WO2000008460A1

WO2000008460A1 - Method for determining hemoglobins

Info

Publication number: WO2000008460A1
Application number: PCT/JP1999/004202
Authority: WO
Inventors: Yuji Setoguchi; Kazuyuki Oishi; Kazuhiko Shimada; Toshiki Kawabe; Takayuki Oka
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2001-02-07
Also published as: EP1103812B1; US6428704B1; ES2563162T3; CA2339360C; EP1103812A4; EP1103812A1; AU5064499A; CA2339360A1

Description

明細書へモグロビン類の測定方法発明の分野

本発明は、ヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳細には安定型へモグロビン A 1 cの測定を目的とした、陽イオン交換液体クロマトダラフィ一によるヘモグロビン類の測定方法に関する。先行技術の説明

ヘモグロビン A l e (以下、 H b A l e と略す）は、すべてのへモグ口ビンに対するその構成比率が、過去 1〜 2力月間の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する検査項目として繁用されている。

H b A 1 cは、血液中のグルコースとヘモグロビン A (以下、 H b A と略す）とが反応して生成された糖化ヘモグロビン（以下、 G H b と略す）であり、可逆的に反応したものを不安定型 H b A 1 c ( unstable HbAlc) と呼び、不安定型 H b A 1 cを経て不可逆的に反応したものを安定型 H b A 1 c (stable HbAlc)と呼んでいる。

普通、へモグロビンは 2種類のサブュニット 2つずつから構成される 4量体のタンパク質である。 H b Aのサブュニットは α鎖と jS鎖であり、この β鎖の Ν末端ァミノ酸にグルコースが結合したものが H b A 1 cである。過去 1〜 2力月間の平均的な血糖値を良く反映するのは安定型 H b A 1 cであり、臨床検査分野では、高精度に安定型 H b A 1 c値（。/。）を得ることができる測定法の開発が望まれている。従来、 H b A 1 cの主な測定法としては、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、へモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィー（以下、 L Cと略す）が用いられてきた。（例えば、日本国 ·特公平 8— 7 1 9 8号公報等）。

陽イオン交換 L Cにより、十分な時間を掛けて溶血試料中のへモグロビン類を分離すると、通常はヘモグロビン A l a (以下、 HbA l aと略す）及びヘモグロビン A l b (以下、 H b A l bと略す）、へモグロビン F (以下、 H b Fと略す）、不安定型 H b A 1 c、安定型 H b A 1 c及びヘモグロビン AO (以下、 H b AOと略す）の順に溶離されてくる。 Hb A l a、 H b A 1 b及び H b A 1 cは H b Aが糖化された GH b、 H b Fはひ鎖と γ鎖から成る胎児性ヘモグロビン、 Hb AOは Hb Aを主成分とする一群のへモグロビン成分であって、 H b A 1 cより強くカラムに保持されたものである。

従来の技術では、安定型 H b A 1 cから不安定型 H b A 1 cを十分に分離することができないばかりでなく、時にァセチル化へモグロビン（以下、 AHb と略す）や力ルバミル化へモグロビン（以下、 CHbと略す）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型 H b A 1 c と重なって溶離してくるとレ、う問題があった。

すなわち、陽イオン交換 L Cによる安定型 H b A 1 c値（％) の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型 HbA 1 cの測定値に影響を与えないように、安定型 H bA 1 c と溶出挙動が近似している不安定型 H b A 1 cや AH b及び CH bピークを、安定型 H b A 1 c ピークから分離することが困難であった。

一方、「異常ヘモグロビン」としてヘモグロビン S (以下、 H b Sと略す）やヘモグロビン C (以下、 H b Cと略す）が知られている。 H b Sは H b Aの 3鎖の N末端から 6番目のグルタミン酸がバリンに置換されたものであり、 H b Cは同じ部位がリジンに置換されたものである。また、ヘモグロビン A 2 (以下、 Hb A2と略す）は α鎖と δ鎖から成るヘモグロビンであり、 H b Fと共に地中海性貧血症（thalassemia) においてその構成比率が正常者より高い。

通常の陽イオン交換 L Cによるへモグロビン類の測定においては、 H 0ょり後に^1 2、 Hb S、 H b Cが順にそれぞれ溶出される。 H b S、 H b C等の異常へモグロビンを含む検体の安定型 H b A 1 c を測定するときには、これらのピークを Hb AOピークから分離し、安定型 H b A l c (%) は、異常ヘモグロビンを除いた他のヘモグロビン成分の合計ピーク面積に対する安定型 H b A 1 c ピーク面積の比率 (%) を算出して求める必要がある。

また、地中海性貧血症を同時に検査したい場合には、 HbA2を Hb AOから分離できるような溶離条件を設定する。この場合は、全へモグ口ビンに対する H b Fと Hb A 2の構成比率が測定結果として算出される。

陽ィオン交換 L Cによる通常のへモグロビン類の分離の場合、 H b A 0ピークに含まれるヘモグロビン成分（以下、 Hb AO成分と略す）は、測定条件の違いによって次の 2つに分けられる。まず、 Hb Aより充填剤に強く保持される H b A 2や異常へモグロビン等を含む血液検体を一気に溶出させる測定条件では、 H b A以外にこれらのへモグロビン成分を含んだピークとなる。一方、 H b A2や異常ヘモグロビン等を分離する測定条件では、 H b Aを主としたピークとなる。

ところで、 L Cによる Hb類の測定では、主に陽イオン交換 LCが用いられている（例えば、日本国、特公平 8— 7 1 9 8号公報等）。

従来の H b類の測定用充填剤としては、無機あるいは有機高分子粒子等にイオン交換基を有する化合物を反応させて得られる充填剤や、陽ィオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを重合して得られる充填剤等が知られている。

これらの陽イオン交換用充填剤の性能を決定する重要な特性の 1つが、イオン交換容量である。従来の陽イオン交換用充填剤のイオン交換容量は、数 m e q〜数十 m e q / g程度であり、少ない場合であっても、 0 . 2〜0 . 3 m e qノ g程度であった。イオン交換容量は、反応させるィオン交換基含有化合物の量及び反応条件だけでなく、充填剤の粒径、比表面積、細孔径及び細孔容積等に依存する。従って、精密な分離を行うためには、イオン交換容量、細孔径、比表面積及び細孔容積等についての最適化を行うことが極めて重要であると考えられる。

日本国、特開平 7 - 2 7 7 5 4号公報には、細孔直径 2 0〜2 0 0 0 オングストローム、比表面積 0 . 1〜 1 0 0 m²/ gの多孔性粒子に、イオン交換基含有化合物を反応させ、それによつてイオン交換容量が 0 - 5〜3 . O m e q / gである充填剤が得られている。

しかしながら、この先行技術に記載の充填剤は、高分子粒子等にィォン交換基を有する化合物を反応させることにより得られている。従って、イオン交換基含有化合物を高分子粒子等に定量的に導入することが困難であり、測定の再現性に劣るという問題があった（吉廻、細矢、木全、田中： Chromatography, 16 (1) 7 - 12 (1995) )。

また、高分子粒子がシリカ粒子等の場合には、溶離液の p H域が制限されたり、非特異吸着により分離能が低下したり、さらに、カラムの寿命が短くなつたりするという問題があった。また、天然高分子粒子の場合には、膨潤ゃ収縮しやすく、耐圧性が低いという問題があった。

他方、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを重合して得られる充填剤は、再現性に優れ、容易に製造でき、カラムの寿命も短くなり難いため、上記充填剤より優れている。しかしながら、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを重合することにより得られた充填剤では、細孔径、比表面積、細孔容積及びイオン交換容量等を最適化したものは、これまで知られていない。

上記従来の充填剤を充填したカラムを用いる専用の高速液体クロマトグラフィー（以下、 H P L Cと略す）力 S 「自動グリコヘモグロビン測定装置」として臨床検査分野に普及している。

一般的にこれらは、陽イオン交換を主な分離機構とし、ヘモグロビン類をそのプラス荷電状態と充填剤官能基のマイナス荷電との相互作用の差異を利用して分離している。

これらの装置で用いられている専用溶離液としては、各へモグロビン成分がプラス荷電を持つようにへモグロビンの等電点より酸性側で緩衝作用を有するリン酸緩衝液等にイオン強度の調整剤として塩化ナトリウム等を添加したものが一般的に使用されている。

また、溶離条件としては、ひとつの送液ポンプを用いて溶出力の異なる 2種あるいは 3種の溶離液を段階溶出法で送液する方法が一般的である。溶出力の違いは溶離液の p Hやイオン強度等でコントロールしている。

溶離液の送液順序として 2種の溶離液を使用する場合は、溶出力の弱い溶離液により H b A l aから H b A l cまでを溶離した後、溶出力の強い溶離液に切り替えて H b A 0を溶出させている。 3種の溶離液を使用する場合は、溶出力の最も弱い溶離液により H b A l aから H b F付近まで溶離し、次に溶出力の強い溶離液に切り替えて H b A 1 cまでを溶離し、その後溶出力の最も強い溶離液に切り替えて H b A O以降に溶出するヘモグロビン成分を溶出させている。 3種の溶離液を用いると 2 種の場合より、装置は複雑になるが、 H b A 1 c ピークをシャープにすることができ、同時に測定時間の短縮化も実現し易くなる。

H P L Cに試料を注入するために前処理に必要な血液の溶血試薬（溶血希釈液）としては、分離に影響せず、血液を溶血して適当なへモグロビン濃度に希釈するため、溶離液と同じ緩衝剤を使用した緩衝液に、非イオン性界面活性剤等の溶血剤を添加したものが一般的である。

また、通常、こられの装置にはカラムの上流側にラインフィルターを設けており、送液ポンプのシール材の「破片」や試料中の異物がカラムに流入しないようにしている。ラインフィルタ一は測定を続けていくと、異物が集積していくため圧力損失が大きくなつてくる。そのため、装置の耐圧性との関係等でラインフィルターを交換する必要が生じてくる。ラインフィルターの交換作業には手間が掛かるため、装置の取り扱い性を良くするためにはラインフィルターの寿命を長くする工夫が求められている。

一方、カラムの両側にあるエンドフィッティング内には、充填剤を力ラム内に収容し、かつ溶離液や試料がカラム内を流れるようにするためのフィルター（以下、カラムフィルターと略す）が装着されている。通常、このラインフィルターやカラムフィルターには、出来る限り測定目的成分の分離に影響を与えないような材質や形状が必要とされ、材質としてはステンレス、形状としては円柱状のものが使用されている。

発明の概要

本発明の目的は、高精度に安定型 H b A l cを測定するために、上述した従来技術の欠点を解消し、短時間でしかも分離能に優れたへモグロビン類の測定方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、上述した従来のイオン交換 L C用充填剤の欠点を解消し、耐久性及び製造再現性に優れ、かつ、より短時間で高分離能を得ることができる陽イオン交換 L C用充填剤を提供することにある。本願の第 1の発明によれば、陽イオン交換 L Cによるへモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ p H4. 0 〜6. 8で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩を含む溶離液を用いることを特徴とするへモグロビン類の測定方法が提供される。

本願の第 2の発明によれば、陽イオン交換 L Cによるヘモグロビン類 - の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数 (p K a) 力 S2. 1 5〜 6. 3 9の範囲及び 6. 40〜： 1 0. 50の範囲にある緩衝剤を含む溶離液を用いることことを特徴とするへモグロビン類の測定方法が提供される。

本発明の特定の局面では、 H b AOを溶出するために、カラムに流入する際の p Hがへモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりァルカリ側になる溶離液が用いられる。

本発明のより特定の局面によれば、へモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりアル力リ側になる上記溶離液の p Hは 6. 8以上とされる。

本発明の他の特定の局面では、少なくとも溶出力の異なる 3種の溶離液を用い、 H b A 0を溶出するための溶離液を送液する前に、該 Hb A 0を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液する。

本発明のある特定の局面では、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中にぉレ、て溶離液の溶出力を低下させる。

本発明の他の特定の局面では、 H b AOの溶出より後に、 Hb A2、 H b S、H b Cから成る群のへモグロビンを少なくとも 1つ溶出させる。本発明の他の特定の局面では、前記溶離液が分子量 20〜 500のァミン類を少なくとも 1種類以上を含有している。本発明の他の特定の局面では、分子量 2 0〜 5 0 0のアミン類を少なくとも 1種類以上含有した溶血試薬を用いる。

本発明に係る L C用充填剤は、本発明に係るへモグロビン類の測定方法に用いられる陽イオン交換 L C用充填剤であって、イオン交換基を有する単量体及び架橋性単量体を構成成分とする重合体より成り、平均直径が 1 0〜 1 0 0オングストロームである細孔を有し、比表面積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0 . 0 5〜 5 m ²であり、細孔容積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0 . 1〜 1 0 μ Lであり、イオン交換容量が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり l〜 1 0 0 i e qであることを特徴とする。本発明に係るへモグロビン類の測定方法に用いられるフィルタ一は、ポリエーテルケトン類及び/またはポリエチレンを構成材料とすることを特徴とする。

本発明に係るへモグロビン類の測定方法に用いられる血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬は、カオトロピックイオンを含有することを特徴とする。

以下、本発明の詳細を説明する。

(第 1の発明）

本願の第 1の発明で用いられる溶離液は、カオトロピックイオンを含有し、かつ、 p H 4 . 0〜6 . 8で緩衝能を持つ無機酸、有機酸またはこれらの塩を含む。

上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のェント口ピー減少を抑制するものである。

陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロ口酢酸イオン、チォシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物ィオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピックィオンとしては、ノくリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グァニジンィオン等が挙げられる。

これらカオトロピックイオンの中で第 1の発明に用いられるものは、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロ口酢酸イオン、チォシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸ィォン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリゥムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムィオン、グァニジンイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、チォシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グァニジンイオン等が用いられる。

上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃度が、 0 . I mMより低いとへモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、また、 3 0 0 O mMよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、 0 . 1 mM〜 3 0 0 0 mMが好ましく、 1 mM〜 1 0 0 0 mMがより好ましく、更に、 1 0 mM〜 5 0 0 mMが好ましレヽ。また、カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。

上記カオトロピックイオンは、測定試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添加しても良い。

第 1の発明においては、溶離液に用いる緩衝能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの塩が含まれる。上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、力ルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、力コジル酸、ピロリン酸等が挙げられる。

上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、 β |3—ジメチルダルタル酸、バルビツール酸、ァミノ酪酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クェン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記ァミノ酸としては、例えば、ァスパラギン酸、ァスパラギン等が挙げられる。

上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のもので良く、例えば、ナトリゥム塩、力リゥム塩等が挙げられる。

上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。

上記無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合計の濃度は、溶離液の ρ Ηを 4 . 0〜6 . 8にする緩衝作用があれば良く、 1〜 1 0 0 0 mMが好ましく、 1 0〜 5 0 0 mMが特に好ましレ、。

第 1の発明においては、上記溶離液の P Hは、 4 . 0〜 6 . 8に限定され、好ましくは 4 . 5〜 5 . 8である。溶離液の p Hが 4未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、 p Hが 6 . 8を超えると、へモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が悪くなる。

上記溶離液には、以下の物質を添加しても良い。

( 1 ) 無機塩類（塩化ナトリゥム、塩化力リゥム、硫酸ナトリゥム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは 1〜 1 5 0 0 mMである。

( 2 ) p H調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、 0· 00 1〜500mMでめる。

(3) メタノール、エタノール、ァセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは 0〜80% (v/ v) であり、カオトロピックィオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるのが好ましレ、。

(4) アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。

(5) ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、ェチレンジァミン四酢酸（EDTA) 等のキレート剤、ダルタチオン、アジ化ナトリゥム等の還元剤 ·酸化防止剤等を添加しても良い。

(第 2の発明）

本願の第 2の発明では、溶離液が、上記カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（p K a ) 力 2. 1 5〜6. 3 9の範囲及び 6. 40〜 1 0. 50の範囲にある緩衝剤を含有する溶離液が用いられる。第 2の発明において用いられるカオトロピックイオンとその濃度等については、第 1の発明の場合と同様であるため、上述した第 1の発明におけるカオトロピックイオンについての説明を援用することにより省略する。

第 2の発明において、上記緩衝剤としては、酸解離定数（p K a) 力 2. 1 5〜6. 3 9及び 6. 40〜； 1 0. 50の範囲に存在するものが用いられる。すなわち、緩衝剤として、 p Kaを、 2. 1 5〜6. 39 及び 6. 40〜 1 0. 5 0の範囲に少なくとも一^ 3ずつもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、 2. 1 5〜6. 3 9の範囲に少なくとも一つの p K aをもつ物質と 6. 4 0〜 1 0. 5 0の範囲に少なくとも一つの p K aをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良レ、。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。

上記緩衝剤の P K aの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液の p H付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、 2. 6 1〜 6. 3 9及び 6. 4 0〜： 1 0. 5 0の範囲が好ましく、より好ましくは、 2. 8 0〜 6 · 3 5及び 6 · 8 0〜 1 0. 0 0の範囲である。さらに好ましくは、 3. 5 0〜6. 2 5及び 7. 0 0〜 9. 5 0の範囲である。

上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほ力カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、ァニリンまたはァニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、力コジル酸、グリセロールリン酸、 2 , 4 , 6—コリジン、 Ν—ェチルモルホリン、モルホリン、 4—アミノビリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ベリジン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。

上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。

上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、ダルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、 β , β ' —ジメチルダルタノレ酸、ノくノレビツーノレ酸、 5， 5—ジェチルバルビツール酸、 γ—ァミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、 £ 一アミノカプロン酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クェン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。

上記ァニリンまたはァニリン誘導体としては、例えば、ァニリン、ジメチルァニリン等が挙げられる。

上記アミノ酸としては、例えば、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グリシン、ひーァラニン、 β—ァラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。上記ァミン類としては、例えば、エチレンジァミン、エタノールァミン、トリメチルァミン、ジエタノールァミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、 5 (4) —ヒドロキシイミダゾール、 5 (4) ーメチルイミダゾール、 2， 5 (4) 一ジメチルイミダゾール等が挙げられる。

上記アルコール類としては、例えば、 2—アミノー 2—メチルー 1 , 3—プロパンジオール、 2—アミノー 2—ェチルー 1， 3—プロパンジオール、 2—ァミノ一 2—メチルー 1一プロパノール等が挙げられる。また、上記緩衝剤としては、 2— （Ν—モリホリノ）エタンスルホン酸（ME S)、ビス（ 2—ヒドロキシェチル）イミノトリス一（ヒドロキシメチル）メタン（B i s t r i s )、 N— (2—ァセトアミド）ィミドジ酢酸（ADA)、ピぺラジン一 N， N ' — ビス（2—エタンスルホン酸）（P I P E S)、 1， 3—ビス（トリス（ヒドロキシメチル）一メチルァミノ）プロパン（B i s t r i s p r o p a n e)、 N— (ァセトアミド）一 2—アミノエタンスルホン酸（ACE S)、 3— (N— モルフォリン）プロパンスルホン酸（MO P S)、 N, N，一ビス（2 一ヒドロキシェチル）一 2—アミノエタンスルホン酸（B E S)、 N- トリス（ヒドロキシメチル）メチル一 2—アミノエタンスルホン酸（T E S)、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン一 N' —エタンスルホン酸（HE P E S)、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン一 N，一プロパンスルホン酸（HE P P S)、 N トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（ T r i c i n e )、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（T r i s )、 N， N ' ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン (B i c i n e )、グリシルグリシン、 N トリス（ヒドロキシメチル）メチルー 3—ァミノプロパンスルホン酸（TAP S)、グリシン、シク口へキシルァミノプロパンスルホン酸（CAP S)等の一般にグッド（G o o d) の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質の p K aを表 1 · 2に示す（引用文献：堀尾武ー · 山下仁平蛋白質 ·酵素の基礎実験法南江堂 1 9 8 5年）。

表 1

5 表 2 緩衞吝 ll C 緩衞 l¾吝 l| nk γ °r 炭酔 1 3.76 27 nープ nピル了ルコ—ル 1 in 57 リ

2 10.33 25 メチルアミン 1 10.64 ゲリ - 口ルリン酸 tt 2 6.65 25 ェチノレアミン 1 10 63 25 チレンジ了ミン 1 6.85 25 n—フ、 'チノレ" ミ 1 10.64 5

2 9.91 トリ工チノ zレ *^アン 1 10.72 25 ィミダ、ソ、、—— レ 1 6.95 25 ジメチノレアミン 1 1 n 77 2

2 6.77 25 へキサメチレンジ了ミン 2 10 93 25

？ 4 fi -コりジン 1 7 43 95 ピぺ I) ジ z 1 9

5(^4")—メ千 )ル，イミヽタ' ル， 1 7 52 MR S 1 fi 15

N ェチルモノホリン z 1 7 67 25 R 1 † 1 6

5 5—ジェチルバルドツール^ 1 7 98 25 ADA 1 fi 6

5 ( ）一"メチル、イミダゾール 1 8.36 リ P T p F 1 6 8 リモノレホ门ン 1 8.60 25 1 6 8 20

2了ミノ 2メチル 1 3プロパンジオール 1 8.79 25 2 9.0

2了ミノ 2ェチル 1, 3プ Dパンジオ-ル 1 8.80 25 AC E S 1 6.9 20 ジェ夕ノールァミン 1 8.88 25 MOP S 1 7.15 20

4一アミノビリジン 1 9.11 25 B E S 1 7.15 20 セリン 2 9.21 25 T E S 1 7.5 20 ホウ酸 1 9.24 25 H E P E S 1 7.55 20 ァンモニァ 1 9.25 25 H E P P S 1 8.1 20 ェタノーノレアミン 1 9.50 25 T r i c i n e 1 8.15 20 エフヱドリン 1 9.39 25 T r i s 1 8.3 20 ヒドロキシプロリン 2 9.66 25 B i c i n e 1 8.35 20

2ァミノ 2メチル 1プ αパノ-ル 1 9.69 25 Glycylglycine 1 8.4 20 οイシン 2 9.74 25 TAP S 1 8.55 20 卜リメチルァミン 1 9.80 25 G l y c i n e 1 9.9 20 α—丁ラニン 1 9.87 25 CAP S 1 10.4 20 溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用がある範囲であれば良く、好ましくは 1〜 1 000 mM、より好ましぐは 1 0〜 500 mMである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、有機物と無機物を混合して用いても良い。

第 2の発明に係るへモグロビン類の測定方法においても、溶離液には、第 1の発明の場合と同様に、無機塩類、 p H調節剤、水溶性有機溶媒、アジ化ナトリゥム、へモグロビン安定剤等を第 1の発明の場合と同様に添加しても良い。

本発明においては、 p Hの異なる少なくとも 2種類以上の上記溶離液を用いるのが好ましい。また、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベースライン変動力測定値に悪影響を与えなければ、その必要はない。

さらに、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離する

にあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。

なお、溶離液の p Hは、例えば、前述の pH調節剤の添加量により調節できる。

上記 p Hの異なる 2種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。

上記測定目的のピークとは、 H bA l a、 Hb A l b、 Hb F、不安定型 H b A 1 c、安定型 H b A l c、 AH b、 CHb、 Hb A0、 H b

A2 、 Hb S、 H b C等が挙げられる。

H b A 0よりも前に溶出するへモグロビン類を分離するための溶離液の p Hは、 4. 0未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、 6. 8を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が减少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので 4. 0〜6. 8が好ましく、 4. 5〜5. 8がより好ましレ、。

本発明において、 H b A 0の溶出に際し、すなわち、 H b A 1 じより強く充填剤に保持された H b A等から成る「Hb AO成分」を溶出するためには、カラムに流入する際の p Hをへモグロビンの等電点よりアル力リ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、 P Hがへモグロビンの等電点よりアル力リ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、 p Hの異なる 2種以上の溶離液を用いる方法がある。

へモグロビンは pHが等電点より酸性側からアル力リ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽ィオン交換基との「電気的反発力によって H b A 0成分を溶出」させることができる。なお、理化学辞典（第 4版、 1 98 7年 9月、岩波書店、久保亮五ら編集）、 1 1 7 8頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点は p H 6. 8〜7. 0である。そのため、 H b A 0成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液の p Hを 6. 8以上にすることがより好ましい。

この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液の p Hが 6. 8以上であることが必要である。本溶離液の pH は望ましくは 7. 0〜： 1 2. 0であり、 7. 5〜： 1 1. 0がより好ましく、更には 8. 0〜9. 5が好ましい。溶離液の p Hが 6 · 8未満になると H b A 0成分の溶出が不十分となる。溶離液の pHは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。

H b A 0成分の溶出に好適に用いられる、 pHが 6. 8以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クェン酸等のヒドロキシカルボン酸、 β、 β—ジメチルダルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、 2— (Ν—モリホリノ）エタンスルホン酸（ME S)、 N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン一 N ' —エタンスルホン酸（HE P E S)、ビス ( 2—ヒドロキシェチル）イミノトリス一（ヒドロキシメチル）メタン (B i s t r i s )、 T r i s、 ADA, P I P E S、 B i s t r i s p r o p a n e , ACE S, MO P S、 BE S、 TE S、 HE P E S、 HE P P S、 T r i c i n e、 B i c i n e、グリシルグリシン、 T A P S、 CAP S等の一般にグッド（G o o d) の緩衝液といわれるものも使用できる。また、 B r i t t o nと R o b i n s o nの緩衝液； G T A緩衝液も使用できる。また、ィミダゾール等のィミダゾール類；ェチレンジァミン、メチルァミン、ェチルァミン、トリェチルァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン等のアミン類；グリシン、 ]3 ーァラニン、ァスパラギン酸、ァスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。

また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良レ、。

より効果的に H b A 0成分を溶出するためには、上記溶離液に力オト口ピックイオンを添加するのが好ましい。添加するカオトロピックィォンは第 1の発明の場合と同様である。

添加するカオトロピックイオン濃度は、 l〜3000mMで、好ましくは、 1 0〜 1 000 mM、更には、 50〜 500 mMが好ましレヽ。本発明の特定の局面では、少なくとも溶出力の異なる 3種の溶離液を用い、 H b A 0を溶出するための溶離液を送液する前に、該 Hb AOを溶出するための溶離液以外の溶離液を送液する。

すなわち、 H b A 0成分を溶出するための溶離液が（送液ポンプで）送液されてカラムに通液されると H b A O成分が溶出されてくる。この H b A 0成分を溶出するための溶離液を送液する前、すなわち、 H b A 0より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離するために、 H b A 0成分を溶出する溶離液以外の溶離液を送液する。

H b A 0よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、 p H 4 . 0〜 6 . 8の溶離液を少なくとも 2種類以上用い、塩濃度勾配法や p H勾配法またはこの 2つの組み合わせにより、安定型 H b A 1 c等の測定対象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。

本発明の特定の局面では、 H b A 0よりも前に溶出するへモグロビン類（H b A 1 a及び b、 H b F、不安定型 H b A 1 c、安定型 H b A 1 c ) の溶出には、少なくとも 2種類以上の溶離液を用い、かつ、溶出力の最も弱レ、溶離液を先に流す。

本発明に係るへモグロビン類の測定方法では、好ましくは、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることが望ましい。

従来の L Cでは、分離対象成分のピークをシャープにしたり、隣り合つて溶出する 2つ以上のピークの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されている。

勾配溶出法は「グラジェント溶出」と呼ばれている。すなわち、複数台の送液ポンプを用い、溶出力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させて送液する。それによつて、図 3 2に示すように、時間と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われる。

また、段階溶出法は「ステップワイズ溶出」と称されている。この方法では、 1台の送液ポンプを、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結する。そして、電磁弁を切り換えることにより、溶出力の低い溶離液から、溶出力の高い溶離液に切り換えて送液する。従って、図 3 3に示すように、溶出力は段階的に上昇いていく。

しかしながら、溶出される各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されている場合、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそれがあった。

これに対して、本発明の上記特定の局面では、勾配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その途中、すなわち勾配溶出法または段階溶出法により複数の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。

陽イオン交換 L Cにおいて、溶離液の溶出力を低下させるには、溶離液の塩濃度を下げる方法や P Hを下げる方法、またはこの 2つを組み合わせる方法が挙げられる。

陰イオン交換 L Cでは溶離液の塩濃度を下げる方法や p Hを上げる方法、逆相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を上げる方法、順相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を下げる方法が挙げられる。

上記のように勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させる方法により、ヘモグロビンを分離する場合をより具体的に説明する。へモグロビン類の分離には、陽イオン交換充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度 20〜 1 00 OmM、 p H4〜9の範囲で勾配溶出法または段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液の塩濃度を 5〜 500mM、 ^1を0. 1〜 3の範囲で下げることによつて溶離液の溶出力を低下させて分離を行う。

本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を図 1 6に示した。溶離液 A， B, C， Dは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、 p H、極性等において異なる）ものであり、電磁弁 1によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ 2により、試料注入部 3から導入された試料とともにカラム 4に導かれ、各成分が検出器 5により検出される。各ピークの面積、高さ等はィンテグレータ 6により算出される。

安定型 H b A l cの測定に悪影響を与える可能性のある H b A 2、 H b S、 H b C等のヘモグロビン成分を含む血液検体を測定する場合、 H b AO成分（ピーク）として主に H b Aを溶出させ、それより後に Hb A2、 H b S、 H b C等を溶離させる測定方法を設定することがある。これにより、 H b A 0ピークから H b A以外のへモグロビン成分を除けるため、より正確な安定型 H b A 1 c (%) を算出できる。

Hb A 2、 Hb S、 H b C等を溶離させる測定方法を設定する場合、前述した少なくとも溶出力の異なる 3種の溶離液を用いる方法における「H b A 0を溶出するための溶離液」は、 H b Aを主成分とする H b A 0ピークを溶出する溶離液を意味している。このとき、「HbA0を溶出するための溶離液」の後に、 H b A2、 Hb S、 Hb C等を溶離するために、より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる。

本発明における陽イオン交換 L Cによるへモグロビン類の測定方法において、へモグロビン類の流路内への吸着が測定値に影響する場合は、本発明に係る溶離液、又は、溶血試薬に分子量 2 0〜 500のァミン類を少なくとも 1種類以上添加するのが好ましい。

上記アミン類としては、分子量 20〜500の第 1級ァミン、第 2級ァミン、第 3級ァミンが挙げられる。第 1級ァミンとしては、例えば、メチルァミン、ェチルァミン、 2—アミノエタノール等が挙げられる。第 2級ァミンとしては、例えば、ジメチルァミン、ジェチルァミン、ェチルメチルァミン等が挙げられる。第 3級ァミンとしては、例えば、トリメチルァミン、トリェチルァミン、ジメチルェチルァミン等が挙げられる。

ァミン類の分子量が、 20未満になると揮発性が大きくなり保存性に問題を生じ、 500を超えると溶解性が小さくなるので、 20〜500 に限定され、好ましくは 2 5〜 400、より好ましくは 30〜 1 50である。

溶離液、又は、溶血試薬に含有されるァミン類の濃度は、 l p pm未満ではヘモグロビン類の流路内への非特異的吸着が起こり易くなり、 5 00 0 p p mを超えるとへモグロビン類の分離能が悪くなるので、 1〜 5 000 p p mが好ましく、 5〜： 1 000 p p mがより好ましく、 1 0 〜 5 00 p p mが最も好ましレヽ。

本発明の H b類測定用充填剤は、陽イオン交換 L C用充填剤であって、陽イオン交換基を有する単量体及び架橋性単量体を構成成分とする重合体よりなり、平均直径が 1 0〜 1 00オングストロームである細孔を有し、比表面積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0. 05〜5m²であり、細孔容積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0. 1〜 1 0 / Lであり、陽イオン交換容量が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 1〜 1 00 μ e qである。

上記陽イオン交換基を有する単量体とは、陽イオン交換基を少なくとも一つ以上有し、かつ、重合性官能基を少なくとも一つ以上有する単量体である。ここで、陽イオン交換基とは、ある p Hにおいて、陽イオン交換能を示す官能基のことであり、公知の陽イオン交換基であれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等を挙げることができる。また、上記重合性官能基としては、ビニル基等、公知の重合性官能基であれば特に限定されない。

上記陽イオン交換基を有する単量体であって、カルボキシル基を有するものとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、 2— (メタ）アタリ口ィルォキシェチルコハク酸、クロトン酸、ィタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。上記陽イオン交換基を有する単量体であって、リン酸基を有するものとしては、例えば、（（メタ）アタリロイルォキシェチル）アシッドホスフェート、（ 2— (メタ）アタリロイルォキシェチル）アシッドホスフエート、（ 3— （メタ）アタリロイルォキシプロピル）アシッドホスフヱート及びこれらの誘導体等が挙げられる。

上記陽イオン交換基を有する単量体であって、スルホン酸基を有するものとしては、例えば、（メタ）ァリルスルホン酸、 2— （メタ）ァクリルアミド— 2 —メチルプロパンスルホン酸、（3—スルホプロピル）ーィタコン酸、 3—スルホプロピル（メタ）アクリル酸及びこれらの誘導体等が挙げられる。

上記各種陽イオン交換基を有する単量体は、上述した単量体の他、その各種誘導体、ナトリゥム塩や力リゥム塩等の塩類、塩化物等であって

¾ い。

本発明において、陽イオン交換基を有する単量体は、化学反応によりイオン交換基に変換し得る官能基を有する単量体を用い、該単量体の重合後において、化学反応により該官能基を陽イオン交換基に変換することによって得られるものであっても良い。この化学反応としては、加水分解反応や転移反応があり、化学反応により陽イオン交換基に変換し得る官能基としては、例えば、エステル基等があげられる。具体例としては、単量体としてメチルメタタリレートを用い、重合した後、アルカリ性下で加温することにより、エステル結合が分解してカルボキシル基に変換されることで、陽イオン交換基を有する単量体及び架橋性単量体を構成成分とする重合体よりなる陽イオン交換 L C用充填剤を調製することができる。

上記陽イオン交換基を有する単量体の使用量は、単量体の種類によつて異なるが、架橋性単量体 1 0 0重量部に対し、 1 0〜2 0 0重量部を用いるのが良い。これは、 1 0重量部未満であると、陽イオン交換容量が小さすぎて十分な陽イオン交換反応が行われにくく、分離能が低下するためであり、 2 0 0重量部を超えると、親水性が大きくなり耐圧性、耐膨潤性が低下し、また、溶離液の切り替え時等には平衡化に長時間を要し、測定時間が長くなるという問題が生じるためである。また、上記単量体は必要に応じて 2種以上が混合されて用いられても良い。

本発明における架橋性単量体としては、例えば、 1分子中に 2個以上のビニル基を有する単量体、後述のような（メタ）アクリル酸エステルの誘導体、脂肪族ジェン化合物およびその誘導体等が挙げられる。上記 1分子中に 2個以上のビニル基を有する単量体としては、例えば、ジビ二ノレベンゼン、ジビニノレトノレェン、ジビニノレキシレン、ジビニノレエチノレベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体等が挙げられる。上記（メタ）アクリル酸エステルの誘導体としては、例えば、ェチレングリコールジ（メタ）アタリレート、ポリエチレンダリコールジ（メタ）アタリレート、 1， 3—ブチレングリコールジ（メタ）ァクリレート、 1， 6—へキサグリコールジ（メタ）アタリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）ァクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アタリレート、トリメチロールェタントリ（メタ）アタリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アタリレート、 2 —ヒドロキシ一 1 , 3 —ジ（メタ）アタリロキシプロパン、 2— ヒドロキシー 1—アタリ口キシー 3—メタクリロキシプロパン、 1 ， 1 0 —ジ（メタ）アタリ口キシー 4 ， 7—ジォキサデカン一 2， 9ージォール、 1 ， 1 0 —ジ（メタ）アタリ口キシ一 5 —メチル一 4 ， 7—ジォキサデカン一 2 ， 9ージオール、 1 , 1 1ージ（メタ）ァクリロキシー 4 ， 8 —ジォキサゥンデカン一 2 ， 6 ， 1 0 — トリオール、及びこれらの誘導体等が挙げられる。

上記脂肪族ジェン化合物としては、例えば、 1 ， 3—ブタジエン、ィソプレン、 1 ， 4 一へキサジェン及びこれらの誘導体等が挙げられる。本発明の充填剤は、上記単量体を、懸濁重合、乳化重合、分散重合等の公知の重合方法によって調製することができる。特に好ましくは、日本国 ·特公平 8— 7 1 9 7号公報記載のように、架橋性単量体を用いて架橋性重合体粒子を調製した後、該重合体粒子に重合開始剤を含侵させ、イオン交換基を有する単量体を添加して重合を行う方法により調製することができる。

本発明において、単量体の重合に際して用いる重合開始剤は、特に限定されず、水溶性または油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニゥム等の過硫酸塩；クメンハイドロパーォキサイド、ベンゾィルパーォキサイド、ラウロイルパーォキサイド、オタタノィルパーォキサイド、 o 一クロ口ベンゾィルパーオキサイド、ァセチルバ一オキサイド、 _t 一ブチルハイド口パーオキサイド、 t ブチルバ一ォキシアセテート、 t ーブチルバ一ォキシイソブチレート、 3 ， 5 ， 5— トリメチルへキサノイノレノヽ °一オキサイド、 t ーブチノレパーォキシ 2—ェチノレへキサノエ一ト、ジ一 t ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物； 2 ， 2—ァゾビスイソプチロニトリル、 2 ， 2—ァゾビス（ 2 ， 4ージメチルバレロニトリル）、 4 ， 4—ァゾビス（4 シァノペンタン酸）、 2 , 2 ァゾビス（ 2 メチルブチロニトリル）、 2 ， 2—ァゾビス（ 2 ， 4—ジメチノレバレロニトリノレ）、ァゾビスシク口へキサンカノレボニトリル等のァゾ化合物が挙げられる。

上記重合開始剤の使用量は、架橋性単量体 1 0 0重量部に対し、 0 . 0 5重量部未満の場合には、重合反応が不十分になったり、重合に長時間要することがあり、 1重量部を超えると急激な反応の進行により、凝集物が発生することがあるので、 0 . 0 5〜 1重量部で用いるのが好ましい。なお、上記重合開始剤は、上記架橋性単量体に溶解させて用いるのが良い。

上記重合体の構成成分としては、上記架橋性単量体等に加えて、非架橋性単量体、有機溶媒、重合体粒子等の添加物を添加しても良い。但し該添加物は、以下に例示したものに限定されるわけではなく、公知の種々の添加物を添加しても良い。

上記非架橋性単量体としては、例えば、スチレン、 α—メチルスチレン、 ρ—メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン誘導体；塩化ビニル等の脂肪族系の単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アタリル酸メチル、 (メタ）アクリル酸ェチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アタリル酸ー 2—ェチルへキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）ァクリルァミド、（メタ）アクリロニトリル、ダリシジル（メタ）ァクリレート等のァクリル酸誘導体等が挙げられる。

上記非架橋性単量体の使用量は、単量体の種類によって異なるが、上記架橋性単量体 1 0 0重量部に対し、 0〜 1 0 0重量部が好ましい。また、上記非架橋性単量体は必要に応じて 2種以上が混合されて用いられても良い。

上記有機溶媒は、使用する単量体の種類により、公知の有機溶媒から選択される。例えば、トルエン、キシレン、ジェチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；へキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素類；メタノール、エタノール、イソプロピルァノレコーノレ、ブチルアルコール、イソアミノレアルコール、へキシノレアルコール、ォクチルアルコール等のアルコール類；ジメチルホルムアミド等のァミン類；ジェチルエーテル等のエーテル類等が挙げられる。

これらの有機溶媒は、架橋性単量体または陽イオン交換基含有単量体を溶解して添加しても良いし、別個に分散媒に添加しても良い。また添加時期も、最初から添加してもよいし、重合の途中で添加しても良い。これらの有機溶媒の使用量は、上記架橋性単量体 1 0 0重量部に対し、 0〜 3 0 0重量部が好ましレ、。

上記重合体粒子は、粒度分布が揃ったものであり、これを上記架橋性単量体あるいは陽イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体の混合物に添加してから重合を行うと、粒度分布の揃った充填剤を得ることができる。上記重合体粒子としては、例えば、スチレン重合体、スチレン一ジビニルベンゼン共重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）ァクリル酸ェチル重合体等、上記非架橋性単量体等の単独あるいは共重合体である非架橋性重合体粒子が挙げられる。また、上記重合体粒子として、上記非架橋性単量体および上記架橋性単量体等からなる架橋共重合体粒子を用いても良い。この場合、架橋性重合体の割合が 1 0 %以下である、低架橋性の重合体粒子を用いるのが良い。

上記重合体粒子は、公知の重合方法によって調製されたものが使用でき、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合等により重合できる。

上記重合体粒子の平均粒径は、 0. 1〜 1 0 μ m、粒径のばらつきは変動係数 [CV値（％)] = 1 5 %以下（CV値（％) = (標準偏差 Z 平均粒径） X 1 00) が好ましい。

上記重合体粒子の使用量は、上記架橋性単量体 1 00重量部に対して、 0. 5〜： 1 00重量部が好ましい。

本発明の充填剤は、平均直径が 1 0〜 1 00オングストロームである細孔を有するものである。これは、平均直径が 1 0オングストローム未満である細孔は、製造上制御が困難であり、また再現性のあるものが調製し難いためである。また、平均直径が 1 00オングストロームを超えるものは、膨潤 ·収縮をおこしやすく、測定中に圧力損失の変動をおこす恐れがあり、また、複数の溶離液を用いた場合には、溶離液の変化に対してカラム内が平衡に達するのに時間がかかるという問題が生じるためである。

本発明の充填剤の比表面積は、充填剤の乾燥重量 1 g当り 0. 05〜 5m²である。これは、 0. 0 5 m²/ g未満では、粒径が大きくなつてしまうため、分離能が低下し、 5 m²/gを超えると、粒径が非常に微小になり、圧力損失の増大を招くという問題があるためである。

本発明の充填剤の細孔容積は、充填剤の乾燥重量 1 g当り 0. 1〜 1 0 Lである。これは、 0. 1 μ LZg未満では、製造上の制御が難しく、性能の再現性のある充填剤を調製するのが困難であり、 1 0 z L/ gを超えると、膨潤 ·収縮をおこしゃすく、測定中に圧力損失の変動をおこす恐れがあり、また、複数の溶離液を用いた場合には、溶離液の変化に対してカラム内が平衡に達するのに時間がかかるという問題が生じるためである。

本発明の充填剤のイオン交換容量は、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 1 〜1 0 0 ;u e qである。これは、 1 μ e q / g未満では、測定試料とのイオン交換反応が起きにくく、分離性能が低下するためであり、 1 0 0 μ e q Z gを超えると平衡化に長時間を要し、測定時間が長くなるとともに、耐圧性が減少する問題があるためである。

本発明においては、平均細孔直径 ·比表面積 ·細孔容積 · イオン交換容量の各物性値は、それぞれ上記に規定する範囲内でなければならず、これらは本発明において必須の構成要件である。従って、各物性値のうち、一つでも上記範囲内にない場合は、本発明特有の効果を発揮することができない。

本発明の充填剤は、平均粒径が 1〜 2 0 μ mが好ましく、粒径のばらつきは C V値（％) = 4 0 %以下が好ましい。必要に応じて、上記範囲となるように公知の乾式あるいは湿式の分級法によって、分級しても良レ、。

本発明の充填剤は、通常、ステンレス製等のカラムに充填して使用する。充填の方法に関しては、特に限定されないが、特に湿式法（スラリ一法）を用いることが好ましい。この湿式法では、充填剤を溶離液に用いる溶媒等に分散させ、カラム内にパッカー等を経由して圧入することによって充填することができる。

本発明においては、好ましくは、 L C用フィルタ一として、該フィルターがポリエーテルケトン類、ポリエチレンの少なくとも 1種類以上のイナ一トな材料からなるものが用いられる。

本発明のイナートな材料とは、従来より生体試料の分析に使用されている公知のイナートな材料である。この材料を用いることにより、長期使用における目詰まりの発生が少なくなる。

上記イナ一卜な材料からなる L C用フィルタ一は、次の知見に基づき考案されたものである。すなわち、本発明によるヘモグロビン類の測定では、従来のステンレス製の材料から成るフィルターを使用すると、血液検体に含まれるヘモグロビン等の成分がフィルターに吸着し易くなり、その結果として分離が悪化すると共に、フィルターの目詰まりが発生し易くなるという問題が発生した。そこで、フィルター材質を上記イナ一トなものに変えることによって、これらの問題を解決できることを見いだした。

それでも、測定試料中に含まれる成分の上記フィルターへの吸着が、測定値に影響がある場合は、該フィルター及び/またはカラムをプロッキング試薬、具体的には、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、へモグロビン、ミオグロビン等のタンパク質、リン脂質等の極性脂質、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ一 4—ォクチルフェニルエーテル（トリトン X— 1 0 0 ) 等の界面活性剤でブロッキングするのが好ましい。'

上記ポリエーテルケトン類とは、フヱニルケトンとフエニルエーテルの組み合わせ構造からなる超耐熱性の結晶性高分子であり、例えば、以下の化学式（ 1 ) で表されるポリエーテルエーテルケトン（通常、 P E E K樹脂と称される）；ポリアリルエーテルケトン；ポリエーテルケトンケトン；ポリエーテルケトンエーテルケトンケトン等が挙げられる。特に、ポリエーテルエーテルケトンが好ましい。化

本発明の LC用フィルタ一は、少なくともポリエーテルケトン類、ポリエチレンを含む材料からなれば良く、例えば、ポリエーテルケトン類、ポリエチレンそのもの；ポリエーテルケトンとフッ素樹脂との混合物、ポリエチレンとフッ素樹脂との混合物が挙げられる。

本発明のフィルターの形状は、液体の流れを乱さない構造であれば、特に限定されない。例えば、図 2 6に示すように、（a) 円柱状、（b) 円錐状、（c) 円錐台状の凸部を有するもの、（d) 円錐状凸部と円柱とを組み合わせた形状、（e)円錐台状凸部と円柱とを組み合わせた形状、 ( f ) 2つの円錐同士を組み合わせた形状などが挙げられる。

本発明のフィルターのサイズは、直径は 1〜 1 00mmが好ましく、

2〜5 Ommがより好ましレヽ。厚さは 0. 1〜 1 0 mmが好ましく、 0. 5〜 5 mmがより好ましレ、。濾過孔径は、公知の孔径で良く、 0. 1〜 20 i mが好ましく、 0. 2〜： 1 0 μ mがより好ましい。

本発明のフィルターの用途としては、 LCのラインフィルター、カラムの流入側及び流出側のフィルタ一等がある。

図 2 7は、本発明のフィルター 1 1がホルダー 1 3内に装着されて構成されているラインフィルター 1 5の断面図である。ラインフィルター 1 5においては、ホルダー 1 3に本発明のフィルター 1 1が収められている。ホルダー 1 3とフィルター 1 1 との間の気密性を十分保てない場合は、ホルダー 1 3とフィルター 1 1の間にシール部材 1 2を設ける必要がある。具体的には、ホルダー 1 3とフィルター 1 1の間に隙間ができないように、図 2 8 ( a )、 ( b ) に示すように、フィルター 1 1をシール部材 1 2で囲む方法がある。

上記シール部材の材質は、フィルターを保持できる強度を有するものであれば特に限定されず、例えば、ポリエーテルケトン類、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の混合物、ステンレス等が挙げられる。シール部材の大きさ及び形状については、フィルターの形状にフィットした形状が好ましく、しかも、試料の拡散を起こさない大きさ及び形状が好ましい。

本発明の L C用カラムは、本発明の L C用フィルターが装着されたことを特徴とする。

以下、本発明の L C用カラムについて説明する。

本発明の L C用カラムは、本発明のフィルターがカラムの流入側及び流出側のフィルターとして装着されている。

すなわち、本発明の L C用カラムは、図 2 9に示すように、フイノレタ一 1 1 として本発明のフィルターが装着されている他は、従来の L C用カラムと同様である。なお、図 2 9において、符号 4 0は分離カラム本体、 4 2はエンドフィッティングを示す。

本発明に用いる溶血試薬は、本発明に係るへモグロビン類の測定方法に用いられるものであり、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬である。安定型 H b A l cの分離を更に良くするためには、カオトロピックイオンを含有した溶血試薬を用いるのが好ましい。該溶血試薬で用いられるカオトロピックイオンは、第 1の発明の場合と同様である。

更に、好ましくは、該溶血試薬に 5 . 0〜 1 0 . 0で緩衝作用を持つ緩衝剤を添加するのが好ましい。本発明に用いられる溶血試薬の p Hは、 5. 0〜 1 0. 0であり、好ましくは、 pH 5. 5〜9. 5であり、より好ましくは、 6. 0〜9. 0である。 p Hが 5. 0より低くても、また、 1 0. 0より高くても、ヘモグロビン類が変性する。

また、本発明に使用される L C装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンブラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽ゃ溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。

上記測定法における、他の測定条件としては、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは 0. 0 5〜5mL/分、より好ましくは 0. 2〜3mL/分である。ヘモグロビン類の検出は、 4 1 5 nmの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは 0. 1〜 1 00 μ L程度である。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたク口マトグラムを示す図である。

図 2は、実施例 1の測定条件により、へモグ口ビン類の測定（試料 b ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 3は、実施例 1の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたク口マトグラムを示す図である。

図 4は、比較例 1の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 5は、比較例 1の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 b ) を行った際に得られたク口マトグラムを示す図である。

図 6は、比較例 1の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 7は、実施例 5の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 8は、実施例 5の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 b ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 9は、実施例 5の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 0は、比較例 3の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 1は、比較例 3の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料 b ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 2は、比較例 3の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 3は、実施例 9の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 4は、実施例 9の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 b ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 5は、実施例 9の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 6は、段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を示す図である。

図 1 7は、実施例 1 3の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 8は、比較例 5の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。

図 1 9は、比較例 6の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。

図 2 0は、実施例 1 4によって得られた充填剤を用いて、へモグロビン類の測定を行ない得られたク口マトグラムを示す図である。

図 2 1は、比較例 7によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図である。

図 2 2は、比較例 8によって得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図である。

図 2 3は、実施例 1 4によって得られた充填剤を用いて、異常へモグ口ビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図である。

図 2 4は、比較例 7によって得られた充填剤を用いて、異常へモグロビン類の測定を行ない得られたクロマトグラムを示す図である。

図 2 5は、実施例 1 4及び比較例 7， 8により得られた充填剤を用いて、カラム耐久性試験を行った結果を示す図である。

図 2 6は、本発明の L C用フィルターの様々な例を示す断面図である。図 2 7は、本発明のフィルターがホルダー内に装着されて構成されているラインフィルターの断面図である。

図 2 8は、本発明の L C用フィルターを示す図であり、（a ) はその断面図、（b ) は平面図である。

図 2 9は、本発明の L C用カラムを示す断面図である。

図 3 0は、測定試料を測定して得られたクロマトグラムであり、（a ) はラインフィルターを使用しない場合、（b ) は実施例 1 5〜 1 7のラインフィルターを使用した場合、（ c ) は比較例 9のラインフィルターを使用した場合を示す。

図 3 1は、測定試料を測定して得られたクロマトグラムであり、（a ) は実施例 1 8のカラムを用いた場合、（b ) は比較例 1 0のカラムを用いた場合を示す。

図 3 2は、勾配溶出法を説明するための説明図である。

図 3 3は、段階溶出法を説明するための説明図である。

図 3 4は、実施例 2 2の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 a ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 3 5は、実施例 2 2の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

図 3 6は、実施例 2 2の測定条件により、へモグロビン類の測定（試料 c ) を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。

発明を実施するための最良の形態

次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。

(実施例 1 )

充填剤の調製

テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製） 4 0 0 g及び 2—アタリルァミドー 2—メチルプロパンスルホン酸 1 5 0 g の混合物に過酸化ベンゾィル（和光純薬社製） 1 . 5 gを溶解した。これを 4重量％ポリビュルアルコール（日本合成化学社製）水溶液 2 5 0 O m Lに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で 7 5 °Cに昇温し、 8時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径 6 μ mの粒子を得た。

充填剤のカラムへの充填

得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子 0 . 7 gを、 5 O mMリン酸緩衝液（p H 5 . 8 ) 3 O m Lに分散し、 5分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径 4. 6 X 3 Omm) を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキエ業社製）を接続し、圧力 300k g/c m² で定圧充填した。

ヘモグロビン類の測定

得られたカラムを用いて、以下の測定条件でへモグロビン類の測定を行った。

(測定条件）

システム：送液ポンプ： LC 9 A (島津製作所社製）

オートサンブラ： ASU— 420 (積水化学工業社製）検出器： S PD— 6 AV (島津製作所社製）溶離液：溶離液 A ： 5 OmMの過塩素酸を含有する

50 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 B ： 20 OmMの過塩素酸を含有する

5 OmMリン酸緩衝液（pH 8. 0)

なお、リン酸の p K aは表 1に記載の通りである。測定開始より 0〜 3分の間は溶離液 Aを送液し、 3〜3. 2分の間は溶離液 Bを送液し、 3. 2〜 5分の間は溶離液 Aを送液した。

流速： 2. OmL/分

検出波長： 4 1 5 nm

試料注入量： 1 0 μ L

(測定試料）

健常人血をフッ化ナトリゥム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、 0. 1重量％ポリエチレングリコールモノー 4ーォクチルフエ二ルエーテル（トリトン X— 1 00) (東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ρΗ 7. 0) を用いた。 a ) 糖負荷血：全血検体に 5 0 Omg/d Lのグルコース水溶液を添加し、 3 7°Cで 3時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、 1 5 0倍に希釈して試料 a とした。

b ) CH b含有試料：全血検体 1 OmLに、 0. 3重量％のシアン酸ナトリゥムの生理食塩水溶液 1 mLを添加し、 3 7°Cで 3時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、 1 5 0倍に希釈して試料 bとした。

c ) AH b含有試料：全血検体 1 OmLに、 0. 3重量％のァセトァルデヒドの生理食塩水溶液 1 mLを添加し、 3 7 °Cで 3時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、 1 50倍に希釈して試料 cとした。

(測定結果）

上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図 1 〜 3に示す。図 1は試料 a、図 2は試料 b、図 3は試料 cを測定した結果である。ピーク 1は H b A 1 a及び H b A 1 b、ピーク 2は Hb F、ピーク 3は不安定型 H b A 1 c、ピーク 4は安定型 H b A 1 c、ピーク 5は Hb AO、ピーク 6は CHb、ピーク 7は AH bを示す。

図 1では、ピーク 3および 4が良好に分離されている。また、図 2ではピーク 6 (CH b)、図 3ではピーク 7 (AH b ) がピーク 4から良好に分離されている。

(実施例 2)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたク口マトグラムは図 1〜 3と同様に良好であった。

溶離液：溶離液 A ： 5 5 mMの過塩素酸を含有する 2 OmMコハク酸

- 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B ： 2 50 mMの過塩素酸を含有する 20 mM

コハク酸 2 OmMリン酸緩衝液（p H 8. 0) なお、コハク酸の p K aは、表 1に記載の通りである。

(実施例 3)

溶離液：溶離液 A ： 5 5mMの硝酸ナトリゥムを含有する 1 0 mM マレイン酸ー 40 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B : 2 00 mMの硝酸ナトリゥムを含有する 1 0 mM マレイン酸ー 40 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 3) なお、マレイン酸の p K aは、表 1に記載の通りである。

(実施例 4)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図 1〜 3と同様に良好であった。

溶離液：溶離液 A ： 5 0 mMの過塩素酸を含有する 1 0 mMマレイン酸一 5 0 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B ： 200 mMの過塩素酸を含有する 8 mMマレイン酸— 50 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 3)

(比較例 1 )

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。

溶離液：溶離液 A : 1 00 mMコハク酸緩衝液（ p H 5. 4)

溶離液 B ： 3 00mMコハク酸緩衝液（pH8. 0) 得られたクロマトグラムを図 4〜6に示す。図 4は試料 a、図 5は試料 b、図 6は試料 cを測定した結果である。図 1〜3に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離状態が悪いことが分かる。 (比較例 2 )

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図 4〜 6と同様であった。

溶離液：溶離液 A : 200 mMのリン酸緩衝液（ p H 5. 4)

溶離液 B : 3 30 mMのリン酸緩衝液（ p H 6. 0 ) (実施例 5)

溶離液：溶離液 A ： 5 5 mMの過塩素酸を含有する 50 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3 )

溶離液 B ： 200 mMの過塩素酸を含有する 50 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 0 )

測定開始より 0〜 3分の間は溶離液 Aを送液し、 3〜3. 2分の間は溶離液 Bを送液し、 3. 2〜 5分の間は溶離液 Aを送液した。

(測定結果）

得られたクロマトグラムを図 7〜 9に示す。図 7は試料 a、図 8は試料 b、図 9は試料 cを測定した結果である。ピーク 1は Hb A l a及び b、ピーク 2は H b F、ピーク 3は不安定型 H b A 1 c、ピーク 4は安定型 H b A l c、ピーク 5は Hb A0、ピーク 6は CHb、ピーク 7は AH bを示す。

図 7では、ピーク 3および 4が良好に分離されている。また、図 8ではピーク 6 (CH b)、図 9ではピーク 7 (AH b ) がピーク 4から良好に分離されている。

(実施例 6)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたク口マトグラムは図 7〜 9と同様に良好であった。

溶離液：溶離液 A ： 48 mMの硝酸ナトリゥムを含有する 25 mM コハク酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B : 200 mMの硝酸ナトリゥムを含有する 2 5 mM コハク酸一 2 OmMリン酸緩衝液（p H 8. 0)

(実施例 7)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図 7〜 9と同様に良好であった。

溶離液：溶離液 A ： 5 3 mMの過塩素酸を含有する 2 5 mMコハク酸

- 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B : 200 mMの過塩素酸を含有する 2 5 mMコハク酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 0 ) (実施例 8)

溶離液：溶離液 A ： 48 mMの硝酸ナトリゥムを含有する 25 mMコハク酸緩衝液（p H 5. 3)

溶離液 B ： 20 OmMの硝酸ナトリゥムを含有する 3 OmM リン酸緩衝液（ p H 8. 3)

(比較例 3)

溶離液：溶離液 A : 1 70 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B ： 3 30 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 7)

得られたク口マトグラムを図 1 0〜 1 2に示す。図 1 0は試料 a、図 1 1は試料 b、図 1 2は試料 cを測定した結果である。図 7〜9に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離状態が悪いことが分かる。

(比較例 4)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 1 と同様に操作してへモグロビン類の測定を行つた。得られたクロマトグラムは図 1 0〜 1 2 と同様であった。

溶離液：溶離液 A ： 1 00 mMコハク酸緩衝液（ p H 5. 6)

溶離液 B ： 2 5 OmMコハク酸緩衝液（pH 6. 5) 実施例 5〜 8及び比較例 3、 4のクロマトグラムにおいて、 Hb AO のピーク幅及び分離能を比較した結果、実施例 5〜8は、比較例 3、 4 に比べて、 Hb AOのピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。

(実施例 9)

溶離液の数と組成およびその送液条件を以下のように変更した以外は、実施例 1 と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。

溶離液 B ： 6 8 mMの過塩素酸を含有する 50 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 C ： 20 OmMの過塩素酸を含有する 5 OmMリン酸緩衝液（ p H 8. 0 )

測定開始より 0〜0. 7分の間は溶離液 Aを送液し、 0. 7〜 1. 4分の間は溶離液 Bを送液し、 1. 4〜 1. 5分の間は溶離液 Cを送液し、 1. 5〜 1. 9分の間は溶離液 Aを送液した。

(測定結果）得られたク口マトグラムを図 1 3〜 1 5に示す。図 1 3は試料 a、図 1 4は試料 b、図 1 5は試料 cを測定した結果である。ピーク 1は H b 1 &及び13、ピーク 2は H b F、ピーク 3は不安定型 H b A 1 c、ピーク 4は安定型 H b A 1 c、ピーク 5は Hb A0、ピーク 6は CHb、ピーク 7は AH bを示す。

図 1 3では、ピーク 3および 4が良好に分離されている。また、図 1 4ではピーク 6 (CH b)、図 1 5ではピーク 7 (AH b) がピーク 4 から良好に分離されている。

(実施例 1 0)

溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例 9と同様に操作してへモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図 1 3〜 1 5 と同様に良好であった。

溶離液：溶離液 A ： 48 mMの過塩素酸を含有する 2 5 mMコハク酸

- 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B ： 6 7 mMの過塩素酸を含有する 2 5 mMコハク酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 C ： 200 mMの過塩素酸を含有する 25 mMコハク酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 0 )

(実施例 1 1 )

溶離液：溶離液 A ： 5 3 mMの過塩素酸を含有する 20 mMマレイン酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 B ： 6 8 mMの過塩素酸を含有する 20 mMマレイン酸一 20 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 3) 溶離液 C ： 2 00 mMの過塩素酸を含有する 20 mMマレイン酸ー 20 mMリン酸緩衝液（ p H 8. 5 )

(実施例 1 2)

溶離液：溶離液 A ： 48mMの硝酸ナトリゥムを含有する 25mM コハク酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 B ： 7 1 mMの硝酸ナトリゥムを含有する 2 5 mM コハク酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 C ： 20 OmMの硝酸ナトリゥムを含有する 30 mM リン酸緩衝液（ p H 8. 3)

(実施例 1 3)

図 1 6に示した装置を用いて、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行った。カラムには陽イオン交換樹脂（ミクロネックス A 1 c HS- IV、積水化学工業社製）を充填したものを用いた。溶離液 Aとして 1 7 0 mM、溶離液 Bとして 1 90 mM、溶離液 Cとして 1 50 mM, 溶離液 Dとして 3 30 mMの、それぞれリン酸緩衝液で p H 6のものを用いた。試料としては、実施例 1で用いた全血検体を溶血試薬を用いて 1 00倍に溶血、希釈したものを用いた。 2分間で Hb A l c (後述のピーク P 5) を各へモグロビン類のピークから分離するように溶離液を段階溶出法を用いて切り替えた。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図 1 7に示した。すなわち、溶離液は 0〜 38秒は溶離液 Aを、 3 8〜 58秒は溶出力のより高い溶離液 Bを、 58〜78秒はより溶出力の低い溶離液 Cを、 7 8〜 1 00秒は溶出力の最も高い溶離液 Dを、 1 00〜 1 20秒は溶離液 Aを再び送液した。ピークの検出には 4 1 5 nmの吸収強度を用いた。

図 1 7のクロマトグラムにおいて、ピーク P 1〜P 3は、 Hb A l a 及び H b A l b類であり、ピーク P 4は H b Fであり、ピーク P 5は H b A l eであり、ピーク P 6は H b A 0である。

上記の方法では、溶離液 Aから溶離液 Bへの切り替えにより溶出力を上昇させたことによりピーク P 6が早く溶出して、 Hb A l cのピークであるピーク P 5の正確な検出を妨害するのを防ぐため、溶離液 Bから溶出力のより低い溶離液 Cへの切り替えを行っている。

再現性を評価するために、この方法で同一試料について 1 0回繰り返し測定し、次式により H b A 1 c値を算出した。 1 0回の各測定値、その平均値および CV値（％) を表 3に示した。

H b A 1 c値（％) =ピーク P 5の面積 ÷ (ピーク P 1の面積 +ピーク P 2の面積 +ピーク P 3の面積 +ピーク P 4の面積 +ピーク P 5の面積 +ピーク P 6の面積） X 1 00

(比較例 5)

実施例 1 3における溶離液 Cを用いなかった他は、実施例 1 3に準じて実施例 1 3と同一の試料中のへモグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件および得られたク口マトグラムを図 1 8に示した。すなわち、溶離液は 0〜38秒は溶離液 Aを、 38〜 78秒は溶出力のより高い溶離液 Bを、 78〜 1 00秒は溶出力の最も高い溶離液 Dを、 1 0 0〜 1 20秒は溶離液 Aを再び送液した。溶離液 Aから溶離液 Bへの切り替えにより溶出力を上昇させたことが影響し、図 1 8に〇で囲んだように、ピーク P 6の一部が早く溶出し、ピーク P 5と重なっていることが分かる。

再現性をみるために、この方法で同一試料について 1 0回繰り返し測定し、実施例 1 と同様にして H b A 1 c濃度を算出した。 1 0回の各測定値、その平均値および CV値（％) を表 3に示した。

(比較例 6 )

実施例 1 3における溶離液 Cを用いなかったこと、および溶離液 Bの代わりに溶離液 B l ( 1 80mM、 p H 6のリン酸緩衝液）を用いた他は、実施例 1 3に準じて実施例 1 3と同一の試料中のヘモグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図 1 9に示した。すなわち、溶離液は 0〜 3 8秒は溶離液 Aを、 38〜 7 8秒は溶離液 B 1を、 7 8〜 1 00秒は溶出力の最も高い溶離液 Dを、 1 00〜 1 20秒は溶離液 Aを再び送液した。溶離液 Aから溶離液 Bよりも溶出力の低い溶離液 B 1へ切り替えたため、ピーク P 6の一部が早く溶出することはないが、ピーク P 5はシャープにならず、図 1 9に〇で囲んだように、ピーク P 5にピーク P 4およびピーク P 6がー部重なつていることが分かる。

再現性をみるために、この方法で同一試料について 1 0回繰り返し測定し、実施例 1 と同様にして Hb A l c値を算出した。 1 0回の各測定値、その平均値および CV値（％) を表 3に示した。

表 3

(実施例 1 4)

テトラエチレングリコールジメタタリレート（新中村化学製） 450 gにベンゾィルパーオキサイド 2. O gを混合して溶解させ、 2. 5 L の 4重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。

これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、 80°〇で1. 5時間重合させた。反応系を 3 5°Cに冷却した後、 2—ァクリルァミドー 2—メチルプロパンスルホン酸（東京化成製） 200 gを添加して 1時間攪拌し、再ぴ 80 °Cで 1. 3時間重合させた。重合後、洗浄し、分級して平均粒径 6. 5 μ ηの充填剤を得た。

(比較例 7)

2—ヒドロキシェチルメタクリレート（新中村化学製） 400 g、ジエチレングリコールジメタクリレート 50 g、メチルメタクリレート 5 0 g及びベンゾィルパーオキサイド 1. 5 gを混合し、 2. 5 Lの 4重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、 80°Cで 8時間重合させた。

得られた重合体を洗浄した後、分級して平均粒径 2. 9 / mの重合体を得た。該重合体 1 00 gに 20重量％の水酸化ナトリゥム水溶液 1 0 OmL中に分散させた。これにェピクロルヒドリン 40 gを添加して 5 時間反応させた。得られたエポキシ基含有重合体 1 00 gを 20重量％の硫酸ナトリゥム水溶液 1 0 OmLに分散させた後、 80°Cで 1 5時間反応させた。得られた重合体を洗浄して乾燥させ充填剤を得た。

(比較例 8)

エチレングリコールジメタタリレート（新中村化学製） 1 25 g及びベンゾィルパーオキサイド 2. 5 gを混合して溶解させた。これを 2. 5 Lの 4. 0重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で攪拌しながら 80°Cで昇温した。 1時間経過後、 2—アクリルァミドー 2—メチルプロパンスルホン酸 1 25 gを反応系に添加し、さらに 8 0°Cで 24時間重合させた。

重合後、生成物を洗浄し分級して平均粒径 6. 5 mの充填剤を得た。

(評価）

( 1 ) 物性評価

乾燥させた充填剤について、以下の物性評価を行った。細孔分布、比表面積、細孔容積については、高速比表面積 ·細孔分布測定装置（ユアサアイォニタス製 NOVA— 1 200) によるガス吸着法により測定した。また、イオン交換容量は、電位差滴定装置（京都電子工業製 A T— 3 1 0) により測定した。測定結果を表 4に示した。表 4

( 2 ) カラムへの充填

上記各充填剤 0. 7 gを、 50 mMリン酸緩衝液（p H 6. 0) 30 mLに分散し、 5分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径 4. 6 X 3 5 mm) を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキエ業社製）を接続し、圧力 200 k g/ c m²で定圧充填した。

(測定条件）

溶離液：溶離液 E ：過塩素酸塩含有 1 5〜 1 00 mMリン酸緩衝液

( p H 5. 0〜6. 0)

溶離液 F ：過塩素酸塩含有 3 00 mMリン酸緩衝液（ p H

7. 0〜 8. 5 )

H b A 1 cの保持時間が最適となるように溶離液 Eの塩濃度と p Hを、溶離液 Fの p Hを上記範囲で調節し、段階溶出法でへモグ口ビン類の測定を実施した。

(測定結果）

実施例 1 4及び比較例 7， 8の充填剤を用いて試料 aの測定を行った結果を、それぞれ図 20、図 2 1、図 2 2に示した。

なお、図 20〜図 24におけるピークの符号の意味は以下の通りである。

2 1 ·'·Η b A 1 a及び H b A 1 b

2 2 '··Η b F

2 3…不安定型 H b A 1 c

24…安定型 H b A 1 c

2 5 ---H b A 0

2 6 ·'·Η b A 2

2 7 ·'·Η b S及び H b C

ここで、 H b Fと安定型 H b A 1 cの良好な定量性を維持するには、 H b F、不安定型 H b A 1 c、安定型 H b A 1 c、 H b A 0の順に溶出される必要がある。この理由は、通常、 Hb Fのピークが Hb A l cや H b A 0のビークと比較して小さいため、例えば、安定型 H b A 1 cと Hb AOの間などに溶出されると、 H b Fの定量性が極めて低下するためである。

実施例 1 4の充填剤では、上記の順序で各ピークが現れており、測定時間が短いにも関らず、良好に分離されていることがわかる。

一方、比較例 7では、溶出順序が逆転しており、 ^！ゃ安定型^!!) A 1 cの定量性に問題を生じる。また、比較例 7、 8共に、測定時間が長いにも関らず分離状態が悪い。

(5) 異常 Hb類の測定異常 H b類として H b A2、 Hb S及び H b Cを含むコントロール血液（ヘレナ製、 AF S Cコントロール）を溶血試薬で 6 7倍に希釈した試料を同様の条件下で測定した。実施例 1 4、比較例 7の充填剤を用いて測定を行った結果を、それぞれ図 2 3， 24に示す。実施例 1 4の充填剤では、比較例 7の充填剤と比較して測定時間が短いにも関らず、各ピークの分離が良いことが分かる。

(6) カラム耐久性試験

上記と同様の測定条件で全血検体を溶血試薬で 1 50倍に溶血希釈した試料を繰り返し測定し、安定型 H b A l c値の変動をみた。

安定型 Hb A l c値は、安定型 Hb A l c値（％) = (安定型 H b A l c ピークの面積） ÷ (全ピーク面積） X I 00で求めた。

結果を図 2 5に示した。実施例 1 4の充填剤は、比較例 7、 8の充填剤と比較して、測定値が長時間安定であった。

(7) 製造再現性試験

実施例 1 4及び比較例 7、 8の充填剤を、各々同一条件下で 30回（3 0ロット）調製し、上記と同様の測定条件で全血検体測定を行った。安定型 H b A 1 cの保持時間は、約 5. 0分となるように溶離液を調整した。表 5に示したように、各ロットにおける安定型 Hb A 1 cの保持時間と安定型 Hb A 1 c値のバラツキを比較したところ、実施例 1 4の充填剤は、比較例 7、 8に比べて製造再現性が優れていた。また、比較例 8では、 30ロット中 7ロットにおいて重合中に凝集物が発生し、カラムへの充填ができなかつた。表 5

(実施例 1 5)

図 26 ( a ) に示したフィルター 1 1を、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の等重量混合物を焼結処理して一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径 5mm、厚さが 1. 5 mmの円柱体からなり、濾過孔径は 2 mとした。

次に、このフィルター 1 1をポリエーテノレエーテルケトン製のシール部材 1 2に挿入した後、図 2 7に示すように、ステンレス製ホルダー 1 3 (頂角 A= 90度）に嵌め込み、半体 1 3 a及び 1 3 b同士をネジ結合して、ラインフィルター 1 5を作製した。

(実施例 1 6)

実施例 1 5と同様にして得られたフィルター 1 1をポリエーテルエーテルケトン製のシール部材 1 2に挿入した後、ポリエーテルエーテルケトン製のホルダー 1 3 (頂角 A= 1 50度）に嵌め込み、半体 1 3 a及び 1 3 b同士をネジ結合して、ラインフィルター 1 5を作製した。

(実施例 1 7)

図 26 (a) に示したフィルター 1 1を、ポリエチレンを焼結処理して一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径 5mm、厚さが 1. 5 mmの円柱体からなり、濾過孔径は 2 μ mとした。

次に、このフィルター 1 1をポリエーテノレエーテルケトン製のシール部材 1 2に挿入した後、図 2 7に示すように、ポリエーテルエーテルケトン製ホルダ一 1 3 (頂角 A = 1 50度）に嵌め込み、半体 1 3 a及び 1 3 b同士をネジ結合して、ラインフィルター 1 5を作製した。

(比較例 9)

図 2 6 (a ) に示したフィルター 1 1を、ステンレス焼結体の一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径 5mm、厚さが 1. 5 m mの円柱体からなり、濾過孔径は 2 μ mとした。

次に、このフィルター 1 1をフッ素樹脂製のシール部材 1 2に挿入した後、ステンレス製ホルダー 1 3 (頂角 A= 90度）に嵌め込み、半体 1 3 a及び 1 3 b同士をネジ結合して、ラインフィルター 1 5を作製した。

実施例 1 5〜 1 7及び比較例 9で得られたラインフィルターを用いて以下のようにして、（ 1 ) 吸着性の評価、及び（2) 生体試料の吸着性と p H ( p H 5. 0、 p H 6. 0、 p H 7. 0) の関係の評価を行った。

( 1 ) 吸着性の評価

溶離液の組成とその送液条件を以下のように変更した以外は、実施例 1 と同様に操作し、実施例 1 5〜 1 7または比較例 9で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、へモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性について検討した。なお、測定試料も実施例 1での試料 aを用いた。

(測定条件）

溶離液：溶離液 A ： 1 00 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 8)

溶離液 B ： 300 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 8) 測定開始より 0〜 3分の間は溶離液 Aを送液し、 3〜5分の間は溶離液 Bを送液し、 5〜 1 0分の間は溶離液 Aを送液した。

(測定結果）上記測定条件により、測定試料を測定して得られた代表的なクロマトグラムを図 30 (a ) (ラインフィルター使用せず）、図 30 (b) (実施例 1 5〜 1 7のラインフィルター使用）、図 30 ( c ) (比較例 9のラインフィルター使用）に示した。ピーク 6 1はヘモグロビン類のピークを示す（なお、カラムで分離されていないので単一のピークとなっている）。ピーク 6 2は、溶離液 Aではフィルターに吸着したヘモグロビン類が溶離液 Bによって脱着したために現れたピークと思われる。

評価方法

ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのへモグロビン類のピーク面積を 1 00 %として、実施例 1 5〜 1 7、比較例 9のラインフィルターを用いて測定したときのへモグロビン類のピーク面積 (ピーク 6 1の面積）から、以下の式により溶離液 Aによる回収率を求め、結果を表 6に示した。なお、測定はそれぞれ 3回行った。

回収率（0/₀) = (ラインフィルター装着時のヘモグロビン類のピーク面積） ÷ (ラインフィルター装着なし時のヘモグロビン類のピーク面積） X 1 00

比較例 9では、回収率の平均値が 5 7. 4%であったのが、実施例 1 5〜 1 7では、回収率の平均値がそれぞれ 95. 3%、 98. 5%、 9 8. 0%であった。

以上より、実施例 1 5〜 1 7のラインフィルターを用いたものでは、比較例 9のラインフィルターを用いたものに比べてヘモグロビン類の吸着が少なかったことがわかる。表 6

また、表 6 (及び後述の表 7) における、 CV値（％) とは変動係数 (すなわち、 CV値（％) =標準偏差 ÷平均値 X 1 00) のことである、比較例 9のラインフィルターを用いたものは、実施例 1 5〜 1 7のラインフィルターを用いたものに比較して CVがはるかに大きく、へモグロビン類の吸着量のばらつきが大きいことが分かる。

( 2 ) 生体試料の吸着性と p Hの関係の評価

上記吸着性の評価で溶離液 Aの p Hを p H 5. 0、 p H 6. 0、 p H 7. 0とした以外は上記吸着性の評価と同じ測定条件を用い、実施例 1 5〜 1 7または比較例 9で作製したラインフィルターのみを用いて（すなわち、カラムは使用せず）、へモグロビン類の測定をすることにより、生体試料の吸着性と pHの関係を評価した。

評価方法

ラインフィルターを装着せずに、測定試料を測定したときのへモグロビン類のピーク面積を 1 00%として、実施例 1 5〜 1 7または比較例 9で得られたラインフィルターを用いて測定（n = 5) したときのへモグロビン類のピーク面積から、以下の式により溶離液 Aによる回収率を求め、結果を表 7に示した。

比較例 9では、 pH 5. 0、 p H 6. 0、 p H 7. 0での回収率がそれぞれ平均 1 3. 56%、 76. 5 2 %、 9 1. 98%であった。また、 CV値（％) は、 p Hが低くなるほど悪くなり、 pH 5. 0で、 37.

2 7 %であった。

実施例 1 5では、 pH 5. 0、 p H 6. 0、 p H 7. 0での回収率がそれぞれ平均 9 7. 4 2 %、 9 7. 82 %、 9 7. 20 %であった。実施例 1 6では、 ρ Η 5 · 0、 ρ Η 6. 0、 ρ Η 7. 0での回収率がそれぞれ平均 9 8. 56 %、 9 8. 76 %、 9 8. 82 %であった。実施例 1 7では、 ρ Η 5. 0、 ρ Η 6. 0、 ρ Η 7. 0での回収率がそれぞれ平均 9 7. 7 2 %、 98. 2 2%、 9 8. 46 %であった。

表 Ί

また、実施例 1 5〜 1 7での CV値（％) は、いずれの pHにおいても、 1 %以下であった。

以上より、比較例 9のステンレス製フィルターではへモグロビン類の吸着性は、 p Hの影響を非常に強く受けることが明らかになった。ステンレス製フィルターではヘモグロビン類の吸着が極めて大きくなり、吸着率も大きくばらつくので、ステンレス製フィルターをへモグロビン類の測定に用いるとフィルター寿命が短くなり、データーのばらつく原因になると考えられる。

実施例 1 5〜 1 7のフィルターでのヘモグロビン類の吸着性は、 pH 9. 0から酸性側 5. 0付近までの p Hの影響を受けず、回収率もほぼ 1 00 %であった。

以上より、ヘモグロビン類の測定に用いるフィルタ一としては、広い p Hの範囲でへモグロビン類の吸着が殆どないポリエーテルエーテルケトンを含む材料あるいはポリエチレンからなるフィルターを用いた方が良いことが明らかである。

(実施例 1 8)

図 26 ( a ) に示したフィルター 1 1を、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の等重量混合物を焼結処理して一体成形品として製造した。その構造の詳細は、直径 4. 8 mm, 厚さが 2 mmの円柱体からなり、濾過孔径は 2 x mとした。次に、このフィルター 1 1をフッ素樹脂製のシール部材 1 2 (外径 6. 3 mm, 内径 4. 8 mm, 厚さ 2 mm) に挿入した後、これを図 29に示したステンレス製カラム本体 40 (内径 4. 6 mm, 長さ 30mm) の両端に取り付けるためのエンドフイツティング 4 2に装着した。

上記のカラムに、以下のようにして調製した充填剤を、以下に示す力ラムの作製の項で述べるようにして充填して、本発明の LC用カラムを製造した。

充填剤の調製

テトラエチレングリコールジメタタリレート（新中村化学社製） 40 0 g及びメタクリル酸（和光純薬社製） 1 5 0 gの混合物にベンゾィルパーオキサイド（重合開始剤、和光純薬社製） 1. 5 gを溶解した。これを、 4重量。 /。ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液 2 5 O OmLに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で 7 5°Cに昇温し、 8 時間重合した。重合後、洗浄し、乾燥した後、分級して平均粒径 6 μ πι の粒子を得た。カラム 1本あたり、上記充填剤 1. 0 gを、 50 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 0) 30mLに分散し、 5分間超音波処理した後、よく攪拌した。全量を上記のステンレス製カラム本体 40 (内径 4. 6 X 3 Omm) を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカー（梅谷精機社製）に送液ポンプ（サヌキエ業社製）を接続し、上記充填剤を上記ステンレス製カラム本体 40に圧力 300 k g Z c m²で定圧充填した後、エンドフィッティング 42とカラム本体 40を螺合して本実施例の LC 用カラムを製造した。

(実施例 1 9)

実施例 1 8における、フィルター 1 1を、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の等重量混合物を焼結処理して一体成形品として製造したことの代わりに、ポリエチレン焼結体の一体成形品として製造したことの他は、実施例 1 8と全く同様にして LC用カラムを製造した。

(比較例 1 0)

実施例 1 8における、フィルター 1 1を、ポリエーテルエーテルケトンとフッ素樹脂の等重量混合物を焼結処理して一体成形品として製造したことの代わりに、ステンレス焼結体の一体成形品として製造したことの他は、実施例 1 8と全く同様にしてカラムを製造した。

実施例 1 8、 1 9及び比較例 1 0で得られたカラムを用いて以下のようにして、ヘモグロビン類の測定を行うことにより、該カラムの分離性能に与える評価を行った（なお、ラインフィルタ一は用いなかった）。測定条件

流速を 1. 6mLZ分にし、溶離液の組成とその送液条件を以下のように変更した以外は、実施例 1 と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。また、測定試料は実施例 1の試料 aを用いた。

測定条件

溶離液：溶離液 A ： 1 00 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 8)

溶離液 B ： 300 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 8) 測定開始より ◦〜 5分の間は溶離液 Aを送液し、 5〜6分の間は溶離液 Bを送液し、 6〜 1 0分の間は溶離液 Aを送液した。

測定結果

上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図 3 1 (a) (実施例 1 8のカラムを用いたもの）、図 3 1 (b) (比較例 1 0のカラムを用いたもの）に示した。ピーク 5 1は H b A 1 a及び H b A l b、ピーク 5 2は H b F、ピーク 5 3は不安定型 H b A 1 c、ピーク 54は安定型 H b A 1 c、ピーク 55は H b A 0を示す。この結果、実施例 1 8の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものでは、比較例 1 0の液体クロマトグラフィー用カラムを用いたものに比較して分離性能に優れていることが分かる。また、実施例 1 9のカラムでは、実施例 1 8と同様、良好な分離が得られた。

(実施例 20)

溶血試薬として以下の試薬を用いた以外は比較例 2と同様に操作を行レ、、 H b類（試料 a ) の測定を行った。

(溶血試薬）

0. 1重量⁰ /₀ポリエチレングリコールモノ 4ーォクチルフエニルエーテル（トリトン X— 1 0 0) のリン酸緩衝液溶液（ p H 7. 0 ) (標準の溶血試薬）に、グァニジンを 1 00 mMとなるよう添加したもの。

(測定結果）

得られたク口マトグラムは図 1 とほぼ同様であった。比較例 2のクロマトグラム（図 4) と比較すると、各ピークの分離が良好になった。

(実施例 2 1 )

以下の溶離液を用いた以外は、上記比較例 9のステンレスフィルターを用いて同様に評価して回収率を求めた。

(溶離液）

溶離液 A ： 2—アミノエタノール 1 00 p p mを含有する 1 00 mM リン酸緩衝液（ p H 5. 8)

溶離液 B : 300 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 8)

(測定結果）

回収率を表 6に示す。比較例 9での低回収率が、ァミン類の添加で大幅に向上した。

(実施例 22)

(充填剤の調製）

テトラエチレングリコールジメタタリレート（新中村化学製） 450 gおよび 2 ヒドロキシー 1， 3 ジメタクリロキシプロパン 50 gにベンゾィルパーオキサイド 2. 0 gを混合して溶解させ、 2. 5 Lの 4 重量％ポリビュルアルコール水溶液に分散させた。

これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、 80°Cで 1. 5時間重合させた。反応系を 3 5°Cに冷却した後、 2 アクリルアミドー 2 メチルプロパンスルホン酸（東京化成製）の 50%水溶液 400 g、およびメタノール 40 OmLを添加して 1時間攪拌し、再び 80°Cで 1. 3時間重合させた。

重合後、洗浄し、分級して平均粒径 6. 5 μ πιの充填剤を得た。さらに上記の方法によりカラムに充填した。

得られたカラムを用い以下の H b類の測定を行った。

(システム）実施例 1 と同じ。

(ラインフィルター）実施例 1 7のポリエチレン製を用いた。

(カラムの充填方法）実施例 1に同じ。但し充填後、 0. 3重量％の H b試薬（D i f c o L a b o r a t o r i e s社製）を含む 1 7 0 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 7) を流速 1. 5 m L/分で 1 5分通液し、さらに ρΗ 5· 7の 1 70 mMリン酸緩衝液の 1 5分通液することにより、より速く測定初期の測定値の安定化が行えた。

(その他の条件）

検出波長： 4 1 5 nm

流速： 1. 8 mLZ分

試料注入量： 1 0 μ L

(試料）

実施例 1に記載の試料 a〜c) および実施例 1 4で用いた異常 Hbコントロール血液を用いた。

(試料 a〜c) の測定）

(測定条件）

(溶離液）以下の 3種類を用いた。

溶離液 A ： 5 5 mM過塩素酸を含む 20 mMコハク酸 20 mM リン酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 B ： 70 mM過塩素酸を含む 20 mMコハク酸 20 mM リン酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 C : 2 5 0 mM過塩素酸を含む 2 0 mMコハク酸一 2 0 mM リン酸緩衝液（ p H 8. 0 )

(送液条件）以下の時間により溶離液を切り替える段階溶出法により行った。

0〜 3 8秒：溶離液 A

3 8〜 5 8秒：溶離液 B

5 8〜 7 8秒：溶離液 A

7 8〜： L 0 0秒：溶離液 C

1 0 0〜 1 2 0秒：溶離液 A

(測定結果）

試料 a〜 cの測定結果を、それぞれ図 3 4〜 3 6に示す。図 3 4〜3 6において、ピーク 2 1〜 2 5の意味は実施例 1 4と同じであり、更にピーク 2 8は CH b、ピーク 2 9は AH bを示す。

図 3 4では不安定型 H b A 1 cおよび安定型 H b A 1 cが良好に分離された。また図 3 5ではピーク 2 8 (CH b) 、図 3 6ではピーク 2 9 (AH b ) 、ピーク 2 4から良好に分離された。

(異常 H b含有試料の測定）

(測定条件）

(溶離液）以下の 4種類を用いた。

溶離液 A ： 5 5 mM過塩素酸を含む 2 0 mMコハク酸一 2 0 mM リン酸緩衝液（ p H 5. 3)

溶離液 B ： 7 0 mM過塩素酸を含む 2 0 mMコハク酸一 2 0 mM リン酸緩衝液（p H 5. 3)

溶離液 C : 2 5 0 mM過塩素酸を含む 2 0 mMコハク酸一 2 0 mM リン酸緩衝液（ p H 8. 0 ) 00/ 4 溶離液 D ： 70 mM過塩素酸を含む 20 mMコハク酸一 20 mM リン酸緩衝液（ p H 6. 8)

0〜 3 8秒：溶離液 A

3 8〜 58秒：溶離液 B

58〜 78秒：溶離液 A

7 8〜： L 20秒：溶離液 D

1 20〜： L 40秒：溶離液 C

1 40〜 1 80秒：溶離液 A

(測定結果）

得られたクロマトグラムは図 2 3と同様、 Hb AOの後に各異常 Hb が良好に分離された。発明の効果

本願の第 1，第 2の発明に係る測定方法によれば、従来のへモグロビン類の測定方法における問題点であつたへモグ口ビン類の分離性能が改善され、特に安定型 Hb A l cを高い再現性で精密に分離できる。

Claims

請求の範囲

1. 陽イオン交換 L Cによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ pH4. 0〜6. 8で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び/またはこれらの塩を含む溶離液を用いることを特徴とするへモグ口ビン類の測定方法。

2. 陽イオン交換 L Cによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（p K a) が 2. 1 5〜6.

3 9の範囲及び 6. 40〜 1 0. 50の範囲にある緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

3. 請求項 1〜 2のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法であって、 H b A 0を溶出するために、カラムに流入する際の pHがへモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

4. 請求項 3に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、前記溶離液の p Hが 6.8以上であることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

5. 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法であって、少なくとも溶出力の異なる 3種の溶離液を用い、 Hb AOを溶出するための溶離液を送液する前に、該 H b A 0を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

6. 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法であって、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

7. 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、 H b AOの溶出より後に、 Hb A2、 H b S、 Hb Cから成る群のへモグロビンを少なくとも 1つ溶出させることを特徴とするへモグ口ビン類の測定方法。

8. 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載のヘモグロビン類の測定方法において、前記溶離液がさらに分子量 2 0〜 5 0 0のアミン類を少なくとも 1種類以上を含有していることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

9. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法において、分子量 2 0〜 5 0 0のアミン類を少なくとも 1種類以上含有した溶血試薬を用いることを特徴とするへモグロビン類の測定方法。

1 0. 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のヘモグロビン類の測定方法に用いるための陽イオン交換クロマトグラフィー用充填剤であって、ィオン交換基を有する単量体及び架橋性単量体を構成成分とする重合体より成り、平均直径が 1 0〜 1 0 0オングストロームである細孔を有し、比表面積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0. 0 5〜 5 m²であり、細孔容積が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり 0. 1〜 1 0 /i Lであり、ィォン交換容量が、充填剤の乾燥重量 1 g当たり l〜 1 0 0 z _e qであることを特徴とする陽イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

1 1. 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法に用いるためのフィルターであって、該フィルターがポリエーテルケトン類及び/またはポリエチレンを構成材料とすることを特徴とする液体クロマトグラフィー用フィルター。

1 2. 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のへモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、力オト口ピックイオンを含有することを特徴とする溶血試薬。