation de collagène d'origine aquatique pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire.
Par l'expression "collagène d'origine aquatique" on entend un collagène issu de tissus contenant du collagène d'êtres vivants d'origine aquatique, ces êtres vivants sont bien connus à l'homme de l'art et comprennent par exemple, sans limitation, les mammifères aquatiques, en particulier les mammifères marins, les méduses et les poissons de mer ou d'eaux douces. L'homme de l'art sait, par ailleurs, que ces êtres vivants ont une peau qui contient essentiellement le collagène. De préférence, le "collagène d'origine aquatique" est extrait de la peau de poisson de la famille des téléostéens, plus particulièrement des poissons présentant des zones de peau dépigmentées, encore plus particulièrement des poissons plats et en particulier des poissons cités précédemment, le poisson plat le plus préféré étant la sole.
Selon un mode de réalisation avantageux, le collagène est obtenu à partir de la peau de poisson, de préférence sous sa forme native. Selon encore un mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagène a sa résistance mécanique renforcée où sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par une réticulation chimique et/ou physique, soit par adjonction d'une macromolécule naturelle ayant de fortes interactions avec le collagène, soit par une combinaison des deux procédés. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagène est utilisé sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène soumis de préférence à une étape de lyophilisation.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation physique, de préférence par déshydratation hydrothermique ou DHT.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation chimique, de préférence au diphénylphosphorylazide ou DPPA ou par un carbodiimide et/ou le N- hydroxysuccinimide ou par le glutaraldéhyde. Selon un mode de réalisation avantageux, le collagène précité peut se présenter sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir de collagène marin de préférence natif, mélangé avec chitosane et éventuellement au moins un glycosaminoglycanne de préférence le chondroïtine sulfate.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le collagène précité peut se présenter sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène, ladite matrice poreuse étant revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée.
Selon une variante de réalisation également avantageuse, la compression précitée de l'éponge collagénique très fortement comprimée est réalisée à une pression minimum égale à environ 50 bars (environ 50.105 Pascal (Pa)), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), cette compression ayant éventuellement été réalisée à une température comprise entre 20°C et 80°C, encore mieux entre 40°C et 60°C. Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention, au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés. Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endotéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, adipocytes, sébocytes, des chondrocytes, des cellules osseuses, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales ou génétiquement modifiées ou malignes.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la couche poreuse contient des fibroblastes normaux, génétiquement modifiés ou malins, et la membrane essentiellement compacte contient des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, il peut être particulièrement intéressant de préparer soit des peaux reconstruites "jeunes" en utilisant des cellules prélevées sur des sujets jeunes, soit des peaux reconstruites "âgées" obtenues à partir de cellules prélevées sur des sujets âgés. Grâce à ces modèles, il sera possible d'améliorer les connaissances sur le processus du vieillissement cutané et d'étudier l'influence d'actifs sur ce processus.
Selon encore un mode de réalisation particulièrement avantageux, la membrane essentiellement compacte précitée est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant la membrane et en la déposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé.
Selon un deuxième aspect, la présente invention couvre aussi un support destiné à l'ingénierie tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend du collagène d'origine aquatique tel que défini précédemment ou tel qu'il résulte de la description suivante prise dans son ensemble, et intégrant les exemples qui font partie intégrante de la présente invention dans leur généralité et pour ce qui concerne toute caractéristique qui apparaît être nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque, cette caractéristique étant prise dans sa fonction et dans sa généralité indépendamment du contexte de l'exemple.
Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi un biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il a été préparé à partir du collagène d'origine aquatique tel que précédemment défini dans tous ces aspects et tel qu'il résulte aussi de la description suivante comme pour le support du deuxième aspect ci-dessus.
Dans le cadre de la présente description et des revendications, l'expression "supports destinés à l'ingénierie tissulaire" signifie un support qui sera utilisé pour réaliser la culture et la prolifération de cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, que ce soit in vitro ou in vivo, cette prolifération étant de préférence appliquée in vivo sur un mammifère, comprenant un animal, mieux et de préférence un être humain. On comprend que l'invention trouve une utilisation particulièrement préférée dans le cadre de l'ingénierie tissulaire pour la fabrication de biomatériaux, par exemple sous la forme de tissus conjonctifs reconstitués ou de peaux reconstituées. Dans ce cadre, une première étape sera généralement une culture du support avec lesdites cellules vivantes in vitro pour aboutir à un biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué ou de peau reconstituée, puis, dans une deuxième étape, l'utilisation de ce biomatériau en tant que tissu conjonctif reconstitué ou de peau reconstituée in vivo sur un mammifère, par exemple animal et de préférence et mieux un être humain, afin de reconstituer un tissu conjonctif endommagé ou supprimé par chirurgie, ou de même pour une peau reconstituée remplaçant une zone de peau endommagée ou éliminée par voie chirurgicale pour une raison médicale quelconque.
Avantageusement, le support destiné à l'ingénierie tissulaire, ou mieux le biomatériau, qui se présente par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peaux reconstituées, comprend des cellules soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets jeunes, soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets âgés, en particulier pour étudier le processus du vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité d'ingrédients ou principes actifs sur ce processus.
On comprend ainsi que l'invention permet de résoudre dans l'ensemble de nouveaux problèmes techniques énoncés précédemment d'une manière particulièrement simple, à faible coût, à faible risque de contamination et avec une capacité de différenciation du collagène aquatique relativement au collagène du mammifère, et de préférence du collagène d'un être humain, nouvellement synthétisé lors de l'utilisation in vivo.
En effet, la mise en œuvre de collagène de poisson dans la réalisation de tissus artificiels vivants apporte trois avantages essentiels par rapport à la source mammifère :
. La peau de poisson matière première généralement utilisée, peut être obtenue en abondance dans des conditions de grande propreté.
. Le danger de contamination infectieuse est très faible. En particulier le risque de transmission d'agents de type prion est inconnu à ce jour.
. Enfin, le collagène de poisson ayant une composition en acides aminés relativement éloignée de celle du collagène humain les deux protéines peuvent être différenciées de façon relativement aisée grâce à des anticorps spécifiques.
Cette méthodologie sera très précieuse en particulier dans les tests « in vitro » ou dans les études de cicatrisation « in vivo ».
En outre, l'emploi de collagène marin va rendre l'immunomarquage très efficace et permettre la différenciation du collagène marin relativement au collagène nouvellement synthétisé.
Le collagène de poisson a une structure native qui le protège de la dégradation enzymatique due aux protéases et qui lui confère une grande partie de ses propriétés mécaniques. Il sera donc très important lors des opérations de l'extraction et de la purification que les traitements utilisés altèrent le moins possible la structure de la protéine. Cela signifie que la structure hélicoïdale ainsi que les réticulations inter et intramoléculaires soient le plus possible préservées.
Pour cela, les inventeurs ont plus particulièrement mis en œuvre le procédé décrit dans le brevet US N° 5331092 délivré le 19 juillet 1994. Néanmoins, pour des applications particulières, l'emploi de collagène partiellement déréticulé pourra être envisagé, par exemple de l'atélocollagène, c'est-à-dire du collagène ayant perdu une partie de ses télopeptides.
Ensuite, pour la plupart des applications d'ingénierie tissulaire les propriétés mécaniques du collagène seront renforcées et sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par des techniques de réticulation chimiques et/ou physiques, soit par adjonction de macromolécules naturelles ayant de fortes interactions avec la protéine soit enfin par une combinaison des deux procédés.
La protection du collagène de poisson sera d'autant plus importante que sa stabilité naturelle est plus faible que celle du collagène de mammifère. Cette dernière caractéristique est due à un taux plus faible d'hydroxyproline.
Les biomateriaux précédemment décrits pourront être ensemencés avec des cellules vivantes et donneront ainsi naissance à des tissus artificiels vivants qui pourront être utilisés soit dans le domaine des tests « in vitro »soit dans le domaine pharmaceutique pour la réparation des tissus lésés. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence aux exemples de réalisation de forme de collagène d'origine aquatique pouvant être utilisé dans le cadre de l'invention pour la réalisation des supports destinés à l'ingénierie tissulaire, et constituant ainsi de tels supports ainsi que des biomatériaux, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Dans les exemples, la température est donnée en degré Celsius, la pression est la pression atmosphérique, et les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire. Les exemples 1 à 13 constituent bien entendu des exemples de préparation de collagène utilisable comme support d'ingénierie tissulaire selon l'invention.
Les exemples 14 à 16 constituent des essais notamment comparatifs, dans le cadre de l'utilisation de ce collagène d'origine aquatique, sous les formes préparées dans certains des exemples 1 à 13, dans le cadre de la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire. Dans les figures annexées :
- la figure 1 représente la prolifération des fibroblastes humains normaux en derme équivalent, avec le temps exprimé en jour et en abscisse et la densité optique x 1000 en ordonnées avec des unités augmentant de 100 ; la courbe avec les losanges est celle qui est obtenue en utilisant comme support une matrice poreuse de collagène aquatique, ici de poissons, et la courbe avec des carrés est obtenue avec du collagène bovin ; et
- la figure 2 représente une courbe de prolifération similaire de fibroblastes en derme équivalent avec en abscisse le temps exprimé en jour et en ordonnées la fluorescence exprimée en unité internationale, commençant à 15.000 avec des unités augmentant de 10.000 ; la courbe avec les losanges pleins représente la fluorescence obtenue dans le cadre de l'essai 1 ; la courbe avec le carré celle obtenue avec l'essai 2 ; la courbe avec les triangles vides étant obtenue avec l'essai 3 et enfin la courbe avec les croix étant celle obtenue avec l'essai 4.
EXEMPLE 1
Préparation d'une matrice poreuse en collagène natif aquatique
Le collagène étant obtenu selon la technique du brevet US 5331092 accordé le 19 juillet 1994 A - Obtention du collagène natif aquatique
Un gel de collagène est préparé à partir de peaux ventrales de sole broyées puis lavées avec un tampon phosphate pH 7.8 dont la composition est : 0.78 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium et 21.7 g 1 de monohydrogénophosphate disodique. Le lavage s'effectue sous agitation pendant une heure à raison de 5 1 de tampon pour 1 kg de broyât. Le phosphate est ensuite éliminé par deux lavages successifs à l'eau permutée, puis par une centrifugation en continu à 4000 t/mn (décanteur Rousselet), à raison de 5 1 d'eau pour 1 kg de broyât. Le broyât est alors acidifié par une solution d'acide acétique 0.25 M à raison de 1 kg de broyât pour 10 1 de solution. Le gel est alors centrifugé à
4000 t/mn pendant 5mn.
Le gel qui sera utilisé est constitué par le surnageant obtenu dont la concentration en collagène est comprise entre 0.5 et 2 %.
B - Préparation de la matrice poreuse à partir du gel de collagène obtenu précédemment
Ce gel est coulé dans un plateau de lyophilisation à raison de 20 g/cm2. Il est alors lyophilisé après congélation à -30° C et chauffage à + 32° C. La lyophilisation dure au total 16 heures sous une pression de 400 microbars. La matrice obtenue est alors réticulée par déshydratation hydrothermique
(DHT). Celle-ci consiste en un chauffage dans une étuve à 110° C sous un vide de 400 microbars pendant 16 heures. EXEMPLE 2
Préparation d'une matrice poreuse réticulée grâce au diphenylphosphorylazide (DPPA) selon la technique décrite dans le brevet européen N° 466 829 du 24 juillet 1996
La matrice de collagène de l'exemple 1 est incubée 24 h dans une solution renfermant 5 à 250 μl de DPPA/g de collagène contenu dans. 100 ml de diméthylformamide (DMF). Le collagène est ensuite débarrassé du DPPA par rinçage dans 100 ml de DMF. Le DMF est ensuite éliminé par rinçage dans 100 ml d'une solution de tampon borate pH 8.9 (tétraborate de sodium
0.04 M, acide borique 0.04 M).
Le collagène est finalement incubé pour une nuit dans le même tampon borate. Enfin le tampon borate est éliminé par rinçage à l'eau permutée en continu pendant 6 h.
EXEMPLE 3
Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le carbodiimide et le N- hydroxysuccinimide
La matrice de collagène aquatique de l'exemple 1 est réticulée avec de l'EDC (Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) à la concentration de 0.23 à 0.69 g/g de collagène, et avec du NHS (N-hydroxysuccinimide) à la concentration de 0.42 g/g de collagène.
Après rinçage à l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé.
EXEMPLE 4
Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le glutaraldéhyde
La matrice poreuse de collagène aquatique de l'exemple 1 est réticulée pendant 24 à 96 h dans une solution contenant 0.6 à 1 % de GTA à 20°C. Après rinçage avec l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé.
EXEMPLE 5
Matrice poreuse préparée avec le collagène natif aquatique de l'exemple 1 en association avec du chitosane et un glycosaminoglycanne comme décrit dans le brevet européen du 29 mai 1991 N° 296078 A 600 g de gel à 1.5 % de collagène, sont ajoutés 2.5 g de chitosane dissous dans 356 ml d'eau et 1.9 ml d'acide acétique, puis une solution renfermant 1 g de chondroïtine 4 sulfate contenu dans 400 ml d'eau permutée. Le mélange dont le pH est d'environ 4.0 est ensuite agité puis lyophilisé. L'éponge obtenue est réticulée par DHT.
EXEMPLE 6
Matrice poreuse décrite dans l'exemple 1 surfacée avec un film de collagène
A - Préparation du film
Le gel de collagène dont la matière sèche est comprise entre 0.3 et'0.8 % est séché dans une étuve à 30° C ou sous hotte à raison de 0.5 g de gel/cm de plateau.
Dans le gel de collagène il est possible d'ajouter de 10 à 40 % de glycérol. Le collagène séché dans ces conditions forme un film transparent.
B - Association du film avec la matrice poreuse décrite plus haut
Le gel de collagène aquatique natif de 0.5% à 2% en matière sèche, est déposé à raison de 0.5g par cm2 dans un plateau de lyophilisation, puis le film de collagène est déposé sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé.
Le lyophilisât obtenu est réticulé par DHT.
EXEMPLE 7
Matrice poreuse préparée avec un gel de collagène acido-soluble surfacée avec un film de collagène
Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué de collagène acido-soluble préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art.
EXEMPLE 8
Matrice poreuse préparée avec un gel d'atélocoUagène ou surfacée avec un film de collagène
Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué d'atélocoUagène c'est-à-dire de collagène sans télopeptide préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art.
EXEMPLE 9
Matrice poreuse constituée de collagène associé avec du chitosane et un glycosaminoglycanne surfacée avec un film de collagène.
Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, mais dans ce cas le gel coulé sur le film du collagène est constitué de collagène, de chitosane, d'un glycosaminoglycanne. La préparation de ce gel est décrite dans l'exemple 5.
EXEMPLE 10
Toutes les matrices poreuses surfacées avec un film de collagène décrites précédemment peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 2, 3 et 4.
EXEMPLE 11
Matrice poreuse en collagène seul décrite dans l'exemple 1 surfacée avec une éponge de collagène comprimée.
A - Préparation de l'éponge comprimée
Le gel de collagène préparé comme dans l'exemple 1 et ayant une matière sèche comprise entre 0.3 et 1.5 % est lyophilisé de façon à obtenir une éponge ayant un poids compris entre 0.5 et 2 g/cm2. Le lyophilisât est comprimé pendant 5 à 60 secondes, à une température comprise entre 20 et 60° C et une pression située entre 50 et 200 bars (50 à 200.105 Pa).
B - Association de l'éponge comprimée avec la matrice poreuse
Le gel de collagène décrit dans l'exemple 1 est déposé à raison de 0.5 g par
•y cm dans un plateau de lyophilisation. L'éponge comprimée est alors déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Une éponge poreuse de collagène surfacée avec une éponge comprimée de collagène est ainsi obtenue. L'ensemble est réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 12
Matrice poreuse constituée de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne telle que décrite dans l'exemple 5 et surfacée avec l'éponge comprimée.
Le gel de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne, préparé selon le procédé de l'exemple 5 est déposé à raison de 0.5 g par cm dans un plateau de lyophilisation, puis l'éponge comprimée est déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisât est alors réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 13
Toutes les matrices poreuses surfacées avec une éponge de collagène comprimée décrites plus haut peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 2, 3 et 4.
EXEMPLES 14 A 16 : Essais de comparaison du métabolisme cellulaire entre les matrices collagéniques bovines et aquatiques
EXEMPLE 14 : ESSAI DE VIABILITE CELLULAIRE DE FIBROBLASTE
I - Préparation des dermes équivalents Pour cet essai de comparaison, on fabrique d'une part une matrice poreuse aquatique réticulée au DPPA, selon l'exemple 2.
A titre de comparaison, une fabrique une matrice poreuse comparative avec du collagène d'origine bovine, dite matrice bovine, également réticulée au DPPA, dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 2. On prend des fibroblastes humains normaux issus d'un pool de donneurs jeunes utilisé au 7eme passage et que l'on ensemence dans chacune des matrices aquatique et bovine, à raison de 250 000 cellules par cm2 dans le cas de l'étude de prolifération et de synthèse protéique, et que l'on ensemence à raison de 300 000 cellules par cm2 pour les matrices aquatique et bovine destinées aux études d'histologie.
On effectue la culture de ces matrices respectivement aquatique et bovine dans du milieu composé de DMEM/HAM F 12 dans un rapport 50/50 (v/v) additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 25 μg/ml de gentamycine, 1 μg/ml d'amphotéricine B, 50 μg/ml de vitamine C. On réalise cette culture pendant 1 mois en changeant le milieu de culture 3 fois par semaine. II - Analyses réalisées
1) Mesure de la viabilité cellulaire par réaction au MTT
On ajoute 1 % en poids de MTT (c'est-à-dire le 3-(4-(diméthylthiazol- 2-yl)2,5-diphényltétrazolium bromure) dans le milieu de culture.
On réalise une incubation pendant 2,5 heures à 37°C.
Après incubation pendant cette durée, la densité optique du produit de transformation (bleu formazan) est lue à 550 nm après solubilisation dans le DMSO.
La densité optique obtenue est proportionnelle à l'activité des succinate-déshydrogénases qui sont capables d'effectuer la transformation du sel de tétrazolium MTT jaune clair en cristaux bleus de formazan.
La viabilité cellulaire a été réalisée après 1, 5, 7, 22 jours et un mois de culture.
Pour déterminer les valeurs moyennes, on a réalisé 6 échantillons pour chaque matrice.
TABLEAU I DE RESULTATS
Figure imgf000016_0001
Ces résultats font également l'objet des courbes de la figure 1 annexée.
On notera que la courbe avec les losanges est celle obtenue avec la matrice aquatique et la courbe avec les carrés est celle obtenue avec la matrice bovine.
On observe à partir des résultats que de manière totalement surprenante, la matrice aquatique non seulement constitue un support permettant la survie de fibroblastes humains normaux mais aussi la prolifération cellulaire de ces fibroblastes humains normaux, tout en constituant même un support de culture bien meilleur pendant les trois premières semaines. Il peut donc être conclu de ces essais que le collagène aquatique est, de manière surprenante, particulièrement adapté pour réaliser un support d'ingénierie tissulaire en particulier pour des applications in vitro et même et surtout in vivo pour constituer des biomatériaux contenant des cellules vivantes et en particulier et de préférence des cellules vivantes d'êtres humains.
2) Mesure des synthèses protéiques
La synthèse des protéines sécrétées pendant 3 jours dans un milieu de culture sans sérum de veau foetal a été évaluée après un mois de maturation des dermes équivalents, tels qu'obtenus après le mois de culture dans les conditions rapportées ci-dessus dans la préparation des dermes équivalents.
Le dosage est réalisé par la méthode du microBCA de Pierce.
Parallèlement, la densité cellulaire a été évaluée par un test au MTT dans les conditions décrites ci-dessus. La teneur en protéines relative correspond à la teneur protéique ramenée à 1 unité de densité cellulaire exprimée en densité optique ou DO, afin de raisonner à concentration cellulaire équivalente. Les résultats obtenus sont répertoriés au tableau H ci-après :
TABLEAU ïï RESULTATS DE SYNTHESE PROTEIQUE
Figure imgf000017_0001
* : Déviation standard moyenne
Comme pour le tableau I, la moyenne résulte d'une moyenne réalisée sur 6 échantillons. 3) Histologie
Les dermes équivalents obtenus après culture pendant 21 jours de culture à partir des matrices en collagène aquatique et bovin sont fixés dans une solution à 2 % en paraformaldéhyde puis post-fixes dans une solution de tétroxide d'osmium, déshydratés, inclus en Epon, coupés et observés en microscopie électronique à transmission (Jeol 1200) au CMEABG (Lyon, France).
Conclusions
Ces résultats indique une très bonne colonisation des matrices tridimensionnelles qu'eUes soient aquatiques ou bovines. Après trois semaines de culture, la densité cellulaire est équivalente dans les deux types de matrices.
Toutefois, il semble que la matrice aquatique permette une meilleure adhésion cellulaire en début d'expérimentation comme l'indique l'étude de prolifération lors de la première semaine de culture et ainsi une meilleure colonisation pour des temps courts de culture.
En ce qui concerne les synthèses protéiques, après un mois de culture les capacités de synthèse des fibroblastes (teneur en protéines relative) sont également équivalentes.
Ces résultats indiquent que les matrices de collagène aquatique mises au point ont permis la préparation de dermes équivalents de bonne qualité ; les résultats obtenus avec ces matrices étant comparables à ceux obtenus avec des matrices de collagène bovin.
En microscopie électronique à transmission, les fibroblastes ont pu être observés dans les matrices d'origine bovine et aquatique. Dans les deux types de matrices, on note la présence d'une abondante matrice extracellulaire néosynthétisée. On peut différencier la matrice extracellulaire néosynthétisée grâce à la striation périodique des fibres de collagène déposé comparativement aux amas collagéniques formant la matrice tridimensionnelle de l'éponge de départ.
EXEMPLE 15
Influence des différents types de réticulation des matrices collagéniques aquatiques sur la viabilité cellulaire
Pour étudier l'influence des différents types de réticulation des matrices collagéniques aquatiques sur la viabilité cellulaire, on procède aux essais suivants : I) Préparation des dermes équivalents a) Support ou matrice utilisé
On prépare divers supports ou matrices de collagène en utilisant diverses proportions de collagène dans le gel de collagène servant à fabriquer la couche ou matrice poreuse et en utilisant éventuellement un agent de réticulation différent, comme suit :
1) Essai 1
Pour cet essai, on fabrique une matrice poreuse sous forme d'épongé poreuse à partir d'un gel de collagène aquatique préparé à partir de 1,3 % en poids en collagène aquatique, que l'on congèle à -80°C et que l'on soumet à une lyophilisation standard conforme à l'exemple 2 et que l'on soumet ensuite à une réticulation au DPPA à une proportion de 250 μl/g d'épongé à l'état sec.
2) Essai 2 Pour cet essai, on prépare un support poreux sous forme d'épongé aquatique à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 0,7 % en poids de collagène aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80°C, puis à une lyophilisation standard et une réticulation au DPPA à 250 μl/g sec comme dans l'essai 1.
3) Essai 3
Pour cet essai, on procède comme pour l'essai 1, si ce n'est que la réticulation a lieu avec l'EDC, selon l'exemple 3, à une proportion de 0,46 g/g d'épongé sèche.
4) Essai 4
On prépare un support poreux comprenant une éponge de collagène aquatique obtenu à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 1,1 % en poids de collagène aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80°C, puis à une lyophilisation standard et à une réticulation au DPPA à 250 μl/g sec comme dans l'essai 2, la différence résidant dans une proportion de 1,1 % en poids de collagène aquatique.
Dans l'ensemble de ces essais, le collagène aquatique est issu, comme dans l'exemple 2, de la peau ventrale de sole. b) Culture des fibroblastes sur ces matrices
On utilise, comme dans l'exemple 14, des fibroblastes humains normaux mais qui sont prélevés au 8eme passage.
On réalise un ensemencement à raison de 275 000 cellules par cm . Le milieu culture est composé de DMEM/HAM F12 50/50 (v/v) additionné de 10 % en poids de sérum de veau foetal, 100 UI7ml de pénicilline, 25 μg/ml de gentamycine, 1 μg/ml d'amphotéricine B, 50 μg/ml de vitamine C.
On réalise la culture pendant 1 mois en changeant de milieu 3 fois par semaine. Pour chaque essai, on utilise 4 matrices afin d'effectuer une moyenne pour chaque type d'essai et mesurer la déviation standard moyenne.
rf) Analyses réalisées
Mesure de la viabilité cellulaire par réaction à l'Alamar Blue (marqueur d'oxydoréduction
L'Alamar Blue est ajouté à raison de 2 % en poids d'un milieu de culture utilisé, au moment où l'on souhaite mesurer la viabilité cellulaire sur un prélèvement réalisé sur le milieu culture.
Après incubation à 2 h 20 à 37°C, on lit la fluorescence, sur la base d'une excitation à 530 nm et une émission à 590 nm).
L'intensité de la fluorescence obtenue est proportionnelle à l'activité métabolique des cellules.
On effectue la mesure de la viabilité cellulaire sur 10 échantillons après 1, 4 6, 11 17 jours de culture. Les résultats sont exprimés au tableau ni ci-après.
Les résultats sont indiqués en unité internationale de fluorescence en fonction du temps.
TABLEAU VIABILITE CELLULAIRE (u I fluorescence)
Figure imgf000021_0001
* : Déviation standard
Les résultats du tableau 3 font aussi l'objet de la figure 2 annexée. Ils montrent les courbes de prolifération fibroblastique en derme équivalent. La courbe en losange plein est celle réalisée avec l'essai 1 ; la courbe en carré plein est celle réalisée avec l'essai 2 ; la courbe en triangle est celle réalisée avec l'essai 3 et la courbe avec les croix est celle réalisée avec l'essai 4.
Le temps est exprimé en jour en abscisse et la fluorescence en UI avec une échelle démarrant à 15 000 et augmentant par unité de 10 000 jusqu'à 55 000. Les résultats permettent d'aboutir aux conclusions suivants.
Conclusions
Les résultats indiquent les différentes matrices préparées peuvent permettre une bonne croissance fibroblastique après 17 jours de culture. Quelle que soit la préparation des matrices collagéniques aquatiques, les fibroblastes adhèrent bien à leur support tridimensionnel et se divisent très rapidement afin de coloniser la matrice.
Le profil de prolifération est très légèrement variable d'un type de matrice à l'autre mais après 17 jours de culture, la densité fibroblastique est comparable quel que soit le procédé de fabrication.
Les différents types de réticulation employés réalisés soit avec le DPPA ou avec l'EDC ne semblent pas influencer le renouvellement cellulaire. Après pratiquement 3 semaines de culture, la stabilité des matrices est excellente, à savoir peu de digestion, peu de contraction.
EXEMPLE 16 :
Essai démontrant les avantages du collagène aquatique pour la mise en évidence et le dosage du collagène humain néosynthétisé
Cet essai est similaire à celui de l'exemple 14, si ce n'est que l'on effectue une histologie avec immuno-marquage.
L'essai a lieu de la manière suivante :
1) Préparation des dermes équivalents
Il s'agit de dermes équivalents de l'exemple 14, la culture étant réalisée dans les conditions de l'exemple 14.
Cette culture est donc effectuée pendant trois semaines en changeant le milieu trois fois par semaine, l'ensemencement des fibroblastes humains normaux ayant eu lieu à 300.000 cellules par cm2 comme cela était indiqué dans l'exemple 14.
2) Histologie a) Histologie classique
On réalise la fixation avec le paraformaldéhyde à une teneur de 4 % en poids , on réalise ensuite une déshydratation et une inclusion en paraffine.
On effectue ensuite des coupes à 7 μm et une coloration Mallory Haidenhain après déparaffinage et réhydratation.
b) hnmunomarquage
On fixe également avec le paraformaldéhyde à 4 % en poids, on réalise une inclusion en Tissue Tek OCT compound, c'est-à-dire un liquide d'inclusion fourni par Miles, Elkhart, Indiana, USA, et une coupe à froid à 7 μm. L'immunomarquage est effectué de la manière suivante : i. Avec un premier anticorps anti-collagène de type I humain de lapin (dilution 1/40) ii. Un deuxième anticorps anti-lapin conjugué FITC (Fluorescéine Iso ThioCyanate) (dilution 1/160)
Contre coloration avec DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dilactate).
3) Résultats
On constate que les support constitués respectivement par une matrice aquatique et une matrice bovine forment des pores plus ou moins lâches dans lesquels viennent adhérer les fibroblastes. En surface, on note une proportion plus importante de fibroblastes formant un surfaçage favorable du derme équivalent pour la réalisation d'une peau reconstruite. La répartition des fibroblastes est homogène dans les éponges aquatique et bovine.
En immunomarquage, on constate que la matrice formée de collagène bovin est marquée par l'anticorps anti-coUagène de type I humain (croisement).
Par contre, la matrice d'origine aquatique n'est que très faiblement marquée par l'anticorps anti-collagène humain.
L'utilisation des éponges composées de collagène aquatique est donc favorable à la mise en évidence de la matrice extracellulaire néosynthétisée. Ces résultats s'expliquent par les travaux du Professeur Hartmann sur les réactions des différents antigènes par rapport aux différents anticorps déterminés par les mesures des densités optiques après immunomarquage données au tableau TV dit de Hartmann ci-après :
TABLEAU IV Réaction croisée humain, bovin, poisson (test Elisa)
Figure imgf000024_0001
(> : densité optique supérieure à 2000)
Les résultats sont exprimés en D.O. x 103 (densité optique à λ = 450 nm) Légendes : 20111 (225) : anti-coUagène I humain
50121 (03) : anti-coUagène I bovin
50171 (01) : anti-collagène I poisson (sole)
De ce tableau de résultats, il ressort que quel que soit l'anticorps (anti- collagène type I humain, anti-collagène type I bovin, anti-collagène type I de sole), en immunomarquage, la différence est beaucoup plus importante entre le collagène humain et le collagène de sole qu'entre le collagène humain et le collagène bovin. Il en résulte que dans une matrice de collagène de poisson, le collagène synthétisé par les fibroblastes humains pourra être mis en évidence beaucoup plus aisément. Ceci confirme les résultats décrits précédemment obtenus par un immunomarquage par l'anticorps anti-collagène de type I humain du collagène synthétisé dans la matrice de collagène de poisson, ce qui constitue un résultat particulièrement inattendu et avantageux de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de collagène d'origine aquatique, de préférence issu de la peau de poisson de la famille des téléostéens, pour la réalisation de supports destinés à l'ingénierie tissulaire.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le collagène est obtenu à partir de la peau de poisson de la famille des éléostéens, plus particulièrement des poissons présentant des zones de peau dépigmentée, encore plus particulièrement des poissons plats, en particulier ceux qui sont péchés de façon industrielle comme par exemple la sole, la limande, lé turbot, le barbue, de préférence la sole.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le collagène a sa résistance mécanique renforcée ou sa résistance à la digestion enzymatique augmentée soit par une réticulation chimique et/ou physique, soit par adjonction d'une macromolécule naturelle ayant de fortes interactions avec le collagène, soit par une combinaison des deux procédés.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le collagène est utilisé sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène soumis de préférence à une étape de lyophilisation.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation physique, de préférence par déshydratation hydrothermique ou DHT.
6. Utilisation selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que la matrice poreuse précitée est réticulée par une réticulation chimique, de préférence au diphenylphosphorylazide ou DPPA ou par un carbodiimide ou le N- hydroxysuccinimide ou par le glutaraldéhyde.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le collagène précité se présente sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir de collagène aquatique de préférence natif, mélangé avec du chitosane et éventuellement au moins un glycosaminoglycanne de préférence le chondroïtine sulfate.
8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le collagène précité se présente sous forme d'une matrice poreuse préparée à partir d'un gel de collagène, ladite matrice poreuse étant revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée.
9. Utilisation selon la revendication 6, 7 ou 8, caractérisée en ce qu'au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou de sujets âgés.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endotéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, adipocytes, sébocytes, des chondrocytes, des cellules osseuses, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales ou génétiquement modifiées ou malignes.
11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que la couche poreuse contient des fibroblastes normaux, génétiquement modifiés ou malins, et la membrane sensiblement compacte contient des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine san uine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses.
12. Utilisation selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que la compression précitée de l'éponge collagénique très fortement comprimée est réalisée à une pression minimum égale à environ 50 bars (50.105 Pa), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), cette compression ayant éventuellement été réalisée à une température comprise entre 20°C et 80°C, encore mieux entre 40°C et 60°C.
13. Utilisation selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisée en ce que la membrane sensiblement compacte est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant la membrane et en la déposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé.
14. Support destiné à l'ingénierie tissulaire, caractérisé en ce qu'il comprend du collagène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes.
15. Biomatériau, par exemple sous la forme d'un tissu conjonctif reconstitué, ou de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il a été préparé à partir du collagène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, avantageusement ce biomatériau comprenant des cellules soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets jeunes, soit obtenues sensiblement exclusivement à partir de sujets âgés, en particulier pour étudier le processus du vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité d'ingrédients actifs sur ce processus.
PCT/FR2001/001629 2000-05-26 2001-05-25 Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus Ceased WO2001092322A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20027015990A KR100646046B1 (ko) 2000-05-26 2001-05-25 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의용도, 그 지지체 및 생체 재료
DE10196235T DE10196235B4 (de) 2000-05-26 2001-05-25 Verwendung von Fischkollagen zur Herstellung von Trägern für die Gewebebildung sowie diese Träger
JP2002500933A JP3747412B2 (ja) 2000-05-26 2001-05-25 組織工学用にデザインされた担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用並びにそれにより得られる担体及び生体材料

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR00/06748 2000-05-26
US09/616,282 2000-07-14
US09/616,282 US6541023B1 (en) 2000-05-26 2000-07-14 Use of collagen of aquatic origin for the production of supports for tissue engineering, and supports and biomaterials obtained

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001092322A1 true WO2001092322A1 (fr) 2001-12-06

Family

ID=24468766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2001/001629 Ceased WO2001092322A1 (fr) 2000-05-26 2001-05-25 Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP3747412B2 (fr)
DE (1) DE10196235B4 (fr)
WO (1) WO2001092322A1 (fr)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041320A1 (fr) * 2002-11-06 2004-05-21 National Institute For Materials Science Materiau d'apatite/collagene poreux reticule contenant un composite d'apatite/collagene auto-organise et son procede de production
US7053051B2 (en) 2003-10-28 2006-05-30 Medtronic, Inc. Methods of preparing crosslinked materials and bioprosthetic devices
WO2007055431A1 (fr) * 2005-11-14 2007-05-18 Seoul National University Industry Foundation Procede de production d'une membrane composite constituee de collagene et d'apatite pour la regeneration osseuse guidee
US7255857B2 (en) 2004-01-23 2007-08-14 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
KR100787553B1 (ko) * 2003-06-13 2007-12-21 엥겔하드 리옹 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
WO2009024280A3 (fr) * 2007-08-20 2009-07-30 Univ Eberhard Karls Support de cellule à base de collagène
FR2937253A1 (fr) * 2008-10-22 2010-04-23 Perouse Lab Implant medical biologique d'origine animale
US8008357B2 (en) 2004-03-30 2011-08-30 Hoya Corporation Method for controlling average pore diameter of porous body comprising apatite/collagen composite fibers
WO2014009566A1 (fr) 2012-07-13 2014-01-16 Laboratoires Expanscience Procédé d'identification de marqueurs moléculaires de la peau d'enfant
WO2014020132A1 (fr) * 2012-08-02 2014-02-06 Sofradim Production Procédé pour la préparation d'une couche poreuse à base de chitosan
US8906425B2 (en) 2003-06-13 2014-12-09 Basf Beauty Care Solutions France S.A.S. Stimulation of the synthesis of the activity of an isoform of lysyl oxidase-like LOXL for stimulating the formation of elastic fibers
EP2644620B1 (fr) * 2010-11-26 2017-06-28 Tokyo Institute of Technology Collagène non-fibrogène et méthode pour sa production
US9724367B2 (en) 2010-11-10 2017-08-08 Regenmed (Cayman) Ltd. Injectable formulations for organ augmentation
WO2017220763A1 (fr) 2016-06-23 2017-12-28 Laboratoires Expanscience Modèles de la dermatite atopique juvénile
WO2018234430A1 (fr) 2017-06-22 2018-12-27 Laboratoires Expanscience Modeles de peau sensible reconstituee
CN109589455A (zh) * 2018-11-07 2019-04-09 山东大学第二医院 一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法
CN111647098A (zh) * 2020-06-17 2020-09-11 山东警察学院 一种鱼皮来源的硫酸软骨素/硫酸皮肤素及其应用
US10837958B2 (en) 2014-03-31 2020-11-17 Laboratoires Expanscience Method for evaluating the harmful effects of urine on children's skin
CN114796608A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 浙江万里学院 一种交联改性的三维胶原支架及其制备方法
US11892447B2 (en) 2015-12-16 2024-02-06 Laboratoires Expanscience Method for evaluating the effects of dehydration on children's skin

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4463702B2 (ja) * 2004-04-28 2010-05-19 井原水産株式会社 伸縮性コラーゲン成形体、その製造方法および用途
US20080033550A1 (en) * 2004-08-24 2008-02-07 Gunze Limited Process For Producing Collagen Sponge, Process For Producing Artificial Skin, Artificial Skin And Cell Tissue Culture Substrate
US20080026032A1 (en) * 2006-07-27 2008-01-31 Zubery Yuval Composite implants for promoting bone regeneration and augmentation and methods for their preparation and use
JP5050197B2 (ja) * 2006-07-31 2012-10-17 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 生物由来スキャフォールドの作製方法
CN101918047B (zh) * 2008-01-16 2016-12-07 科麦德有限公司 由水母制成的胶体胶原蛋白凝胶
JP5237714B2 (ja) * 2008-07-29 2013-07-17 ＢｉｏＲＯＩＳ株式会社 細胞輸送用担体及びそれを使用した細胞の輸送方法
MX2012004037A (es) * 2009-10-07 2012-10-15 Kerecis Ehf Material de andamiaje para el cuidado de heridas y/u otras aplicaciones para cicatrizacion de tejido.
JP5870398B2 (ja) * 2010-11-26 2016-03-01 国立大学法人東京工業大学 高強度コラーゲン線維膜及びその製造方法
JP6341592B2 (ja) * 2012-10-24 2018-06-13 多木化学株式会社 水溶性コラーゲンシートの製造方法
JP5633880B2 (ja) * 2013-05-07 2014-12-03 国立大学法人東京工業大学 コラーゲン成形体及びその製造方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012055A2 (fr) * 1989-04-12 1990-10-18 Bioetica Procede de reticulation du collagene par le diphenylphosphorylazide, collagene reticule ainsi obtenu et biomateriaux a base de collagene ainsi reticules
US5166187A (en) * 1987-06-15 1992-11-24 Centre National De La Recherche Biomaterials with a base of mixtures of collagen, chitosan and glycosaminoglycans, process for preparing them and their application in human medicine
JPH0775566A (ja) * 1993-09-10 1995-03-20 Marino Forum 21 魚類細胞の培養方法
US5420248A (en) * 1991-07-04 1995-05-30 Coletica Unpigmented fish skin, particularly from flat fish, as a novel industrial source of collagen, extraction method, collagen and biomaterial thereby obtained
FR2724563A1 (fr) * 1994-09-15 1996-03-22 Coletica Utilisation de membranes collageniques comme protheses de regeneration peritoneale
EP0753313A1 (fr) * 1995-06-26 1997-01-15 Hokkaido Government Peau artificielle utilisant des organismes marins
WO1997020569A2 (fr) * 1995-12-07 1997-06-12 Encelle, Inc. Dispositifs bioartificiels et matrices cellulaires pour lesdits dispositifs

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3157524A (en) * 1960-10-25 1964-11-17 Ethicon Inc Preparation of collagen sponge
US5660692A (en) * 1988-02-24 1997-08-26 Cedars-Sinai Medical Center Method of crosslinking amino acid-containing polymers using photoactivatable chemical crosslinkers
US5206028A (en) * 1991-02-11 1993-04-27 Li Shu Tung Dense collagen membrane matrices for medical uses
US6080194A (en) * 1995-02-10 2000-06-27 The Hospital For Joint Disease Orthopaedic Institute Multi-stage collagen-based template or implant for use in the repair of cartilage lesions

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166187A (en) * 1987-06-15 1992-11-24 Centre National De La Recherche Biomaterials with a base of mixtures of collagen, chitosan and glycosaminoglycans, process for preparing them and their application in human medicine
WO1990012055A2 (fr) * 1989-04-12 1990-10-18 Bioetica Procede de reticulation du collagene par le diphenylphosphorylazide, collagene reticule ainsi obtenu et biomateriaux a base de collagene ainsi reticules
US5420248A (en) * 1991-07-04 1995-05-30 Coletica Unpigmented fish skin, particularly from flat fish, as a novel industrial source of collagen, extraction method, collagen and biomaterial thereby obtained
JPH0775566A (ja) * 1993-09-10 1995-03-20 Marino Forum 21 魚類細胞の培養方法
FR2724563A1 (fr) * 1994-09-15 1996-03-22 Coletica Utilisation de membranes collageniques comme protheses de regeneration peritoneale
EP0753313A1 (fr) * 1995-06-26 1997-01-15 Hokkaido Government Peau artificielle utilisant des organismes marins
WO1997020569A2 (fr) * 1995-12-07 1997-06-12 Encelle, Inc. Dispositifs bioartificiels et matrices cellulaires pour lesdits dispositifs

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE WPI Section Ch Week 199520, Derwent World Patents Index; Class B04, AN 1995-151478, XP002161598 *
GIRAUD-GUILLE M -M M -M ET AL: "Structural aspects of fish skin collagen which forms ordered arrays via liquid crystalline states", BIOMATERIALS,GB,ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., BARKING, vol. 21, no. 9, May 2000 (2000-05-01), pages 899 - 906, XP004202455, ISSN: 0142-9612 *
WANG MING-CHE ET AL: "Collagen fibres with improved strength for the repair of soft tissue injuries.", BIOMATERIALS, vol. 15, no. 7, 1994, pages 507 - 512, XP000982411, ISSN: 0142-9612 *
YEH M I ET AL: "A novel native matrix for tissue engineering. Analysis of cell-matrix interaction.", FASEB JOURNAL, vol. 14, no. 4, 15 March 2000 (2000-03-15), Annual Meeting of Professional Research Scientists: Experimental Biology 2000;San Diego, California, USA; April 15-18, 2000, pages A444, XP000982329, ISSN: 0892-6638 *

Cited By (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2004041320A1 (ja) * 2002-11-06 2006-03-02 独立行政法人物質・材料研究機構 自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を含むアパタイト／コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法
US7153938B2 (en) 2002-11-06 2006-12-26 National Institute For Materials Science Cross-linked apatite/collagen porous body containing self-organized apatite/collagen composite and its production method
WO2004041320A1 (fr) * 2002-11-06 2004-05-21 National Institute For Materials Science Materiau d'apatite/collagene poreux reticule contenant un composite d'apatite/collagene auto-organise et son procede de production
JP4699759B2 (ja) * 2002-11-06 2011-06-15 独立行政法人物質・材料研究機構 自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を含むアパタイト／コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法
CN100372579C (zh) * 2002-11-06 2008-03-05 独立行政法人物质·材料研究机构 含有自体组织化磷灰石-胶原复合体的交联磷灰石-胶原多孔体及其制备方法
KR100844914B1 (ko) * 2003-06-13 2008-07-09 엥겔하드 리옹 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
US8906425B2 (en) 2003-06-13 2014-12-09 Basf Beauty Care Solutions France S.A.S. Stimulation of the synthesis of the activity of an isoform of lysyl oxidase-like LOXL for stimulating the formation of elastic fibers
KR100787553B1 (ko) * 2003-06-13 2007-12-21 엥겔하드 리옹 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을 제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
US7053051B2 (en) 2003-10-28 2006-05-30 Medtronic, Inc. Methods of preparing crosslinked materials and bioprosthetic devices
US8173121B2 (en) 2004-01-23 2012-05-08 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
US8404231B2 (en) 2004-01-23 2013-03-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
US7674458B2 (en) 2004-01-23 2010-03-09 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
US7255857B2 (en) 2004-01-23 2007-08-14 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
US7255856B2 (en) 2004-01-23 2007-08-14 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) and elastogenesis
US8008357B2 (en) 2004-03-30 2011-08-30 Hoya Corporation Method for controlling average pore diameter of porous body comprising apatite/collagen composite fibers
WO2007055431A1 (fr) * 2005-11-14 2007-05-18 Seoul National University Industry Foundation Procede de production d'une membrane composite constituee de collagene et d'apatite pour la regeneration osseuse guidee
EP3098305A1 (fr) * 2007-08-20 2016-11-30 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Support cellulaire contenant du collagene
WO2009024280A3 (fr) * 2007-08-20 2009-07-30 Univ Eberhard Karls Support de cellule à base de collagène
AU2008290857B2 (en) * 2007-08-20 2013-05-02 Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum Cell carrier containing collagen
RU2511426C2 (ru) * 2007-08-20 2014-04-10 Эберхард-Карлс-Универзитэт Тюбинген Универзитэтсклиникум Применение композиции для культивирования биологических клеток
FR2937253A1 (fr) * 2008-10-22 2010-04-23 Perouse Lab Implant medical biologique d'origine animale
US9724367B2 (en) 2010-11-10 2017-08-08 Regenmed (Cayman) Ltd. Injectable formulations for organ augmentation
EP2644620B1 (fr) * 2010-11-26 2017-06-28 Tokyo Institute of Technology Collagène non-fibrogène et méthode pour sa production
WO2014009566A1 (fr) 2012-07-13 2014-01-16 Laboratoires Expanscience Procédé d'identification de marqueurs moléculaires de la peau d'enfant
WO2014020132A1 (fr) * 2012-08-02 2014-02-06 Sofradim Production Procédé pour la préparation d'une couche poreuse à base de chitosan
US10363690B2 (en) 2012-08-02 2019-07-30 Sofradim Production Method for preparing a chitosan-based porous layer
FR2994185A1 (fr) * 2012-08-02 2014-02-07 Sofradim Production Procede de preparation d'une couche poreuse a base de chitosane
US10837958B2 (en) 2014-03-31 2020-11-17 Laboratoires Expanscience Method for evaluating the harmful effects of urine on children's skin
US11892447B2 (en) 2015-12-16 2024-02-06 Laboratoires Expanscience Method for evaluating the effects of dehydration on children's skin
WO2017220763A1 (fr) 2016-06-23 2017-12-28 Laboratoires Expanscience Modèles de la dermatite atopique juvénile
WO2018234430A1 (fr) 2017-06-22 2018-12-27 Laboratoires Expanscience Modeles de peau sensible reconstituee
US12061189B2 (en) 2017-06-22 2024-08-13 Laboratoires Expanscience Models of reconstructed sensitive skin
CN109589455A (zh) * 2018-11-07 2019-04-09 山东大学第二医院 一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法
CN109589455B (zh) * 2018-11-07 2022-02-15 山东大学第二医院 一种热变性胶原蛋白或热变性真皮支架替代物及制备方法
CN111647098A (zh) * 2020-06-17 2020-09-11 山东警察学院 一种鱼皮来源的硫酸软骨素/硫酸皮肤素及其应用
CN111647098B (zh) * 2020-06-17 2022-05-17 山东警察学院 一种鱼皮来源的硫酸软骨素/硫酸皮肤素及其应用
CN114796608A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 浙江万里学院 一种交联改性的三维胶原支架及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE10196235T1 (de) 2003-04-17
JP3747412B2 (ja) 2006-02-22
JP2003534858A (ja) 2003-11-25
DE10196235B4 (de) 2007-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2001092322A1 (fr) Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
FR2809412A1 (fr) Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
WO2001091821A1 (fr) Supports a base de collagene pour l'ingenierie tissulaire et la preparation de biomateriaux
US6790454B1 (en) Processes for the preparation of novel collagen-based supports for tissue engineering, and biomaterials obtained
US6974679B2 (en) Support with collagen base for tissue engineering and manufacture of biomaterials
El Blidi et al. Extraction methods, characterization and biomedical applications of collagen: A review
JP4751005B2 (ja) 三次元皮膚モデル
CA2139864C (fr) Utilisation d'un materiau poreux a base de carbonate de calcium comme support pour un facteur de croissance dans la preparation d'un implant bioresorbable
KR100520944B1 (ko) 인공조직 및 생체재료 제조용 콜라겐 지지체
CA2306317C (fr) Equivalent de peau agee
JP7693152B2 (ja) 組織足場
EP3759153B1 (fr) Hydrogel pour stimuler la neurotisation, l'osteogenese et l'angiogenese
FR2809313A1 (fr) Procedes de preparation de nouveaux supports a base de collagene pour l'ingenieurie tissulaire et biomateriaux obtenus
Lin et al. Studies of novel hyaluronic acid-collagen sponge materials composed of two different species of type I collagen
EP3619242A1 (fr) Procédé de préparation d'hydrogel à partir d'acide hyaluronique modifié et de collagène de type i
CA2625604C (fr) Matrice poreuse biocompatible et biodegradable notamment utile pour la reconstruction tissulaire
CA2582306C (fr) Greffage covalent de substances hydrophobes sur le collagene
FR2927632A1 (fr) Cornee et muqueuse reconstruites.
EP0217816B1 (fr) Produit a base d'elastine, procede pour sa preparation et ses applications biologiques, en particulier en tant que biomateriaux et supports artificiels
FR2809314A1 (fr) Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus
EP1960011B1 (fr) Utilisation d' un polysaccharide excrete par l'espece vibrio diabolicus a des fins d'ingenierie des tissus conjonctifs non mineralises
KR100646046B1 (ko) 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의용도, 그 지지체 및 생체 재료
Sorushanova The influence of collagen type I source and cross-linking on cell function and phenotype maintenance
EP4125962B1 (fr) Biomatériau comprenant une matrice poreuse résorbable et procédé de fabrication associé
WO2023203235A1 (fr) Matrice composite utile pour favoriser l'innervation, l'ostéogenèse et l'angiogenèse

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): DE JP KR US

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020027015990

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020027015990

Country of ref document: KR

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 10196235

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20030417

Kind code of ref document: P

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10196235

Country of ref document: DE

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8607

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8607

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8607