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WO2001052869A2 - Präparat und verfahren zur behandlung von sclerotinia-infektionen - Google Patents

Präparat und verfahren zur behandlung von sclerotinia-infektionen Download PDF

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WO2001052869A2
WO2001052869A2 PCT/HU2001/000005 HU0100005W WO0152869A2 WO 2001052869 A2 WO2001052869 A2 WO 2001052869A2 HU 0100005 W HU0100005 W HU 0100005W WO 0152869 A2 WO0152869 A2 WO 0152869A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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pseudomonas
azotobacter
azospirillum
infections
strains
Prior art date
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PCT/HU2001/000005
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WO2001052869A3 (de
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Gyula Beszedics
József HEGÓCZKY
Gyula Jusztusz
Mihály KECSKÉS
Gábor VERECZKEY
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BIO-MIKRO KFT
Original Assignee
BIO-MIKRO KFT
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom

Definitions

  • the invention relates to a preparation and a method for the treatment of
  • the subject matter of the invention is a preparation which contains a mixture of environmentally friendly bacteria and can preferably be used for the treatment of Sclerotinia infections.
  • Sclerotinia spp. are common dangerous pathogens in agriculture and horticulture all over the world. With Sclerotinia spp. are fungi living in etoden, between whose hyphae threads black hard structures, the so-called sclerotia, develop. These show a considerable morphological variety, in some species they develop on or in the roots of the plants, in others in the plant tissue. They are very hardy and can survive in the soil for several years. In spring they germinate, form pharmacies, and from these grow the fruiting bodies, which have a characteristic trumpet shape and can grow up to 10 mm high. 8 ascospores form in the fruiting bodies (asci).
  • Sclerotinia infections which contains strains of the genera Azospirillum, Azotobacter and Pseudomonas as active ingredient, optionally together with the usual carriers and other auxiliary substances.
  • the invention further relates to a method for the treatment of 5 Sclerotinia infections.
  • the preparation according to the invention is applied to the plants or their habitat in an effective amount.
  • the active ingredient of the preparation according to the invention is a bacterial mixture consisting of strains of the genera Azospirillum, Azotobacter and 10 Pseudomonas.
  • the gram-negative species Azospirillum sp. can, under the microaerobic conditions in the soil (which means about 1-2% oxygen content) come into close contact with the roots of the plants, settle in the upper tissue layers of the roots, reduce the free atmospheric nitrogen to .5 ammonia and this ammonia of the plant to hand over.
  • This type of microorganism which also requires the presence of a plant to bind nitrogen, is referred to collectively as associative nitrogen binder.
  • plant hormones and growth substances that can be useful for the development of the plant.
  • the gram-negative bacteria Azotobacter also live in the soil, freely or occasionally in symbiosis with plants, and - in contrast to the associative Nitrogen binders - they are also able to reduce the nitrogen in the air to ammonia, which they use to ensure the nitrogen supply to crops.
  • the Azotobacter strains can be selected on the basis of the measurement of the activity of the enzyme nitrogenase (Dilworth, MJ: Biochim. Biophys. Acta 127, 285 (1966)). The effectiveness of nitrogen binding and the formation of other compounds that have a beneficial effect on crops have been proven by laboratory tests and experiments on small plots.
  • Certain microorganisms including the strains of the genus Pseudomonas, are able to dissolve the insoluble phosphorus into a form that the plant can absorb. This is necessary because there is enough phosphorus in the soil, but in the form of inorganic phosphates that cannot be used by the plant (e.g. apatite).
  • the sources of soluble phosphorus compounds, the phosphorus mines, are drying up all over the world; It should also be mentioned that the excessive use of phosphorus and nitrogen-rich artificial fertilizers leads to acidification of the soil, to nitrate accumulation in the water, which promotes the algae (eutrophy) of the water.
  • the selection for the ability to dissolve phosphate can be carried out on a glucose-free or glucose-containing medium containing 1% hydroxyapatite and 10% tricalcium phosphate.
  • the strains of the genus Pseudomonas are able to synthesize siderophores and phytoho ⁇ nones (for example auxins and gibberellic acid).
  • siderophores can concentrate iron even in the presence of only small amounts of iron. This process can inhibit the multiplication of other disease-producing microorganisms by depriving them of the iron that is essential for their vital functions.
  • the production of siderophores can be examined by inhibiting the growth of an Escherichia coli strain; the selection is made on the same basis.
  • the biosynthesis of gibberellic acid can be observed and measured from the plant hormones. Thin-layer chromatographic methods can be used for strain selection.
  • the morphology of the individual strains can be described as follows. Azotobacter sp.
  • the cells which can be moved in one to two days, have Perittch flagella, whose wavelength is 2.5-3.3 ⁇ m, amplitude 0.37-0.76 ⁇ m.
  • the colonies are not slimy, but they can be of different shapes depending on the amount of extracellular polysaccharides produced.
  • Ammonium and nitrate ions can be used as the nitrogen source, and the hydrolysis can be carried out with ⁇ -amylase or ⁇ -amylase.
  • the G + C content of the DNA is 65.8-67.6 mol%.
  • the cells are spiral. They are gram-negative and move in liquid media using a single polar flag, while numerous lateral flagella are formed on solid culture media.
  • the cells are chemo-organotrophic, i.e. of mainly respiratory metabolism. Aerobic, micro-aerophilic. Oxidase-positive; generally also catalase positive. The cells are capable of nitrous oxide fixation under microaerobic conditions. They accumulate poly-ß-hydroxybutyrate. The G + C content of the DNA is 69-71 mol%. Pseudomonas sp.
  • the species has 5 biovars, which are heterogeneous in their nutritional properties.
  • Pseudomonas fluorescens can be regarded as Biovar I and its type strain also belongs to this group. They are straight or curved, non-helical gram-negative rods with a diameter of 0.5-0.8 ⁇ m and a length of 1.5-2.8 ⁇ m. They do not form prostheses and are not surrounded by a shell. Cell wall and membrane are the characteristic of Gram-negative bacteria. They move with the help of polar flagella. Your metabolism is strictly bound to oxygen as a terminal electron acceptor. Xanthomonaddins are not produced.
  • the bacteria do not need organic growth factors, they are oxidase and catalase positive and chemoorganotrophic; they can utilize a wide variety of organic compounds as sources of carbon, nitrogen and energy.
  • the optimal growth temperature is 25-30 ° C, below pH 4.5 there is no growth. They contain different pigments.
  • the best known soluble pigment, pioverdin is abundantly formed on low-iron nutrient media, and the fluorescence changes from white to bluish green in UV light. The maximum UV The wavelength is around 400 nm.
  • the G + C content of the DNA is 59.4-61.3 mol%.
  • Type strain ATCC 3525. Pseudomonas spp. are widespread in nature.
  • strains are particularly preferably used, which were deposited by the authors of the present invention in the strain collection of the Budapest University of Horticulture and Food Industry: NCAIM (P) 001279 Azotobacter sp. Sarret, NCAIM (P) B 001280 Azospirillum sp. Särret and NCAIM (P) B 001281 Pseudomonas sp. Särret.
  • NCAIM (P) 001279 Azotobacter sp. Sarret NCAIM (P) B 001280 Azospirillum sp. Särret
  • NCAIM (P) B 001281 Pseudomonas sp. Särret NCAIM (P) 001279 Azotobacter sp. Sarret
  • NCAIM (P) B 001280 Azospirillum sp. Särret and NCAIM (P) B 001281 Pseudomonas
  • the finished culture of the respective fermenter is the inoculum for the fermenter following in the order.
  • the composition of the nutrient medium in the fermenters is the same, only the nutrient medium of the starter culture, which is grown in shake flasks, is different.
  • the fermenter with 10 1 volume is sterilized in an autoclave (30 min, 1.2 bar, 121 ° C).
  • the 100 liter fermenter and the larger ones are sterilized by direct introduction of steam (1.3 bar, 130 ° C).
  • the glucose is sterilized as a 50% aqueous solution separately in an autoclave (30 min, 1.2 bar, 121 ° C).
  • the fermentation time is 24 hours, the cultivation time is 24 hours, the shaking frequency is 200 min "1.
  • the air requirement is 1 dm 3 / dm 3 min, for volumes> 100 liters 0.4 clm 3 / dm 3 min.
  • Glanopon is used as a defoamer.
  • the number of cells in the fermentation broth has depending from the culture values of 5 x 10 8 - reaches 10 9 / cm 3: Azospirillum sp at. and Azotobacter sp. 504 5x 10 8 - 10 9 / cm 3 , in Pseudomonas sp. 4 x 10 3 - 8 x 10 5 / cm 3 .
  • the fermentation broth must be cooled. It is then processed, packaged and stored under sterile conditions.
  • the amount of azospirillum is generally 20-30% by mass, preferably 25
  • That of Azotobacter generally 20-30% by mass, preferably 25
  • the preparation according to the invention can be successfully used in various plant crops, in particular crops of oil plants such as oilseed rape, soybeans and sunflowers, vegetables and cereals, to combat Sclerotinia infections.
  • the bacterial mixture itself or in the form of a suitable preparation is applied to the plants to be treated or their habitat.
  • Suitable preparations are, for example, liquid formulations, such as solutions, suspensions and concentrates, and also solid formulations, for example powders, scattering agents, wettable powders, pastes and granules.
  • the preparations are manufactured in a manner known per se.
  • the fermentation broth is generally thickened. This can be done gently, for example, by centrifugation, ultrafiltration and separation.
  • the volume of the fermentation broth can be reduced to 10% of the original volume by means of ultrafiltration.
  • the concentrate obtained can be stored at low temperatures for a long time (up to one year). Before use, it only needs to be diluted to the desired application concentration.
  • the concentrate is mixed with a carrier material and the mixture is dried under mild conditions.
  • Organic materials for example water-insoluble biopolymers, lignocelluloses, such as plant stems, straw, starch-containing plant seeds, for example rice, wheat and barley, and by-products from agriculture and the food industry are preferably used as the carrier material.
  • inorganic materials for example pearlite, diatomaceous earth and sand, and also synthetic materials, for example polyurethane foam and other plastic foam, as the carrier material.
  • the formulations may contain the usual additives and auxiliaries as further components. Stabilizers, antioxidants, dispersants, fillers, binders and dyes can be considered as such. Microbiological nutrients, for example carbon source, nitrogen source and water, can also be used as additives, which are then used by the bacteria for the growth and production of metabolites.
  • the formulations generally contain the bacterial mixture in an amount of 0.1-99% by mass, preferably 0.5-95% by mass.
  • Treatment is carried out in the usual way, for example by watering, spraying, sriihening, sprinkling or injecting into the soil.
  • the treatment is carried out before sowing or after sowing, but before emergence. Treatment before sowing is preferred; After preparing the soil, the formulation is applied to the surface and then incorporated into the top layer of the soil.
  • the application amount is generally 5-50 l / ha, preferably 10-30 1 ha, based on the bacterial mixture. This amount is generally applied with 50-5001 / ha, preferably 80-300 1 / ha, of water.
  • Example 1 The cultivation of the microorganism 1.1 Maintenance of the strain 1.1.1 To maintain the Azospirillum sp. the following nutrient medium is used: 1 g meat extract, 2 g yeast extract, 5 g peptone, 5 g NaCl, 15 g agar, 1 dm 3 dest. Water (pH ⁇ 7.4), temperature 30 ° C.
  • the nutrient solution has the following composition: 14 g glucose, 26 g molasses, 15 g corn steep liquor (50 mass% dry matter content), 5 g yeast extract, 4 g acid casein, 2 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g NH4NO3, 2 g CaCO 3 , 2 g KH 2 PO 4 , 1 g NaCl, 3 g MgSO 4 , 4.6 g trace element solution *) *)
  • the trace element solution has the following composition: 210 mg
  • FeSO 4 • 7H O 11 mg FeCl 3 • 6H 2 O, 2 mg MnSO 4 • H 2 O, 2 mg CuSO 4 • 5H O, 2 mg Na 2 MoO 4 , 2 mg CoCl 2 • 6H 2 O, 2 mg ZnSO 4 • 7H 2 O, 1 mg Na 2 BO 4 ⁇
  • the 10% volume laboratory fermentor is inoculated using 10% inoculum from the inoculum.
  • the semi-technical fermentor with a volume of 100 liters is inoculated, the fermentation broth created in this becomes the inoculum for the pre-fermenter of Im 3 volume.
  • the nutrient medium used in the fermenters has a different composition than that for the shake cultures.
  • the fermenter cultures are cultivated in nutrient medium of the following composition.
  • 1 m 3 30 kg molasses, 10 kg corn steep liquor, 5 kg CaCO 3 , 4 kg glucose, 200 g KH 2 PO, 200 g CaCl 2 , 300 mg MgSO 4 , 200 g K 2 SO 4 , 500 g NaCl, 50 g FeCl 3 , 5 g H 2 BO 4 , 5 g (NH4) 2 MoO, -0.5 g KI, 0.5 g NaBr, 0.2 g
  • the 10 liter volume fermenter is sterilized in an autoclave
  • the glucose is sterilized separately in the form of a 50% strength aqueous solution in an autoclave (30 min, 1.2 bar, 121 ° C.).
  • the fermenters with a volume of 100 liters or 1 m 3 are sterilized by directly blowing in steam (1.3 bar, 130 ° C).
  • the fermentation time is
  • Air consumption is 1 dm 3 / dm 3 min, with 1 m 3 volume 0.4 dm 3 / dm 3 min.
  • Glanopon is used as a defoamer.
  • the main fermentation is carried out in a fermenter of 10 m 3 .
  • a fermenter of 10 m 3 As an inoculum, the one produced in the pre-fermenter with a volume of 1 m 3
  • Bacterial culture used The composition of the nutrient medium used in the main fermentor is the same as that used in the pre-fermentation. Sterilization is carried out by direct steam introduction (1.3 bar,
  • the fermentation time is 24 hours, the cultivation time is 24 hours, the stirring frequency is 200 min "1.
  • the air requirement is 0.4 dm 3 / dm 3 min.
  • Glanopon is used as a defoamer.
  • the number of cells in the fermentation broth has depending from the culture values of 5 x 10 8 - reaches 10 9 / cm 3: Azospirillum sp at. and Azotobacter sp. 504 5x 10 8 - 10 9 / cm 3 , in Pseudomonas sp. 4 x 10 3 - 8 x 10 5 / cm 3 .
  • the fermentation broth After the fermentation is stopped, the fermentation broth must be cooled. It is then processed, packaged and stored under sterile conditions.
  • the tests were carried out on sunflowers (Helianthus annuus) outdoors by treating the soil. Before the sunflowers were sown, a bacterial mixture with the germ count of 2.5 ⁇ 10 8 / cm 3 was sprayed onto the soil in the stated amount and then mechanically worked into the top layer of the soil. Then the sunflower seeds are put in, and the soil is infected with the sclerotia of S. sclerotiorum (20 pieces on 60 m 2 ). The viability of sclerotia at the time of infection is 70%. Then the plants are cultivated under the usual culture conditions.
  • Untreated plants are used as a control, plants treated with the known agent Koni Standard (Bioved Kft, Szigetszentmikl ⁇ s, HU) as a reference.
  • the active ingredient of Koni Standard is the parasitic fungus Conioterium ministrans.
  • the evaluation takes place in the cotyledon stage, in the stage with 2 subsequent leaves (1) and in the stage with 6-8 subsequent leaves (2).
  • the percentage of infestation is determined by visually rating the stem rot.
  • the viability of sclerotia is determined by a laboratory test. The results are summarized in the following table.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen geeignetes Präparat, das als Wirkstoff Stämme von zu den Gattungen Azospirillum, Azotobacter und Pseudomonas gehörenden Arten enthält, gegebenenfalls zusammen mit den üblichen Trägerstoffen und sonstigen Hilfsstoffen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen.

Description

Präparat und Verfahren zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen
Die Erfindung betrifft ein Präparat und ein Verfahren zur Behandlung von
Sclerotinia-Infektionen. Näher betrachtet ist der Erfindungsgegenstand ein Präparat, welches ein Gemisch umweltfreundlicher Bakterien enthält und vorzugsweise zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen eingesetzt werden kann.
Die Sclerotinia spp. sind auf der ganzen Welt verbreitete gefährliche Krankheitserreger in Feld- und Gartenbau. Bei Sclerotinia spp. handelt es sich um im Etoden lebende Pilze, zwischen deren Hyphenfäden sich schwarze harte Gebilde, die sogenannten Sklerotia, entwickeln. Diese zeigen eine beträchtliche morphologische Vielfalt, bei einigen Arten entwickeln sie sich auf oder in den Wurzeln der Pflanzen, bei anderen im pflanzlichen Gewebe. Sie sind sehr widerstandsfähig und können im Boden mehrere Jahre überleben. Im Frühling keimen sie, bilden Apothezien, und aus diesen wachsen die Fruchtkörper, die eine charakteristische Trompetenform aufweisen und bis zu 10 mm hoch werden können. In den Fruchtkörpern (Asci) bilden sich 8 Ascosporen.
Im Zuge des Pilzbefalls greifen die Sklerotia den Wurzelhals und die in Erdnähe befindlichen Teile des Stieles an. Dadurch werden die Gefäßbündel geschädigt, was eine Störung in der Ernährung der Pflanze hervorruft. Durch die Pilzinfektion kommt es zur Stengelgrundfäule, die ein Niederlegen der Pflanze und damit ihr Eingehen zur Folge haben kann.
Die Sclerotinia spp. befallen mehr als 400 Pflanzen. In erster Linie sind sie für Ölpflanzen (Raps, Soja, Sonnenblume), für Gemüse und für Getreide gefährlich. Fast jede Pflanze hat ihren eigenen Sclerotinia-Krankheitserreger. So werden zum Beispiel Tomaten und Kartoffeln von S. minor, Sonnenblumen von S. sclerotiorum befallen.
Gegen Sclerotinia-Infektionen sind keine geeigneten mechanischen oder chemischen Schutzmaßnahmen bekannt; höchstens kann man versuchen, die gegen Botrytis angewendeten Wirkstoffe einzusetzen (Horväth J.: A szäntόföldi növenyek betegsegei /= Die Krankheiten der Ackerpflanzen/, Mezögazdasägi Kiadό, Budapest 1995, S. 112-114). In der Praxis wendet man die Fruchtfolge an, d.h. auf dem jeweiligen Stück Feld wird alle einige Jahre etwas anderes angebaut. Wegen der Gefahr einer eventuellen Überkreuzinfektion ist diese Schutzmethode jedoch nicht sehr wirksam.
Es bestand deshalb die Notwendigkeit, ein Präparat auszuarbeiten, das gegen Sclerotinia-Infektionen mit Erfolg eingesetzt werden kann. 5 Es wurde nun gefunden, daß die aus dem Boden und aus .der Rhizosphäre der Pflanzen stammenden Bakterien, insbesondere Stämme von zu den Gattungen Azospirillum, Azotobacter und Pseudomonas gehörenden Arten in Form eines Bakteriengemisches erfolgreich zum Schutz gegen die Sclerotinia-Infektien verwendet werden können. 0 Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Präparat zur Behandlung von
Sclerotinia-Infektionen, das als Wirkstoff Stämme von zu den Gattungen Azospirillum, Azotobacter und Pseudomonas gehörenden Arten enthält, gegebenenfalls zusammen mit den üblichen Träger- und sonstigen Hilfsstoffen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von 5 Sclerotinia-Infektionen. Gemäß dem Verfahren wird das erfmdungsgemäße Präparat in einer wirksamen Menge auf die Pflanzen oder deren Lebensraum ausgebracht.
Wie bereits erwähnt, ist der Wirkstoff des erfindungsgemäßen Präparates ein aus Stämmen von zu den Gattungen Azospirillum, Azotobacter und 10 Pseudomonas gehörenden Arten bestehendes Bakteriengemisch.
Die Gram-negativen Arten Azospirillum sp. können unter den im Boden herrschenden mikroaeroben Bedingungen (was etwa 1-2 % Sauerstoffgehalt bedeutet) in enge Verbindung mit den Wurzeln der Pflanzen treten, sich in den oberen Gewebeschichten der Wurzel ansiedeln, den freien Luftstickstoff zu .5 Ammoniak reduzieren und diesen Ammoniak der Pflanze übergeben. Diese Art von Mikroorganismen, die zum Binden des Stickstoffs auch die Anwesenheit einer Pflanze braucht, bezeichnet man zusammenfassend als assoziative Stickstoffbinder. In der Natur locken die Pflanzen durch von ihren Wurzeln ausgeschiedene organische Säuren, Zucker die A∑ospirillum-Stämme an. J0 Azospirillum bindet nicht nur Stickstoff, sondern produziert auch Stoffe
(pflanzliche Hormone und Wuchsstoffe), die für die Entwicklung der Pflanze von Nutzen sein können.
Die Gram-negativen Bakterien Azotobacter leben ebenfalls im Boden, frei oder fallweise in Symbiose mit Pflanzen, und - im Gegensatz zu den assoziativen Stickstoffbindern - sind sie auch allein in der Lage, den Luftstickstoff zu Ammoniak zu reduzieren, mit dem sie die StickstoffVersorgung von Nutzpflanzen gewährleisten. Die Azotobacter-Stä me können auf Grund der Messung der Aktivität des Enzyms Nitrogenase selektiert werden (Dilworth, M. J.: Biochim. Biophys. Acta 127, 285 (1966)). Die Effektivität der Stickstoffbindung und auch die EUldung von sonstigen, für die Nutzpflanzen günstig wirkenden Verbindungen wurde durch Laboratoriumsversuche und Experimente auf Kleinparzellen bewiesen.
Bestimmte Mikroorganismen, darunter auch die Stämme der Gattung Pseudomonas, vermögen den unlöslichen Phosphor in Lösung zu bringen, in eine für die Pflanze aufnehmbare Form umzuwandeln. Dies ist deshalb erforderlich, weil im Boden zwar genügend Phosphor vorhanden ist, jedoch in Form von für die Pflanze nicht verwertbaren anorganischen Phosphaten (zum Beispiel Apatit). Die Quellen der löslichen Phosphorverbindungen, die Phosphorbergwerke, sind auf der ganzen Welt am Versiegen; auch ist zu erwähnen, daß die übertriebene Anwendung von phosphor- und stickstoffreichen Kunstdüngern zum Sauerwerden des Bodens, zu Nitratanreicherung in den Gewässern fuhrt, was die Veralgung (Eutrophie) der Gewässer fördert. Die Selektierung auf die Fähigkeit, Phosphat in Lösung zu bringen, kann auf einem 1 % Hydroxyapatit und 10 % Tricalcium- phosphat enthaltenden, glucosefreien oder glucosehaltigen Nährboden vorgenommen werden.
Die Stämme der Gattung Pseudomonas sind fähig, Siderophore und Phytohoπnone (zum Beispiel Auxine und Gibberellinsäure) zu synthetisieren. Die sog. Siderophore können Eisen auch in Gegenwart von nur geringen Eisenmengen konzentrieren. Dieser Prozeß kann die Vermehrung von anderen, krankheits- erzeugenden Mikroorganismen hemmen, indem er ihnen das für ihre Lebensfunktionen unverzichtbare Eisen entzieht. Die Produktion von Siderophoren kann an Hand der Hemmung des Wachstums eines Escherichia coli Stammes untersucht werden; die Selektierung erfolgt auf der gleichen Grundlage. Von den pflanzlichen Hormonen kann die Biosynthese der Gibberellinsäure beobachtet und gemessen werden. Zur Stammselektierung können dünnschicht- chromatographische Verfahren herangezogen werden.
Die Morphologie der einzelnen Stämme kann wie folgt beschrieben werden. Azotobacter sp.
Die in ein- bis zweitägigen Kulturen beweglichen Zellen verfügen über Perittch-Geißeln, deren Wellenlänge 2,5-3,3 μm, Amplitude 0,37-0,76 μm beträgt. Die Kolonien sind nicht schleimig, jedoch können sie, der Menge der produzierten extrazellulären Polysaccharide entsprechend, von unterschiedlicher Form sein. Als Stickstoffquelle können Ammonium- und Nitrationen verwendet werden, die Hydrolyse ist mit α-Amylase oder ß-Amylase durchfuhrbar. Der G+C-Gehalt der DNA hegt bei 65,8-67,6 Mol%. Azospirillum sp. Die Zellen sind spirillumf rmig. Sie sind Gram-negativ und bewegen sich in flüssigen Medien mittels einer einzigen Polargeißel, während auf festem Nährboden zahlreiche laterale Geißeln ausgebildet werden. Sie sind chemo- organotroph, d.h. von hauptsächlich respiratorischem Stoffwechsel. Aerob, mikro- aerophil. Oxydase-positiv; im allgemeinen auch katalase-positiv. Die Zellen sind unter mikroaeroben Bedingungen zur Distickstofffixierung fähig. Sie akkumulieren Poly-ß-hydroxybutyrat. Der G+C-Gehalt der DNA beträgt 69-71 Mol%. Pseudomonas sp.
Die Art hat 5 Biovare, die ihren Ernährungseigenschaften nach heterogen sind. Pseudomonas fluorescens ist als Biovar I zu betrachten, und auch sein Typenstamm gehört zu dieser Gruppe. Es handelt sich um gerade oder gekrümmte, nicht helikale Gram-negative Stäbchen von 0,5-0,8 μm Durchmesser und 1,5-2,8 μm Länge. Sie bilden keine Prosteken und sind von keiner Hülle umgeben. Zellwand und Membran sind die für Gram-negative Bakterien charakteristischen. Sie bewegen sich mit Hilfe polarer Geißeln. Ihr Stoffwechsel ist streng an Sauerstoff als einen terminalen Elektronenakzeptor gebunden. Xanthomonaddine werden nicht produziert. Die Bakterien brauchen keine organischen Wachstumsfaktoren, sie sind oxydase- und katalase-positiv und chemoorganotroph; sie können eine große Vielfalt von organischen Verbindungen als Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle verwerten. Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 25-30 °C, unter pH 4,5 findet kein Wachstum statt. Sie enthalten verschiedene Pigmente. Das bekannteste lösliche Pigment, das Pioverdin, wird auf eisenarmen Nährböden reichlich gebildet, und die Fluoreszenz ändert sich im UV-Licht von weiß nach bläulichgrün. Die maximale UV- Wellenlänge liegt bei etwa 400 nm. Der G+C-Gehalt der DNA beträgt 59,4-61,3 Mol%. Typenstamm: ATCC 3525. Pseudomonas spp. sind in der Natur weitverbreitet.
Im Sinne der Erfindung werden besonders bevorzugt die folgenden Stämme verwendet, die von den Autoren vorüegender Erfindung in der Stammsammlung der Budapester Universität für Gartenbau und Lebensmittelindustrie deponiert wurden: NCAIM (P) 001279 Azotobacter sp. Sarret, NCAIM (P) B 001280 Azospirillum sp. Särret und NCAIM (P) B 001281 Pseudomonas sp. Särret. Die im Sinne der Erfindung anzuwendende Bakterienmischung wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Bevorzugt wird kontinuierlich fermentiert. Dies kann zum Beispiel erfolgen, indem man unter Verwendung von 10 % Impfmaterial aus dem Inokulum die Fermentoren von 10 Liter, 100 Liter, 1 m3 und 10 m Volumen beimpft. Zum Zweck der Maßstabsvergrößerung ist die fertige Kultur des jeweiligen Fermentors das Inokulum für den in der Reihenfolge folgenden Fermentor. Die Zusammensetzung des Nährmediums in den Fermentoren ist gleich, nur das Nährmedium der Starterkultur, die in Schüttelkolben angezüchtet wird, ist davon abweichend. Der Fermentor mit 10 1 Volumen wird im Autoklav sterilisiert (30 min, 1,2 bar, 121 °C). Die Sterilisation des 100 Liter fassenden Fermentors und der noch größeren erfolgt durch direkte Einleitung von Dampf (1,3 bar, 130 °C). Die Glucose wird als 50 %ige wäßrige Lösung gesondert im Autoklav sterilisiert (30 min, 1,2 bar, 121 °C). Die Fermentationsdauer beträgt 24 Stunden, die Anzuchtzeit 24 Stunden, die Schüttelfrequenz 200 min"1. Der Luftbedarf beträgt 1 dm3/dm3min, bei Volumina > 100 Liter 0,4 clm3/dm3min. Als Entschäumer wird Glanopon eingesetzt. Temperatur und pH sind abhängend von den einzelnen Kulturen verschieden: Azospirillum sp.: t = 30 °C, pH ~ 7,4; Azotobacter sp. 504: t = 28 °C, pH ~ 7,3; Pseudomonas sp. : t = 30 °C, pH ~ 6,8.
Am Ende der Fermentierung hat die Anzahl der Zellen in der Fermentbrühe abhängend von der Kultur Werte von 5 x 108 - 109/cm3 erreicht: bei Azospirillum sp. und Azotobacter sp. 504 5x 108 - 109/cm3, bei Pseudomonas sp. 4 x 103 - 8 x 105/cm3. Nach dem Abbruch der Fermentation muß die Fermentbrühe gekühlt werden. Anschließend wird sie unter sterilen Bedingungen aufgearbeitet, verpackt und gelagert.
In der erfindungsgemäß verwendeten Bakterienmischung beträgt die Menge von Azospirillum im allgemeinen 20-30 Masse%, vorzugsweise 25
Masse%, die von Azotobacter im allgemeinen 20-30 Masse%, vorzugsweise 25
Masse%, und die von Pseudomonas im allgemeinen 40-60 Masse%, vorzugsweise
50 Masse%.
Das erfindungsgemäße Präparat kann in verschiedenen Pflanzenkulturen, insbesondere Kulturen von Ölpflanzen wie Raps, Soja und Sonnenblumen, Gemüse und Getreide mit Erfolg zur Bekämpfung von Sclerotinia-Infektionen angewendet werden.
Zur erfindungsgemäßen Behandlung wird die Bakterienmischung an sich oder in Form eines geeigneten Präparates auf die zu behandelnden Pflanzen oder deren Lebensraum aufgebracht.
Die Lagerfähigkeit der erfindungsgemäßen Bakterienmischung kann sehr verbessert werden, wenn die im Zuge der Fermentierung erhaltene Fermentbrühe zu geeigneten Präparaten verarbeitet wird. Geeignete Präparate sind zum Beispiel flüssige Formulierungen wie Lösungen, Suspensionen und Konzentrate, ferner feste Formulierungen, zum Beispiel Pulver, Streumittel, Spritzpulver, Pasten und Granulate.
Die Präparate werden in an sich bekannter Weise hergestellt. Im ersten Schritt wird im allgemeinen die Fermentbrühe eingedickt. Dies kann in schonender Weise zum Beispiel durch Zentrifügieren, Ultrafiltration und Separieren erfolgen. Bei Verwendung eines Filtereinsatzes geeigneter Porengröße kann das Volumen der Fermentbrühe mittels Ultrafiltration auf 10 % des ursprünglichen Volumens verringert werden. Das erhaltene Konzentrat kann bei niedrigen Temperaturen über lange Zeit hinweg (bis zu einem Jahr) gelagert werden. Vor der Anwendung muß es nur auf die gewünschte Anwendungs- konzentration verdünnt werden.
Zur Herstellung einer festen Formulierung wird das Konzentrat mit einem Trägermaterial vermischt und das Gemisch unter schonenden Bedingungen getrocknet. Als Trägermaterial werden vorzugsweise organische Stoffe, zum Beispiel wasser-unlösliche Biopolymere, Lignozellulosen, wie Pflanzenstengel, Stroh, stärke-haltige Pflanzensamen, zum Beispiel Reis, Weizen und Gerste, sowie Nebenprodukte der Landwirtschaft und der Lebensmittelindustrie verwendet. Es ist jedoch auch möglich, als Trägermaterial anorganische Stoffe, zum Beispiel Perlit, Diatomeenerde und Sand, ferner synthetische Stoffe, zum Beispiel Polyurethanschaum und anderen Kunststoffschaum, zu verwenden.
Als weitere Komponenten können die Formulierungen die üblichen Zusatzstoffe und Hilfsstoffe enthalten. Als solche kommen zum Beispiel Stabilisatoren, Antioxydantien, Dispergiermittel, Füllstoffe, Bindemittel und Farbstoffe in Betracht. Als Zusatzstoffe können ferner mikrobiologische Nährstoffe, zum Beispiel Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Wasser, verwendet werden, die dann von den Bakterien zum Wachstum und zur Herstellung von Metaboliten genutzt werden. Die Formulierungen enthalten das Bakteriengemisch im allgemeinen in einer Menge von 0,1-99 Masse%, vorzugsweise 0,5-95 Masse%.
Die Behandlung erfolgt in der üblichen Weise, zum Beispiel durch Gießen, Spritzen, Sriihen, Streuen oder Injizieren in den Boden.
Im allgemeinen wird die Behandlung vor der Aussaat oder aber nach der Aussaat, aber vor den Auflaufen vorgenommen. Die Behandlung vor der Aussaat ist bevorzugt; nach einer Vorbereitung des Bodens wird die Formulierung auf die Oberfläche aufgebracht und dann in die Oberschicht des Bodens eingearbeitet.
Die Anwendungsmenge beträgt im allgemeinen 5-50 1/ha, vorzugsweise 10-30 1 ha, bezogen auf das Bakteriengemisch. Diese Menge wird im allgemeinen mit 50-5001/ha, vorzugsweise 80-300 1/ha, Wasser ausgebracht.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert, jedoch ist der Schutzumfang nicht auf die Beispiele beschränkt. Beispiel 1: Die Anzucht des Mikroorganismus 1.1 Aufrechterhaltung des Stammes 1.1.1 Zur Aufrechterhaltung des Azospirillum sp. wird folgendes Nährmedium verwendet: 1 g Fleischextrakt, 2 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 5 g NaCl, 15 g Agar, 1 dm3 dest. Wasser (pH ~ 7,4), Temperatur 30 °C.
1.1.2 Zur Aufrechterhaltung von Azotobacter sp. 504 wird folgendes Nährmedium verwendet: 10 g Glucose, 0,1 g CaCl2 • 2H2O, 0,1 g MgSO4 • 2H20, 0,9 g.K2HPO4, 0,1 g KH2PO4, 5 g CaCO3, 10 mg FeSO4 • 7H2O, 5 mg NaaMoO l dm3 destilliertes Wasser (pH ~ 7,3), Temperatur 28 °C.
1.1.3 Zur Aufrechterhaltung von Pseudomonas sp. wird folgendes Nähermedium verwendet: 1 g Fleischextrakt, 2 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 5 gNaCl, 15 g Agar, 1 dm3 dest. Wasser, 0,45 g K2HPO4, 2,39 g NaH2PO4 • 12H2O (pH ~ 6,8), Temperatur 30 °C.
1.2 Anzucht im Schüttelkolben
In Erlenmeyerkolben von je 1000 cm3 (Sterilisation bei 121 °C 30 Minuten) werden je 200 cm3 Nährlösung mit den auf Schrägagarkulturen gewachsenen Mikroorganismen beimpft. Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung: 14 g Glucose, 26 g Melasse, 15 g Maisquell wasser (50 Masse% Trockensubstanzgehalt), 5 g Hefeextrakt, 4 g Säurecasein, 2 g (NH4)2Sθ4, 2 g NH4NO3, 2 g CaCO3, 2 g KH2PO4, 1 g NaCl, 3 g MgSO4, 4,6 g Spurenelementelösung*) *) Die Spurenelementelösung hat folgende Zusammensetzung: 210 mg
FeSO4 • 7H O, 11 mg FeCl3 • 6H2O, 2 mg MnSO4 • H2O, 2 mg CuSO4 • 5H O, 2 mg Na2MoO4, 2 mg CoCl2 • 6H2O, 2 mg ZnSO4 • 7H2O, 1 mg Na2BO4 ■
10H2O, 0,15 mg Bi(N03)3 • 2H2O, 0,01 mg SnCl2, 0,01 mg Selenchlorid, 1 mg KI, 120 mg Citronensäure, destilliertes Wasser 1 dm3. Die Kulturen werden bei 30 °C 26-34 Stunden lang auf dem Schütteltisch mit einer Frequenz von 200 min"1 geschüttelt, dann werden die sterilen Proben unter dem Mikroskop untersucht.
1.3 Vorfermentierung
Um die erforderliche Maßstabsvergrößerung vornehmen zu können, wird zuerst unter Verwendung von 10 % Impfmaterial aus dem Inokulum der Laborfermentor von 10 Liter Volumen beimpft. Mit der am Ende der Fermentation entstandenen Fermentbrühe wird der halbtechnische Fermentor des Volumens von 100 Litern beimpft, die in diesem entstehende Fermentbrühe wird das Inokulum für den Vorfermentor von Im3 Volumen. Das in den Fermentoren eingesetzte Nährmedium hat eine andere Zusammensetzung als das für die Schüttelkulturen.
Die Fermentorkulturen werden in Nährmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert. Für 1 m3: 30 kg Melasse, 10 kg Maisquellwasser, 5 kg CaCO3, 4 kg Glucose, 200 g KH2PO , 200 g CaCl2, 300 mg MgSO4, 200 g K2SO4, 500 g NaCl, 50 g FeCl3, 5 g H2BO4, 5 g (NH4)2MoO , -0,5 g KI, 0,5 g NaBr, 0,2 g
ZnSO4, 0,3 g Al2(SO4)3, 2 dm3 Entschäumer.
Der Fermentor von 10 Liter Volumen wird in einem Autoklav sterilisiert
(30 Minuten, 1,2 bar, 121 °C). Die Glucose wird in Form einer 50 %igen wäßrigen Lösung getrennt im Autoklav sterilisiert (30min, 1,2 bar, 121 °C). Die
Sterilisierung der Fermentoren mit 100 Liter bzw. 1 m3 Volumen erfolgt durch direktes Einblasen von Dampf (1,3 bar, 130 °C). Die Fermentationsdauer beträgt
24 Stunden, die Anzuchtzeit 24 Stunden, die Schüttelfrequenz 200 min"1. Der
Luftbedarf beträgt 1 dm3/dm3min, bei 1 m3 Volumen 0,4 dm3/dm3min. Als Entschäumer wird Glanopon eingesetzt. Temperatur und pH sind abhängend von den einzelnen Kulturen verschieden: Azospirillum sp.: t = 30 °C, pH ~ 7,4;
Azotobacter sp. 504: t = 28 °C, pH ~ 7,3; Pseudomonas sp.: t = 30 °C, pH ~ 6,8.
1.4 Hauptfermentation
Die Hauptfermentation wird in einem Fermentor von 10 m3 vorgenommen. Als Inokulum wird die in dem Vorfermentor mit 1 m3 Volumen hergestellte
Bakterienkultur verwendet. Die Zusammensetzung des im Hauptfermentor eingesetzten Nährmediums ist die gleiche wie die des in der Vorfermentierung verwendeten. Die Sterilisierung erfolgt durch direkte Dampfeinleitung (1,3 bar,
130 °C). Die Fermentationsdauer beträgt 24 Stunden, die Anzuchtzeit 24 Stunden, die Rührfrequenz 200 min"1. Der Luftbedarf beträgt 0,4 dm3/dm3min.
Als Entschäumer wird Glanopon eingesetzt. Temperatur und pH sind abhängend von den einzelnen Kulturen verschieden: Azospirillum sp.: t = 30 °C, pH ~ 7,4;
Azotobacter sp. 504: t = 28 °C, pH ~ 7,3; Pseudomonas sp.: t = 30 °C, pH ~ 6,8. Am Ende der Fermentierung hat die Anzahl der Zellen in der Fermentbrühe abhängend von der Kultur Werte von 5 x 108 - 109/cm3 erreicht: bei Azospirillum sp. und Azotobacter sp. 504 5x 108 - 109/cm3, bei Pseudomonas sp. 4 x 103 - 8 x 105/cm3.
Nach dem Abbruch der Fermentation muß die Fermentbrühe gekühlt werden. Anschließend wird sie unter sterilen Bedingungen aufgearbeitet, verpackt und gelagert.
Beispiel 2: Behandlung der Sclerotinia-Infektion in Sonnenblumenkulturen
Die Versuche wurden an Sonnenblumen (Helianthus annuus) im Freiland durch Behandlung des Bodens vorgenommen. Vor der Aussaat der Sonnenblumen wurde auf den Boden eine Bakterienmischung mit der Keimzahl von 2,5 x 108/cm3 in der angegebenen Menge aufgesprüht und dann mechanisch in die oberste Schicht des Bodens eingearbeitet. Danach werden die Sonnenblumenkerne gesteckt, und der Boden wird mit den Sklerotia von S. sclerotiorum (20 Stück auf 60 m2) infiziert. Die Lebensfähigkeit der Sklerotia zum Zeitpunkt der Infektion ist 70 %. Dann werden die Pflanzen unter den üblichen Kulturbedingungen kultiviert.
Als Kontrolle werden unbehandelte Pflanzen, als Referenz mit dem bekannten Mittel Koni Standard (Bioved Kft, Szigetszentmiklόs, HU) behandelte Pflanzen verwendet. Der Wirkstoff von Koni Standard ist der parasitäre Pilz Conioterium ministrans.
Die Auswertung erfolgt im Keimblattstadium, im Stadium mit 2 Folgeblättern (1) und im Stadium mit 6-8 Folgeblättern (2). Der prozentuale Befall wird durch visuelles Bonitieren der Stengelgrundfäule ermittelt. Die Lebensfähigkeit der Sklerotia wird durch eine Laboratoriumsprüfung ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Figure imgf000011_0001

Claims

Patentansprüche
1. Präparat zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen, enthaltend als Wirkstoff Stämme von zu den Gattungen Azospirillum, Azotobacter und Pseudomonas gehörenden Arten, gegebenenfalls zusammen mit den üblichen Trägerstoffen und sonstigen Hilfsstoffen.
2. Präparat nach Anspruch 1, enthaltend als Wirkstoff ein Gemisch aus 20- 30 Masse% Azospirillum, 20-30 Masse% Azotobacter und 40-60 Masse% Pseudomonas.
3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend die Stämme NCAIM (P) B 001279 Azotobacter sp. Särret, NCAIM (P) B 001280 Azospririllum sp. Särret und NCATM (P) B 001281 Pseudomonas sp. Sarret.
4. Verfahren zur Behandlung von Sclerotinia-Infektionen, bei dem ein Präparat nach einem der Ansprüche 1-3 in wirksamer Menge auf die Pflanzen oder deren Lebensraum aufgebracht wird.
5. Verwendung der Stämme von zu den Gattungen Azospirillum,
Azotobacter und Pseudomonas gehörenden Arten zur Behandlung von ScleTotinia-Infektionen.
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