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WO2000000217A1 - Immunisation a ciblage mucosal - Google Patents

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WO2000000217A1
WO2000000217A1 PCT/FR1999/001539 FR9901539W WO0000217A1 WO 2000000217 A1 WO2000000217 A1 WO 2000000217A1 FR 9901539 W FR9901539 W FR 9901539W WO 0000217 A1 WO0000217 A1 WO 0000217A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
iga
igg
use according
mucosa
immunogenic composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/001539
Other languages
English (en)
Inventor
Thérèse JOURDIER
Catherine Moste
Bernard Meignier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur SA
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur SA, Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA filed Critical Aventis Pasteur SA
Priority to EP99926545A priority Critical patent/EP1089758A1/fr
Priority to AU43754/99A priority patent/AU751970B2/en
Priority to CA002335506A priority patent/CA2335506A1/fr
Publication of WO2000000217A1 publication Critical patent/WO2000000217A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to an immunization method for inducing a local immune response, in particular in the rectogenitourinary mucous region. It also relates to the use of immunogens for the production of vaccine compositions intended to be administered according to said method.
  • the main route of transmission of the AIDS virus is through the mucous membranes, in particular the genital and rectal mucosa, or even the oral mucosa. From these mucous membranes, the virus quickly spreads to the draining nodes, before joining the peripheral blood.
  • the targeting of local mucosal-type immunity can be demonstrated by the presence of specific antibodies contained in the mucous membranes or secretions (Thibodeau L. et al., Aids Research and Human Retrovirus, 1379, 1992; Russel MW et al. , Reviews of infectious diseases, 5440-5446, 1988).
  • Gaffar A. et al. (US3931398) teach that an injection of a vaccine into the oral cavity would induce local immunity. No antibody measurements are reported. It therefore seems that the proximity of the injection site to the place of targeting of local immunity is essential, as also reported by Letchworth G.J. et al. above.
  • the present invention aims at the use of specific immunogen of a pathogenic agent having an entry point at the level of a mucosa for the production of an immunogenic composition intended for administration to humans parenterally on the surface of a separate part of the body remote from said mucosa, so as to directly develop a local response in IgA, IgG and / or IgM antibodies and in B cells secreting said antibodies at the level of said mucosa and of the ganglia which drains it.
  • a particular objective of the invention relates to the targeting of the rectal, genital and / or urinary mucosa by parenteral administration in the thigh. Faced with this observation, we can now search for multiple sites injections distinct from the mucous membranes which will directly allow the induction of a local response in these mucous membranes, in particular in antibodies and in B cells secreting antibodies found in the mucous membranes and the ganglia which drain them.
  • Another particular objective of the invention is to provide such an immunization route for developing local immunity against the AIDS virus (HIV).
  • HIV AIDS virus
  • Another objective of the invention is to simultaneously induce systemic immunity, in particular humoral and / or cellular, detectable in the peripheral blood.
  • the present invention thus relates to the development of a local response, in particular at the level of the recto-genito-urinary mucosa and of the ganglia which drain it by parenteral injection of an immunogenic composition into a part of the body distinct from the mucosa, such as the thigh.
  • Parenteral administration in the thigh and in the surrounding upper regions, in particular the groin makes it possible to target the iliac and inguinal nodes.
  • the intramuscular route is preferred in one or both of the lower limbs, particularly in the quadriceps, particularly in the anterior rectus muscle.
  • Such an immunization pathway proves capable of locally inducing at the level of this mucosa on the one hand the production of immunoglobulins in the secretions and, on the other hand regionally, at the level of the ganglia draining this mucosa, the production of antibody secreting B cells, while inducing systemic immunity.
  • This immunity is capable of inducing protection against the entry and spread of the pathogen considered from this recto-genito-urinary mucous region.
  • the invention applies both to the field of prophylaxis (e.g. vaccines) and to the field of active immunotherapy.
  • immunogenic composition therefore covers compositions for prophylactic purposes, in particular vaccines, and compositions for curative purposes in which the immunogen is of antigen type.
  • a first particular object of the invention is therefore the use of an immunogen specific for a pathogenic agent having an entry point at the level of the recto-genito-urinary mucous region, for the production of an immunogenic composition.
  • intended to be administered to man parenterally in the thigh preferably intramuscularly, especially in the quadriceps, in particular in the anterior rectus muscle (parenteral administration in a thigh muscle will preferably be in the muscle of each right and left lower limb), so as to develop a local response in IgA antibody, or even also in IgG and / or IgM antibody, and in B cells secreting IgG, IgM and / or IgA at the level of respectively on the one hand the recto-genitourinary mucous membranes and their secretions, and on the other hand the lymph nodes which drain this mucous membrane, in particular external and internal iliac nodes and inguinal nodes.
  • Parenteral and in particular intramuscular injection into the thigh indeed appears
  • the HIV virus Herpes viruses, eg Herpes simplex, in particular type 2, Candida, Chlamydia, Human papillomavirus, Genital Mycoplasmas, Treponema pallidum, Papovaviruses, eg Condyloma accuminatum and gonococcal infections.
  • Herpes viruses eg Herpes simplex, in particular type 2
  • Candida Chlamydia
  • Human papillomavirus Genital Mycoplasmas
  • Treponema pallidum eg Condyloma accuminatum and gonococcal infections.
  • Papovaviruses eg Condyloma accuminatum and gonococcal infections.
  • this mode of administration is not limited to inducing a local response, and can also make it possible to induce at the same time a systemic response, the two actions combining, and complementing, or even reinforcing, so particularly advantageous. Consequently, the use in accordance with the invention also aims to develop, in addition to a local response according to the invention, a systemic response of the IgG and / or IgM type, and optionally IgA (antibodies and secretory B cells).
  • Another object of the invention is the method of immunization against pathogenic agents as described above, consisting in administering by any means known per se, the appropriate immunogenic composition by parenteral route, in particular intramuscular, in the thigh, one or both lower limbs, preferably quadriceps, particularly the anterior rectus muscle.
  • the immunization method can use each of the characteristics, alone or in combination, stated here in the context of use.
  • the invention applies to all types of immunogenic composition and in particular known vaccines, whether they are of the conventional type or of the recombinant type.
  • the compositions e.g. vaccines of the conventional type group together the compositions, e.g. whole live attenuated or inactivated vaccines, the subunits (proteins or peptides). They can be adjuvanted or non-adjuvanted and be presented in combined form bringing together different valences and / or different immunogenic forms of the same valence.
  • compositions eg recombinant vaccines group together the live vectors expressing one or more immunogens of the pathogen considered as well as the polynucleotide plasmid vectors made up of DNA which can for example be naked or included in a liposome (see eg WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660) and which express one or more immunogens.
  • vectors such as the vaccinia virus and especially the avian poxviruses (canarypox, fowlpox, pigeonpox, etc.), such as those described in Tartaglia et al. ., Virol. 1992, 188: 217, as well as adenoviruses.
  • poxviruses such as the vaccinia virus and especially the avian poxviruses (canarypox, fowlpox, pigeonpox, etc.), such as those described in Tartaglia et al. ., Virol. 1992, 188: 217, as well as adenoviruses.
  • compositions eg vaccines
  • the invention cannot be limited to a particular type of composition, eg vaccines, but is intended to apply to all types of immunogenic compositions, eg vaccines, and to all the compositions, eg vaccines, available which can be used parenterally, in particular intramuscularly.
  • the immunization protocol will depend on the type of composition or the composition used. It will include the number of administrations usually used for a given composition which, in general, will correspond to more than 1 administration, in particular from 2 to 4.
  • anyone skilled in the art is in any case perfectly capable of routine to determine the optimum number of administrations (eg primary vaccination and booster). It should be noted, however, that injection into a site separate from the mucous membranes can alone target a local response, without the need for a reminder in the mucous membranes.
  • This targeted immunization may also be associated with conventional systemic immunization with the same composition or another composition against the same pathogen.
  • an immunization protocol targeting the oral mucosa comprising the administration of an immunogenic composition against the same pathogen, identical or different, in particular of the same composition, aimed at inducing a local IgG response.
  • a sublingual injection is an appropriate means, other routes of administration in the oral cavity remaining possible.
  • Such a combination is particularly useful for preventing or treating infection by a pathogen having both the oral and recto-genitourinary entry points. Mention may in particular be made of the HIV virus, Herpesvirus, etc.
  • the invention also relates to the use of an immunogenic composition intended to be administered to a host parenterally in the thigh, in particular intramuscularly in the thigh, preferably in the quadriceps, in particular in the anterior rectus muscle, and on the other hand the use of another immunogenic composition, identical or different from the previous one, intended to be administered to the same host by sublingual injection in the floor of the mouth.
  • the use and the immunization method in accordance with the invention find a preferred application in the context of vaccination against the HIV virus.
  • a particular example is the use of a vaccine combining a vector expressing gp120 / gp160 of HIV and of the gp120 / gp160 glycoprotein subunit of this same virus.
  • a particular example is described below.
  • this anti-HIV vaccine for its administration by intramuscular route in the thigh, possibly combined with conventional sublingual and / or systemic administration, e.g. by intramuscular injection in the deltoid.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising at least one immunogen specific for a pathogen having an entry point at the level of the recto-genitourinary mucous region and a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient, this vehicle or excipient, or this composition, leading, in conjunction with the immunogen, to a local response in IgG, IgM and / or IgA antibodies and in B cells secreting IgG, IgM and / or IgA in this mucous region, when the composition is administered parenterally to the thigh, in particular intramuscularly.
  • the characteristics set out here with regard to the other objects of the invention can be used alone or in combination.
  • vCP205 is an ALVAC canarypox virus whose construction is described in Example 14 of WO-A-95 27507 to which a person skilled in the art may refer. It is capable of expressing the env, gag and pro genes of the HIV-1 virus. These genes are inserted into the C3 locus and are regulated by the H6 and I3L promoters of the vaccinia virus.
  • These cassettes were inserted into the C3 locus, between the flanking sequences of ALVAC, in a 5'-5 'configuration, and linked to the H6 and I3L promoters.
  • VCP205 was produced on fibroblasts from chicken embryos in DMEM-Ham F12 medium without serum, added with lactoglutamate and clarified by centrifugation.
  • the mean titer was 10 8.0 TCID 5 o ml on QT35 cells.
  • the vaccine solutions are prepared by dilution in PBS ("phosphate buffer saline") with Ca ++ and Mg ++ .
  • the subunit produced is a hybrid gp160 subunit obtained from a pox vector.
  • a WTG9150 vaccine vector is used to produce gp160.
  • This vector codes for a soluble hybrid gp160 in which the gp120 part is derived from the HIV-1 MN strain and the gp41 part comes from the LAI isolate.
  • the corresponding DNA sequences were fused using an SmaI artificial restriction site not modifying either of the two amino acid sequences of gp120 and gp41. The construction is briefly described below.
  • sequence coding for gp120 MN was amplified from SupT1 cells infected with HIV-MN, by PCR technique with oligonucleotides introducing a SphI restriction site and a SmaI site respectively immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide and upstream of the cleavage sites located between gp120 and gp41.
  • the sequence coding for gp41 was thus produced: the complete coding sequence for env HIV-1 LAI was placed under the control of the vaccinia virus promoter PH5R.
  • a SphI restriction site was created immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide, without altering the amino acid sequence.
  • a SmaI restriction site was also created immediately upstream of the sequence coding for the cleavage sites between gp120 and gp41, without altering the amino acid sequence.
  • the two cleavage sites in position 507-516 (amino acid numbering according to Myers et al. In: Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) were mutated (original sequence: KRR ...
  • WTG9150 was then constructed by conventional homologous recombination and propagated to ensure the expression of gp160 according to the method usually used for vCP205 on BHK21 cells. Gp160 was then purified by immunoaffinity chromatography.
  • One of the two monkeys received an additional injection of the same mixture (vCP205 + gp160 MN / LAI-2) in the floor of the mouth as well as the upper right thigh, three months after the last injection.
  • Lymphocytes from peripheral blood and certain lymph nodes were analyzed in ELISPOT for the detection of B cells producing IgA and IgG antibodies specific for gp160 and CPpp.
  • the vaccine is a mixture containing 10 6.3 DICC50 of vCP205 and 100 ⁇ g of gp160 subunit.
  • An ALVAC vector comprising no HIV sequence was also used as a control.
  • Group 1 4 monkeys (rhesus macaques) received 4 times, at 1 month in the interval, an injection of the vaccine mixture sublingually into the floor of the mouth; mixture at equal volume of vCP205 at 10 6 ' 9 DICC 50 / ml and gp160 at 400 ⁇ g / ml; 0.25 ml on the right and 0.25 ml on the left.
  • - Group 2 4 monkeys (rhesus macaques) received 4 times, 1 month apart, an injection of the vaccine mixture intramuscularly into the thigh (perpendicular to, and into the anterior rectus muscle); mixture at equal volume from vCP205 to 10 6 ' 6 DICC 50 / ml and from gp160 to 200 ⁇ g / ml; 0.5 ml on the right and 0.5 ml on the left.
  • controls 3 monkeys (rhesus macaques) received 4 times, 1 month apart, an injection of the ALVAC vector intramuscularly into the thigh; ALVAC (CPpp) at 10 6 ' 3 DICC 50 / ml; 0.5 ml on the right and 0.5 ml on the left.
  • the right and left lymph nodes of each category were removed after sacrifice of the animal, crushed (the right and left submandibular lymph nodes were pooled), then subjected to the analysis of antibody-producing cells by the ELISPOT technique (adapted from Erikson K. et al., Journal of Immunological methods, 153: 107-113, 1992).
  • the vaccine consists of two products injected separately, first of all vCP20) 55 to 1100 6655 DDIICCC50, then of the gp160 MN / LAI subunit at 50 ⁇ g adjuvanted by a conventional adjuvant
  • the number of B lymphocytes secreting IgG and IgA specific for gp160 was measured for 10 6 mononuclear cells, in each sample (lymph nodes and blood) of the two macaques. The mean and standard deviation of triplicate counts for each sample are shown.
  • the right and left nodes of each category (submaxillary, axillary, inguinal, internal iliac, external iliac) were removed after sacrifice of the animal, crushed, the right and left lymph nodes of each category were pooled, then subjected to the analysis of antibody-producing cells by the ELISPOT technique (adapted from Eriksson K. et al., Journal of Immunological Methods, 153: 107-113, 1992).
  • the anti-gp160 antibodies IgA and IgG antibodies were also assayed by the ELISA technique in the serum and mucous secretions (urine, vaginal and rectal washings) of the two macaques.
  • the samples were taken before the two late boosters (S99), then after immunization just before the animal was sacrificed (S104 or S105).
  • the results are expressed, for each secretion, as the ratio of the specific anti-gp160 IgA or IgG activity measured at the time of sacrifice. compared to that evaluated before the two late recalls (S99).
  • a secretion was considered to be significantly positive in specific IgA or IgG if this ratio was greater than 3 (the specific activity of a secretion corresponds to the specific IgA or IgG titer (here of gp160) divided by the titer in IgA or total IgG).
  • IgA has also been detected in some urinary, vaginal and rectal secretions.
  • Vaccines against Herpes simplex, Candida, Chiamydia, Human Papillomavirus, Genital Mycoplasma or Treponema pallidum have been injected into the thigh muscles in order to stimulate and target a local IgA antibody response at least in rectal, genital and / or urinary mucosa.

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Abstract

Utilisation d'immunogène spécifique d'un agent pathogène ayant une porte d'entrée au niveau d'une muqueuse pour la production d'une composition immunogène destinée à être administrée chez l'homme par voie parentérale à la surface d'une partie du corps distincte de ladite muqueuse, de manière à directement développer une réponse locale en anticorps IgA, IgG et/ou IgM au niveau de ladite muqueuse.

Description

Immunisation à ciblage mucosal
La présente invention concerne une méthode d'immunisation permettant d'induire une réponse immunitaire locale, notamment dans la région muqueuse recto- génito-urinaire. Elle a également pour objet l'utilisation d'immunogènes pour la réalisation de compositions vaccinales destinées à être administrées selon ladite méthode.
Etat de la technique
La voie de transmission principale du virus du SIDA est constituée par les muqueuses, en particulier muqueuses génitale et rectale, voire muqueuse buccale. Depuis ces muqueuses, le virus se dissémine rapidement vers les ganglions drainants, avant de rejoindre le sang périphérique.
Comme dans le cas des autres agents pathogènes (virus, bactérie, etc..) à porte d'entrée mucosale, l'induction d'immunité capable de bloquer le virus à son entrée dans la muqueuse ou dans les premières étapes de sa dissémination dans les ganglions paraît importante.
La plupart des travaux visent généralement à l'obtention d'une immunité systémique qui est détectable par le titre en anticorps sériques, comme décrit par Jian-Ming X. et al. (vaccine, 993-1000, 1996), Kim J.J. et al. (vaccine, 879-883, 1997), Anderson et al. (The Journal of Infectious Diseases, 960-969, 1989), David D. et al. (vaccine, 1661-1669, 1997), Raskisov et al. (US4368191) et Transgène (FR2751879).
Le ciblage d'une immunité locale du type mucosale peut être démontrée par la présence d'anticorps spécifiques contenus dans les muqueuses ou les sécrétions (Thibodeau L. et al., Aids Research and Human Retrovirus, 1379, 1992 ; Russel M.W. ét al., Reviews of infectious diseases, 5440-5446, 1988).
Les travaux de Lehner et al., (Nature Medicine, 767-775, 1996) réalisés chez le macaque rhésus ont montré qu'il est possible d'induire une immunité locale vis-à- vis du virus SIV, en effectuant une injection sous-cutanée extrêmement profonde dans la région pelvienne au voisinage des ganglions iliaques. Cette immunisation se traduit par l'induction d'anticorps de type IgA et IgG dans les fluides rectaux, urinaires et dans le sérum. Une telle méthode d'immunisation n'est cependant pas applicable à l'homme.
Letchworth G.J. et al. (US5462734) enseignent qu'une injection intramusculaire (sans précision du site d'injection) d'une glycoprotéine induit une réponse systémique uniquement, et le rappel effectué au niveau des muqueuses permet l'obtention alors d'une immunité locale mucosale. Il semble donc que l'injection intramusculaire ne permette pas à elle seule le ciblage d'une réponse locale.
Gaffar A. ét al. (US3931398) enseignent qu'une injection d'un vaccin dans la cavité orale permettrait d'induire une immunité locale. Aucune mesure des anticorps n'est rapporté. Il semble donc que la proximité du site d'injection avec le lieu de ciblage d'une immunité locale soit essentielle, comme rapporté aussi par Letchworth G.J. et al. ci-dessus.
Il n'existe donc pas à l'heure actuelle de méthode d'immunisation mucosale ciblant la région recto-génito-urinaire, qui soit réellement efficace et utilisable dans la pratique courante de la médecine humaine ou vétérinaire. Par ailleurs rien ne permet de penser qu'une injection dans des sites éloignés des muqueuses puisse établir une réponse locale ciblée.
Résumé de l'invention
Afin de pallier les besoins de disposer de solutions techniques pour induire efficacement et facilement une immunité locale, la présente invention vise ainsi l'utilisation d'immunogène spécifique d'un agent pathogène ayant une porte d'entrée au niveau d'une muqueuse pour la production d'une composition immunogène destinée à être administrée chez l'homme par voie parentérale à la surface d'une partie du corps distincte et éloignée de ladite muqueuse, de manière à directement développer une réponse locale en anticorps IgA, IgG et/ou IgM et en cellules B sécrétrices desdits anticorps au niveau de ladite muqueuse et des ganglions qui la draine.
Un objectif particulier de l'invention concerne le ciblage des muqueuses rectales, génitales et/ou urinaires par une administration par voie parentérale dans la cuisse. Face à ce constat, on peut donc maintenant rechercher de multiples sites d'injections distincts des muqueuses qui permettront directement l'induction d'une réponse locale au niveau de ces muqueuses, notamment en anticorps et en cellules B sécrétrices d'anticorps retrouvées au niveau des muqueuses et des ganglions qui les drainent.
Un autre objectif particulier de l'invention est de proposer une telle voie d'immunisation pour développer une immunité locale contre le virus du SIDA (HIV).
Un autre objectif de l'invention est d'induire simultanément une immunité systémique, notamment humorale et/ou cellulaire, détectable au niveau du sang périphérique.
Détail de l'invention
La présente invention a ainsi pour objet le développement d'une réponse locale, notamment au niveau de la muqueuse recto-génito-urinaire et des ganglions qui la drainent par injection parentérale d'une composition immunogène dans une partie du corps distincte de la muqueuse, telle que la cuisse. L'administration parentérale dans la cuisse et dans les régions avoisinantes supérieures, en particulier l'aine, permet de cibler les ganglions iliaques et inguinaux. On préfère la voie intramusculaire dans l'un ou les deux membres inférieurs, en particulier dans le quadriceps, notamment dans le muscle droit antérieur. Une telle voie d'immunisation s'avère capable d'induire localement au niveau de cette muqueuse d'une part la production d'immunoglobulines dans les sécrétions et, d'autre part régionalement, au niveau des ganglions drainant cette muqueuse, la production de cellules B sécrétrices d'anticorps, tout en induisant une immunité systémique. Cette immunité est susceptible d'induire une protection contre l'entrée et la dissémination du pathogène considéré depuis cette région muqueuse recto-génito-urinaire.
L'invention s'applique aussi bien au domaine de la prophylaxie (e.g. vaccins) qu'au domaine de l'immunothérapie active. Le terme composition immunogène recouvre donc les compositions à visée prophylactique, en particulier vaccins, et les compositions à visée curative dans lesquelles l'immunogène est de type antigène.
Un premier objet particulier de l'invention est donc l'utilisation d'immunogène spécifique d'un agent pathogène ayant une porte d'entrée au niveau de la région muqueuse recto-génito-urinaire, pour la production d'une composition immunogène destinée à être administrée à l'homme par voie parentérale dans la cuisse, de préférence par voie intramusculaire, notamment dans le quadriceps, en particulier dans le muscle droit antérieur (l'administration parentérale dans un muscle de la cuisse se fera de préférence dans le muscle de chaque membre inférieur droit et gauche), de manière à développer une réponse locale en anticorps IgA, voire aussi en anticorps IgG et/ou IgM, et en cellules B sécrétrices d'IgG, IgM et/ou IgA au niveau respectivement d'une part des muqueuses recto-génito-urinaires et de leurs sécrétions, et d'autre part des ganglions qui drainent cette muqueuse, en particulier ganglions iliaques externes et internes et ganglions inguinaux. L'injection parentérale et notamment intramusculaire dans la cuisse s'avère en effet permettre le recrutement des cellules B productrices d'anticorps IgG, IgM et/ou IgA dans les ganglions drainant la région muqueuse recto-génito-urinaire.
On rapporte ainsi la production d'anticorps IgA et IgG d'origine plasmatique ou sécrétoire, et le recrutement local des cellules B sécrétrices d'IgA et IgG comme on l'a constaté dans les essais rapportés aux points III et V des exemples.
Parmi les agents pathogènes auxquels l'invention peut s'appliquer, on citera tout particulièrement : le virus HIV, les virus Herpès, e.g. Herpès simplex, notamment de type 2, les Candida, les Chlamydia, le Papillomavirus humain, les Mycoplasmes génitaux, Treponema pallidum, les Papovavirus, e.g. Condyloma accuminatum et les infections à gonocoques.
Il convient de noter que ce mode d'administration ne se limite pas à induire une réponse locale, et peut permettre également d'induire en même temps une réponse systémique, les deux actions se combinant, et se complétant, voire se renforçant, de manière particulièrement avantageuse. En conséquence, l'utilisation conforme à l'invention vise aussi à développer en plus d'une réponse locale selon l'invention une réponse systémique de type IgG et/ou IgM, et éventuellement IgA (anticorps et cellules B sécrétrices).
Sans qu'il soit besoin de le préciser à chaque fois, il va de soi que lorsqu'on parle d'une réponse en IgG, IgM ou IgA, anticorps et cellules B sécrétrices, il s'agit d'une réponse spécifique à l'immunogène utilisé. Pour d'autres immunogènes, la réponse pourra être en plus ou à la place une réponse immunitaire cellulaire locale
(lymphocytes T cytotoxiques, réponse TH1 et TH2, éventuellement suppresseur). Un autre objet de l'invention est la méthode d'immunisation contre des agents pathogènes tels que décrits plus haut, consistant à administrer par tout moyen connu en soi, la composition immunogène appropriée par voie parentérale, notamment intramusculaire, dans la cuisse, de l'un ou des deux membres inférieurs, de préférence quadriceps, en particulier muscle droit antérieur. Sans qu'il soit besoin de le rappeler à chaque fois, la méthode d'immunisation peut reprendre chacune des caractéristiques, seules ou en combinaison, énoncées ici dans le cadre de l'utilisation.
Dans le cadre de l'utilisation et de la méthode d'immunisation, on peut préciser encore que l'invention s'applique à tous les types de composition immunogène et notamment vaccins connus, qu'ils soient de type classique ou de type recombinant. Comme cela est connu en soi, les compositions, e.g. vaccins de type classique regroupent les compositions, e.g. vaccins entiers vivants atténués ou inactivés, les sous-unités (protéines ou peptides). Ils peuvent être adjuvés ou non adjuvés et être présentés sous forme combinés regroupant différentes valences et/ou différentes formes immunogènes d'une même valence. Les compositions, e.g. vaccins recombinants regroupent les vecteurs vivants exprimant un ou plusieurs immunogènes du pathogène considéré ainsi que les vecteurs plasmidiques polynucléotidiques constitués d'un ADN qui peut être par exemple nu ou inclus dans un liposome (voir e.g. WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660) et qui expriment un ou plusieurs immunogènes. Pour ce qui est des vecteurs vivants recombinants, on peut citer en particulier comme vecteurs les poxvirus, tels que le virus de la vaccine et surtout les poxvirus aviaires (canarypox, fowlpox, pigeonpox, etc.), tels que ceux décrits dans Tartaglia et al., Virol. 1992, 188 : 217, ainsi que les adénovirus. S'agissant d'une nouvelle voie d'administration, il est bien évident que l'invention ne peut pas être limitée à un type particulier de composition, e.g. vaccins mais a vocation à s'appliquer à tous les types de compositions immunogènes, e.g. vaccins, et à toutes les compositions, e.g. vaccins, disponibles utilisables par voie parentérale, notamment intramusculaire.
De même, le protocole d'immunisation sera fonction du type de composition ou de la composition utilisée. Il inclura le nombre d'administrations habituellement utilisé pour une composition donnée ce qui, de manière générale, correspondra à plus d'1 administration, notamment de 2 à 4. L'homme du métier est de toute façon parfaitement à même par des essais de routine de déterminer le nombre optimum d'administrations (e.g. primo-vaccination et rappel). Il faut noter toutefois que l'injection dans un site distinct des muqueuses peut permettre à elle seule le ciblage d'une réponse locale, sans nécessité de faire un rappel au niveau des muqueuses.
Cette immunisation ciblée pourra aussi être associée à une immunisation systémique classique par la même composition ou une autre composition contre le même pathogène.
On peut aussi lui associer chez le même hôte un protocole d'immunisation ciblant la muqueuse buccale comportant l'administration d'une composition immunogène contre le même pathogène, identique ou différente, notamment de la même composition, visant à induire une réponse locale en IgG, IgM et/ou IgA et en cellules B sécrétrices d'IgG, IgM et/ou IgA au niveau respectivement de la salive et des ganglions drainant la muqueuse buccale, notamment des ganglions sous- maxillaires (elle peut aussi s'accompagner d'une réaction systémique), de préférence par injection sublinguale dans le plancher de la bouche. L' essai rapporté aux points
III et IV montre qu'une injection sublinguale est un moyen approprié, d'autres voies d'administration au niveau de la cavité orale restant possible. On peut bien entendu utiliser d'autres moyens aptes à activer convenablement les ganglions drainant la muqueuse buccale, notamment les ganglions sous-maxillaires.
Une telle combinaison est particulièrement utile pour prévenir ou traiter une infection par un pathogène ayant à la fois les portes d'entrée buccale et recto-génito- urinaire. On peut citer notamment le virus HIV, Herpèsvirus, etc.
En conséquence, selon un développement avantageux de la présente invention, l'invention concerne aussi l'utilisation d'une composition immunogène destinée à être administrée à un hôte par voie parentérale dans la cuisse, notamment par voie intramusculaire dans la cuisse, de préférence dans le quadriceps, en particulier dans le muscle droit antérieur, et d'autre part l'utilisation d'une autre composition immunogène, identique ou différente de la précédente, destinée à être administrée au même hôte par injection sublinguale dans le plancher de la bouche.
L'utilisation et la méthode d'immunisation conformes à l'invention trouvent une application préférée dans le cadre de la vaccination contre le virus HIV.
Un exemple particulier est l'utilisation d'un vaccin regroupant un vecteur exprimant gp120/gp160 de HIV et de la sous-unité glycoprotéique gp120/gp160 de ce même virus. Un exemple particulier est décrit plus loin.
Dans le cadre de la présente invention, on prévoit ainsi de mettre en œuvre ce vaccin anti-HIV pour son administration par voie intramusculaire dans la cuisse, éventuellement combiné à une administration sublinguale et/ou systémique classique, e.g. par injection intramusculaire dans le deltoïde.
Enfin, l'invention a encore pour objet une composition immunogène comprenant au moins un immunogène spécifique d'un pathogène ayant une porte d'entrée au niveau de la région muqueuse recto-génito-urinaire et un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable, ce véhicule ou excipient, ou cette composition, conduisant, en liaison avec l'immunogène, à une réponse locale en anticorps IgG, IgM et/ou IgA et en cellules B sécrétrices d'IgG, IgM et/ou IgA au niveau de cette région muqueuse, lorsque la composition est administrée par voie parentérale dans la cuisse, notamment par voie intramusculaire. Dans le cadre de cette composition immunogène, les caractéristiques énoncées ici au regard des autres objets de l'invention, peuvent être reprises seules ou en combinaison.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs. Il doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais en englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention.
Exemple I - Ciblage des ganglions
Le ciblage des ganglions impliqués dans les réponses recto-génito-urinaires par la voie intramusculaire dans la cuisse est illustrée par des expériences effectuées chez le macaque cynomolgus : dans ces expériences, une solution de colorant Bleu d'Evans à 2 % en solution saline a été injectée (0,5 à 1 ml) dans le muscle droit antérieur au niveau d'un site situé à distance d'un tiers de l'aine et de deux tiers du genou.
La dissection des animaux euthanasiés 4 heures après injection du colorant, a permis le repérage des ganglions drainant la zone d'inoculation grâce à leur coloration bleue : ganglions inguinaux et iliaques ont ainsi été identifiés. Exemple II - Vaccin
11-1 Vaccin vivant recombinant vCP205, ALVAC-HIV :
vCP205 est un virus canarypox ALVAC dont la construction est décrite à l'exemple 14 de WO-A-95 27507 auquel l'homme du métier pourra se reporter. Il est capable d'exprimer les gènes env, gag et pro du virus HIV-1. Ces gènes sont insérés dans le locus C3 et sont régulés par les promoteurs H6 et I3L du virus de la vaccine.
Un plasmide pHIV32 contenant les cassettes d'expression pour le gène de la glycoprotéine env gp120 MN (plus la partie transmembranaire de gp41 LAI) et les gènes de la souche LAI codant pour gag et pour la protéase pro, a été utilisé comme plasmide donneur dans une procédure de recombinaison in vivo pour produire le vCP205. Ces cassettes ont été insérées dans le locus C3, entre les séquences flanquantes d'ALVAC, dans une configuration 5'-5', et liées aux promoteurs H6 et I3L.
Le vCP205 a été produit sur fibroblastes d'embryons de poulets en milieu DMEM-Ham F12 sans sérum, additionné de lactoglutamate et clarifié par centrifugation. Le titre moyen était de 108,0 DICC5o ml sur cellules QT35. On prépare les solutions vaccinantes par dilution en PBS ("phosphate buffer saline") avec Ca++ et Mg++.
II-2 vaccin de sous-unité gp160MN/LAI-2
La sous-unité produite est une sous-unité gp160 hybride obtenue à partir d'un vecteur pox.
On utilise un vecteur vaccine WTG9150 pour produire la gp160. Ce vecteur code pour une gp160 soluble hybride dans laquelle la partie gp120 est dérivée de la souche HIV-1 MN et la partie gp41 provient de l'isolât LAI. Les séquences d'ADN correspondantes ont été fusionnées à l'aide d'un site de restriction artificiel Smal ne modifiant aucune des deux séquences d'acide aminés de gp120 et gp41. On décrit ci-après brièvement la construction.
La séquence codant pour gp120 MN a été amplifiée à partir de cellules SupT1 infectées par HIV-MN, par technique PCR avec des oligonucléotides introduisant un site de restriction SphI et un site Smal respectivement immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader et en amont des sites de clivage situés entre gp120 et gp41.
La séquence codant pour gp41 a été ainsi produite : la séquence codante complète de env HIV-1 LAI a été placée sous le contrôle du promoteur PH5R du virus de la vaccine. Plusieurs modifications ont été apportées. Un site de restriction SphI a été créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader, sans altérer la séquence en acides aminés. On a aussi créé un site de restriction Smal immédiatement en amont de la séquence codant pour les sites de clivage entre gp120 et gp41 , sans altérer la séquence en acides aminés. Les deux sites de clivage en position 507-516 (numérotation des acides aminés selon Myers et al. dans : Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) ont été mutés (séquence originale : KRR ... REKR mutée en QNH ... QEHN). La séquence codant pour le peptide hydrophobe transmembranaire IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV (acides aminés 689-710 d'après Myers et al. supra) a été délétée. Un codon stop a été introduit à la place du deuxième codon E de la séquence codant pour PEGIEE (acides aminés 735-740 d'après Myers et al.), c'est- à-dire le 29ème acide aminé du domaine intracytoplasmique.
Le plasmide dans lequel la séquence LAI était insérée entre les régions homologues du gène TK du virus de la vaccine, a été coupé par SphI et Smal, puis lié à la séquence gp120 MN. Le WTG9150 a ensuite été construit par recombinaison homologue conventionnelle et propagé pour assurer l'expression de la gp160 selon la méthode habituellement utilisée pour vCP205 sur cellules BHK21. Le gp160 a ensuite été purifiée par chromatographie d'immunoaffinité.
Exemple III - Essai 1
Deux macaques rhésus femelles (P9224 et P9225) déjà immunisées par voie intramusculaire (dans les cuisses gauche ou droite, alternativement) 2 fois avec 1065 DICCso de l'ALVAC-HIV (vCP205) clarifié, puis 3 fois avec 100 μg de gp160 MN/LAI- 2 adjuvée avec de l'OspA ("outer surface protein A" de Borrelia burgdorferi) et de l'hydroxyde d'alumine, ont été inoculées 2 fois à 1 mois d'intervalle, dans le plancher de la bouche (sublinguale), avec un mélange contenant de 106 DICC50 de vCP205 clarifié et 100 μg de gp160 MN/LAI-2. La salive, l'urine, les sécrétions vaginales et rectales ainsi que le sérum ont été analysés par ELISA pour détecter la présence d'IgA et d'IgG anti-gp160 et anti-CPpp (contre le virus canarypox lui-même).
L'un des deux singes (P9225) a reçu une injection supplémentaire du même mélange (vCP205 + gp160 MN/LAI-2) dans le plancher de la bouche ainsi que le haut de la cuisse droite, trois mois après la dernière injection. Les lymphocytes du sang périphérique et de certains ganglions lymphatiques (sous-maxillaires, axillaires, inguinaux et iliaques) ont été analysés en ELISPOT pour la détection de cellules B productrices d'anticorps IgA et IgG spécifiques de gp160 et CPpp.
Il a pu être montré l'apparition d'IgA anti-gp160 et anti-CPpp dans le lavage de bouche du macaque P9224, et d'IgA anti-gp160 dans le lavage vaginal du macaque P9224. Les réponses IgG spécifiques anti-gp160 sont apparues dès la première injection dans la plupart des sécrétions testées et se sont maintenues tout au long de l'étude.
Par ailleurs, les sérums des deux macaques ont montré une augmentation significative des IgA et IgG spécifiques de gp160 et CPpp.
Enfin, il a été mis en évidence par ELISPOT, chez le singe P9225, une induction préférentielle de cellules B sécrétrices d'anticorps lgA+ et lgG+ anti-gp160 et anti-CPpp dans les ganglions lymphatiques ciblés par les immunisations, à savoir les ganglions sous-maxillaires et les ganglions inguinaux et iliaques droits. Ces cellules étaient présentes également dans le sang périphérique, mais à plus faible fréquence.
Pour conclure, ce test a montré la possibilité d'induire une réponse anticorps locale et systémique anti-HIV-1 chez le singe rhésus après immunisation à proximité de ganglions drainant les muqueuses buccales et recto-génito-urinaires.
Exemple IV - Essai 2
Le vaccin est un mélange contenant 106,3 DICC50 de vCP205 et 100 μg de sous-unité gp160. On a aussi utilisé un vecteur ALVAC ne comprenant aucune séquence HIV, comme témoin.
- Groupe 1 : 4 singes (macaques rhésus) ont reçu à 4 reprises, à 1 mois d'intervalle, une injection du mélange vaccinal par voie sublinguale dans le plancher de la bouche ; mélange à volume égal de vCP205 à 106'9 DICC50/ml et de gp160 à 400 μg/ml ; 0,25 ml à droite et 0,25 ml à gauche.
- Groupe 2 : 4 singes (macaques rhésus) ont reçu à 4 reprises, à 1 mois d'intervalle, une injection du mélange vaccinal par voie intramusculaire dans la cuisse (perpendiculaire au, et dans le muscle droit antérieur) ;mélange à volume égal de vCP205 à 106'6 DICC50/ml et de gp160 à 200 μg/ml ; 0,5 ml à droite et 0,5 ml à gauche.
- Groupe 3 (témoins) : 3 singes (macaques rhésus) ont reçu à 4 reprises, à 1 mois d'intervalle, une injection du vecteur ALVAC par voie intramusculaire dans la cuisse ; ALVAC (CPpp) à 106'3 DICC50/ml ; 0,5 ml à droite et 0,5 ml à gauche.
On a mesuré le nombre de lymphocytes B sécréteurs d'lgG+ totales, spécifiques de la gp160 (résultant des deux types de vaccins) et spécifiques du vecteur ALVAC témoin pour 106 cellules mononuclées, par prélèvement et dans chaque groupe de macaques. La moyenne et l'écart-type calculés ont été arrondis à l'unité la plus proche.
Les ganglions droits et gauches de chaque catégorie (sous-maxillaires, axillaires, inguinaux, iliaques internes, iliaques externes) ont été prélevés après sacrifice de l'animal, broyés (les ganglions sous-maxillaires droits et gauches ont été poolés), puis soumis à l'analyse des cellules productrices d'anticorps par la technique ELISPOT (adaptée de Erikson K. et al. , Journal of Immunological methods, 153 : 107-113, 1992).
Une réponse systémique en anticorps IgG a aussi été constatée.
Les résultats de comptage des lymphocytes B sécréteurs d'IgG sont rassemblés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000014_0001
Exemple V - Essai 3
Le vaccin est constitué de deux produits injectés séparément, tout d'abord du vCP20 )55 àà 11006655 DDIICCC50, puis de la sous-unité gp160 MN/LAI à 50 μg adjuvée par un adjuvant classique
2 macaques rhésus femelles (#P952 et #P9315) ont reçu :
- à 2 reprises, aux semaines 0 et 4, une injection de vCP205 par voie intramusculaire dans la cuisse (perpendiculaire au, et dans le muscle droit antérieur), à droite puis à gauche alternativement, à la dose de 1065 DICC50 sous un volume de 1 ml.
- à 5 reprises, aux semaines 8, 12, 25, 99 (pour P952) ou 100 (pour P9315) et 103 (pour P952) ou 104 (pour P9315), une injection de gp160 MN/LAI adjuvée par voie intramusculaire dans la cuisse (perpendiculaire au, et dans le muscle droit antérieur), à droite et à gauche, à la dose de 50 μg (+ 500 μg d'adjuvant) sous un volume de 1 ml (0,5 ml dans chaque cuisse).
On a mesuré le nombre de lymphocytes B sécréteurs d'IgG et d'IgA spécifiques de la gp160 pour 106 cellules mononuclées, dans chaque prélèvement (ganglions et sang) des deux macaques. La moyenne et l'écart-type des numérations effectuées en triplicat pour chaque prélèvement sont représentés. Les ganglions droits et gauches de chaque catégorie (sous-maxillaires, axillaires, inguinaux, iliaques internes, iliaques externes) ont été prélevés après sacrifice de l'animal, broyés, les ganglions droits et gauches de chaque catégoire ont été poolés, puis soumis à l'analyse des cellules productrices d'anticorps par la technique ELISPOT (adaptée de Eriksson K. et al., Journal of Immunological Methods, 153 : 107-113, 1992).
On a également dosé par la technique ELISA les anticorps IgA et IgG anti- gp160 dans le sérum et les sécrétions muqueuses (urine, lavages vaginaux et rectaux) des deux macaques. Les prélèvements ont été effectués avant les deux rappels tardifs (S99), puis après immunisation juste avant le sacrifice de l'animal (S104 ou S105). Les résultats sont exprimés, pour chaque sécrétion, sous forme de ratio de l'activité spécifique IgA ou IgG anti-gp160 mesurée au moment du sacrifice par rapport à celle évaluée avant les deux rappels tardifs (S99). On a considéré qu'une sécrétion était significativement positive en IgA ou IgG spécifiques si ce ratio était supérieur à 3 ( l'activité spécifique d'une sécrétion correspond au titre en IgA ou IgG spécifiques (ici de gp160) divisé par le titre en IgA ou IgG totales).
Par ailleurs, l'origine locale ou plasmatique des IgA ou IgG spécifiques dans une sécrétion a été évaluée selon deux techniques différentes :
1. mesure du coefficient d'excrétion relative des lg(A ou G) par rapport à l'albumine (protéine d'origine essentiellement plasmatique), selon la technique décrite par Bélec L. et al., AIDS Research And Human Retroviruses, 12 : 157-167, 1996.
2. mesure du coefficient de production locale des lg(A ou G), comparant l'activité spécifique mesurée dans la sécrétion à celle dans le sérum prélevé au même temps, selon la technique décrite par Van Cott T. et al., Journal of Immunology, 160 : 2000-2012, 1998.
Résultats sur les cellules sécrétrices d'anticorps:
Figure imgf000016_0001
Résultats sur les immunoqlobulines présentes dans les sécrétions
Figure imgf000017_0001
On a détecté aussi des IgA dans certaines sécrétions urinaires, vaginales et rectales.
Exemple VI
Des préparations vaccinales contre l'Herpès simplex, un Candida, une Chiamydia, un Papillomavirus humain, un Mycoplasme génitale ou Treponema pallidum ont été injectées dans les muscles de la cuisse afin de stimuler et cibler une réponse locale en anticorps IgA au moins au niveau des muqueuses rectales, génitales et/ou urinaires.

Claims

Revendications
1. Utilisation d'immunogène spécifique d'un agent pathogène ayant une porte d'entrée au niveau d'une muqueuse pour la production d'une composition immunogène destinée à être administrée chez l'homme par voie parentérale à la surface d'une partie du corps distincte et éloignée de ladite muqueuse, de manière à directement développer une réponse locale en anticorps IgA, IgG et/ou IgM et en cellules B sécrétrices desdits anticorps au niveau de ladite muqueuse et des ganglions qui la draine.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la muqueuse est constituée des muqueuses rectales, génitales et/ou urinaire, et que l'administration par voie parentérale est effectuée dans la cuisse.
3. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'on développe des IgA secrétoires.
4. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'on développe une réponse en cellules B sécrétrices d'IgG, IgM et/ou IgA au niveau respectivement des muqueuses rectales, génitales et/ou urinaires et des ganglions qui les drainent.
5. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la composition immunogène est destinée à être administrée par voie intramusculaire dans la cuisse.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que la composition immunogène est destinée à être administrée dans le/les quadriceps, notamment le/les muscles droits antérieurs.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition immunogène est destinée à développer aussi une réponse systémique.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition immunogène est dirigée contre un pathogène choisi dans le groupe consistant en : le virus HIV, les virus Herpès notamment Herpès simplex, les Candida, les Chiamydia, le Papillomavirus humain, les Mycoplasmes génitaux, Treponema pallidum, et les infections à gonocoques.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, en combinaison avec l'utilisation d'une autre composition immunogène, identique ou différente de la précédente, destinée à être administrée au niveau de la cavité orale au même sujet de manière à induire en outre une réponse en anticorps IgG et/ou IgA et aussi en cellules B sécrétrices d'IgG et/ou IgA au niveau de la muqueuse buccale et des ganglions qui la drainent.
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