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WO2000052470A1 - Moyen de diagnostic et de traitement de la leucemie - Google Patents

Moyen de diagnostic et de traitement de la leucemie Download PDF

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Publication number
WO2000052470A1
WO2000052470A1 PCT/JP2000/001294 JP0001294W WO0052470A1 WO 2000052470 A1 WO2000052470 A1 WO 2000052470A1 JP 0001294 W JP0001294 W JP 0001294W WO 0052470 A1 WO0052470 A1 WO 0052470A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
human
vegf receptor
human vegf
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2000/001294
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenya Shitara
Masabumi Shibuya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to AU28281/00A priority Critical patent/AU2828100A/en
Priority to CA002363568A priority patent/CA2363568A1/en
Priority to EP00906685A priority patent/EP1160572A4/en
Publication of WO2000052470A1 publication Critical patent/WO2000052470A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G01N33/57505—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing leukemia using an anti-human VEGF receptor Flt-1 antibody, and a diagnostic and therapeutic agent containing an anti-human VEGF receptor Flt-1 antibody as an active ingredient.
  • Angiogenesis plays an important role in the formation of the circulatory system and many tissues in the embryonic stage of vertebrates, and also in adult individuals (females), luteal formation during the estrous cycle, and transient endometrial endometrium. It is closely related to proliferation and placental formation.
  • pathological conditions include angiogenesis that is deeply involved in the growth and metastasis of solid tumors, diabetic retinopathy, and pathogenesis and promotion of rheumatoid arthritis [J. Biol. Chem., 267, 10931 ( 1992)].
  • Vascular permeability factor (VPF) / Vascular endothelial growth factor (VEGF) is known as a factor that induces angiogenesis as the most important factor in angiogenesis in the above-mentioned developmental stage and in angiogenesis in a pathological state [ Advances in Cancer Research, 67, 281 (1995)].
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • kidney cancer [Cancer Research, 54, 4233 (1994)]
  • breast cancer [Human Pathology, 26, 86 (1995)]
  • brain tumor [J. Clinical Investigation, 91, 153 (1993)]
  • VEGF is produced in many human tumor tissues such as gastrointestinal cancer [Cancer Research, 53, 4727 (1993)] and ovarian cancer [Cancer Research, 54, 276 (1994)].
  • Fit-l the first human VEGF receptor belonging to the receptor tyrosine kinase family
  • KDR kinase insert domain-containing receptor
  • the extracellular domains of F-1 and KDR / Flk-1 consist of seven immunoglobulin-like domains, and the intracellular domain consists of a membrane protein having a tyrosine kinase domain and a molecular weight of 180 to 200 kilodaltons.
  • VEGF has a KD value of 20 pM for F It-1 and KDR / Flk-1 W
  • F-1 and KDR / Flk-1 are specifically expressed in vascular endothelial cells [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7533 (1993); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8915 (1993)].
  • Flt-1 has been reported to be expressed in human monocytes and involved in cell migration [Blood, 87, 3336 (1996)].
  • flt-1 mRNA was increased as compared to vascular endothelial cells in normal tissues.
  • flt-1 mRNA is expressed in vascular endothelial cells in patients with rheumatoid arthritis by in situ hybridization in situ hybridization.
  • VEGF and the VEGF receptor Fit-1 have been reported to be involved in the growth or metastasis of solid tumors, but no association with leukemia has been reported so far.
  • the present inventors have found for the first time that an antibody against the VEGF receptor Flt-1 responds to leukemia cell lines at a high rate, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to the following (1) to (18).
  • a diagnostic agent for leukemia containing an anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody as an active ingredient.
  • Anti-human VEGF receptor F-1 antibody is 30, 30, KM173U KM1732, KM1748 and And KM1750.
  • the diagnostic agent according to (1) which is an antibody selected from the group consisting of:
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is an antibody selected from the group consisting of Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single-chain antibody or disulfide stabilized antibody. Diagnostics.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is an antibody that is chemically or genetically fused with a radioisotope, protein, or low-molecular-weight drug.
  • a therapeutic agent for leukemia comprising an anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody as an active ingredient.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is an antibody selected from the group consisting of KM1730, KM173K, KM1732, KM1748, and KM1750.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is any of Fab, Fab ', F (ab,) 2 , a single-chain antibody and a disulfide-stabilized antibody, The therapeutic agent described in 7).
  • the anti-human VEGF receptor F-1 antibody is an antibody that is chemically or genetically fused with a radioisotope, protein, or low molecular weight drug.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is an antibody selected from the group consisting of KM1730, K173U KM1732, KM1748 and KM1750.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is an antibody selected from the group consisting of Fab, Fab ', F (ab,) 2 , a single-chain antibody and a disulfide-stabilized antibody (13). ).
  • Anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is radioisotope, protein or low (13) The method for diagnosing leukemia according to the above (13), wherein the antibody is an antibody fused chemically or genetically with a child drug.
  • the antibodies used in the present invention can be any antibodies that can bind to VEGF receptor Flt-1 (hereinafter simply referred to as F-1) and have a diagnostic or therapeutic effect on leukemia. May be.
  • the anti-Fit-1 antibody used in the present invention can be prepared by known methods [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. ), Hereinafter referred to as “antibody-lab-laboratory-manual”] as a polyclonal or monoclonal antibody.
  • the anti-F-1 antibody used in the present invention either a polyclonal or monoclonal antibody can be used, but a monoclonal antibody derived from a mammal is preferred.
  • mammal-derived monoclonal antibodies include antibodies produced by hybridomas, recombinant antibodies produced by transformants transformed with expression vectors containing antibody genes, and human antibodies.
  • monoclonal antibody used in the present invention those which are established by the following production method are preferable.
  • a human VEGF receptor Fit-1 protein is prepared as an antigen, a plasma cell having antigen specificity is induced from an animal immunized with the antigen, and further fused with myeloma cells to prepare a hybridoma.
  • An anti-human obtained by culturing the hybridoma, or administering the hybridoma cells to an animal to cause the animal to undergo ascites cancer, and separating and purifying the culture solution or ascites.
  • VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibodies can be raised.
  • Examples of the recombinant antibody used in the present invention include those obtained by modifying the above-described monoclonal antibody of the present invention using a gene recombination technique, and specifically include humanized antibodies and antibody fragments. it can. Among these antibodies, those with low antigenicity and prolonged blood half-life are preferred as therapeutic agents.
  • the humanized antibody used in the present invention includes a human chimeric antibody and a human CDR (Complementary Determining Region; hereinafter referred to as CDR) transplanted antibody.
  • CDR Complementary Determining Region
  • the human chimeric antibody is composed of an antibody variable region heavy chain (hereinafter, referred to as VH) and a variable region light chain (hereinafter, referred to as VL) of a non-human animal and a constant region heavy chain (hereinafter, referred to as CH) of a human antibody. ) And the constant region light chain of a human antibody (hereinafter, referred to as CL).
  • VH antibody variable region heavy chain
  • VL variable region light chain
  • CH constant region heavy chain
  • CL constant region light chain of a human antibody
  • the human chimeric antibody used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to human VEGF receptor F-1, and obtaining human antibody CH.
  • a human chimeric antibody expression vector is constructed by inserting the gene into an expression vector for animal cells having a gene encoding the human antibody CL, and then expressed and produced by introducing the vector into animal cells.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody in which the CDRs of VH and VL of a human antibody are each substituted with the CDR sequence of an antibody of a non-human animal.
  • the human CDR-grafted antibody used in the present invention is a VH and VL CDR sequence of an arbitrary human antibody that binds to the human VEGF receptor Fit-1 and has the VH and VL CDR sequences of a non-human animal antibody.
  • CDNAs encoding the respective substituted V regions were constructed and inserted into expression vectors for animal cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively, to express human CDR-grafted antibody. It can be produced by constructing a vector, introducing it into animal cells, and expressing it.
  • the human antibody portion of the human chimeric antibody and the human CDR-grafted antibody used in the present invention may belong to any of the immunoglobulin (Ig) classes, but is preferably of the IgG type and belongs to the IgG type. Any of the immunoglobulin C regions such as IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 can be used.
  • immunoglobulin immunoglobulin
  • Human antibody originally refers to an antibody naturally occurring in the human body, but human antibody phage libraries and human antibody production produced by recent advances in genetic, cell engineering, and developmental engineering technologies Antibodies obtained from transgenic animals are also included.
  • Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting them with an EB virus, etc., immortalizing them, and then cloning the cells to produce the antibody-producing lymphocytes.
  • the antibody can be purified.
  • the human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and single chain antibodies are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. Phage expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity can be collected from the library using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted to a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal refers to an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic animal can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, transplanting the ES cells into an early embryo of another mouse, and then developing the embryo.
  • a method for producing a human antibody from a transgenic animal producing human antibodies is to obtain a human antibody-producing hybridoma by a conventional method for producing a hybridoma used in mammals other than humans, and culture the resultant into a culture. Human antibodies can be produced and accumulated.
  • the antibody fragment used in the present invention includes Fab (abbreviation of Fragment of antigen binding), Fab, F (ab,) 2 , which is an antibody fragment exhibiting binding properties to human VEGF receptor Fit-1.
  • Fab abbreviation of Fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab fragment exhibiting binding properties to human VEGF receptor Fit-1
  • Fab is obtained by degrading the peptide at the top of two disulfide bonds that bridges two H chains at the hinge region of IgG with enzyme papain. It is a fragment composed of the entire chain and having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 50,000.
  • Fab used in the present invention can be obtained by treating an anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody with papain.
  • a DNA encoding a Fab fragment of the anti-human VEGF receptor F-1 antibody is inserted into an expression vector for animal cells, and the vector is expressed by introducing the vector into animal cells to produce Fab. be able to.
  • Fab ' is a fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, in which the disulfide bond between the hinges of F (ab') 2 is cleaved.
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating an anti-human VEGF receptor Flt-1 antibody with dithiothreitol as a reducing agent.
  • DNA encoding the Fab ′ fragment of the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is inserted into an expression vector for animal cells, and the vector is expressed by introducing the vector into animal cells to produce Fab ′. be able to.
  • F (ab ') 2 is obtained by degrading the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme trypsin. This fragment has 10,000 antigen-binding activities.
  • F (ab ') 2 used in the present invention can be obtained by trypsinizing an anti-human VEGF receptor FU-1 antibody.
  • a DNA encoding the F (ab ') 2 fragment of the anti-human VEGF receptor Fit-1 antibody is inserted into an animal cell expression vector, and the expression is carried out by introducing the vector into animal cells.
  • F (ab ') 2 can be produced.
  • a single-chain antibody (scFv) is obtained by connecting one VH and one VL using an appropriate peptide linker (hereinafter, referred to as P) to form a VH—P—VL or VL—P—VH poly. Is a peptide.
  • P an appropriate peptide linker
  • the single-chain antibody used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing an antibody that binds to human VEGF receptor F-1, and constructing a single-chain antibody expression vector. However, it can be expressed and produced by introducing it into E. coli, yeast, animal cells or insect cells.
  • the disulfide-stabilized antibody refers to an antibody in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue via a disulfide bond.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • VH or VL contained in the disulfide-stabilized antibody used in the present invention any of a mouse anti-human VEGF receptor F-1 monoclonal antibody and a human CDR-grafted antibody can be used.
  • the disulfide-stabilized antibody used in the present invention obtains cMA encoding VH and VL from a hybridoma producing an antibody that reacts with human VEGF receptor F-1, and inserts it into an appropriate expression vector. It can be produced by introducing and expressing the expression vector into Escherichia coli, yeast, animal cells or insect cells.
  • the fusion antibody is obtained by fusing a radioisotope, a protein, a low-molecular drug or the like to the above-mentioned antibody chemically or by genetic engineering.
  • the fusion antibody used in the present invention can be produced by chemically fusing a radioisotope, a protein, a low-molecular-weight drug, or the like to an antibody that binds to human VEGF receptor Fit-1.
  • a cDNA encoding the protein is ligated to a cDNA encoding the antibody, inserted into an appropriate expression vector, and the expression vector is expressed in E. coli, yeast, animal cells, or insect cells. It can be manufactured by making it.
  • Antigens required for preparing anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody include cells expressing human VEGF receptor Fit-1 on the cell surface or a cell membrane fraction thereof, or amino acids having the length of amino acids. Soluble human VEGF receptor F-1 protein with different extracellular domains Examples include white matter or a fusion protein of the protein with the Fc portion of an antibody.
  • Cells expressing the human VEGF receptor Fit-1 on the cell surface include NIH3T3-FU-1 cells
  • a recombinant vector was constructed in which the full-length or partial fragment cDNA encoding human VEGF receptor Flt-l [Cell Growth & Differentiation, 7, 213 (1996)] was inserted downstream of a suitable vector.
  • the human VEGF receptor Flt-l-expressing cells obtained by introducing it into host cells are cultured in an appropriate medium so that human VEGF receptor F-1 can be expressed in the cells or in the culture supernatant.
  • Full-length or partial fragments can be produced as they are or as fusion proteins. Further, it can also be prepared by synthesizing a polypeptide having a partial sequence of the protein described above using an amino acid synthesizer.
  • the host may be any host such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, as long as it can express the gene of interest.
  • bacteria include bacteria of the genus Escherichia such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and bacteria of the genus Bacillus.
  • yeast Saccharomyces '' cerepiche
  • Animal cells include human cells, Namalva cells, monkey cells, COS cells, and Chinese hamster cells.
  • insect cells include Sf9 and Sf21 (manufactured by Farmingzin), High Five (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • any vector into which the DNA encoding Flt-1 is introduced can be used as long as it can incorporate the DNA and can be expressed in a host cell.
  • a bacterium for example, Escherichia coli
  • the expression vector is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, a transcription termination sequence, and, in some cases, a promoter sequence.
  • commercially available pGEX manufactured by Pharmacia
  • pET system manufactured by Novagen
  • a method for introducing a recombinant vector into bacteria a method for introducing MA into bacteria, for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] Any method such as the protoplast method (JP-A-63-248394) can be used.
  • yeast When yeast is used as a host, examples of expression vectors include YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), and YCp50 (ATCC37419).
  • a method of introducing a recombinant vector into yeast if it is a method of introducing DNA into yeast, for example, electroporation method [Methods. Enzymol., 194, 182-187 (1990)], spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 1929 (1978)], lithium acetate Any of these methods can be used, for example, the J. Bacteriol., 153, 163 (1983).
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV), the promoter of SV40 or the promoter of metallothionein can be used. And the like.
  • the human CMV IE gene enhancer may be used together with the promoter.
  • a method for introducing a recombinant vector into animal cells includes, for example, an electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and a calcium phosphate method (Japanese Unexamined Patent Publication No. Any method can be used, such as the riboaction method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • baculovirus 'expression' vectors- A protein can be expressed by a method described in, for example, Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual. That is, the recombinant gene transfer vector and baculovirus described below are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the recombinant virus is transmitted to the insect cells to express the protein. Obtain insect cells.
  • pVL1392 As the gene transfer vector, for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacII I (all manufactured by Invitrogen) and the like are used.
  • baculovirus for example, autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus infecting night moth insects, is used.
  • Examples of the method of co-introducing the above-described recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a lipofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, the full-length or partial fragment of human VEGF receptor F-1 is produced and accumulated in the culture, and collected from the culture to obtain human VEGF receptor.
  • the full length or partial fragment of the body Fit-1 can be produced as it is or as a fusion protein.
  • the method for culturing the above transformant in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium for culturing the transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, so that the transformant can be cultured efficiently.
  • a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium is used (Molecular Cloning 2nd Edition).
  • Culture is usually performed at 15-40 ° C for 16-96 hours under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium as needed.
  • a medium for culturing the transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI 1640 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium is used. Cultures, 5% C0 2 presence usually performed 3-7 days at 35 to 37 C, the culture if necessary, kanamycin, good insect cells be added to the medium antibiotics such penicillins as host
  • Culture media for culturing the obtained transformants include commonly used TNM-FH media (Pharmingen), Sf900I ISFM [Life Technologies], ExCell400, ExCe 11405 [both manufactured by JRH Biosciences] are used. Cultivation is performed at 25-30 ° C for 1 to 4 days. It may be added to the medium.
  • a serum-free medium to facilitate purification of the full-length or partial fragment of human VEGF receptor Fit-1 as it is or as a fusion protein. Is preferred.
  • the full-length or partial fragment of human VEGF receptor F-1 is accumulated in the host cell as it is or as a fusion protein, after culturing, the cells are centrifuged, suspended in an aqueous buffer, and suspended. The cells are disrupted by sonication, French press, etc., and the protein is recovered by centrifugation and purification.
  • the protein denaturant when solubilizing the insoluble substance with a protein denaturant, the protein denaturant is not contained or the concentration of the protein denaturant is such that the protein does not change. It can be diluted or dialyzed into a very dilute solution to form a protein conformation.
  • the expressed protein can be recovered in the culture supernatant.
  • solvent extraction, fractional precipitation with organic solvents, salting out, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic mouth chromatography, affinity chromatography Separation operations such as reverse phase chromatography, crystallization, and electrophoresis can be performed alone or in combination.
  • Polypeptides having a partial sequence can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Also, Kuwawa Trading (US Advanced ChemTech), Pakinkin Elmergapant (US Perkin-Elmer), AROKA (US Protein Technology Instrument), Kurabo (US Synthecell-Vega), Nippon Perceptive 'Limited The product can also be produced using a peptide synthesizer manufactured by PerSeptive (US) or Shimadzu Corporation.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • Kuwawa Trading US Advanced ChemTech
  • Pakinkin Elmergapant US Perkin-Elmer
  • AROKA US Protein Technology Instrument
  • Kurabo US Synthecell-Vega
  • Nippon Perceptive 'Limited The product can also be
  • an animal is immunized using the protein obtained above as an antigen.
  • the antigen may be directly administered subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to the animal, but a carrier protein having high antigenicity may be bound to the antigen and administered, or an appropriate adjuvant may be used.
  • the antigen is administered.
  • Carrier proteins include keyhole mussels to mosquitoes, keyhole limpets to mosiansin, bovine serum albumin, and bovine thyroglobulin. Examples include Complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • Examples of the immunized animal include non-human mammals such as rabbits, goats, mice, rats, and hamsters.
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 / zg per animal.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal 3 to 7 days after each administration, and the reactivity of the serum with the antigen is determined by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): Medical Shoin Published (1976)].
  • lymphocytes are excised from the immunized animal according to a known method (Antibodies' Laboratory Manual), and the lymphocytes and myeloma cells are fused.
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the serum.
  • the monoclonal antibody is prepared by fusing the antibody-producing cells with myeloma cells derived from a non-human mammal to produce a hybridoma, and culturing the hybridoma or administering the hybridoma to an animal to cause the cells to develop ascites carcinoma. It can be prepared by separating and purifying the culture solution or ascites.
  • Antibody-producing cells are collected from antigen-administered non-human mammalian spleen cells, lymph nodes, peripheral blood, and the like.
  • Myeloma cells include 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (P3-Ul), a cell line obtained from mice [Eur. J. Immunol. , 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol., 123, 1548 (1979) ], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)], and any other myeloma cells that can be propagated in vitro. According to known methods for culturing and passaging of these cell lines (anti body Ichizu- ⁇ la Boratori one 'Manual), to ensure a 2 x lO 7 or more cell numbers until cell fusion.
  • a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol 1000 (PEG-1000) is added to fuse the cells, and the cells are suspended in the medium. Cloudy.
  • MEM medium or PBS 1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monopotassium phosphate, 7.65 g of salt, 1 liter of distilled water, pH 7.2), etc.
  • a HAT medium ⁇ normal medium [glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 mM) in RPMI-1640 medium) so that only the desired fused cells can be selectively obtained.
  • a sample that reacts with the antigen protein but does not react with the non-antigen protein is selected by enzyme immunoassay. Then, cloning is performed by the limiting dilution method, and a monoclonal antibody-producing hybridoma strain having a stable and high antibody titer is selected by the following enzyme immunoassay.
  • the antigen protein or cells expressing the antigen protein are coated on a plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained by the above method is reacted as the first antibody.
  • the plate After the first antibody reaction, the plate is washed and the second antibody is added.
  • the second antibody is an antibody capable of recognizing the first antibody, which is labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound. Specifically, if a mouse was used for the production of the hybridoma, an antibody capable of recognizing mouse immunoglobulin is used as the second antibody.
  • a reaction according to the substance labeled with the second antibody is performed, and the antibody is selected as a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically reacts with the antigen.
  • anti-Fit-1 monoclonal antibody examples include monoclonal antibody KM1732 belonging to mouse IgGl subclass produced by Hypri-Doma KM1732 (FERM BP-5698) described in W098 / 22616, Hypri-Doma KM1730 (FEM BP-5697) produces a monoclonal antibody KM1730 belonging to the mouse IgG2b subclass and a hybridoma KM1731 (FERM BP-5718) produces the monoclonal antibody KM1731 belonging to the mouse IgG2a subclass and a hybridoma KM1748 (FERM BP-5699) Monoclonal antibody KM1748 belonging to mouse IgG2b subclass and monoclonal antibody K1750 belonging to mouse IgG2b subclass produced by hybridoma KM1750 (FERM BP-5700) are exemplified.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from a culture solution obtained by culturing hybridoma cells or Monoclonal mice were given to mice aged 8 to 10 weeks or nude mice that had been treated with squirrel (intraperitoneally administered with 0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpen decane (Pristane) and bred for 2 weeks).
  • the antibody-producing hybridoma cells can be prepared by intraperitoneal administration of ascites and separation and purification from ascites cancerous ascites.
  • Methods for separating and purifying monoclonal antibodies include centrifugation, salting out with 40-50 saturated ammonium sulfate, caprylic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A- or G-column or gel. There is a method in which chromatography using a filtration column or the like is performed alone or in combination. By this method, an IgG or IgM fraction can be collected and a purified monoclonal antibody can be obtained.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a monoclonal antibody typing kit or the like.
  • the protein content can be calculated by the Lowry method or the absorbance at 280 nm.
  • Antibody subclasses refer to isotypes within a class. In mice, IgGl, IgG2a, IgG2b, and IgG3, and in humans, IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4, but especially mouse IgGl, IgG2a, and human IgGl types Has a complement-dependent cytotoxic activity (hereinafter, CDC activity) and an antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter, ADCC activity), and is useful for therapeutic applications.
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • the humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding the C region of human antibody, CH and CL, are incorporated. It was constructed by inserting each of the encoding genes.
  • the C region of the human antibody for example, a C region of any human antibody such as C ⁇ 1 or C ⁇ 4 for a human antibody H chain and C for a human antibody L chain can be used.
  • the gene encoding the C region of the human antibody chromosomal DNA consisting of exon and intron can be used, and cDNA can also be used. Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the human antibody C region. For example, PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Promoters and enhancers used in expression vectors for animal cells include the initial promoters and enhancers for SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moroni-LTR Promoter for Mouse Leukemia Virus Yuichi and Enhancer [Biochem. Biophys. Res. Cons., 149, 960 (1987)], and the promotion of immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and Enhansa [Cell, 33, 717 (1983)].
  • the vector for expressing a humanized antibody can be either a type in which the antibody H chain or L chain is present on a separate vector or a type in which the antibody is present on the same vector (tandem type). Tandem humanized antibody in terms of ease of construction of an antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, and balance of expression of antibody H and L chains in animal cells. Expression vectors are preferred [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies for example, VH and VL of a mouse anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody, are obtained as follows.
  • MRNA is extracted from cells producing an anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibody, such as mouse human VEGF receptor Flt-1 antibody-producing hybridoma, and cDNA is synthesized. Insert the synthesized cDNA into a phage or plasmid cell to prepare a cDNA library. From the library, a recombinant phage or recombinant plasmid having VH-encoding cDNA, and VL were obtained using a non-human animal antibody, for example, the C region or V region of a mouse antibody as a probe. Isolate the recombinant phage or recombinant plasmid containing the encoding cDNA, respectively.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is estimated from the nucleotide sequence.
  • a cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is inserted upstream of the gene encoding the CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector constructed in 2) above.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed. For example, to clone cDNA encoding VH and VL of non-human animal antibodies upstream of the gene encoding CH and CL of the human antibody in the chimeric antibody expression vector.
  • the recognition sequence of the restriction enzyme is provided in advance, and cMA coding for the V region of an antibody of a non-human animal is inserted into this cloning site via the synthetic DNA described below to obtain a human chimera.
  • An antibody expression vector can be produced.
  • Synthetic DNA consists of the nucleotide sequence at the 3 'end of the V region of an antibody of a non-human animal and the nucleotide sequence at the 5' end of the C region of a human antibody. It is manufactured using an MA synthesizer so that it has
  • VH and VL which form the antigen-binding site of the antibody, are composed of four relatively conserved framework regions (hereinafter referred to as FR regions) and three sequence-rich complements that link them.
  • FR regions four relatively conserved framework regions
  • CDRs sex determination regions
  • Sequences of Proteins of Immunological Interest US Dept. Health and Human Services, 1991: Hereafter, it is abbreviated as "sequences of proteins-of 'immunological' in evening rest.”
  • Each CDR amino acid sequence can be identified by comparing with the amino acid sequence of the known antibody V region [Sequences-of-proteins-of-imbiological-inrest]. .
  • CDNAs encoding VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be obtained as follows.
  • the FR amino acid sequence of the V region of the human antibody for transplanting the CDR of the V region of the antibody of the animal other than the target human is selected for each of VH and VL.
  • the FR amino acid sequence of the V region of the human antibody any amino acid sequence of the FR of the V region derived from a human antibody can be used.
  • the amino acid sequence of the FR of the V region of the human antibody registered in the Protein Data Bank the common amino acid sequence of each subgroup of the FR of the V region of the human antibody [sequences of proteins.
  • high homology preferably 65, with the amino acid sequence of the V region of the target non-human animal antibody is desired. It is desirable to have a homology of at least%.
  • the MA sequence encoding the amino acid sequence of FR in the V region of the selected human antibody and the DNA sequence encoding the amino acid sequence of the CDR in the V region of the antibody of the non-human animal antibody of interest are ligated to obtain VH, Design a DNA sequence that encodes the amino acid sequence of each VL.
  • the amplified fragment is subcloned into an appropriate vector, its nucleotide sequence is determined, and a plasmid containing cDNA encoding the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is prepared. get.
  • a plasmid containing cDNA encoding the amino acid sequence of the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is prepared.
  • synthetic DNA consisting of about 100 bases, annealing and ligating them, the amino acid in the V region of each chain of the target human CDR-grafted antibody is synthesized.
  • a cDNA encoding the sequence can also be constructed.
  • a human CDR-grafted antibody has the activity of the original non-human animal by simply transplanting only the CDR of the V region of the target non-human animal antibody between the FRs of the V region of the human antibody. It is known that the activity is lower than that of the antibody [BI0 / TECHN0L0GY, 9, 266 (1991)]. Therefore, in the amino acid sequence of the FRs in the V region of the human antibody, the amino acid residues involved in direct binding to the antigen, the amino acid residues interacting with the CDR amino acid residues, or the three-dimensional structure of the antibody Amino acid residues that have a possibility of being involved in maintenance have been modified to amino acid residues found in antibodies of non-human animals to increase the activity.
  • the modification of the FR amino acid sequence in the V region of the selected human antibody can be achieved by performing the PCR described in 2 (5) above using various mutagenesis primers. After subcloning the amplified fragment after PCR into an appropriate vector, determine its nucleotide sequence, and obtain a vector containing the cDNA into which the desired mutation has been introduced (hereinafter referred to as an amino acid sequence-modified vector). You.
  • modification of the amino acid sequence of a narrow region can be performed by a PCR mutagenesis method using a mutagenesis primer consisting of 20 to 35 bases.
  • a sense mutation primer and an antisense mutation primer consisting of 20 to 35 bases containing the MA sequence encoding the modified amino acid residue were synthesized, and the amino acid in the V region to be modified was synthesized.
  • VH and VH of the human CDR-grafted antibody obtained in 2 (5) and 2 (6) above the gene encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector of 2 (1) above, respectively.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence is introduced at the 5 ′ end and 3 ′ end of the synthetic DNA. By doing so, they can be inserted upstream of the gene encoding the C region of the desired human antibody so that they can be expressed in an appropriate form.
  • the expression vector of human type knull antibody described in 2 (3) above and the expression vector of human CDR-grafted antibody described in 2 (7) above were obtained.
  • these modified vectors were introduced into COS-7 cells (ATCCCRL1651) to transiently express humanized antibodies [Methods in Nucleic Acids Res.], CRC Press , p.283, 1991], and the activity can be measured.
  • Methods for introducing an expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res.], CRC Press, p.283, 1991], Lipofexion Natl. Acad. Sci., 84, 7413 (1987)].
  • the activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by the enzyme immunoassay (ELISA method) described in 1 (4) above.
  • a trait capable of stably producing a humanized antibody by introducing the expression vector (2) of the human chimeric antibody and the expression vector (2) of the human CDR-grafted antibody into an appropriate host cell.
  • a converted strain can be obtained.
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include an electrolysis method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any host cell that can express the humanized antibody can be used.
  • mouse SP2 / 0-Agl4 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC CRL1580
  • CH0 cells deficient in the dihydrofolate reductase gene hereinafter referred to as DHFR gene
  • DHFR gene CH0 cells deficient in the dihydrofolate reductase gene
  • a transformant which stably produces a humanized antibody is selected on an RPMI 1640 medium containing G418 and FCS according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • a humanized antibody By culturing the obtained transformant in a medium, a humanized antibody can be produced and accumulated in the culture solution.
  • the activity of the humanized antibody in the culture solution is measured by the method described in 1 (4) above.
  • the transformed strain can increase the amount of humanized antibody produced by using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-2577891.
  • the humanized antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Antibodies; A Laboratory Manual, Co Id Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988;
  • purification methods used for ordinary proteins can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration.
  • the molecular weight of H-chain, L-chain of purified humanized antibody or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting ( Antibodies, Chapter 12, 1988).
  • the reactivity of the purified humanized antibody and the inhibitory activity of the humanized antibody on VEGF can be measured by the method described in the above 1 (4).
  • An antibody fragment is generated by treating the above antibody with an enzyme.
  • the enzyme include papain and tribcine.
  • DNA encoding the Fab, Fab 'or F (ab') 2 fragment of the anti-human VEGF receptor Flt-1 antibody is inserted into an expression vector for animal cells, and It can be expressed by introduction into cells to produce Fab, Fab 'or F (ab') 2 .
  • the antibody fragment to be produced can be produced by a combination of gel filtration, ion exchange, affinity chromatography and ultrafiltration.
  • Purified Fab, Fab ', F (ab,) 2 molecular weights can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting (Antibodies, Chapter 12, 1988).
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody of a non-human animal or the human CDR-grafted antibody according to the above 2 (2), 2 (5) and 2 (6), is a vector for expressing a single-chain antibody.
  • an expression vector for a single-chain antibody of a non-human animal antibody or a single-chain antibody of a human CDR-grafted antibody can be constructed by inserting the antibody.
  • any antibody can be used as long as it can incorporate and express a non-human animal antibody or a cDNA encoding the VH and VL of a human CDR-grafted antibody. Can be.
  • a cDNA encoding a single-chain antibody consisting of VH-P-VL or VL-P-VH (P is a peptide linker) is added to the selected expression vector at an appropriate promoter and downstream of the signal peptide.
  • P is a peptide linker
  • the cDNA encoding the single-chain antibody can be obtained by combining a cDNA encoding VH and a cDNA encoding VL with a synthetic DNA encoding a peptide linker having recognition sequences for appropriate restriction enzymes at both ends. It can be obtained by linking. It is important to optimize the linker peptide so that its addition does not interfere with the binding of VH and VL to the antigen, such as those shown by Pantoliano et al. [Biochemistry, 30, 10117 (1991)]. ] Or a modified version thereof can be used.
  • the disulfide-stabilized antibody corresponds to one amino acid residue at the appropriate position in the cDNA coding for VH and VL of a non-human animal antibody or the cDNA coding for VH and VL of a human CDR-grafted antibody.
  • DNA sequence corresponding to the cysteine residue It can be prepared by modifying the sequence, expressing and purifying, and then forming a disulfide bond. Amino acid residues can be modified into cysteine residues by the mutagenesis method using PCR described in the above 2 (5).
  • a disulfide-stabilized antibody H-chain expression vector and a disulfide-stabilized antibody L-chain expression vector are constructed. can do.
  • any vector can be used as long as it can integrate and express cDNA encoding modified VH and modified VL. For example, PAGE107
  • E. coli, yeast, animal cells, etc. are used as hosts for expressing the disulfide stabilized antibody L chain expression vector and the disulfide stabilized antibody H chain expression vector used to form the disulfide stabilized antibody. Appropriate ones can be selected from among them, but in that case, it is necessary to select an appropriate expression vector for each host. Also, by inserting a cDNA encoding an appropriate signal peptide into an expression vector, the disulfide-stabilized antibody can be secreted extracellularly, transported to the periplasmic region, or retained inside the cell. it can.
  • a transformant producing a stabilized antibody H chain or a disulfide stabilized antibody L chain can be obtained.
  • Antibody fragments single-chain antibodies, disulfide-stabilized antibody H chains, or disulfide-stabilized antibody L chains, which are insoluble and exist as granules (inclusion 'body), dissolve cells and isolate granules For example, after repeated solubilization with guanidine-hydrochloric acid, various kinds of chromatography or gel filtration are carried out.
  • the activity of the purified antibody fragment and single-chain antibody can be measured by the method described in 1 (4) or the like.
  • the purified disulfide-stabilized antibody H-chain and disulfide-stabilized antibody L-chain are mixed with each other, and then disulfide is performed by an operation that leads to an active structure [refolding operation, Molecular Immunology, 32, 249 (1995)].
  • the active disulfide-stabilized antibody can be purified by antigen affinity chromatography or ion exchange chromatography or gel filtration.
  • the activity of the disulfide-stabilized antibody can be measured by the method described in 1 (4) or the like. 4.
  • a fusion antibody obtained by fusing a radioisotope, protein, low-molecular-weight drug, or the like to the antibody or the antibody fragment used in the present invention chemically or by genetic engineering can also be used as a derivative of the antibody.
  • a fusion antibody in which an antibody and a toxin protein are chemically fused can be prepared, for example, according to Anticancer Research, 11, 2003 (1991); Nature Medicine, 3, 350 (1996).
  • a fusion antibody in which an antibody is fused with a protein such as a toxin or cytokine by genetic engineering is described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826 (1996).
  • a fusion antibody obtained by chemically fusing an antibody with a small molecule anticancer agent can be prepared, for example, according to Science, 261,212 (1993).
  • a fusion antibody in which an antibody and a radioisotope are chemically fused can be prepared according to, for example, Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 3, 60 (1990); Anticancer Research, 11, 2003 (1991).
  • anti-Fit-1 antibody the antibody fragment or a fusion antibody thereof with another molecule binds to the human VEGF receptor Fit-1, and expresses the Fit-1 expressing cell through the effector activity of an antibody such as ADCC or CDC. Is thought to be useful for the treatment of leukemia and the like.
  • the pharmaceutical containing the antibody of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers to obtain a pharmaceutical preparation. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation manufactured by any method well known in the art.
  • intravenous administration can be preferably mentioned.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p- It can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as stove beef flavor and peppermint as additives.
  • sugars such as sucrose, sorbitol, fructose
  • glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p- It can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as stove beef flavor and peppermint as additives.
  • preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as stove beef flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy It can be produced using a binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the propellant is prepared using the compound itself or a carrier which does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 mg / kg to 8 mg / kg per adult per day.
  • the monoclonal antibody against the VEGF receptor Fit-1 shown in the present invention reacts with leukemia cells at a high rate and can be used as a diagnostic or therapeutic agent for leukemia.
  • the method of examining the antitumor effect of the antibody used in the present invention on leukemia cells includes, as in vitro experiments, a method for measuring complement-dependent cytotoxicity (CDC activity), ) Measurement methods and the like, and in vivo experiments include antitumor experiments using tumor systems in experimental animals such as mice.
  • Methods for immunologically detecting leukemia cells using antibodies against VEGF receptor Flt-1 include fluorescent antibody method, immunoenzymatic antibody method (ELISA), and radioactive substance-labeled immunological antibody method.
  • RIA immunohistochemical staining
  • immunohistochemical staining such as immune cell staining (ABC, CSA, etc.
  • stamp lotting immunoprecipitation
  • enzyme immunoassay described above sandwich ELISA method [Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific, 1987), Seikagaku experiment course 5 immunobiochemical research method (Tokyo Kagaku Dojin, 1986)] and the like can be used.
  • Optical geometry can be performed using the method described in Monoclonal Antibodies: Principles and practice Third edition (Academic Press, 1996), Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific, 1987), and the like.
  • an anti-immunoglobulin labeled with a fluorescent substance such as fluorescin / isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin is prepared by reacting the monoclonal antibody of the present invention with isolated cells or tissues.
  • FITC fluorescin / isothiocyanate
  • An antibody is a method of measuring a fluorescent dye by a flow cytometer after reacting a binding fragment.
  • ELISA immunoenzyme-linked immunosorbent assay
  • antibodies are reacted with isolated cells or their lysates, tissues or their lysates, cell culture supernatants, serum, pleural effusion, ascites, and eye fluids, and then peroxidase and biotin.
  • an anti-imnoglobulin antibody or a binding fragment labeled with an enzyme such as described above the coloring dye is measured with an absorptiometer.
  • the radiolabeled immunoassay involves reacting antibodies with isolated cells or their lysates, tissues or their lysates, cell culture supernatants, serum, pleural effusion, ascites, eye fluids, etc. After reacting a labeled anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment, measurement is performed using a scintillation counter or the like.
  • the immunocytostaining and immunohistochemical staining methods involve reacting an antibody with isolated cells or tissues, and then labeling fluorescent substances such as fluorescin'isothiosinate (FITC), and enzyme labels such as peroxidase and biotin. After reacting the anti-immunoglobulin antibody or the binding fragment subjected to the above, the reaction is observed using a microscope.
  • fluorescent substances such as fluorescin'isothiosinate (FITC)
  • enzyme labels such as peroxidase and biotin.
  • Western blotting refers to the isolation of microorganisms, animal cells or insect cells that express Flt-1. After fractionating the cell extract by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], the gel is blotted on a PVDF membrane or a trocellulose membrane, and the gel is applied to the membrane.
  • the reaction is carried out by reacting the monoclonal antibody of the present invention with a fluorescent substance such as FITC, or an anti-mouse IgG antibody or a binding fragment labeled with an enzyme such as peroxidase or biotin.
  • Immunoprecipitation refers to the reaction of a cell extract of a microorganism, animal cell or insect cell expressing Fit-1 with the monoclonal antibody of the present invention, and then the ability to specifically bind to immunoglobulin such as protein G-sepharose.
  • the carrier is added to precipitate the antigen-antibody complex.
  • the sandwich ELISA method is a monoclonal antibody of the present invention.
  • one monoclonal antibody is adsorbed on a plate in advance, and the other monoclonal antibody is a fluorescent substance such as FFTC or peroxida.
  • Label with enzymes such as enzyme and biotin.
  • This method involves reacting a cell extract of a microorganism, animal cell, or insect cell expressing Flt-1 on an antibody adsorption plate, and then reacting with a labeled monoclonal antibody to perform a reaction according to the labeling substance.
  • Fig. 1 Reactivity of anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibodies KM1730 and KM1732 with human cell lines K0PN-K, G361, CAPAN-1, HUVEC, HSB-2 and Jurkat by flow cytometry. The result of the analysis is shown.
  • Hypri-Doma KM1732 (FERM BP-5698), which produces anti-Fit-1 monoclonal antibody, hybridoma KM1730 (FERM BP-5697), Hypri-Doma KM173KFERM BP-5718), Hypridoma KM1748 (FEM BP-5699), and KM1750 (FERM BP-5700) was injected intraperitoneally into 8-week-old nude female mice (Balb / c) treated with pristane at 5 to 20 ⁇ 10 6 cells / animal, respectively. After 10 to 21 days, Hypri-Doma became ascites carcinoma.
  • Ascites is collected from mice with accumulated ascites (1-8 ml / animal), and the solid content is removed by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes), followed by force prillic acid precipitation (Antibody's laboratory). 'Manual) and used as purified monoclonal antibodies.
  • the antibody class of the monoclonal antibody is a subcluster typing kit [Zimet
  • KM1732 is mouse IgGl
  • KM1731 was a mouse IgG2a subclass
  • KM1748 was a mouse IgG2b subclass
  • KM1750 was a monoclonal belonging to the mouse IgG2b subclass.
  • small cell lung cancer SBC-3 [Cancer Research, 54, 1511 (1994) ⁇ ], SBC-5 [Cancer Research, 54, 1511 (1994)], squamous cell lung cancer Calu-1 [ Cancer Research, 54, 1511 (1994)], PC-10 [Cancer Research, 54, 1511 (1994)], Lung adenocarcinoma PC-7 [Cancer Research, 54, 1511 (1994)], HLC-1 [Cancer Research , 54, 1511 (1994)], colorectal cancer Colo205 (ATCC CCL-222), uterine cancer He la (ATCC CCL-2), ovarian cancer MCAS (Human Science Resources Foundation JCRB 0240), 0VCAR-3 (from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) Purchase), gastric cancer MKN-1 [Cancer Research, 46, 4438 (1986)], Katol 11 [Cancer Research, 46, 4438 (1986)], breast cancer R27 [Anticancer Research, 12, 1121 (1992)], MCF7 (ATCC) HTB
  • vascular endothelial cells derived from human umbilical vein (purchased from Clonetics) were used as normal cells.
  • the reactivity of the anti-human VEGF receptor F-1 monoclonal antibody obtained in Example 1 with respect to a human cancer cell line was confirmed using an immunocytostaining method according to the following procedure.
  • the anti-human VEGF receptor Fit-1 monoclonal antibodies KM1730 and KM1732 reacted with HUVEC-5620 cells expressing the human VEGF receptor as compared to the KM1135 control antibody.
  • the leukemia cells K0PN-K CCRE-CEM, HSB-2 and JURKAT also reacted with the anti-human VEGF receptor FU; -1 monoclonal antibodies KM1730 and KM1732 as compared to the KM1135 control antibody.
  • the anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibodies KM1730 and KM1732 did not react at all with G361 cells and CAPAN-1 cells.
  • Table 1 summarizes the analysis results of a total of 41 cell lines examined in the same manner.
  • KM1730 and KM1732 reacted with the 12 cell lines Jurkat, HSB-2, KOPN-K, and CCRF-CEM for 12 leukemia cells.
  • KOPN-K and CCRF-CEM showed the same reactivity as HUVEC, and Jurkat and HSB-2 showed higher reactivity than HUVEC.
  • Three of the four leukemia cells that reacted (Jurkat, HSB-2, CCRF-CEM) were T cell leukemias, and one (KOPN-II) was a non-T cell non-B cell leukemia. Met. T-cell leukemia responded at a high rate with three of the five types examined.
  • epithelial cell-derived tumors such as lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, colorectal cancer, uterine cancer, ovarian cancer, stomach cancer, breast cancer, Teng cancer, and small cell lung cancer derived from the neuroectodermal system, melanoma
  • a total of 24 cancer cell lines were examined for neuroblastoma and glioblastoma, but no anti-VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibodies KM1730 and KM1732 reacted at all.
  • the present invention provides a diagnostic and therapeutic agent for leukemia using a monoclonal antibody that specifically binds to human VEGF receptor Fit-1.

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Description

明 細
白血病の診断薬および治療薬
技術分野
本発明は、 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体を用いた白血病の診断方法、 ならびに抗 ヒ卜 VEGF受容体 Flt-1抗体を有効成分とする診断薬および治療薬に関する。
背景技術
血管新生は、脊椎動物の胎生期における循環器系の形成や多くの組織の構築に重要 な役割を果たすとともに、 成熟個体（雌） においても性周期における黄体形成、 子宮 内膜の一過性の増殖、 胎盤形成などに密接に関与する。 さらに、 病的状態としては、 固形腫瘍の増殖、 転移形成、 糖尿病性網膜症、 慢性関節リュウマチの病態形成、 促進 に血管新生が深く関与している [J. Biol . Chem. , 267, 10931 ( 1992)]。 血管新生を 誘導する因子としては、 Vascular permeability factor (VPF) /Vascular endothelial growth factor (VEGF)が上記発生段階における血管新生および病的な状態における血 管新生において最も重要な因子として知られている [Advances in Cancer Research, 67, 281 ( 1995)]。
血管新生を伴う疾患の中で、 固形腫瘍の増殖、 転移形成、 糖尿病性網膜症、 慢性関 節リュウマチの病態形成に VEGFが深く関与していることが報告されている。 固形腫 瘍については、 これまでに腎癌 [Cancer Research, 54, 4233 ( 1994)]、 乳癌 [Human Pathology, 26, 86 ( 1995)]、 脳腫瘍 [J. Clinical Investigation, 91, 153 ( 1993)]、 消化器癌 [Cancer Research, 53, 4727 ( 1993)]、 卵巣癌 [Cancer Research, 54, 276 ( 1994 ) ]などの多くのヒト腫瘍組織において VEGFが産生されていることが報告されて いる。
ヒトの VEGF受容体としてはこれまでに受容体型チロシンキナーゼフアミリーに属 する第 1の受容体である Fit- l(fms-like tyrosine kinase) [Oncogene, 5, 519 ( 1990) ; Science, 255, 989 ( 1992) ]および第 2の受容体である KDR( kinase insert domain- containing receptor) [W092/ 14748, Priolity Feb. 22， 1991 ; Biochem. Biophys. Res. Comm. , 187, 1579 ( 1992)]の 2種が報告されている。 ヒト型 VEGF受容体 KDRのマウ ス型ホモログは Flk- l [Proc. Natl. Acad. Science, USA, 88, 9026 ( 1991 ) ; W094/11499 Priolity Nov. 13, 1992; Cell, 72, 835 ( 1993)]と命名されている。 F - 1 および KDR/Flk-1の細胞外ドメインは 7個のィムノグロブリン様ドメインよりなり、 細胞内 ドメインはチロシンキナーゼドメインを有する分子量 180〜200キロダルトンの膜夕 ンパクよりなる。 VEGFは F It- 1および KDR/Flk-1にはそれそれ KD値が 20 pMおよび W
75 pMで特異的に結合する。 F - 1および KDR/Flk- 1は血管内皮細胞に特異的に発現 していると報告されている [Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 90, 7533 ( 1993) ; Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 90, 8915 ( 1993)]。 Flt-1については、 ヒト単球に発現し、 細胞の 遊走に関与することが報告されている [Blood, 87, 3336 ( 1996)]。
Flt-1の様々な疾患における発現については、 ヒトグリオブラストーマ組織の腫瘍 血管内皮細胞 [Nature, 359, 845( 1992)] 、 ヒト消化器癌組織の腫瘍血管内皮細胞
[Cancer Research, 53, 4727 ( 1993)] で、 正常組織の血管内皮細胞に比べ flt-1 mRNA の発現が上昇していることが報告されている。 さらに、 慢性関節リュウマチ患者の関 節の血管内皮細胞においてもィン 'サイチュ 'ハイプリダイゼ一シヨン （in situ hybridization ) により flt-1 mRNA の発現が認められることが報告されている
[Journal of Experimental Medicine, 180, 341 ( 1994) ] 。 これらの結果は、 腫瘍 血管新生において VEGF- VEGFレセプ夕一 FU-1系が重要な役割を果たしていることを 強く示唆するものである。 F - 1は VEGFが結合すること、細胞内ドメインが自己リン 酸化されることが報告されているが [Science, 255, 989 ( 1992)] 、 詳しい機能につ いては不明である。 しかし、 fit- 1遺伝子を破壊した flt-1ノックアウトマウスは発 生初期の血島形成や、 それに続く血管新生において、 血管内皮細胞の形態異常により 血管構築が異常となり胎生 8.5〜9.5日齢で死亡することから、 Flt-1は血管新生にお ける血管内皮細胞の管腔形成に必須の機能を果たしていると推定されている [Nature， 376, 66 ( 1995 )] 。
以上のように、 VEGFおよび VEGF受容体 Fit- 1は、 固形腫瘍の増殖もしくは転移形 成に関与することが報告されているが、 白血病との関連についてはこれまで報告され ていない。
発明の開示
造血系細胞が腫瘍化した疾患である白血病を診断および治療するための有用な方 法が求められている。
本発明者らは、 VEGF受容体 Flt-1 に対する抗体が白血病細胞株に高率に反応する ことを初めて見い出し、 本発明を完成させた。即ち、 本発明は以下の （1 ) 〜（ 1 8 ) に関する。
( 1 ) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体を有効成分として含有する白血病の診断薬。
( 2 ) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴 とする上記 （ 1 ) 記載の診断薬。
( 3 ) 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体が、 30、 KM173U KM1732, KM1748およ び KM1750からなる群より選ばれる抗体である上記 （ 1) 記載の診断薬。
(4) 抗ヒ卜 VEGF受容体 Flt-1抗体が、 ヒト化抗体である上記 （ 1 ) 記載の診 断薬。
(5) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab, Fab'、 F(ab' )2、 一本鎖抗体または ジスルフィ ド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である上記（ 1)記載の診断薬。
(6) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分子 の薬剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である上記（1)記載の診断薬。
(7) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体を有効成分として含有する白血病の治療薬。
(8) 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴 とする上記 （7) 記載の治療薬。
(9) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 KM1730、 KM173K KM1732, KM1748およ び KM1750からなる群より選ばれる抗体である上記 （ 7 ) 記載の治療薬。
( 10) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 ヒト化抗体である上記 （ 7 ) 記載の 治療薬。
( 11) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab、 Fab'、 F(ab，）2、 一本鎖抗体およ びジスルフィ ド安定化抗体のいずれかであることを特徴とする上記（7)記載の治療 薬。
( 12) 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分 子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である、 上記 （7)記載の治 療薬。
( 13) 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体を用いる、 白血病の診断方法。
( 14) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特 徴とする上記 （ 13) 記載の白血病の診断方法。
( 15) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 KM1730、 K 173U KM1732, KM1748お よび KM1750からなる群より選ばれる抗体である上記 （13) 記載の白血病の診断方 法。
( 16) 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体が、 ヒト化抗体である上記 （ 13 ) 言己載 の白血病の診断方法。
( 17) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab、 Fab'、 F(ab，）2、 一本鎖抗体およ びジスルフィ ド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である上記（13)記載の白 血病の診断方法。
( 18) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分 子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である、 上記 （ 1 3 ) 記載の 白血病の診断方法。
本発明で使用される抗体は、 VEGF受容体 Flt-1 (以下、 単に F - 1と記す） に結合 することができ、 かつ白血病の診断あるいは治療効果を有するものであれば、 いかな るものでもよい。 本発明で使用される抗 Fit- 1抗体は、 公知の手段 [アンティボディ —ズ ·ァ ·ラボラトリ一 ·マニュアル、 コールド 'スプリングハ一バー ·ラボラトリ 一 (Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 、 以 下、 アンチボディ一ズ ·ァ ·ラボラトリ一 'マニュアルと記す] を用いてポリクロー ナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
本発明で使用される抗 F - 1抗体として、 ポリクローナルまたはモノクローナル抗 体のいずれも用いることができるが、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイプリ ドーマにより産生される抗 体、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝 子組換え抗体およびヒト抗体をあげることができる。
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、以下に述べる製造法によって確立した ものが好適なものとしてあげられる。
すなわち、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1タンパク質を抗原として調製し、 該抗原を免疫 した動物より抗原特異性をもつ形質細胞を誘導し、 さらに、 それと骨髄腫細胞とを融 合させてハイプリ ドーマを調製し、 該ハイプリ ド一マを培養するか、 あるいは該ハイ プリ ドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、 精製することにより取得された、 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノクローナル抗体をあ げることができる。
本発明で使用される遺伝子組換え抗体としては、上記本発明のモノクローナル抗体 を遺伝子組換え技術を用いて改変したものであげられるが、具体的にはヒト化抗体、 抗体断片などをあげることができる。 該抗体において、 抗原性が低く、 血中半減期の 延長されたものは、 治療薬として好ましい。
本発明で使用されるヒ ト化抗体は、 ヒ ト型キメラ抗体およびヒ ト型 CDR (Complementary Determining Region;相補性決定領域 以下、 CDRと記す） 移植抗体 を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体可変領域重鎖（以下、 VHと称す）およ び可変領域軽鎖 （以下、 VL と称す） とヒト抗体の定常領域重鎖 （以下、 CH と称す） およびヒト抗体の定常領域軽鎖 （以下、 CLと称す） とからなる抗体を意味する。 本発明で使用されるヒト型キメラ抗体は、 ヒト VEGF受容体 F - 1に結合するモノ ク口一ナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取 得し、 ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現べ クタ一にそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現べクタ一を構築し、動物細胞へ導入 することにより発現させ製造することができる。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト抗体の VHおよび VLの CDRをヒト以外の動物の抗体の CDR配列でそれぞれ置換した抗体を意味する。
本発明で使用されるヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1に結合する、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列で任意のヒト抗体の VHおよび VLの CDR配列をそれぞれ置換した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒ卜抗体の CHおよ びヒト抗体の CL をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現べクタ一にそれぞれ挿 入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させるこ とにより製造することができる。
本発明で使用されるヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR 移植抗体のヒト抗体部分 はいずれのィムノグロブリン（Ig)クラスに属するものでもよいが IgG 型のものが好 適であり、 IgG型に属する IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4等のィムノグロブリンの C領域の いずれも用いることができる。
ヒト抗体は、 元来、 ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、 最近の遺伝子ェ 学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライ ブラリーおよびヒト抗体産生トランスジエニック動物から得られる抗体等も含まれ る。
ヒト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルス等 を感染させ不死化、 クロ一ニングすることにより、 該抗体を産生するリンパ球を培養 でき、 培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒ卜抗体ファージライブラリ一は、 ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ 遺伝子に挿入することにより Fab、 一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現さ せたライブラリ一である。 該ライブラリ一より、 抗原を固定化した基質に対する結合 活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを 回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、 2本の完全な H 鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。 ヒト抗体産生トランスジエニック動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動 物を意味する。 具体的には、 マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、 該 ES細胞を 他のマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニッ ク動物を作製することができる。 ヒト抗体産生トランスジエニック動物からのヒト抗 体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイプリ ドーマ作製方法 によりヒト抗体産生ハイプリ ドーマを得、 培養することで培養物中にヒト抗体を産生 蓄積させることができる。
本発明で使用される抗体断片は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1に対して結合性を示す抗 体断片である Fab (Fragment of antigen bindingの略） 、 Fab，、 F(ab，）2、 一本鎖抗 体（single chain Fv; 以下、 scFvと称す） およびジスルフィ ド安定化抗体（disulfide stabilized Fv; 以下、 dsFvと称す）を包含する。
Fabは、 IgGのヒンジ領域で 2本の H鎖を架橋している 2つのジスルフィ ド結合の 上部のぺプチド部分を酵素パパィンで分解して得られた、 H鎖の N末端側約半分と L 鎖全体で構成された、 分子量約 5万の抗原結合活性を有するフラグメントである。 本発明で使用される Fabは、 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体をパパイン処理して得 ることができる。 または、 該抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体の Fab断片をコードする DNAを動物細胞用発現べクタ一に挿入し、 該ベクターを動物細胞へ導入することによ り発現させ、 Fabを製造することができる。
Fab'は、 上記 F(ab' )2のヒンジ間のジスルフィ ド結合を切断した分子量約 5万の抗 原結合活性を有するフラグメントである。
本発明で使用される Fab'は、 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体を還元剤ジチオスレィ トール処理して得ることができる。 または、 該抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体の Fab' 断片をコードする DNAを動物細胞用発現べクタ一に挿入し、該ベクターを動物細胞へ 導入することにより発現させ、 Fab'を製造することができる。
F(ab' )2は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフィ ド結合の下部を酵素トリプシンで 分解して得られた、 2つの Fab領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10 万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明で使用される F(ab' )2は、抗ヒト VEGF受容体 FU- 1抗体をトリプシン処理し て得ることができる。 または、該抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体の F(ab' )2断片をコ一 ドする DNAを動物細胞用発現ベクターに挿入し、 該ベクターを動物細胞へ導入するこ とにより発現させ、 F(ab' )2を製造することができる。 一本鎖抗体 (scFv) は、 一本の VHと一本の VLとを適当なぺプチドリンカ一 （以下、 Pと称す） を用いて連結した、 VH—P— VLないしは VL— P— VHポリペプチドである。 本発明で使用される scFvに含まれる VHおよび VLは、 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノ クロ一ナル抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明で使用される一本鎖抗体は、 ヒト VEGF受容体 F - 1に結合する抗体を生産 するハイプリ ド一マより VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 一本鎖抗体発現 ベクターを構築し、 大腸菌、 酵母、 動物細胞あるいは昆虫細胞へ導入することにより 発現させ製造することができる。
ジスルフィ ド安定化抗体 （dsFv) は、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基を システィン残基に置換したポリべプチドをジスルフィ ド結合を介して結合させたも のをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiter らにより示された方法 [Protein Engineering, 7, 697 ( 1994)] に従って、 抗体の立体構造予測に基づいて 選択することができる。 本発明で使用されるジスルフィ ド安定化抗体に含まれる VH あるいは VLはマウス型抗ヒト VEGF受容体 F - 1モノクローナル抗体あるいはヒ卜型 CDR移植抗体のいずれをも用いることができる。
本発明で使用されるジスルフィ ド安定化抗体は、 ヒト VEGF受容体 F - 1に反応す る抗体を生産するハイプリ ドーマより VHおよび VLをコードする cMAを取得し、 適 当な発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ一を大腸菌、 酵母、 動物細胞あるいは昆虫 細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
融合抗体は、 上述の抗体に放射性同位元素、 蛋白質、 低分子の薬剤などを化学的あ るいは遺伝子工学的に融合させたものをいう。
本発明で使用される融合抗体は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1に結合する抗体に放射性 同位元素、蛋白質あるいは低分子の薬剤などを化学的に融合させることにより製造す ることができる。 また、 蛋白質との融合抗体については、 抗体をコードする cDNAに 蛋白質をコードする cDNAを連結させ、 適当な発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ 一を大腸菌、 酵母、 動物細胞あるいは昆虫細胞に発現させることにより製造すること ができる。
1 . 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノクローナル抗体の作製方法
( 1 ) 抗原の調製
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1を細胞表面に発現した細胞あるいはその細胞膜画分、 ま たは、 アミノ酸の長さの異なる細胞外領域を有する可溶性ヒト VEGF受容体 F - 1蛋 白質あるいは該蛋白質と抗体の Fc部分との融合蛋白質などがあげられる。
ヒト VEGF 受容体 Fit- 1 を細胞表面に発現する細胞としては、 NIH3T3-FU-1 細胞
[Cell Growth & Differentiation, 7, 213 ( 1996 )] があげられる。 ヒト VEGF受容 体 Flt-l をコー ドする全長あるいはその部分断片 cDNA [ Cell Growth & Differentiation, 7, 213 ( 1996)] を適当なベクターのプロモー夕一下流に揷入した 組み換え体ベクターを造成し、 それを宿主細胞に導入することにより得られたヒト VEGF受容体 Flt-l発現細胞を、適当な培地中で培養することにより細胞内あるいは培 養上清中にヒ卜 VEGF受容体 F - 1の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合 蛋白質として生産することができる。 また、 上述の蛋白質の部分配列を有するポリべ プチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによつても調製することができる。 宿主としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞など、 目的とする遺伝子を発現で きるものであれば、いずれでもよい。細菌としては、ェシエリヒア 'コリ (Escherichia coli) 、 バチルス 'ズブチリス (Bacillus subtilis) 等のェシエリヒア属、 バチル ス属等の細菌が例示される。 酵母としては、 サッカロミセス ' セレピシェ
(Saccharomyces cerevisiae; 、 シゾサヅカロミセス ·ホンべ (Schizosaccharomyces pombe) 等が例示される。 動物細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ細胞、 サル の細胞である COS細胞、 チャイニーズ ·ハムスターの細胞である CH0細胞等が例示さ れる。 昆虫細胞としては、 Sf9、 Sf21 (ファーミンジヱン社製） 、 High Five (インビ トロジェン社製） 等が例示される。
Flt-lをコードする DNAを導入するべクタ一としては、 該 DNAを組み込むことがで き、 宿主細胞で発現できるものであればいかなるベクタ一でも用いることができる。 細菌、 例えばェシエリヒア 'コリ (Escherichia coli) を宿主として用いる場合の 発現べクタ一としては、 プロモーター、 リボゾーム結合配列、 本発明の DNA、 転写終 結配列、場合によってはプロモー夕一の制御配列より構成されているのが好ましいが、 例えば、 市販の pGEX (フアルマシア社製）、 pET システム （ノバジェン社製） などが 例示される。
細菌への組換えべクタ一の導入方法としては、細菌に MAを導入する方法であれば、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)] 、 プロ トプラスト法 （特開昭 63- 248394) 等、 いずれの方法も用いられる。 酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3(ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等が用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれば、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. , 194, 182-187 ( 1990)]、 スフエロプラスト法 [Proc. Natl . Acad. Sci.， USA, 84, 1929 ( 1978)] 、 酢酸リチ ゥム法 [J. Bacteriol. , 153, 163 ( 1983)] 等、 いずれの方法も用いられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現べクタ一として、例えば、 PAGE107 [特 開平 3-22979 ； Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、 pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 ( 1987) ]等が用いられる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいかなるものを用い てもよいが、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の IE( immediate early) 遺伝子 のプロモー夕一、 SV40あるいはメタロチォネィンのプロモータ一等があげられる。ま た、 ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサ一をプロモ一夕一とともに用いてもよい。 動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に MAを導入する方法 であれば、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、 リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)] 等、 いずれの方法も用いられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント 'プロトコールズ 'イン ' モレキュラー 'バイオロジー、 サプルメント 1 〜3 4 ( Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-34) 、 バキュロウィルス 'イクスプレツシヨン ' ベクタ——ズ、 ァ ·ラボラ 卜リ—— ·マ二ユアノレ (Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual ) 等に記載された方法によって、 タンパク質を発現することがで きる。 すなわち、 以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを 昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得たのち、 さらに組換 えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 タンパク質発現昆虫細胞を取得する。
遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacII I (ともに インビトロジェン社製） 等が用いられる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるァゥ トグラファ ·カリフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス ·ウィルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) などが用いられる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと 上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法（特開平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法 [Pro Natl. Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)] 等が用いられる。
また、 ファーミンジェン社製バキュ口ゴールドス夕一夕ーキヅトなどを用いて組み 換えバキュロウィルスを作製したのち、 前述した Sf9、 Sf21あるいは High Five 等の 昆虫細胞に該組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産させることも でさる [Bio/Technology, 6, 47 ( 1988)] 。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 分泌生産、 融合蛋白質発現等が開発 されており、 いずれの方法も用いることができる。例えば、 モレキュラー ·クロ一二 ング 第 2版、コールドスプリングハーバ一ラボラトリー'プレス [Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab. Press New York ( 1989)；以下、 「モレキュ ラー 'クローニング 第 2版」 と記す] に記載されている方法に準じて行うことがで ぎる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中にヒト VEGF受容 体 F - 1の全長あるいは部分断片を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、 ヒ卜 VEGF受容体 Fit- 1の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質とし て製造することができる。
上記の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に 従って行われる。
大腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地 としては、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の 培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい （モ レキユラ一 ·クローニング 第 2版） 。 培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培 養などの好気的条件下、 15〜40°Cで 16〜96 時間行う。 培養期間中、 pHは 3.0~9.0 に保持する。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシゥ ム、 アンモニアなどを用いて行う。培養中は必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサ イクりン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地、 Eagleの MEM培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加し た培地等が用いられる。培養は、 通常 5%C02存在下、 35〜37 Cで 3〜7日間行い、 培養 中は必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM-FH培地 [ファーミンジェン （Pharmingen) 社製] 、 Sf900I ISFM [ライ フテクノロジ一ズ （Life Technologies) 社製] 、 ExCell400 、 ExCe 11405 [いずれ も JRHバイオサイエンシーズ （JRH Biosciences) 社製] 等が用いられる。 培養は、 25〜30°Cで 1〜4 日間行い、 培養中は必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
上記において、 動物細胞および昆虫細胞の培養において可能であれば、 ヒト VEGF 受容体 Fit- 1の全長あるいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として精製する ことを容易にするため、 血清無添加の培地を用いることが好ましい。
ヒト VEGF受容体 F - 1 の全長あるいは部分断片がそのままあるいは融合蛋白質と して宿主細胞内に蓄積された場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離し、 水系緩衝液 にけん濁後、 超音波法、 フレンチプレス法などにより細胞を破碎し、 その遠心分離上 清に該蛋白質を回収する。
さらに、 細胞内に不溶体を形成した場合には、 不溶体をタンパク質変性剤で可溶化 後、 夕ンパク質変性剤を含まないあるいは夕ンパク質変性剤の濃度が夕ンパク質が変 性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 タンパク質の立体構造を形成さ せることができる。
ヒト VEGF受容体 Fit- 1の全長あるいは部分断片がそのままあるいは融合蛋白質と して細胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を回収することができる。 単離精製については、 溶媒抽出、 有機溶媒による分別沈殿、 塩析、 透析、 遠心分離、 限外ろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 疎水性ク 口マトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 結晶化、 電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行うことができる。 部分配列を有するポリべプチドは、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボニル 法）、 tBoc法 （t-ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造するこ とができる。 また、 桑和貿易 （米国 Advanced chemTech社製） 、 パ一キンエルマージ ャパン （米国 Perkin- Elmer社製） 、 ァロカ （米国 Protein Technology Instrument 社製） 、 クラボウ （米国 Synthecell- Vega社製） 、 日本パーセプティブ ' リミテヅ ド (米国 PerSeptive社製） 、 島津製作所等のペプチド合成機を用いても製造すること ができる。
( 2 ) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記で得られた該蛋白質を抗原として動物を免疫する。 免疫する方法としては、 動 物の皮下、 静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、 抗原性の高いキ ャリアタンパク質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントととも に抗原を投与することが好ましい。
キャリアタンパク質としては、 スカシガイへモシァニン、 キ一ホールリンペットへ モシァニン、 牛血清アルブミン、 牛チログロブリン等があげられ、 アジュバンドとし ては、 フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant), 水酸化アルミ ニゥムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 マウス、 ラット、 ハムスターなどの非ヒト哺乳 動物があげられる。
抗原の投与は、 1回目の投与の後、 1〜2週間毎に 3〜10回行う。 抗原の投与量は 動物 1匹当たり 50~100 /z gが好ましい。各投与後、 3 〜7 日目に免疫動物の眼底静 脈叢あるいは尾静脈より採血し、 該血清の抗原との反応性について、 酵素免疫測定法 [酵素免疫測定法 （ELISA法） ：医学書院刊 （1976年） ] などで確認する。
そして、 該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、 抗体産生細胞の供給源 とする。
抗原の最終投与後 3 ~7日目に、免疫動物より公知の方法（アンチボディーズ'ァ ' ラボラトリー ·マニュアル） に準じてリンパ球を摘出し、 リンパ球と骨髄腫細胞とを 融合させる。
ポリクローナル抗体は、 該血清を分離、 精製することにより調製することができる。 モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融 合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養するか、 動物に投与して 該細胞を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を分離、 精製することにより調製するこ とができる。
抗体産生細胞は、 抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、 リンパ節、 末梢血などか ら採取する。
( 3 ) 骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスから得られた株化細胞である、 8-ァザグァニン耐性マ ウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8-Ul(P3-Ul ) [Eur. J. Immunol. , 6, 511 ( 1976)]、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269 ( 1978)] 、 P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunol . , 123, 1548 ( 1979)]、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256, 495 ( 1975)] など、 イン .ビトロ （in vitro) で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。 これらの細胞株の培養および継代については公知の方法 （アンチボディ一ズ ·ァ ·ラ ボラトリ一 'マニュアル） に従い、 細胞融合時までに 2 x lO7個以上の細胞数を確保 する。
( 4 ) 細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングラィ コール一 1000(PEG- 1000)などの細胞凝集性媒体を加え、 細胞を融合させ、 培地中に懸 濁させる。 細胞の洗浄には MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.83g、 リン酸 一カリウム 0.21g、 食塩 7.65g、 蒸留水 1 リヅトル、 pH7.2 ) などを用いる。 また、 融合細胞を懸濁させる培地としては、 目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、 HAT培地 {正常培地 [RPMI-1640 培地にグルタミン（1.5mM) 、 2-メルカプトエタノー ル （5 x lO—5M ) 、 ジェン夕マイシン（10〃g/ml ) および牛胎児血清 (FCS) (CSL社製、 10%) を加えた培地] にヒポキサンチン （10—4M ) 、 チミジン （1.5 X 10— ) およびァ ミノプテリン （4 lO"7M) を加えた培地 } を用いる。
培養後、 培養上清の一部をとり、 酵素免疫測定法により、 抗原蛋白質に反応し、 非 抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、 限界希釈法によりクローニン グを行い、下記の酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノ クローナル抗体産生ハイプリ ドーマ株を選択する。
酵素免疫測定法
抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などをプレートにコートし、ハイブ リ ドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として反応さ せる。
第一抗体反応後、 プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、 第一抗体を認識できる抗体に、 ピオチン、 酵素、 化学発光物質ある いは放射線化合物等で標識したものである。具体的には、 ハイプリ ドーマ作製の際に マウスを用いたのであれば、 第二抗体としては、 マウスィムノグロブリンを認識でき る抗体を用いる。
反応後、 第二抗体を標識した物質に応じた反応を行い、 抗原に特異的に反応するモ ノクロ一ナル抗体を生産するハイプリ ドーマとして選択する。
抗 Fit- 1モノクローナル抗体の具体例としては、 W098/22616に記載されているハイ プリ ドーマ KM1732(FERM BP-5698)が生産するマウス IgGlサブクラスに属するモノク 口一ナル抗体 KM1732、 ハイプリ ドーマ KM1730(FEM BP-5697)が生産するマウス IgG2b サブクラスに属するモノクローナル抗体 KM1730、 ハイプリ ドーマ KM1731(FERM BP- 5718)が生産するマウス IgG2aサブクラスに属するモノクローナル抗体 KM1731、 ハイ ブリ ドーマ KM1748(FERM BP- 5699)が生産するマウス IgG2bサブクラスに属するモノク ローナル抗体 KM1748、 および、 ハイプリドーマ KM1750(FERM BP- 5700)が生産するマ ゥス IgG2bサブクラスに属するモノク口一ナル抗体 K 1750などがあげられる。
( 5 ) モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、 ハイプリドーマ細胞を培養して得られる培養液、 またはプ リス夕ン処理〔2， 6, 10, 14-テトラメチルペン夕デカン（Pristane)0.5ml を腹腔内投与 し、 2 週間飼育する〕 した 8 〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、 モノクロ一 ナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水から、分離、 精製することにより調製できる。
モノクローナル抗体を分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40~50飽和硫酸 アンモニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロ一スカラム、 陰イオン 交換カラム、 プロティン A-または G-カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロ マトグラフィ一等を、 単独または組み合わせて行う方法があげられる。 この方法によ り、 IgGあるいは IgM画分を回収し、精製モノクローナル抗体を取得することができ る。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、 モノクローナル抗体タイピングキ ットなどを用いて行うことができる。 蛋白質量は、 ローリ一法あるいは 280nmでの吸 光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、 クラス内のアイソタイプのことで、 マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b 、 IgG3、 ヒトでは、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4があげられるが、 特にマ ウス IgGl、 IgG2a、 ヒト IgGlタイプは、 補体依存性細胞傷害活性 （以下、 CDC活性） および抗体依存性細胞傷害活性 （以下、 ADCC活性） を有し、 治療への応用上、 有用で ある。
2 . 組換え抗体の作製方法 （ 1 ) —抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1 ヒト化抗体の作 製方法
( 1 ) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト以外の動物の抗体からヒト化抗体を作製するために必要なヒト化抗体発現用 ベクタ一を構築する。 ヒト化抗体発現用べクタ一とは、 ヒト抗体の C領域である CH および CLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物 細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれそれ挿入す ることにより構築されたものである。
ヒト抗体の C領域としては、 例えば、 ヒト抗体 H鎖では Cァ 1や Cァ 4、 ヒト抗体 L鎖では C 等の任意のヒト抗体の C領域を用いることができる。 ヒト抗体の C領域 をコードする遺伝子としてはェキソンとィントロンより成る染色体 DNAを用いること ができ、 また、 cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現べクタ一としては、 ヒト 抗体 C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用 いることができる。 例えば、 PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)] 、 pAGE103 [J. Biochem. , 101 , 1307 ( 1987)]、 pHSG274 [Gene, 27, 223 ( 1984)] 、 pKCR [Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 78, 1527 ( 1981 )] 、 pSGl β d2-4 [Cytotechnology, 4, 173 ( 1990)] 等があげ られる。 動物細胞用発現べクタ一に用いるプロモー夕一とェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモ一夕一とェンハンサー [J. Biochem. , 101, 1307 ( 1987)] 、 モロニ —マウス白血病ウィルスの LTR プロモ一夕一とェンハンサー [Biochem. Biophys. Res. Comun. , 149, 960( 1987) ]、および免疫グロブリン H鎖のプロモ一夕一 [Cell , 41, 479 ( 1985 )] とェンハンサ一 [Cell , 33, 717 ( 1983 )] 等があげられる。
ヒト化抗体発現用べクタ一は、 抗体 H鎖、 L鎖が別々のベクター上に存在するタイ プあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いるこ とができるが、 ヒト化抗体発現ベクターの構築のしゃすさ、 動物細胞への導入のし易 さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L 鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタン デム型のヒ ト化抗体発現用べクタ一の方が好ましい [J. Immunol . Methods, 167, 271( 1994)] 。
( 2 ) ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得する。
抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体を産生する細胞、 例えば、 マウスヒ ト VEGF受容体 Flt-1抗体産生ハイプリ ドーマ等より mRNAを抽出し、 cDNAを合成する。 合成した cDNAを、 ファ一ジあるいはプラスミドなどのぺク夕一に挿入し、 cDNAライ ブラリーを作製する。 該ライブラリ一より、 ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス 抗体の C領域部分あるいは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコ一ドする cDNA を有する組換えファージあるいは組換えプラスミ ド、 および VLをコードする cDNAを 有する組換えファージあるいは組換えプラスミ ドをそれぞれ単離する。組換えファー ジあるいは組換えプラスミド上の目的とする抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定 し、 塩基配列より VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定する。
( 3 ) ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記 2 ( 1 ) で構築したヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコ 一ドする遺伝子の上流に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコ一ドする cDNA を挿入し、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、 キメラ 抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコ一ドする遺伝子の上流にあちかじ めヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングするため の制限酵素の認識配列を設けておき、 このクロ一ニングサイ 卜にヒト以外の動物の抗 体の V領域をコ一ドする cMAを下記に述べる合成 DNAを介して挿入することにより、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを製造することができる。合成 DNAは、 ヒト以外の動 物の抗体の V領域の 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の C領域の 5'末端側の塩基配列 とからなるものであり、 両端に適当な制限酵素部位を有するように MA合成機を用い て製造する。
( 4 ) ヒト以外の動物の抗体の CDR配列の同定
抗体の抗原結合部位を形成する VH及び VLは、 配列の比較的保存された 4個のフレ —ムワーク領域（以下、 FR領域と称す） とそれらを連結する配列の変化に富んだ 3個 の相補性決定領域 （CDR) から成っている [シーケンシズ' ォブ- プロテインズ' ォ フ、、- ィムノロジカメレ- イ ン夕レス 卜 ( Sequences of Proteins of Immunological Interest) ， US Dept. Health and Human Services, 1991：以下、 「シ一ケンシズ' ォ ブ- プロテインズ' ォブ' ィムノロジカル' イン夕レスト」 と略記する] 。 そして各 CDR アミノ酸配列 （CDR 配列）は、 既知の抗体の V領域のアミノ酸配列 [シーケンシ ズ- ォブ · プロテインズ · ォブ · ィムノロジカル · イン夕レスト]と比較することに より同定することができる。
( 5 ) ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコ一ドする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得す ることができる。
まず、 目的のヒ卜以外の動物の抗体の V領域の CDR を移植するためのヒト抗体の V 領域の FRのァミノ酸配列を VH、 VLそれぞれについて選択する。 ヒト抗体の V領域の FRのァミノ酸配列としては、 ヒト抗体由来の V領域の FRのァミノ酸配列であればい かなるものでも用いることができる。
例えば、 Protein Data Bank に登録されているヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸 配列、 ヒト抗体の V領域の FRの各サブグループの共通アミノ酸配列 [シ一ケンシズ' ォブ · プロテインズ. ォブ · ィムノロジカル · インタレスト]があげられるが、 充分 な活性を有するヒト型 CDR移植抗体を創製するためには、目的のヒト以外の動物の抗 体の V領域のァミノ酸配列と高い相同性、好ましくは 65%以上の相同性を有すること が望ましい。次に、選択したヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配列をコードする MA 配列と目的のヒト以外の動物の抗体の V領域の CDRのァミノ酸配列をコードする DNA 配列を連結させて、 VH、 VLそれぞれのアミノ酸配列をコードする DNA配列を設計す る。 CDR移植抗体可変領域遺伝子を構築するために設計した DNA配列を得るためには、 全 DNA配列をカバ一するように各鎖について数本の合成 DNAを設計し、 それらを用い てポリメラーゼ 'チェイン ' リアクション （Polymerase Chain Reaction；以下、 PCR と記す）を行う。 PCRでの反応効率および合成可能な DNAの長さから各鎖について、 好ましくは、 6本の合成 DNA を設計する。反応後、増幅断片を適当なベクタ一にサブ クロ一ニングし、 その塩基配列を決定し、 目的のヒト型 CDR移植抗体の各鎖の V領 域のアミノ酸配列をコードする cDNAを含むプラスミ ドを取得する。 また、 約 100塩 基よりなる合成 DNAを用いてセンス、 アンチセンスともに全配列を合成し、 それらを アニーリング、 連結することで、 目的のヒト型 CDR移植抗体の各鎖の V領域のアミ ノ酸配列をコードする cDNAを構築することもできる。
( 6 ) ヒト型 CDR移植抗体の V 領域のァミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は目的のヒト以外の動物の抗体の V 領域の CDR のみをヒト抗 体の V領域の FR間に、 単純に移植しただけでは、 その活性はもとのヒト以外の動物 の抗体の活性に比べて低下してしまうことが知られている [BI0/TECHN0L0GY， 9, 266 ( 1991 )] 。 そこでヒト抗体の V領域の FRのアミノ酸配列のうち、 直接抗原との結合 に関与しているアミノ酸残基、 CDRのアミノ酸残基と相互作用をしているアミノ酸残 基、あるいは抗体の立体構造の維持に関与している等の可能性を有するァミノ酸残基 をもとのヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、活性を上昇させ ることが行われている。 そして、 それらのアミノ酸残基を効率よく同定するため、 X 線結晶解析あるいはコンピュータ一モデリング等を用いた抗体の立体構造の構築お よび解析を行っている。 しかし、 いかなる抗体にも適応可能なヒト型 CDR移植抗体の 製造法は未だ確立されておらず、現状では個々の抗体によつて種々の試行錯誤が必要 である。
選択したヒト抗体の V領域の FRのァミノ酸配列の改変は各種の変異導入ブラィマ 一を用いて前記 2 ( 5 ) に記載の PCR を行うことにより達成できる。 PCR後の増幅断 片を適当なベクタ一にサブクロ一ニング後、 その塩基配列を決定し、 目的の変異が導 入された cDNAを含むベクタ一 （以下、 アミノ酸配列改変ベクターと称す） を取得す る。
また、狭い領域のアミノ酸配列の改変であれば、 20〜35塩基からなる変異導入ブラ イマ一を用いた PCR変異導入法により行うことができる。具体的には、 改変後のアミ ノ酸残基をコードする MA配列を含む 20〜35塩基からなるセンス変異プライマ一及 びアンチセンス変異ブラィマ一を合成し、改変すベき V領域のァミノ酸配列をコード する cDNAを含むプラスミ ドを錶型として 2段階の PCRを行う。 最終増幅断片を適当 なベクターにサブクロ一ニング後、 その塩基配列を決定し、 目的の変異が導入された cDNAを含むアミノ酸配列改変ベクターを取得する。
(7) ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一の構築
前記 2 ( 1 )のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CH及び CLをコードする遺 伝子の上流に、 前記 2 (5)および 2 (6)で取得したヒト型 CDR移植抗体の VH及び VLをコードする cDNAを挿入し、 ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一を構築することが できる。例えば、 ヒト型 CDR移植抗体の VH及び VLのアミノ酸配列をコードする cDNA を構築するための PCRの際に 5'末端および 3'末端の合成 DNAの末端に適当な制限酵 素の認識配列を導入することで、所望のヒト抗体の C領域をコードする遺伝子の上流 にそれらが適切な形で発現するように挿入することができる。
( 8 ) ヒト化抗体の一過性 （卜ランジェント） 発現および活性評価
多種類のヒ卜化抗体の活性を効率的に評価するために、 前記 2 (3) のヒト型キヌ ラ抗体発現べクタ一、および前記 2 (7) のヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一あるい はそれらの改変べクタ一を COS- 7細胞 （ATCCCRL1651) に導入してヒト化抗体の一過 性発現 [メソヅズ 'イン 'ヌクレイック 'アシッド ' リサーチ （Methods in Nucleic Acids Res.) , CRC Press, p.283, 1991] を行い、 その活性を測定することができる。
COS- 7細胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE- デキス卜ラン法 [メソッズ' イン · ヌクレイツク' アシッド' リサーチ （Methods in Nucleic Acids Res. ) , CRC Press, p.283, 1991]、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413(1987)] 等があげられる。
ベクターの導入後、 培養上清中のヒト化抗体の活性は前記 1 (4) に記載の酵素免 疫測定法 （ EL I SA法） 等により測定することができる。
(9) ヒト化抗体の安定 （ステーブル） 発現および活性評価
前記 2 (3) のヒト型キメラ抗体発現べクタ一および前記 2 (7) のヒト型 CDR移 植抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒ卜化抗体を安定に生 産する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現べクタ一の導入法としては、 エレクトロボレ一シヨン法〔特開平 2-257891、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) 〕 等があげられる。
ヒト化抗体発現べクタ一を導入する宿主細胞としては、 ヒト化抗体を発現させるこ とができる宿主細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 例えば、 マウ ス SP2/0- Agl4細胞 (ATCC CRL1581) 、 マウス P3X63- Ag8.653 細胞 (ATCC CRL1580) 、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 DHFR遺伝子と称す）が欠損した CH0細胞 [Pro Natl . Acad. Sci . USA, 77, 4216 ( 1980) ] 、 ラット YB2/3HL.P2. G11. 16Ag.20細胞
(ATCC CRL1662s 以下、 YB2/0細胞と称す） 等があげられる。
ベクタ一の導入後、 ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418および FCS を含む RPMI 1640培地により選択する。 得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中にヒト化抗体を生産蓄積さ せることができる。 培養液中のヒト化抗体の活性は前記 1 ( 4 ) に記載の方法などに より測定する。 また、 形質転換株は、 特開平 2- 257891に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテイン A カラムを用いて精製するこ とができる [アンチボディズ (Antibodies;， A Laboratory Manual , Co IdSpring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988 ；以下、 「アンチボディズ」 と記す] 。 また、 その他 に、 通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィ一および限外濾過等を組合せて行い、精製することがで きる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE) [Nature, 227, 680 ( 1970) ] やウエスタンブ ロッテイング法 （アンチボディズ， Chapter 12， 1988) 等で測定する。
精製したヒト化抗体の反応性、 また、 ヒト化抗体の VEGF に対する阻害活性の測定 は前記 1 ( 4 ) に記載の方法などにより測定することができる。
3 . 組換え抗体の作製方法 （ 2 )
( 1 ) 抗体断片 Fab、 Fab\ F(ab' )2の作製方法
上述した抗体を酵素で処理することにより、 抗体断片を生成させる。酵素としては、 パパイン、 トリブシンなどをあげることができる。
または、 該抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体の Fab、 Fab'あるいは F(ab' )2断片をコ一 ドする DNAを動物細胞用発現べクタ一に挿入し、該ぺク夕一を動物細胞へ導入するこ とにより発現させ、 Fab、 Fab'あるいは F(ab' )2を製造することができる。
生成される抗体断片は、 ゲル濾過、 イオン交換、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ —および限外濾過等を組み合わせて行い、生成することができる。精製した Fab、 Fab'、 F(ab，）2分子量は、 ポリアクリルァミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) [Nature, 227, 680 ( 1970) ] やウエスタンブロヅティング法 （アンチボディズ， Chapter 12， 1988) 等 で測定する。
精製した Fab、 Fab'、 F(ab，）2の反応性、 また、 Fab、 Fab\ F(ab，）2の VEGFに対す る阻害活性の測定は前記 1 ( 4 ) に記載の方法などにより測定することができる。 ( 2 ) 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1—本鎖抗体の作製方法
前記 2 ( 2 )、 2 ( 5 ) および 2 ( 6 ) に記載のヒト以外の動物の抗体あるいはヒ ト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを一本鎖抗体発現用べク夕一に 挿入することによりヒト以外の動物の抗体の一本鎖抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体 の一本鎖抗体の発現ベクターを構築することができる。ここで用いる一本鎖抗体発現 用べクタ一としてはヒト以外の動物の抗体あるいはヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコ一ドする cDNAを組込み発現できるものであれば、 いかなるものでも用いるこ とができる。
例えば、 PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)] , pAGE103 [J. Biochem. , 101 , 1307 ( 1987)] 、 pHSG274 [Gene, 27, 223( 1984) ]、 pKCR [Proc. Natl . Acad. Sci . USA. , 78, 1527 ( 1981 )] 、 SGl β d2 - 4 [Cytotechnology, 4, 173 ( 1990 )] 等があげられ る。 一本鎖抗体を発現させるための宿主としては、 大腸菌、 酵母、 動物細胞等の中か ら適切なものを選択することができるが、 その場合の発現用べクタ一としては、 それ それの宿主に適切なものを選択する必要がある。 また、 適切なシグナルペプチドをコ —ドする cDNAを発現用ベクターに挿入することで一本鎖抗体を細胞外に分泌させ、 ペリブラズマ領域に輸送させ、 あるいは細胞内に留まらせることができる。
選択された発現用ベクターに、 VH— P— VLあるいは VL— P— VH (Pはぺプチドリンカ 一） からなる一本鎖抗体をコードする cDNAを適切なプロモー夕一、 シグナルぺプチ ドの下流に挿入することにより、 目的の一本鎖抗体をコードする cDNAが挿入された 一本鎖抗体発現べク夕一を構築することができる。
一本鎖抗体をコードする cDNAは、 VHをコードする cDNAと VLをコ一ドする cDNAと を、 両端に適当な制限酵素の認識配列を有するぺプチドリンカ一をコ一ドする合成 DNAを用いて連結することにより得ることができる。 リンカ一ペプチドは、 その付加 が VH、 VLの抗原への結合に対して妨害しないように最適化することが重要で、 例え ば Pantol ianoらにより示されたもの [Biochemistry, 30, 10117 ( 1991 ) ] あるいは それを改変したものを用いることができる。
( 3 ) 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1ジスルフィ ド安定化抗体の作製方法
ジスルフィ ド安定化抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VL をコードする cDNAあるいはヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコ一ドする cDNAのそれぞれの適 切な位置の 1アミノ酸残基に相当する DNA配列をシスティン残基に相当する DNA配 列に改変し、 発現および精製したのち、 ジスルフィ ド結合を形成させることで作製す ることができる。アミノ酸残基のシスティン残基への改変は前記 2 ( 5 )に記載の PCR を用いた変異導入法により行うことができる。
得られた改変 VHおよび改変 VLをコードする cDNAを適切な発現用べクタ一に挿入 することによりジスルフィ ド安定化抗体 H鎖発現べクタ一およびジスルフィ ド安定化 抗体 L 鎖発現べクタ一を構築することができる。ここで用いるジスルフィ ド安定化抗 体発現用べクタ一としては改変 VHおよび改変 VLをコ一ドする cDNAを組込み発現で きるものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107
[Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)] 、 pAGE103 [J. Biochem. , 101 , 1307 ( 1987)]、 PHSG274 [Gene, 27, 223 ( 1984) ]、 pKCR [Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 78, 1527 ( 1981 ) ]、 pSGl β d2-4 [Cytotechnology, 4, 173 ( 1990) ] 等があげられる。 ジスル フィ ド安定化抗体を形成させるために用いるジスルフィ ド安定化抗体 L鎖発現べクタ 一およびジスルフィ ド安定化抗体 H鎖発現ベクターを発現させるための宿主として は、 大腸菌、 酵母、 動物細胞等の中から適切なものを選択することができるが、 その 場合の発現用べクタ一としては、 それぞれの宿主に適切なものを選択する必要がある。 また、 適切なシグナルペプチドをコードする cDNAを発現用べクタ一に挿入すること でジスルフィ ド安定化抗体を細胞外に分泌させ、 ペリプラズマ領域に輸送させ、 ある いは細胞内に留まらせることができる。
( 4 ) 各種抗体の発現および活性評価
前記 （ 1 ) 〜 （3 ) で構築された抗体断片発現べクタ一、 一本鎖抗体発現べクタ一、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖発現ベクターあるいはジスルフィ ド安定化抗体 L鎖発 現べクタ一をエレクトロポレーシヨン法 [特開平 2-257891、 サイ トテクノロジ一 Cytotechnology, 3, 133 ( 1990 )] 等の方法により宿主細胞へ導入することにより、 目的の抗体断片、 一本鎖抗体、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフィ ド安 定化抗体 L 鎖を生産する形質転換株を取得することができる。発現べク夕一の導入後、 培養上清等に含まれる抗体断片、 一本鎖抗体、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖あるいは ジスルフィ ド安定化抗体 L鎖の発現は前記 1 ( 4 ) に記載の方法等により確認するこ とができる。 抗体断片、 一本鎖抗体、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフィ ド安定化 抗体 L鎖の回収および精製は公知の技術を組み合わせることにより達成することがで きる。例えば、 抗体断片、 一本鎖抗体、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖あるいはジスル フィ ド安定化抗体 L鎖が培地中に分泌されるならば、限外濾過により濃縮することが でき、次いで各種クロマトグラフィ一あるいはゲル濾過を実行することにより達成す ることができる。 また、 宿主細胞のペリプラズマ領域へと輸送されるならば、 その細 胞に浸透圧ショックを与え、 限外濾過により濃縮することができ、 次いで各種クロマ トグラフィ一あるいはゲル濾過を実行することにより達成することができる。不溶性 であり、 かつ顆粒 （インクルージョン 'ボディー） として存在している抗体断片、 一 本鎖抗体、 ジスルフィ ド安定化抗体 H鎖あるいはジスルフィ ド安定化抗体 L鎖は、 細 胞の溶解、 顆粒を単離するための遠心分離と洗浄の繰り返し、 例えばグァニジン-塩 酸による可溶化後、各種クロマトグラフィーあるいはゲル濾過を実行することにより 達成することができる。
精製された抗体断片および一本鎖抗体の活性は、 前記 1 ( 4 ) に記載の方法等によ り測定することができる。
精製されたジスルフィ ド安定化抗体 H鎖とジスルフィ ド安定化抗体 L鎖は、各々を 混合したのち、 活性を有する構造へと導く操作 [ refolding 操作， Molecular Immunology, 32, 249 ( 1995)] によりジスルフィ ド結合を形成させた後、 抗原ァフィ 二ティ一クロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィ一またはゲルろ 過により活性を有するジスルフィ ド安定化抗体を精製することができる。ジスルフィ ド安定化抗体の活性は前記 1 ( 4 ) に記載の方法等により測定することができる。 4 . 融合抗体の作製方法
本発明で使用される抗体あるいは該抗体断片に、 放射性同位元素、 蛋白質、 低分子 の薬剤などを、化学的あるいは遺伝子工学的に融合させた融合抗体も抗体の誘導体と して使用することができる。抗体と毒素蛋白とを化学的に融合させた融合抗体は例え ば Anticancer Research, 11, 2003 ( 1991 ) ;Nature Medicine, 3, 350 ( 1996 )に従つ て作製することができる。抗体と毒素、 サイトカイン等の蛋白質とを遺伝子工学的に 融合させた融合抗体は例えば Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 ( 1996)， Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 93, 7826 ( 1996)に従って作製することができる。 抗体と低分子抗 癌剤を化学的に融合させた融合抗体は例えば Science, 261,212 ( 1993)に従って作製 することができる。 抗体と放射性同位元素を化学的に融合させた融合抗体は例えば Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 3, 60 ( 1990) ; Anticancer Research, 11, 2003 ( 1991 )に従って作製することができる。
これらの誘導体は、 抗体分子の特異性に従って放射性同位元素、 蛋白質 （サイ トカ イン、 トキシン、 酵素など） 、 低分子の薬剤などを標的組織周辺に集積させることで、 より効果的で副作用の少ない診断あるいは治療を可能にすることが期待されている。 5 . 抗体の使用方法
上述した抗 Fit- 1抗体、 該抗体断片あるいはそれらと他分子との融合抗体は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1と結合し、 ADCC、 CDC等の抗体のエフェクター活性を介して Fit- 1 発現細胞を破壊するため、 白血病の治療等に有用であると考えられる。
本発明の抗体を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではある が、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤 学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供 するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげる ことができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆 粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等 の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 オリ一ブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 スト 口べリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造で きる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等 の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチ ン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤と して用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて 調製する。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤は該化合物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せ ず、 かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調 製する。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体および用いる担体 の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダ一等の製剤が可能である。 また、 これらの 非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。 投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重 等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10〃 g/kg〜8mg/kgである。
本発明で示した VEGF受容体 Fit- 1 に対するモノクローナル抗体は、 白血病細胞に 高率に反応することから、 白血病の診断薬あるいは治療薬に用いることができる。 また、 本発明で使用される抗体の白血病細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 インビトロ実験としては、 補体依存性細胞障害活性 （CDC活性） 測定法、 抗体依存性 細胞障害活性（ADCC活性）測定法等があげられ、 インビボ実験としては、 マウス等の 実験動物での腫瘍系を用 、た抗腫瘍実験等があげられる。
CDC活性および ADCC活性などの抗腫瘍実験は、 Cancer Immunology Immunotherapy,
36, 373 ( 1993) , Cancer Research, 54, 1511 ( 1994)等記載の方法に従い行うことが できる。
6 . 白血病の診断方法
白血病の診断方法として、 被験者の細胞あるいは組織に存在するヒト VEGF受容体 Fit- 1を下記の述べる免疫学的に検出または定量する方法があげられる。
VEGF受容体 Flt-1 に対する抗体を用いて白血病細胞を免疫学的に検出する方法と しては、 蛍光抗体法、 免疫酵素抗体法 （ELISA) 、 放射性物質標識免疫抗体法
(RIA) 、 免疫組織染色法、 免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法 （ABC法、 CSA 法等） 、 ゥヱスタンプロッテイング法、 免疫沈降法、 上記に記した酵素免疫測定法、 サンドィヅチ ELISA法 [単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイェンティフィヅ ク、 1987年） 、 続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法 （東京化学同人、 1986年） ] などを用いることができる。
光 f几体 は、 Monoclonal Antibodies : Principles and practice Third edition(Academic Press, 1996年）、 単クローン抗体実験マニュアル （講談社サイエ ンティフィック、 1987年）等に記載された方法を用いて行うことができる。具体的に は、 分離した細胞あるいは組織などに、 本発明のモノクローナル抗体を反応させ、 さ らにフルォレシン ·イソチオシァネート （FITC) あるいはフィコエリスリンなどの蛍 光物質でラベルした抗ィムノグロブリン抗体あるレ、は結合断片を反応させた後、蛍光 色素をフローサイトメ一ターで測定する方法である。
免疫酵素抗体法 （ELISA) は、 分離した、 細胞あるいはその破砕液、 組織あるいは その破砕液、 細胞培養上清、 血清、 胸水、 腹水、 眼液などに、 抗体を反応させ、 さら にペルォキシダーゼ、 ピオチンなどの酵素標識などを施した抗ィムノグロプリン抗体 あるいは結合断片を反応させた後、 発色色素を吸光光度計で測定する方法である。 放射性物質標識免疫抗体法 （RIA) は、 分離した、 細胞あるいはその破砕液、 組織 あるいはその破砕液、 細胞培養上清、 血清、 胸水、 腹水、 眼液などに、 抗体を反応さ せ、 さらに放射線標識を施した抗ィムノグロプリン抗体あるいは結合断片を反応させ た後、 シンチレ一シヨンカウン夕一などで測定する方法である。
免疫細胞染色法、 免疫組織染色法は、 分離した、 細胞あるいは組織などに、 抗体を 反応させ、 さらにフルォレシン 'イソチオシァネート （FITC) などの蛍光物質、 ペル ォキシダ一ゼ、 ピオチンなどの酵素標識を施した抗ィムノグロブリン抗体あるいは結 合断片を反応させた後、 顕微鏡を用いて観察する方法である。
ウェスタンブロッテイング法とは、 Flt-1 を発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の 細胞抽出液を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]で分画した後、該ゲルを PVDF膜あるいは-トロセルロース 膜にブロッテイングし、該膜に本発明のモノクローナル抗体を反応させ、さらに FITC などの 蛍光物質、ペルォキシダーゼ、ピオチンなどの酵素標識を施した抗マウス IgG抗体あるいは 結合断片を反応させた後、確認する。
免疫沈降法とは、 Fit- 1 を発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞の細胞抽出液を 本発明のモノクローナル抗体と反応させた後、プロテイン G—セファロース等のィムノグロブリ ンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させるものである。
サンドイッチ ELISA法とは、本発明のモノクローナル抗体で、抗原認識部位の異なる 2種類 のモノクローナル抗体のうち、あらかじめ一方のモノクローナル抗体はプレートに吸着させ、 もう一方のモノクローナル抗体は FFTCなどの蛍光物質、ペルォキシダ一ゼ、ピオチンなどの 酵素で標識しておく。抗体吸着プレートに、 Flt-1 を発現した微生物、動物細胞あるいは昆 虫細胞の細胞抽出液を反応後、標識したモノクローナル抗体を反応させ、標識物質に応じ た反応を行う方法である。
図面の簡単な説明
第 1図 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノクローナル抗体 KM1730および KM1732のヒ ト細胞株 K0PN- K、 G361、 CAPAN- 1、 HUVEC、 HSB- 2および Jurkat との反応性をフロー サイ トメ一夕一により解析した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 抗ヒト VEGF受容体 F - 1モノクローナル抗体の製造法
抗 Fit- 1モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマ KM1732(FERM BP- 5698)、 ハ イブリ ドーマ KM1730(FERM BP-5697), ハイプリ ドーマ KM173KFERM BP- 5718)、 ハイ プリドドーマ KM1748(FEM BP- 5699)、 および、 KM1750(FERM BP-5700)をそれぞれ 5 〜 20 X 106細胞/匹をプリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（Balb/c)の腹腔内に注 射した。 10〜21日後に、 ハイプリ ドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、 腹水を採取 （1 〜8ml/匹） し、 遠心分離 （3, 000rpm、 5 分間） して固形分を除去した 後力プリル酸沈殿法 （アンチボディ一ズ ·ァ ·ラボラトリー 'マニュアル） により精 製し、 精製モノクローナル抗体とした。
モノクローナル抗体の抗体クラスはサブクラスタイピングキヅ ト [ザィメッ ト
(Zymed) 社製] を用いた酵素免疫測定法を行った。 その結果、 KM1732はマウス IgGl サブクラス、 KM1730はマウス IgGlサブクラス、 KM1731はマウス IgG2aサブクラス、 KM1748はマウス IgG2bサブクラス、 および、 KM1750はマウス IgG2bサブクラスに属 するモノクローナルであった。
実施例 2 抗ヒト Flt-1モノクローナル抗体のヒト癌細胞株との反応性の確認
ヒト由来癌細胞株としては、 肺小細胞癌 SBC- 3 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994)〗、 SBC-5 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994)]、 肺扁平上皮癌 Calu-1 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 PC- 10 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 肺腺癌 PC- 7[Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 HLC-1 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 大腸癌 Colo205 (ATCC CCL-222) 、 子宮癌 He la (ATCC CCL-2) 、 卵巣癌 MCAS (ヒューマン サイエンス資源財団 JCRB 0240)、 0VCAR-3 (大日本製薬より購入）、胃癌 MKN-1 [Cancer Research, 46, 4438 ( 1986 ) ]、 Katol 11 [Cancer Research, 46, 4438 ( 1986 ) ]、 乳癌 R27[Anticancer Research, 12, 1121 ( 1992 ) ]、 MCF7 (ATCC HTB-22) 、 脬癌 HPAF-2 (ATCC CRL-1997) 、 BXPC-3 (ATCC CRL-1687) 、 Capan-1 (ATCC HTB-79) 、 Capan-2 (ATCC HTB-80) 、 メラノーマ G361 (ATCC CRL-1424) 、 Sk-Mel-28 (ATCC HTB-72) 、 神経芽細胞腫 NAGAI [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994)], YT-nu [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 グリオブラスト一マ A172 (ATCC CRL-1620) 、 T98G (ATCC CRL-1690) 、 白血病 Jurkat (ATCC TIB-152) 、 U-937 (ATCC CRL-1593) 、 HL-60 (ATCC CRL-240) 、 HSB-2 (ATCC CC卜 120. 1)、 TALL-1 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994)]、 KOPN-K [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 NALL-1 [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 HEL92. 1.7 (ATCC TIB- 180)、 HPB-ALL [Cancer Research, 54, 1511 ( 1994) ]、 K562 (ATCC CCL-243)、 CCRF-CEM (ATCC CCL-119) 、 CCRF-SB (ATCC CC1-120) を用いた。 また、 正常細胞と してヒトさい帯静脈由来の血管内皮細胞（HUVEC) (Clonetics社より購入） を用いた。 実施例 1で得られた抗ヒト VEGF受容体 F - 1モノクローナル抗体のヒト癌細胞株 に対する反応性を免疫細胞染色法を用いて以下の手順に従い確認した。
抗ヒト VEGF受容体 F - 1モノクローナル抗体 KM1730および KM1732、ならびにコン トロール抗体として、 マウス IgGlクラスに属し、 かつヒト VEGF受容体 Flt-1には反 応せず、 ヒト MxA蛋白質に反応するマウスモノクローナル抗体 KM1135(W096/05230) を、 常法に従いピオチン化標識した。
各細胞株 2 X 105個を丸底 96ゥエルプレートに免疫細胞染色用緩衝液（ 1% BSA O.02% EDTA、 0.05% アジ化ナトリウムを含む PBS) 100〃 1に懸濁して分注した。 4 °C、 350 x gで 1分間遠心分離後、 上清を除き、 ピオチン化標識 KM1730抗体、 ピオチン化標識 KM1732抗体またはビォチン化標識 KM1135コントロール抗体をそれぞれ該ゥエルに 50 j 1 ( 10 g/ml) を添加し、 4°Cで 30分間反応させた。 反応後、 200〃 1の免疫細胞 染色用緩衝液を各ゥエルに加え 4°C、 350 x gで 1分間遠心分離後、 上清を除き細胞の 洗浄を行った。 この洗浄操作をさらに 2回行った後、 Avidin-PE (Streptoavidin-R- Phycoerythrin) ( Gibco社製）を 5 ju g/mlの濃度を含む免疫細胞染色用緩衝液 20 μ 1 を加えて 4 °Cで 30分間反応させた。反応後、 上記と同様の洗浄操作を 3回行った後、 フローサイ トメ一夕一 （コールター社製） を用いて解析を行った。
結果を第 1図および第 1表に示す。 第 1 表 反応性
抗 Fit - 1モノクローナル抗体
ターゲッ卜細胞 KM 1730 KM 1732
肺小細胞癌
SBC-3
SBC-5
肺馬平上皮癌
Calu-1
PC-10
肺腺癌
PC-7
HLC-1
大腸癌 子宮癌
Heia
卵巣癌
MCAS OVCAR-3
胃癌
MKN-1
Katolll
乳痛
R27
CF7
mm
HPAF-2
capan-1
CaDan-2 反応性
抗 Flt-1モノクロ一ナル抗体 ターゲット細胞 KM1730 KM 1732 メラノ一マ
G3S1 - - 神経芽細胞臆
NAGAI " "
YT-nu " ' グリ才ブラスト一マ
A172 - -
T98G " " 白血病
Jurkat (T) ++ ++
U-937 (Monocyte) - -
HL-60 (Promyelo) - -
HSB-2 (T) ++ ++
TALL-1《丁） - -
KOPN-K (Null) + +
NALL-1 (Null) - -
HEL92.1.7 (Erythro) - -
HPB-ALし（T) - -
K562 (Myelo) - ■
CCRF-CEM (T) + +
CCRF-SB (B) - - 正常血管内皮細胞
HUVEC + +
第 1図に示したように抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1モノクローナル抗体 KM1730および KM1732 は、 KM1135 コントロール抗体に比べて、 ヒト VEGF 受容体を発現している HUVEC-5620細胞に反応した。 白血病細胞である K0PN-Kヽ CCRE- CEM、 HSB - 2、 JURKAT についても、 抗ヒト VEGF受容体 FU;- 1モノクローナル抗体 KM1730および KM1732は、 KM1135コントロール抗体に比べ反応した。 一方、 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1モノクロ —ナル抗体 KM1730および KM1732は、 G361細胞、 CAPAN- 1細胞には全く反応しなかつ た。
第 1表には、 同様にして検討した計 41種類の細胞株の解析結果をまとめた。 12種 類の白血病細胞については、 4種の細胞株 Jurkat、 HSB- 2、 KOPN- K、 CCRF-CEMに KM1730 および KM1732が反応した。 KOPN- K、 CCRF-CEMについては HUVECと同等の反応性を示 し、 Jurkat、 HSB- 2については HUVEC以上の高い反応性を示した。 反応した 4種の白 血病細胞のうち 3種 （Jurkat、 HSB- 2、 CCRF-CEM) は T細胞系の白血病であり、 1種 (KOPN- Κ) は非 T細胞非 B細胞系の白血病であった。 T細胞系白血病については 5種 類検討したうち 3種類と高率に反応した。 一方、 上皮細胞由来の腫瘍である肺腺癌、 肺扁平上皮癌、 大腸癌、 子宮癌、 卵巣癌、 胃癌、 乳癌、 滕癌、 および、 神経外胚葉系 由来腫瘍である肺小細胞癌、 メラノーマ、 神経芽細胞腫、 グリオブラストーマについ ては計 24種の癌細胞株を検討したが、 抗 VEGF 受容体 Flt-1 モノクローナル抗体 KM1730、 KM1732は全く反応しなかった。
産業上の利用可能性
本発明は、 ヒト VEGF受容体 Fit- 1に特異的に結合するモノクローナル抗体を用い た白血病の診断薬および治療薬を提供する。

Claims

請求の範囲
1. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体を有効成分として含有する白血病の診断薬。
2. 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴とす る請求項 1記載の診断菓。
3. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 KM1730、 KM173K KM1732、 K 1748および KM1750からなる群より選ばれる抗体である請求項 1記載の診断薬。
4. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 ヒト化抗体である請求項 1記載の診断薬。
5. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab、 Fab，、 F(ab' )2、 一本鎖抗体およびジ スルフイ ド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である請求項 1記載の診断薬。
6. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分子の薬 剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である、 請求項 1記載の診断薬。
7. 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体を有効成分として含有する白血病の治療薬。
8. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴とす る請求項 7記載の治療薬。
9. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 KM1730、 M1731, KM1732, KM1748および KM1750からなる群より選ばれる抗体である請求項 7記載の治療薬。
10. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 ヒト化抗体である請求項 7記載の治療薬。
11. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab、 Fab'、 F(ab，）2、 一本鎖抗体およびジ スルフィ ド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である請求項 7記載の治療薬。
12. 抗ヒト VEGF受容体 F - 1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分子の 薬剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である、 請求項 7記載の治療薬。
13. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体を用いる、 白血病の診断方法。
14. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴と する請求項 1 3記載の白血病の診断方法。
15. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 KM1730、 KM1731, KM1732、 KM1748および K 1750からなる群より選ばれる抗体である請求項 1 3記載の白血病の診断方法。
16. 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体が、 ヒト化抗体である請求項 1 3記載の白血 病の診断方法。
17. 抗ヒト VEGF受容体 Fit- 1抗体が、 Fab、 Fab'、 F(ab，）2、 一本鎖抗体およびジ スルフィ ド安定化抗体からなる群より選ばれる抗体である請求項 1 3記載の白血病 の診断方法。
18. 抗ヒト VEGF受容体 Flt-1抗体が、 放射性同位元素、 蛋白質または低分子の 薬剤と化学的または遺伝子工学的に融合させた抗体である、請求項 1 3記載の白血病 の診断方法。
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