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WO2000058491A1 - Novel substances kf-1040t4a, kf-1040t4b, kf-1040t5a and kf-1040t5b and process for producing the same - Google Patents

Novel substances kf-1040t4a, kf-1040t4b, kf-1040t5a and kf-1040t5b and process for producing the same Download PDF

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WO2000058491A1
WO2000058491A1 PCT/JP1999/001526 JP9901526W WO0058491A1 WO 2000058491 A1 WO2000058491 A1 WO 2000058491A1 JP 9901526 W JP9901526 W JP 9901526W WO 0058491 A1 WO0058491 A1 WO 0058491A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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substance
present
substances
culture
methanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/001526
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Omura
Hiroshi Tomoda
Rokuro Masuma
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kitasato Institute
Original Assignee
Kitasato Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kitasato Institute filed Critical Kitasato Institute
Priority to US09/937,335 priority Critical patent/US6608185B1/en
Priority to PCT/JP1999/001526 priority patent/WO2000058491A1/ja
Priority to AU28564/99A priority patent/AU2856499A/en
Publication of WO2000058491A1 publication Critical patent/WO2000058491A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to novel KF-104T4A substance, KF-104T4B substance, KF-104T5A substance and KF-104O substance having lipid metabolism inhibitory activity. It relates to T5B substances and methods for producing them.
  • antiobesity drugs and hyperlipidemia drugs are known.
  • a central appetite suppressant for example, mazindol (AJ3 3 01 and 1 1. Rush, Ann. Intern. Med., 81, 5 26-53 3 1978) Decreases lipid biosynthesis by suppressing appetite It can cause health problems instead of reducing appetite. Therefore, a new anti-obesity drug and a drug for treating hyperlipidemia without side effects are desired.
  • sphingomyelin a lipid that is a component of biological membranes
  • cytokines such as interleukin-11 ⁇ and tumor necrosis factor (YA Hannun, Journal 'Ob').
  • Obesity is a condition in which the body's fat reserves, mainly triglycerides, are excessively accumulated, resulting from increased synthesis of triacylglycerol and abnormal accumulation of fat in adipocytes. Triacylglycerolemia is also thought to increase trisylglycerol synthesis in the intestine and liver, causing lipoproteinemia with high triacylglycerol in the blood.
  • a substance that inhibits diacylglycerol-acyltransferase, which controls the selective synthesis of triacylglycerol is expected to suppress the accumulation of triacylglycerol and be effective for such diseases.
  • providing a substance having a diacylglycerol-acyltransferase inhibitory activity is useful for treating various adult diseases such as obesity and hyperlipidemia and arteriosclerosis based on it. is there.
  • the present inventors have conducted various studies on metabolites produced by microorganisms. It has been found that a substance having an activity of inhibiting diasylglycerol-l-acyltransferase and an activity of inhibiting sphingomyelinase are produced in a culture of a KF-1040 strain newly isolated from seaweed. Next, these active substances that inhibit lipid metabolism were separated and purified from the culture, and as a result, substances having the chemical structures represented by the following formulas [I] and [II] were found. Since substances having these chemical structures have not been known at all, these substances are referred to as KF-104 T4 A substance, KF- 104 T4 B substance, KF- 104 T5 A substance and KF—104 T5B substance.
  • the present invention relates to a stereoisomer KF—104T5A substance and a KF—104T5B substance consisting of a compound represented by the formula:
  • the present invention still further relates to the genus Gliocladium, wherein the substance KF—104 T4A and / or the substance KF—104 T4B and / or the substance KF—104 T5A And / or microorganisms capable of producing KF-1040 T5B substances.
  • the substance KF—104 T4A and / or the substance KF—104 T4B and / or the substance KF—104 T5A And / or microorganisms capable of producing KF-1040 T5B substances Incubate in medium and add KF-104 T4A substance and / or KF-
  • the present invention relates to a method for producing a 4A substance, a KF-1040T4B substance, a KF-1040T5A substance, and a KF-1040T5B substance.
  • the present invention also belongs to the genus Gliocladium, and comprises a KF—104 T4A substance and / or a KF—104 T4B substance and / or a KF—104 T5A substance. And / or a microorganism capable of producing a KF—104 T5B substance is Gliocladium sp. KF—104 (Gliocladium sp. KF-1104. FERM BP—62) Production of KF—104T4A substance, KF—104T4B substance, KF—104T5A substance and KF—104T5B substance It is about the law.
  • the present invention furthermore belongs to the genus Griocladium, wherein the KF—104 T4A substance and / or the KF—104T4B substance and / or the KF—104T5A substance and Z Or refers to microorganisms that produce KF-1040 T5B material.
  • KF-140 substance producing bacteria Microorganisms having the ability to produce 5B substances (hereinafter referred to as “KF-140 substance producing bacteria”) belong to the genus Griocladium, and for example, Gliocladium sp. KF-1 isolated by the present inventors.
  • the 440 strain is an example of a strain most effectively used in the present invention.
  • the bacteriological properties of this KF-140 strain are as follows.
  • This strain contains potato and glucose containing 50% seawater (salinity 3.4%). It grows relatively well on agar medium, corn-meal agar medium, wort agar medium, Miura agar medium, seawater starch agar medium, etc., and has good conidia formation.
  • the conidiophores of Vertici 11 ate stand upright from the basal hypha and cut off from the long flask at the tip or branch, and become tapered toward the tip.
  • Conidia are formed independently from the size of 3.0 to 5.0 X 17 to 25 m).
  • the conidium is colorless at penicci 11 ate, and has an elliptic shape with a size of 2.5 to 3.0 X 3.0 to 5.0 m, an oblong shape, and a slightly sharp end at one end.
  • the size is from 2.5 to 3.0 x 6.0 to 8.5 zm from a colorless ellipse to an oblong.
  • Table 1 shows the results of macroscopic observations of this strain cultured on various media at 25 ° C for 14 days. No sclerotium or sclerotium-like structure is formed in these media.
  • the optimal growth conditions for this strain are pH 4-8, temperature 17-25 ° C, and seawater concentration 0-50%.
  • the growth range of this strain is pH 3 to 10, temperature 9 to 32 ° C, * seawater concentration 0 to 200%.
  • G Gliocladium
  • the strain was identified as belonging to the genus 1 i 0 c 1 adi urn) and designated as Gliocladium sp. KF-104. This strain was designated as Gliocladium sp. KF-1040 (G1i0c1 adi urn sp.
  • the preferred KF-140 substance-producing bacterium used in the present invention includes the above-mentioned Gliocladium sp. KF-140 strain, but the microbiological properties of the general bacterium are extremely high. It is easy to mutate, is not constant, and is naturally or normally used for UV irradiation, X-ray irradiation or mutated derivatives, such as N-methyl-N'-two-row N-nitrosogazine, 2-aminopurine, etc.
  • KF-104O4T4A substances belonging to the genus Glyocladium, including artificially modified strains, cell fusion strains, and genetically engineered strains obtained by mutation treatment of All the strains producing —104 T4B substance, KF—104T5A substance and KF—104T5B substance can be used in the present invention.
  • KF—104 T4A substance KF—104 T4B substance, KF—104 T5A substance and KF—1040T5B substance of the present invention
  • a KF-1040 substance producing bacterium belonging to the genus Gliocladium in a medium.
  • a nutrient source suitable for the above KF-1040 substance-producing bacterium a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, inorganic salts, vitamins, etc., is used.
  • a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, inorganic salts, vitamins, etc. is used.
  • sugars such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, dextrin and starch, and vegetable oils such as soybean oil are used alone or in combination.
  • Digestible nitrogen sources include peptone, yeast extract, meat extract, soybean flour, cottonseed flour, corn steep licorice, malt extract, casein, amino acids, urea, ammonium salts, nitrates, etc., alone or in combination Used.
  • salts such as phosphates, magnesium salts, calcium salts, sodium salts, potassium salts, etc., as required, iron salts, manganese salts
  • Heavy metals such as copper, cobalt, and zinc salts, vitamins, and other substances suitable for the production of this substance are added as appropriate.
  • an antifoaming agent such as liquid paraffin, animal oil, vegetable oil, silicon, or a surfactant may be added as necessary.
  • the medium may be liquid or solid as long as it contains the above-mentioned nutrient source.
  • cultivation using a flask is preferred.
  • the composition of the medium used for the preculture and the composition of the medium used for the production culture may be the same, or both may be changed if necessary.
  • the cultivation temperature is such that the KF-104 substance producing bacterium of the present invention is the KF-104 T4A substance, KF-104 T4B substance, KF-104 T5A substance of the present invention.
  • KF-104T5B substance can be appropriately changed within the range of producing the substance, but it is usually preferable to culture at about 20 to 30 ° C., preferably at about 27.
  • the culture pH is usually 5 to 8, preferably around 7.
  • the culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually about 10 to 20 days.
  • KF—104T4A substance, KF—104T4B substance, KF—104T5A substance and KF—104T substance of the present invention thus obtained.
  • 5B substance is present in the culture and the culture filtrate.
  • the desired KF-104T4A substance, KF-104T4B substance, KF-104T5A substance and KF-104T5B substance To collect the whole culture, extract the whole culture with a water-miscible organic solvent such as acetone, evaporate the extract under reduced pressure, and then wash the residue with water-immiscible solvent such as ethyl acetate. This is performed by extraction with a neutral organic solvent.
  • KF-104T4A, KF-104T4B, KF-104T5A and KF-104T5B Each component can be separated and purified.
  • the physicochemical properties of the KF-104T4A substance, the KF-104T4B substance, the KF-1004T5A substance and the KF-104T5B substance of the present invention are described. I will describe the nature of the nature.
  • Infrared absorption spectrum measured by the bromide rim-tablet method is as shown in Fig. 2, and it is 33437, 2962, 2927, 28 75, 1 7 0 7, 1 6 4 ⁇ 1 6 3 0, 1 4 5 8, 1 3 7 5, 1 275, 1 2 2 8, 1 0 74, 1 0 2 characteristic maximum at 6 cm 1 Has absorption.
  • Proton nuclear magnetic resonance spectrum Proton nuclear magnetic resonance spectrum (measured in heavy toluene) measured by a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian Japan. , As shown in Figure 3
  • the KF-1 040 T 4 A substance of the present invention has the following formula [ I] was determined.
  • Infrared absorption spectrum The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide tablet method is as shown in Fig. 6, and is 3437, 2960, 2926, 2873, 2854, 1701. have a characteristic absorption maximum at 1 653, 1 637, 1 458 , 1 375, 1 269, 1 230, 1 070, 1 024 cm 1.
  • Proton nuclear magnetic resonance spectrum Proton nuclear magnetic resonance spectrum measured with a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian Japan (measured in heavy methanol) Is as shown in Fig. 7.
  • the KF-1040 T4B substance of the present invention has the following formula [I ] Has been determined.
  • Infrared absorption spectrum infrared absorption spectrum measured by potassium bromide agent method The vectors are as shown in Fig. 10; 3 4 3 4, 2 9 6 2, 2 927, 2 8 7 3, 1 74 1, 1 7 0 1, 1 6 5 5, 1 6 3 7, 1 has a 4 5 8 1 3 75, 1 27 3, 1 23 2, 1 1 2 8 1 0 7 8, characteristic absorption maximum in a 1 0 3 6 cm 1.
  • Proton nuclear magnetic resonance spectrum Proton nuclear magnetic resonance spectrum measured using a nuclear magnetic resonance spectrometer (manufactured by Varian Japan) ) Is as shown in Fig. 11
  • 13 C nuclear magnetic resonance spectrum 13 C magnetic resonance spectrum (measured in heavy methanol) measured using a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian Japan. As shown in Fig. 12
  • Infrared absorption spectrum The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide tablet method is as shown in Fig. 14, and it is 334, 294, 290, 29 2 6, 2 8 7 3, 2 8 5 4, 1 7 4 3, 1 7 0 7, 1 6 5 5, 1 6 3 7, 1 4 8 8, 1 3 7 5, 1 2 6 9, 1 2 3 has a 8, 1 1 2 4, 1 0 7 8, 1 0 3 4 c ⁇ JP ⁇ a maximum absorption at 1.
  • Proton nuclear magnetic resonance spectrum Proton nuclear magnetic resonance spectrum (measured in heavy methanol) measured by a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian Japan. As shown in Figure 15
  • 13 C nuclear magnetic resonance spectrum 13 C magnetic resonance spectrum (measured in heavy methanol) measured using a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by Varian Japan. As shown in Figure 16
  • the KF—104T4A substance, the KF—104T4B substance, the KF—104T5A substance, and the KF—104T5B substance of the present invention As described above, the KF—104T4A substance, the KF—104T4B substance, the KF—104T5A substance, and the KF—104T5B substance of the present invention.
  • Various physical and chemical properties of substances Although the properties have been described in detail, no compound corresponding to such properties has been reported so far. Therefore, KF-104 T4A substance, KF-104 T4B substance, The KF-104 T5A substance and the KF-104 T5B substance were determined to be new substances.
  • the KF-104T4A substance, the KF-104T4B substance, the KF-104T5A substance and the KF-104T5B substance of the present invention are described. The biological properties are described below.
  • the result of calculating the concentration that inhibits the production of triacylglycerol by 50% is shown by the KF-104T4A substance, the KF-104T4B substance, and the KF-104T5A substance of the present invention.
  • the substance and the KF-104 T5B substance were both 10 / m1.
  • the membrane fraction prepared from rat brain as an enzyme source 20 mM HEP ES- NaOH buffer (pH7. 4), 6. 5mM MgC 1 2, 0. 1% Triton X- 1 0 0, 2 5 [N- methyl-one 3 H] Sufui Ngomieri down the (0. 0 0 6 C i) was added and the total volume of 5 0 1.
  • black hole Hol beam methanol: the (1 2, v / v) mixture 20 0/1 was added in the raw material [3 H] sphingomyelin with the reaction product [ [3 H] phosphocholine is separated.
  • the upper layer was placed in a vial, and the amount of [ 3 H] phosphocholine was quantified using a liquid scintillation counter, and the neutral sphingomyelinase activity was measured.
  • the result of calculating the concentration of the substance of the present invention that inhibits this enzyme by 50% is 39.1 g / m K KF-104 T4 substance of the KF-104 T4A substance of the present invention and 34 1 g / m 1
  • an acidic sphingomyelinase (manufactured by Sigma) derived from human placenta was used as an enzyme source in a 25 OmM sodium acetate buffer (pH 5.0), 0.1% NP-
  • the result of calculating the concentration of the substance of the present invention that inhibits the present enzyme by 50% is as follows: 233 fig / m 1 for the KF-104 T4A substance of the present invention and 233 fig / m 1 for the KF-104 T4 substance. 70 g / ml, KF-104 T 5 A substance, 196 g 1 and KF-104 T
  • the novel substance according to the present invention exhibits an inhibitory activity on diasylglycerol-acyltransferase and an inhibitory activity on sphingomyelinase, and thus is related to arteriosclerosis, obesity, thrombosis, inflammation and immune function Useful for prevention and treatment of diseases.
  • FIG. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040 T4A substance of the present invention.
  • Fig. 2 shows the infrared absorption spectrum of the KF-1040 T4A substance of the present invention (KB r method).
  • FIG. 3 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T4A substance of the present invention.
  • FIG. 4 shows a 13 C nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T4A substance of the present invention.
  • FIG. 5 shows the ultraviolet absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040 T4B substance of the present invention.
  • FIG. 6 shows the infrared absorption spectrum (KBr method) of the KF-1040T4B substance of the present invention.
  • FIG. 7 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T4B substance of the present invention.
  • FIG. 8 shows the 13 C nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T4B substance of the present invention.
  • FIG. 9 shows the ultraviolet absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040 T5A substance of the present invention.
  • FIG. 10 shows the infrared absorption spectrum (KBr method) of the KF-1040T5A substance of the present invention.
  • FIG. 11 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T5A substance of the present invention.
  • FIG. 12 shows the 13 C nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T5A substance of the present invention.
  • FIG. 13 shows the UV absorption spectrum (in methanol) of the KF-1040T5B substance of the present invention.
  • FIG. 14 shows the infrared absorption spectrum (KBr method) of the KF-104T5B substance of the present invention.
  • FIG. 15 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum (in deuterated methanol) of the KF-1040 T5B substance of the present invention.
  • FIG. 16 shows the 13 C nuclear magnetic resonance spectrum of the KF—104 T5B substance of the present invention. (In heavy methanol).
  • Glyocladium sp. KF-104 strain (G1i0c1 adi urn sp.KF-1 04 0.FERM BP-6252) cultured on an agar slant medium gave glucose 2.0. %, Polypeptone (Nippon Pharmaceutical) 0.5%, Yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.2%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%
  • a platinum loop was inoculated into two 500 ml Erlenmeyer flasks in which 100 ml of a liquid medium (pH 6.0) containing 0.1% agar dissolved in 50% natural seawater was dispensed. Shaking culture was performed at 27 ° C for 4 days.
  • crude substance T 4 and crude substance T 5 were subjected to high-performance liquid chromatography (YMC-Pack ODS -AM. 20 x 250 mm, flow rate 6.0 m 1 min, detection, UV 220 nm, Elution solvent (50% aqueous acetonitrile) was used for fractionation.
  • Elution solvent 50% aqueous acetonitrile
  • Substance B has an inhibitory activity on diasylglycerol-syltransferase and an inhibitory activity on sphingomyelinase. Expected to be useful for treatment.

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Description

明 細 書 新規 KF - 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF - 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF- 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質
並びにそれらの製造法 発明の属する技術分野
本発明は、 脂質代謝阻害活性を有する新規 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF - 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF - 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF - 1 0 4 0 T 5 B物 質並びにそれらの製造法に関する。 従来の
従来、 いくつかの抗肥満薬や高脂血症薬物が知られている。 例えば中枢性食 欲抑制剤として例えばマジンドール （A. J. 3
Figure imgf000003_0001
3 01と11. Ru s h , An n. I n t e r n. Me d. , 8 1巻、 5 2 6— 5 3 3、 1 9 7 4年） は 、 食欲を抑えることにより脂質生合成を減少させるものであるが、 食欲を減退さ せるために却って健康を害する場合がある。 それ故、 副作用のない新しい抗肥満 薬や高脂血症治療薬が望まれている。
—方、 生体膜成分である脂質の 1つスフィンゴミエリンの加水分解反応は、 インターロイキン一 1 ^や腫瘍壊死因子一ひなどのサイ トカインによる細胞内情 報伝達 （Y. A. Ha n n u n、 ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカルケミストリ 一、 2 6 9巻、 3 1 2 5— 3 1 2 8頁、 1 9 9 4年； R. Ko l e s n i c kと D. W. G 0 1 d e、 セル、 7 7巻、 3 2 5— 3 2 8頁、 1 9 9 4年） や T細胞 の活性化における紬胞内情報伝達 （L. M. B o u c h e rら、 ジャーナル *ォ ブ ' イクスメンタルメディスン、 1 8巻、 2 0 5 9— 2 0 6 8頁、 1 9 9 5年； 越智厚雄、 メディシナルイ厶ノロジィ一、 2 8巻、 3 9 7— 4 0 1頁、 1 9 9 4 年） に関与しており、 動脈硬化、 血栓症、 炎症などの疾患や免疫調節機構などに 働いていることが最近明らかにされてきた。
しカヽし、 このスフイ ンゴミエリンの加水分解酵素であるスフインゴミエリナ ーゼを特異的にかつ強力に阻害する薬剤からの当該疾患に対する予防、 治療薬は 未だ実用化されていない。 発明が解決しょうとする課題
近年、 食生活の向上に伴い、 トリアンルグリセロールの蓄積に起因した肥満 症や高脂血症の患者が増加する傾向に有り、 種々の病変の原因ないし誘因として 治療医学および予防医学上大きな問題を提示している。 トリァシルグリセロール 蓄積による肥満症や高脂血症と併発しやすい病気として、 動脈硬化症、 脂防肝、 高血圧症、 糖尿病等があり、 現在これらの患者数は増加する傾向にある。
肥満症は身体の貯蔵脂肪、 主としてトリグリセリ ドが過剰に蓄積した状態で あり、 トリァシルグリセロールの合成が増加し、 脂肪細胞内に異常に脂肪が蓄積 することに起因する。 トリァシルグリセロール血症もまた、 腸や肝臓でのトリア シルグリセロール合成が亢進し、 血中に高トリアシルグリセロールを含んだリポ 夕ンパク血症を惹起すると考えられている。
したがって、 トリアシルグリセロールの選択的な合成を司るジァシルグリセ ロールァシル転移酵素を阻害する物質は、 トリァシルグリセロールの蓄積を抑制 し、 かかる疾病に有効であることが期待される。
かかる実情において、 ジァシルグリセロールァシル転移酵素阻害活性を有す る物質を提供することは、 肥満症や高脂血症さらにそれに基づく動脈硬化などの 種々の成人病の治療上有用なことである。
また、 生体膜成分脂質であるスフィ ンゴミエリンを分解するスフィ ンゴミエ リナ一ゼを阻害することにより今までにない新しい作用に基づく抗動脈硬化剤、 抗血栓剤、 抗炎症剤や免疫抑制剤として利用できることが期待される。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、 新たに海藻から分離した KF— 1 0 4 0菌株の培養物中に、 ジァシルグリセ口一 ルァシル転移酵素阻害活性とスフイ ンゴミエリナ一ゼ阻害活性を有する物質が産 生されることを見出した。 次いで、 該培養物からこれら脂質代謝を阻害する活性 物質を分離、 精製した結果、 後記の式 [ I ] および [ I I ] で示される化学構造 を有する物質を見いだした。 これらの化学構造を有する物質は従来まったく知ら れていないことから、 本物質を KF— 1 0 4 0 T4 A物質、 KF— 1 04 0 T4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質とそれぞれ称 することにした。
本発明は、 かかる知見にもとずいて完成されたものであって、 下記式 [ I ]
Figure imgf000005_0001
で表される化合物からなる立体異性体 KF— 1 0 4 0 T4 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 4 B物質と下記式 [ I I ]
Figure imgf000005_0002
で表される化合物からなる立体異性体 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質に関する。
本発明は更にまた、 グリオクラジウム属に厲し、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質 および/または KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A 物質および/または KF - 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する能力を有する微生物を 培地に培養し、 培養液中に KF— 1 0 4 0 T 4 A物質および/または KF— 1 0
4 0 T 4 B物質および Zまたは KF— 1 0 4 0 T 5 A物質および または K F— 1 0 4 0 T 5 B物質を蓄積せしめ、 該培養物から KF— 1 0 4 0 T 4 A物質およ び または KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A物質 および/または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を採取する新規 KF— 1 0 4 0 T 4 A 物質、 KF - 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の製造法に関するものである。
本発明はまた、 グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質およ び/または KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A物質 および/または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する能力を有する微生物が、 グ リオクラジウム エスピー KF— 1 0 4 0 (G l i o c l a d i um s p. KF- 1 0 4 0. FERM B P— 6 2 5 1 ) である KF— 1 0 4 0 T 4 A物質 、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の製造法に関するものである。
本発明は更にまた、 グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質 および または KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A 物質および Zまたはは KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する微生物に関するもの である。
前記に述べた式 [ I ] および [ I I ] で表される KF— 〖 0 4 0 T 4 A物質 、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF - 1 0 4 0 T
5 B物質を生産する能力を有する微生物 （以下 「KF - 1 0 4 0物質生産菌」 と 称する） は、 グリオクラジウム属に属するが、 例えば本発明者らが分離したグリ ォクラジウム エスピー KF— 1 0 4 0株は、 本発明において最も有効に使用 される菌株の一例である。 本 KF - 1 0 4 0菌株の菌学的性状を示すと、 以下の 通りである。
1. 形態的性質
本菌株は、 海水 （塩分濃度 3. 4 %) を 5 0 %含むバイレイショ ·ブドウ糖 寒天培地、 コーン · ミール寒天培地、 麦芽汁寒天培地、 三浦寒天培地、 海水澱粉 寒天培地などで比較的良好に生育し、 分生子の着生も良好である。
コーン ， ミール寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、 菌糸は 透明で隔壁を有している。 分生子柄は、 ほうき状 （p e n i c i 1 1 a t e) と 輪生 （ve r t i c i l l a t e) とが混在している。 p e n i c i 1 1 a t e の分生子柄 （長さ 1 00〜200 urn) は基底菌糸より直立または分岐し、 先端 または分岐上でほうき状に輪生した大きさ 2. 5〜3. 0 1 0〜23 01の数 本のフィアラィ ド上に分生子塊を形成する。
一方、 V e r t i c i 1 1 a t eの分生子柄 （長さ 25〜50 /zm) は基底 菌糸より直立し、 先端または分岐上で長フラスコ形からきり状で先端に向かつて 先細となったフィアライ ド （大きさは 3. 0〜5. 0 X 1 7〜25 m) から単 独で分生子塊が形成される。 分生子は、 p e n i c i 1 1 a t eでは無色で大き さ 2. 5〜3. 0 X 3. 0〜5. 0 mの楕円形から長楕円形で一端がわずかに 尖るものがある。 v e r t i c i 1 1 a t eでは、 無色の楕円形から長楕円形で 大きさ 2. 5〜3. 0 x 6. 0〜8. 5 zmである。
2. 培養上の諸性状
本菌株を各種培地上で 25°C、 1 4日間培養した場合の肉眼的に観察した結 果は、 下記の第 1表に示すとおりである。 なお、 これらの培地において、 菌核ま たは菌核様の構造は形成されない。
第 1表 培地 培地上の生育状態 コ πニー表 コ α二—裏 可溶性
(コロニーの直径） 面の色調 面の色調 色素 ノくレイショ · 良好 (28〜30匪） 明灰色 明灰色 無し ブドウ糖寒天 羊毛状、 平坦
培地 コーン . ミー 良好 (24〜30 mm) 明灰色 明灰色 無し ル寒天培地 羊毛状、 帯状 麦芽汁寒天 良好 (20〜22 mm) 灰白色 明灰色 無し 培地 羊毛状、 平坦 三浦寒天 良好 (22〜24 mm) 明灰色 明灰色 無し 培地 羊毛状、 ややしわ状 海水澱粉寒天 良好 （24〜27 mm) 明灰色 乳白色 無し 培地 羊毛状、 平坦
3. 生理的、 生態的性状
( 1 ) 最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、 pH4〜8、 温度 1 7〜25°C、 * 海水濃度 0〜 5 0 %である。
* ：塩分濃度 3. 4 %の天然海水を使用
(2) 生育範囲
本菌株の生育範囲は、 p H 3〜 1 0、 温度 9〜 3 2 °C、 * 海水濃度 0〜 2 0 0 %である。
* :塩分濃度 3. 4 %の天然海水を使用
(3) 好気性、 嫌気性の区別 好気性
以上のように、 本菌株 KF - 1 0 4 0株の形態的特徵、 培養性状および生理 的性状にもとずき、 既知菌種との比較を試みた結果、 本菌株はグリオクラジウム (G 1 i 0 c 1 a d i urn) 属に属するー菌株と同定し、 グリオクラジウム ェ スピー KF— 1 04 0と命名した。 本菌株は、 グリオクラジウム エスピー KF— 1 0 4 0 (G 1 i 0 c 1 a d i urn s p. KF— 1 0 4 0) として、 平成 1 0年 2月 6日に工業技術院生 命工学工業技術研究所に FERM P- 1 6 6 2 9として寄託され、 平成 1 0年 ( 1 9 9 8 ) 2月 1 2日に日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号に所在する通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に原寄託よりブタペスト条約にもと ずく寄託への移管請求により FERM BP- 6 2 5 1 として寄託されている。
本発明で使用される好ましい KF— 1 0 4 0物質生産菌としては、 前述のグ リオクラジウム エスピー KF— 1 0 4 0菌株が挙げられるが、 菌の一般的性 状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、 一定したものではなく、 自然的に あるいは通常行われる紫外線照射、 X線照射または変異誘導体剤、 例えば N—メ チル -N' —二トロー N—二トロソグァ二ジン、 2—ァミノプリン等の変異処理 により取得できる人工変株、 細胞融合株、 遺伝子操作株を含め、 グリオクラジゥ ム属に属し、 前記式 [ I ] および [ I I ] で表される KF— 1 04 0 T 4 A物質 、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 04 0 T 5 B物質を生産する菌株はすべて本発明において用いることができる。
本発明の KF— 1 0 4 0 T4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 04 0 T 5 B物質を製造するにあたっては、 先ず グリオクラジウム属に属する KF— 1 0 4 0物質生産菌を培地に培養することに より行われる。 上記 KF— 1 0 4 0物質生産菌に適した栄養源としては、 微生物 が同化し得る炭素源、 消化し得る窒素源、 さらに必要に応じて無機塩、 ビタミン 等を含有させた栄養培地が用いられる。
上記の同化し得る炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 マルト一ス 、 ラク ト一ス、 ガラク ト一ス、 デキストリン、 澱粉などの糖類、 大豆油等の植物 性油脂類が単独または組み合わせて用いられれる。 消化し得る窒素源としては、 ペプトン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粉、 綿実粉、 コーン ·スティープ ' リカ 一、 麦芽エキス、 カゼイン、 アミノ酸、 尿素、 アンモニゥ厶塩類、 硝酸塩類等が 単独または組み合わせて用いられる。 その他必要に応じてリン酸塩、 マグネシゥ 厶塩、 カルシウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩などの塩類、 鉄塩、 マンガン塩 、 銅塩、 コバルト塩、 亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、 その他本物質の生 産に好適なものが適宜添加される。
培養するに当たり、 発泡が激しいときには、 必要に応じて液体パラフィン、 動物油、 植物油、 シリ コン等、 界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。 上記 の培養は、 上記栄養源を含有すれば、 培地は液体でも固体でもよいが、 通常は液 体培地を用い、 培養するのがよい。 少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が 好適である。 目的物質を大量に工業生産するには、 他の醱酵生産物と同様に、 通 気攪拌するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合、 生産工程において、 菌の生育遅延を防止す るため、 はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、 次に培養物を大 きなタンクに移して、 そこで生産培養するのが好ましい。 この場合、 前培養に使 用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、 両者ともに同一であっても よいし、 必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌培養で行う場合、 例えばプロペラやその他機械による攪拌、 ファメーターの回転または振とう、 ポンプ処理、 空気の吹き込みなど既知の方法 が適宜使用される。 通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、 本 K F— 1 0 4 0物質生産菌が本発明の K F— 1 0 4 0 T 4 A 物質、 K F— 1 0 4 0 T 4 B物質、 K F— 1 0 4 0 T 5 A物質及び K F— 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、 通常は 2 0〜3 0 °C、 好ま しくは 2 7で前後で培養するのが好ましい。 培養 p Hは、 通常は 5〜8、 好まし くは 7前後で培養するのがよい。 培養時間は培養条件によっても異なるが、 通常 は 1 0〜2 0日程度である。
このようにして得られた本発明の K F— 1 0 4 0 T 4 A物質、 K F— 1 0 4 0 T 4 B物質、 K F— 1 0 4 0 T 5 A物質及び K F - 1 0 4 0 T 5 B物質は、 塔 養菌体および培養濾液に存在する。 培養物から目的とする K F— 1 0 4 0 T 4 A 物質、 K F— 1 0 4 0 T 4 B物質、 K F— 1 0 4 0 T 5 A物質及び K F - 1 0 4 0 T 5 B物質を採取するには、 全培養物をァセトン等の水混和性有機溶媒で抽出 し、 抽出液を減圧下有機溶媒を溜去後、 続いて残渣を酢酸ェチルなどの水不混和 性有機溶媒で抽出することによって行われる。
上記の抽出法に加え、 脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、 例えば吸 着クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 薄層クロマトグラフィー 、 遠心向流分配クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィ一等を適宜組み 合わせ、 あるいは繰り返すことにより、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF - 1 04 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を各 成分に分離、 精製することができる。 次に、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 04 0 T4 B物質、 K F- 1 04 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の理化学的性伏について 述べる。
[ I ] KF - 1 0 4 0 T 4 A物質
( 1 ) 性状： 白色粉末
(2) 分子量： 77 6 (高速原子衝撃質量分析による）
(3) 分子式： C4。H72〇14
(4) 比旋光度： 〔ひ〕 。 24 = + 1 2° (c = 0. 1、 メタノール）
( 5 ) 融点： 3 6. 7 °
( 6) 紫外部吸収スペク トル ： メタノール中で測定した紫外部吸収スペク トル は第 1図に示すとおりであり、 2 0 3 nm (£ = 4 5 8 0 0) 、 222 nm ( ε = 3 3 1 0 0 ) 付近に特徴的な吸収極大を示す。
(7) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは第 2図に示す通りであり、 3 4 3 7、 2 9 6 2、 29 27、 28 75、 1 7 0 7、 1 6 4 Κ 1 6 3 0、 1 4 5 8、 1 3 7 5、 1 275、 1 2 2 8、 1 0 74、 1 0 2 6 cm 1に特徴的な極大吸収を有する。
(8) プロ トン核磁気共鳴スぺク トル： Va r i a n J a p a n社製、 核磁 気共鳴スぺク トロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スぺク トル （重メ 夕ノール中で測定） は、 第 3図に示すとおり
(9) 13C核磁気共鳴スぺク トル ： Va r i a n J a p a n社製、 核磁気共 鳴スぺク トロメ一夕を用いて測定した13 C磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中 で測定） は、 第 4図に示すとおり
(1 0) 溶媒に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェ チルに可溶、 水、 へキサンに難溶
(1 1) 呈色反応：硫酸、 リンモリブデン酸に陽性
( 1 2) 酸性、 中性、 塩基性の区別 ： 中性物質
以上のように、 本発明の KF— 1 040 T 4 A物質の各種理化学的性状ゃス ぺク トルデータを詳細に検討した結果、 本発明の KF— 1 040 T 4 A物質は下 記式 [I] で表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000012_0001
[I I] KF- 1 040 T4 B物質
( 1 ) 性状： 白色粉末
(2) 分子量： 776 (高速原子衝撃質量分折による）
(3) 分子式： C4。H72〇14
(4) 比旋光度： [ひ] 。 24 = +8° (c = 0. し メタノール）
( 5 ) 融点： 35. 6 ° 、
(6) 紫外部吸収スぺク トル： メタノール中で则定した紫外部吸収スぺク トル は第 5図に示すとおりであり、 203 nm (£ = 25800) 、 222 nm ( ε = 1 7800 ) 付近に特徴的な吸収極大を示す。
(7) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リウム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは第 6図に示す通りであり、 3437、 2960、 2926、 2873、 2854、 1 70 1、 1 653、 1 637、 1 458、 1 375、 1 269、 1 230、 1 070 , 1 024 c m 1に特徴的な極大吸収を有する。 (8) プロ トン核磁気共鳴スぺク トル： Va r i an J a p a n社製、 核磁 気共鳴スぺク トロメータを用いて测定したプロトン核磁気共鳴スぺク トル （重メ 夕ノール中で測定） は、 第 7図に示すとおり
(9) 13C核磁気共鳴スぺク トル： Va r i an J a p a n社製、 核磁気共 鳴スぺク トロメータを用いて则定した13 C磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中 で測定） は、 第 8図に示すとおり
(1 0) 溶媒に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェ チルに可溶、 水、 へキサンに難溶
(1 1) 呈色反応：硫酸、 リ ンモリブデン酸に陽性
(1 2) 酸性、 中性、 塩基性の区別 ： 中性物質
以上のように、 本発明の KF— 1 04 0 T4 B物質の各種理化学的性状ゃス ぺク トルデータを詳細に検討した結果、 本発明の KF— 1 040 T4 B物質は下 記式 [I] で表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000013_0001
[I I IJ KF- 1 040T5 A物質
( 1 ) 性状：無色油状
(2) 分子量： 8 1 8 (高速原子衝擊質量分析による）
(3) 分子式： C42H74015
( 4 ) 比旋光度： [ひ] ！) 24 = +22° (c = 0. 1、 メタノール）
(5) 紫外部吸収スペク トル ： メタノール中で測定した紫外部吸収スペク トル は第 9図に示すとおりであり、 20 3 nm (£ = 27000) 、 222 nm ( ε = 20900 ) 付近に特徴的な吸収極大を示す。
(6) 赤外部吸収スぺク トル：臭化カリウム绽剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは第 1 0図に示す通りであり、 3 4 3 4、 2 9 6 2、 2 927、 2 8 7 3 、 1 74 1、 1 7 0 1、 1 6 5 5、 1 6 3 7、 1 4 5 8、 1 3 75、 1 27 3、 1 23 2、 1 1 2 8、 1 0 7 8、 1 0 3 6 c m 1に特徴的な極大吸収を有する。
(7) プロ トン核磁気共鳴スぺク トル： Va r i a n J a p a n社製、 核磁 気共鳴スぺク トロメータを用いて则定したプロ トン核磁気共鳴スぺク トル （重メ 夕ノール中で測定） は、 第 1 1図に示すとおり
(8) 13C核磁気共鳴スぺク トル： Va r i a n J a p a n社製、 核磁気共 鳴スぺク トロメータを用いて测定した13 C磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中 で測定） は、 第 1 2図に示すとおり
(9) 溶媒に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチ ルに可溶、 水、 へキサンに難溶
( 1 0) 呈色反応：硫酸、 リンモリブデン酸に陽性
( 1 1 ) 酸性、 中性、 塩基性の区別 ： 中性物質
以上のように、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 A物質の各種理化学的性状ゃス ぺク トルデータを詳細に検討した結果、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 A物質は下 記式 [ I I ] で表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000014_0001
[ I V] KF- 1 0 4 0 T 5 B物質
( 1 ) 性状：無色油状
(2) 分子量： 8 1 8 (高速原子衝撃質量分析による）
(3) 分子式： C42H74015
(4) 比旋光度： [ひ] 。 24 = + 1 0° (c = 0. 1、 メタノール）
( 5) 紫外部吸収スペク トル： メタノール中で測定した紫外部吸収スペク トル W は第 1 3図に示すとおりであり、 2 0 3 nm (£ = 4 1 6 0 0 ) 、 2 2 2 nm ( ε = 3 2 0 0 0 ) 付近に特徴的な吸収極大を示す。
( 6) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リウム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺ ク トルは第 1 4図に示す通りであり、 3 4 3 4、 2 9 6 0、 2 9 2 6、 2 8 7 3 、 2 8 5 4、 1 7 4 3、 1 7 0 7、 1 6 5 5、 1 6 3 7、 1 4 5 8、 1 3 7 5、 1 2 6 9、 1 2 3 8、 1 1 2 4、 1 0 7 8、 1 0 3 4 c πΤ1に特徵的な極大吸収 を有する。
(7) プロ トン核磁気共鳴スぺク トル： Va r i a n J a p a n社製、 核磁 気共鳴スぺク トロメータを用いて测定したプロトン核磁気共鳴スぺク トル （重メ 夕ノール中で測定） は、 第 1 5図に示すとおり
(8) 13C核磁気共鳴スぺク トル ： Va r i a n J a p a n社製、 核磁気共 鳴スぺク トロメータを用いて则定した13 C磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中 で測定） は、 第 1 6図に示すとおり
( 9) 溶媒に対する溶解性： メタノール、 ベンゼン、 クロ口ホルム、 酢酸ェチ ルに可溶、 水、 へキサンに難溶
( 1 0) 呈色反応：硫酸、 リ ンモリブデン酸に陽性
( 1 1 ) 酸性、 中性、 塩基性の区別 ： 中性物質
以上のように、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の各種理化学的性状ゃス ぺク トルデータを詳細に検討した結果、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 B物質は下 記式 [ I I ] で表される化学構造であることが決定された。
Figure imgf000015_0001
上記したように、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T 4 B 物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の各種理化学的 性状について詳述したが、 このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報 告されておらず、 それ故 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 04 0 T 4 B物質 、 KF- 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質は新規物質であると 決定した。 次に、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T4 B物質、 K F- 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の生物学的性質について 以下に述べる。
( 1 ) ラッ ト由来ジァシルグリセロールァシル転移酵素に対する阻害作用 ジァシルグリセロール了シル転移酵素活性は、 Ma y 0 r e kと B a r— T a n aらの方法 （ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカルケミストリ一 （J o u r n a 1 o f B i o l o g i c a l C h em i s t r y) ) 、 2 6 0巻、 6 5 2 8— 6 5 3 2頁、 1 9 8 5年） を一部改変して測定した。
すなわち、 ラッ ト肝より調製したミクロソーム画分を酵素源として用いて、 8 mM Mg C 12 > 1 mg/m 1ゥシ血清アルブミン、 2. 5 mMジイソプロ ピルフルォロリン酸を含む 1 75 mMトリス塩酸 （pH 8. 0) バッファーに、 0. 75 mMジォレオイルグリセロール、 3 0 ; Μ [ 1—14 C] パルミ トイルー C oA ( 0. 0 2 C i ) を加え、 全容量 2 0 0 1 とし、 23 °Cで 1 5分間反 応させ、 総脂質をクロ口ホルム ： メタノール （ 1 ： 2) 混合液で抽出後、 TLC (キーゼルゲル GF 254 、 展開溶媒として石油エーテル： ジェチルエーテル：酢 酸、 8 0 : 2 0 : 1 ) で各脂質を分離後、 R Iラジオスキャナー （アンビス社製 ) でトリアシルグリセロール画分の放射活性を計測し、 ジァシルグリセロールァ シル転移酵素活性を測定した。
本酵素を 5 0 %阻害する薬剤濃度を算定した結果は、 本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質は 1 3. 2 g/mし KF— 1 04 0 T 4 B物質は 1 1. 6 g /m K KF- 1 0 4 0 T 5 A物質は 1 8. 0 g/m 1及び KF— 1 0 4 0 T 5 Β物質は 1 4. 7 gZm lであった。 (2) ヒト由来細胞 （ヒ トバ一キッ トリ ンパ腫由来の R a j i細胞） における トリァシルグリセロール生成に対する阻害作用
トリァシルグロセロール生成に対する影響は、 供田らの方法 （ジャーナル - ォブ .バイオロジカルケミストリー、 2 6 6巻、 4 2 1 4— 4 2 1 9頁、 1 9 9 1年） に従い、 ヒト由来系細胞 （ヒトバ一キッ トリンパ腫由来の R a j i細胞） を用いて行った。
2. 7 x l 06 c e l l s/m lの R a j i細胞液 [ 1— 14C] ォレイン酸 (0. 0 2 C i ) を全容量 20 0 1 とし、 37でで 3 0分間反応させ、 総脂 質をクロ口ホルム ： メタノール （2 : 1 ) 混合液で抽出後、 以下ラッ ト由来ジァ シルグリセロール了シル転移酵素系に対する阻害作用において行った同様の方法 で測定した。
トリアシルグリセロール生成に対する 5 0%阻害する濃度を算定した結果は 、 本発明の KF - 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 04 0 T 5 B物質はいずれも 1 0 /m 1であつ た。
(3) ラッ ト脳由来中性スフィ ンゴミエリナーゼ阻害作用
ラッ ト脳由来の中性スフィ ンゴミエリナ一ゼに対する影響は、 Mu r a k a m i と A r i m aらの方法 （ジャーナル . ォブ .ニューロケミストリ一 （J o u r n a l o f Ne u r o c h em i s t r y) ) 、 5 2巻、 6 1 1— 6 1 8 頁、 1 9 8 9年） を改変して行った。
すなわち、 ラッ ト脳より調製した膜画分を酵素源として、 20mM HEP ES— NaOH緩衝液 （pH7. 4) 、 6. 5mM MgC 12 , 0. 1 %トリ トン X— 1 0 0、 2 5 [N—メチル一3 H] スフイ ンゴミエリ ン （0. 0 0 6 C i ) を加え、 全量を 5 0 1 とした。 37°Cで 3 0分反応後、 クロ口ホル ム ： メタノール （ 1 : 2、 v/v) 混合液を 20 0 / 1加え、 原料の [3 H] ス フィンゴミエリンと反応生成物の [3 H] ホスホコリンを分離する。 上層を 5 0 1をバイアルにとり、 液体シンチレ一シヨ ンカウンターで [3 H] ホスホコリ ンの量を定量し、 中性スフィ ンゴミエリナーゼ活性を測定した。 本酵素を 5 0 %阻害する本発明物質の濃度を算定した結果は、 本発明の KF - 1 04 0 T 4 A物質で 3 9 1 g/m K KF- 1 0 4 0 T4 B物質で 34 1 g/m 1でめつた。
(4) ヒ ト胎盤由来酸性スフィ ンゴミエリナーゼに対する影響
ヒト胎盤由来の酸性スフィ ンゴミエリナ一ゼに対する影響は J 0 n e sらの 方法 （バイオケミカルジャーナル （B i o c hm i c a l J o u r n a l ) ) 、 1 9 5巻、 3 7 3— 3 8 2頁、 1 9 8 1年） を一部改変して行った。
すなわち、 ヒト胎盤由来の酸性スフイ ンゴミエリナーゼ （シグマ社製） を酵 素源として、 2 5 OmM酢酸ナト リウム緩衝液 （pH 5. 0) 、 0. 1 %NP-
4 0 (シグマ社製） 、 2 5 M [N—メチル一 3 H] スフィ ンゴミエリ ン （0.
0 0 6 C i ) を加え、 全量を 5 0 1 とした。 3 7てで 3 0分反応後、 クロ口 ホルム ： メタノール （ 2 ： 1 ： v/v) 混合液を 2 0 0 1加え、 [3 H] スフ ィンゴミエリンと反応生成物 [3 H] ホスホコリンを分離する。 上層を 5 0 1 をバイアルにとり、 液体シンチレーシヨンカウンタ一で [3 H] ホスホコリ ンを 定量し、 酸性スフイ ンゴミエリナーゼ活性を測定した。
本酵素を 5 0 %阻害する本発明物質の濃度を算出した結果は、 本発明の KF - 1 04 0 T 4 A物質で 23 3 fi g/m 1、 KF— 1 04 0 T 4 Β物質で 7 0 g/m l、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質で 1 9 6 g 1及び K F— 1 0 4 0 T
5 B物質で 4 9 g/m 1であった。
以上のように、 本発明による新規物質は、 ジァシルグリセロールァシル転移 酵素に対する阻害活性およびスフイ ンゴミエリナーゼに対する阻害活性を示すこ とから、 動脈硬化、 肥満、 血栓症、 炎症や免疫機能に関連した疾患の予防や治療 に ¾用である。 図面の簡単な説明
第 1図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質の紫外部吸収スぺク トル （メタ ノール中） を示したものである。
第 2図は本発明の KF - 1 0 4 0 T 4 A物質の赤外部吸収スぺク トル （KB r法） を示したものである。
第 3図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質のプロ トン核磁気共鳴スぺク ト ル （重メタノール中） を示したものである。
第 4図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 A物質の13 C核磁気共鳴スぺク トル （ 重メタノール中） を示したものである。
第 5図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 B物質の紫外部吸収スぺク トル （メタ ノール中） を示したものである。
第 6図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 B物質の赤外部吸収スぺク トル （KB r法） を示したものである。
第 7図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 B物質のプロトン核磁気共鳴スぺク ト ル （重メタノール中） を示したものである。
第 8図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 4 B物質の13 C核磁気共鳴スぺク トル （ 重メタノール中） を示したものである。
第 9図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 A物質の紫外部吸収スぺク トル （メタ ノール中） を示したものである。
第 1 0図は本発明の KF - 1 0 4 0 T 5 A物質の赤外部吸収スぺク トル （K B r法） を示したものである。
第 1 1図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 A物質のプロトン核磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中） を示したものである。
第 1 2図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 A物質の13 C核磁気共鳴スぺク トル (重メタノール中） を示したものである。
第 1 3図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の紫外部吸収スぺク トル （メ 夕ノール中） を示したものである。
第 1 4図は本発明の KF - 1 0 4 0 T 5 B物質の赤外部吸収スぺク トル （K B r法） を示したものである。
第 1 5図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 B物質のプロ トン核磁気共鳴スぺク トル （重メタノール中） を示したものである。
第 1 6図は本発明の KF— 1 0 4 0 T 5 B物質の13 C核磁気共鳴スぺク トル (重メタノール中） を示したものである。 発明の実施の態様
次に、 実施例を挙げて本発明を説明するが、 本発明はこれのみに限定される ものではない。
寒天斜面培地で培養したグリオクラジウム エスピー KF— 1 0 4 0菌株 (G 1 i 0 c 1 a d i urn s p. KF- 1 0 4 0. FERM B P - 6 2 5 1 ) より、 グルコース 2. 0 %、 ポリペプトン （日本製薬社製） 0. 5 %、 酵母ェ キス （オリエンタル酵母工業社製） 0. 2 %、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 0 5 %, リン酸二水素カリウム 0. 1 %、 寒天 0. 1 %を 5 0 %天然海水で溶解し た液体培地 （pH 6. 0) を 1 0 0m lずつ分注した 5 0 0 m l容三角フラスコ 2本に 1白金耳ずつ接種し、 2 7°Cで 4日間振とう培養した。
そして、 それを種培養液として、 ポテト 1 0 0 g/リッ トルとグルコース 1 . 0 %を 5 0 %天然海水で溶解した液体培地を 6 0本の 1 0 0 0 m 1容のル一ビ ンに 3 0 0 m lずつ仕込み、 滅菌冷却後、 種培養した培養液を 3m 1ずつ各ルー ビンに無菌的に移植し、 2 7てで 1 6日間静置培養した。
得られた全培養液に 1 8 リッ トルのアセ トンを加えて良く攪拌した後、 減圧 濃縮し、 これを再び酢酸ェチルで抽出し減圧濃缩後、 2. 2 gの粗物質を得た。 これを少量のァセトニトリルに溶解し、 3 0 %了セトニトリル水で充塡した OD Sカラム （2 0 0 g、 センシユ ー科学、 ODS— S S— 1 0 2 0 T) にかけ、 5 0 %ァセトニトリル水で洗浄後、 6 0 %ァセトニトリル水、 さらに 7 0 %ァセト 二トリル水で溶出し、 減圧濃縮によりそれぞれの溶出液より粗物質 T 4は 8 7 m gおよび粗物質 T 5は 1 0 4mgを得た。
続いてそれぞれ粗物質 T 4および粗物質 T 5を高速液体クロマトグラフィー (YMC - P a c k ODS -AM. 2 0 x 2 5 0 mm、 流速 6. 0 m 1 分、 検出、 UV 2 2 0 nm、 溶出溶媒 5 0 %ァセトニトリル水） を行い分画した。 粗 物質 T 4からは 9 6分と 1 0 0分に溶出する画分を、 また粗物質 T 5からは 2 1 2分と 2 2 4分に溶出する溶出画分をそれぞれ集め、 有機溶媒を除き、 水層を酢 酸ェチルで抽出することにより、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質を 7. 5mg、 KF — 1 0 4 0 T 4 B物質を 3. 3mg、 KF - 1 0 4 0 T 5 A物質を 2. 6mg、 及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を 4. 2 mgそれぞれ得た。 発明の効果
以上のことから、 本発明による新規 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び KF— 1 0 4 0 T 5 B物質は、. ジァシルグリセロール了シル転移酵素に対する阻害活性およびスフィゴミエリナ ーゼに対する阻害活性を示すことから、 動脈硬化、 肥満、 血栓症、 炎症や免疫機 能に関連した疾患の予防および治療に有用であると期待される。

Claims

1. 下記式 [ I ]
α一-冑
Figure imgf000022_0001
で表される化合物である立体異性体 KF— 1 0 4 0 Τ 4 Α物質と KF— 1 0 4 0 範
T 4 B物質および下記式 [ I I ]
Figure imgf000022_0002
で表される化合物である立体異性体 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質と KF— 1 0 4 0 T 5 B物質、
とからなる新規 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF— 1 0 4 0 T 5 A物質及び K F- 1 0 4 0 T 5 A物質。
2. ダリオクラジウム属に厲し、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質および/ま たは KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A物質および /または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を生產する能力を有する微生物を培地で培養 し、 培養液中に KF— 1 0 4 0 T 4 A物質および/または KF— 1 0 4 0 T 4 B 物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 A物質および/または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を蓄積せしめ、 該培養物から KF— 1 0 4 0 T 4 A物質および/または KF— 1 0 4 0 T 4 B物質およびノまたは KF— 1 0 4 0 T 5 A物質および ま たは KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を採取することからなる新規 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質、 KF— 1 0 4 0 T 4 B物質、 KF - 1 04 0 T 5 A物質および KF - 1 04 0 T 5 B物質の製造法。
3. ダリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 0 T 4 A物質および/ま たは KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および Zまたは KF— 1 0 4 0 T 5 A物質および /または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する能力を有する微生物が、 グリオク ラジウム エスピー KF— 1 0 4 0 (G l i o c l a d i um s p. KF - 1 0 4 0、 FERM BP— 6 2 5 1 ) である請求の範囲第 2項記載の製造法。
4. グリオクラジウム属に属し、 KF— 1 0 4 0 T4 A物質および/ま たは KF— 1 0 4 0 T 4 B物質および/または KF— 1 04 0 T 5 A物質および /または KF— 1 0 4 0 T 5 B物質を生産する能力を有する微生物。
5. 微生物が、 グリオクラジウム エスピー KF— 1 04 0 (G 1 i o c l a d i um s p. KF- 1 0 4 0 , FERM BP— 6 25 1 ) である 請求の範囲第 4項記載の微生物。
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