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WO2000046352A1 - Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et leur utilisation therapeutique - Google Patents

Lymphocytes t humains effecteurs exprimant la molecule cd86 et leur utilisation therapeutique Download PDF

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WO2000046352A1
WO2000046352A1 PCT/FR2000/000240 FR0000240W WO0046352A1 WO 2000046352 A1 WO2000046352 A1 WO 2000046352A1 FR 0000240 W FR0000240 W FR 0000240W WO 0046352 A1 WO0046352 A1 WO 0046352A1
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WO
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lymphocytes
cells
human
molecule
population
Prior art date
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Application number
PCT/FR2000/000240
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English (en)
Inventor
Pascale Jeannin
Yves Delneste
Marc Vittori
Jean-Yves Bonnefoy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP00901698A priority patent/EP1149159A1/fr
Priority to JP2000597412A priority patent/JP2002535983A/ja
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    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Definitions

  • the present invention relates to lymphocytes expressing the functional CD86 molecule, methods for preparing a substantially homogeneous population of these lymphocytes and their application in therapy and diagnostics.
  • T cells play an essential role in regulating an immune response as well as in maintaining a memory immune response.
  • T cells 15 direct effector. Activation of T cells is necessary for them to acquire functional properties (Swain SL et al, Immunol Rev. (1996) 150, 143-67).
  • Cellular immunotherapy is a treatment which consists in reinjecting in a patient autologous cells which have been modified ex vivo in order to confer them
  • CPN blood mononuclear cells
  • T lymphocytes 25 T lymphocytes The advantage of stimulating CMNs ex vivo before reinjecting them avoids the toxicity linked to the systemic injection of T lymphocyte activators.
  • IL-2 interleukin 2
  • T cell stimuli such as cytokines (such as IL-4 or IL-7) or activating antibodies against surface molecules (such as CD3 molecules (Landegren U et al, Eur J Immunol. (1984 ) 14, 325-8), CD2 (Van Lier RA et al, Eur J Immunol. (1988) 18, 167-72 & European Patent 40 96 55) and / or CD28 (Greenfield EA, et al, Crit Rev Immunol. (1998) 18, 389-418)) are used alone or in combination in order to generate these cells.
  • cytokines such as IL-4 or IL-7
  • CD2 Van Lier RA et al, Eur J Immunol. (1988) 18, 167-72 & European Patent 40 96 55
  • CD28 Greenfield EA, et al, Crit Rev Immunol. (1998) 18, 389-418)
  • CMN CMN-derived neurotrophic factor
  • activation of CMN in vitro does not lead to the expansion of a homogeneous population of T lymphocytes, all having a well-defined phenotype and function, but to a set of populations with degrees of activation, phenotypes and different functional properties.
  • the generation of a homogeneous population the production of which would be reproducible, the phenotypic characteristics of which would be known, which would be easily identifiable and which would simultaneously exhibit several effector functions (that is to say, besides cytotoxic properties, immunological properties which are beneficial in immunosuppression), would be a considerable advance.
  • CD4-type T lymphocytes recognize fragments of antigens presented by antigen presenting cells (CPAg) in association with the major class II histocompatibility complex (MHC II) and are considered to have "helper" properties (that is to say capable of helping B lymphocytes and cytotoxic T lymphocytes to acquire their functional properties).
  • CD8 type lymphocytes recognize fragments of antigens presented by CPAg in association with MHC I and are generally considered to have. cytotoxic properties.
  • T lymphocytes having never encountered the antigen against which they are specific are called naive T lymphocytes and are characterized by the expression of the CD45RA molecule.
  • the T lymphocytes having already encountered the antigen vis-à-vis which they are specific are called memory T lymphocytes and express the molecule CD45RO (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
  • T lymphocytes The intensity and nature of the signals necessary for the activation of T lymphocytes vary depending on whether they are naive or memory T lymphocytes.
  • Naive T lymphocytes must receive more costimulation signals than memory T lymphocytes in order to be properly activated and to differentiate into effector cells. These costimulation signals are provided by the CPAg and in particular by the dendritic cells. If the lymphocytes meet the antigen in the absence of costimulation signals, they become anergic, tolerant or die by apoptosis.
  • the CD86 molecule is expressed constitutively on the surface of many CPAg (Lenschow DJ et al, Annu Rev Immunol (1996) 14, 233-58). It has two ligands: (1) the CD28 molecule, expressed constitutively by T lymphocytes, which generates, after ligation with the CD86 molecule (or with the CD80 molecule), a strong activation signal for T lymphocytes and (2) the CTLA-4 molecule, expressed only by activated T lymphocytes and which generates, after ligation with the CD 86 molecule (or the CD 80 molecule), an inhibition signal.
  • the functional activity of T lymphocytes is therefore partly regulated by activating and inhibiting signals mediated by the molecules CD28 and CTLA-4, respectively.
  • the present invention relates to a new, practically homogeneous population of polyclonal human T lymphocytes, characterized by the expression of the functional CD86 molecule and, moreover, by cytotoxic, immunostimulatory and especially costimulatory properties.
  • costimulatory properties are only partially mediated by the expression of the CD86 molecule, many other costimulation molecules being expressed at very high levels or selectively on these cells.
  • T lymphocytes which, in the absence of any transfection or modification, constitutively express numerous costimulation molecules, and in particular the functional CD86 molecule, appears to be an essential contribution.
  • the T lymphocytes according to the present invention concomitantly express costimulation and immunostimulation properties, properties which are generally not provided by CPAg.
  • This population can be used in particular in cellular immunotherapy in the treatment of cancers, infectious diseases, immune deficiencies and in the field of vaccinology.
  • the invention also relates to T cells expressing the CD86 molecule as a source of new lymphocyte molecules involved in the immune response.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing immune abnormalities by detecting in the blood or tissues of T lymphocytes expressing the functional CD86 molecule, in particular using anti-CD86 antibodies.
  • This diagnosis will, for example, highlight serious immune deficiencies of congenital origin (Owen syndrome for example), autoimmune diseases (arthritis type), viral infections (CMV and HIV) or latent bacterial infections .
  • the invention also relates to therapeutic compositions characterized in that they comprise at least T lymphocytes or a practically homogeneous population of human T lymphocytes expressing the functional CD86 molecule.
  • the lymphocytes or cell populations obtained can be used for the production of a medicament intended more particularly for the treatment of congenital, acquired or pathological immunodeficiencies. It may especially be the treatment of patients with an absent or deficient immune response with regard, for example, to a tumor or a pathogen.
  • the products according to the invention may be used in particular for the production of a medicament intended for the treatment: - microbial affections (virus, bacteria, parasite, yeast, including in particular the problems linked to transplants) and, - cancers, in particular HIV positive subjects and / or suffering from myeloma, lymphoma, leukemia, melanoma, carcinoma of the kidney, brain, prostate, rectum, pancreas, ovaries, lungs, for example.
  • the CD86 + T lymphocytes and populations of T cells according to the present invention can also be used as an adjuvant or immunostimulant by vaccinology and this in combination with vaccinating antigens and / or other compounds of bacterial, viral or DNA type for example, in order to produce therapeutic vaccines.
  • CD86 + lymphocytes and populations containing CD86 + T lymphocytes according to the present invention can also be used in the case of treatment of septic shock.
  • these populations of CD86 + T lymphocytes can be used in autologous injection, that is to say it is possible to start from the patient's cells, CMN or isolate. of lymphocytes, to implement the process, then to reinject them after stimulation. This of course represents the enormous advantage of eliminating any risk associated with possible contamination and any phenomenon of antigenicity.
  • compositions according to the present invention may include other elements useful in the treatment of particular pathologies, they may be chemical molecules, drugs for example, or biological, genetically modified organisms, bacterial or viral, of which will want to use genes or antigens.
  • lymphocytes or populations of T lymphocytes according to the present invention characterized in that they have been drawn with a biological extract or biological derivatives, it may be in this case cells or microbes or derivatives of the peptide, protein, glycolipid, glycopeptide and lipopeptide type for example as well as mixtures, in particular of antigens, in this case the property of the lymphocytes according to the present invention is in particular used to possess costimulatory properties necessary during the process of presentation of the antigen.
  • the population of T lymphocytes according to the present invention can be transfected or coupled with DNA or chemical or immunological molecules, in order to promote for example the expression and / or the targeting of certain of these products.
  • the properties of the populations according to the present invention will be analyzed below before the examples. 1.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a practically homogeneous population of human T lymphocytes expressing the functional CD86 molecule, characterized in that, from a sample containing human T lymphocytes, at least two sequential stimulations are carried out said lymphocytes.
  • practically homogeneous population of human T lymphocytes expressing the functional CD86 molecule is meant a population containing more than 70%, preferably more than 90%, of CD86 + T cells.
  • the stimulation is carried out using activators and compounds ensuring the proliferation of T lymphocytes.
  • the activators are preferably chosen from anti-CD2, anti-CD3 and anti-CD28 activating antibodies and the mitogens or mixtures of these compounds; compounds stimulating the proliferation of T lymphocytes will also be used, in particular the interleukins IL-2 (Mier JW et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 6134-6138; Northoff et al, J. Immunol. (1980) 125, 1823-1828; Mier JW et al J. Immunol. (1982) 128, 1122-7), IL-4, IL-7 for example.
  • sequential stimulation is intended to denote two stimulations carried out on cell culture in new medium at least 4 days apart, and preferably at least 7 days, in general this interval will be of the order of 1 to 3 weeks, it will depend, in particular, on the intensity of the stimulation.
  • the present invention therefore relates to a method characterized in that the duration between two stimulations is at least 4 days, preferably 7 days.
  • each stimulation it is preferably regularly added, for example every 2 days, a cytokine stimulating the proliferation of T lymphocytes.
  • T lymphocytes After the second stimulation, likewise, it will preferably be a few days, for example more than 4 days, in general more than 7 days, before obtaining a practically homogeneous population of T lymphocytes expressing the CD86 molecule.
  • T lymphocytes can be cultured with all the appropriate media, which are known to those skilled in the art, examples of such media of type RPMI 1640 will be explained in particular in the examples.
  • Calf serum may be replaced by autologous human serum or by a suitable medium without protein of animal or human origin.
  • the amounts of stimulating agents used vary depending on the agent used, for example the antibodies will be used preferably at concentrations of 10 to 1000 ng / ml, preferably from 10 to 500 ng / ml, as for the cytokines themselves are used at concentrations of the order of 10 to 1000 U / ml, in particular from 100 to 500 U / ml.
  • the sample containing T lymphocytes is preferably either a sample of blood mononuclear cells (CMN), or an isolate of T lymphocytes originating from CMN.
  • CMN stimulation (10 6 cells / ml) is carried out in the culture medium described in Example 1 (knowing that the calf serum can be replaced by autologous human serum or by a suitable medium without protein of animal origin or human) with an amount for example of 200 ng / ml of anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3 (Kung P et al, Science (1979) 206, 347-349; Tax, WMJM et al, Nature (1983) 304, 445-447) plus 200 U / ml of recombinant human IL-2. Every two days, recombinant human 1TL-2 will be added, for example 200 U / ml.
  • a second stimulation with an amount for example of 200 ng / ml of anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3 plus 200 U / ml of IL-2 will be performed. Every two days, recombinant human 1TL-2 will be added, for example 200 U / ml.
  • T lymphocytes (10 6 cells / ml) are isolated by the technique rosettes with sheep erythrocytes (as detailed in Example 3). Stimulation of T lymphocytes (10 6 cells / ml) is carried out in the culture medium described in Example 1 (knowing that the calf serum can be replaced by autologous human serum or by a suitable medium without original protein animal or human) with a human anti-CD28 monoclonal antibody (previously adsorbed on the culture surface at a concentration of 20 ⁇ g / ml) (Martin PJ et al, J.
  • Example 1 describe the generation and kinetics of expression of the CD86 molecule on T lymphocytes after stimulation of CMNs by an activating anti-CD3 antibody in the presence of IL-2 ( Figure 1).
  • protocol 1 or 2 two approaches can be proposed in order to isolate CD86 + T cells having the biological properties according to the present invention.
  • protocols 1 and 2 it is thus possible to implement protocols 1 and 2 as described above.
  • all the lymphocytes express the CD86 molecule one week after the second stimulation. If this is not the case, the cells will be cultured for an additional 2 to 4 days with for example 200 U / ml of IL-2 in order to obtain a population of T cells all expressing the CD 86 molecule.
  • the present invention relates generally to CD86 + T lymphocytes, which can be obtained in particular by implementing protocols 1 and 2 in an incomplete manner, that is to say by only making the first stimulation with the anti-CD3 antibody plus 1TL-2 (in the presence or absence of the anti-CD28 antibody).
  • the CD86 + cells can be purified using a cell sorting cytofluorometer.
  • the negative and positive CD86 cells will be isolated on the basis of the expression level of the HLA-Dr molecule which is lower on CD86 cells than on CD86 + cells (see Example 3,
  • the protocol used shows that a practically homogeneous population made up of human CD86 + T lymphocytes is only generated after a series of at least two stimulations jointly involving at least two stimuli of different nature such as for example an anti-CD3 antibody and interleukin 2 (Example 1 and Figure
  • the present invention also relates to a practically homogeneous population of human CD86 + T lymphocytes such that they can be obtained in particular by the method described above but which can be obtained by other methods, in particular after a single stimulation and cell sorting.
  • the lymphocytes according to the invention express at least one of the following molecules in a stable manner: CD25, CD54 and CD80, and transiently: CD30, CD40-L and
  • the CD86 molecule constitutes the reference marker for characterizing this new population of memory and effector human T lymphocytes.
  • T lymphocytes express the CD2, CD3, CD4 or CD8 molecules and, remarkably, the CD86 molecule. They express among others the following membrane molecules: CD25 (alpha chain of the interleukin 2 receptor), CD45RO (molecule selectively expressed by memory T cells) (Example 2 and Figure 2), major class I histocompatibility complex (MHC I), MHC II, CD54 and CD80 (Example 3 and Table I). They selectively express, although transiently, the CD30 molecule, the ligand of the CD40 molecule (CD40-L) and the CD70 molecule (Example 3 and Figure 3).
  • CD86 molecule only appears on T lymphocytes expressing the CD45RO molecule (see Example 2, Figure 2); the CD45RO molecule characterizes memory cells (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
  • CD25, CD54, CD80 and HLA-Dr molecules are invariably expressed more significantly on CD86 + T lymphocytes than on CD86- T lymphocytes (see Example 3, Figure 3 and Table I); the increased expression of the molecules CD25, CD54 and HLA-Dr on the CD86 + cells show that they are in a significant state of activation (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
  • costimulation molecules CD54, CD70, CD80, and CD86 are expressed in an increased manner on CD86 + T lymphocytes.
  • the use of costimulation molecules currently appears as a new therapeutic approach of choice and is proposed in particular: (i) in anticancer immunotherapy (Liebowitz DN et al, Curr Opin Oncol (1998) 10, 533-41); (ii) to facilitate the establishment of an effective T lymphocyte response vis-à-vis microbial exogenous agents (Kaye PM, Immunol Today (1995) 16, 423-7); and (iii) as an adjuvant in vaccinology (Chamberlain RS et al, Cancer Res. (1996) 56, 2832-6).
  • CPAg CPAg-T lymphocyte interaction. These interactions are necessary for the education and activation of T lymphocytes during antigen presentation.
  • the CD54 molecule binds to the LFA-1 molecule which transduces a powerful costimulation signal to T lymphocytes (Van Seventer GA et al, J. Immunol (1990) 144, 4579-86).
  • a costimulation signal mediated by CD28 allows an effective activation of T lymphocytes, objectified by an increase in proliferation and production of IL-2.
  • CD40-L, CD70, CD80 and CD86 molecules are expressed by CD86 + cells. They allow CD86 + T lymphocytes to acquire cytotoxic properties. Indeed :
  • NK cells Natural Killer (NK) cells via CD27 (which has the CD70 molecule as a ligand) increases their cytotoxic activity (Yang FC et al, Immunology (1996) 88, 289-93).
  • the CD40-L molecule will also promote the development of a cytotoxic response by two mechanisms: a. by binding to the CD40 molecule expressed by CPAg, it leads to activation of CPAg (and in particular of dendritic cells) so powerful that these cells will be able to confer cytotoxic activity on naive T lymphocytes, in the absence of lymphocyte T "helper" (Bennet SR et al., Nature (1988) 393, 478-
  • the CD80 and CD86 molecules are essential in generating antiviral and antitumor cytotoxic responses. This particular activity has been reported many times in the literature, in particular in vaccination models since they promote the induction of a specific cytotoxic T lymphocyte response.
  • the CD80 molecule increases the cytotoxic properties of NK cells (Yeh KY et al, Cell Immunol (1995) 165, 217-24) as well as the generation of memory cytotoxic T lymphocytes (Flynn K & Mullbacher A, Eur J Immmunol (1997) 27 , 456-62).
  • the transfection of cells with a gene coding for the molecule CD 80 increases the frequency of cytotoxic T lymphocytes generated as well as their functional activity with respect to cells infected with a virus (He XS et al., Proc Natl Acad Sci USA ( 1996) 93, 7274-8; Rao JB et al., J Immunol (1996) 156, 3357-65; Tsuji T et al, Eur J Immunol (1997) 27, 782-7) or with respect to cells tumor (P ⁇ tzer BM et a, Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94, 10889-94; Imro MA et al, Hum Gène Ther (1998) 9, 1335-44; Leong CC et al, Eur J Immunol (1997) 71 , 476-82).
  • a signal via the CD28 molecule is required to generate cytotoxic T lymphocytes (Azuma M et al, J Immunol (1993) 150, 2091-101 ; Lanier LL et al, J Immunol (1995) 154, 97-105).
  • the interaction of the CD80 and / or CD86 molecules with their CD28 ligand has also been implicated in the generation of an effective response towards the parasite Toxoplasma gondii (Hunter CA et al, J Immunol (1997) 158, 2285- 93).
  • the CD40-L molecule gives cells that express it immunostimulatory properties. After ligation with the CD40 molecule, it induces the activation of monocytes (Laman JD et al, Crit Rev Immunol. (1996) 16, 59-108) as well as the maturation (induction of expression of the CD83 molecule) and the activation (production of IL-12) of dendritic cells .
  • the injection of DNA encoding the CD40-L molecule increases the efficiency of an immune response (humoral and cellular) and induces protective immunity against infectious agents or against a tumor challenge (Gurunathan et a, J Immunol. ( 1998) 161, 4563-71).
  • the CD40-L and CD70 molecules give the cells which express them the ability to stimulate B lymphocytes ("helper" property for B lymphocytes).
  • B lymphocytes By attaching to its ligand the CD40 molecule, CD40-L participates in the isotypic switching processes, production of immunoglobulins, survival and proliferation of B lymphocytes (Laman JD et a, Crit Rev Immunol. (1996) 16, 59-108).
  • the CD70 molecule is involved in the regulation of B cell proliferation, dTgG and IgM production and differentiation into plasma cells (Agematsu K et al, Eur J Immunol. (1995) 25, 2825 -29).
  • the present invention relates to cytokines and in particular lymphokines produced by a population of CD86 + T lymphocytes as described above as well as a purified lymphokine obtained from the lymphokines according to the invention.
  • the profile of cytokines produced by CD86 + T cells is different from CD86- cells (Example 4, Figures 4a and 4b):
  • IFN ⁇ interferon gamma
  • CD86 + T lymphocytes of the order of 10 to 100 ng / ml
  • CD86- cells Figure 4b
  • LTFN ⁇ plays a crucial role in resistance to pathogens and in the anti-tumor response. In addition, it has powerful antiviral properties, increases the bactericidal activity of macrophages and promotes the expression of MHC I and MHC II molecules and therefore the development of immune responses to antimicrobials and antitumors (Boehm U, Ann Rev Immunol (1997) 15 , 749-95). LTFN ⁇ is used clinically in the treatment of cancers (eg kidney cancer).
  • cancers eg kidney cancer
  • TNF ⁇ induces the death of tumor cells which express one of its receptors (Hieber U & Heim ME, Oncology (1994) 51, 142-53). It also plays a key role in initiating the inflammatory phase by activating numerous cellular partners such as endothelial cells, epithelial cells and effector cells of the inflammatory reaction such as monocytes, neutrophils and eosinophils. By activating these cells, it also participates in the effector phase of the antimicrobial response (Camussi G et al, Eur J Biochem (1991) 202, 3-14).
  • CD86 + T lymphocytes concomitantly present a set of surface molecules or cytokines expressed by the effector cells (like the cytotoxic cells) but also by the CPAg. This gives them the ability to initiate, carry out (effector phase) and control an immune response.
  • the invention claims the generation of a practically homogeneous population of human T lymphocytes expressing the CD86 molecule and having simultaneously the following effector functions: costimulation (that is to say that they promote the generation of a lymphocyte response naive), cytotoxicity (that is to say, they destroy tumor cells and / or pathogenic microorganisms) and immunostimulation.
  • costimulation that is to say that they promote the generation of a lymphocyte response naive
  • cytotoxicity that is to say, they destroy tumor cells and / or pathogenic microorganisms
  • immunostimulation that is to say, they destroy tumor cells and / or pathogenic microorganisms
  • the effector properties of CD86 + T cells were compared to those of CD86- T cells. 4.1.
  • CD86 + T cells have powerful costimulatory properties.
  • naive T lymphocytes expressing the CD45RA molecule
  • the activation (proliferation and production of cytokines) of naive T lymphocytes requires at least two signals: a first signal via the T receptor, which can be mimicked by an anti-CD3 antibody, and a second signal via costimulation molecules such as the CD28 molecule.
  • Two types of experiments were used to objectify the costimulatory properties of CD86 + T lymphocytes. In these two types of experiments, naive T lymphocytes were used as responder cells because it is in this activation state that the T lymphocytes need to receive the most costimulation signals to be activated.
  • the tests used are as follows: - activation of stimulated naive T lymphocytes with a suboptimal dose of anti-CD3 activating antibody (OKT3).
  • the activation of naive T lymphocytes is objectified by an induction of proliferation (Example 5, Figure 5a) and of the production of IFN ⁇ (Example 5, Figure 5b), - activation of naive T lymphocytes in the presence of heterologous CD86 + T lymphocytes .
  • the proliferation of naive T lymphocytes is measured (Example 5, Figure 5c).
  • CD86 + T cells are capable of activating naive T cells.
  • the use of neutralizing anti-CD86 antibodies shows that the CD86 molecule expressed by human T lymphocytes is biologically active and participates, at least in part, in the costimulation activity.
  • CD86- T cells as well as freshly isolated T cells show little or no costimulation activity (Example 5, Figures 5a, 5b and 5c).
  • CD86 + T cells have cytotoxic properties.
  • the stimulation of T lymphocytes by 1TL-2 leads to the generation of killer T lymphocytes (also called “lymphokine activated killer cells” or LAK) spontaneously possessing powerful cytotoxic properties.
  • cytotoxic cell generation techniques involve stimulating T cells in vitro before reinjecting them into patients. These protocols exploit the fact that stimulation will not only induce proliferation of T lymphocytes but also give them cytotoxic properties. Indeed, in the absence of activation, naive T lymphocytes as well as memory lymphocytes have little or no cytotoxic property.
  • CD86 + T cells spontaneously exhibit cytotoxic activity against tumor cells (Example 7, Figure 7). This cytotoxic activity is also carried by a mixed population containing CD86 + lymphocytes and CD86- lymphocytes and by CD86- T lymphocytes. In contrast, freshly isolated, non-activated T cells do not kill tumor cells.
  • Example 7 An example using the K562 tumor line as target cell is presented in Example 7 (FIG. 7).
  • Figure 1 In vitro generation of a population of T lymphocytes expressing the CD86 molecule by stimulation of CMN from peripheral blood with an anti-CD3 antibody in the presence of IL-2.
  • Human CMNs from peripheral blood were stimulated (on D0) with the anti-CD3 antibody OKT3 and 1TL-2 (as described in example 1) and were (D) or not (H) stimulated a second times on D21 with the anti-CD3 antibody OKT3 and interleukin 2 (as described in Example 1).
  • Interleukin 2 is added every two days to the culture.
  • the expression of. the CD86 molecule on CD3 + T lymphocytes is evaluated by cytofluorometry kinetically over 6 weeks by double labeling.
  • the results are expressed as a percentage of T cells expressing the CD86 molecule. They are representative of one of 10 experiences.
  • Figure 2 CD86 + human T cells express the CD45RO molecule. Human CMNs were stimulated by the anti-CD3 antibody OKT3 and interleukin 2 as described in Example 1. The expression of the CD45RO molecule by the CD86 + and CD86- T lymphocytes was evaluated by double labeling. cytofluorometry after 15 days of culture. The results are representative of one of 10 experiences.
  • Figure 3 Preferential expression of CD30, CD40 ligand and CD70 molecules on CD86 + T lymphocytes.
  • Human CMNs were stimulated by the antibody OKT3 and interleukin 2 as described in Example 1.
  • the expression of the HLA-Dr, CD30, CD40-L and CD70 molecules on CD86 + and CD86- T lymphocytes was evaluated by double labeling in cytofluorometry after 15 days of culture. The results are representative of one of the 10 experiments.
  • Figures 4a and 4b Comparison of the production of IFN ⁇ by CD86 + and CD86- T lymphocytes.
  • Figure 4a CMNs were stimulated as described in Example 1.
  • CD86 + and CD86- T lymphocytes were sorted using a cell sorting cytofluorometer and stimulated with PMA plus ionomycin for 6 hours. The total population was also "treated in the same way" after or not incubation with the neutralizing anti-CD86 antibody (IT2.2). LTFN ⁇ was assayed in the supernatants by ELIS A. The results, expressed in pg / ml (mean ⁇ SD) are representative of one of 3 experiments.
  • FIGS. 5a, 5b and 5c The CD86 + T lymphocytes provide the costimulation signals necessary for the activation of the naive T lymphocytes.
  • Figures 5a and 5b Costimulation test of naive T cells in the presence of an anti-CD3 antibody.
  • CD86 + T cells generated and purified as described in Example 1, were fixed with paraformaldehyde and then cultured with lymphocytes Naive T stimulated with an anti-CD3 antibody in the presence or absence of neutralizing anti-CD86 antibodies (clones IT2.2 or FUN-1) or of a monoclonal antibody of isotype control.
  • Figure 5c Mixed lymphocyte reaction test.
  • Figure 6 The CD86 molecule expressed by human B and T lymphocytes has a similar molecular weight of 70 kDa.
  • the non-activated T cells were obtained by the rosette technique as described in Example 3.
  • Example 1 Generation of a homogeneous population of human T lymphocytes expressing the CD86 molecule after stimulation of human mononuclear cells isolated from peripheral blood with an anti-CD3 antibody in the presence of IL-2.
  • CD86 positive T cells are generated from human peripheral blood.
  • the blood is taken by leukopheresis (in the presence of an anticoagulant such as for example lithium heparinate).
  • CMNs are then cultured at the concentration of 1x10 6 cells / ml in the following medium (hereinafter referred to as complete culture medium): RPMI 1640 supplemented with 10% of decomplemented fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L- glutamine.
  • CMNs are activated with a minimum concentration of 200 ng / ml of human anti-CD3 monoclonal antibody clone OKT3 in the presence of recombinant human interleukin 2 (IL-2) at a concentration of 200 U / ml.
  • Human 1TL-2 is added to the culture every other day.
  • a second stimulation of the cells on D21 will make it possible to generate a homogeneous population of human T lymphocytes all expressing the CD86 molecule.
  • the lymphocytes are collected on D21, washed twice in RPMI 1640 medium and then re-cultured in complete culture medium at the concentration of 1x10 6 cells / ml.
  • Cells are activated with 200 ng / ml of anti-CD3 antibodies and 200 U / ml of recombinant IL-2.
  • 1TL-2 200 U / ml is added every other day.
  • the anti-human CD3 antibody (clone OKT3) is produced by the myeloma CRL-8001 obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Myeloma is cultivated in Dulbecco medium modified according to Iscove (Life technologies) supplemented with 20% of decomplemented fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml of penicillin and 100 / xg / ml of streptomycin. The antibody is purified by fixation on a column of protein A coupled to Sepharose (Pierce). They are then detached from the resin in the presence of a 10 mM Tris-HCl solution pH 4.
  • the pH of the eluted fraction is then brought back to pH 7.0.
  • the eluted fraction is concentrated and then quantified (BCA protein piercing reagent, Pierce).
  • BCA protein piercing reagent Pierce
  • the purity of the anti-CD3 antibodies is verified by polyacrylamide gel electrophoresis under reduced and unreduced conditions before staining with silver nitrate. Purity is> 95%.
  • the sterility of the anti-CD3 antibody solution is ensured by filtration through 0.22 ⁇ m.
  • Recombinant human interleukin 2 (produced in prokaryotic system) is obtained from R & D Systems (Abingdon, United Kingdom).
  • Methodology Analysis by cytofluorometry of the expression of the CD86 molecule on T lymphocytes by double labeling.
  • a cell culture sample is taken to analyze the expression of the CD86 molecule on T lymphocytes by double labeling in flow cytometry (FACS Vantage type cytofluorimeter; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium).
  • the cells are washed in FACS buffer (10 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide) before being distributed in wells of a culture plate 96 wells with conical bottom (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 2 ⁇ 10 5 cells in a volume of 50 ⁇ l of FACS buffer.
  • an anti-human CD3 antibody labeled with phycoerythrin (anti-CD3 PE) (Becton Dickinson) or an isotypic control antibody labeled with phycoerythrin (Becton Dickinson).
  • an anti-human CD86 antibody labeled with biotin (clone IT2.2; Pharmingen) or a control antibody.
  • biotin clone IT2.2; Pharmingen
  • a control antibody After 20 minutes of incubation at 4 ° C, the cells are washed twice with 200 ⁇ l of FACS buffer before being incubated in the presence of Cychrome-labeled streptavidin (Pharmingen) at a concentration of 10 ⁇ g / ml to detect the anti-CD86 antibody.
  • the CD86 molecule is not expressed by human T lymphocytes freshly isolated from peripheral blood. - CD86 + T cells are detected from D3 after the first stimulation.
  • the culture conventionally contains 50 ⁇ 10% of CD86 + T lymphocytes (result obtained on 20 experiments).
  • the percentage of CD86 + T lymphocytes continues to increase until a homogeneous population of lymphocytes which all express the CD86 molecule is obtained.
  • Example 2 The expression of the CD86 molecule is restricted to T lymphocytes expressing the CD45RO molecule (memory lymphocytes).
  • CD86 molecule is restricted to memory T lymphocytes (expressing the CD45RO molecule) (see Figure 2). at. Methodology: Human CMNs were stimulated by the antibody CD3 OKT3 and 1TL-2 as described in Example 1. The expression of the CD45RO molecule on CD86 + and CD86- T lymphocytes was evaluated by cytofluorometry in double marking after 15 days of culture. In fact, we observed that after 7 days of culture, all of the cells of the population are made up of CD3 + T lymphocytes. 2x10 5 cells are washed in FACS buffer, resuspended in FACS buffer and distributed in a 96-well culture plate with conical bottom at the rate of 50 ⁇ l / well.
  • Example 3 Compared to CD86- T lymphocytes, CD86 + T lymphocytes express higher levels of costimulation and activation molecules and selectively express certain molecules playing a crucial role in the immune response.
  • CMNs were stimulated with the anti-CD3 antibody OKT3 and 1TL-2 for 15 days as described in Example 1.
  • the phenotype of the CD86 + and CD86- T lymphocytes was analyzed by FACS in double labeling. The phenotype is compared to that of freshly isolated T cells from blood which have been purified by the rosette technique with sheep erythrocytes.
  • the CMNs are resuspended at a concentration of 200 ⁇ 10 6 cells / ml and mixed with 1 ml of a 50% solution of sheep erythrocytes (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). The cell suspension is incubated at 4 ° C overnight. After a gentle resuspension, the T cells are isolated by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (1500 rpm for 30 minutes at room temperature). The sheep erythrocyte-T lymphocyte complexes are collected at the bottom of the tube. Red blood cells are lysed by two hypotonic shocks successive. The purity of the T cells thus isolated, evaluated by labeling with an anti-CD3 FITC antibody, is> 95%.
  • Cell labeling with the antibodies is carried out as described in Example 1: the cells are washed in FACS buffer before resuspension in FACS buffer at the rate of 2 ⁇ 10 6 cells / ml. The cells are then distributed in the wells of a 96-well culture plate with a conical bottom at the rate of 50 ⁇ l / well.
  • an anti-CD54 FITC antibody an anti-CD80 FITC antibody, or an anti-HLA-Dr FITC antibody (all from Becton Dickinson), or an anti-CD70 FITC antibody (Pharmingen, San Diego, CA), either an anti-CD30 FITC antibody (Dako, Glostrup, Denmark), or an anti-CD40-L FITC antibody (Ancell, Bayport, MN), or the control antibodies corresponding to each isotype (Becton Dickinson).
  • the expression of the CD86 molecule is evaluated using an anti-human CD86 antibody labeled with biotin (clone IT2.2) (Pharmingen).
  • the cells are washed 3 times with 200 ⁇ l of FACS buffer before being incubated in the presence of streptavidin labeled with Cychrome (Pharmingen) at a concentration of 10 ⁇ g / ml to detect the antibodies anti-CD86.
  • the cells are washed 3 times with 200 ⁇ l of FACS buffer before being resuspended in 200 ⁇ l of this same buffer for analysis by cytofluorometer.
  • the expression of the molecules CD54, CD80, HLA-Dr, CD70, CD30 and CD40-L is compared on freshly isolated T lymphocytes, CD86 T lymphocytes and CD86 + T lymphocytes.
  • Results As presented in Table I and FIG. 3, the results show that: - The freshly isolated T lymphocytes express the activation molecules at weakly detectable levels and do not express the costimulation molecules CD80 and CD86.
  • CD86 + T cells express higher levels of CD25 and HLA-Dr activation markers than CD86- T cells.
  • CD86 + T lymphocytes express higher levels of the CD54 and CD80 costimulation molecules than CD86- lymphocytes.
  • the CD30 molecule is not expressed by freshly purified T lymphocytes.
  • the CD30 molecule is expressed only by CD86 + lymphocytes.
  • TNF ⁇ family molecules such as CD40-L and CD70 molecules are not expressed by freshly purified T lymphocytes, are little expressed on CD86 cells - but are mainly expressed by CD86 + lymphocytes.
  • Table I below presents the results obtained after comparison of the surface molecules expressed by human CD86 + T lymphocytes and CD86- T lymphocytes.
  • Human CMNs were stimulated with the anti-CD3 antibody OKT3 and 1TL-2 as described in Example 1.
  • the expression of different surface molecules on CD86 + and CD86- T lymphocytes is carried out by double labeling in cytofluorometry (FACScan, Becton Dickinson) after two weeks of culture.
  • the results presented summarize the data obtained with cells from 5 different subjects.
  • Table I Phenotypic characterization of T lymphocytes expressing the CD86 molecule and of T lymphocytes not expressing the CD86 molecule (the values in brackets correspond to the percentage of cells expressing the molecule).
  • Example 4 CD86 positive T cells produce larger amounts of IFN ⁇ than CD86 negative T cells.
  • CMNs were stimulated as described in Example 1.
  • the CD86 + cells were separated from the CD86 cells using a cell sorting cytoffuorometer (FACSVantage, Becton Dickinson). Briefly, the cells were incubated with an anti-CD86 FITC antibody (clone IT2.2, Pharmingen) (5 ⁇ g of antibody for 5 ⁇ 10 6 cells / 500 ⁇ l) for 20 minutes at 4 ° C. After three washes with complete culture medium, the CD86 + cells are separated from the CD86- cells on the basis of the expression of the CD86 molecule. The purity of the two T lymphocyte populations, analyzed by cytofluorometry, is> 98%. As a control, the non-separated populations are incubated or not with a neutralizing anti-CD86 antibody (IT2.2, used at 10 ⁇ g / ml) were also used.
  • IT2.2 neutralizing anti-CD86 antibody
  • the cells are resuspended in complete culture medium at the concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml and activated or not with for 6 hours with 10 ng / ml of phorbol myristate acetate (Sigma, Saint Louis, MO) plus 1 ⁇ M of ionomycin (Calbiochem, San Diego, CA).
  • the culture supernatants are collected and centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ° C.
  • Methodology Measurement of the frequency of IFN ⁇ producing T lymphocytes among CD86 + and CD86- T lymphocytes.
  • the T lymphocytes are stimulated in the presence of 2.5 ⁇ g / ml of brefeldine A (Molecular Probes, Eu confusing, OR). After washing, the cells are incubated in a 96-well conical bottom culture plate with an anti-CD86 antibody labeled with biotin. After 20 minutes of incubation at 4 ° C, the cells are washed 3 times with 200 ⁇ l of FACS buffer before being incubated in the presence of streptavidin labeled with Cychrome as described in Example 1.
  • brefeldine A Molecular Probes, Eu confusing, OR
  • Example 5 CD86 positive human T lymphocytes provide the costimulation signals necessary for the proliferation and activation of naive T lymphocytes.
  • CD86 + T cells were generated as described in Example 1 and used one week after the second stimulation (Example 1, Figure 1).
  • CD86- T cells were isolated two weeks after stimulation (as described in Example 1) using a cell sorting cytofluorometer (as described in Example 4a). The cells are then fixed using a solution of 1% paraformaldehyde prepared in 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 for 10 minutes at 4 ° C. After three washes in phosphate buffer, the cells are incubated with a neutralization solution (200 mM L-lysine, Sigma). After three washes in phosphate buffer, the cells are resuspended in complete culture medium at the concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Naive T lymphocytes (CD45RA positive) are isolated from peripheral blood. Briefly, the CMNs are isolated by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient as described in Example 1 and the T lymphocytes are purified by the rosette technique, as described in Example 3. After washing, the cells are resuspended in the complete culture medium and incubated with an anti-CD45RO antibody for 20 minutes at 4 ° C (5 ⁇ g of antibody for 5 ⁇ 10 6 cells / 1 ml of cell suspension). After washing, the cells are incubated with magnetic beads carrying anti-mouse immunoglobulin antibodies (Dynabeads system, Dynal). CD45RO + T cells are removed from the cell suspension by the action of a magnetic field.
  • CD45RA + CD45RO- T cell population is resuspended in complete culture medium at the concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • CD45RA positive T lymphocytes (2x10 5 cells / ml, 100 ⁇ l / well) are cultured in a 96-well round-bottom culture plate (Nunc) and stimulated with 10 ng / ml of anti-CD3 OKT3 antibody in the absence or in the presence of either CD86 + T cells or CD86 T cells at a final concentration of 2 x 10 5 cells / well.
  • the experiments are carried out in the presence or absence of 10 ⁇ g / ml of neutralizing anti-human CD86 antibody (clone IT2.2, Pharmingen or clone FUN-1, Ancell). The different experimental conditions are carried out three times.
  • CD86 + and CD86- cell populations from two different donors are generated as described above.
  • CD45RA + T lymphocytes (2 ⁇ 10 6 cells / ml, 100 ⁇ l / well) are cultured in a 96-well round-bottom culture plate (Nunc) in the absence or in the presence of either CD86 + T lymphocytes or CD86- to the final concentration of 2x10 5 cells / well.
  • CD86 + human T lymphocytes provide a costimulation signal necessary for proliferation (Figure 5a) and the production of IFN ⁇ ( Figure 5b) by naive human T lymphocytes (CD45RA) stimulated by a suboptimal dose of anti-CD3 antibodies.
  • CD86 + cells but not CD86- cells are capable of inducing a mixed lymphocyte reaction ( Figure 5c).
  • the role of costimulation carried by CD86 + T lymphocytes is inhibited by two different anti-CD86 neutralizing antibodies (clones IT2.2 and FUN-1) demonstrating the functionality of the CD86 molecule expressed by T lymphocytes ( Figure 5c).
  • Example 6 The CD86 molecule expressed by human T lymphocytes has an apparent molecular weight of 70 kDa.
  • CD86 molecule expressed by human T lymphocytes has an apparent molecular weight of 70 kDa similar to the CD86 molecule expressed by CPAg. at.
  • Methodology A population of T lymphocytes expressing the CD86 molecule was generated by two successive stimulations as described in Example 1.
  • the Daudi human B lymphoid line and the Jurkat human T lymphoid line were obtained from the American Type Culture Collection . These cells are cultured in complete medium (RPMI medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 10% of decomplemented fetal calf serum).
  • the cells are collected and washed three times with RPMI medium and then lysed in a 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 0.5% of Nonidet P40 and a cocktail of protease inhibitors (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) for 20 minutes at 4 ° C.
  • the cell lysates are then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to remove the nuclei.
  • the supernatant is taken up in an equivalent volume of 10 mM phosphate buffer containing 0.1% bromophenol blue, 5% glycerol and 0.1% ⁇ -mercaptoethanol.
  • the proteins are then separated according to their molecular weight by polyacrylamide gel electrophoresis (5% concentration gel - 10% separation gel).
  • a quantity of proteins corresponding to 5 ⁇ 10 6 cells is deposited in each line. After migration, the proteins are transferred by Western blotting onto a nitrocellulose membrane. After saturation in a phosphate solution containing 10% of skimmed milk, the membranes are incubated overnight at 4 ° C with shaking with an anti-CD86 antibody (clone IT2.2, Pharmingen) at a concentration of 10 ⁇ g / ml. After washing with a phosphate buffer containing 10% of skimmed milk, the membranes are incubated with a goat anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with peroxidase (Dako) for 2 hours at room temperature with shaking. The membranes are washed in phosphate buffer.
  • Example 7 The CD86 + T lymphocytes exhibit spontaneous cytotoxic activity with respect to the tumor cell line 562.
  • the example here is the fact that human T lymphocytes expressing the molecule
  • CD86 are able to spontaneously kill tumor cells in vitro (Figure 7). at. Methodology: A mixed population of T lymphocytes expressing or not expressing the CD86 molecule was generated 14 days after stimulation, as described in example 1. The CD86- and CD86 + T lymphocytes were isolated using of a cell sorting cytofluorometer as described in Example 4. Human T lymphocytes from peripheral blood were isolated as described in Example 3.
  • the target cell is the K562 line which was obtained from the American Type Culture Collection. These cells are cultured in complete medium (RPMI medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 10% of decomplemented fetal calf serum). These cells are collected and washed twice with RPMI medium. They are then incubated with a 51 Cr solution (100 ⁇ Ci / 10 6 cells) for 90 minutes at 37 ° C. The cells are then centrifuged and washed three times with complete culture medium. The target cells are then distributed in a 96-well round-bottom culture plate (Nunc) at the rate of 1x10 5 cells / well.
  • complete medium RPMI medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 10% of decomplemented fetal calf serum. These cells are collected and washed twice with RPMI medium. They are then incubated with a 51 Cr solution (100 ⁇ Ci / 10 6 cells) for 90 minutes at 37 ° C. The cells are then centrifuged and washed
  • Effector cells freshly isolated peripheral blood T cells, CD86 + T cells, CD86 T cells or a mixed population (50/50) of CD86 + T cells / CD86 T cells
  • the culture plate is then incubated in an oven at 37 ° C, 5% CO 2 in a humid atmosphere for 4 hours.
  • 100 ⁇ l of supernatant are removed and the release of 51 Cr is measured using a ⁇ radiation counter (Packard, Australia). Spontaneous release is measured in the supernatants of target cells alone.
  • the total release of 51 Cr is measured on the culture wells containing only target cells and treated with a 1% solution of Tween 20 in 10 mM phosphate buffer, pH 7.4.
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Abstract

L'invention concerne des lymphocytes exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, des procédés pour préparer une population pratiquement homogène de ces lymphocytes et leur application en thérapeutique et en diagnostique.

Description

LYMPHOCYTES T HUMAINS EFFECTEURS EXPRIMANT LA MOLECULE CD86 ET LEUR UTILISAΗON THERAPEUTIQUE
5 La présente invention concerne des lymphocytes exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, des procédés pour préparer une population pratiquement homogène de ces lymphocytes et leur application en thérapeutique et en diagnostique.
Les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans la régulation d'une réponse immune ainsi que dans le maintien d'une réponse immune mémoire. De part les
10 médiateurs solubles qu'ils produisent et les molécules de surface qu'ils expriment, ils contrôlent l'état d'activation de nombreuses cellules immunitaires effectrices comme les lymphocytes B, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (rôle d'initiateurs et de régulateurs) et participent directement à la destruction des agents exogènes pathogènes (tels que les virus et les bactéries) ou les cellules tumorales (rôle
15 effecteur direct). Une activation des lymphocytes T est nécessaire pour qu'ils acquièrent des propriétés fonctionnelles (Swain SL et al, Immunol Rev. (1996) 150, 143-67).
L'immunothérapie cellulaire est un traitement qui consiste à réinjecter chez un patient des cellules autologues qui ont été modifiées ex vivo afin de leur conférer des
20 propriétés physiologiques particulières, qu'elles ne peuvent pas acquérir in vivo. Par exemple, les sujets atteints de cancer ou d'immunosuppression ne développent pas de réponse effectrice efficace. Une approche classique en immunothérapie cellulaire consiste à prélever des cellules mononucléées sanguines (CMN), à les stimuler in vitro afin d'induire la prolifération et de conférer des propriétés cytotoxiques aux
25 lymphocytes T. L'intérêt de stimuler les CMN ex vivo avant de les réinjecter permet d'éviter la toxicité liée à l'injection systémique d'activateurs lymphocytaires T.
Différentes méthodes ont été rapportées pour générer ex vivo des cellules T effectrices utilisables en immunothérapie cellulaire. Une cytokine classiquement utilisée dans ce type d'approche est l'interleukine 2 (IL-2) (Mule JJ et al, Science
30 (1984) 225, 1487-9 & brevet WO 91/4444) qui agit en favorisant la prolifération des lymphocytes T et en leur permettant d'acquérir des propriétés cytotoxiques. D'autres stimuli des lymphocytes T comme des cytokines (telles que l'IL-4 ou l'IL-7) ou des anticorps activateurs dirigés contre des molécules de surface (telles que les molécules CD3 (Landegren U et al, Eur J Immunol. (1984) 14, 325-8), CD2 (Van Lier RA et al, Eur J Immunol. (1988) 18, 167-72 & Brevet Européen 40 96 55) et/ou CD28 (Greenfield EA, et al, Crit Rev Immunol. (1998) 18, 389-418)) sont utilisés seuls ou en association afin de générer ces cellules.
Néanmoins, l'activation de CMN in vitro ne conduit pas à l'expansion d'une population homogène de lymphocytes T ayant tous un phénotype et une fonction bien déterminés mais à un ensemble de populations présentant des degrés d'activation, des phénotypes et des propriétés fonctionnelles différents. La génération d'une population homogène, dont la production serait reproductible, dont les caractéristiques phénotypiques seraient connues, qui serait facilement identifiable et présenterait simultanément plusieurs fonctions effectrices (c'est-à-dire, outre des propriétés cytotoxiques, des propriétés immunologiques bénéfiques en cas d'immuno- suppression), constituerait une avancée considérable. Ceci permettrait : (i) d'optimiser les procédures de stimulation ex vivo, (ii) d'évaluer ex vivo pour chaque sujet la composition de la préparation, (iii) de n'injecter au patient que les cellules d'intérêt et donc (iv) d'augmenter l'efficacité du traitement.
Jusqu'à présent, la relation entre les propriétés fonctionnelles et le phénotype des sous populations lymphocytaires T n'est pas complètement élucidée. Les lymphocytes T de type CD4 reconnaissent des fragments d'antigènes présentés par les cellules présentatrices d'antigène (CPAg) en association avec le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) et sont considérés comme ayant des propriétés "helper" (c'est-à-dire capables d'aider les lymphocytes B et les lymphocytes T cytotoxiques à acquérir leurs propriétés fonctionnelles). Les lymphocytes de type CD8 reconnaissent des fragments d'antigènes présentés par les CPAg en association avec le CMH I et sont généralement considérés comme possédant des. propriétés cytotoxiques. De plus, il est clairement établi qu'une expression accrue d'un certain nombre de molécules telles que les molécules CD25 et CD54 caractérisent les lymphocytes T activés (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67). Les lymphocytes T n'ayant jamais rencontré l'antigène vis-à-vis duquel ils sont spécifiques sont appelés lymphocytes T naïfs et sont caractérisés par l'expression de la molécule CD45RA. Les lymphocytes T ayant déjà rencontré l'antigène vis-à-vis duquel ils sont spécifiques sont appelés lymphocytes T mémoires et expriment la molécule CD45RO (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143- 67).
L'intensité et la nature des signaux nécessaires à l'activation des lymphocytes T varient selon qu'il s'agit de lymphocytes T naïfs ou mémoires. Les lymphocytes T naïfs doivent recevoir plus de signaux de costimulation que les lymphocytes T mémoires pour être correctement activés et se différencier en cellules effectrices. Ces signaux de costimulation sont fournis par les CPAg et en particulier par les cellules dendritiques. Si les lymphocytes rencontrent l'antigène en l'absence de signaux de costimulation, ils deviennent anergiques, tolérants ou meurent par apoptose. Ainsi, des traitements visant à activer les lymphocytes T via les molécules de costimulation qu'ils expriment (à l'aide de ligands solubles recombinants ou de transfectants cellulaires exprimant ce ligand) sont donc proposés comme approche thérapeutique pour le traitement des phénomènes de tolérance et d'ignorance rencontrés par exemple dans les cancers (Melero I et al, Life Sci. (1997) 60, 2035-41) mais également pour augmenter l'efficacité d'une réponse immune dirigée contre des agents exogènes pathogènes (Kaye PM, Immunol Today (1995) 16, 423-7). Parmi les nombreuses molécules de costimulation connues, la molécule CD86 possède des propriétés de costimulation très puissantes. La molécule CD86 est exprimée constitutivement à la surface de nombreuses CPAg (Lenschow DJ et al, Annu Rev Immunol (1996) 14, 233-58). Elle possède deux ligands : (1) la molécule CD28, exprimée constitutivement par les lymphocytes T, qui génère, après ligation à la molécule CD86 (ou à la molécule CD80), un puissant signal d'activation des lymphocytes T et (2) la molécule CTLA-4, exprimée uniquement par les lymphocytes T activés et qui génère, après ligation à la molécule CD 86 (ou à la molécule CD 80), un signal d'inhibition. L'activité fonctionnelle des lymphocytes T est donc régulée en partie par les signaux activateurs et inhibiteurs médiés par les molécules CD28 et CTLA-4, respectivement. Récemment, l'expression et le rôle de la molécule CD86 ont été mis en évidence à la surface des lymphocytes T. La régulation de son expression sur les lymphocytes T reste mal connue et semble être différente chez l'homme et la souris. Les lymphocytes T murins expriment spontanément une forme fonctionnelle du CD86 (Hakamada-Taguchi R et al, Eur J Immunol. (1998) 28, 865- 73) alors que les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang ne l'expriment pas. Bien que son activité biologique n'ait pas été évaluée, la molécule CD86 a été décrite sur les lymphocytes T humains après activation des CMN in vitro (Azuma M et al, Nature (1993) 366, 76-9). La seule étude qui a évalué l'activité biologique de la molécule CD86 sur les cellules T humaines a utilisé des clones lymphocytaires T humains et rapporte que la molécule CD86 exprimée par ces cellules est hypoglycosylée (comparativement à la molécule CD86 exprimée par les CPAg) et inactive (Hollsberg P et al, J. Immunol. (1997) 159, 4799-805).
La présente invention concerne une nouvelle population pratiquement homogène de lymphocytes T humains polyclonaux, caractérisée par l'expression de la molécule CD86 fonctionnelle et en outre par des propriétés cytotoxiques, immunostimulantes et surtout des propriétés costimulatrices.
Les propriétés costimulatrices ne sont qu'en partie médiées par l'expression de la molécule CD86, de nombreuses autres molécules de costimulation étant exprimées à des niveaux très importants ou de manière sélective sur ces cellules.
Un intérêt croissant est manifesté actuellement sur le rôle essentiel que peuvent jouer les molécules de costimulation en immunothérapie et en particulier en cancérologie. De ce fait, l'utilisation de ces lymphocytes T qui, en l'absence de toute transfection ou modification, expriment de façon constitutive de nombreuses molécules de costimulation, et en particulier la molécule CD86 fonctionnelle, apparaît un apport essentiel. De manière exceptionnelle, en plus des propriétés cytotoxiques couramment générées après stimulation des CMN in vitro, les lymphocytes T selon la présente invention expriment de manière concomitante des propriétés de costimulation et d'immunostimulation, propriétés qui ne sont en général apportées par les CPAg. C'est la première fois que l'on décrit des lymphocytes T humains ayant des propriétés costimulatrices en partie médiées par la molécule CD86 fonctionnelle. Cette population peut être utilisée notamment en immunothérapie cellulaire dans le traitement des cancers, des maladies infectieuses, des déficits immunitaires et dans le domaine de la vaccinologie.
L'invention concerne également les lymphocytes T exprimant la molécule CD86 comme une source de nouvelles molécules lymphocytaires impliquées dans la réponse immune.
La présente invention concerne également un procédé de diagnostique d'anomalies immunitaires par la mise en évidence dans le sang ou les tissus de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 fonctionnelle en utilisant notamment des anticorps anti-CD86. Ce diagnostique permettra, par exemple, de mettre en évidence des déficits immunitaires graves d'origine congénitale (syndrome de Owen par exemple), des maladies auto-immunes (type arthrite), des infections virales (CMV et HIV) ou des infections bactériennes latentes.
L'invention concerne également des compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles comportent au moins des lymphocytes T ou une population de lymphocytes T humains pratiquement homogène exprimant la molécule CD86 fonctionnelle.
Les lymphocytes ou les populations de cellules obtenus peuvent être utilisés pour la réalisation d'un médicament destiné plus particulièrement au traitement des immunodeficiences congénitales, acquises ou d'origine pathologique. Il peut s'agir notamment du traitement des patients ayant une réponse immune absente ou déficiente vis-à-vis par exemple d'une tumeur ou d'un pathogène. Les produits selon l'invention pourront être utilisés notamment pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement : - des affections microbiennes (virus, bactérie, parasite, levure, incluant notamment les problèmes liés aux transplantations) et, - des cancers, en particulier sujets HIV positifs et/ou atteints de myélome, lymphome, leucémie, mélanome, carcinome du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, par exemple. Les lymphocytes et les populations de lymphocytes T CD86+ selon la présente invention peuvent également être utilisés en tant qu'adjuvant ou immunostimulant en vaccinologie et ce en combinaison avec des antigènes vaccinants et/ou d'autres composés de type bactérien, viral ou ADN par exemple, afin de produire des vaccins thérapeutiques.
Les lymphocytes CD86+ et les populations contenant des lymphocytes T CD86+ selon la présente invention peuvent également être utilisés dans le cas de traitements des chocs septiques.
Il est important de remarquer que, grâce au procédé selon la présente invention, ces populations de lymphocytes T CD86+ peuvent être utilisées en injection autologue, c'est-à-dire qu'il est possible de partir des cellules du patient, CMN ou isolât de lymphocytes, de mettre en œuvre le procédé, puis de les réinjecter après stimulation. Ceci représente bien entendu l'énorme avantage d'écarter tout risque lié à des contaminations éventuelles et à tout phénomène d'antigénicité.
Bien entendu, les compositions thérapeutiques selon la présente invention pourront comprendre d'autres éléments utiles dans le traitement de pathologies particulières, il pourra s'agir de molécules chimiques, médicaments par exemple, ou biologiques, organismes génétiquement modifiés, bactérien ou viral, dont on voudra utiliser les gènes ou les antigènes.
Il sera possible également d'utiliser des lymphocytes ou des populations de lymphocytes T selon la présente invention caractérisés en ce qu'ils ont été puisés avec un extrait biologique ou des dérivés biologiques, il peut s'agir dans ce cas de cellules ou de microbes ou de dérivés de type peptide, protéine, glycolipide, glycopeptide et lipopeptide par exemple ainsi que des mélanges, notamment d'antigènes, dans ce cas on utilise notamment la propriété des lymphocytes selon la présente invention à posséder des propriétés costimulatrices nécessaires lors du processus de présentation de l'antigène.
Enfin, la population de lymphocytes T selon la présente invention peut être transfectée ou couplée avec de l'ADN ou des molécules chimiques ou immuno- logiques, afin de favoriser par exemple l'expression et/ou le ciblage de certains de ces produits. Les propriétés des populations selon la présente invention seront analysées ci- après avant les exemples. 1. Procédé d'obtention
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle, caractérisé en ce que, à partir d'un échantillon contenant des lymphocytes T humains, on effectue au moins deux stimulations séquentielles desdits lymphocytes. Par "population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle" on entend désigner une population contenant plus de 70 %, de préférence plus de 90 %, de cellules T CD86+ .
La stimulation est effectuée à l'aide d' activateurs et de composés assurant la prolifération des lymphocytes T. Les activateurs sont choisis de préférence parmi les anticorps activateurs anti-CD2, anti-CD3 et anti-CD28 et les mitogènes ou des mélanges de ces composés ; on utilisera également des composés stimulant la prolifération des lymphocytes T, notamment les interleukines IL-2 (Mier JW et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 6134-6138 ; Northoff et al, J. Immunol. (1980) 125, 1823-1828 ; Mier JW et al J. Immunol. (1982) 128, 1122-7), IL-4, IL-7 par exemple.
Parmi les mélanges de stimulations préférés, il faut citer :
- les mélanges anticorps anti-CD3 et IL-2, et
- les mélanges anticorps anti-CD28 et anticorps anti-CD3 et IL-2. Par "stimulation séquentielle", on entend désigner deux stimulations effectuées sur culture de cellules en milieu neuf à au moins 4 jours d'intervalle, et de préférence à au moins 7 jours, en général cet intervalle sera de l'ordre de 1 à 3 semaines, il dépendra, en particulier, de l'intensité de la stimulation.
La présente invention concerne donc un procédé caractérisé en ce que la durée entre deux stimulations est d'au moins 4 jours, de préférence 7 jours.
Après chaque stimulation, on ajoute de préférence régulièrement, par exemple tous les 2 jours, une cytokine stimulant la prolifération des lymphocytes T.
Après la deuxième stimulation, de même, on attendra de préférence quelques jours, par exemple plus de 4 jours, en général plus de 7 jours, avant d'obtenir une population pratiquement homogène de lymphocytes T exprimant la molécule CD86. Les lymphocytes T peuvent être cultivés avec tous les milieux appropriés, lesquels sont connus de l'homme de métier, des exemples de tels milieux de type RPMI 1640 seront explicités notamment dans les exemples. Le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine.
Les quantités d'agents stimulants utilisées varient en fonction de l'agent utilisé, par exemple les anticorps seront utilisés de préférence à des concentrations de 10 à 1 000 ng/ml, de préférence de 10 à 500 ng/ml, quant aux cytokines elles sont utilisées à des concentrations de l'ordre de 10 à 1 000 U/ml, notamment de 100 à 500 U/ml. Dans le procédé selon la présente invention, l'échantillon contenant des lymphocytes T est de préférence soit un prélèvement de cellules mononucléées sanguines (CMN), soit un isolât de lymphocytes T provenant de CMN.
Afin de générer rapidement une population pratiquement homogène de lymphocytes T CD86 positifs, on utilisera l'un des deux protocoles suivants : - Les cellules du sang sont prélevées du sang périphérique par leucophérèse et les CMN sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (comme détaillé dans l'exemple 1). Une stimulation des CMN (106 cellules/ml) est réalisée dans le milieu de culture décrit dans l'exemple 1 (sachant que le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine) avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain OKT3 (Kung P et al, Science (1979) 206, 347-349 ; Tax, WMJM et al, Nature (1983) 304, 445-447) plus 200 U/ml d'IL-2 humaine recombinante. Tous les deux jours, de 1TL-2 humaine recombinante sera ajouté, par exemple 200 U/ml. A partir de 7 jours (et jusqu'à 21 jours comme décrit dans l'exemple 1), une seconde stimulation avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 sera réalisée. Tous les deux jours, de 1TL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml.
- Les cellules du sang sont prélevées du sang périphérique par leucophérèse et les CMN sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (comme détaillé dans l'exemple 1). Les lymphocytes T sont isolés des CMN par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton (comme détaillé dans l'exemple 3). Une stimulation des lymphocytes T (106 cellules/ml) est réalisée dans le milieu de culture décrit dans l'exemple 1 (sachant que le sérum de veau pourra être remplacé par du sérum humain autologue ou par un milieu adapté sans protéine d'origine animale ou humaine) avec un anticorps monoclonal anti-CD28 humain (préalablement adsorbé sur la surface de culture à la concentration de 20 μg/ml) (Martin PJ et al, J. Immunol. (1986) 136, 3282-7 ; Nunes J et al, Int. Immunol. (1993) 5, 311-5) en présence d'une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 humaine recombinante. Tous les deux jours, de 1TL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml. A partir de J7, une seconde stimulation avec une quantité par exemple de 200 ng/ml d'anticorps OKT3 plus 200 U/ml d'IL-2 sera réalisée. Tous les deux jours, de 1TL-2 humaine recombinante sera ajoutée, par exemple 200 U/ml.
De façon générale, il faut noter qu'une seconde stimulation est toujours nécessaire afin d'obtenir une population homogène contenant essentiellement des lymphocytes T CD86 + . En effet, le pourcentage de lymphocytes CD86+ varie dans le temps : consécutivement à une première stimulation, ces cellules apparaissent, prolifèrent puis disparaissent en l'absence de restimulation. Les données présentées dans l'exemple 1 décrivent la génération et la cinétique d'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T après stimulation des CMN par un anticorps anti-CD3 activateur en présence d'IL-2 (Figure 1).
Que le protocole 1 ou 2 soit utilisé, deux approches peuvent être proposées afin d'isoler les cellules T CD86+ possédant les propriétés biologiques selon la présente invention.
On peut ainsi mettre en oeuvre les protocoles 1 et 2 comme décrits ci-dessus. Pour la majorité des sujets, tous les lymphocytes expriment la molécule CD86 une semaine après la seconde stimulation. Si ce n'est pas le cas, les cellules seront cultivées de 2 à 4 jours supplémentaires avec par exemple 200 U/ml d'IL-2 pour obtenir une population de cellules T exprimant toutes la molécule CD 86.
Il convient de rappeler que la présente invention concerne de façon générale les lymphocytes T CD86 + , lesquels peuvent être obtenus notamment en mettant en oeuvre les protocoles 1 et 2 de façon incomplète, c'est-à-dire en ne faisant que la première stimulation avec l'anticorps anti-CD3 plus 1TL-2 (en présence ou non de l'anticorps anti-CD28). Dans ce cas, la totalité des cellules n'exprimant pas la molécule CD86 après au moins 7 jours de culture, les cellules CD86+ pourront être purifiées à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules. Les cellules CD86 négatives et positives seront isolées sur la base du niveau d'expression de la molécule HLA-Dr qui est plus faible sur les cellules CD86- que sur les cellules CD86+ (voir Exemple 3,
Tableau I et Figure 3). Dans ce cas bien sûr, l'obtention d'une population homogène de lymphocytes T CD86+ peut être plus laborieuse mais peut être réalisée.
Le protocole utilisé montre qu'une population pratiquement homogène constituée de lymphocytes T humains CD86+ n'est générée qu'après une série d'au moins deux stimulations impliquant conjointement au moins deux stimuli de nature différente comme par exemple un anticorps anti-CD3 et de l'interleukine 2 (Exemple 1 et Figure
1) ou un anticorps anti-CD28, un anticorps anti-CD3 et de l'interleukine 2.
La présente invention concerne également une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains CD86+ tels qu'ils peuvent être obtenus notamment par le procédé décrit précédemment mais qui peuvent être obtenus par d'autres procédés, notamment après une seule stimulation et un tri cellulaire.
2. Molécules de surface exprimées par les lymphocytes T CD86+ Les lymphocytes selon l'invention expriment au moins l'une des molécules suivantes de façon stable : CD25, CD54 et CD80, et de façon transitoire : CD30, CD40-L et
CD70. La molécule CD86 constitue le marqueur de référence pour caractériser cette nouvelle population de lymphocytes T humains mémoires et effecteurs.
L'analyse phénotypique par cytofluorométrie de la population de lymphocytes T générés montre que ces cellules présentent un phénotype de cellules effectrices mémoires (Swain SL et al, Immunol Rev (1996) 150, 143-67) (Exemple 2 et Figure 2). Les lymphocytes T selon la présente invention expriment les molécules CD2, CD3, CD4 ou CD8 et de façon remarquable, la molécule CD86. Ils expriment entre autres les molécules membranaires suivantes : CD25 (chaîne alpha du récepteur à l'interleukine 2), CD45RO (molécule exprimée de manière sélective par les lymphocytes T mémoires) (Exemple 2 et Figure 2), complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I), CMH II, CD54 et CD80 (Exemple 3 et Tableau I). Ils expriment sélectivement, bien que de manière transitoire, la molécule CD30, le ligand de la molécule CD40 (CD40-L) et la molécule CD70 (Exemple 3 et Figure 3).
L'expression de nombreuses molécules membranaires diffère sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- contenus dans une même population hétérogène (générée après seulement une stimulation, (voir Exemple 1)).
- La molécule CD86 n'apparaît que sur les lymphocytes T exprimant la molécule CD45RO (voir Exemple 2, Figure 2) ; la molécule CD45RO caractérise les cellules mémoires (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
- Les molécules CD25, CD54, CD80 et HLA-Dr sont invariablement exprimées de façon plus importante sur les lymphocytes T CD86+ que sur les lymphocytes T CD86- (voir Exemple 3, Figure 3 et Tableau I) ; l'expression accrue des molécules CD25, CD54 et HLA-Dr sur les cellules CD86+ montrent qu'elles sont dans un état d'activation important (Swain SL et al, Immunol. Rev. (1996) 150, 143-67).
- L'expression membranaire des molécules CD30, CD40-L et CD70 est pratiquement restreinte aux lymphocytes T CD86+ (Exemple 3, Figure 3 et Tableau I).
2. 1. Molécules de surface conférant des propriétés costimulatrices aux lymphocytes T CD86 + .
Les molécules de costimulation CD54, CD70, CD80, et CD86 sont exprimées de façon accrue sur les lymphocytes T CD86+ . L'utilisation des molécules de costimulation apparaît actuellement comme une nouvelle approche thérapeutique de choix et est proposée notamment : (i) en immunothérapie anticancéreuse (Liebowitz DN et al, Curr Opin Oncol (1998) 10, 533-41) ; (ii) pour faciliter l'établissement d'une réponse lymphocytaire T efficace vis-à-vis d'agents exogènes microbiens (Kaye PM, Immunol Today (1995)16, 423-7) ; et (iii) en tant qu'adjuvant en vaccinologie (Chamberlain RS et al, Cancer Res. (1996) 56, 2832-6). Ces molécules sont généralement exprimées de façon constitutive et à des taux élevés par les CPAg. Leur rôle principal est de fournir des cosignaux d'activation aux lymphocytes T lors de l'interaction CPAg-lymphocytes T. Ces interactions sont nécessaires à l'éducation et à l'activation des lymphocytes T lors de la présentation antigénique.
- La molécule CD54 se lie à la molécule LFA-1 qui transduit un puissant signal de costimulation aux lymphocytes T (Van Seventer GA et al, J. Immunol (1990) 144, 4579-86).
- De même, lorsque les molécules CD80 et CD86 se lient à leur ligand CD28 exprimé par les lymphocytes T, un signal de costimulation médié par le CD28 permet une activation efficace des lymphocytes T, objectivée par une augmentation de la prolifération et une production d'IL-2.
- La ligation de la molécule CD27, exprimée par les lymphocytes T non activés, par son ligand qui est la molécule CD70, induit la génération d'un signal de costimulation qui favorise la production de lymphokines et la prolifération cellulaire
(Kobata T et al, J. Immunol. (1994) 153, 5422-32).
2.2. Molécules de surface conférant des propriétés cytotoxiques aux lymphocytes T
CD86 + .
Les molécules CD40-L, CD70, CD80 et CD86 sont exprimées par les cellules CD86 + . Elles permettent aux lymphocytes T CD86+ d'acquérir des propriétés cytotoxiques. En effet :
- L'activation des cellules Natural Killer (NK) via le CD27 (qui a pour ligand la molécule CD70) augmente leur activité cytotoxique (Yang FC et al, Immunology (1996) 88, 289-93). - La molécule CD40-L va également favoriser le développement d'une réponse cytotoxique et ce par deux mécanismes : a. en se liant à la molécule CD40 exprimée par les CPAg, elle conduit à une activation des CPAg (et en particulier des cellules dendritiques) si puissante que ces cellules vont pouvoir conférer une activité cytotoxique à des lymphocytes T naïfs, en l'absence de lymphocyte T "helper" (Bennet SR et al. , Nature (1988) 393, 478-
83), b. en se liant à la molécule CD40 présente à la surface de certaines cellules tumorales, elle favorise le rejet de ces cellules par les lymphocytes cytotoxiques en augmentant la sensibilité des cellules tumorales à la mort par apoptose et/ou en favorisant l'expression par des cellules tumorales de molécules de costimulation qui vont faciliter la génération d'une réponse cytotoxique spécifique (Dilloo D et al , Blood (1997) 80, 1927-33).
- Les molécules CD80 et CD86 sont essentielles dans la génération de réponses cytotoxiques antivirales et antitumorales. Cette activité particulière a été rapportée de nombreuses fois dans la littérature, en particulier dans des modèles de vaccination puisqu'elles favorisent l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique spécifique. La molécule CD80 augmente les propriétés cytotoxiques des cellules NK (Yeh KY et al , Cell Immunol (1995) 165, 217-24) ainsi que la génération de lymphocytes T cytotoxiques mémoires (Flynn K & Mullbacher A, Eur J Immmunol (1997) 27, 456-62). La transfection de cellules avec un gène codant pour la molécule CD 80 augmente la fréquence de lymphocytes T cytotoxiques générés ainsi que leur activité fonctionnelle vis-à-vis de cellules infectées par un virus (He XS et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93, 7274-8 ; Rao JB et al. , J Immunol (1996) 156, 3357- 65 ; Tsuji T et al , Eur J Immunol (1997) 27, 782-7) ou vis-à-vis de cellules tumorales (Pϋtzer BM et a , Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94, 10889-94 ; Imro MA et al , Hum Gène Ther (1998) 9, 1335-44 ; Leong CC et al , Eur J Immunol (1997) 71, 476-82). De la même manière, un signal via la molécule CD28, consécutif à l'interaction avec les molécules CD80 et/ou CD86, est requise pour générer des lymphocytes T cytotoxiques (Azuma M et al , J Immunol (1993) 150, 2091-101 ; Lanier LL et al , J Immunol (1995) 154, 97-105). L'interaction des molécules CD80 et/ou CD86 avec leur ligand CD28 a également été impliquée dans la génération d'une réponse efficace vis-à-vis du parasite Toxoplasma gondii (Hunter CA et al, J Immunol (1997) 158, 2285-93).
2.3. Molécules de surface conférant des propriétés immunostimulatrices aux lymphocytes T CD86 + . La molécule CD40-L confère aux cellules qui l'expriment des propriétés immunostimulantes. Après ligation à la molécule CD40, elle induit l'activation des monocytes (Laman JD et al , Crit Rev Immunol. (1996) 16, 59-108) ainsi que la maturation (induction de l'expression de la molécule CD83) et l'activation (production d'IL-12) des cellules dendritiques. L'injection d'ADN codant pour la molécule CD40- L augmente l'efficacité d'une réponse immune (humorale et cellulaire) et induit une immunité protectrice contre des agents infectieux ou contre un challenge tumoral (Gurunathan et a , J Immunol. (1998) 161, 4563-71). Les molécules CD40-L et CD70 confèrent aux cellules qui les expriment la capacité de stimuler les lymphocytes B (propriété "helper" pour les lymphocytes B). En se fixant à son ligand la molécule CD40, le CD40-L participe aux processus de commutation isotypique, de production d'immunoglobulines, de survie et de prolifération des lymphocytes B (Laman JD et a , Crit Rev Immunol. (1996) 16, 59-108). De la même manière, la molécule CD70 est impliquée dans la régulation de la prolifération des cellules B, de la production dTgG et d'IgM et de la différentiation en plasmocytes (Agematsu K et al , Eur J Immunol. (1995) 25, 2825-29).
3. Molécules produites par les lymphocytes T CD86+ La présente invention concerne les cytokines et notamment les lymphokines produites par une population de lymphocytes T CD86+ tels que décrits précédemment ainsi qu'une lymphokine purifiée obtenue à partir des lymphokines selon l'invention. Le profil de cytokines produites par les cellules T CD86+ est différent des cellules CD86-(Exemple 4, Figures 4a et 4b) :
- certaines cytokines, comme l'interferon gamma (IFNγ), sont produites en quantité beaucoup plus importante par les lymphocytes T CD86+ que par les lymphocytes T CD86- (Figure 4a). La fréquence de cellules produisant de l'IFNγ est plus élevée dans les lymphocytes T CD86+ que dans les lymphocytes T CD86- (Figure 4b) ;
- d'autres cytokines comme le TNFα sont produites en quantité très importante par les lymphocytes T CD86+ (de l'ordre de 10 à 100 ng/ml) mais également par les cellules CD86- (Figure 4b).
Ces deux cytokines participent aux activités cytotoxiques, immunostimulantes et costimulatrices des lymphocytes T CD86 + . LTFNγ joue un rôle crucial dans la résistance vis-à-vis des pathogènes et dans la réponse antitumorale. De plus, il possède des puissantes propriétés antivirales, augmente l'activité bactéricide des macrophages et favorise l'expression des molécules CMH I et CMH II et donc le développement des réponses immunes antimicrobiennes et antitumorales (Boehm U, Ann Rev Immunol (1997) 15, 749-95). LTFNγ est utilisé en clinique dans le traitement des cancers (ex : cancer du rein).
Le TNFα induit la mort des cellules tumorales qui expriment l'un de ses récepteurs (Hieber U & Heim ME, Oncology (1994) 51, 142-53). Il joue également un rôle clé dans l'initiation de la phase inflammatoire en activant de nombreux partenaires cellulaires comme les cellules endotheliales, les cellules épithéliales et les cellules effectrices de la réaction inflammatoire comme les monocytes, les neutrophiles et les éosinophiles. En activant ces cellules, il participe également à la phase effectrice de la réponse antimicrobienne (Camussi G et al , Eur J Biochem (1991) 202, 3-14).
Il est essentiel de noter que, de manière remarquable, les lymphocytes T CD86 + présentent de façon concomitante un ensemble de molécules de surface ou de cytokines exprimées par les cellules effectrices (comme les cellules cytotoxiques) mais également par les CPAg. Ceci leur confère la capacité d'initier, de réaliser (phase effectrice) et de contrôler une réponse immune. Ces propriétés sont exemplifiées ci- dessous.
4. Propriétés fonctionnelles des lymphocytes T exprimant la molécule CD86
L'invention revendique la génération d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 et présentant de manière simultanée les fonctions effectrices suivantes : costimulation (c'est-à-dire qu'elles favorisent la génération d'une réponse lymphocytaire naïve), cytotoxicité (c'est-à-dire qu'elles assurent la destruction de cellules tumorales et/ou de micro-organismes pathogènes) et immunostimulation. Les propriétés effectrices des lymphocytes T CD86+ ont été comparées à celles des cellules T CD86-. 4.1. Les lymphocytes T CD86+ possèdent de puissantes propriétés costimulatrices. L'activation (prolifération et production de cytokines) des lymphocytes T naïfs (exprimant la molécule CD45RA) requiert au moins deux signaux : un premier signal via le récepteur T, qui peut être mimé par un anticorps anti-CD3, et un deuxième signal via des molécules de costimulation telles la molécule CD28. Deux types d'expériences ont été utilisés pour objectiver les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+ . Dans ces deux types d'expériences des lymphocytes T naïfs ont été utilisés comme cellules répondeuses car c'est dans cet état d'activation que les lymphocytes T nécessitent de recevoir le plus de signaux de costimulation pour être activés. Les tests utilisés sont les suivants : - activation de lymphocytes T naïfs stimulés avec une dose suboptimale d'anticorps activateur anti-CD3 (OKT3). L'activation des lymphocytes T naïfs est objectivée par une induction de la prolifération (Exemple 5, Figure 5a) et de la production d'IFNγ (Exemple 5, Figure 5b), - activation de lymphocytes T naïfs en présence de lymphocytes T CD86+ hétérologues. Dans ce test (réaction lymphocy taire mixte) est mesurée la prolifération des lymphocytes T naïfs (Exemple 5, Figure 5c).
Les résultats montrent que les lymphocytes T CD86+ sont capables d'activer les lymphocytes T naïfs. L'utilisation d'anticorps neutralisants anti-CD86 montre que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est biologiquement active et participe, au moins en partie, à l'activité de costimulation. Au contraire, les lymphocytes T CD86- ainsi que des lymphocytes T fraîchement isolés ne présentent pas ou peu d'activité de costimulation (Exemple 5, Figures 5a, 5b et 5c).
Cette mise en évidence d'une activité fonctionnelle de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est confortée par des expériences complémentaires montrant que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T présente (i) une séquence nucléotidique équivalante à celle reportée dans la littérature (numéro d'accession U04343 dans la banque de données GenBank) ainsi que (ii) un degré de glycosylation similaire à celui de la molécule CD86 exprimée par les CPAg (Azuma M et al , Nature (1993) 366, 76-9) (Exemple 6, Figure 6). 4.2. Les lymphocytes T CD86+ présentent des propriétés cytotoxiques. La stimulation des lymphocytes T par 1TL-2 conduit à la génération de lymphocytes T tueurs (également appelés "lymphokine activated killer cells" ou LAK) possédant spontanément de puissantes propriétés cytotoxiques. La majorité des techniques de génération de cellules cytotoxiques consiste à stimuler des lymphocytes T in vitro avant de les réinjecter chez les patients. Ces protocoles exploitent le fait que la stimulation va non seulement induire une prolifération des lymphocytes T mais également leur conférer des propriétés cytotoxiques. En effet, en l'absence d'activation, les lymphocytes T naïfs ainsi que les lymphocytes mémoires n'ont pas ou peu de propriété cytotoxique. Nous rapportons que les lymphocytes T CD86+ présentent spontanément une activité cytotoxique vis-à-vis de cellules tumorales (Exemple 7, Figure 7). Cette activité cytotoxique est également portée par une population mixte contenant des lymphocytes CD86+ et des lymphocytes CD86- et par les lymphocytes T CD86-. Par contre, les lymphocytes T fraîchement isolés et non activés ne tuent pas les cellules tumorales.
Un exemple utilisant comme cellule cible la lignée tumorale K562 est présenté dans l'exemple 7 (Figure 7).
Légendes des Figures
Figure 1 : Génération in vitro d'une population de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 par stimulation de CMN issues du sang périphérique avec un anticorps anti-CD3 en présence d'IL-2. Des CMN humaines issues du sang périphérique ont été stimulées (à J0) avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de 1TL-2 (comme décrit dans l'exemple 1) et ont été (D) ou non (H) stimulées une deuxième fois à J21 avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'interleukine 2 (comme décrit dans l'exemple 1). De l'interleukine 2 est ajoutée tous les deux jours à la culture. L'expression de . la molécule CD86 sur les lymphocytes T CD3+ est évaluée en cytofluorométrie de façon cinétique sur 6 semaines par double marquage. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules T exprimant la molécule CD86. Ils sont représentatifs d'une expérience parmi 10. Figure 2 : Les lymphocytes T humains CD86+ expriment la molécule CD45RO. Des CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de l'interleukine 2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de la molécule CD45RO par les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par double marquage en cytofluorométrie après 15 jours de culture. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 10.
Figure 3 : Expression préférentielle des molécules CD30, CD40 ligand et CD70 sur les lymphocytes T CD86+ . Des CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps OKT3 et de l'interleukine 2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression des molécules HLA-Dr, CD30, CD40-L et CD70 sur les lymphocytes T CD86 + et CD86- a été évaluée par double marquage en cytofluorométrie après 15 jours de culture. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 10. Figures 4a et 4b : Comparaison de la production d'IFNγ par les lymphocytes T CD86+ et CD86-. Figure 4a : Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après 2 semaines de culture, les lymphocytes T CD86+ et CD86- ont été triés à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules et stimulés avec de la PMA plus de la ionomycine pendant 6 heures. La population totale a également «été traitée de la même façon» après ou non incubation avec l'anticorps neutralisant anti-CD86 (IT2.2). LTFNγ a été dosé dans les surnageants par ELIS A. Les résultats, exprimés en pg/ml (moyenne ± SD) sont représentatifs d'une expérience parmi 3.
Figure 4b : Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après 3 semaines de culture, les cellules ont été stimulées pendant 6 heures avec de la PMA plus ionomycine en présence de brefeldine A. Les cellules ont alors été marquées avec un anticorps anti-CD86, fixées, perméabilisées puis marquées avec un anticorps anti- IFNγ. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 3. Figures 5a, 5b et 5c : Les lymphocytes T CD86+ fournissent les signaux de costimulation nécessaires à l'activation des lymphocytes T naïfs. Figures 5a et 5b : Test de costimulation de cellules T naïves en présence d'un anticorps anti-CD3. Les cellules T CD86+, générées et purifiées comme décrit dans l'exemple 1, ont été fixées à la paraformaldéhyde puis cultivées avec des lymphocytes T naïfs stimulés avec un anticorps anti-CD3 en présence ou non d'anticorps neutralisants anti-CD86 (clones IT2.2 ou FUN-1) ou d'un anticorps monoclonal d'isotype contrôle. L'activation des lymphocytes T est objectivée par une induction de la prolifération (n=5) (figure 5a) et de la production d'IFNγ (n=3) (figure 5b). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD, n=3.
Figure 5c : Test de réaction lymphocytaire mixte. Les lymphocytes T CD86+ et CD86- ont été générés et purifiés comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules ont été fixées à la paraformaldéhyde puis cultivées avec des lymphocytes T naïfs allogéniques en présence d'anticorps neutralisants anti-CD86 (clones IT2.2 ou FUN-1) ou d'un anticorps monoclonal d'isotype contrôle. La prolifération des lymphocytes T naïfs a été mesurée après 5 jours d'incubation par incorporation de 3H-Thy. Les expériences ont été réalisées en quintuplicate, les résultats sont exprimés en moyenne ± SD, n=3. Figure 6 : La molécule CD86 exprimée par les lymphocytes B et T humains présente un poids moléculaire similaire de 70 kDa. Des extraits de protéines membranaires et solubles de la lignée B humaine Daudi, de cellules T CD86+ (obtenues comme décrit dans l'exemple 1) et de la lignée T Jurkat ont été séparés selon leur poids moléculaire en SDS-PAGE en condition réduite. L'expression de la molécule CD86 a été évaluée par Wertern Blotting en utilisant un anticorps polyclonal anti-CD86 humain. Figure 7 : Les lymphocytes T CD86+ présentent une activité cytotoxique spontanée vis-à-vis de la lignée tumorale K562. Une population pratiquement homogène de lymphocytes T CD86+ a été obtenue. La population cellulaire contenant des cellules T CD86+ et des cellules T CD86- a été obtenue 15 jours après la première stimulation de CMN comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules T CD86- et les cellules CD86+ ont été purifiées à l'aide d'un trieur de cellules comme décrit dans l'exemple 4. Les cellules T non activées ont été obtenues par la technique des rosettes comme décrit dans l'exemple 3. Les cellules cibles K562 marquées au 51Cr ont été incubées avec les cellules effectrices suivantes (selon un rapport cellules effectrices : cellules cibles- de 50: 1) : des lymphocytes T fraîchement isolés et non stimulés, la population cellulaire contenant des cellules CD86+ et des cellules T CD86-, des lymphocytes T CD86+ purifiés et des lymphocytes T CD86- purifiés est mesurée en triplicate par le relargage de 51Cr et est exprimée en pourcentage de cytotoxicité comme défini dans l'exemple 7 (moyenne ± SD, n=3).
Exemple 1 : Génération d'une population homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 après stimulation de cellules mononucléées humaines isolées du sang périphérique avec un anticorps anti-CD3 en présence d'IL-2.
Nous exemplifions ici une méthode permettant de générer des lymphocytes T CD86 positifs ainsi qu'une étude cinétique d'apparition de la molécule CD86 sur les lymphocytes T (voir Figure 1). a. Méthodologie : Génération de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86.
Les lymphocytes T CD86 positifs (CD86+) sont générés à partir de sang périphérique humain. Le sang est prélevé par leucophérèse (en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium). Les cellules mononucléées (CMN) (contenant les lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes) sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité = 1,077) (Pharmacia, Uppsala, Suède). Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies). Les CMN sont ensuite mises en culture à la concentration de lxlO6 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : RPMI 1640 supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM L- glutamine. Les CMN sont activées avec une concentration minimale de 200 ng/ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 humain clone OKT3 en présence d'interleukine 2 (IL-2) humaine recombinante à la concentration de 200 U/ml. De 1TL-2 humaine est ajoutée à la culture tous les deux jours. Une deuxième stimulation des cellules à J21 va permettre de générer une population homogène de lymphocytes T humains exprimant tous la molécule CD86. Brièvement, les lymphocytes sont collectés à J21, lavés deux fois en milieu RPMI 1640 puis remis en culture dans du milieu de culture complet à la concentration de lxlO6 cellules/ml. Les cellules sont activées avec 200 ng/ml d'anticorps anti-CD3 et 200 U/ml d'IL-2 recombinante. De 1TL-2 (200 U/ml) est ajoutée tous les deux jours.
L'anticorps anti-CD3 humain (clone OKT3) est produit par le myélome CRL- 8001 obtenu auprès de l' American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Le myélome est cultivé en milieu Dulbecco modifiée selon Iscove (Life technologies) supplémenté de 20 % de sérum de veau foetal décomplémenté, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 /xg/ml de streptomycine. L'anticorps est purifié par fixation sur une colonne de protéine A couplée à de la Sépharose (Pierce). Ils sont ensuite détachés de la résine en présence d'une solution Tris-HCl 10 mM pH 4. Le pH de la fraction éluée est ensuite ramené à pH 7,0. La fraction éluée est concentrée puis quantifiée (réactif de colorimétrie des protéines BCA, Pierce). La pureté des anticorps anti-CD3 est vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en condition réduite et non réduite avant coloration au nitrate d'argent. La pureté est > 95 % . La stérilité de la solution d'anticorps anti-CD3 est assurée par filtration sur 0,22 μm. L'interleukine 2 humaine recombinante (produite en système procary otique) est obtenue auprès de R & D Systems (Abingdon, Royaume Uni). b. Méthodologie : Analyse par cytofluorométrie de l'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T par double marquage.
A différents temps, un échantillon de la culture cellulaire est prélevé pour analyser l'expression de la molécule CD86 sur les lymphocytes T par double marquage en cytométrie en flux (cytofluorimètre de type FACS Vantage ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique). Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01 % d'azide de sodium) avant d'être réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 2xl05 cellules dans un volume de 50 μl de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CD3 humain marqué à la phycoerythrine (anti-CD3 PE) (Becton Dickinson) soit un anticorps isotypique contrôle marqué à la phycoerythrine (Becton Dickinson). Dans chacune de ces conditions est ajouté soit un anticorps anti-CD86 humain marqué à la biotine (clone IT2.2 ; Pharmingen) soit un anticorps contrôle. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 2 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome (Pharmingen) à la concentration de 10 μg/ml pour détecter l'anticorps anti- CD86. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 μl de ce même tampon. L'analyse de l'expression de CD86 à la surface des lymphocytes T (CD3+) est analysée par FACS. c. Résultats : les résultats présentés dans la Figure 1 montrent que :
- La molécule CD86 n'est pas exprimée par les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique. - Des cellules T CD86+ sont détectées dès J3 après la première stimulation.
- Le pourcentage de lymphocytes T CD 86+ varie avec le temps.
- Deux à trois semaines après la stimulation, la culture contient classiquement 50 ± 10 % de lymphocytes T CD86+ (résultat obtenu sur 20 expériences).
- Le pourcentage de cellules CD86+ décroît après 4 à 5 semaines en l'absence de restimulation.
- En réponse à une deuxième stimulation à J21, le pourcentage de lymphocytes T CD86+ continue d'augmenter jusqu'à obtention d'une population homogène de lymphocytes qui expriment tous la molécule CD86.
Exemple 2 : L'expression de la molécule CD86 est restreinte aux lymphocytes T exprimant la molécule CD45RO (lymphocytes mémoires).
On montre que l'expression de la molécule CD86 est restreinte aux lymphocytes T mémoires (exprimant la molécule CD45RO) (voir Figure 2). a. Méthodologie : Des CMN humaines ont été stimulées par l'anticorps anti- CD3 OKT3 et de 1TL-2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de la molécule CD45RO sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- a été évaluée par cytofluorométrie en double marquage après 15 jours de culture. En effet, nous avons observé qu'après 7 jours de culture la totalité des cellules de la population est constituée de lymphocytes T CD3 + . 2xl05 cellules sont lavées dans du tampon FACS, remises en suspension dans du tampon FACS et réparties dans une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 50 μl/puits. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CD45RO humain FITC (Becton Dickinson), soit un anticorps isotypique contrôle (Becton Dickinson). L'expression de CD86 est évaluée à l'aide d'un anticorps anti-CD86 humain marqué à la biotine. Après incubation à 4°C, les cellules sont lavées 2 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome à la concentration de 10 μg/ml pour détecter l'anticorps anti- CD86. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS puis sont resuspendues dans 200 μl de ce même tampon. b. Résultats : Les résultats présentés dans la Figure 2 montrent que tous les lymphocytes T CD86+ présentent un phénotype de cellule mémoire puisqu'ils expriment la molécule CD45RO.
Exemple 3 : Comparativement aux lymphocytes T CD86-, les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus importants de molécules de costimulation et d'activation et expriment sélectivement certaines molécules jouant un rôle crucial dans la réponse immune.
On compare l'expression des molécules de surface présentes sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- issus d'une même population hétérogène obtenue deux semaines après la première stimulation. Les résultats sont présentés dans le tableau I et certains exemples sont détaillés dans la figure 3. a. Méthodologie : Les CMN ont été stimulées avec l'anticorps anti-CD3 OKT3 et de 1TL-2 pendant 15 jours comme décrit dans l'exemple 1. Le phénotype des lymphocytes T CD86+ et CD86- a été analysé par FACS en double marquage. Le phénotype est comparé à celui des lymphocytes T fraîchement isolés du sang qui ont été purifiés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton. Brièvement, les CMN sont remises en suspension à la concentration de 200xl06 cellules/ml et mélangées avec 1 ml d'une solution à 50 % d' érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). La suspension cellulaire est incubée à 4°C pendant une nuit. Après une remise en suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes érythrocytes de mouton-lymphocytes T sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules T ainsi isolées, évaluée grâce à un marquage avec un anticorps anti-CD3 FITC, est > 95 % .
Le marquage cellulaire avec les anticorps est réalisé comme décrit dans l'exemple 1 : les cellules sont lavées dans du tampon FACS avant remise en suspension dans du tampon FACS à raison de 2xl06 cellules/ml. Les cellules sont ensuite réparties dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 50 μl/puits. Dans chacune des conditions sont ajoutés soit un anticorps anti- CD54 FITC, soit un anticorps anti-CD80 FITC, soit un anticorps anti-HLA-Dr FITC (tous provenant de Becton Dickinson), soit un anticorps anti-CD70 FITC (Pharmingen, San Diego, CA), soit un anticorps anti-CD30 FITC (Dako, Glostrup, Danemark), soit un anticorps anti-CD40-L FITC (Ancell, Bayport, MN), soit les anticorps contrôles correspondant à chaque isotype (Becton Dickinson). L'expression de la molécule CD86 est évaluée à l'aide d'un anticorps anti-CD86 humain marqué à la biotine (clone IT2.2) (Pharmingen). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome (Pharmingen) à la concentration de 10 μg/ml pour détecter les anticorps anti-CD86. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être resuspendues dans 200 μl de ce même tampon pour l'analyse au cytofluoromètre. L'expression des molécules CD54, CD80, HLA-Dr, CD70, CD30 et CD40-L est comparée sur les lymphocytes T fraîchement isolés, les lymphocytes T CD86- et les lymphocytes T CD86 + . b. Résultats : Comme présenté dans le tableau I et la figure 3, les résultats montrent que : - Les lymphocytes T fraîchement isolés expriment les molécules d'activation à des taux faiblement détectables et n'expriment pas les molécules de costimulation CD80 et CD86.
- Les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus élevés de marqueurs d'activation CD25 et HLA-Dr que les lymphocytes T CD86-. - Les lymphocytes T CD86+ expriment des taux plus élevés des molécules de costimulation CD54 et CD80 que les lymphocytes CD86-. - La molécule CD30 n'est pas exprimée par des lymphocytes T fraîchement purifiés.
- La molécule CD30 est exprimée uniquement par les lymphocytes CD86 + .
- Les molécules de la famille du TNFα comme les molécules CD40-L et CD70 ne sont pas exprimées par des lymphocytes T fraîchement purifiés, sont peu exprimées sur les cellules CD86- mais sont essentiellement exprimées par les lymphocytes CD86+ .
Le tableau I ci-après présente les résultats obtenus après comparaison des molécules de surface exprimées par des lymphocytes T humains CD86+ et des lymphocytes T CD86-. Des CMN humaines ont été stimulées avec l'anticorps anti- CD3 OKT3 et de 1TL-2 comme décrit dans l'exemple 1. L'expression de différentes molécules de surface sur les lymphocytes T CD86+ et CD86- est réalisée par double marquage en cytofluorométrie (FACScan, Becton Dickinson) après deux semaines de culture. Les résultats présentés résument les données obtenues avec les cellules provenant de 5 sujets différents. Le symbole* représente le pourcentage de cellules positives (moyenne ± SD, n=5).
Tableau I. Caractérisation phénotypique des lymphocytes T exprimant la molécule CD86 et des lymphocytes T n'exprimant pas la molécule CD86 (les valeurs entre parenthèses correspondent au pourcentage de cellules exprimant la molécule).
Cellules T fraîchement CD86 - CD86 + isolées
HLA-Dr + /- (5% ± 1) + + + +
CD25 - + + + + +
CD30 - - + + (40 % ± 12)
CD40-L - - + (10 % ± 3)
CD54 + /- + + +
CD70 - - + + (39 % ± 8) CD80 + + +
Exemple 4 : Les lymphocytes T CD86 positifs produisent de plus grandes quantités d'IFNγ que les lymphocytes T CD86 négatifs.
On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains CD86+ produisent plus d'IFNγ que les lymphocytes T humains CD86-. Ceci a été objectivé par deux approches différentes. a. Méthodologie : Mesure de la production d'IFNγ par ELISA.
Des CMN ont été stimulées comme décrit dans l'exemple 1. Après deux semaines de culture, les cellules CD86 + ont été séparées des cellules CD86- à l'aide d'un cytoffuoromètre trieur de cellules (FACSVantage, Becton Dickinson). Brièvement, les cellules ont été incubées avec un anticorps anti-CD86 FITC (clone IT2.2, Pharmingen) (5 μg d'anticorps pour 5xl06 cellules/500 μl) pendant 20 minutes à 4°C. Après trois lavages avec du milieu de culture complet, les cellules CD86 + sont séparées des cellules CD86- sur la base de l'expression de la molécule CD86. La pureté des deux populations lymphocytaires T, analysée par cytofluorométrie, est >98 % . En tant que contrôle, les populations non séparées sont incubées ou non avec un anticorps neutralisant anti-CD86 (IT2.2, utilisé à 10 μg/ml) ont également été utilisées.
Les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2xl06 cellules/ml et activées ou non avec pendant 6 heures avec 10 ng/ml de phorbol myristate acétate (Sigma, Saint Louis, MO) plus 1 μM de ionomycin (Calbiochem, San Diego, CA). Les surnageants de culture sont collectés et centrifugés à 2500 rpm pendant 15 minutes à 4°C. Les taux d'IFNγ sont quantifiés dans les surnageants en utilisant un kit ELISA commercial (R & D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Les résultats, exprimés en ng/ml (moyenne ± SD, n=3), sont présentés dans la figure 4a. b. Méthodologie : Mesure de la fréquence de lymphocytes T producteurs IFNγ parmi les lymphocytes T CD86+ et CD86-.
Dans ce cas, les lymphocytes T sont stimulés en présence de 2,5 μg/ml de bréfeldine A (Molecular Probes, Eugène, OR). Après lavage, les cellules sont incubées dans une plaque de culture 96 puits à fond conique avec un anticorps anti- CD86 marqué à la biotine. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être incubées en présence de streptavidine marquée au Cychrome comme décrit dans l'exemple 1. Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 3 fois avec 200 μl de tampon FACS avant d'être fixées et perméabilisées en utilisant un kit commercial en respectant la procédure décrite (kit Cytowash/cytoperm, Pharmingen). Les cellules (2xl05) sont incubées dans une plaque de culture 96 puits à fond conique avec un anticorps anti-IFNγ FITC pendant 20 minutes à 4°C sous un volume de 50 μl. Après deux lavages dans du tampon FACS, les cellules sont analysées au cytofluoromètre. Les résultats sont présentés dans la figure 4b. c. Résultats : les résultats présentés dans les Figures 4 a et 4b montrent que :
- Consécutivement à une stimulation, la fréquence de cellules productrices d'IFNγ est plus importante dans la population de lymphocytes CD86+ que dans la population de lymphocytes T CD86- (Figure 4a)
- Les lymphocytes T CD86+ produisent plus d'IFNγ que les lymphocytes T CD86- après activation (Figure 4b).
Exemple 5: Les lymphocytes T humains CD86 positifs fournissent les signaux de costimulation nécessaires à la prolifération et à l'activation des lymphocytes T naïfs.
On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains CD86+ mais pas les lymphocytes T CD86- fournissent les signaux de costimulation requis pour induire une activation efficace des lymphocytes T naïfs (mesurée par l'induction de prolifération et/ou de la production d'IFNγ) (Figures 5 a, 5b et 5c). a. Méthodologie : Expériences de costimulation utilisant un anti-CD3.
Les lymphocytes T CD86+ ont été générés comme décrit dans l'exemple 1 et utilisés une semaine après la seconde stimulation (exemple 1, figure 1). Les lymphocytes T CD86- ont été isolés deux semaines après stimulation (comme décrit dans l'exemple 1) à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules (comme décrit dans l'exemple 4a). Les cellules sont ensuite fixées à l'aide d'une solution de paraformaldéhyde à 1 % préparée en tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 pendant 10 minutes à 4°C. Après trois lavages en tampon phosphate, les cellules sont incubées avec une solution de neutralisation (200 mM L-lysine, Sigma). Après trois lavages en tampon phosphate, les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2xl06 cellules/ml.
Les lymphocytes T naïfs (CD45RA positifs) sont isolés du sang périphérique. Brièvement, les CMN sont isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque comme décrit dans l'exemple 1 et les lymphocytes T sont purifiés par la technique des rosettes, comme décrit dans l'exemple 3. Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture complet et incubées avec un anticorps anti- CD45RO pendant 20 minutes à 4°C (5 μg d'anticorps pour 5xl06 cellules/1 ml de suspension cellulaire). Après lavage, les cellules sont incubées avec des billes magnétiques portant des anticorps anti-immunoglobulines de souris (système Dynabeads, Dynal). Les lymphocytes T CD45RO+ sont retirés de la suspension cellulaire par action d'un champ magnétique. Après lavage, la population de cellules T CD45RA+ CD45RO- est remise en suspension dans du milieu de culture complet à la concentration de 2xl06 cellules/ml. La pureté, déterminée par cytofluorométrie en utilisant un anticorps anti-CD45RA FITC comparativement à un anticorps isotypique contrôle, est > 95 %. Les lymphocytes T CD45RA positifs (2xl05 cellules/ml, 100 μl/puits) sont cultivés en plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) et stimulés avec 10 ng/ml d'anticorps anti-CD3 OKT3 en l'absence ou en présence soit de lymphocytes T CD86+ soit de lymphocytes T CD86- à la concentration finale de 2xl05 cellules/puits. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence de 10 μg/ml d'anticorps neutralisant anti-CD86 humain (clone IT2.2, Pharmingen ou clone FUN- 1, Ancell). Les différentes conditions expérimentales sont réalisées trois fois.
L'activation des cellules T CD45RA est mesurée par deux critères : - la prolifération des cellules est évaluée après 3 jours de culture par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-Thy, Amersham, Amersham, Royaume Uni). Brièvement, 0,25 μCi de 3H-Thy sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de 3H-Thy est mesurée par un compteur à scintillantion (Packard, Australie). Les résultats, présentés dans la figue 5a, sont exprimés en cpm (moyenne ± sd, n=5), - la production d'IFNγ est mesurée dans les surnageants de culture comme décrit dans l'exemple 4 après deux jours de culture. Les résultats, présentés dans la figue 5b, sont exprimés en ng/ml (moyenne ± sd, n=3). b. Méthodologie : Réactions lymphocytaires mixtes.
Les populations cellulaires CD86+ et CD86- provenant de deux donneurs différents sont générées comme décrit ci-dessus. Les lymphocytes T CD45RA + (2xl06 cellules/ml, 100 μl/puits) sont cultivés en plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) en l'absence ou en présence soit de lymphocytes T CD86+ soit de lymphocytes T CD86- à la concentration finale de 2xl05 cellules/puits. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence de 10 μg/ml d'anticorps neutralisant anti-CD86 (clone IT2.2 ou clone FUN-1). Les différentes conditions expérimentales sont réalisées trois fois. Après 5 jours de culture, la prolifération des cellules est évaluée par mesure de l'incorporation de 3H-Thy comme décrit dans ci- dessus. Les résultats sont présentés dans la figure 5c (moyenne ± SD, n=5). c. Résultats : Comme présenté dans les Figures 5a, 5b et 5c, les résultats montrent que :
- Les lymphocytes T humains CD86+ fournissent un signal de costimulation nécessaire pour la prolifération (Figure 5a) et la production d'IFNγ (Figure 5b) par les lymphocytes T humains naïfs (CD45RA) stimulés par une dose suboptimale d'anticorps anti-CD3.
- Cet effet de costimulation porté par les lymphocytes T CD86+ est partiellement inhibé par deux anticorps anti-CD86 neutralisants différents (clones IT2.2 et FUN-1) démontrant la fonctionnalité de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T (Figures 5a et 5b).
- Les lymphocytes T CD86- ne sont pas capables de supporter cette activité de costimulation (Figures 5a et 5b).
- Les cellules CD86+ mais pas les cellules CD86- sont capables d'induire une réaction lymphocy taire mixte (Figure 5c). - Le rôle de costimulation porté par les lymphocytes T CD86+ est inhibé par deux anticorps neutralisants anti-CD86 différents (clones IT2.2 et FUN-1) démontrant la fonctionnalité de la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T (Figure 5c).
- Les lymphocytes T CD86- ne sont pas capables de supporter cette activité de costimulation (Figure 5c).
- Le fait que les anticorps anti-CD86 ne neutralisent que partiellement les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+ suggère que d'autres molécules de costimulation, également exprimées par les lymphocytes T CD86 + , participent à l'activité de costimulation portée par ces cellules. En conclusion, les résultats montrent que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains est fonctionnelle. Le fait que les anticorps anti-CD86 ne neutralisent que partiellement les propriétés costimulatrices des lymphocytes T CD86+ suggère que d'autres molécules de costimulation, également exprimées par les lymphocytes T CD86+, participent à l'activité de costimulation portée par ces cellules.
Exemple 6 : La molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa.
On exemplifie ici le fait que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa similaire à la molécule CD86 exprimée par les CPAg. a. Méthodologie : Une population de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 a été générée par deux stimulations successives comme décrit dans l'exemple 1. La lignée lymphoide B humaine Daudi et la lignée lymphoide T humaine Jurkat ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection. Ces cellules sont cultivées en milieu complet (milieu RPMI supplémenté de 2 mM de L-glutamine et de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté) . Les cellules sont collectées et lavées trois fois avec du milieu RPMI puis lysées dans un tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne) pendant 20 minutes à 4°C. Les lysats cellulaires sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 10 minutes à 4°C pour enlever les noyaux. Le surnageant est repris dans un volume équivalent de tampon phosphate 10 mM contenant 0,1 % de bleu de bromophénol, 5 % de glycérol et 0,1 % de β- mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite séparées selon leur poids moléculaire par électrophorèse en gel de polyacrylamide (gel de concentration 5 % - gel de séparation 10 %). Une quantité de protéines correspondant à 5xl06 cellules est déposée dans chaque ligne. Après migration, les protéines sont transférées par Western Blotting sur une membrane de nitrocellulose. Après saturation dans une solution phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées pendant une nuit à 4°C sous agitation avec un anticorps anti-CD86 (clone IT2.2, Pharmingen) à la concentration de 10 μg/ml. Après lavage avec un tampon phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées avec un anticorps de chèvre anti- immunoglobulines de souris marqué à la péroxidase (Dako) pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les membranes sont lavées en tampon phosphate. Les anticorps fixés sont détectés par chimioluminescence en utilisant le système ECL de Amersham. b. Résultat : le Western Blotting (Figure 6) montre que la molécule CD86 exprimée par les lymphocytes T humains présente un poids moléculaire apparent de 70 kDa (ligne 2). Ce poids moléculaire est le même que celui présenté par les cellules B humaines (lignée Daudi) (ligne 1). La molécule CD86 n'est pas exprimée par les cellules Jurkat (ligne 3). Nous avons confirmé que les cellules CD86- n'expriment pas de molécule CD86 (résultats non présentés).
Exemple 7 : Les lymphocytes T CD86+ présentent une activité cytotoxique spontanée vis-à-vis de la lignée cellule tumorale 562. On exemplifie ici le fait que les lymphocytes T humains exprimant la molécule
CD86 sont capables de tuer spontanément in vitro des cellules tumorales (Figure 7). a. Méthodologie : Une population mixte de lymphocytes T exprimant ou n'exprimant pas la molécule CD86 a été générée 14 jours après la stimulation, comme décrit dans l'exemple 1. Les lymphocytes CD86- et les lymphocytes T CD86+ ont été isolés à l'aide d'un cytofluoromètre trieur de cellules comme décrit dans l'exemple 4. Les lymphocytes T humains issus du sang périphérique ont été isolés comme décrit dans l'exemple 3.
La cellule cible est la lignée K562 qui a été obtenue auprès de l' American Type Culture Collection. Ces cellules sont cultivées en milieu complet (milieu RPMI supplémenté de 2 mM de L-glutamine et de 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté). Ces cellules sont collectées et lavées deux fois avec du milieu RPMI. Elles sont ensuite incubées avec une solution de 51Cr (100 μCi/106 cellules) pendant 90 minutes à 37°C. Les cellules sont ensuite centrifugées et lavées trois fois avec du milieu de culture complet. Les cellules cibles sont ensuite réparties dans une plaque de culture 96 puits à fond rond (Nunc) à raison de lxlO5 cellules/puits. Les cellules effectrices (lymphocytes T du sang périphérique fraîchement isolés, lymphocytes T CD86+ , lymphocytes T CD86- ou une population mixte (50/50) de lymphocytes T CD86+/ lymphocytes T CD86-) sont ajoutées à raison de 50 cellules effectrices pour une cellule cible pour un volume final de 200 μl. La plaque de culture est ensuite incubée dans une étuve à 37°C, 5 % de CO2 en atmosphère humide pendant 4 heures. 100 μl de surnageant sont prélevés et le relargage de 51Cr est mesuré à l'aide d'un compteur de rayonnements γ (Packard, Australie). Le relargage spontané est mesuré dans les surnageants de cellules cibles seules. Le relargage total de 51Cr est mesuré sur les puits de culture contenant uniquement des cellules cibles et traitées avec une solution de Tween 20 à 1 % dans du tampon phosphate 10 mM, pH 7,4.
L'activité cytotoxique des cellules effectrices est évaluée en pourcentage de lyse des cellules cibles calculé de la façon suivante :
(relargage de 51Cr en présence des cellules effectrices - relargage spontané / relargage total - relargage spontané).
Résultats: Le test de cytotoxicité a montré que les lymphocytes T CD86+ tuent spontanément les cellules cibles K562 (Figure 7). Cette activité cytotoxique est également portée par les cellules CD86- ainsi que par une population cellulaire contenant des cellules CD86+ et des cellules CD86-. Par contre, les lymphocytes T fraîchement isolés ne sont pas capables de tuer les cellules K562. Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1) Lymphocyte T humain exprimant la molécule CD86 fonctionnelle. 2) Lymphocyte T humain selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est costimulant et cytotoxique.
3) Lymphocyte T humain selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il exprime au moins l'une des molécules suivantes : CD54, CD25, CD80, CD30, CD40-L et CD70. 4) Procédé d'obtention d'une population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, à partir d'un échantillon contenant des lymphocytes T humains, on effectue au moins deux stimulations séquentielles desdits lymphocytes. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que chaque stimulation est effectuée avec au moins un activateur et une cytokine stimulant la prolifération de lymphocytes T humains.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l' activateur est choisi parmi les anticorps anti-CD2, anti-CD3 et anti-CD28 et les mitogènes, et les cytokines stimulant la prolifération des lymphocytes T humains sont choisies parmi IL-2, IL-4 et IL-7.
7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'échantillon contenant des lymphocytes T humains est un prélèvement de cellules mononucléées sanguines (CMN) ou un isolât de lymphocytes T présents dans les CMN.
8) Procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la stimulation est effectuée par l'un des mélanges suivants :
- anticorps anti-CD3 et IL-2, et
- anticorps anti-CD3, anticorps anti-CD28 et IL-2. 9) Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que après la stimulation on ajoute régulièrement une cytokine pour stimuler la prolifération des lymphocytes T.
10) Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la durée entre deux stimulations est d'au moins 4 jours, de préférence 7 jours.
11) Procédé selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que, après la deuxième stimulation, on attend de préférence plus de 4 jours avant d'obtenir la population pratiquement homogène.
12) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle qui peut être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 4 à 11.
13) Population selon la revendication 12, caractérisée en ce que les lymphocytes sont costimulants, immunostimulants et cytotoxiques.
14) Population selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que les lymphocytes expriment également l'une des molécules suivantes :
- CD54, CD25 et CD80.
15) Population selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que les lymphocytes expriment également l'une des molécules suivantes :
- CD30, CD40-L et CD70. 16) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle a été puisée avec un extrait biologique ou des dérivés biologiques ou des peptides ou des lipopeptides.
17) Population pratiquement homogène de lymphocytes T humains exprimant la molécule CD86 fonctionnelle selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'elle a été transfectée par un ADN ou couplée à une molécule chimique ou immunologique.
18) Lymphokine produite par une population de lymphocytes T selon l'une des revendications 12 à 17. 19) Lymphokine purifiée obtenue à partir des lymphokines selon la revendication 18. 20) Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins des lymphocytes T humains selon l'une des revendications 1 à 3 ou une population selon l'une des revendications 12 à 17 ou une lymphokine selon l'une des revendications 18 et 19. 21) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d' immunodeficiences congénitales, acquises ou d'origine pathologique.
22) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d'une affection microbienne.
23) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une - population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement d'un cancer. 24) Utilisation de lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement des chocs septiques.
25) Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte au moins des lymphocytes selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une population selon l'une des revendications 12 à 17.
26) Procédé de diagnostic d'un déficit immunitaire par mise en évidence dans un échantillon de sang ou de tissu de lymphocytes T exprimant la molécule CD86 fonctionnelle.
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