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WO2001068068A2 - Composes se liant au cytosquelette - Google Patents

Composes se liant au cytosquelette Download PDF

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WO2001068068A2
WO2001068068A2 PCT/FR2001/000816 FR0100816W WO0168068A2 WO 2001068068 A2 WO2001068068 A2 WO 2001068068A2 FR 0100816 W FR0100816 W FR 0100816W WO 0168068 A2 WO0168068 A2 WO 0168068A2
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WO
WIPO (PCT)
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map
steroids
cytoskeleton
proteins
preg
Prior art date
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PCT/FR2001/000816
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English (en)
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WO2001068068A3 (fr
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Etienne-Emile Baulieu
Paul Robel
Esther Fellous
Koichi Murakami
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Publication date
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Priority to CA002403420A priority patent/CA2403420A1/fr
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Priority to US10/221,862 priority patent/US20030125311A1/en
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system

Definitions

  • the invention relates to compounds capable of binding to constituent proteins or associated with elements of the cytoskeleton.
  • the cytoskeleton is a complex network (see bibliographic reference (1) at the end of the description) which includes the primary networks of three classes of cytoskeletal filaments (microtubules, microfilaments, and intermediate filaments) to which is added a microtrabecular network which includes the majority proteins associated with microtubules, microfilaments and intermediate filaments.
  • the MAP protein family of Microbubules Associated Proteins described below 1 is a characteristic example of a component of this network: it has " a binding domain to microtubules, but also to microfilaments (2,3) and intermediate filaments (4, 5).
  • the microtubules are hollow cylinders with an external diameter of 25 mm, the wall of which is made up of protoflaments, themselves formed by the stack of globular ⁇ and ⁇ subunits of tubule (50 Kd).
  • Tubod heterodimeres are periodically associated with proteins called MAP S associated proteins; whose role is to facilitate the assembly of the tubule, but also the organization and functions of the icrctubular network
  • the tubule presents a great heterogeneity. It indeed includes numerous isoforms originating from both the expression of several genes and numerous post-translational modifications (6).
  • MAP S are divided into two groups, namely, "structural” MAP involved in the assembly of tubulins and MAP ⁇ "motor” which use microtubules as rails to ensure the movement of certain molecules and organelles.
  • the structural MAP ⁇ targeted in the invention include several families of proteins, namely, the MAPi A and B proteins (350 Kd) encoded by separate genes, the high molecular weight MAP A and B proteins (300 Kd), the proteins MAP. Low molecular weight C and D (around 70 Kd), MAP proteins A and B (180 Kd) present in neurons up to 10 days after birth, MAP proteins 4 A, B and C (215 to 240 Kd ) ubiquitous, with properties very close to those of MAP., Tau proteins (50-67 Kd or 110-120 Kdj, STOP proteins (145 Kd), very stabilizing molecules with microtubules.
  • MAP proteins participate in the dend ⁇ tique arborization, while the tau proteins are essential for axonal growth.
  • MAP. B increases his expression from fetal to adult stage.
  • MAP- A is only expressed from a certain stage of development.
  • MAP 2 C (2) which is mainly expressed in the early stages of development, is still present in the olfactory bulb (7) and in the photoreceptor cells of the retina (8) in adults.
  • MAP 2 D is localized in the hippocampus from the fetal stage (3).
  • Microfilaments are polymers made of actin (43 Kd). Very abundant in the cortical region of the axon, they are also found in the central region where they participate in its dynamic architecture.
  • the intermediate filaments of neurons polymers formed by a triplet of proteins (68, 150, and 200 Kd), are present in differentiated neurons. Interconnected with microfilaments and microtubules, they help maintain the neuronal architecture, MAP S serving as a bridge between the three types of cytoskeletal filamentary structures.
  • this new mechanism of action concerns any non-toxic compound, capable of crossing the blood-brain barrier, and capable of binding the same site as the
  • PREG on said proteins, or to move PREG, and to exert an effect on the assembly and stabilization of microtubules.
  • the object of the invention is therefore to provide compounds capable of binding to the proteins constituting or associated with the elements of the cytoskeleton as identified by a screening method, comprising bringing these compounds into contact with said proteins, under conditions allowing the establishment of a bond when the protein, MAP for example, is a receptor for the compound.
  • the invention particularly relates to the use of such compounds for the manufacture of medicaments for the treatment of pathologies involving these proteins.
  • the compounds which can be used according to the invention for the manufacture of medicaments are more especially steroid hormones, (this term being used in the description and the claims to cover their conjugates, such as sulphate esters, or fatty acid esters), their precursors, their metabolites, free or conjugated, as well as their analogs, steroid or non-steroid.
  • pregnenolone or its esters in particular pregnenolone sulfate (PREGS), for which no intracellular receptor has been identified to date.
  • PREGS pregnenolone sulfate
  • Analogs are pharmaceutical agents capable of increasing the formation of microtubules, stabilize under the conditions given in the examples relating to PREG, to compete with PREG for binding to MAPc and to cross the blood-brain barrier while remaining sequestered in the nervous system if possible (9, 10, 11).
  • They include polycyclic compounds, natural or enantiomeric, optionally in mixtures, their sulfates, or their lipid derivatives.
  • the invention relates to addition and / or substitution products produced from said compounds on the one hand and proteins constituting or associated with elements of the cytoskeleton on the other hand.
  • the invention relates in particular to steroid coupling products - associated proteins - microtubules, - in particular, steroids - MAP-, where appropriate in the form of copolymerized with tubulin, or steroids - tau proteins in the form of copolymerized with tubulin.
  • the invention also relates to the use of proteins constituting or associated with the elements of the cytoskeleton as receptors for compounds as defined above.
  • the invention therefore relates to the use of said compounds for manufacturing medicaments capable of binding specifically to constituent proteins or associated with elements of the cytoskeleton with cytoplasmic or nuclear localization for the treatment of pathologies with dysfunction of these proteins.
  • the invention relates in particular to the manufacture of drugs adm istrable in oral form, for the treatment of the central nervous system, or in injectable form, for administration by the general route or m if you.
  • the medicaments produced in accordance with the invention are advantageously used in combination with growth factors (NGF) and / or cellular regulators, such as mterferon or cytomes.
  • growth factors such as Alzheimer's disease, dementia of vascular origin, the consequences of trauma and stroke in the nervous system and neurodegenerative diseases.
  • the invention also relates to the manufacture of medicaments, using said compounds, for combating the aging of nerve cells, or of any other cell type containing MAP 3 , such as epithelial cells, thyroid cells, or endocrine glands , steroidogens in particular.
  • said compounds can be used in combination with stabilizing effect compounds of the cytoskeleton, such as Taxol ® and Taxotere ®.
  • Taxol ® or Taxotere ® or equivalent have a stabilizing effect on microtubules, it is possible to consider a synergistic phenomenon if the two drugs are used simultaneously. In this case, the doses of the two drugs required for good efficacy will be much lower than those required when the drugs are given as monotherapy.
  • the above drugs can be used for the treatment cancers, in combination with anticancer agents, and allow the effect of the latter to be modulated, in particular in the event of chemo-resistance.
  • the compounds used are combined with pharmacologically acceptable vehicles suitable for the dosage form chosen.
  • the unit doses are of the order of 100 to 500 mg and the daily doses of the order of 500 mg to 1 g for administration by general route, this dose being reduced for administration in si tu.
  • FIG. 2 by fetal brain cytosol chromatography by FPLC on a Mono Q ion exchange column,
  • FIG. 3 by chromatography of the Mono Q peaks by FPLC on a column of Superose 12 filtration gel,
  • FIG. 4 with one immunoblot of the cytosol and of the fractions of one of the peaks eluted from the columns of ion exchange and gel filtration, - Figure 5, the equilibrium binding of PREG [ J H] to MAP. purified, complexed or not with purified tubule,
  • FIG. 6 the assembly kinetics of microtubules
  • Sprague-Dawley rats from the January farm (Le Genest St Isle, France) are used. The rats are subjected to a light-dark alternation of 12 h (lights at 8 h) at 20 ° C and fed to satiety.
  • Full females (the morning after mating is designated by EO) are housed in the pet store at least 7 days before sacrifice at E18.
  • Adult males 60 to 70 days old are also used.
  • the calf brains used are free of meninges and large blood vessels. They are stored in an ice-cold isotonic saline solution.
  • the PREG [7- J H] (22.5 Ci / mmol) used is a product marketed by NEN (Boston, MA, EUA).
  • Progesterone, pregnenolone sulfate, testosterone, corticosterone, t ⁇ amc olone acetonide, 17 ⁇ -OH PREG, 17 ⁇ -OH progesterone and cholesterol are Sigma-Aldrich products (St Quentin Fallavier, France)
  • protemase K Merck, Darmstadt Germany
  • Pronase Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France
  • TNM buffer containing lO M Tris, 0.1M NaCl, 3mM MgCl ⁇ (pH 7.4).
  • Deoxy ⁇ bonuclease I and ribonuclease A are Sigma-Aldrich products and are adjusted, respectively, to 100 IU / l and 5 IU / ml.
  • Phospholipase A2 (Roche Molecular Biochemicals) is diluted to 20 IU / ml in TNM.
  • the anti- ⁇ -tubulm monoclonal antibody N-356 is an Amersham Pharmacia Biotech product (Freiburg, Germany).
  • the monoclonal antibody 152 is an antibody produced by one of the inventors which reacts specifically with a MAP2 of high molecular weight.
  • the antibody antibodies are diluted in PBS containing 3 of BSA.
  • Fetal brains are recovered, from which the meninges are removed and subjected to rinsing with a homogenization buffer at 4 ° C. [10 mM T ⁇ s-HCl, pH 8.5 containing 1.5 mM EDTA, ImM dithiothreitol, 10 ° o glycerol, a mixture of Complete protease inhibitors ® (Roche Molecular Biochemical), called TEDG buffer]
  • the brains of adult male rats are recovered after perfusion with PBS containing 2 IU / ml of heparm.
  • the brains are weighed and homogenized with 4 vol. of homogenization buffer, in Potter glass / Teflon R homogenizers, and centrifugal at 800 g for 10 mm.
  • the supernatant is then centrifuged at 100,000 g for 1 h at 4 ° C.
  • the samples are used immediately for testing or are stored in liquid nitrogen until needed.
  • Protein concentrations are determined using the Bio-Rad kit (Bio-Rad, Hercules, Canada) with BSA as a reference standard.
  • each sample is purified with a suspension of dextran-carbon and samples of 2 ml of supernatant (purified cytosol) are added to a series of tubes containing PREG [ J H] at a rate of 1 to 500 nM, with or without unmarked steroid in excess of 1000 times.
  • the tubes are incubated at 45 ° C for 30 mm.
  • the separation of the bound steroid and the free steroid was carried out on a mini-column of Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the counting of the radioactivity in the flasks was carried out in a liquid scintillation spectrometer with correction of the attenuation (T ⁇ -carb 2100 TR, Packard).
  • the FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech) was equipped with an anion exchange column (5ml Econo-Pac High Q,
  • the column was equilibrated with a TEDG buffer containing 0.03% CHAPS and 100 nM PREG (TEDGCP buffer) at 4 ° C.
  • the cytosol (20 ml, 60 mg of protein) is applied and eluted at a speed of 1 ml / mm with the TEDGCP buffer for 20 mm.
  • the Superose 12 column (1 x 30 cm, Amersham Pnarmacia Biotech) is balanced with TEDGCP buffer containing 0.15 M NaCl, at 4 ° C.
  • the fractions collected are incubated with PREG [ J H] 100 nM in the absence or with a 100-fold excess of non-radioactive PREG. The saturable bond is then determined.
  • Calf brains are washed 2 times in L buffer (0.1 M MES, 1 M EGTA, 0.1 mM EDTA, 1 mM MgCl, 1 mM dithiothreitol and 1 mM PMSF, pH 6.4).
  • microtubules are prepared from calf brain or adult or fetal rat brain according to an assembly / disassembly process, as a function of temperature, m vi tro (12).
  • the calf tubule is purified according to the protocol of Weinberg et al (13), but the step using phosphocellulose is replaced by chromatography on a cation exchange column (Fractogel Merck) (14).
  • the microtubules and the tube are prepared in buffer L, supplemented with 1 mM GTP (buffer A).
  • Proteins tau and MAP are purified according to the protocol of Fellous et al (12) by denaturation of microtubules by heat and gel filtration column, Sephacryl ® 300 being used instead of Ultrogel ACA 34. tau proteins are then further purified according to Lmdwall and Cole method (15).
  • This assembly is able by controlling the turbidity increases with a spectrophotometer Uvicon ® (Kontron Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France). - Culture of neurons
  • the cells are incubated at 37 ° C. for 1 h, then at 4 ° C. for approximately 14 h, in the presence of either anti- ⁇ -tubulm monoclonal antibody diluted to 1/2000 or d monoclonal antibody ant ⁇ -MAP2 diluted to 1/1000 or anti-double cortin antiserum diluted to 1/300.
  • the secondary antibody is added at room temperature, for 45 mm. It acts either of rabbit IgG [fragment F (ab ') _] anti-mouse Ig conjugated with biot e, diluted to 1/350 (Roche Molecular Biochemicals) or biotmyle anti-rabbit IgG, diluted to 1/300 (Boehrmger).
  • the peroxidase-streptavidme amplification complex (Dako, Denmark) is added for 30 mm at room temperature.
  • the cells are washed and the AEC substrate (amino-ethyl-carbazole, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) is deposited on the cells for 15 mm.
  • the reaction is stopped by adding distilled water.
  • the cells are counter-stained with hematoxylm and mounted on Glycergel.
  • cytosol samples (0.2 ml, 2.5 mg protein / ml), previously deteroidized by adsorption on carbon / dextran, are incubated with increasing concentrations of PREG [ 3 H] in a TEDG buffer at pH 8 , 5, at 40 ° C, for 30 mm.
  • the bound steroid is separated by gel filtration on Sephadex LH20 ® at 0-4 ° C.
  • the binding constants are determined with the Mac Ligand program.
  • FIG. 1 represents a Scatchard diagram of the specific bond.
  • Another steroid with a structure similar to PREG, namely 3 ⁇ -hydroxy-5 ⁇ -pregnane-20-one (5 ⁇ -dihydro-PREG) also appears to be an effective competitor, although 5 times less active than PREG.
  • DHEA is a weak competitor and DHEA sulfate has an almost negligible effect.
  • the preferred structures are C-21 steroids with a ketone group or an alcohol group in positions 3 and 20 and a ring A or B msature conferring a more planar structure on the skeleton of the steroid.
  • the pregnenolone binding sites are eluted using an exchange column Mono Q ® ions. 60 mg of cytosolic proteins in a TEDGCP buffer are loaded on the column and eluted with a NaCl gradient. 2 ml fractions are collected.
  • FIG. 2 shows the saturable bond of PREG [ 3 H] PREG (dpm x 10 ⁇ 4 ) (-o-) and the protein concentration (mg / ml) (0) in each fraction.
  • Peaks A and B filters on a Superose 12 ® column eluting with TEDGCP buffer containing 0.15 M NaCl.
  • cytosol binding protein could be a very high molecular protein associated with microtubules, which are major constituents of the neuronal cytoplasm.
  • FIG. 4 reports the immunoblot of the cytosol and of the peak A fractions eluted from the ion exchange columns and ironed on a gel filtration column.
  • Lane 1 corresponds to the raw cytosol; lane 2 at fraction A Mono Q ® ; lane 3 at fraction A subjected to a new chromotography on Superose 12 ® . 10 ⁇ g of protein are deposited on tracks 1 and 2. The amount of protein in track 3 is below the detection threshold.
  • the fetal microtubules have a Kd constant for PREG [ J H] of 42.9 nM and a Bmax of 3.7 pmol / mg of protein, which represents a 3-fold enrichment compared to the fetal brain cytosol.
  • the MAP fraction shows specific binding sites which increase when co-incubated with tubule.
  • the molar concentration of the binding sites is 14 nM and that of MAP . , based on an average MW of 200,000, approximately 200 nM.
  • microtubules are reconstituted m vi tro with purified tubule (1 mg / l) and MAP2 (0.05 mg / ml) in buffer A.
  • the increase in absorbance is measured at 345 nm, at 37 ° C and recorded every 30 sec. for 15 min.
  • the results are given in FIG. 6.
  • the assembly of microtubules is measured either in the absence of steroids (- -), or in the presence of 500 nM of steroid: PREG (- -), progesterone (-X-), estradiol (-V-), or in presence of both PREG and progesterone (-o-) or PREG and estradiol (- ⁇ -), each at a concentration of 500 nM.
  • Microtubules polymerized in the presence of PREG were analyzed to verify their appearance.
  • the calf brain tubule In the presence of calf brain MAP 2 , the calf brain tubule assembles into microtubules of normal appearance, that is to say characterized by a remarkably constant conformation and a uniform diameter. The microtubule structure remains completely normal when MAP. induces tubing polymerization in the presence of 500 nM PREG. Effects of pregnenolone on neuronal cultures
  • the fetal rat brain neurons are studied by immunocytochemistry after 3 days of culture.
  • the results are given in FIG. 7 where A, C, E correspond to a control culture for 3 days, B, D, F, to the addition of pregnenolone 1 ⁇ M the last 2 days of culture.
  • a and B a monoclonal anti-tubulin antibody is added, in C and D, a polyclonal anti-doublecortin antibody and in E and F, a monoclonal anti-MAP 2 antibody.

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Abstract

L'invention vise l'utilisation de stéroïdes et de composés non toxiques, capables de passer la barrière hémato-encéphalique caractérisés en ce qu'ils sont capables de lier le même site que la prégnènolone sur les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette et de déplacer la prégnènolone liée à MAP2, ainsi que d'influer sur l'assemblage et la stabilisation des microtubules. Application, notamment, au traitement du système nerveux, pour lutter contre le vieillissement des cellules contenant des MAPs, et pour le traitement de cancers.

Description

"Composés capables de se lier a des protéines constituantes ou associées aux éléments de cytosquelette et leurs applications pour la fabrication de médicaments".
L'invention concerne des composes capables de se lier a des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette
Elle vise plus specialemert leurs applications pour la fabrication de médicaments pour le traitement de patnologies impliquant des dysfonctionnements de ces protéines.
Le cytosquelette est un reseau complexe (voir référence bibliographique (1) en fin αe description) qui comprend les reseaux primaires de trois classes de filaments cytosquelettiques (microtubules, microfîlaments, et filaments intermédiaires) auxquels s'ajoute un reseau microtrabeculaire qui comprend la ma orité des protéines associées aux microtubules, microfîlaments et filaments intermédiaires. La protéine MAP (famille des Microbubules Associated Proteins décrites ci-apres1 est un exemple caractéristique de composant de ce reseau : elle possède "un domaine de liaison aux microtubules, mais également aux microfilaments (2,3) et aux filaments intermédiaires (4,5).
Les microtubules sont des cylindres creux de 25 mm de diamètre externe dont la paroi est constituée de protofîlaments, eux-mêmes formes par l'empilement de sous- unites globulaires α et β de tubulme (50 Kd) . Aux heterodimeres de tubulme sont associées, de façon périodique, les protéines appelées MAPS
Figure imgf000002_0001
associated proteins; dont le rôle est de faciliter l'assemblage de la tubulme, mais auss- l'organisation et les fonctions du reseau icrctubulaire La tubulme présente une grande hétérogénéité. Elle comprend en effet de nombreuses isoformes provenant a la fois de l'expression de plusieurs gènes et de très nombreuses modifications post-traductionnelles (6).
Les MAPS sont divisées en deux groupes a savoir, les MAP "structurales" impliquées dans l'assemblage des tubulines et les MAPΞ "motrices" qui utilisent les microtubules comme rails pour assurer le mouvement de certaines molécules et organelles.
Les MAPΞ structurales visées dans l'invention comprennent plusieurs familles de protéines a savoir, les protéines MAPi A et B (350 Kd) codées par des gènes distincts, les protéines MAP A et B de haut poids moléculaire (300 Kd) , les protéines MAP. C et D de bas poids moléculaire (70 Kd environ), les protéines MAP A et B (180 Kd) présentes dans les neurones jusqu'à 10 jours après la naissance, les protéines MAP4 A , B et C (215 a 240 Kd) ubiquitaires , à propriétés très voisines de celles de MAP., les protéines Tau (50-67 Kd ou 110-120 Kdj , les protéines STOP (145 Kd) , molécules très stabilisantes αes microtubules.
Dans le neurone, les microtubules sont impliques dans de nombreuses fonctions (la croissance neuπtique, le maintien de morphologies complexes comme les arborisations dendritiques, le transport axonal de molécules diverses). Par exemple, les protéines MAP. participent a l'arborisation dendπtique, alors que les protéines tau sont essentielles pour la croissance axonale. On sait également que les différents isotypes de chaque MAP ont une localisation et des rôles spécifiques. MAP. B augmente son expression du stade foetal au stade adulte. MAP- A s'exprime seulement à partir d'un certain stade de développement. MAP2 C (2), qui s'exprime essentiellement dans les stades précoces de développement, est encore présente dans le bulbe olfactif (7) et dans les cellules photoréceptrices de la rétine (8) de l'adulte. MAP2 D est localisée au niveau de l'hippocampe dès le stade foetal (3) .
Les microfilaments sont des polymères constitués d'actine (43 Kd) . Très abondants dans la région corticale de l'axone, on les trouve aussi dans la région centrale où ils participent à son architecture dynamique.
Les filaments intermédiaires des neurones, polymères constitués par un triplet de protéines (68, 150, et 200 Kd) , sont présents dans les neurones différenciés. Interconnectés avec les microfilaments et les microtubules, ils aident au maintien de l'architecture neuronale, les MAPS servant de pont entre les trois types de structures filamenteuses cytosquelettiques .
Après avoir mis en évidence, une liaison saturable de haute affinité dans le cytosol de cerveau de rat (foetus et adulte jeune) avec des stéroides, les inventeurs ont constaté que des préparations hautement purifiées de MAP2 possédaient les mêmes caractéristiques de liaison.
Des travaux in vi tro des inventeurs ont également démontré une action spécifique de stéroides sur la polymérisation des structures du cytosquelette. Or, actuellement, on considère que les effets des stéroides s'exercent par l'intermédiaire de récepteurs solubles intracellulaires d'une autre classe protéique. Ces récepteurs ont ete clones et souvent classes comme "nucléaires" du fait de leur mode d'action en tant que facteurs de transcription au niveau du génome.
Une série d'observations publiées au cours des 20 dernières années indique que αes récepteurs pour des stéroides fonctionnent également au niveau de la membrane plasmique de cellules cibles, l'action des neurostéroides au niveau de récepteurs des neurotransmetteurs en étant un exemple important .
En mettant en évidence une interaction directe de stéroides, plus spécialement de la pregnenolone (PREG en abrégé) , avec des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette, les inventeurs ont révélé un nouveau mécanisme d'action de ces composés, pouvant être avantageusement mis à profit pour intervenir sur toutes les fonctions impliquant les microtubules, filaments intermédiaires et microfîlaments, y compris la croissance, la différenciation, la plasticité des neurones, la prévention et la réparation des affections et lésions neurodégénératives, et plus généralement tous les phénomènes de division cellulaire.
De manière générale, ce nouveau mécanisme d'action concerne tout composé non toxique, capable de passer la barrière hémato-encéphalique, et capable de lier le même site que la
PREG sur lesdites protéines, ou de déplacer la PREG, et d'exercer un effet sur l'assemblage et la stabilisation des microtubules .
L'invention a donc pour but de fournir des composés capables de se lier aux protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette tels qu'identifies par une méthode de criblage, comprenant la mise en contact de ces composes avec lesdites protéines, dans des conditions permettant l'établissement d'une liaison lorsque la protéine, MAP par exemple, est un récepteur pour le composé .
L'invention vise tout particulièrement l'utilisation de tels composés pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant ces protéines.
Les composés utilisables selon l'invention pour la fabrication de médicaments sont plus spécialement des hormones stéroides, (ce terme étant utilise dans la description et les revendications pour couvrir leurs conjugues, comme les esters sulfates, ou les esters d'acides gras), leurs précurseurs, leurs métabolites, libres ou conjugués, ainsi que leurs analogues, stéroidiens ou non stéroidiens.
Comme précurseur d'hormones stéroides, on citera en particulier la pregnenolone ou ses esters, notamment le sulfate de pregnenolone (PREGS), pour lesquels aucun récepteur intracellulaire n'a ete identifié à ce jour.
Les analogues sont des agents pharmaceutiques capables d'augmenter la formation des microtubules, de les stabiliser dans les conditions données dans les exemples en rapport avec PREG, d'entrer en compétition avec PREG pour la liaison à MAPc et de passer la barrière hématoencéphalique en demeurant si possible séquestrés dans le système nerveux ( 9, 10, 11) .
Ils comprennent des composés polycycliques, naturels ou énantiomériques, éventuellement en mélanges, leurs sulfates, ou leurs dérivés lipidiques.
En tant que produits nouveaux, l'invention vise les produits d'addition et/ou de substitution élaborés à partir desdits composés d'une part et des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette d'autre part.
L'invention vise notamment les produits de couplage stéroides - protéines associées - microtubules, --en particulier, stéroides - MAP-, le cas échéant sous forme copolymérisée à la tubuline, ou stéroides - protéines tau sous forme copolymérisées à la tubuline.
L'invention vise également l'utilisation de protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette comme récepteurs de composés tels que définis ci-dessus.
L'action exercée par ces composés sur la polymérisation et la stabilisation des structures du cytosquelette, comme illustré dans les exemples, leur confère un grand intérêt pour fabriquer des médicaments.
L'invention vise donc l'utilisation desdits composés pour fabriquer des médicaments capables de se- lier spécifiquement a des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette a localisation cytoplasmique ou nucléaire pour le traitement de pathologies avec dysfonctionnement de ces protéines.
Elle vise notamment l'utilisation desdits composes pour fabriquer des médicaments pour le traitement du système nerveux, système nerveux central ou système nerveux périphérique. De tels médicaments permettent notamment de stimuler la différenciation/maturation des neurones.
L'invention vise en particulier la fabrication de médicaments adm istrables sous forme orale, en vue du traitement du système nerveux central, ou sous forme injectable, pour une administration par la voie générale ou m si tu .
D'autres formes d'administration entrent dans le cadre de l'invention, comme les solutions retard ou les pré-drogues avec conjugaison, par exemple, à un acide gras.
Pour augmenter la biodisponibilite, il est également prévu, selon l'invention, d'utiliser les principes actifs sous forme de dérivés appropriés, tels que les esters d'acides gras .
Dans ces applications, les médicaments fabriqués conformément à l'invention sont avantageusement utilisés en association avec des facteurs de croissance (NGF) et/ou des régulateurs cellulaires, comme l'mterféron ou les cyto mes . Des applications de grand intérêt comprennent la prévention ou le traitement d'affections telles que la maladie d'Alzheimer, les démences d'origine vasculaire, les conséquences de traumatismes et d'accidents vasculaires au niveau du système nerveux et les maladies neuro- degenératives .
L'invention vise également la fabrication de médicaments, à l'aide desdits composes, pour lutter contre le vieillissement des cellules nerveuses, ou de tout autre type cellulaire contenant des MAP3, comme les cellules epithéliales, les cellules thyroïdiennes, ou des glandes endocrines, stéroidogènes notamment.
Dans ces applications pour le traitement du système nerveux et du vieillissement des cellules, lesdits composés peuvent être utilisés en association avec des composés à effet stabilisateur du cytosquelette, tel que le Taxol® et le Taxotere®.
Dans la mesure où les deux types de molécules, composés stéroides ou analogues steroidiens ou non stéroidiens, d'une part, Taxol® ou Taxotere® ou équivalent, d'autre part, ont un effet stabilisateur des microtubules, il est possible d'envisager un phénomène de synergie si les deux médicaments sont utilisés simultanément. Dans ce cas les doses des deux médicaments requises pour une bonne efficacité seront très inférieures à celles requises lorsque les médicaments sont données en monotherapie .
Selon un autre aspect de grand intérêt de l'invention, les médicaments ci-dessus sont utilisables pour le traitement de cancers, en association avec des agents anticancéreux, et permettent de moduler l'effet de ces derniers, en particulier en cas de chimio-résistance .
De telles associations avec des agents à tropisme microtubulaire sont en effet susceptibles de potentialiser les effets respectifs des produits.
Dans ces différentes applications, les composés mis en oeuvre sont associés aux véhicules pharmacologiquement acceptables appropriés pour la forme galénique choisie. Les doses unitaires sont de l'ordre de 100 à 500 mg et les doses quotidiennes de l'ordre de 500 mg à 1 g pour une administration par voie générale, cette dose étant réduite pour une administration in si tu .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans la description qui suit , avec référence aux figures 1 à 7, qui se rapportent , respectivement,
- la figure 1, à la liaison à l'équilibre de PREG [3H] à du cytosol de cerveau foetal,
- la figure 2, à la chromatographie de cytosol de cerveau foetal par FPLC sur colonne échangeuse d'ions Mono Q,
- la figure 3, à la chromatographie des pics Mono Q par FPLC sur une colonne de gel filtration Superose 12,
- la figure 4, à 1 ' immunoblot du cytosol et des fractions de l'un des pics éluées des colonnes d'échange d'ions et de gel filtration, - la figure 5, la liaison à l'équilibre de PREG [JH] à MAP. purifiée, complexée ou non a de la tubulme purifiée,
- la figure 6, aux cinétiques d'assemblage de microtubules, et
- la figure 7, à 1 ' îmmunocytochimie de neurones de cerveau de rat foetal .
1 - Matériels et méthodes
Animaux
On utilise des rats Sprague -Dawley de l'élevage Janvier (Le Genest St Isle, France) . Les rats sont soumis à une alternance lumière-obscurité de 12 h (lumières à 8 h) à 20 °C et nourris à satiété.
Les femelles pleines (le matin après l'accouplement est designé par EO) sont hébergées dans l'animalerie au moins 7 jours avant le sacrifice à E18. On utilise aussi des mâles adultes de 60 à 70 jours.
Les cerveaux de veau utilisés sont débarrassés de méninges et des gros vaisseaux sanguins. Ils sont conservés dans une solution saline isotonique glacée.
Les animaux sont traites en conformité avec les dispositions de la Directive du Conseil de l'Union
Européenne du 24 novembre 1986 (86/609/EEC) . Matériels
- Stéroides :
La PREG [7-JH] (22,5 Ci/mmole) utilisée est un produit commercialise par NEN (Boston, MA, EUA) .
La progestérone, le sulfate de pregnenolone, la testosterone, la corticosterone, l'acetonide de tπamc olone, la 17α-OH PREG, la 17α-OH progestérone et le cholestérol sont des produits Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France)
- Enzymes :
La protemase K (Merck, Darmstadt Allemagne) et la Pronase (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) sont dissoutes a 1 mg/ml dans du tampon TNM contenant lO M de Tris, 0,1M de NaCl, 3mM de MgCl^ (pH 7,4). La deoxyπbonuclease I et la ribonuclease A sont des produits Sigma-Aldrich et sont ajustes, respectivement, a 100 Ul/ l et 5 Ul/ml. La phospholipase A2 (Roche Molecular Biochemicals) est diluée a 20 Ul/ml dans du TNM.
- Anticorps
L'anticorps monoclonal anti-α-tubulme N-356 est un produit Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Allemagne) . L'anticorps monoclonal 152 est un anticorps produit par l'un des inventeurs qui réagit spécifiquement avec une MAP2 de poids moléculaire eleve. Les dxfferents anticorps sont dilues dans du PBS contenant 3 de BSA.
Méthodes . Préparation du cytosol
On récupère des cerveaux foetaux, dont on enlevé les méninges et on les soumet a un rinçage avec un tampon d'homogénéisation a 4°C [lOmM de Tπs-HCl, a pH 8,5 contenant 1,5 mM d'EDTA, ImM de dithiothreitol, 10°o de glycerol, un mélange d'inhibiteurs de protease Complète® (Roche Molecular Biochemical) , dit tampon TEDG]
Les cerveaux de rats mâles adultes sont récupères après perfusion avec du PBS contenant 2 Ul/ml d'heparme. Les cerveaux sont pesés et homogénéises avec 4 vol. de tampon d'homogénéisation, dans des homogeneiseurs Potter verre/TeflonR, et centrifuges a 800 g pendant 10 mm.
Le surnageant est alors centrifuge a 100 000 g pendant 1 h a 4°C. Les échantillons sont utilises immédiatement pour les essais ou sont stockes dans de l'azote liquide jusqu'au moment de leur utilisation.
Les concentrations en protéines sont déterminées a l'aide du kit Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Canada) avec de la BSA comme standard de référence.
. Constantes de liaison a l'équilibre
Juste avant l'essai de liaison, chaque échantillon est purifie avec une suspension de dextran-charbon et des prélèvements de 2 ml de surnageant (cytosol purifie) sont ajoutes dans une série de tubes contenant la PREG [JH] à raison de 1 à 500 nM, avec ou sans stéroide non marque en excès de 1000 fois.
Les tubes sont mis a incuber a 45°C pendant 30 mm. La séparation du steroide lié et du steroide libre a été réalisée sur une minicolonne de Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia Biotech) .
Le comptage de la radioactivité dans les flacons a été effectué dans un spectrometre a scintillation liquide avec correction de l'atténuation (Tπ-carb 2100 TR , Packard) .
. Nature du composant liant la pregnenolone
1 ml de cytosol de cerveau est mis à incuber avec 0,2 ml d'une solution d'enzyme à 37°C pendant 30 mm. On étudie l'activité de liaison des échantillons (0,2 ml) ayant subi le traitement enzymatique ou des échantillons témoins dilués avec le tampon seul.
. Essais de compétition
Dans les essais de compétition entre la pregnenolone et différents stéroides pour la liaison étudiée, on fait incuber 0,2 ml de cytosol avec 100 nM de PREG [°H] et un excès de 1, 10, 100 et 1000 fois en stéroide non radioactif . . Chromatographie d'échange d'anions
Le système FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) a ete équipe d'une colonne echangeuse d'anions (5ml Econo-Pac High Q,
La colonne a ete équilibrée avec un tampon TEDG contenant 0,03% de CHAPS et 100 nM de PREG (tampon TEDGCP) a 4°C.
Le cytosol (20 ml, 60 mg de protéine) est applique et élue a une vitesse de 1 ml/mm avec le tampon TEDGCP pendant 20 mm.
On recueille des fractions de 2ml. On applique alors un gradient linéaire de NaCl dans TEDGCP pour atteindre une concentration de NaCl 1M après 30 mm., suivi de l'application isocratique de NaCl 1 M dans un tampon TEDGCP.
Les fractions appropriées sont reunies ; les sels sont élimines par passage a travers des minicolonnes de dessalage Hi Trap® (Amersham Pharmacia Biotech) .
- Gel filtration
On équilibre la colonne Superose 12 (1 x 30 cm, Amersham Pnarmacia Biotech) avec du tampon TEDGCP contenant 0,15 M de NaCl, à 4°C.
Le débit est ajuste a 0,25 ml/mm. et on recueille des fractions de 0,4 ml. - Contrôle de la purification des protéines
A chaque étape de purification, on incube les fractions collectées avec la PREG [JH] 100 nM en l'absence ou avec un excès de 100 fois de PREG non radioactive. On détermine alors la liaison saturable.
- Western blots
Du cytosol brut et des échantillons partiellement purifiés
(10 μg de protéine) sont séparés par SDS-PAGE à 10%, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose . Les membranes sont bloquées par incubation dans 5% de lait écrémé contenant 0,1% de Tween 20 , ajouté à un tampon Tris® (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 8,8), pendant 1 h, à température ambiante. Tous les lavages sont effectués dans du tampon Tris contenant 0,1% de Tween 20® (tampon TNT) . Les membranes sont ensuite mises à incuber avec des anticorps anti-tubuline (1 : 2000), ou des anticorps monoclonaux anti-MAP2 (1 : 1000), à 4°C, pendant 14 h environ.
L'incubation avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris [fragment F(ab')2], couplé à la peroxydase, 1/10000, (Pierce, Rockford, 111., EUA) est réalisée dans un tampon TNT contenant 5% de lait, pendant 45 min., à température ambiante. Le signal est détecté par un système de chimioluminescence ECL (Amersham Pharmacia Biotech) , avec un film Kodak Y-Omat, en suivant les instructions du fabricant. - Préparation des protéines de microtubules
Les cerveaux de veau sont laves 2 fois dans un tampon L (MES 0,1 M, EGTA 1 M, EDTA 0,1 mM, MgCl 1 mM, dithiothreitol 1 mM et PMSF 1 mM, pH 6,4).
On prépare les microtubules a partir de cerveau de veau ou de cerveau de rat adulte ou foetal selon un procède d'assemblage/ desassemblage, en fonction de la température, m vi tro (12) .
La tubulme de veau est purifiée selon le protocole de Weingarten et al (13), mais l'étape utilisant la phosphocellulose est remplacée par une chromatographie sur colonne d'échange de cations (Fractogel Merck) (14). Les microtubules et la tubul e sont prépares dans le tampon L, supplemente par 1 mM de GTP (tampon A) .
Les protéines tau et MAP. sont purifiées selon le protocole de Fellous et al (12) par denaturation des microtubules par la chaleur et gel filtration sur colonne, le Sephacryl 300® étant utilise a la place de l'Ultrogel ACA 34. Les protéines tau sont ensuite encore purifiées selon la méthode de Lmdwall et Cole (15) .
- Mesure de l'assemblage des microtubules
Cet assemblage est mesure en contrôlant les augmentations de turbidite avec un spectophotometre UVICON® (Kontron Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France) . - Culture des neurones
On procède a des cultures primaires de neurones de foetus E17 selon El-Etr et al (16). Brièvement, cette méthode consiste à étaler les cellules dissociées (200 000 cellules/cm-) sur des lamelles de verre recouvertes de poly-1-ornιthme et mises en culture dans un milieu complètement défini dans 5° αe CO; a 37 °C. Les conditions de culture utilisées permettent d'obtenir une population neuronale pratiquement pure.
24 h après l'ensemencement, on ajoute de la pregnenolone 1 micromolaire (concentration finale d'éthanol 0,01%) ou le solvant seul et on poursuit les cultures pendant 2 jours. Les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4%, puis congelées à -80°C. En temps utile, elles sont réhydratées par des passages de 5 mm dans de l'éthanol à des concentrations de 100, 90 et 70%. Après 2 lavages dans du PBS, pendant 5 mm, les cellules sont incubées dans du PBS contenant 3% de BSA et 0,1% de Triton X100®, à température ambiante, pendant 1 h.
Après 4 lavages dans du PBS, les cellules sont mises à incuber à 37 °C pendant 1 h, puis à 4°C pendant environ 14 h, en présence soit d'anticorps monoclonal anti-α-tubulme dilué à 1/2000 ou d'anticorps monoclonal antι-MAP2 dilué à 1/1000 ou d'antisérum anti-double cortine dilué à 1/300.
Après 3 lavages dans du PBS, on ajoute l'anticorps secondaire à température ambiante, pendant 45 mm. Il 'agit soit d'IgG de lapin [fragment F(ab')_] anti-Ig de souris conjugué à de la biot e, dilué a 1/350 (Roche Molecular Biochemicals) ou d'IgG anti-lapin biotmylee, diluée a 1/300 (Boehrmger) .
Apres 3 lavages, le complexe d'amplification peroxydase- streptavidme (Dako, Danemark) est ajouté pendant 30 mm a température ambiante.
Les cellules sont lavées et le substrat AEC (amino-ethyl- carbazole, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) est déposé sur les cellules pendant 15 mm. La réaction est arrêtée par addition d'eau distillée. Les cellules sont contre colorées avec de 1 ' hematoxylme et montées sur Glycergel .
- Microscopie électronique
Après polymérisation des microtubules induite par MAP2 en l'absence ou en présence de la substance à tester, une partie aliquote de l'échantillon expérimental est déposée sur une grille hydrophile (300 mesh) revêtue de carbone. Les grilles sont traitées par une solution aqueuse d'acétate d'uranyle à 1%. Les observations sont effectués avec un microscope électronique Philips CM12.
- Analyses statistiques
Les données de liaison à l'équilibre sont analysées avec le programme Mac Ligand, adapte de Munson et Rodbard (17) . Les courbes sont tracées avec le logiciel kaléidograph TM 3.0 (Abelbeck software, Ritme Informatique, Paris) . 2 - Résultats
Sites de liaison de la pregnenolone dans le cerveau de rat.
Les échantillons de cytosol (0,2 ml, 2,5 mg de protéine/ml) , préalablement désteroidés par adsorption sur charbon/dextran, sont mis à incuber avec des concentrations croissantes en PREG [3H] dans un tampon TEDG a pH 8,5, à 40°C, pendant 30 mm.
Le stéroide lié est séparé par gel filtration sur Séphadex LH20® à 0-4 °C. Les constantes de liaison sont déterminées avec le programme Mac Ligand.
La figure 1 représente un diagramme de Scatchard de la liaison spécifique.
On observe une constante Kd de 31,0 ± 0,8 nM et une concentration maximale des sites de liaison (Bmax) de 1,2 ± 0,1 pmol/mg de protéine (moyenne ± erreur - type, n = 3) .
Pour étudier les effets d'enzymes hydrolytiques sur la liaison de la PREG [JH] , on a utilisé des échantillons de 1 ml de cytosol incubés avec 0,2ml d'une solution d'enzyme, à 37°C, pendant 30 mm. Les résultats obtenus, exprimés en °0 de l'incubation témoin (cytosol dilué dans du tampon) sont rapportés dans le tableau 1 (moyenne ± écart - type (n-3) ) . TABLEAU 1
Enzyme Concentration/ml % de témoin
Protemase K 0,17 mg 42,2 ± 7,5
Pronase 0,17 mg 40,5 ± 5,7
Deoxyπbonuclease 1 17 UI 99,4 ± 12,7
Ribonuclease A 0,8 UI 82,4 ± 9,2
Phospholipase A2 33 UI 85,0 ± 7,3
On constate que les sites de liaison de la PREG [3H] sont détruits a raison d'environ 60% par la protemase K et la Pronaseκ. Au contraire, on n'observe pas d'effet significatif avec la DNAase, la RNAase et la phospholipase A2.
Pour étudier la spécificité de la liaison de la PREG [3H] , différents stéroides ont ete utilises.
On a détermine les index de compétition relative en tant que rapports des concentrations du compétiteur (en dénominateur) versus PREG entraînant une diminution de 50% de la liaison spécifique de PREG [1H] x 100 (moyenne ± écart - type, n = 3) . Les résultats sont donnes dans le tableau 2.
TABLEAU 2
"~~~™~~Stéî dê7" R.C.R 50
Pregnenolone 100
Sulfate de pregnenolone 78,8 ± 7,0
Progestérone 72,1 ± 17,7
Δ5- Prégnène-3β,20α-diol 68,4 ± 15,3
3β-hydroxy-5α-prégnane 20-one 18,4 ± 4,0
Testostérone 5,6 ± 2,8
Déhydroépiandrostérone 4,3 ± 2,6
Estrone 4,4
Corticostérone 2,8
Androstènediol 1,7
Estradiol 1,3
Acétonide de triamcinolone 1
17 -hydroxy-prégnènolone 0, 85
17α-hydroxy-progestérone 0,79
Sulfate de DHEA 0,045
Cholestérol 0,02
On constate que les meilleurs compétiteurs pour la liaison de PREG [JH] sont le sulfate de pregnenolone, la progestérone, et le Δ5-prégnène-3β, 20α-diol (20α-dihydro- prégnènolone) .
Un autre stéroide, possédant une structure similaire à la PREG, à savoir la 3β-hydroxy-5α-prégnane-20-one (5α- dihydro-PREG) se révèle également un compétiteur efficace, bien que 5 fois moins actif que PREG. Parmi les autres stéroides testes, la DHEA est un faible compétiteur et le sulfate de DHEA a un effet pratiquement négligeable .
Les structures préférées sont des stéroides en C-21 avec un groupe cétone ou un groupe alcool en positions 3 et 20 et un cycle A ou B msature conférant une structure plus plane au squelette du stéroide.
D'autres essais réalises avec des cerveaux de rat adulte donnent des résultats du même ordre, montrant que le cerveau contient un composant liant la PREG, avec des constantes de liaison similaires a celles du cerveau foetal (Kd = 50,7 nM, Bmax = 0,75 pmol/mg de protéine) .
Purification de la protéine de liaison du cytosol . Chromatographie sur colonne Mono Q
Les sites de liaison de la pregnenolone sont élues à l'aide d'une colonne echangeuse d'ions Mono Q®. 60 mg de protéines cytosoliques dans un tampon TEDGCP sont chargés sur la colonne et élues avec un gradient de NaCl. On recueille des fractions de 2 ml. On rapporte sur la figure 2 la liaison saturable de PREG [3H] PREG (dpm x 10"4) (-o-) et la concentration de protéines (mg/ml) ( 0 ) dans chaque fraction.
Les fractions du pic A (fractιonsl7 a 19 : 4,5 mg de protéine) et celles du pic B (fractions 23 à 25 : 1,1 mg de protéine) sont reunies séparément. Les sels des 2 fractions sont éliminés et les fractions sont concentrées et soumises a une gel filtration. . Chromatographie sur Superose 12®
Les pics A et B sont filtres sur une colonne Superose 12® (élution avec le tampon TEDGCP contenant 0,15 M de NaCl) .
On recueille des fractions de 0,4 ml. On mesure la liaison spécifique de PREG [JH] sur chaque fraction de la colonne calibrée avec des marqueurs de poids nucléaire. On rapporte les résultats obtenus sur la figure 3 qui donne, pour chaque fraction, la liaison saturable de PREG [JH] (-o-) en dpm x 10~4 et la concentration des protéines en mg/ml
( Δ ) . On note la présence de 2 pics de 40-60 kDA
(fraction A) et de plus de 440 kDa (fraction B) .
La présence d'un composant à très haut poids moléculaire suggère que la protéine de liaison du cytosol pourrait être une protéine de très haut moléculaire associée aux microtubules, qui sont des constituants majeurs du cytoplasme neuronal.
Il convenait de vérifier la présence dans la fraction A de composants du système microtubulaire . A cet effet les pics de liaison de la PREG ont été soumis à une SDS-PAGE, suivie d'un immunoblot. On rapporte sur la figure 4 1 ' immunoblot du cytosol et des fractions du pic A éluées des colonnes d'échange d'ions et repassées sur colonne de gel filtration. La piste 1 correspond au cytosol brut ; la piste 2 à la fraction A Mono Q® ; la piste 3 à la fraction A soumise à une nouvelle chromotographie sur Superose 12®. 10 μg de protéine sont déposes sur les pistes 1 et 2. La quantité de protéine dans la piste 3 est inférieure au seuil de détection.
On constate que les protéines qui reagissent immunologiquement avec les anticorps antι-MAP2 et anti- tubul e (α et β) ont été enrichies dans ces préparations partiellement purifiées, et ce en proportion compatible avec l'augmentation d'activité de liaison spécifique. Le faible poids moléculaire des polypeptides reconnus par les anticorps anti-MAP. suggère que des cassures de la (des) protéine (s) MAP de 300 (ou 70) Kd se sont produites durant la purification de la protéine cytosolique.
Liaison de PREG [3H] à des microtubules de cerveau de rat purifié .
On a déterminé la liaison de la PREG [JH] aux microtubules préparés par des cycles de polymérisation/dépolymérisation.
Les microtubules foetaux ont une constante Kd pour PREG [JH] de 42,9 nM et une Bmax de 3,7 pmol/mg de protéine, ce qui représente un enrichissement de 3 fois par rapport au cytosol de cerveau foetal.
La spécificité du ligand apparaît inchangée [RCR :
PREG (100) > PREGS (78,8) > PROG (72,1) » Testostérone
(5,6) > DHEA (4,3) >estradιol (1,3)].
Les microtubules adultes ont une constante Kd pour PREG [JH] de 54,8 nM et une Bmax de 3,4 pmol/mg de protéine, ce qui représente un enrichissement de 4,5 fois comparé au cytosol de cerveau adulte.
Activités de liaison de la pregnenolone à MAP., à la tubulme et a la protéine tau purifiées.
On fait incuber de la tubul e de cerveau de veau purifiée (90 μg/ml) , de la MAP2 (45 μg/ml) ou de la protéine tau (25 μg/ml) avec PREG [JH] lOOnM sans ou avec un excès de 1000 fois de PREG non radioactive.
On constate que ni la tubulme, ni la protéine tau, ni l'IgG de lapin ne lient PREG [°H] d'une manière saturable.
Au contraire, la fraction MAP. montre des sites de liaison spécifiques qui augmentent lorsqu'on procède à une co- mcubation avec de la tubulme.
Les constantes de liaison à l'équilibre de MAP. de veau purifiée sont les suivants : Kd=39,2 nM, Bmax = 16pmol/mg de MAPo alors que celles des copolymeres MAP2-tubulme sont : Kd=44,0 nM, Bmax=135 pmol/mg de MAP2.
Il apparaît donc que la liaison de MAP2 à la tubul e ne modifie par l'affinité de la PREG, mais augmente au contraire la concentration des sites de liaison de plus de 8 fois.
Sur la figure 5, on rapporte les valeurs B/U en fonction de B en nM, (-o-) représentant la liaison à l'équilibre de
MAP; de cerveau de veau purifiée et (-o-) , la liaison a l'équilibre de MAP. de cerveau de veau purifiée associée à de la tubul e purifiée de cerveau de veau (pour les détails expérimentaux, voir la figure 1) .
La concentration molaire des sites de liaison est de 14 nM et celle de MAP., en se basant sur un PM moyen de 200 000, d'environ 200 nM.
On constate donc que moins de 10% des molécules de MAP2 peuvent se lier à PREG [JH] .
Le remplacement du tampon A par le tampon TEDG n'influe pas sur les constantes de liaison de la pregnenolone à 1 ' équilibre .
La spécificité de liaison des stéroides aux copolymeres de MAP2-tubulme est très proche de celle des microtubules foetaux [RCR : PREG (100) > PREGS (91,5) > PROG (81,3) » estradiol (3,2) > Testostérone et DHEA (2,3)].
Effets des stéroides sur les cinétiques d'assemblage des microtubules
Les microtubules sont reconstitués m vi tro avec de la tubulme purifiée (1 mg/ l) et MAP2 (0,05 mg/ml) dans du tampon A.
L'augmentation d'absorbance est mesurée à 345 nm, à 37°C et enregistrée toutes les 30 sec. pendant 15 min.
Les résultats sont donnés sur la figure 6. L'assemblage des microtubules est mesure soit en l'absence de stéroides (- -), soit en présence de 500 nM de stéroide : PREG (- -) , progestérone (-X-), estradiol (-V-), soit en présence a la fois de PREG et de progestérone (-o-) ou de PREG et d'estradiol (-Δ-) , chacun a une concentration de 500 nM.
L'augmentation de l'absorbance a 345 nM montre que la PREG induit une forte augmentation a la fois de la vitesse et de l'étendue de l'assemblage de la tubulme. L'estradiol, qui ne se lie pas a MAP., est inactif. Cependant, la progestérone, qui montre une affinité pour MAP du même ordre que celle de la PREG, est également sans effet. Contrairement a l'estradiol, elle contrecarre l'effet stimulateur de la PREG sur l'assemblage des microtubules. Le sulfate de PREG a des effets semblables à celles de la progestérone .
Analyse par microscopie électronique
On a procédé a l'analyse des microtubules polymérisés en présence de PREG pour vérifier leur aspect.
En présence de MAP2 de cerveau de veau, la tubulme de cerveau de veau s'assemble en microtubules d'apparence normale, c'est-à-dire caractérises par une conformation remarquablement constante et un diamètre uniforme. La structure des microtubules reste complètement normale lorsque MAP. induit la polymérisation de tubul e en présence de 500 nM de PREG. Effets de la pregnenolone sur les cultures neuronales
On étudie les neurones de cerveau de rat foetaux par immunocytochimie après 3 jours de culture. Les résultats sont donnés sur la figure 7 où A, C, E correspondent à une culture témoin de 3 jours, B, D, F, à l'addition de pregnenolone 1 μM les 2 derniers jours de culture. Dans A et B, on ajoute un anticorps monoclonal anti α-tubuline, dans C et D, un anticorps polyclonal anti-doublecortine et dans E et F, un anticorps monoclonal anti-MAP2.
La coloration avec les anticorps monoclonaux anti-α tubuline ou anti-doublecortine ne montre aucune différence entre les cultures témoins et les cultures exposées à de la pregnenolone 1 μM pendant 2 jours. Au contraire, l'exposition à la pregnenolone augmente 1 ' immunomarquage de MAP2 des corps cellulaires et induit son extension aux neurites proches (voir les flèches) .
Etude de la capacité compétition de divers composés avec la pregnenolone
On rapporte dans le tableau ci-après les résultats obtenus avec 11 dérivés de stéroides.
Pregnenolone
Figure imgf000030_0001
Indice de Compétition
Composés Cytosol MT MAP-2c + à Grande Capacité Compétitrice (Rat) (Bœuf) Tubuline
PREG Tosylate 107 121 129
Figure imgf000030_0002
3β-0H- 5 , 14 Prégnadiène-20-one 102 95
Figure imgf000030_0003
Indice de Compétition
Composés Cytosol MT MAP-2c + à~—G. ran—de Capacité Compétitrice (Rat) (Bœuf) „, Tub„uline
Prégna-5-ène-3β, 20α-diol 100 (Bœuf)
3β-OH-Prégna-5-ène-20-one-21- 80 107
Figure imgf000031_0001
acétoxy
(Sigma) (Porcelet!
c≈o S? PREG-acétate 79
CH,
Indice de Compétition
Composés Cytosol MT MAP-2c + à Grande Capacité (Rat) (Bœuf) Tubuline
Compétitrice
PREG-16α-méthyl 80
Figure imgf000032_0001
97
Figure imgf000032_0002
PREG-16α-cyclohexylamine 59 81 (Porcelet)
Prégna-16α-17α-méthylène 62 59
Figure imgf000032_0003
Figure imgf000032_0004
Les résultats montrent que les stéroides testés se lient au même site que la PREG sur les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette.
J ",J -*
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Composés non toxiques, capables de passer la barrière hémato-encéphalique caractérisés en ce qu'ils sont capables de lier le même site que la pregnenolone sur les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette et de déplacer la pregnenolone liée à MAP , ainsi que d'influer sur l'assemblage et la stabilisation des microtubules.
2/ Produits d'addition élaborés à partir des composés selon la revendication 1 ou de stéroides d'une part, et des protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette d' autre part .
3/ Produits d'addition selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'il s'agit de stéroides - protéines associées microtubules, notamment de stéroides - MAP2, le cas échéant sous forme copolymérisée à la tubuline, ou de stéroides ..- protéines tau sous forme copolymérisées à la tubuline.
4/ Utilisation de protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette comme récepteurs de stéroides ou de composés selon la revendication 1.
5/ Utilisation de stéroides ou de composés selon la revendication 1, pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant les protéines constituantes ou associées aux éléments du cytosquelette.
6/ Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le stéroide est la pregnenolone ou son sulfate. 7/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour le traitement du système nerveux, système nerveux central ou système nerveux périphérique.
8/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les médicaments se présentent sous forme orale en vue du traitement du système nerveux, ou sous forme injectable, pour une administration par la voie générale ou m si tu, ou encore sous forme de solutions retard ou de pré-drogues avec conjugaison, par exemple, a un acide gras.
9/ Utilisation selon la revendication 7 ou 8 pour fabriquer des médicaments pour la prévention ou le traitement d'affections telles que la maladie d'Alzhei er, les démences d'origine vasculaire, les conséquences de traumatismes et d'accidents vasculaires au niveau du système nerveux et les maladies neuro-dégénératives .
10/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour lutter contre le viellissement des cellules nerveuses, ou de toute autre type cellulaire contenant des MAPΞ, comme les cellules épithéliales, les cellules thyroïdiennes, ou des glandes endocrines.
11/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 en association avec des composés à effet stabilisateur du cytosquelette, tel que le Taxol®.
12/ Utilisation selon la revendication 5 ou 6, pour fabriquer des médicaments pour le traitement de cancers, en association avec des agents anticancereu .
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