[go: up one dir, main page]

WO2000066725A1 - Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale - Google Patents

Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale Download PDF

Info

Publication number
WO2000066725A1
WO2000066725A1 PCT/FR2000/001191 FR0001191W WO0066725A1 WO 2000066725 A1 WO2000066725 A1 WO 2000066725A1 FR 0001191 W FR0001191 W FR 0001191W WO 0066725 A1 WO0066725 A1 WO 0066725A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inducible
sequence
antisense
ischemia
antisense oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2000/001191
Other languages
English (en)
Inventor
Sophie Parmentier
Andrees Bohme
Michel Plotkine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9905629A external-priority patent/FR2793142A1/fr
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Priority to AU50812/00A priority Critical patent/AU5081200A/en
Publication of WO2000066725A1 publication Critical patent/WO2000066725A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13039—Nitric-oxide synthase (NADPH dependent) (1.14.13.39)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/028—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a herpesvirus

Definitions

  • the present invention relates to the therapeutic field of the central nervous system and more particularly the use of antisense oligonucleotides of an isoform inducible of nitric oxide synthase (NO-synthase, NOS, EC 1.14.13.39) in the prevention and the treatment of cerebral ischemia.
  • the invention also relates to vectors containing a nucleic acid encoding said antisense oligonucleotides and compositions containing them.
  • Cerebral ischemia is characterized by a decrease in cerebral blood flow resulting in a deficit in energy substrates essential for the brain (oxygen and glucose).
  • ischemia depends on its severity (intensity of the drop in blood flow) and its duration.
  • the decrease in blood flow leads to major cellular dysfunctions including the increase in cytosolic calcium, the activation of numerous enzymes which cause a loss of cellular integrity and the release of excitatory amino acids such as glutamate. and aspartate, leading to neuronal death.
  • MCA middle cerebral artery
  • the Applicant has now demonstrated a surprising therapeutic effect for the protection of very specific cells, the nerve cells, in a disorder of the metabolic nervous system such as cerebral ischemia by the administration of antisense oligonucleotides.
  • the present invention therefore relates to the use of antisense of an inducible isoform of NO synthase for the protection of nerve cells oligonucleotides against deleterious effects of overproduction monoxide nitrogen during cerebral ischemia.
  • the invention relates to the use of antisense oligonucleotides of an inducible isoform of NO synthase for the preparation of a medicament intended for the prevention and treatment of cerebral ischemia.
  • NO synthase we classically distinguish two groups of NO synthase.
  • the so-called “constitutive” NO synthases (cNOs) are present in a physiological and calmodulin dependent state. These enzymes produce nitrogen monoxide (NO) for short periods (Bredt and Snyder, 1990; Fôrsterman et ai, 1991). This NO intervenes as mediator in many physiological processes such as vasodilation and neurotransmission.
  • cNOs nitrogen monoxide
  • This NO intervenes as mediator in many physiological processes such as vasodilation and neurotransmission.
  • a neuronal constitutive isoform of NO-synthase Boredt et al, 1991
  • an endothelial constitutive isoform of NO-synthase Lamas et al, 1992
  • Inducible NO synthases are generally not present in the physiological state but are induced following stimulation by biological messengers such as cytokines such as interferon-gamma or rinterleukin-1, or bacterial products like lipopolysaccharides. These enzymes produce NO in large quantities and over long periods and their activation is calmodulin-independent. The NO produced plays a deleterious role in various pathophysiological processes.
  • An inducible NO synthase has been cloned from mouse macrophages (Xie et al., 1992).
  • NO synthase activity could also be induced in a large number of cell types such as smooth muscle cells, hepatocytes, cardiomyocytes, neutrophils, microglia, astrocytes, chondrocytes (Nathan, 1992) and also neurons (Minc-Golomb et ai, 1992).
  • the NO synthase against the expression of which the oligonucleotides of the invention are used is preferably an inducible NO synthase (iNOs) or also called type 2.
  • iNOs inducible NO synthase
  • the antisense oligonucleotides according to the invention constitute antisense sequences of the messenger RNAs of all or part of the enzyme NO synthase.
  • the antisense oligonucleotides of the invention are preferably directed against all or part of an inducible NO synthase.
  • the sequence of the antisense oligonucleotides according to the invention corresponds to the sequence SEQ ID No. 1 or one of the derived sequences.
  • the sequence of the antisense oligonucleotides corresponds to the sequence SEQ ID No. 2 or one of the derived sequences.
  • derived sequence means any sequence obtained by modification and coding for a product retaining the property of inhibiting the synthesis of an inducible isoform of NO synthase. This derived sequence also shares 90% and preferably 80% homology with the native sequence.
  • modification is meant any mutation, deletion, substitution addition or modification of a genetic and / or chemical nature. These modifications can be carried out by techniques known to those skilled in the art. These derivatives can in particular be molecules having a great affinity for their binding sites, sequences allowing an improved expression in vivo, molecules having a greater resistance to proteases, molecules having a greater therapeutic efficacy.
  • the molecules in which one or more residues have been substituted comprising, relative to the native sequence, additional residues such as, for example, secretion and / or junction.
  • the sequence of the antisense oligonucleotide as described above comprises between 10 and 30 seas and preferably between 15 and 25 seas.
  • the vector of the invention can be for example a plasmid, a cosmid or any DNA encapsulated by a virus, a phage, an artificial chromosome, a recombinant virus, etc. It is preferably a plasmid or a recombinant virus.
  • viral vectors in accordance with the invention, mention may very particularly be made of vectors of the adenovirus type, retroviruses, adeno-associated viruses, herpes virus or vaccinia virus as well as baculoviruses.
  • the viral vector is defective, that is to say devoid of the sequences necessary for its autonomous replication in the target cells. Obtaining defective viral vectors such as those mentioned above is now well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence includes a promoter region for functional transcription. It may be a promoter region of eukaryotic or viral genes.
  • the vector may include in its genome, in particular upstream of the nucleic acid sequence coding for the oligonucleotide according to the invention, a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence can be a natural signal sequence or an artificial signal sequence.
  • the vector according to the invention can be used both in an ex vivo or in vivo approach.
  • an ex vivo approach can be envisaged by grafting cells genetically modified by a vector described above. These cells can be of various origins: for example nervous (human or non-human).
  • the combination of certain drugs can be considered with a view in particular to improving the maintenance of the transplant or the expression of the transgene (immunosuppressants, anti-complement ). It is also possible to envisage the implantation of genetically modified cells by a vector of the invention after packaging in an inert system.
  • the antisense oligonucleotides or the vector containing them are preferably associated with one or more pharmaceutically acceptable vehicles to be formulated for administration by topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, sub- cutaneous, intraocular, transdermal, stereotaxic, etc.
  • the antisense oligonucleotides or the vector containing them are used in an injectable form.
  • saline solutions monosodium phosphate, disodium phosphate, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts
  • sterile, isotonic, or dry compositions in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of virus used for administration can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the site of administration considered, the number of injections, the gene to be expressed, or also the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 10 -4 pfu, e t preferably 10 "to 10 ⁇ pfu.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells. Techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • Another object of the invention resides in a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one viral or plasmid vector comprising in its genome a nucleic acid coding for the antisense oligonucleotide defined above.
  • composition characterized in that it comprises at least one antisense oligonucleotide of an isoform inducible of NO synthase for protection against cerebral ischemia.
  • Another subject of the invention is a medicament comprising at least one antisense oligonucleotide of an isoform inducible of nitric oxide synthase for the prevention and treatment of cerebral ischemia.
  • Yet another object of the invention relates to the use of a vector described above for the manufacture of a medicament intended for the prevention and treatment of cerebral ischemia.
  • the invention also consists of a medicament comprising at least one vector as described above and preferably comprising at least one viral or plasmid vector.
  • Figure 1 Realization of the transient focal ischemia model. Installation of the temporary occlusion device of the common carotid artery (A) and maneuver thereof (B).
  • Figure 2 Realization of the transient focal ischemia model. Installation of the temporary occlusion device (microclip) of the middle cerebral artery.
  • microclip temporary occlusion device
  • Figure 3 Quantification of histological damage by staining with triphenyl-tetrazolium.
  • the transient focal ischemia model used requires a craniectomy in order to clear the middle cerebral artery (MCA).
  • MCA middle cerebral artery
  • the rats are anesthetized by intraperitoneal injection (i.p.) of chloral hydrate (400 mglkg in a volume of 10 ml / kg).
  • the animal is then placed on the right flank under a binocular magnifier (Zeiss).
  • the scalp is incised along an axis starting from the left ear using an electric scalpel (ME 80®, Martin).
  • ME 80®, Martin an electric scalpel
  • a craniectomy 3 to 4 mm in diameter is then carried out around the oval foramen using a dental bur (Minigyr®, Anthogyr, France).
  • the dura is incised to release the left MCA.
  • the rectal temperature of the animals is monitored using thermal probes (Digi-Sense®, Cole-Palmer, Chicago, USA) and maintained at 37.5 ⁇ 0.5 ° C thanks to to a heating blanket.
  • the transient focal ischemia model used consists of reversibly occluding the left MCA using a microclip. Associated with this occlusion is the clamping of the common ipsilateral carotid artery (ACCi).
  • ACCi common ipsilateral carotid artery
  • the rats anesthetized by intraperitoneal injection of chloral hydrate (400 mg / kg in a volume of 10 ml / kg), are placed in supine position.
  • a longitudinal incision is made in the tracheal region, the ACC is released and isolated from the vagus nerve using a silicone tube (Silastic®, ref. 602-7, Sigma), on which is inserted a lozenge d '' about 5 mm in diameter also made of silicone (Silastic®, ref. 500-135, Sigma) previously drilled with two holes.
  • the free ends of the silicone tube are knotted as shown in Figure 1A.
  • the ACC is thus ready for clamping which will be carried out immediately
  • the animals are again anesthetized with chloral hydrate.
  • the incision is reopened and the microclip and the carotid clamping are removed.
  • the temporal and tracheal incisions are then permanently closed using staples.
  • the animals are placed in enclosures thermostatically controlled at 29 ° C until they wake up and then returned to the animal facility until they are euthanized.
  • the animals, having difficulty chewing, are fed with granules previously softened in water.
  • a polyethylene catheter (Biotrol®, ref. E03403) is introduced from anesthesia of the animals into the artery of the tail.
  • the catheter is connected to a three-way stopcock; one is used for drawing blood for the analysis of pO, pCO 2 and pH by a blood gas analyzer (ABL 330, Radiometer®, Copenhagen); the other is connected to a sensor (EMKA Technologies, Paris), connected to a recorder (SEFRAM, Paris), for the measurement of average BP.
  • This device requires heparinization of animals.
  • a heparin solution (Choay® heparin solution for injection) at 50 IU / ml of physiological solution is prepared. Two hundred microliters of this solution are injected through the tap as soon as the catheter is placed, then each time blood is drawn. The animals are kept in normothermia for the entire duration of the measurements using a heating blanket. Three measurements of the physiological variables are carried out, one immediately before the clamping of the arteries, the second 30 minutes after the clamping of the arteries, finally the third is carried out 30 minutes after the clogging of the arteries. Simultaneously, the rectal temperature of the animals is raised, in order to check their normothermia. At the end of the experiment, the catheter is removed and the tail artery is occluded using a wire.
  • the measurement of the cerebral blood flow is carried out using a laser-Doppler (Laseflow BPM2 (E Vasamedics). Animals anesthetized with a solution of chloral hydrate (400 mg / kg in a volume of 10 ml / kg ) are placed in stereotaxic restraint. The surface of the skull is shaved and an incision is made in order to clear the calvariwn. An orifice is drilled to allow the introduction of the laser-Doppler probe into the chosen region. Cerebral blood flow (DSC) is measured in an area corresponding to the darkness of the infarction The coordinates of the measurement were determined using Atlas Paxinos and Watson (1986):
  • the probe is placed on the surface of the cortex in contact with the dura mater.
  • the probe is held at its measurement site thanks to a polyethylene support glued to the skull bone with a cyanolit® type glue.
  • the animal is then removed from the stereotaxic apparatus and the surgical procedure of ischemia can be started.
  • the weight loss of the animals is evaluated by the difference between the weight before the ischemia and the weight on the day of euthanasia.
  • the neurological examination consists of an evaluation of the presence of different reflexes and behavioral reactions.
  • Neurological disturbances are assessed using the following tests:
  • Score 1: takes support / 0: does not take support.
  • Total 2 for each side.
  • the overall neurological score is therefore for each side equal to 5.
  • Euthanasia of rats is carried out by injection of a massive dose of sodium pentobarbital (120 mg / kg, ip) (Sanofi). Their brains are removed and cut into 7 coronal sections 2 mm thick using a matrix for rat brains. They are taken from anteriority level 13.7 with respect to the inter-aural line and this every 2 mm up to anteriority level 1, 7.
  • TTC triphenyl tetrazolium hydrochloride
  • the sections are examined using an image analysis system (IMSTAR®, Paris, France).
  • IMSTAR® image analysis system
  • the cortical and striatal infarction zones are delimited using a cursor and their area measured by the computer.
  • the areas of necrosis measured are then corrected as a function of this edema (that is to say multiplied by the ratio of the area of the right hemisphere to the area of the left hemisphere).
  • the volume of the infarction can then be calculated according to the values of corrected areas of necrosis and the distance separating each of the cutting levels.
  • the edema is calculated as follows: (area of the left hemisphere - area of the right hemisphere / area of the right hemisphere)
  • An 8 mm long guide made from a 25G gauge needle (Terumo®), is attached to the micromanipulator of a stereotaxic device (David Kopf®, Roucaire establishment).
  • the rats are anesthetized with chloral hydrate (400 mg / kg, i.p.) and then placed in stereotaxic restraint.
  • the surface of the skull is shaved and an incision is made to uncover the skull; the calvarium is clear.
  • An opening is pierced vertically in the left ventricle according to the coordinates determined using Atlas Paxinos and Watson (1986):
  • the guide is then brought using the micromanipulator to the surface of the dura mater so as to induce as little damage as possible.
  • the guide is then fixed to the cranial box with dental cement (AP9,
  • Inducible anti-NOS antisense was synthesized using an automatic synthesizer. Treatments begin 5 days after the guide is put in place.
  • the injection needle consists of a 30G caliber dental needle (Sofijet®), on which a stopper, consisting of a 23G caliber needle section (Terumo®) was previously glued using cyanolit® type glue, 1 1 mm from the end of the bevel of the dental needle. In this way, when the needle is inserted in its guide to the stopper, the middle of its bevel is 3.5 mm from the surface of the skull, which according to the Atlas of Paxinos and Watson (1986 ) corresponds to the center of the ventricle.
  • the oligonucleotides are administered in solution in artificial cerebrospinal fluid (Dulbecco, Sigma, ref. D8662) at a concentration of 1 nmole / ⁇ l.
  • artificial cerebrospinal fluid Dulbecco, Sigma, ref. D8662
  • Three nanomoles of the different sequences (SEQ ID No. 1 and No. 2) are injected in a volume of 3 ⁇ l in 2 minutes using an infusion pump (flow rate of 1.5 ⁇ l / min), 12 hours before ischemia, just before ischemia, then every 12 hours until the animals are euthanized, 3 days after ischemia.
  • the animals serving as controls for the solvent receive, according to the same protocol, an injection of artificial cerebrospinal fluid.
  • antisense (AS) or antisense oligonucleotide sequence, its control sequence or the solvent are administered according to the protocol described above.
  • coronal sections 2 mm thick using a matrix The fourth section is isolated and dissected on ice.
  • a sample containing both cortical infarction (except the clip area) and striatal infarction is taken and frozen at -40 ° C for the assay of NOS activities and nitrotyrosine production.
  • These assays are also carried out in control-operated, but untreated animals, and in non-operated control rats.
  • the other 6 sections are immersed in a 2% TTC solution for the measurement of infarct surfaces.
  • the total volume of the infarction can be determined, since the area of the infarction corresponding to the fourth section, is identical to that measured on the back of the third section.
  • the purpose of this example is to demonstrate a histological and functional improvement with respect to the control sequence, by the action of the oligonucleotide of the invention, measured through parameters indicative of functional and histological damage.
  • the treatments are injected intracerebroventricularly as described in example A (dose of 3 nmoles (1 nmole / ⁇ l) 12 hours before ischemia, just before ischemia, then every 12 hours until euthanasia of the animals, 3 days after ischemia).
  • the control animals which received the solvent have cortical and striatal infarction volumes of 1 12 ⁇ 7 and 42 ⁇ 2 mm 3 respectively . These volumes are not significantly modified by the control sequence.
  • the rats treated with the sequence AS have volumes of cortical infarction reduced by 25 to 50% compared to those of the animals treated with the solvent, and those of the rats treated with the control sequence.
  • the volumes of striatal infarctions are not significantly affected by the AS sequence. nor by its control sequence. The reduction of the infarction is exerted on the levels of the sections ranging between 1 1, 7 and 9,7 mm compared to the interaural line. which corresponds to the anterior part of the infarction.
  • Control-operated animals have a neurological score of 5 for the left and right sides. Ischemia induces a marked neurological deficit on the right side. Treatment with the control sequence does not modify this neurological deficit. On the other hand, treatment with the AS sequence significantly reduces the deficit on the right side compared to that of the animals treated with the solvent, and compared to that of the rats treated with the control sequence.
  • Control-operated animals lose an average of 7 grams during the two days after the intervention, then they regain their initial weight. After ischemia, the animals lose an average of 36 ⁇ 3 g the first day after the intervention, 52 ⁇ 2 g at 2 days and 66 ⁇ 3 g at 3 days. Control sequence processing does not affect this gradual drop in weight.
  • the rats treated with the AS sequence exhibit, 2 days after ischemia, a reduced weight loss of between 10 and 30% compared to those induced in the animals treated with the solvent or in the rats treated with the sequence control. Three days after ischemia, weight loss is no longer changed by treatment with the AS sequence.
  • this example demonstrates that the animals treated with the antisense oligonucleotides present, 3 days after ischemia, a reduction of between 25 and 50% in the volumes of cortical infarction and a marked improvement in sensorimotor performance.
  • This example also made it possible to demonstrate that treatment with the control sequence of the antisense has no effect, either on the size of the lesions or on the functional disorders. This absence of effect of the control sequence clearly demonstrates that the effect of the antisense oligonucleotide is not linked to a non-specific activity, but results from the inhibition of the synthesis of an inducible NO synthase.
  • the purpose of this example is to demonstrate that the administration of antisense oligonucleotides according to the invention allows a reduction in the calcium-independent NOS activity induced by ischemia.
  • the calcium-dependent and calcium-independent NOS activities of the animals treated, either by the AS sequence, or by its control sequence, or by the solvent were evaluated as well as in control-operated rats and in non-operated control rats.
  • Ischemia induces a decrease in calcium-dependent NOS activity compared to control-operated and non-operated control animals. Treatments with the AS sequence and its control sequence have no effect on this activity. 2) Calcium-independent NO-synthase activity
  • Ischemia induces an increase in calcium-independent NOS activity by a factor of 6 to 10 compared to control-operated and non-operated control animals.
  • Treatment with the control sequence does not significantly modify this activity.
  • treatment with the AS sequence results in a reduction of 25 to 50% in the calcium-independent NOS activity induced by ischemia.
  • results of this example demonstrate that the administration of antisense oligonucleotides according to the invention advantageously makes it possible to reduce the calcium-independent NOS activity induced by ischemia in nerve cells.
  • nitrotyrosine production of the animals treated was thus evaluated in control-operated rats and in non-operating control rats.
  • nitrotyrosine is increased by a factor of 2 compared to that of control-operated and non-operated control animals.
  • the control sequence does not modify this production.
  • treatment with the AS sequence reduces by about a third the increase in the quantities of nitrotyrosine induced by ischemia.
  • This example demonstrates the effect of the antisense of the invention on the production of peroxynitrites, the main toxic metabolites of NO. This production was evaluated by the nitrotyrosine assay. The results show that the treatment with antisense reduces by about 1/3 the increase in the production of nitrotyrosine induced by ischemia, while the control sequence has no significant effect on this production.
  • the control animals have physiological values of mean arterial pressure, pO 2 , pCO 2 , pH and rectal temperature which are not modified either by ischemia or by reperfusion. Treatments with the AS sequence and its control sequence have no effect on these physiological variables.
  • Calmodulin-dependent endothelium-derived relaxing factor / nitric oxide synthase activity is present in the particulate and cytosolic fraction of bovine aorthic endothelial cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88: 1788-1792.
  • nitric oxide synthase structurally resembles cytochrom P-450 reductase, Nature, 1991, 351: 714-718 Lamas, S., Marsden, PA, Li, GK, Tempst, P. and Michel, T., Endothelial nitric-oxide synthase: molecular cloning and characterization of a distinct constitutive enzyme isoform, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 6348-6352.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote dans la prevention et le traitement de l'ischémie cérébrale. Vecteurs contenant un acide nucléique codant pour les séquences desdits oligonucléotides antisens et compositions les contenant.

Description

UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS DE NO-SYNTHASE
INDUCTIBLE DANS LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DE
L'ISCHEMIE CEREBRALE.
La présente invention concerne le domaine thérapeutique du système nerveux central et plus particulièrement l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote (NO-synthase, NOS, EC 1.14.13.39) dans la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale. L'invention se rapporte également à des vecteurs contenant un acide nucléique codant pour lesdits oligonucléotides antisens et compositions les contenant.
L'ischémie cérébrale se caractérise par une baisse du débit sanguin cérébral ayant pour conséquence un déficit en substrats énergétiques indispensables pour le cerveau (oxygène et glucose).
Les conséquences de l'ischémie dépendent de sa sévérité (intensité de la chute du débit sanguin) et de sa durée. La diminution du débit sanguin entraine d'important dysfonctionnements cellulaires dont l'augmentation du calcium cytosolique, l'activation de nombreuses enzymes à l'origine d'une perte de l'intégrité cellulaire et la libération d'acides aminées excitateurs tels que le glutamate et l'aspartate, conduisant à la mort neuronale.
A l'heure actuelle, les atteintes ischémiques cérébrales constituent toujours l'une des principales causes de mortalité et de morbidité, en raison de l'absence de thérapeutiques efficaces. Les modèles expérimentaux d'ischémie par occlusion de l'artère cérébrale moyenne (ACM) mis au point chez différentes espèces animales ont permis de révéler l'effet neuroprotecteur des stratégies consistant, soit à bloquer les différents types de récepteurs glutamatergiques, soit à inhiber la libération de glutamate.
Cependant, il a été décrit par Margaill et al. (1996) que les stratégies "anti-glutamate", efficaces dans les modèles d'ischémie focale permanente, ne présentent qu'une fenêtre d'opportunité thérapeutique étroite dans certains modèles d'ischémie focale transitoire. Ceci pouvant être à l'origine des difficultés actuelles à mettre en évidence une activité de ces traitements "antiglutamate" au cours d'essais cliniques. Par ailleurs, Margaill et al. (1997) ont démontré qu'une stratégie visant à inhiber la production de monoxyde d'azote (NO) conserv e une activité protectrice même lorsque le traitement est instauré 9 heures après l'ischémie. Cette fenêtre d'opportunité thérapeutique, considérablement supérieure à celle observée à la suite de l'administration d'agents agissant sur le glutamate, a incité à poursuivre l'exploration des mécanismes tardifs survenant à la suite d'une ischémie. En effet, on peut faire l'hypothèse qu'une stratégie thérapeutique visant à s'opposer à un phénomène délétère tardif pourrait avoir un intérêt clinique supérieur à celui des stratégies "anti-glutamate".
Le rôle délétère de la NO-synthase et en particulier d'une isoforme inductible de cette enzyme a été établi dans des modèles d'ischémie focale permanente et transitoire grâce à l'utilisation d'animaux transgéniques chez lesquels un gène codant pour une NOS inductible à été invalidé (Iadecola et al., 1997) ou de substrances pharmacologiques inhibitrices de NOS inductible (Parmentier et al, 1999).
L'effet d'oligonucléotides antisens de NOS inductible a déjà été étudié dans le cas de l'ischémie rénale (Noiri et ai, 1996). Les résultats de ces études démontrent une atténuation des dysfonctionnements des reins chez des rats sujets à des ischémie expérimentales de ces organes et une amélioration de la viabilité des cellules épithéliales rénales (Peresleni et ai, 1996).
L'effet d'oligonucléotides antisens de NOS inductible a été également étudié dans le cas d'une affection du système nerveux à caractère immunitaire telle que la sclérose en plaque (Ding et al., 1998). Les résultats de cette étude démontrent l'inhibition de l'induction d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale chez la souris.
Bien que des études aient été menées avec des antisens, il n'en demeure pas moins qu'aucune étude n'a utilisé cette stratégie pour bloquer spécifiquement la synthèse de NO-synthase inductible et démontrer le rôle bénéfique de cette inhibition dans l'ischémie cérébrale.
La demanderesse a maintenant démontré un effet thérapeutique surprenant de protection de cellules bien particulières, les cellules nerveuses, dans une affection du système nerveux à caractère métabolique comme l'ischémie cérébrale par l'administration d'oligonucléotides antisens . La présente invention se rapporte donc à l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la NO-synthase pour la protection des cellules nerveuses envers les effets délétères de la surproduction de monoxyde d'azote lors d'une ischémie cérébrale. En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de NO-synthase pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et la traitement de ischémie cérébrale .
On distingue classiquement deux groupes de NO synthase. Les NO synthases dites "constitutives" (cNOs) sont présentes à l'état physiologique et calmoduline dépendantes. Ces enzymes produisent le monoxyde d'azote (NO) pendant de courtes périodes (Bredt et Snyder, 1990 ; Fôrsterman et ai, 1991 ). Ce NO intervient comme médiateur dans de nombreux processus physiologiques tels que la vasodilation et la neurotransmission. Par des techniques de purification puis de clonage, il a ainsi été identifié une isoforme constitutive neuronale de NO-synthase (Bredt et ai, 1991) et une isoforme constitutive endothéliale de NO-synthase (Lamas et ai, 1992). Les NO synthases inductibles (iNOs) ne sont généralement pas présentes à l'état physiologique mais sont induites à la suite d'une stimulation par des messagers biologiques telles que des cytokines comme l'interféron-gamma ou rinterleukine-1, ou des produits bactériens comme des lipopolysaccharides. Ces enzymes produisent le NO en grande quantité et sur de longues périodes et leur activation est calmoduline-indépendante. Le NO produit joue un rôle délétère dans divers processus physiopathologiques. Une NO-synthase inductible à été clonée à partir de macrophages de souris (Xie et al., 1992). Il a ensuite été démontré qu'une activité NO-synthase pouvait aussi être induite dans un grand nombre de type cellulaires tels que les cellules musculaires lisses, les hépatocytes, les cardiomyocytes, les neutrophiles, la microglie, les astrocytes, les chondrocytes (Nathan, 1992) et également les neurones (Minc-Golomb et ai, 1992).
Ainsi, dans le cadre de l'invention, la NO-synthase à encontre de l'expression de laquelle les oligonucléotides de l'invention sont utilisés est de manière préférée une NO synthase inductible (iNOs) ou également appelée de type 2. Les oligonucléotides antisens selon l'invention constituent des séquences antisens des ARN messagers de tout ou partie de l'enzyme NO synthase. Comme cela a été décrit précédemment, les oligonucléotides antisens de l'invention sont de manière préférée dirigés contre tout ou partie d'une NO-synthase inductible.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la séquence des oligonucléotides antisens selon l'invention correspond à la séquence SEQ ID N° 1 ou l'une des séquences dérivées.
Selon une variante de l'invention, la séquence des l'oligonucléotides antisens correspond à la séquence SEQ ID N° 2 ou l'une des séquences dérivées.
Par séquence dérivée, on entend toute séquence obtenue par modification et codant pour un produit conservant la propriété d'inhiber la synthèse d'une isoforme inductible de la NO-synthase. Cette séquence dérivée partage en outre 90 % et préférentiellement 80 % d'homologie avec la séquence native.
Par modification, on entend toute mutation, délétion, substitution addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par des techniques connues de l'homme du métier. Ces dérivés peuvent notamment être des molécules ayant une grande affinité pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une expression améliorée in vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans laquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus suplémentaires tels que par exemple des signaux de sécrétions et/ ou de jonction.
La séquence de l'oligonucléotide antisens telle que décrite précédemment comprend entre 10 et 30 mers et préférentiellement entre 15 et 25 mers.
Un autre objet de l'invention est relatif à un vecteur comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour l'oligonucléotide antisens selon l'invention. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN encapsulé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant....Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention, on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adenovirus, les rétrovirus, les virus adéno- associés, le virus de l'herpès ou le virus de la vaccine ainsi que les baculovirus.
Selon un mode préféré de l'invention le vecteur viral est défectif c'est-a-dire dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication autonome dans les cellules cibles. L'obtention de vecteurs viraux défectifs tels que ceux mentionés précédemment est maintenant bien connue de l'homme du métier.
Généralement, la séquence d'acide nucléique comprend un région promotrice de la transcription fonctionelle. Il peut s'agir d'une région promotrice de gènes eucaryotes ou viraux.
Par ailleurs, le vecteur peut comporter dans son génome, en particulier en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oligonucléotide selon l'invention, une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être une séquence signal naturelle ou une séquence signal artificielle.
Le vecteur selon l'invention peut être utilisé aussi bien dans une approche ex vivo ou in vivo. Dans le cadre d'une thérapie génique applicable à l'homme, on peut envisager une approche ex vivo par greffe de cellules modifiées génétiquement par un vecteur décrit ci-dessus. Ces cellules peuvent être d'origines diverses: par exemple nerveuses (humaines ou non humaines). L'association de certains médicaments peut être envisagée en vue notamment de d'améliorer le maintien de la greffe ou l'expression du transgène (immunosuppresseurs, anti-complément...). On peut aussi envisager l'implantation de cellules génétiquement modifiées par un vecteur de l'invention après encapsidation dans un système inerte. Pour leur utilisation selon la présente invention, les oligonucléotides antisens ou le vecteur les contenant sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, stéréotaxique, etc. De préférence, les oligonucléotides antisens ou le vecteur les contenant sont utilisés sous une forme injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du site d'administration considéré, du nombre d'injections, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10 '4 pfu, et de préférence 10" à 10^ pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
C'est pourquoi un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral ou plasmidique comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour l'oligonucléotide antisens défini précédemment.
Par ailleurs, un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la NO-synthase pour la protection contre l'ischémie cérébrale.
Un autre objet de l'invention est un médicament comprenant au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale. Un autre objet encore de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un vecteur décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
Ainsi, l'invention consiste également en un médicament comprenant au moins un vecteur tel que décrit précédemment et de manière préférée comprenant au moins un vecteur viral ou plasmidique.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Réalisation du modèle d'ischémie focale transitoire. Mise en place du dispositif d'occlusion temporaire de l'artère carotide commune (A) et manoeuvre de celui-ci (B).
Figure 2 : Réalisation du modèle d'ischémie focale transitoire. Mise en place du dispositif d'occlusion temporaire (microclip) de l'artère cérébrale moyenne.
Figure 3 : Quantification des atteintes histologiques par coloration au triphényle- tétrazolium.
Figure 4 : Mise en place du guide pour l'injection intracérébroventriculaire
MATERIEL ET METHODES
Toutes les expériences sont réalisées sur des rats mâles Sprague-Dawley (Iffa Credo, France) d'un poids compris entre 300 et 330 grammes.
1. ISCHÉMIE CÉRÉBRALE FOCALE TRANSITOIRE
Le modèle d'ischémie focale transitoire pratiqué nécessite une craniectomie afin de dégager l'artère cérébrale moyenne (ACM). L'approche subtemporale que nous utilisons est celle initialement décrite par Tamura et al. ( 1981). 1.1. Procédure chirurgicale
1.1.1. Abord chirurgical de l'artère cérébrale moyenne
Les rats sont anesthésiés par injection intrapéritonéale (i.p.) d'hydrate de chloral (400 mglkg sous un volume de 10 ml/kg). L'animal est ensuite placé sur le flanc droit sous une loupe binoculaire (Zeiss). Le scalp est incisé selon un axe partant de l'oreille gauche à l'aide d'un bistouri électrique (ME 80®, Martin). Suivant ce même axe, le muscle temporal est incisé et l'arcade zygomatique retirée. On effectue alors autour du foramen ovale une craniectomie de 3 à 4 mm de diamètre à l'aide d'une fraise dentaire (Minigyr®, Anthogyr, France). La dure-mère est incisée afin de dégager l 'ACM gauche.
Durant toute la durée de l'opération, la température rectale des animaux est contrôlée à l'aide de sondes thermiques (Digi-Sense®, Cole-Palmer, Chicago, USA) et maintenue à 37,5 ± 0,5 °C grâce à une couverture chauffante.
1.1.2. Ischémie focale transitoire
Le modèle d'ischémie focale transitoire utilisé consiste à occlure de façon réversible l 'ACM gauche à l'aide d'un microclip. A cette occlusion, est associé le clampage de l'artère carotide commune ipsilatérale (ACCi). Pour cela, les rats, anesthésiés par injection intrapéritonéale d'hydrate de chloral (400 mg/kg sous un volume de 10 ml/kg), sont placés en décubitus dorsal. Une incision longitudinale est effectuée dans la région trachéenne, l'ACC est dégagée et isolée du nerf vague à l'aide d'un tube de silicone (Silastic®, réf. 602-7, Sigma), sur lequel est enfilé une pastille d'environ 5 mm de diamètre également en silicone (Silastic®, réf. 500- 135, Sigma) préalablement percée de deux trous. Les bouts libres du tube de silicone sont noués comme indiqué dans la figure 1A. L'ACC est ainsi prête pour le clampage qui sera effectué immédiatement après la mise en place du microclip sur l'ACM.
L'approche chirurgicale de l'ACM est celle décrite au paragraphe 1.1.1.
Celle-ci est ensuite occluse au niveau de sa partie proximale, en amont de l'artère lenticulo-striée, par un microclip (zen type temporary clip, 15 mm x 0,4 Ohwa Tsusho Co., Ltd Tokyo, Japon) enfoncé perpendiculairement à la surface du cerveau, à l'aide d'une pince spéciale (zen type clip applier, 15 cm, Ohwa Tsusho Co., Ltd Tokyo, Japon) (Figure 2). L'incision des plans cutanés superficiels est ensuite refermée par une agrafe chirurgicale.
On effectue enfin le clampage de l'ACC en enfilant sur le tube de silicone un embout bleu de pipette Gilson® (Polylabo) préalablement coupé à ses deux extrémités et fendu dans sa partie supérieure; en tirant sur le fil et en le coinçant dans cette fente, on interrompt la circulation carotidienne (Figure 1B).
Au terme de la durée d'occlusion souhaitée, les animaux sont à nouveau anesthésiés par l'hydrate de chloral. L'incision est ré-ouverte et le microclip ainsi que le clampage carotidien sont retirés. Les incisions temporale et trachéenne sont alors définitivement refermées à l'aide d'agrafes. Les animaux sont placés dans des enceintes thermostatées à 29°C jusqu'à leur réveil puis remis à l'animalerie jusqu'à leur euthanasie. Les animaux, ayant de la difficulté pour mâcher, sont nourris avec des granulés préalablement ramollis dans de l'eau.
1.2. Mesure des variables physiologiques
Pour la mesure de la pression artérielle moyenne (PA moyenne), la pression partielle en O2 (pO2), la pression partielle en CO2 (pCO2) et le pH, un cathéter en polyéthylène (Biotrol®, réf. E03403) est introduit dès l'anesthésie des animaux dans l'artère de la queue. Le cathéter est relié à un robinet à trois voies; l'une sert au prélèvement de sang pour l'analyse de la pO , de la pCO2 et du pH par un analyseur des gaz du sang (ABL 330, Radiometer®, Copenhagen); l'autre est branchée sur un capteur (EMKA Technologies, Paris), relié à un enregistreur (SEFRAM, Paris), pour la mesure de la PA moyenne.
Ce dispositif nécessite l'héparinisation des animaux. Une solution d'héparine (solution injectable d'héparine Choay®) à 50 Ul/ml de soluté physiologique est préparée. Deux cent microlitres de cette solution sont injectés par le robinet dès la pose du cathéter, puis à chaque prélèvement de sang. Les animaux sont maintenus en normothermie pendant toute la durée des mesures à l'aide d'une couverture chauffante. Trois mesures des variables physiologiques sont effectuées, l'une immédiatement avant le clampage des artères, la seconde 30 minutes après le clampage des artères, enfin la troisième est réalisée 30 minutes après le déclampage des artères. Simultanément, la température rectale des animaux est relevée, afin de vérifier leur normothermie. A la fin de l'expérience, le cathéter est retiré et l'artère de la queue occluse à l'aide d'un fil.
Il faut noter que les animaux sont maintenus anesthésiés durant la mesure des variables physiologiques.
1.3. Mesure du débit sanguin cérébral
La mesure du débit sanguin cérébral est réalisée à l'aide d'un laser-Doppler (Laseflow BPM2(E Vasamedics). Les animaux anesthésiés par une solution d'hydrate de chloral (400 mg/kg sous un volume de 10 ml/kg) sont placés en contention stéréotaxique. La surface du crâne est rasée et une incision est effectuée de manière à dégager le calvariwn. Un orifice est percé pour permettre l'introduction de la sonde à laser-Doppler dans la région choisie. Le débit sanguin cérébral (DSC) est mesuré dans une zone correspondant à la pénombre de l'infarctus. Les coordonnées de la mesure ont été déterminées à l'aide de l'Atlas Paxinos et Watson (1986):
- Antéro-postériorité: 4,2 mm par rapport à la ligne inter-aurale.
- Latéralité: -3 mm par rapport au bregma.
La sonde est placée à la surface du cortex en contact de la dure-mère. La sonde est maintenue au niveau de son site de mesure grâce à un support en polyéthylène collé à l'os du crâne avec une colle de type cyanolit®. L'animal est alors retiré de l'appareil stéréotaxique et on peut commencer la procédure chirurgicale d'ischémie. 1.4. Quantification des atteintes fonctionnelles
1.4.1. Perte de poids
La perte de poids des animaux est évaluée par la différence entre le poids avant la réalisation de l'ischémie et le poids le jour de l'euthanasie.
1.4.2. Déficit neurologique
L'examen neurologique consiste en une évaluation de la présence de différents réflexes et de réactions comportementales.
Les perturbations neurologiques sont évaluées à l'aide des tests suivants:
- Le réflexe d'agrippement au niveau de chacune des pattes antérieures. Score = 1 : capable de s'agripper / 0: ne s'agrippe pas.
Total = 1 pour chaque côté.
- Les réactions de placement visuel au niveau de chacune des pattes antérieures. Score = 1 : capable de se placer / 0: ne se place pas.
Total = 1 pour chaque côté.
- Les réactions de perte d'appui au niveau de chacune des pattes antérieures et postérieures.
Score = 1 : prend son appui / 0: ne prend pas son appui. Total = 2 pour chaque côté.
- Le réflexe de redressement avec le test de rotation. Score = 1 : rotation dans le sens opposé / 0: pas de rotation. Total = 1 pour chaque côté.
Le score neurologique global est donc pour chaque côté égal à 5.
1.5. Quantification des atteintes histologiques
L'euthanasie des rats est réalisée par l'injection d'une dose massive de pentobarbital sodique (120 mg/kg, i.p.) (Sanofi). Leurs cerveaux sont prélevés et coupés en 7 sections coronales de 2 mm d'épaisseurs à l'aide d'une matrice pour cerveaux de rats. Elles sont prélevées àpartir du niveau d'antériorité 13,7 par rapport à la ligne inter-aurale et ceci tous les 2 mm jusqu'au niveau d'antériorité 1 ,7.
1) Coloration
Les coupes fraîchement prélevées sont immergées dans une solution à 2% de chlorhydrate de triphényl-tétrazolium (TTC) (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante. Cette solution entraîne la coloration des zones saines en rose alors que les zones nécrosées ne se colorent pas. Les coupes sont ensuite fixées dans une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA, Sigma) dans un tampon phosphate sodique à 50 mM (pH 7) et placées à l'obscurité. Les surfaces d'infarctus peuvent alors être mesurées 24 heures après la coloration (Figure 3).
2) Quantification des atteintes histologiques
Les coupes sont examinées à l'aide d'un système d'analyse d'image (IMSTAR®, Paris, France). Les zones d'infarctus corticales et striatales sont délimitées à l'aide d'un curseur et leur surface mesurée par l'ordinateur. Nous déterminons également la surface de l'hémisphère droit et de l'hémisphère gauche afin d'évaluer l'oedème cérébral pour chacune des coupes frontales digitalisées. Les surfaces de nécrose mesurées sont alors corrigées en fonction de cet oedème (c'est-à-dire multipliées par le rapport de la surface de l'hémisphère droit sur la surface de l'hémisphère gauche). Le volume de l'infarctus pourra alors être calculé en fonction des valeurs de surfaces de nécrose corrigées et de la distance séparant chacun des niveaux de coupe.
L'oedème est calculé de la façon suivante: (surface de l'hémisphère gauche - surface de l'hémisphère droit / surface de l'hémisphère droit)
2. INJECTION INTRACEREBROVENTRICULAIRE CHEZ LE RAT
La voie d'administration choisie pour l'étude de l'effet des oligonucléotidiques antisens anti-NOS inductible a nécessité la mise en place d'un guide, 5 jours avant le premier traitement (Figure 4). 2.1. Mise en place du guide
Un guide d'une longueur de 8 mm, réalisé à partir d'une aiguille de calibre 25G (Terumo®), est fixé sur le micromanipulateur d'un appareil stéréotaxique (David Kopf®, établissement Roucaire).
Les rats sont anesthésiés par l'hydrate de chloral (400 mg/kg, i.p.) puis placés en contention stéréotaxique. La surface du crâne est rasée et une incision est effectuée de manière à découvrir la boîte crânienne; le calvarium est dégagé. Un orifice est percé à la verticale du ventricule gauche selon les coordonnées déterminées à l'aide de l'Atlas Paxinos et Watson ( 1986):
- Antéro-postériorité: 0,8 mm par rapport au bregma -Latéralité: 1,5 mm par rapport au bregma.
Le guide est ensuite amené à l'aide du micromanipulateur à la surface de la dure-mère de manière à induire le moins possible de lésion.
On fixe ensuite le guide à la boite crânienne par du ciment dentaire (AP9,
AtlanticCodental) et deux vis d'ancrage. On peut alors détacher le guide du micromanipulateur. L'animal est retiré de l'appareil stéréotaxique et remis dans des conditions normales de stabulation à l'animalerie.
2.2. Protocole d'injection des oligonucléotides antisens anti-NOS inductible
Les antisens anti-NOS inductible ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur automatique. Les traitements débutent 5 jours après la mise en place du guide. L'aiguille d'injection est constituée d'une aiguille dentaire de calibre 30G (Sofijet®), sur laquelle un butoir, constitué d'un tronçon d'aiguille de calibre 23G (Terumo®) a été préalablement collé à l'aide de colle de type cyanolit®, à 1 1 mm de l'extrémité du biseau de l'aiguille dentaire. De cette manière, lorsque l'aiguille est enfoncée dans son guide jusqu'au butoir, le milieu de son biseau se trouve à 3,5 mm de la surface du crâne, ce qui d'après l'Atlas de Paxinos et Watson ( 1986) correspond au centre du ventricule. EXEMPLES
EXEMPLE A : Administration des oligonucléotides antisens de l'invention
Les oligonucléotides sont administrés en solution dans du liquide céphalorachidien artificiel (Dulbecco, Sigma, réf. D8662) à une concentration de 1 nmole/μl. Trois nanomoles des différentes séquences (SEQ ID n° l et n° 2) sont injectés sous un volume de 3 μl en 2 minutes à l'aide d'une pompe à perfusion (débit de 1 ,5 μl/min), 12 heures avant l'ischémie, juste avant l'ischémie, puis toutes les 12 heures jusqu'à l'euthanasie des animaux, 3 jours après l'ischémie. Les animaux servant de témoins pour le solvant reçoivent, selon le même protocole, une injection de liquide céphalorachidien artificiel.
La séquence antisens (AS) ou oligonucléotide antisens, sa séquence contrôle ou le solvant sont administrés selon le protocole décrit précédemment. Trois jours après l'ischémie, les animaux sont euthanasiés et leur cerveau est prélevé et coupé en
7 sections coronales de 2 mm d'épaisseur à l'aide d'une matrice. La quatrième coupe est isolée et disséquée sur de la glace. Au niveau de cette coupe, un échantillon contenant à la fois l'infarctus cortical (excepté la zone du clip) et l'infarctus striatal est prélevé et congelé à -40°C pour le dosage des activités NOS et de la production de nitrotyrosine. Ces dosages sont aussi réalisés chez des animaux témoins-opérés, mais non-traités, et chez des rats témoins non-opérés. Les 6 autres coupes sont immergées dans une solution de TTC à 2% pour la mesure des surfaces d'infarctus. Malgré l'absence de la quatrième coupe, le volume total de l'infarctus peut être déterminé, puisque la surface de l'infarctus correspondant à la quatrième coupe, est identique à celle mesurée au dos de la troisième coupe.
EXEMPLE B : Effet de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur les atteintes histologiques et fonctionnelles
Le but de cet exemple est de démontrer une amélioration histologique et fonctionelle par rapport à la séquence contrôle, par l'action de l'oligonucléotide de l'invention, mesurées au travers des paramètres indicateurs des atteintes fonctionnelles et histologiques. Les traitements sont injectés par voie intracérébroventriculaire comme décrit dans l'exemple A (dose de 3 nmoles ( 1 nmole/μl) 12 heures avant l'ischémie, juste avant l'ischémie, puis toutes les 12 heures jusqu'à l'euthanasie des animaux, 3 jours après l'ischémie).
1 ) Volumes des infarctus
Trois jours après l'ischémie, les animaux témoins ayant reçu le solvant ont des volumes d'infarctus corticaux et striataux respectivement de 1 12 ± 7 et 42 ± 2 mm3. Ces volumes ne sont pas significativement modifiés par la séquence contrôle. Par contre, les rats traités par la séquence AS présentent des volumes d'infarctus corticaux réduits de 25 à 50 % par rapport à ceux des animaux traités par le solvant, et ceux des rats traités par la séquence contrôle. Les volumes des infarctus striataux ne sont pas significativement affectés ni par la séquence AS. ni par sa séquence contrôle. La réduction de l'infarctus s'exerce aux niveaux des sections comprises entre 1 1 ,7 et 9,7 mm par rapport à la ligne inter-aurale. ce qui correspond à la partie antérieure de l'infarctus.
2) Score neurologique
Les animaux témoins-opérés ont un score neurologique égal à 5 pour les côtés gauche et droit. L'ischémie induit un déficit neurologique marqué du côté droit. Le traitement par la séquence contrôle ne modifie pas ce déficit neurologique. En revanche, le traitement par la séquence AS réduit significativement le déficit du côté droit par rapport à celui des animaux traités par le solvant, et par rapport à celui des rats traités par la séquence contrôle.
3) Perte de poids
L'évolution de la perte de poids au cours des jours qui suivent l'ischémie des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant a été mesurée ainsi que chez des animaux témoins-opérés .
Les animaux témoins-opérés perdent en moyenne 7 grammes pendant les deux jours après l'intervention, puis ils retrouvent leur poids initial. Après l'ischémie, les animaux perdent en moyenne 36 ± 3 g le premier jour suivant l'intervention , 52 ± 2 g à 2 jours et 66 ± 3 g à 3 jours. Le traitement par la séquence contrôle n'affecte pas cette chute progressive de poids. Par contre, les rats traités par la séquence AS présentent, 2 jours après l'ischémie, une perte de poids réduite comprise entre 10 et 30% par rapport à celles induites chez les animaux traités par le solvant ou chez les rats traités par la séquence contrôle. Trois jours après l'ischémie, la perte de poids n'est plus modifiée par le traitement par la séquence AS.
Par la mesure des différentes paramètres ci-desus, cet exemple démontre que les animaux traités par les oligonucléotides antisens présentent, 3 jours après l'ischémie, une réduction comprise entre 25 et 50 % des volumes de l'infarctus cortical et une amélioration marquée des performances sensorimotrices. Cet exemple a également permis de mettre en évidence que le traitement par la séquence contrôle de l'antisens n'exerce aucun effet, ni sur la taille des lésions ni sur les atteintes fonctionnelles. Cette absence d'effet de la séquence contrôle démontre bien que l'effet de l'oligonucléotide antisens n'est pas lié à une activité non spécifique, mais résulte de l'inhibition de la synthèse d'une NO-synthase inductible.
EXEMPLE C : Effet de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur le dosage des activités NO-synthases
Le but de cet exemple est de démontrer que l'administration d'oligonucléotides antisens selon l'invention permet une réduction de l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie.
Les activités NOS calcium-dépendante et calcium-indépendante des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant ont été évaluées ainsi que chez des rats témoins-opérés et chez des rats contrôles non-opérés.
1) Activité NO-synthase calcium-dépendante
L'ischémie induit une diminution de l'activité NOS calcium-dépendante par rapport aux animaux témoins-opérés et témoins non-opérés. Les traitements par la séquence AS et sa séquence contrôle sont sans effet sur cette activité. 2) Activité NO-synthase calcium-indépendante
L'ischémie induit une augmentation de l'activité NOS calcium-indépendante d'un facteur 6 à 10 par rapport aux animaux témoins-opérés et témoins non-opérés.
Le traitement par la séquence contrôle ne modifie pas significativement cette activité.
Par contre, le traitement par la séquence AS entraîne une réduction de 25 à 50 % de l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie.
Les résultats de cet exemple démontrent que l'administration d'oligonucléotides antisens selon l'invention permet avantageusement de réduire l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie dans les cellules nerveuses.
Ces résultats montrent en outre, que le traitement par l'antisens réduit entre 25 et 50 % l'activité NOS inductible trois jours après l'ischémie, alors que sa séquence contrôle est dépourvue d'effet significatif sur cette activité enzymatique. En revanche, l'antisens comme son contrôle ne modifie pas l'activité NOS constitutive. Ces données révèlent l'inactivité de la séquence contrôle et l'effet inhibiteur spécifique de l'antisens de l'invention sur la synthèse de la NOS 2. De plus, la réduction de l'activité NOS 2 associée à l'effet neuroprotecteur, observée chez les animaux traités par l'antisens, suggère que l'antisens exerce son effet bénéfique via l'inhibition de la synthèse de la NOS 2.
EXEMPLE D : Effet de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur la production de nitrotyrosine
La production de nitrotyrosine des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant a été évaluée ainsi chez des rats témoins-opérés et chez des rats témoins non-opérés .
Trois jours après l'ischémie, la production de nitrotyrosine est augmentée d'un facteur 2 par rapport à celles des animaux témoins-opérés et témoins non-opérés. La séquence contrôle ne modifie pas cette production. En revanche, le traitement par la séquence AS réduit d'environ un tiers l'augmentation des quantités de nitrotyrosine induite par l'ischémie. Cet exemple démontre l'effet de l'antisens de l'invention sur la production des peroxynitrites, les principaux métabolites toxiques du NO. Cette production a été évaluée par le dosage de la nitrotyrosine. Les résultats montrent que le traitement par l'antisens réduit d'environ 1/3 l'augmentation de la production de nitrotyrosine induite par l'ischémie, alors que la séquence contrôle n'exerce aucun effet significatif sur cette production.
De plus, il faut remarquer que l'importance de la réduction de la formation de peroxynitrites sous l'effet de l'antisens est du même ordre que l'inhibition de l'activité NOS inductible. Cette donnée semble indiquer que les peroxynitrites sont issus du
NO produit par l'activation d'une NOS inductible. Ainsi, l'antisens en inhibant la synthèse d'une NOS inductible réduit la formation des peroxynitrites. Cet effet associé à la neuroprotection suggère en outre que les peroxynitrites sont responsables des effets délétères de l'activation d'une NOS inductible.
EXEMPLE E : Effet de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur les variables physiologiques
Les variables physiologiques des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant ont été mesurées.
Les animaux témoins présentent des valeurs physiologiques de pression artérielle moyenne, pO2, pCO2, pH et température rectale qui ne sont pas modifiées ni par l'ischémie, ni par la reperfusion. Les traitements par la séquence AS et sa séquence contrôle sont sans effet sur ces variables physiologiques.
BIBLIOGRAPHIE
Margail, I., Parmentier, S., Callebert, J., Allix, M., Boulu, R.G. et Plotkine, M., Short therapeutic window for MK-801 in transient focal cérébral ischaemia in normotensive rats, J. Cereb. Blood Flow Metab., 1996, 16: 107- 1 13.
Margail , I., Allix, M., Boulu, R.G. et Plotkine, M., Dose- and time-dependence of L- NAME neuroprotection in transient focal cérébral ischaemia in rats, Br. J. Pharmacol., 1997, 120 : 160-163
Iadecola, C, Zhang, F.Y., Casey, R.. Nagayama, M. et Ross, M.E., Delayed réduction of ischaemic brain injury and neurological déficit in mice lacking the inducible nitric oxide synthase gène, J. Neurosci., 1997, 17 : 9157-9164.
Parmntier, S., Bohme, G. A., Lerouet, D., Damour, D., Stutzmann, J.M., Margail, I. et Plotkine, M., Sélective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents ischaemic brain injury, Br. J. Pharmacol., 1999, 127 : 546-552.
Noiri, E., Peresleni, T., Miller, F., et Goligorsky, M. S., In vivo targeting of inducible NO synthase with oligodeoxynucleotides protects rat kidney against ischaemia, J. Clin. Invest., 1996, 97 : 2377-2383.
Peresleni, T., Noiri, E., Bahou, W. et Goligorsky, M. S., Antisense oligodeosynucleotides to inducible NO synthase rescue epithelial cells from oxidative stress injury, Am. J. Physiol., 1996, 270 : F971-F977.
Ding, M., Zhangh, M., Wong, J.L., Rogers, N.E., Ignarro, L.J. et Voskuhl, R.R., Cutting edge : antisense knockdown of inducible nitric oxide synthase inhibits induction of expérimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J mice, J. Immunol., 1998, 160 : 2560-2564.
Bredt, D.S. et Snyder, S. H., Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 : 682-685.
Fόrstermann, U., Pollock, J.S., Schmidt, H.H.H.W., Heller, M. et Murad, F.,
Calmodulin-dependent endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase activity is présent in the particulate and cytosolic fraction of bovine aorthic endothelial cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88 : 1788- 1792.
Bredt, D.S., Hwang, P.M., Glatt, CE., Lowenstein, C, Reed, R.R. et Snyder, S.H., Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally ressembles cytochrom P-450 reductase, Nature, 1991, 351 : 714-718 Lamas, S., Marsden, P.A., Li, G.K., Tempst, P. et Michel, T., Endothelial nitric-oxide synthase : molecular cloning and characterization of a distinct constitutive enzyme isoform, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89 : 6348-6352.
Xie, Q.W., Cho, H.J., Calacay, J. Mumford, R.A., Swiderek, K.M., Lee, T.D., Ding, A., Troso, T. at Nathan, C ., Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophage, Science, 1992, 256 : 225-228.
Nathan, C, nitric oxide as a secretory product of mammalian cells, Faseb J., 1992, 6 : 3051-3064.
Minc-Gollomb, D., Tsarfaty, I., et Schwartz, J.P., Expression of inducible nitric oxide synthase by neurons following exposure to endotoxin and cytokine, Br. J. Pharmacol., 1994, 1 12 : 720-722.
Tamura, A., Graham , D., McCulloch, I. at Teasdale, G. M., Focal cérébral ischaemia in the rat : 1 description of technique and early neuropathological conséquences following middle cérébral artery occlusion, J. Cereb. Blood Flow Metab., 1981, 1 : 53-60.
Paxinos, G. et Watson, C, The rat brain in stereotaxic coordinates, 1986, Académie press, London.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote (iNOS) pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les oligonucléotides antisens sont antisens pour tout ou partie de la NO-synthase inductible.
3. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence des oligonucléotides correspond à la séquence présentée en SEQ ID N° 1 ou l'une des séquences dérivées.
4. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des oligonucléotides correspond à la séquence présentée en SEQ ID
N° 2 ou l'une des séquences dérivées.
5. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisés en ce que la séquence des oligonucléotides comprend entre 10 et 30 mers.
6. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des oligonucléotides comprend entre 15 et 25 mers.
7. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
8. Vecteur comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour les oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 1.
9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
10. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant.
1 1. Virus tel que décrit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est défectif.
12. Virus selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, un rétrovirus, un virus adéno-associé, un herpès virus, le virus de la vaccine .
13. Utilisation d'un vecteur tel que décrit selon l'une des revendications 8 à 12 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
14. Composition comprenant au moins un vecteur tel que décrit selon les revendications 8 à 12.
15. Médicament comprenant au moins un vecteur tel que décrit selon les revendications 8 à 12.
16. Médicament comprenant au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
PCT/FR2000/001191 1999-05-04 2000-05-03 Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale Ceased WO2000066725A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU50812/00A AU5081200A (en) 1999-05-04 2000-05-03 Use of inducible no-synthase antisense oligonucleotides for preventing and treating cerebral ischemia

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9905629A FR2793142A1 (fr) 1999-05-04 1999-05-04 Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale
FR99/05629 1999-05-04
US13973599P 1999-06-18 1999-06-18
US60/139,735 1999-06-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000066725A1 true WO2000066725A1 (fr) 2000-11-09

Family

ID=26234944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2000/001191 Ceased WO2000066725A1 (fr) 1999-05-04 2000-05-03 Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU5081200A (fr)
WO (1) WO2000066725A1 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1250157A4 (fr) * 2000-01-24 2004-12-29 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation antisens de l'expression de l'oxyde nitrique synthase inductible
US11359197B2 (en) 2018-01-12 2022-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
US12241065B2 (en) 2018-01-12 2025-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994023038A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 The Wellcome Foundation Limited Synthase d'oxyde nitrique inductible et gene s'appliquant a celle-ci
WO1996001902A1 (fr) * 1994-07-12 1996-01-25 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus comportant un gene codant pour une no synthase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994023038A1 (fr) * 1993-03-26 1994-10-13 The Wellcome Foundation Limited Synthase d'oxyde nitrique inductible et gene s'appliquant a celle-ci
WO1996001902A1 (fr) * 1994-07-12 1996-01-25 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus comportant un gene codant pour une no synthase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IADECOLA, C. ET AL.: "Delayed reduction of ischemic brain injury and neurological deficits in mice lacking the inducible nitric oxide synthase gene", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 17, 1 December 1997 (1997-12-01), pages 9157 - 9164, XP000867073 *
NOIRI, E. ET AL.: "In vivo targeting of inducible NO synthase with oligodeoxynucleotides protects rat kidney against ischemia", J. CLIN. INVEST. (1996), 97, 2377-2383, XP002128096 *
PERESLENI T. ET AL.: "Antisense oligodeoxynucleotides to inducible NO synthase rescue epithelial cells from oxidative stress injury.", AM J PHYSIOL 1996 JUN;270(6 PT 2):F971-7, XP000867070 *
ROSS ME. ET AL.: "Nitric oxide synthase expression in cerebral ischemia: neurochemical, immunocytochemical, and molecular approaches.", METHODS ENZYMOL 1996;269:408-26, XP000867069 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1250157A4 (fr) * 2000-01-24 2004-12-29 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation antisens de l'expression de l'oxyde nitrique synthase inductible
US11359197B2 (en) 2018-01-12 2022-06-14 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
US11447775B2 (en) 2018-01-12 2022-09-20 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
US12180478B2 (en) 2018-01-12 2024-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
US12241065B2 (en) 2018-01-12 2025-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU5081200A (en) 2000-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0752004B1 (fr) Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique des cellules gliales (gdnf)
EP0775213B1 (fr) Adenovirus comprenant un gene codant pour la glutathion peroxydase
FR2718150A1 (fr) Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
CA2154355A1 (fr) Virus recombinants et leur utilisation en therapie genique
CA2174232A1 (fr) Therapie genique de la restenose au moyen de vecteur adenoviral
WO2000066725A1 (fr) Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale
EP0707644B1 (fr) Utilisation de compositions pharmaceutiques pour le traitement des maladies neurodegeneratives
WO1996001902A1 (fr) Adenovirus comportant un gene codant pour une no synthase
FR2793142A1 (fr) Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale
FR2717495A1 (fr) Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
EP0722496B1 (fr) Compositions pharmaceutiques et leur utilisation, notamment pour le traitement des maladies neurodegeneratives
EP0752003B1 (fr) Virus recombinants codant pour une activite glutamate decarboxylase (gad)
CA2184200A1 (fr) Virus recombinants, preparation et utlisation en therapie genique
CA2182724A1 (fr) Modele animal de la maladie d'alzheimer, preparation et utilisations
FR2734826A1 (fr) Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations
EP1100946A1 (fr) Vecteurs derives de baculorivus et utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules nerveuses des vertebres
FR2708283A1 (fr) Compositions pharmaceutiques et leur utilisation, notamment pour le traitement des maladies neurodégénératives.
CA2184408A1 (fr) Adenovirus recombinants pour le facteur de maturation des cellules gliales de type beta (gmf-.beta.)
FR2774698A1 (fr) Utilisation d'elements de regulation negative pour l'expression neurospecifique de transgenes
FR2726575A1 (fr) Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP