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WO2000026403A1 - Procede d'evaluation du risque d'apparition d'une surcharge en fer et ses applications - Google Patents

Procede d'evaluation du risque d'apparition d'une surcharge en fer et ses applications Download PDF

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Publication number
WO2000026403A1
WO2000026403A1 PCT/FR1999/002656 FR9902656W WO0026403A1 WO 2000026403 A1 WO2000026403 A1 WO 2000026403A1 FR 9902656 W FR9902656 W FR 9902656W WO 0026403 A1 WO0026403 A1 WO 0026403A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primers
pair
codon
seq
transcripts
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/002656
Other languages
English (en)
Inventor
Olivier Rosmorduc
Brigitte Hermelin
Raoul Poupon
Eric Clauser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Publication of WO2000026403A1 publication Critical patent/WO2000026403A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the risk of developing severe iron overload in humans and to its applications.
  • Iron overloads are the result of various causes, hereditary or acquired.
  • hereditary disorders of iron metabolism there may be mentioned hereditary hemochromatosis and so-called juvenile hemochromatosis, hereditary ra (hypo) transferemia, hereditary aceruloplasminemia; among the causes of acquired overloads, we can cite polymetabolic syndrome, chronic liver diseases (advanced cirrhosis, viral hepatitis C, alcoholic liver diseases), late cutaneous porphyria and hematological diseases (dyserythropoiesis, haemolytic anemias).
  • Hereditary hemochromatosis is the most common recessive genetic disease in northern European countries (1/400).
  • the gene for hereditary hemochromatosis (HFE gene) has been located on the short arm of chromosome 6. This gene codes for a protein related to HLA class I molecules, which could regulate the absorption of iron by complexing with the receptor for transferrin (WO 97/38137; JN Feder et al., PNAS, 1998, 95, 1472-1477).
  • the structure of this gene has been described: it comprises 12146 bp, and includes
  • exon 1 positions 1028-1324; intron 1: positions 1325-4651; exon 2: positions 4652-4915; intron 2: positions 4916-5124; exon 3: positions 5125-5400; intron 3: positions 5401-6493; exon 4: positions 6494-6769; intron 4: positions 6770-6927; exon 5: positions 6928-7041; intron 5: positions 7042-7994; exon 6: positions 7995-9050; intron 6: positions 9051-10205 and exon 7: positions 10206-10637 (EMBL access number Z92910).
  • hepatic iron index (IHF; hepatic iron concentration in ⁇ moles / ' g of dry liver / age):> 1.9, in 91.3% of homozygous subjects; hepatic iron overload is generally predominant in hepatocytes with a decreasing gradient from the periportal areas to the centrolobular areas with, in the case of cirrhosis: (i) presence of sideric deposits within the fibrous tissue, in particular in the walls of the vessels and channels biliary and (ii) homogeneous distribution of the overload, from one nodule to another, - transferrin saturation test:> 55% in 90% of homozygous subjects,
  • the inventors therefore set themselves the goal of providing a test for evaluating the risk of the appearance of a severe iron overload, in particular in predisposed families, which better meets the needs of the practice than existing tests (biological tests). or analysis of the genotype) and which make it possible in particular to assess the risks of iron overload in heterozygous patients.
  • the subject of the present invention is a method for evaluating the risk of developing a severe iron overload, in particular in a predisposed subject, which method is characterized in that it essentially comprises the establishment of the profile of the different transcripts HFE gene, from a biological sample.
  • said method allows the relative quantification of the different transcripts detected.
  • the method according to the invention makes it possible to detect:
  • the type of transcript normal or mutated at the level of codon 282 and / or codon 63 and
  • the mutated H63D transcript is always predominant in H63D heterozygotes (70.6% + 1.5) and in composite heterozygotes (71.9% + 1.2 or 69.3% + 1.4), depending on whether the signals were obtained after amplification of the regions surrounding respectively the codon 63 or the codon 282, - in the normal subject, 100% of non-mutated transcript is detected,
  • - transcripts mutated or not, in which the intron 4 is partially spliced: zone going from nucleotide 6770 to nucleotide 6927 (gain of 158 nucleotides) or zone going from nucleotide 6770 to nucleotide 6835 (gain of 66 nucleotides).
  • the primers used advantageously comprise from 20 to 30 nucleotides. According to an advantageous embodiment of said method, step
  • (c) of said method is implemented with a pair of primers I, consisting of the sequences SEQ ID ⁇ OJ and SEQ ID ⁇ O: 2 and a pair of primers III, consisting of the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • step (d) of said method is implemented with a pair of primers II, consisting of the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and a pair d primers IV, consisting of the sequences SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 8 being preferably marked.
  • the biological sample is preferably made up of peripheral blood mononuclear cells; indeed, the profile of transcripts in said cells is identical to the profile of transcripts obtained from tissue biopsies, is much simpler to implement and is without any risk for the patient.
  • the analysis according to step (e) is carried out by enzymatic digestion of the PCR products, followed by separation of the products obtained by appropriate electrophoresis, in particular gel electrophoresis and detection of the marker.
  • said digestion is carried out in the presence of the restriction enzymes Rsa I and Dpn II.
  • the C282Y mutation creates a new Rsa I site and the H63D mutation eliminates a Dpn IL site According to the invention, the digestion by Rsa I of the products
  • PCR amplified using the pairs of primers III and IV shows bands corresponding to wild RNAs (217 bp) and to RNAs carrying the C282Y mutation (189 bp + 28 bp); a band (76 bp) corresponds to another site for Rsa I and is present in all cases.
  • Digestion by Dpn II of PCR products amplified using the pairs of primers I and II shows bands corresponding to the wild type transcripts (84 + 86 bp) and mutated (170 bp) (see FIG. 1).
  • such a method can be performed routinely, using a simple sample of peripheral whole blood and after extraction of the total RNAs contained in the mononuclear cells of the blood, that is to say from a simple lysis of the red blood cells, either after completion of a FICOLL gradient (thorough purification).
  • FICOLL gradient thorough purification
  • the analysis according to step (e) is carried out by hybridization with a labeled probe selected from the group consisting of exon 2, exon 4 or intron 4 of the HFE gene or a fragment thereof.
  • Said probes preferably comprise between 20 and 50 nucleotides.
  • Such a method also makes it possible to detect other anomalies in the expression of the gene (complete absence of transcripts, for example), in particular in the presence of a discrepancy between the genotype and the results of the study of the transcripts.
  • the present invention also relates to primers selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NOJ to SEQ ED NO: 9.
  • the present invention also relates to probes selected from the group consisting of exon 2, exon 4, intron 4 of the HFE gene or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to a kit for the evaluation of the risk of occurrence of a severe iron overload, characterized in that it comprises, in addition to the reagents suitable for the extraction of RNAs and the reverse transcription of said RNAs, reagents for the amplification of the cDNA fragments corresponding to the transcripts of the HFE gene containing codon 63 or codon 282, namely:
  • a pair of primers I capable of amplifying at least the fragment of exon 2 which contains the codon 63
  • a pair of primers III capable of amplifying at least the fragment of exon 4 which contains the codon 282,
  • pairs of primers II and IN being preferably coupled to an appropriate label.
  • the preferred primer pairs are in particular those described above (SEQ ID ⁇ OJ to SEQ ID ⁇ O: 9).
  • the present invention further relates to a mutated transcript of the HFE gene, characterized in that codon 282 codes for a serine.
  • FIG. 1 shows the detection of HFE RNAs in mononuclear cells in normal subjects, homozygous for C282Y and homozygous for H63D.
  • the PCR products were respectively digested with the restriction enzymes Dpn II and Rsa I (lines 2, 4 and 6) or undigested ( lines 1, 3 and 5). Product sizes are indicated.
  • the Rsa I digestion of the PCR products amplified using the pairs of primers III and IV shows bands corresponding to wild RNAs (217 bp) and to RNAs carrying the C282Y mutation (189 bp + 28 bp); a band (76 bp) corresponds to another site for Rsa I and is present in all cases.
  • Digestion by Dpn // of the PCR products amplified using the pairs of primers I and II shows bands corresponding to the wild (84 + 86 bp) and mutated (170 bp) transcripts;
  • FIG. 2 represents the RNAs encoded by one of the alleles preferentially detected in the mononuclear cells. Three families (Bi, Le, Be) were studied.
  • RNAs encoded by the mutated and wild-type HFEs were studied in the mononuclear cells of composite heterozygous patients (Bi3, Le3, Be2 and Be3), heterozygous for H63D (Bil, Le2 and Be4) and heterozygous for C282Y (Bi2 and Bel);
  • Figure 2A genotype of members of three families studied;
  • FIG. 2B after amplification of the region containing the codon 63 and digestion with Dpn II, a majority band of 170 bp corresponding to the H63D transcripts was detected in all the patients heterozygous for the H63D mutation and composite heterozygotes;
  • FIG. 2C after amplification of the region containing codon 282 and digestion with Rsa I, a majority band of 217 bp corresponding to the non-mutated transcript was detected in patients heterozygous for C282Y and in composite heterozygotes;
  • FIG. 3 illustrates the relative quantification of mutated and non-mutated transcripts.
  • FIG. 3B the signals obtained after amplification of the region containing codon 282 and digestion with Rsa I are presented for a normal homozygous patient (1) showing 100% of non-mutated RNA, for a patient homozygous for C282Y (2) showing 100 % of mutated RNA C282Y and for a composite heterozygous patient (3) showing 73% of non-mutated transcripts and 27% of C282Y transcripts;
  • FIG. 3C the percentages of non-mutated, mutated RNA for H63D and C282Y were determined for 14 composite heterozygotes (70% of H63D transcript), 11 H63D heterozygotes (72% of H63D transcripts) and 10 C282Y heterozygotes (68.5% wild transcripts);
  • FIG. 4 illustrates the profile of transcripts obtained in different biological samples: peripheral blood mononuclear cells (PBMC), liver sample and duodenum sample;
  • FIG. 4A after amplification of the region containing the codon 63 and enzymatic digestion with the restriction enzyme Dpn II, from samples of mononuclear cells, of the liver or of the duodenum of heterozygous subjects (Le3, Gu and Be2), obtains a major band corresponding to the H63D transcripts (170bp); the mRNAs of subjects homozygous for C282Y (Chi) show bands corresponding to wild transcripts (84 bp + 86 bp), in mononuclear cells (a), liver (b) and duodenum (c).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 4A after amplification of the region containing the codon 63 and enzymatic digestion with the restriction enzyme Dpn II, from samples of mononuclear cells, of the liver or of the duo
  • FIG. 4B after amplification of the region containing codon 282 and enzymatic digestion with the restriction enzyme Rsa I. from samples of mononuclear cells, of the liver or of the duodenum of heterozygous subjects (Le3, Gu and Be2), obtains a major band corresponding to wild RNAs (217 bp); the mRNAs of subjects homozygous for C282Y (Chi) show 100% of C282Y transcripts (189 bp) in mononuclear cells (a), liver (b) and duodenum (c). An additional band (76 bp) is present in all cases; M: markers; 1: PCR products before digestion (293 bp); 2: negative control;
  • FIG. 5A corresponds to the analysis of the sequence of genomic DNA with an antisense primer reveals the presence of a double peak (A + C) due to the presence of two missense mutations: a transition GA (C282Y) is associated with GC transversion (C282S) in a heterozygote (Be2);
  • FIG. 5B the sequencing of the cDNA, with an antisense primer reveals the presence of a major peak of cytosine due to the preferential detection of mRNA encoded by an allele carrying both the H63D mutation and the C282S mutation;
  • FIG. 6 illustrates different forms of transcripts, according to the splicing observed at the level of intron 4.
  • a liver biopsy was performed in all C282Y homozygotes and in 13 heterozygotes (seven composite heterozygotes, three H63D heterozygotes and three C282Y heterozygotes).
  • a duodenum biopsy was performed in four patients with atypical epigastric pain (a heterozygote C282Y, a heterozygote H63D, a homozygote C282Y and a composite heterozygote). All patients gave written consent for this study.
  • RNAs are extracted from 5 x 10 lymphocytes using the QIAamp blood kit (Qiagen GmbH, Germany).
  • the C282Y and H63D mutations are detected by enzymatic digestion of the products obtained by PCR containing these mutation sites according to the method described by A.M. Jouanolle et al., (Nat. Genêt., 1996, 14, 251-252).
  • Reverse transcription is performed in a reaction volume of 20 ⁇ l containing 500 mM dNTP, 10 mM DTT, 0.5 U / ml RNasin (Madison Wi.), 5 mM random hexamers, and 10 ⁇ g / ml of reverse transcriptase ( Gibco BRL, Bethesda, MD.).
  • the extracted RNAs are heated for 5 minutes at 70 ° C and cooled on ice before being added (1 ⁇ g) to the reaction medium. Incubations are carried out for one hour at 37 ° C.
  • the cDNA obtained by reverse transcription (5 ⁇ l, 0.25 ⁇ g) is subjected to a PCR amplification of the two regions containing the two missense mutations.
  • RT-PCR for the analysis of the H63D mutation is carried out using the pairs of primers I (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and II (SEQ ID NO: 3 and
  • the PCR conditions are as follows: 10 min at 94 ° C then 40 cycles of 94 ° C for 15 sec, 55 ° C for 15 sec and 72 ° C for 1 min, and finally 72 ° C for 10 min.
  • the cycles are carried out in a Perkin-Elmer 2400 (or 9600) thermal cycler. Negative controls are made with amplified RNA samples without reverse transcriptase.
  • the first PCR is carried out in 25 ⁇ l of reaction medium containing 10 mM Tris-HCl at pH 8.3, 50 mM of magnesium chloride, 0.001% of gelatin, 0.05 U of Taq DNA polymerase and 0, 5 mM of each primer (couple I for the analysis of the H63D mutation and couple read for the analysis of the C282Y mutation).
  • the products previously amplified in the first PCR are used as matrices and two new pairs of internal primers were used (couple II for the analysis of the H63D mutation and couple IV for the analysis of the C282Y mutation ).
  • Nested PCR is performed in
  • reaction medium containing 10 mM Tris-HCl at pH 8.3, 50 mM of magnesium chloride, 0.001% of gelatin, 0.05 U of Taq DNA polymerase
  • the PCR conditions are the same as described above.
  • the Taq is sequenced in a 9600 thermal cycler (Perkin Elmer) as follows: 30 sec at 96 ° C, 15 sec at 50 ° C and 4 min at 60 ° C for 25
  • the enlarged fragments are purified from non-incorporated nucleotides and primers on rapid spin TM columns (Boehringer Mannheim, Meylan, France).
  • the reaction media are then dried and resuspended in 4 ⁇ l of deionized formamide, 50 mM EDTA, pH 8.0, heated for 2 min at 90 ° C, transferred to ice and immediately deposited on a 6% denaturing polyacrylamide gel Migration on the gels is carried out seated for 12 h at 30 w in an ABI model 373A automatic sequencer.
  • HFE mRNAs are detectable in peripheral blood mononuclear cells
  • the HFE mRNAs of the peripheral blood mononuclear cells were amplified in the following patients: a homozygote C282Y, a homozygote H63D and a normal patient.
  • the digestion with Dpn II of the products obtained by amplification by RT-PCR using the pairs of primers I and II was analyzed on a gel.
  • the relative quantification of the HFE mRNA was carried out in 34 heterozygotes (14 composite heterozygotes, 11 heterozygotes H63D, 9 heterozygotes C282Y) including the three families (Be, Le and Bi); it is illustrated in the table HI below.
  • H63D mRNAs are predominant in all H63D heterozyggotes, including composite heterozygotes. In contrast, in all C282Y heterozygotes, wild mRNAs have been found to be predominant. It should be noted that two H63D homozygotes (a young man of 25 years and a menopausal woman) without alcohol consumption have an increase in ST (65.3 and 56.8%>) and a still moderate ferritinemia (113 and 178 ng / ml). 5. The distribution of HFE mRNAs is identical in peripheral blood mononuclear cells and in liver and duodenum samples
  • HFE mRNAs were studied in liver biopsies of six patients (one composite heterozygote, three heterozygotes, one C282Y homozygote and one patient without mutation) and in duodenum biopsies of four patients (two composite heterozygotes, one heterozygote and one homozygote C282Y).
  • Three patients underwent both a liver and duodenum biopsy (a composite heterozygote, a C282Y heterozygote and a C282Y homozygote).
  • the distribution of the bands corresponding to the HFE mRNAs is identical in the mononuclear cells of the peripheral blood, the liver and the duodenum (FIG. 4).
  • the band 293 bp corresponding to the HFE mRNA was detected in all cases and an additional band at 359 bp is present in all the mononuclear cells of the peripheral blood in almost all heterozygotes. These bands were only detected when the PCR amplification was carried out with a sense primer located on exon 4 and an antisense primer, located on exon 5 (pair IV, Table II) but not when the other regions of the HFE mRNAs were amplified.
  • the sequencing shows that the band 359 bp corresponds to the RNAs spliced using an excision-splicing acceptor site located on intron 4 (nucleotide 6834-6835) ( Figures 5 A and 5B).

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Abstract

Procédé d'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, chez l'homme et ses applications. Ledit procédé comprend essentiellement l'établissement du profil des différents transcrits du gène HFE, à partir d'un échantillon biologique.

Description

PROCEDE D'EVALUATION DU RISQUE D'APPARITION D'UNE SURCHARGE EN FER ET SES APPLICATIONS.
La présente invention est relative à un procédé d'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, chez l'homme et à ses applications.
Les surcharges en fer sont le fait de causes variées, héréditaires ou acquises. Parmi les troubles héréditaires du métabolisme du fer, on peut citer l'hémochromatose héréditaire et l'hémochromatose dite juvénile, ra(hypo)transferri- némie héréditaire, l'acéruloplasminémie héréditaire ; parmi les causes de surcharges acquises, on peut citer le syndrome polymétabolique, les maladies chroniques du foie (cirrhose évoluée, hépatite virale C, maladies alcooliques du foie), la porphyrie cutanée tardive et les maladies hématologiques (dysérythropoïèses, anémies hémoly- tiques).
L'hémochromatose héréditaire est la maladie génétique récessive la plus fréquente dans les pays d'Europe du Nord (1/400). Le gène de l'hémochromatose héréditaire (gène HFE) a été localisé sur le bras court du chromosome 6. Ce gène code pour une protéine apparentée aux molécules HLA de classe I, qui pourrait réguler l'absorption du fer en se complexant au récepteur de la transferrine (WO 97/38137 ; J.N. Feder et al., P.N.A.S., 1998, 95, 1472-1477). La structure de ce gène a été décrite : il comprend 12146 pb, et inclut
7 exons et 6 introns positionnés comme suit : exon 1 : positions 1028-1324 ; intron 1 : positions 1325-4651 ; exon 2 : positions 4652-4915 ; intron 2 : positions 4916-5124 ; exon 3 : positions 5125-5400 ; intron 3 : positions 5401-6493 ; exon 4 : positions 6494-6769 ; intron 4 : positions 6770-6927 ; exon 5 : positions 6928-7041 ; intron 5 : positions 7042-7994 ; exon 6 : positions 7995-9050 ; intron 6 : positions 9051-10205 et exon 7 : positions 10206-10637 (EMBL n° d'accès Z92910).
Deux mutations du gène HFE ont été décrites : un changement d'une cystéine en tyrosine, au niveau de l'acide aminé 282 (C282Y) et un changement d'une histidine en acide aspartique au niveau de l'acide aminé 63 (H63D). Ces mutations peuvent être présentes à l'état homozygote ou hétérozygote (WO 97/38137 ; J.N. Feder et al., précité ; A. Waheed et al, P.N.A.S., 1997, 94, 12384-12389).
De nombreux travaux ont conduit à la mise au point de méthodes de diagnostic destinées uniquement à détecter la présence de ces mutations chez les patients homozygotes, notamment des méthodes comprenant une amplification génique suivie d'une digestion enzymatique ; ainsi la demande internationale WO 97/38137 montre que la mutation 24dl (C282Y) crée un site de restriction supplémentaire pour l'enzyme Rsa f, alors que la mutation 24d2 (H63D) entraîne la disparition d'un site de restriction pour toutes les enzymes de utilisées, notamment l'enzyme Dpn II. La mise en œuvre de cette méthode utilise comme amorces des oligonucléotides issus du gène HFE et comprenant au moins 8 nucléotides.
De même C. Ferec et al. (Trans us. Clin. BioL, 1998, 5, 283-289) rapportent que la mutation C282Y donne naissance à un fragment de 110 pb que l'on retrouve aussi bien chez un patient homozygote pour la mutation (C282Y) que chez un patient hétérozygote pour ladite mutation. Toutefois, ces Auteurs utilisent ces résultats uniquement comme un marqueur direct du gène, qui permet de diagnostiquer les sujets homozygotes en période pré-symptomatique. Plusieurs travaux ont montré que la mutation homozygote au niveau du codon 282 était retrouvée avec une fréquence très élevée chez les malades atteints d'hémochromatose génétique ou héréditaire (82 à 100 %) (J.N. Feder et al., 1998, précité ; A.M. Jouanolle et al., Nat. Genêt., 1996, 14, 249-251). Cependant la situation est moins claire pour les patients hétérozygotes en 282 et/ou en 63 (les patients hétérozygotes en 282 et 63 sont dits hétérozygotes composites). En effet, il a été montré que seulement 15 à 25 % des patients identifiés comme hétérozygotes présentaient des anomalies du bilan martial (saturation en transferrine élevée ou ferritine sérique élevée) et il n'a pas été possible d'établir une corrélation entre les signes cliniques et les données génétiques (J.N. Feder et al., Nat. Genêt., 1996, 13, 399-408) ; toutefois, les complications liées à une surcharge en fer isolée sont rares dans cette population (Bulaj et al., N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1799-1805) ; ces résultats montrent que la simple détection de mutations au niveau du codon 282 et/ou du codon 63 du gène HFE, à l'état hétérozygote, n'est pas toujours corrélée à la surcharge en fer observée chez les malades et ne suffit donc pas pour estimer le risque de développement ultérieur d'une surcharge sévère en fer.
En effet, chez la plupart des sujets homozygotes C282Y, les paramètres biologiques du fer sont nettement augmentés :
- taux de ferritine sérique :
> 300 μg/1, chez 96 % des hommes homozygotes, > 200 μg/1, chez 97 % des femmes homozygotes,
- index hépatique en fer (IHF ; concentration hépatique en fer en μmoles/'g de foie sec/âge) : > 1,9, chez 91,3 % des sujets homozygotes ; la surcharge hépatique en fer est généralement prédominante dans les hépatocytes avec un gradient décroissant des zones périportales aux zones centrolobulaires avec, en cas de cirrhose : (i) présence de dépôts sidériques au sein du tissu fibreux, notamment dans les parois des vaisseaux et des canaux biliaires et (ii) distribution homogène de la surcharge, d'un nodule à l'autre, - test de saturation en transferrine : > 55 % chez 90 % des sujets homozygotes,
- quantité de fer éliminé par phlébotomie > 5 g, chez 70 % des hommes et > 73 % des femmes homozygotes. En revanche, ces paramètres sont plus fluctuants chez les sujets hétérozygotes.
Environ 20 % des sujets hétérozygotes présentent une saturation en transferrine supérieure à 45 % et seulement 5 % des hétérozygotes C282Y présentent les critères de diagnostic clinique rencontrés chez les homozygotes, bien que l'on n'observe qu'une faible augmentation de la surcharge en fer dans le foie (Crawford et al, Gastroenterol, 1998, 114, 1003-1008).
Ainsi, alors que toutes les mutations constituent un risque majeur de surcharge sévère en fer, seule la mutation homozygote au niveau du codon 282 qui constitue un risque majeur à court terme est détectable par l'analyse du génotype ; dans tous les autres cas, l'analyse du génotype et la détection d'une mutation hétérozygote au niveau du codon 282 ou du codon 63, ne permet pas d'évaluer le risque d'apparition de surcharge sévère en fer ; ainsi, la simple détection d'une mutation, même par caractérisation des transcrits, n'apporte pas d'élément d'information supplémentaire par rapport aux paramètres phénotypiques habituellement utilisés pour évaluer ou apprécier les risques de développement et/ou d'évolution d'une hémochromatose héréditaire dans les familles à risque.
L'absence de corrélation entre le génotype et les paramètres phénotypiques a notamment été étudié par P.C. Adams et al. (Gastroenterology, 1998, 114, 319-323). Ils ont montré que les critères phénotypiques de diagnostic et d'évolution d'une hémochromatose génétique sont, par ordre décroissant de sensibilité : le taux de ferritine sérique, l'index hépatique en fer, le test de saturation en transferrine et la quantité de fer éliminé par phlébotomie.
Les Inventeurs se sont donc donné pour but de pourvoir à un test d'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, notamment dans les familles prédisposées, qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les tests existants (tests biologiques ou analyse du génotype) et qui permettent notamment d'évaluer les risques de surcharge en fer chez les patients hétérozygotes.
Ils ont trouvé, de manière inattendue, que la détermination du profil d'expression des transcrits, c'est à dire la mesure de la quantité relative des différents transcrits, constitue pour l'ensemble des malades (homozygotes et hétérozygotes) un paramètre fiable d'évaluation du risque de surcharge sévère en fer ; en effet, ils ont trouvé que le type et la quantité des ARNs sont corrélés aux paramètres phénotypiques, notamment au taux de fer et au risque éventuel de surcharge.
La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, notamment chez un sujet prédisposé, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement l'établissement du profil des différents transcrits du gène HFE, à partir d'un échantillon biologique.
Conformément à l'invention, ledit procédé permet la quantification relative des différents transcrits détectés.
Le procédé selon l'invention permet de détecter :
- d'une part le type de transcrit : normal ou muté au niveau du codon 282 et/ou du codon 63 et
- d'autre part la quantité relative des différents transcrits obtenus.
Ce procédé permet d'élaborer un profil des transcrits ; il apparaît, de manière surprenante, que :
- le transcrit normal est toujours prédominant chez les hétérozygotes C282Y (68,5 % + 2,7),
- le transcrit muté H63D est toujours prédominant chez les hétérozygotes H63D (70,6 % + 1,5) et chez les hétérozygotes composites (71,9 % + 1,2 ou 69,3 % + 1,4), selon que les signaux ont été obtenus après amplification des régions entourant respectivement le codon 63 ou le codon 282, - chez le sujet normal, on détecte 100 % de transcrit non-muté,
- chez les sujets homozygotes H63D, on détecte 100 % de transcrits mutés H63D,
- chez les sujets homozygotes C282Y, on détecte 100 % de transcrits mutés C282Y, - la proportion relative de l'ARNm HFE prédominant est semblable dans les cellules mononucléées du sang périphérique, les biopsies hépatiques ou les biopsies duodénales.
L'étude de la corrélation du profil de transcrits avec les paramètres phénotypiques relatifs au fer (taux de ferritine sérique, index hépatique en fer, satura- tion en transferrine par exemple) a permis aux Inventeurs d'observer que l'expression prédominante de l'ARN H63D s'accompagne fréquemment d'anomalies du bilan martial chez les malades hétérozygotes du sexe masculin et après la ménopause, chez la femme : cette expression prédominante pourrait constituer un facteur de risque de surcharge sévère en fer, et/ou de lésion hépatique en particulier en présence d'autres facteurs génétiques ou environnementaux, y compris chez les patients avec un bilan martial normal au moment de l'examen.
Parmi les facteurs environnementaux, il a été montré par exemple, qu'il existe une synergie entre la toxicité du fer et celle de l'alcool, dans l'apparition d'une fibrose du foie dans un modèle animal (H.L. Bonkovsky et al., Seminars in liver disease, 1996, 16, 1, 65-82).
Conformément à l'invention, il est possible de détecter les transcrits suivants :
- transcrits mutés on non, dans lesquels l'intron 4 est totalement épissé ; et
- transcrits mutés ou non, dans lesquels l'intron 4 est partiellement épissé : zone allant du nucléotide 6770 au nucléotide 6927 (gain de 158 nucléotides) ou zone allant du nucléotide 6770 au nucléotide 6835 (gain de 66 nucléotides).
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend :
(a) l'extraction des ARNs totaux, à partir d'un échantillon biologique, (b) la transcription inverse des ARNs obtenus en (a), et l'obtention des ADNc correspondants,
(c) une première amplification des régions contenant les codons 63 et 282 des ADNc obtenus en (b), en utilisant un couple d'amorces I, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 2 qui contient le codon 63 et un couple d'amorces III, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 4 qui contient le codon 282,
(d) une deuxième amplification des produits d'amplification obtenus en (c), en utilisant un couple d'amorces II, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces I et un couple d'amorces IN, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces III, au moins une amorce des couples d'amorces II et IN étant de préférence couplés à un marqueur approprié et
(e) l'établissement du profil des transcrits par analyse des produits obtenus en (d).
Les amorces mises en œuvre comprennent avantageusement de 20 à 30 nucléotides. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'étape
(c) dudit procédé est mise en œuvre avec un couple d'amorces I, constitué des séquences SEQ ID ΝOJ et SEQ ID ΝO:2 et un couple d'amorces III, constitué des séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO:6.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'étape (d) dudit procédé est mise en œuvre avec un couple d'amorces II, constitué des séquences SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4 et un couple d'amorces IV, constitué des séquences SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8, les séquences SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO: 8 étant de préférence marquées.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'échantillon biologique est de préférence constitué de cellules mononucléées du sang périphérique ; en effet, le profil de transcrits dans lesdites cellules est identique au profil de transcrits obtenus à partir de biopsies de tissus, est beaucoup plus simple à mettre en œuvre et est sans aucun risque pour le patient.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'analyse selon l'étape (e) est réalisée par digestion enzymatique des produits PCR, suivie d'une séparation des produits obtenus par électrophorèse appropriée, notam- ment électrophorèse sur gel et d'une détection du marqueur.
Conformément à ce mode de mise en œuvre, ladite digestion est mise en œuvre en présence des enzymes de restriction Rsa I et Dpn II.
La mutation C282Y crée un nouveau site Rsa I et la mutation H63D élimine un site Dpn IL Conformément à l'invention, la digestion par Rsa I, des produits
PCR amplifiés en utilisant les couples d'amorces III et IV montre des bandes correspondant aux ARNs sauvages (217 pb) et aux ARNs portant la mutation C282Y (189 pb + 28 pb) ; une bande (76 pb) correspond à un autre site pour Rsa I et est présente dans tous les cas. La digestion par Dpn II de produits PCR amplifiés en utilisant les couples d'amorces I et II montre des bandes correspondant aux transcrits sauvages (84 + 86 pb) et mutés (170 pb) (voir figure 1).
De manière surprenante, un tel procédé, est réalisable en routine, à partir d'un simple échantillon de sang total périphérique et après extraction des ARNs totaux contenus dans les cellules mononucléées du sang, soit à partir d'une simple lyse des globules rouges, soit après réalisation d'un gradient de FICOLL (purification poussée). En outre, la détection des ARNs mutés ou non est parfaitement corrélée au résultat du génotype chez tous les malades.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'analyse selon l'étape (e) est réalisée par hybridation avec une sonde marquée sélec- tionnée dans le groupe constitué par l'exon 2, l'exon 4 ou l'intron 4 du gène HFE ou un fragment de ceux-ci.
Lesdites sondes comprennent de préférence entre 20 et 50 nucléotides.
Un tel procédé permet en outre de détecter d'autres anomalies de l'expression du gène (absence complète de transcrits, par exemple), notamment en présence d'une discordance entre le génotype et les résultats de l'étude des transcrits.
Un tel procédé suggère qu'il existe une corrélation phéno- type/expression différentielle d'ARN.
La présente invention a également pour objet des amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NOJ à SEQ ED NO:9. La présente invention a également pour objet des sondes sélectionnées dans le groupe constitué par l'exon 2, l'exon 4, l'intron 4 du gène HFE ou un fragment de ceux-ci.
La présente invention a également pour objet un kit pour l'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, caractérisé en ce qu'il comprend outre les réactifs convenables pour l'extraction des ARNs et la transcription inverse desdits ARNs, des réactifs pour l'amplification des fragments des ADNc correspondant aux transcrits du gène HFE contenant le codon 63 ou le codon 282, à savoir :
- un couple d'amorces I, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 2 qui contient le codon 63,
- un couple d'amorces III, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 4 qui contient le codon 282,
- un couple d'amorces II, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces I et - un couple d'amorces IN, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces III, les couples d'amorces II et IN étant, de préférence, couplés à un marqueur approprié.
Les couples d'amorces préférés sont notamment ceux décrits ci- dessus (SEQ ID ΝOJ à SEQ ID ΝO:9). La présente invention a, en outre, pour objet un transcrit muté du gène HFE, caractérisé en ce que le codon 282 code pour une serine.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente la détection des ARNs HFE dans les cellules mononucléées chez des sujets normaux, homozygotes pour C282Y et homozygotes pour H63D. Après amplification des régions contenant le codon 63 (A) et le codon 282 (B), les produits PCR ont été respectivement digérés avec les enzymes de restric- tion Dpn II et Rsa I (lignes 2, 4 et 6) ou non digérés (lignes 1, 3 et 5). Les tailles des produits sont indiqués. La digestion par Rsa I des produits PCR amplifiés en utilisant les couples d'amorces III et IV montre des bandes correspondant aux ARNs sauvage (217 pb) et aux ARNs portant la mutation C282Y (189 pb + 28 pb) ; une bande (76 pb) correspond à un autre site pour Rsa I et est présente dans tous les cas. La digestion par Dpn //des produits PCR amplifiés en utilisant les couples d'amorces I et II montre des bandes correspondant aux transcrits sauvages (84 + 86 pb) et mutés (170 pb) ; - la figure 2 représente les ARNs codés par un des allèles préféren- tiellement détectés dans les cellules mononucléées. Trois familles (Bi, Le, Be) ont été étudiées. Les ARNs codés par les HFE mutés et sauvages ont été étudiés dans les cellules mononucléées de patients hétérozygotes composites (Bi3, Le3, Be2 et Be3), hétérozygotes pour H63D (Bil, Le2 et Be4) et hétérozygotes pour C282Y (Bi2 et Bel) ; figure 2 A : génotype des membres de trois familles étudiées ; figure 2B : après amplification de la région contenant le codon 63 et digestion par Dpn II, une bande majoritaire de 170 pb correspondant aux transcrits H63D a été détectée chez tous les patients hétérozygotes pour la mutation H63D et hétérozygotes composites ; figure 2C : après amplification de la région contenant le codon 282 et digestion par Rsa I, une bande majoritaire de 217 pb correspondant au transcrit non muté a été détectée chez les patients hétérozygotes pour C282Y et chez les hétérozygotes composites ;
- la figure 3 illustre la quantification relative des transcrits mutés et non mutés. Après amplification des régions contenant les codons 63 et 282 en utilisant les amorces de séquences SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:8, couplées à un fluorophore (6F AM), la taille des produits PCR ainsi que l'intensité de la fluorescence ont été automatiquement mesurés en utilisant un logiciel Genescan software (version 1.2) dans un séquenceur automatique ABI modèle 273 (Perkin Elmer) ; figure 3A : les signaux obtenus après amplification de la région contenant le codon 63 et digestion par Dpn II sont présentés pour un patient homozygote normal (1) montrant 100 % d'ARN non muté, pour un patient homozygote pour H63D (2) montrant 100 % d'ARN muté H63D et pour un patient hétérozygote composite (3) montrant 74 % de transcrits H63D et 26 % de transcrits non mutés ; figure 3B : les signaux obtenus après amplification de la région contenant le codon 282 et digestion par Rsa I sont présentés pour un patient homozygote normal (1) montrant 100 % d'ARN non muté, pour un patient homozygote pour C282Y (2) montrant 100 % d'ARN muté C282Y et pour un patient hétérozygote composite (3) montrant 73 % de transcrits non mutés et 27 % de transcrits C282Y ; figure 3C : les pourcentages d'ARN non mutés, mutés pour H63D et C282Y ont été déterminés pour 14 hétérozygotes composites (70 % de transcrit H63D), 11 hétérozygotes H63D (72 % de transcrits H63D) et 10 hétérozygotes C282Y (68,5 % de transcrits sauvages) ;
- la figure 4 illustre le profil de transcrits obtenu dans différents échantillons biologiques : cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), échantillon de foie et échantillon de duodénum ; figure 4A : après amplification de la région contenant le codon 63 et digestion enzymatique par l'enzyme de restriction Dpn II, à partir d'échantillons de cellules mononucléées, de foie ou de duodénum de sujets hétérozygotes (Le3, Gu et Be2), on obtient une bande majeure correspondant aux transcrits H63D (170pb) ; les ARNms des sujets homozygotes pour C282Y (Chi) montrent des bandes correspondant aux transcrits sauvages (84 pb + 86 pb), dans les cellules mononucléées (a), le foie (b) et le duodénum (c). M : marqueurs ; 1 : produits PCR avant digestion (170 pb) ; 2 : contrôle négatif ; figure 4B : après amplification de la région contenant le codon 282 et digestion enzymatique par l'enzyme de restriction Rsa I. à partir d'échantillons de cellules mononucléées, de foie ou de duodénum de sujets hétérozygotes (Le3, Gu et Be2), on obtient une bande majeure correspondant aux ARNs sauvages (217 pb) ; les ARNms des sujets homozygotes pour C282Y (Chi) montrent 100 % de transcrits C282Y (189 pb) dans les cellules mononucléées (a), le foie (b) et le duodénum (c). Une bande supplémentaire (76 pb) est présente dans tous les cas ; M : marqueurs ; 1 : produits PCR avant digestion (293 pb) ; 2 : contrôle négatif ;
- la figure 5 illustre une nouvelle mutation dans le gène HFE : la mutation C282S ; figure 5A : correspond à l'analyse de la séquence de l'ADN géno- mique avec une amorce anti-sens révèle la présence d'une double pic (A + C) du à la présence de deux mutations faux-sens : une transition G-A (C282Y) est associée à une transversion G-C (C282S) chez un hétérozygote (Be2) ; figure 5B : le séquençage de l'ADNc, avec une amorce antisens révèle la présence d'un pic majeur de cytosine due à la détection préférentielle d'ARNm codé par un allèle portant à la fois la mutation H63D et la mutation C282S ; - la figure 6 illustre différentes formes de transcrits, selon l'épissage observé au niveau de l'intron 4.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple : Evaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, chez différents sujets.
METHODES
1. Patients et échantillons tissulaires
Trois familles (Bi, Le et Be) qui comprennent des hétérozygotes composites, des hétérozygotes H63D et des hétérozygotes C282Y, ont été étudiées.
Les taux de fer sérique, de ferritine et le pourcentage de saturation de la transferrine (TS) ont été mesurés par les techniques usuelles. Les résultats sont ceux obtenus le plus tôt possible après une biopsie du foie et au moment du diagnostic dans les autres cas. Les échantillons obtenus par biopsie du foie sont fixés dans de la formaline tamponnée, puis inclus dans de la paraffine. Un marquage au bleu de Prusse Perl est réalisé pour évaluer la charge en fer et est quantifié comme suit : 0 : absence de marquage, + : faible marquage périportal, et ++ : pour environ 50 % d'hépatocytes positifs, +++ : pour environ 70 % d'hépatocytes positifs et ++++ : pour un marquage diffus, important. La concentration hépatique en fer est mesurée par absorption spectrophotométrique. Les paramètres du fer, les facteurs de la surcharge en fer et les résultats des biopsies du foie sont rassemblés dans le Tableau I en fonction du génotype.
TABLEAU I Résultats cliniques, biochimiques et génotype HFE chez trois familles d'hétérozygotes.
Figure imgf000012_0001
51 patients ont été étudiés ; 14 hétérozygotes portant les deux mutations C282Y et H63D, 20 hétérozygotes (9 C282Y et 11 H63D) et 17 homozygotes (2 portant la mutation H63D et 15 portant la mutation C282Y), incluant les membres de la famille initiale. Une biopsie du foie a été réalisée chez tous les homozygotes C282Y et chez 13 hétérozygotes (sept hétérozygotes composites, trois hétérozygotes H63D et trois hétérozygotes C282Y). Une biopsie du duodénum a été réalisée chez quatre patients pour des douleurs épigastriques atypiques (un hétérozygote C282Y, un hétérozygote H63D, un homozygote C282Y et un hétérozygote composite). Tous les patients ont donné leur consentement écrit pour cette étude.
2. Préparation des ADN et des ARN
6
Pour chaque patient, l'ADN est extrait de 5 x 10 lymphocytes en utilisant le kit sanguin QIAamp (Qiagen GmbH, Allemagne). Les ARN sont extraits
6 de 5x10 cellules mononucléées du sang périphérique par une méthode dérivée de la technique de l'isothiocyanate, applicable à l'ARN, selon les instructions du fabricant (Eurobio, les Ulis, France). Les concentrations en ADN et en ARN sont mesurées par spectrophotométrie et contrôlées par migration sur des gels d'agarose à 1%, après marquage au bromure d'éthidium.
3. Amplification des ADN et génotvpage
Les mutations C282Y et H63D sont détectées par digestion enzymatique des produits obtenus par PCR contenant ces sites de mutation selon la méthode décrite par A.M. Jouanolle et coll., (Nat. Genêt., 1996, 14, 251-252).
4. Amplification par RT-PCR des gènes HFE transcrits
Toutes les amorces et toutes les sondes ont été synthétisées par une méthode classique de synthèse d'oligonucléotides. Les séquences des amorces sont données dans le Tableau IL
TABLEAU II Séquences des amorces pour l'analyse des transcrits du gène HFE
Figure imgf000013_0001
La transcription inverse est effectuée dans un volume réactionnel de 20 μl contenant 500 mM dNTP, 10 mM DTT, 0,5 U/ml RNasine (Madison Wi.), 5 mM d'hexamères aléatoires, et 10 μg/ml de transcriptase inverse (Gibco BRL, Bethesda, MD.). Les ARN extraits sont chauffés pendant 5 minutes à 70°C et refroidis sur de la glace avant d'être ajoutés (1 μg) au milieu réactionnel. Les incubations sont réalisées pendant une heure à 37°C.
L'ADNc obtenu par transcription inverse (5 μl, 0,25 μg) est soumis à une amplification PCR des deux régions contenant les deux mutations faux-sens.
La RT-PCR pour l'analyse de la mutation H63D est effectuée en uti- lisant les couples d'amorces I (SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO:2) et II (SEQ ID NO:3 et
SEQ ID NO:4)alors que la RT-PCR pour la mutation C282Y est effectuée en utilisant les couple d'amorces III (SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6) et IV (SEQ ID NO:7 et SEQ
ID NO:8) (Tableau II).
Les conditions de la PCR sont les suivantes : 10 min à 94°C puis 40 cycles de 94°C pendant 15 sec, 55°C pendant 15 sec et 72°C pendant 1 min, et enfin 72°C pendant 10 min. Les cycles sont effectués dans un thermocycleur Perkin-Elmer 2400 (ou 9600). Les témoins négatifs sont réalisés avec des échantillons d'ARN amplifié sans transcriptase inverse.
La première PCR s'effectue dans 25 μl de milieu réactionnel conte- nant 10 mM de Tris-HCl à pH 8,3, 50 mM de chlorure de magnésium, 0,001% de gélatine, 0,05 U de Taq ADN polymérase et 0,5 mM de chaque amorce (couple I pour l'analyse de la mutation H63D et couple lu pour l'analyse de la mutation C282Y).
Dans la seconde amplification, les produits préalablement amplifiés dans la première PCR sont utilisés comme matrices et deux nouveaux couples d'amorces internes ont été utilisés (couple II pour l'analyse de la mutation H63D et couple IV pour l'analyse de la mutation C282Y). La PCR imbriquée est effectuée dans
50 μl de milieu réactionnel contenant 10 mM de Tris-HCl à pH 8,3, 50 mM de chlorure de magnésium, 0,001% de gélatine, 0,05 U de Taq ADN polymérase
(Pharmacia, Uppsala, Suède), 0,5 mM de chaque amorce, 0J5 mM de chaque dNTP et 1,5 μl des produits préalablement amplifiés par PCR qui sont utilisés comme matrice.
Les conditions de la PCR sont les mêmes que décrites précédemment.
5. Analyse des gènes HFE transcrits
Deux approches ont été utilisées pour détecter les mutations C282Y et H63D : (1) la digestion par une enzyme de restriction des produits obtenus par RT-PCR dans lesquels la mutation C282Y crée un nouveau site de restriction Rsa I (nucléotide 1063 à 1066) et où la mutation H63D élimine un site Dpn II, (2) un séquençage complet des produits obtenus par RT-PCR. Le résultat de la digestion par Rsa I des produits obtenus par amplification par RT-PCR en utilisant les couples d'amorces III et IV a été analysé sur un gel d'agarose à 2,5%. : des bandes correspondant au transcrit sauvage et au transcrit muté (C282Y) sont détectées respectivement à 217 pb et 189 pb ; une bande à 76 pb, due à la présence d'un site supplémentaire pour Rsa I (nucléotides 1035 à 1038) est présente dans tous les cas.
Le résultat de la digestion par Dpn II des produits obtenus par amplification par RT-PCR en utilisant les couples d'amorces I et II a été analysé sur un gel d'agarose à 2% : des bandes correspondant au transcrit sauvage et au transcrit muté (H63D) ont été détectées respectivement à (84 + 86 pb) et 170 pb. Dans tous les cas, deux PCR imbriquées avec les mêmes couples d'amorces utilisant respectivement l'amorce de SEQ ID NO:3 et l'amorce de SEQ ID NO:8, couplées à un fluorophore (6 FAM, Perkin-Elmer) ont été effectuées pour déterminer la proportion relative des transcrits muté et sauvage (respectivement H63D et C282Y). Après PCR imbriquée et digestion enzymatique, les produits sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) sur des gels à 6 %. La taille et l'intensité des différentes bandes sont mesurées automatiquement et quantifiées en utilisant un logiciel GeneScan (version (1.2) dans un séquenceur automatique ABI Modèle 373 A. Les produits obtenus par PCR ont également été séquences en utilisant le kit Prism reaction dideoxyterminator selon le protocole fourni par la fabricant (Perkin Elmer). Le séquençage des Taq est effectué dans un thermocycleur 9600 (Perkin Elmer) comme suit : 30 sec à 96°C, 15 sec à 50°C et 4 min à 60°C pendant 25 cycles. Les fragments élargis sont purifiés à partir de nucléotides non incorporés et d'amorces sur colonnes rapides TM spin (Boehringer Mannheim, Meylan, France). Les milieux réactionnels sont ensuite séchés et remis en suspension dans 4 μl de formamide déionisé, 50 mM EDTA, à pH 8,0, chauffés pendant 2 min à 90°C, transférés sur de la glace et immédiatement déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 %. La migration sur les gels est réalisée pendant 12 h à 30 w dans un séquen- ceur automatique ABI model 373A.
RESULTATS
1. Les ARNm HFE sont détectables dans les cellules mononucléées du sang périphérique
Les ARNm HFE des cellules mononucléées du sang périphérique ont été amplifiés chez les patients suivants : un homozygote C282Y, un homozygote H63D et un patient normal. La digestion par la Dpn II des produits obtenus par amplification par RT-PCR en utilisant les couples d'amorces I et II a été analysée sur un gel d'agarose à 2 % (figure 1A) : une seule bande à 170 pb a été détectée chez l'homozygote H63D et deux bandes à 84 et 86 pb ont été détectées chez l'homozygote C282Y et chez le patient normal.
Le résultat de la digestion par Rsa I des produits obtenus par ampli- fication par RT-PCR en utilisant les couples d'amorces III et IN a été analysé sur un gel d'agarose à 2,5 % (figure 1B) : une seule bande à 189 pb a été détectée chez l'homozygote C282Y et une seule bande à 217 pb chez l'homozygote H63D et le patient normal. Ces résultats ont été confirmés chez tous les autres homozygotes et étaient en accord avec le génotype. Ces résultats montrent que les ARΝm HFE mutés C282Y et H63D sont identifiés de manière reproductible par RT-PCR et digestion enzymatique.
2. Les A Νm HFE codés par un seul allèle sont préférentiellement détectés dans les cellules mononucléées du sang périphérique Trois familles (Bi, Le et Be) qui comprennent des hétérozygotes composites (Bi3, Le3, Be2 et Be3), des hétérozygotes portant la mutation H63D (Bil, Le2 et Be4), et des hétérozygotes portant la mutation C282Y (Bi2 et Bel) ont été étudiés (Figure 2A). Après amplification de la région contenant le codon 63 et le clivage par l'enzyme de restriction Dpn II, une bande principale à 170 pb correspondant aux mutants transcrits (H63D) et deux bandes moins importantes à 84 et 86 pb correspon- dant au transcrit sauvage ont été détectées chez tous les hétérozygotes H63D (Bil, Le2 et Be4) et chez tous les hétérozygotes composites (Bi3, Le3, Be2 et Be3) (Figure 2B). Les patients hétérozygotes pour C282Y (Bel et Bi2) et le patient homozygote pour C282Y (Lel) ont montré 100% de transcrits non-mutés (84 et 86 pb).
Après amplification de la région contenant le codon 282 et clivage par l'enzyme de restriction Rsa I, une bande principale à 217 pb correspondant au transcrit non-muté (Figure 2C) et une bande moins importante à 189 pb correspondant au transcrit muté (C282Y) ont été détectées chez les patients hétérozygotes C282Y (Bi2 et Bel) et chez les hétérozygotes composites (Bi3, Le3, Be2 et Be3). Une bande unique à 217 pb correspondant au transcrit non-muté a été détectée chez les patients homozygotes C282Y (Lel).
Ces résultats ont été reproduits quatre fois de manière indépendante et montrent que l'ARΝm HFE portant la mutation H63D est toujours prédominant chez les hétérozygotes composites et chez les patients hétérozygotes H63D et que l'ARΝm non-muté est détecté de manière préférentielle chez tous les hétérozygotes C282Y. En revanche les ARΝm C282Y ne sont jamais prédominants chez les patients hétérozygotes et ce, quelque soit le génotype. 3. Analyse quantitative relative des transcrits mutés et non-mutés
Après PCR imbriquée des régions contenant le codon 63 et le codon 282 en utilisant respectivement les amorces fluorescentes de SEQ ID NO:3 et de SEQ ID NO: 8, la taille et l'intensité de la fluorescence a été mesurée automatiquement en utilisant un logiciel GeneScan ainsi qu'il a été décrit dans "Méthodes" (Figure 3).
Après amplification de la région entourant le codon 63 et digestion par Dpn II on détecte : 100%» de transcrit non-muté chez un patient normal (Figure 3AJ), 100% de transcrits mutés H63D chez un patient homozygote H63D (figure 3A.2) et 74%o de transcrit H63D et 26% de transcrit non-muté chez un patient hétérozygote composite typique (Figure 3A.3).
Après amplification de la région entourant le codon 282 et digestion par Rsa I, on détecte : 100% de transcrit non-muté chez un patient normal homozygote
(Figure 3BJ), 100% de transcrits mutés C282Y chez un patient homozygote C282Y (Figure 3B.2) et 73% de transcrit non-muté et 27% de transcrit muté C282Y chez un patient hétérozygote composite typique (Figure 3B.3).
La quantification relative de l'ARNm HFE a été réalisée chez 34 hétérozygotes (14 hétérozygotes composites, 11 hétérozygotes H63D, 9 hétérozygotes C282Y) incluant les trois familles (Be, Le et Bi) ; elle est illustrée dans le tableau HI ci-après.
TABLEAU III
Quantification relative des ARNm HFE chez les hétérozygotes
Figure imgf000018_0001
Aussi bien la figure 3C que le Tableau III montrent que : le transcrit normal est toujours prédominant chez les hétérozygotes C282Y (68,5 % + 2,7) alors que le transcrit muté H63D est toujours prédominant chez les hétérozygotes H63D (70,6 % ± 1,5) et chez les hétérozygotes composites [71,9 % ± 1,2 ou 69,3 % + 1,4 selon que les signaux ont été obtenus après amplification des régions entourant respectivement le codon 63 (Figure 3A.3) ou le codon 282 (Figure 3B.3)]. 4. Phénotvpe biologique et histologique des hétérozygotes étudiés
Les paramètres cliniques et biochimiques relatifs au fer des patients qui ont été étudiés par la quantification des ARNm HFE sont résumés comme suit : 4J Patients hétérozygotes composites :
10 hommes et 4 femmes ont été étudiés. Trois femmes présentent une ST et une ferritinémie normales et une femme menopausée présente une ST légèrement augmentée (48 %>) et une ferritinémie normale (113 ng/ml). Huit hommes ont des ST légèrement à fortement (42 % à 85,5 %) augmentées et une ferritinémie de 127 à 1225 ng/ml. Les taux les plus élevés sont observés chez des patients ayant une consommation excessive d'alcool (> 80 g par jour). Une biopsie du foie, réalisée chez cinq de ces patients, montre une surcharge en fer allant de faible à modérée (marquage par coloration de Perl 0 à + et/ou IHF < 1,2). De manière surprenante, deux autres patients sans prise d'alcool importante et issus de la même famille (Be2 et Be3) présentent une importante surcharge en fer (ST : 74 et 100 % ; ferritinémie 276 et 3958 ng/ml : marquage par coloration de Perl +++ ou IHF > 1,9). 4.2 Patients hétérozygotes H63D :
Huit hommes et trois femmes ont été étudiés. Deux femmes méno- pausées présentaient une ferritinémie normale à légèrement élevée (44,4 ng/ml à 232 ng/ml). Une jeune fille (8 ans) avait une ST et une ferritinémie normales. Deux jeunes hommes (25 à 35 ans) ont une ST (35,8 %-47,7 %) et une ferritinémie (17 ng et 493 ng) modérément élevées. Les six autres hommes plus âgés (60-87 ans) présentent des ST allant de légèrement à fortement augmenté (39 % à 86 %) et une ferritinémie modérée à élevée (536 ng/ml à 2051 ng/ml). Quatre d'entre eux ont une forte consommation d'alcool.
Une biopsie du foie, réalisée chez ces quatre patients, montre une surcharge en fer minime chez trois d'entre eux (marquage par coloration de Perl 0 à +) et plus sévère chez le quatrième (marquage par coloration de Perl ++ et IHF = 2,2). 4.3 Patients hétérozygotes C282Y :
Cinq hommes et quatre femmes ont été étudiés. Trois hommes et trois femmes ménopausées ont des ST légèrement augmentés (25,9 à 47,5%) et une ferritinémie également légèrement augmentée (31 à 363 ng/ml). Deux hommes et une femme menopausée ont des ST modérément à fortement augmentées (62,3 à 100 %) ainsi qu'une ferritinémie (437 à >2000 ng/ml). Ces trois patients sont issus de la même famille et ont une consommation élevée d'alcool (>80 g par jour) ; la surcharge en fer dans le foie est modérée chez deux d'entre eux (marquage par coloration de Perl ++, IHF : 1,5 et 1,8) et importante (Perl +++) chez le troisième qui présente aussi une β thalassémie et une cirrhose. Ces groupes génotypiques sont hétérogènes en terme de sexe, d'âge
(18 à 82 ans) et de facteurs environnementaux (par exemple l'alcool). Cependant, on observe que la ST et la ferritinémie sont plus élevées en moyenne chez les hétérozygotes composites (ST : 68,8 ± 6,03 ; ferritinémie: 734,9 ± 462) que chez les hétérozygotes H63D (ST : 54,7 ± 15,7 ; ferritinémie: 413 ± 117) et chez les hétérozygotes C282Y (ST : 41,7 ± 3J ; ferritinémie 289 ±64,3) dans le sous-groupe d'hommes sans consommation d'alcool importante ni hépatite C chronique.
Ces résultats sont en accord avec les données cliniques antérieures sur les hétérozygotes. En accord avec ces données, les Inventeurs ont montré que les ARNm H63D étaient prédominants chez tous les hétérozyggotes H63D, y compris les hétérozygotes composites. En revanche, chez tous les hétérozygotes C282Y, on a trouvé que les ARNm sauvages sont prédominants. Il faut noter que deux homozygotes H63D (un jeune homme de 25 ans et une femme menopausée) sans consommation d'alcool présentent une augmentation de ST (65,3 et 56,8%>) et une ferritinémie encore modérée (113 et 178 ng/ml). 5. La répartition des ARNm HFE est identique dans les cellules mononucléées du sang périphérique et dans les échantillons de foie et de duodénum
Les ARNm HFE ont été étudiés dans les biopsies de foie de six patients (un hétérozygote composite, trois hétérozygotes, un homozygote C282Y et un patient sans mutation) et dans les biopsies de duodénum de quatre patients (deux hétérozygotes composites, un hétérozygote et un homozygote C282Y). Trois patients ont subi à la fois une biopsie du foie et du duodénum (un hétérozygote composite, un hétérozygote C282Y et un homozygote C282Y). Après amplification et digestion enzymatique, la répartition des bandes correspondant aux ARNm HFE est identique dans les cellules mononucléées du sang périphérique, le foie et le duodénum (Figure 4). Le résultat montre que les ARNm HFE prédominants détectés dans les cellules mononucléées du sang périphérique, le foie et le duodénum sont les mêmes (c'est-à- dire les ARNm portant la mutation H63D chez les hétérozygotes H63D et les hétérozygotes composites, les ARNm normaux chez les hétérozygotes C282Y) (Tableau IV). De plus on confirme que les ARNm mutés C282Y ne sont jamais prédominants sauf chez les homozygotes C282Y. TABLEAU IV
Détection des ARNm HFE dans les cellules mononucléées du sang périphérique, le foie et le duodénum de patients
Figure imgf000021_0001
6. Première preuve de variants d'excision-épissage pour les ARNm HFE dans les cellules mononucléées du sang périphérique
Après amplification de la région contenant le codon 282, la bande 293 pb correspondant à l'ARNm HFE a été détectée dans tous les cas et une bande supplémentaire à 359 pb est présente dans toutes les cellules mononucléées du sang périphérique chez presque tous les hétérozygotes. Ces bandes ont été seulement détectées quand l'amplification par PCR a été réalisée avec une amorce sens localisée sur l'exon 4 et une amorce antisens, localisée sur l'exon 5 (couple IV, Tableau II) mais pas quand les autres régions des ARNm HFE ont été amplifiées. Le séquençage montre que la bande 359 pb correspond aux ARN épissés en utilisant un site accepteur d'excision-épissage localisé sur l'intron 4 (nucléotide 6834-6835) (Figures 5 A et 5B). La bande à 293 pb est toujours prédominante (73-97%) comparativement à la bande 359 pb (3,27%) (Figure 5C). Ces ARNm épissés ont été détectés en très faible pourcentage (< 5%) dans les cellules mononucléées du sang périphérique des homozygotes C282Y. Cette forme alternative d'excision-épissage introduit un codon stop (nucléotides 6775 à 6777) et pourrait générer une protéine comportant 299 acides aminés et tronquée en C-terminale (délétion des régions transmembranaire et intra- cytoplasmique). 7. Identification d'une nouvelle mutation sur le gène HFE : transversion de G à C résultant en une mutation faux-sens au niveau de l'aminoacide 282
De manière inattendue, deux hétérozygotes composites de la même famille (Be2 et Be4) présentent une importante surcharge en fer (TS : 74 % et 100 %>, marquage par coloration de Perl +++ ou HII > 1,9) et ont été étudiés plus pro fondé- ment. Après RT-PCR de l'ARN total des cellules mononucléées du sang périphérique et digestion enzymatique, on confirme la présence majoritaire de ARNm HFE portant la mutation H63D chez les deux patients, ainsi qu'on l'a observé chez les autres hétérozygotes composites. Cependant le séquençage de l'ADN génomique après amplifi- cation de la région contenant le codon 282 révèle la présence d'un double pic (A + C) montrant l'existence de deux mutations faux-sens au niveau du codon 282 : une transition G à A (C282Y) et une transversion G à C (C282S) (Figure 6). En revanche, le séquençage de l'ADNc montre la présence d'un pic unique de cytosine ; cela montre que le même ARNm prédominant porte les deux mutations H63D et C282S. Ainsi, ces deux patients se comportent comme des homozygotes pour la mutation au niveau du codon 282. De plus, on a détecté cette double mutation dans un hétérozygote H63D de la même famille (Be3) qui présente des paramètres relatifs au fer normaux ; ce patient se comporte comme un hétérozygote C282Y.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Procédé d'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, notamment chez un sujet prédisposé, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement l'établissement du profil des différents transcrits du gène HFE, à partir d'un échantillon biologique.
2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend
(a) l'extraction des ARNs totaux, à partir d'un échantillon biolo- gique,
(b) la transcription inverse des ARNs obtenus en (a), et l'obtention des ADNc correspondants,
(c) une première amplification des régions contenant les codons 63 et 282 des ADNc obtenus en (b), en utilisant un couple d'amorces I, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 2 qui contient le codon 63 et un couple d'amorces III, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 4 qui contient le codon 282,
(d) une deuxième amplification des produits d'amplification obtenus en (c), en utilisant un couple d'amorces II, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces I et un couple d'amorces IN, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces III, au moins une amorce des couples d'amorces II et IN étant de préférence couplée à un marqueur approprié et
(e) l'établissement du profil des transcrits par analyse des produits obtenus en (d).
3°) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (c) dudit procédé est mise en œuvre avec un couple d'amorces I, constitué des séquences SEQ ID ΝOJ et SEQ ID ΝO:2 et un couple d'amorces III, constitué des séquences SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6.
4°) Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape (d) dudit procédé est mise en œuvre avec un couple d'amorces II, constitué des séquences SEQ ID NO:3 et SEQ ID NO:4 et un couple d'amorces IN, constitué des séquences SEQ ID ΝO:7 et SEQ ID NO:8, les séquences SEQ ID NO:3 et SEQ ED NO:8 étant de préférence marquées.
5°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est de préférence constitué de cellules mono- nucléées du sang périphérique.
6°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'analyse selon l'étape (e) est réalisée par digestion enzymatique des produits PCR, suivie d'une séparation des produits obtenus par électrophorèse appropriée, notamment électrophorèse sur gel et d'une détection du marqueur.
7°) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite digestion est mise en œuvre en présence des enzymes de restriction Rsa f et Dpn II. 8°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'analyse selon l'étape (e) est réalisée par hybridation avec une sonde marquée sélectionnée dans le groupe constitué par l'exon 2, l'exon 4 ou l'intron 4 du gène HFE ou un fragment de ceux-ci.
9°) Amorces pour l'amplification des transcrits du gène HFE, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NOJ à SEQ ID NO:9.
10°) Kit pour l'évaluation du risque d'apparition d'une surcharge sévère en fer, caractérisé en ce qu'il comprend outre les réactifs convenables pour l'extraction des ARNs et la transcription inverse desdits ARNs, des réactifs pour l'amplification des fragments des ADNc correspondant aux transcrits du gène HFE contenant le codon 63 ou le codon 282, à savoir :
- un couple d'amorces I, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 2 qui contient le codon 63,
- un couple d'amorces III, apte à amplifier au moins le fragment de l'exon 4 qui contient le codon 282,
- un couple d'amorces II, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces I et
- un couple d'amorces IN, apte à amplifier le produit obtenu avec le couple d'amorces III, au moins une amorce des couples d'amorces II et IV étant de préférence couplés à un marqueur approprié.
11°) Transcrit muté du gène HFE, caractérisé en ce que le codon 282 code pour une serine.
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