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WO2000044221A1 - UTILISATION DE PLANTES TRANSGENIQUES SUREXPRIMANT LE GENE $i(enod40) - Google Patents

UTILISATION DE PLANTES TRANSGENIQUES SUREXPRIMANT LE GENE $i(enod40) Download PDF

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WO2000044221A1
WO2000044221A1 PCT/FR2000/000159 FR0000159W WO0044221A1 WO 2000044221 A1 WO2000044221 A1 WO 2000044221A1 FR 0000159 W FR0000159 W FR 0000159W WO 0044221 A1 WO0044221 A1 WO 0044221A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plants
enod40
root
transgenic
roots
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2000/000159
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Crespi
Céline CHARON
Eva Kondorosi
Adam Kondorosi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to AU30596/00A priority Critical patent/AU3059600A/en
Publication of WO2000044221A1 publication Critical patent/WO2000044221A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a new use of transgenic plants overexpressing the enod40 gene and to its applications.
  • the early enod40 gene, expressed during nodule organogenesis, has been described in CRESPI et al., (EMBO Journal, 1994, 13, 21, 5099-5112), which show that enod40 is expressed in nodule differentiation cells as well in spontaneous nodules than in roots treated with Nod factors and codes for an RNA (riboregulator) involved in controlling plant growth.
  • the transcripts of the enod40 gene are associated with the development program for the organogenesis of the nodule; in fact, after infection of the roots with Rhizobium, enod40 transcripts are detectable from the start of nodule formation, that is to say long before the bacteria reach the internal cortex.
  • the enod40 transcripts are detected not only in the dividing cortical cells but also in the cells of the pericycle of the vascular tissue of the root, adjacent to the point of infection.
  • ENOD40 can activate certain cortical cells, causing their division in the roots of alfalfa in deprivation conditions in nitrogen. These dividing cells express particular enodl2A and accumulate large amounts of Amyloplasts, suggesting that the action, ENOD40 may be related to the regulation of phytohormonale balance in internal root cortical cells, necessary for the generation nodule.
  • ENOD40 is one of the first markers expressed at the initiation of the nodule organogenesis and is induced by Nod factors bacteria, - that transgenic plants overexpressing ENOD40 induce a specific cellular response in roots, de-differentiation and division of internal cortical cells.
  • the present invention therefore relates to the use of a transgenic plant overexpressing the enod40 gene and living in symbiosis with a Rhizobium for obtaining a plant enriched in nitrogen products.
  • plants and in particular legumes overexpressing the enod40 gene see their growth and productivity capacities significantly improved, in the presence of Rhizobium, both in the laboratory and under natural conditions.
  • the inventors also found that the effect of the gene appears to be specific roots.
  • the inventors have found that overexpression of the enod40 gene makes it possible to develop a higher potential for nodulation and root growth of legumes, cultivated under non-optimal conditions, without affecting the shoot / root metabolic balance. Thus, they consider the use of leguminous plants overexpressing the gene ENOD40 field will allow to obtain a better crop yield of these plants.
  • said transgenic plant is a legume.
  • said legume is Medicago truncatula.
  • the present invention also relates to a process for enriching plants with nitrogen, characterized in that it comprises the cultivation of a transgenic plant overexpressing the enod40 gene, in the presence of a Rhizobium.
  • the present invention also relates to plants enriched in nitrogen compounds, characterized in that they are obtainable using the enrichment process as defined above.
  • Said plants are preferably legumes, such as Medicago truncatula.
  • the present invention further relates to plant material from said plants.
  • FIG. 1 illustrates the nodulation of the transgenic M. truncatula plants carrying the construction 35S-Mtenod40:
  • FIG. 1A represents F2 plants (Se40) overexpressing Mtenod40 compared to wild type plants 108R (control) 18 days after inoculation (d.i.i.) with Sinorhizobium meliloti Rm41. Note the longer length of the primary root of plants Se40.
  • Figures 1B and 1 C correspond to an enlargement of the figure
  • FIG. 1D illustrates the number of nodules counted on different days after infection with Rm41 (20 to 40 plants were used for each point). The asterisks indicate the significant differences (P ⁇ 0.01). .
  • FIG. 1E illustrates the evolution of the length of the root relative to the number of days after infection.
  • Figures 2A and 2B represent the root tips of the control plants (Figure 2A) and Se40 ( Figure 2B) 10 days after infection with a strain derived from Rm41 constitutively expressing lacZ. An increased number of infected filaments (arrows) and already developed nodular primordia were detected in Se40 plants, while few bacteria were detected in the roots of control plants. The lines represent 80 microns.
  • Figures 2C and 2D correspond to an enlargement of the root region shown in Figures 2A and 2B.
  • the arrows ( Figure 2D) indicate an infected filament and the stars indicate first divisions of cortical cells in response to bacteria.
  • the lines represent 20 microns.
  • Figures 2E and 2F show cross sections (8 ⁇ m) through the root tip at 10 d.i.i. in a control plant ( Figure 2E) and a Se40 plant ( Figure 2F). The lines represent 50 microns.
  • FIG. 2G represents a longitudinal section (10 ⁇ m) of the root tip of a Se40 transgenic plant at 10 d.i.i. We observe a very extensive proliferation of cortical cell layers. The line represents 20 microns. .
  • Figure 2H illustrates a young nodule at 15 a.i.i. of a control plant root infected with a strain derived from Rm41 constitutively expressing lacZ. Bacteria have been detected from the invasion region to the central symbiotic region. The line represents 80 microns.
  • FIG. 21 represents young nodules and primordia of a developing nodule on a transgenic root Se40 at 12 days inoculated with the same strain derived from Rm41. No difference was detected in the localization of bacteria. while the nodules are enveloped by a region of proliferating cortical cells. The line represents 70 microns.
  • FIG. 2J represents a longitudinal section (10 ⁇ m) of a root tip region of a Se40 plant at 15 d.i.i. after inoculation with the same strain derived from Rm41. We notice the presence of nodules gathered surrounded by cortical cells in division. The line represents 100 microns.
  • FIG. 3A illustrates the Northern blot analysis of the expression of the enod40 gene within the leaves (L) and the roots (R) of wild (control) and transgenic (Se40) plants.
  • FIG. 3B corresponds to the semi-quantitative analysis by RT-PCR of the expression of Mtenodl2 and of Mtcal (enodl2 and CAI of Medicago truncatula), in the root region close to the tip within the control and transgenic plants during the nodulation.
  • the Msc27 gene is used as a constitutive control.
  • - Figures 4A - 4C represent the root region of a Se40 transgenic plant, 23 days after infection (daily) with a mutant Rhizobium NodC strain (Figure 4A), showing different sizes of cortical cells, and with a mutant strain Rhizobium EPS ( Figures 4B and 4C), showing pooled empty nodules surrounded by cortical cells in extensive division. The line represents 50 ⁇ m (FIG. 4A) and 80 microns (FIGS. 4B and 4C).
  • FIG. 4D the line representing 80 microns.
  • FIG. 4E the line representing 20 ⁇ m.
  • - Figure 4F illustrates lateral root primordia with dividing cortical cells and divisions in the pericycle (type (i) zones) two days after treatment with NodRm ⁇ V (S) 10 "7 M. The line represents 20 ⁇ m.
  • FIG. 4G represents the root region showing cells in anticline division in all layers of the root cortex, with a high amount of root hairs (type (ii) areas), two days after treatment with NodRm ⁇ V (S) 10 ' 7 M.
  • the line represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 4H shows an enlargement of the cluster shown in Figure 4C, by a hook.
  • the cells of the internal cortex divide both anticlinically and periclinally (areas of type (iii)).
  • the line represents 40 ⁇ m.
  • Figures 4J and 4K represent the main root length of control plants and Se40 transgenic plants, 23 days after treatments with different concentrations of chitotetraosis (Figure 4J) or NodRm ⁇ V (S) ( Figure 4K) (average + SEM). The asterisks indicate a statistically significant difference (P ⁇ 0.01).
  • FIG. 5A represents the number of nodules in the roots of control and transgenic plants at 18 d.a.i. The plants were grown on a nitrogen-free medium enriched with 0. 1.2 or 5 mM potassium nitrate.
  • FIG. 5B represents plants carrying developing nodules (10 d.i.i.) treated on days 0, 4, 8, 16 (T) with a 20 mM potassium nitrate solution. The number of nodules is represented as a function of time.
  • FIG. 6 shows the main root length of plants cultivated for 5 days on agar plates in a medium poor in nitrogen, enriched with: Figure 6A: ACC; Figure 6B: number of nodules on plant roots at 15 and 23 days (Rm41) or on roots also enriched with ACC and AVG. In all cases, number of nodules: average + SEM. The root length is expressed by the mean + SEM and the asterisks indicate the statistically significant differences (P ⁇ 0.01).
  • - Figure 7 represents the average dry weight of lots of 10 plants
  • the values are expressed as an average ⁇ SEM. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • Medicago truncatula 108R plants were previously transformed with Agrobacterium tumefaciens containing the binary vector pG3.3 which carries a 35S uidA-pol ⁇ (A) 35S promoter cassette and a second 35S Mtenod40-poly (A) 35S promoter cassette (Charon et al. , 1997).
  • Medicago truncatula 108R FI or F2 transgenic seeds were sterilized by immersion for one hour in a solution comprising INOV'CHLORE ® (8.64 g / l, Inov ' chem SA, France) and 0.1% SDS, followed by careful washing with sterile water overnight.
  • the seeds are germinated vertically on 0.55% Kalys agar dishes for one day, and the seeds are transferred to Magenta pots or to square petri dishes containing vermiculite soaked in Gibson medium without nitrogen (Gibson and Nutman. 1960).
  • wet vermiculite is added to half the plate, which is placed vertically. Seeds that have germinated are placed on the vermiculite and held almost vertically to allow root and nodular observations at different times. A week later, the roots are inoculated with S. meliloti or treated with Nod factors (see below).
  • meliloti 1021 of wild type (Rml021) and its mutants NodC -, EPS-, Bac-Rml021 were used for the nodulation experiments (Bauer et al, 1997). No difference was detected between the nodulation behavior of the Rml021 or Rm41 strains.
  • the roots of the plants were carefully washed to remove vermiculite, the nodules were counted and the primary root length was measured from the root point to the hypocotyl, for each plant. In each operating condition, 20 to 40 plants were used in at least three independent experiments.
  • ACC and AVG treatments combined with bacterial inoculation were performed by applying ACC (1-amino-cyclo-propane carboxylic acid) or AVG solution to a week old seed (aminoethoxy-vinyl glycine) (300 ⁇ l at 10 "5 M or 10 '7 M), in the absence or concomitantly with the rhyzobial inoculum.
  • the nodules are counted at 15 and 23 days. In each operating condition, 10 to 20 plants were used and at least 2 independent experiments were carried out.
  • the plants were cultivated in Magenta flasks containing the vermiculite immobilized on a Gibson medium without nitrogen, enriched in KNO at different concentrations (1 mM to 5 mM). 18 days after inoculation with Rhizobia. the roots are thoroughly washed and the nodules are counted. From 20 to 40 plants were used in at least 2 independent experiments.
  • the nitrogen control of the nodulation was tested by growing the plants in vermiculite petri dishes (containing 10 ml of medium without nitrogen) and, 10 days after infection with S meliloti. the roots are treated with 300 ⁇ l of a 20 mM KNO solution. On days 1, 4, 8 and 16, after this treatment, the roots are washed to determine the number of nodules. From 10 to 20 plants were used in at least 2 independent experiments. - Root growth tests
  • NodRm-IV factor (Cl 6: 2, S) (Schultze et al, 1992) at concentrations ranging from 10 "7 to 10'10 M, tetraacetyl chitotetraose (Sigma) to 10 " 7 M and a control aqueous are used.
  • a suspension 300 ⁇ l, optical density at 600 nm: 0.4
  • the root tip region is examined under a microscope to detect, in each seed, the cell divisions.
  • the primary root length was measured 23 days after treatment with factor Nod.
  • 10 to 20 plants were used in at least 2 independent experiments.
  • Hormonal treatments After germination on the agar cans, the seeds are transferred to new agar cans containing a medium poor in nitrogen, ACC (1 -aminocyclopropane carboxylic acid) at concentrations varying from 10 "5 M to 10 '9 M. Five days later, the root lengths are measured.
  • ACC 1- -aminocyclopropane carboxylic acid
  • RNA was prepared from the last 1.5 cm from the roots of 40 plants, excluding the root tips (1 mm), using the guanidium chloride method (Charon et al, 1997). To avoid any genomic contamination of DNA, the total RNA (10 ⁇ g) was treated for 30 minutes at 37 ° C. with 10 U of DNase I, without RNase, in a volume of 24 ⁇ l and in the presence of Tris-HCl 40 mM (pH 7.5), 6 mM MgCl and 12 U of RNAguard (Pharmacia). After the heat inactivation of DNase I, the RNA is precipitated with ethanol and resuspended in water treated with DEPC.
  • RNA treated with DNase (1-2 ⁇ g) is reverse transcribed by 50 U of MMLV H-superscript reverse transcriptase (Gibco BRL) in a reaction medium (30 ⁇ l) containing 100 pmol of oligo (pdT) 12 -18, a corresponding buffer (Gibco BRL), 10 mM DTT, 0.8 mM dNTP and 14.4 U RNAguard (Pharmacia) for 1 hour at 37 ° C. After inactivation of the enzyme by heat, equal amounts of cDNA (in general, one tenth of the reaction medium) were used in 100 ⁇ l of buffer 1 x Eurobio Taq (Eurobio, Les Ulis, France) containing MgCl
  • the probes corresponding to MsCAl (Coba de la Pena et al, 1996), enodl2A (Bauer et al, 1994) and Msc27 (Gyôrgyey et al, 1991) were prepared using the DIG RNA labeling kit (SP6 / T7 ) (Boehringer Mannheim, France).
  • the hybridization and detection protocols by the CDP-star chemiluminescent substrate were carried out according to the instructions of the manufacturer and the modifications described by Dessaux et al. (1995).
  • the roots of treated seeds of M. truncatula were harvested, immediately immobilized in FAA as described by Charon et al, (1997), and blanched for 15 minutes in a commercial solution (1.75% of active chlorine) to allow the microscopic analysis.
  • Each first centimeter of the root, close to the root tip, was screened using a magnification of 10 x 0.8 and in interference contrast (to allow good visualization of the cells) in order to detect the groups of cortical cells in division.
  • Prefixation and coloring with ⁇ -Gal were carried out according to
  • transgenic Medicago truncatula plants overexpressing the Mtenod40 gene (construction comprising the promoter 35S of the cauliflower mosaic virus (plants Se40)) were obtained, in accordance with the technique described in Charon et al, 1997.
  • the nodules were counted on different days after the bacterial infection.
  • the significant increase in the number of nodules at 18 a.i.i. is due to an acceleration in the kinetics of nodulation ( Figure 1D).
  • the first nodules appear at 4-6 days a.i. on enod40 transgenic roots, while they appear at 8-10 a.i.i. on the roots of the plants control. The gap remains until the transgenic and control plants reach a maximum number of nodules.
  • the primordia are larger in the transgenic roots, as confirmed by enlargement of the piliferous zone of root growth (Figure 2D compared to Figure 2C).
  • Cross and longitudinal sections of the enod40 transgenic roots, at the level of the nodulation zone, confirm the presence of an increased division in the cortex, the cells dividing both anticlinically and periclinally throughout the cortex (figures 2F and 2G), and are significantly different from the root sections of the control plants, at the same nodulation stage (FIG. 2E).
  • Mtenodl2 (Bauer et al., 994) and MtCAl (Coba de la Pena et al, 1997) showed that these genes are induced earlier in the transgenic roots (6 jai; Figure 2B), confirming at a molecular level, the acceleration of the kinetics of nodulation in the roots constitutively expressing enod40.
  • Se40 transgenic plants inoculated with S. meliloti exhibit specific proliferation responses associated with the expression of enod40: increased root growth and accelerated nodulation, accompanied by extensive cortical cell divisions in the region near the tip. root.
  • Overexpression of enod40 also results in a disruption in the positioning of dividing cortical cells during early symbiosis.
  • the synergy of action observed by the Inventors, between the overexpression of the enod40 gene and the symbiosis, in legumes results, due to a significantly increased nitrogen fixation, a significant acceleration of nodulation as well as an increase in root growth (in relation to the rate of division of the apical meristem). This notably results in a significantly improved crop yield.
  • transgenic roots were inoculated: - by a Bac S meliloti mutant incapable of differentiating into bacteroids,
  • the accelerated nodulation induced by the action of enod40 is repressed by nitrogen from a concentration of 1 mM in potassium nitrate (number of nodules reduced by 50%).
  • a nitrate solution was applied to the transgenic plants at 10 days (plants carrying developing nodules).
  • a count of nodules indicated that the addition of potassium nitrate blocks nodulation both in the control plants and in the Se40 transgenic plants (FIG. 5B).
  • Eight days later, a higher number of nodules is detected, probably due to the metabolism by the plant, of added nitrogen (Figure 5B).
  • a constitutive expression (independent of an addition of nitrogen) of enod40 does not allow plants to overcome the control, by nitrogen, of nodular development.
  • the inoculated Se40 transgenic plants exhibit an increased number of nodules as well as a deregulation of the positioning of the dividing cortical cells (FIG. 2F). which could indicate a weakening of control by ethylene in deregulated plants compared to the expression of enod40.
  • seeds were cultivated on a solidified agar medium containing little nitrogen, enriched with ACC at different concentrations, and observed five days later.
  • the AAC induced several responses, including inhibition of root growth, elongation of the hypotibular and the formation of a hypocotyl hook. No difference was observed with respect to primary root length after treatments with different ACC concentrations (Figure 6A). Inhibition of root elongation was observed in all cases, indicating that the Medicago control and transgenic enod40 plants are sensitive to the hormone.
  • the plants were treated with ACC (1-aminocyclopropane carboxylic acid, immediate precursor of ethylene) or with AVG (aminoethoxyvinyl-glycine, an inhibitor of ACC synthase) in the absence or concomitantly inoculation with S. meliloti.
  • Transgenic Medicago truncatula plants overexpressing enod40, cultivated in a medium poor in nitrogen combined to initiate nodulation, infected with Rhizobium S. meliloti (Rm41) and harvested 15 days after infection have an average dry weight (0.11g + 0.013 ) statistically superior to that of normal plants (0.056g ⁇ 0.012).

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Abstract

Nouvelle utilisation de plantes transgéniques surexprimant le gène enod40 et ses applications. Utilisation d'une plante transgénique surexprimant le gène (enod40) et vivant en symbiose avec un Rhizobium pour l'obtention d'une plante enrichie en produits azotés.

Description

UTILISATION DE PLANTES TRANSGENIQUES SUREXPRIMANT LE GENE enod40.
La présente invention est relative à une nouvelle utilisation de plantes transgéniques surexprimant le gène enod40 et à ses applications. Le gène précoce enod40, exprimé pendant Porganogénèse des nodules, a été décrit dans CRESPI et al., (EMBO Journal, 1994, 13, 21, 5099-5112), qui montrent que enod40 est exprimé dans les cellules de différenciation du nodule aussi bien dans des nodules spontanés que dans des racines traitées par des facteurs Nod et code pour un ARN (riborégulateur) impliqué dans le contrôle de la croissance des plantes. Les résultats issus de cet article indiquent que les transcrits du gène enod40 sont associés au programme de développement de l'organogénèse du nodule ; en effet, après infection des racines par Rhizobium, des transcrits enod40 sont détectables dès le début de la formation du nodule, c'est-à-dire bien avant que les bactéries n'atteignent le cortex interne. En particulier, les transcrits enod40 sont détectés non seulement dans les cellules corticales en division mais également dans les cellules du péricycle du tissu vasculaire de la racine, adjacent au point d'infection.
Une description détaillée de la préparation des plantes contenant un transgène enod40 (vecteur pGMCSe40.pG3.3) est décrite dans CHARON et al., PNAS, 1997, 94, 8901-8906 ; ce document décrit en particulier que des plantes (Medi- cago truncutala) surexprimant enod40 présentent une division des cellules corticales de leurs racines dans des conditions de déprivation en azote. Un raccourcissement des racines n'est pas observé et une augmentation significative du nombre de divisions de cellules corticales par cm de racine est observée dans les plantes transgéniques ayant un taux élevé d'expression &enod40. La division des cellules corticales est plus fréquente dans la partie supérieure de la racine, en dessous l'hypocotyle.
Les résultats décrits dans ce document indiquent que l'expression àJenod40 conduit à l'induction de la division des cellules corticales, qui représente l'événement initial dans le développement du nodule.
Cet article met, de plus, en avant la complexité du processus de formation du nodule. Toutefois, il ressort clairement de cet article que enod40 parti- cipe, au moins au début de ce processus, en initialisant la dé-différenciation et la division des cellules corticales.
D'autres articles sont également relatifs à l'expression d,enod40 et à son rôle dans l'organogénèse des nodules. On peut citer : - CRESPI et al., 1996, in Biology of Plant-Microbe Interactions
(eds. G. Stacey, B. Mullin and P.M. Gresshoff) IS-MPMI, St Paul, Minnesota, pp. 363-368),
- CRESPI et al., 1997, NATO ASI Séries G : Ecological Sciences, 39, 55-58, - CHARON et al., 1997, in Récent Research Developments in Plant
Physiology (Ed. Pandalai, S. G.), Research Signpost, 1. 1 17-124.
Ces différentes publications montrent :
X qu'il existe une relation entre l'induction de la division des cellules corticales par enod40 et l'initiation de la nodulation, du fait que cette réponse est bloquée en présence d'azote dans le milieu de culture.
•S que la surexpression d,enod40 est capable d'activer certaines cellules corticales, en provoquant leur division dans les racines d'alfalfa dans des conditions de déprivation en azote. Ces cellules en division expriment en particulier enodl2A et accumulent des quantités importantes d'amyloplastes, ce qui suggère que l'action d,enod40 pourrait être reliée à la régulation de la balance phytohormonale dans les cellules corticales internes de racine, nécessaire pour la génération du nodule.
Dans un article de revue, J. Cohn et al, (Trends in plant science, 1998, 3, 3, 105-1 10) reprennent les différentes données connues sur l'organogénèse des nodules dans les légumineuses. Il est rappelé, en particulier que la formation des nodules est un processus ordonné qui implique la dé-différenciation des cellules corticales de racine et leur division. Ce processus fait intervenir les facteurs Nod de la bactérie, qui induisent l'expression de nodulines précoces dans la plante, dont enod40 qui est reconnu, comme intervenant dans l'initiation des primordia. L'ensemble de la littérature montre donc :
- qu,enod40 est l'un des premiers marqueurs exprimés lors de l'initiation de l'organogénèse du nodule et est induit par les facteurs Nod des bactéries, - que les plantes transgéniques surexprimant enod40 induisent une réponse cellulaire spécifique dans les racines, la dé-différenciation et la division des cellules corticales internes.
Toutefois, aucune utilisation à l'échelle industrielle des plantes transgéniques surexprimant enod40 n'a pu être trouvée jusqu'à présent. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une plante transgénique surexprimant le gène enod40 et vivant en symbiose avec un Rhizobium pour l'obtention d'une plante enrichie en produits azotés.
De manière inattendue, des plantes et notamment des légumineuses surexprimant le gène enod40 voient leurs capacités de croissance et de productivité significativement améliorées, en présence de Rhizobium, aussi bien en laboratoire que dans des conditions naturelles.
En effet, il ressort des études effectuées par les Inventeurs que la surexpression de enod40 permet, de manière surprenante chez les plantes transgéniques infectées par un Rhizobium, une nodulation plus précoce, qui entraîne un rendement azoté significativement meilleur, dans l'ensemble des organes de la plante. En outre, on observe une croissance améliorée de la racine, qui entraîne une meilleure utilisation des nutriments par les plantes transgéniques ainsi qu'une meilleure mycor- rhization des légumineuses.
Les Inventeurs ont également trouvé que l'effet du gène semble spécifique des racines.
En résumé, les Inventeurs ont trouvé que la surexpression du gène enod40 permet de développer un potentiel supérieur pour la nodulation et la croissance racinaire des légumineuses, mises en culture dans des conditions non optimales et ce, sans affecter la balance métabolique pousse/racine. Ainsi, ils considèrent que l'utilisation de plantes légumineuses surexprimant le gène enod40 au champ permettra d'obtenir un meilleur rendement agricole de ces plantes.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention ladite plante transgénique est une légumineuse.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite légumineuse est Medicago truncatula.
La présente invention a également pour objet un procédé d'enrichissement de plantes en azote, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une plante transgénique surexprimant le gène enod40, en présence d'un Rhizobium.
La présente invention a également pour objet des plantes enrichies en produits azotés, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à l'aide du procédé d'enrichissement tel que défini ci-dessus.
Lesdites plantes sont, de manière préférée, des légumineuses, telles que Medicago truncatula.
La présente invention a en outre pour objet un matériel végétal issu desdites plantes.
On entend par matériel végétal aussi bien les graines, les fleurs, les feuilles qu'éventuellement les huiles. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la Figure 1 illustre la nodulation des plantes M. truncatula trans- géniques portant la construction 35S-Mtenod40 :
. la figure 1A représente des plantes F2 (Se40) surexprimant Mtenod40 comparées à des plantes de type sauvage 108R (contrôle) 18 jours après l'inoculation (j.a.i.) par Sinorhizobium meliloti Rm41. On remarque la longueur plus élevée de la racine primaire des plantes Se40. . les figures 1B et 1 C correspondent à un agrandissement de la figure
1(A) et représentent respectivement les racines des plantes contrôle (figure 1B) et transgéniques (figure 1 C) portant des nodules (flèches blanches) à 18 j.a.i.
. la figure 1D illustre le nombre de nodules comptés différents jours après l'infection par Rm41 (20 à 40 plantes ont été utilisées pour chaque point). Les astérisques indiquent les différences significatives (P<0,01 ). . la figure 1E illustre l'évolution de la longueur de la racine par rapport au nombre de jours après infection.
- la Figure 2 représente des analyses microscopiques des racines infectées à différents stades de la morphogénèse nodulaire :
. les figures 2A et 2B représentent les pointes racinaires des plantes contrôle (figure 2A) et Se40 (figure 2B) 10 jours après l'infection par une souche dérivée de Rm41 exprimant lacZ de façon constitutive. Un nombre accru de filaments infectés (flèches) et de primordia nodulaires déjà développés ont été détectés dans les plantes Se40, alors que peu de bactéries ont été détectées dans les racines des plantes contrôle. Les traits représentent 80 microns. . les figures 2C et 2D correspondent à un agrandissement de la région racinaire montrée aux figures 2A et 2B. Les flèches (figure 2D) indiquent un filament infecté et les étoiles indiquent des premières divisions de cellules corticales en réponse aux bactéries. Les traits représentent 20 microns.
. les figures 2E et 2F représentent des coupes transversales (8 μm) au travers de la pointe racinaire à 10 j.a.i. dans une plante contrôle (figure 2E) et une plante Se40 (figure 2F). Les traits représentent 50 microns.
. la figure 2G représente une coupe longitudinale (10 μm) de la pointe racinaire d'une plante transgénique Se40 à 10 j.a.i. On observe une prolifération très étendue des couches de cellules corticales. Le trait représente 20 microns. . la figure 2H illustre un jeune nodule à 15 j.a.i. d'une racine de plante contrôle infectée par une souche dérivée de Rm41 exprimant lacZ de façon constitutive. Des bactéries ont été détectées depuis la région d'invasion jusqu'à la région symbiotique centrale. Le trait représente 80 microns.
. la figure 21 représente de jeunes nodules et primordia d'un nodule en développement sur une racine transgénique Se40 à 12 j.a.i. inoculée avec la même souche dérivée de Rm41. Aucune différence n'a été décelée dans la localisation bacté- rienne, alors que les nodules sont enveloppés par une région de cellules corticales en prolifération. Le trait représente 70 microns.
. la figure 2J représente une coupe longitudinale (10 μm) d'une région de pointe racinaire d'une plante Se40 à 15 j.a.i. après l'inoculation avec la même souche dérivée de Rm41. On remarque la présence de nodules rassemblés entourés par des cellules corticales en division. Le trait représente 100 microns.
- la Figure 3 illustre l'expression des gènes de nodulines dans des plantes transgéniques Se40 après infection bactérienne dans la région racinaire proche de la pointe : . la figure 3A illustre l'analyse par Northern blot de l'expression du gène enod40 au sein des feuilles (L) et des racines (R) des plantes sauvages (contrôle) et transgéniques (Se40).
. la figure 3B correspond à l'analyse semi-quantitative par RT -PCR de l'expression de Mtenodl2 et de Mtcal(enodl2 et CAI de Medicago truncatula), dans la région racinaire proche de la pointe au sein des plantes contrôle et transgéniques durant la nodulation. Dans tous les cas, le gène Msc27 est utilisé comme contrôle constitutif.
. la figure 3C correspond à une quantification arbitraire de l'intensité des signaux d'hybridation obtenus (A.U = arbitrary units). - les Figure 4A - 4C représentent la région racinaire d'une plante transgénique Se40, 23 jours après infection (j.aλ.) avec une souche mutante Rhizobium NodC (figure 4A), montrant différentes tailles de cellules corticales, et avec une souche mutante Rhizobium EPS (figures 4B et 4C), montrant des nodules vides rassemblés, entourés de cellules corticales en division extensive. Le trait représente 50 μm (figure 4A) et 80 microns (figures 4B et 4C).
- les Figures 4D - 4E représentent la région racinaire d'une plante transgénique Se40 deux jours après un traitement par le facteur NodRmΙV(S) ( 10'7 M) ; elles montrent un groupe de cellules corticales en division (crochet sur la figure 4D, le trait représentant 80 microns). L'utilisation d'une optique de Nomarski permet d'observer clairement une déformation et une courbure des poils racinaires (figure 4E, le trait représentant 20 μm). - la figure 4F illustre des primordia latéraux racinaires avec des cellules corticales en division et des divisions dans le péricycle (zones de type (i)) deux jours après un traitement par NodRmΙV(S) 10"7 M. Le trait représente 20 μm.
- la figure 4G représente la région racinaire montrant des cellules en division anticlinale dans toutes les couches du cortex racinaire, avec une quantité élevée de poils racinaires (zones de type (ii)), deux jours après un traitement par NodRmΙV(S) 10'7 M. Le trait représente 50 μm.
- la figure 4H représente un agrandissement de l'amas montré à la figure 4C, par un crochet. Les cellules du cortex interne se divisent à la fois de façon anticlinale et périclinale (zones de type (iii)). Le trait représente 40 μm.
- la figure 41 représente le nombre de zones de type (iii) dans le premier cm de la région racinaire proche de la pointe des plantes, deux jours après le traitement, avec différentes concentrations de NodRmΙV(S), de tétraacétyl-chitoté- traose 10"7 M et d'eau, (moyenne + SEM). Les astérisques indiquent les différences significatives d'un point de vue statistique (P<0,05).
- les figures 4J et 4K représentent la longueur racinaire principale des plantes contrôle et des plantes transgéniques Se40, 23 jours après des traitements avec différentes concentrations de chitotétraose (figure 4J) ou de NodRmΙV(S) (figure 4K) (moyenne + SEM). Les astérisques indiquent une différence significative d'un point de vue statistique (P<0,01).
- la Figure 5 illustre le contrôle par l'azote et l'éthylène de l'action d'enod40 dans les plantes transgéniques Se40 pendant la nodulation :
. la figure 5A représente le nombre de nodules dans les racines de plantes contrôle et transgéniques à 18 j.a.i. Les plantes ont été cultivées sur un milieu sans azote enrichi avec du nitrate de potassium à 0. 1. 2 ou 5 mM.
. la figure 5B représente des plantes portant des nodules en développement (10 j.a.i.) traitées aux jours 0, 4, 8, 16 (T) par une solution de nitrate de potassium 20 mM. Le nombre de nodules est représenté en fonction du temps.
- la Figure 6 représente la longueur racinaire principale de plantes cultivées pendant 5 jours sur des plaques d'agar dans un milieu pauvre en azote, enrichi avec : figure 6A : ACC ; figure 6B : nombre de nodules sur les racines des plantes à 15 et 23 j.a.i. (Rm41) ou sur des racines enrichies également avec de l'ACC et de l'AVG. Dans tous les cas, nombre de nodules : moyenne + SEM. La longueur racinaire est exprimée par la moyenne + SEM et les astérisques indiquent les différences significatives d'un point de vue statistique (P<0,01). - La Figure 7 représente le poids sec moyen de lots de 10 plantes
Medicago truncatula normales (contrôle) ou transgéniques (Se40), cultivées sur un milieu pauvre en azote (contenant par exemple, 1 mM de nitrates), récoltées 15 jours après l'infection par Rhizobium S. meliloti (Rm41). Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE : Comportement des plantes Medicago truncatula transgéniques surexprimant enod40. 1) Matériels et méthodes
- Plantes utilisées et culture des plantes
Des plantes Medicago truncatula 108R ont été préalablement transformées par Agrobacterium tumefaciens contenant le vecteur binaire pG3.3 qui porte une cassette promoteur 35S uidA-polγ(A) 35S et une seconde cassette promoteur 35S Mtenod40-poly(A) 35S (Charon et al., 1997). Des graines de Medicago truncatula 108R FI ou F2 transgéniques, ainsi que des plantes Medicago truncatula 108R contrôle, ont été stérilisées par immersion, pendant une heure dans une solution comprenant de l'INOV'CHLORE® (8,64 g/1, Inov'chem S.A., France) et du SDS 0,1%, suivie par un lavage soigneux à l'aide d'eau stérile, pendant une nuit. On fait germer les graines verticalement sur des boîtes d'agar Kalys à 0,55%, pendant une journée, et les semences sont transférées dans des pots Magenta ou dans des boites de Pétri carrées contenant de la vermiculite imbibée d'un milieu de Gibson sans azote (Gibson et Nutman. 1960). Pour la culture dans les boîtes de Pétri, on ajoute la vermiculite humide jusqu'à la moitié de la plaque, qui est placée verticalement. Les semences qui ont germé, sont placées sur la vermiculite et maintenues de façon presque verticale pour permettre des observations racinaires et nodulaires à différentes périodes. Une semaine après, les racines sont inoculées par S. meliloti ou traitées par des facteurs Nod (voir ci-dessous).
Des conditions de culture sur vermiculite sont requises pour les tests de nodulation, puisque les racines de M. truncatula 108R ne poussent pas de façon convenable sur des boîtes d'agar pendant de longues périodes (20-40 jours) ; par contre, des traitements hormonaux de courte durée (5 jours) sont effectués en transférant les semences en germination sur de nouvelles boîtes d'agar contenant un milieu pauvre en azote combiné, enrichi par des hormones à différentes concentrations, tel que décrit dans Bauer et al, 1997. Les plantes sont cultivées dans une chambre de culture à 24°C, pendant une période de 16 heures, à la lumière.
- Tests de nodulation
Des souches de S. meliloti ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu TA avec des antibiotiques convenables, centrifugées et remises en suspension dans MgSO 10 mM, à une DO de 0,4. L'inoculum bactérien (300 μl) est appliqué autour de chaque semence. Pour les études de nodulation et les traitements combinés par ACC/AVG, la souche S. meliloti 41 de type sauvage (Rm41) a été utilisée. Les étapes précoces de nodulation ont été suivies par une souche Rm41 portant un gène de fusion d -ALA::lacZ, comme décrit par Bauer et al., 1997. La souche S. meliloti 1021 de type sauvage (Rml021) et ses mutants NodC-, EPS-, Bac-Rml021 ont été utilisés pour les expériences de nodulation (Bauer et al, 1997). Aucune différence n'a été décelée entre le comportement de nodulation des souches Rml021 ou Rm41. A différents jours après l'inoculation ou les traitements, les racines des plantes ont été soigneusement lavées pour enlever la vermiculite, les nodules ont été comptés et la longueur racinaire primaire a été mesurée depuis la point racinaire jusqu'à l'hypoco- tyle, pour chaque plante. Dans chaque condition opératoire, 20 à 40 plantes ont été utilisées dans au moins trois expériences indépendantes.
Les traitements à l'ACC et à l'AVG combinés avec l'inoculation bactérienne ont été effectués en appliquant, à une graine âgée d'une semaine, une solution d'ACC (acide 1 -aminocyclo-propane carboxylique) ou d'AVG (aminoéthoxy- vinyl-glycine) (300 μl à 10"5 M ou 10'7 M), en l'absence ou de façon concomitante à l'inoculum rhyzobial. Les nodules sont comptés à 15 et 23 jours. Dans chaque condition opératoire, 10 à 20 plantes ont été utilisées et au moins 2 expériences indépendantes ont été réalisées.
Pour étudier le contrôle par l'azote de l'initiation nodulaire, les plantes ont été cultivées dans des fioles Magenta contenant la vermiculite immobilisée sur un milieu Gibson sans azote, enrichi en KNO à différentes concentrations (1 mM à 5 mM). 18 jours après l'inoculation par les Rhizobia. les racines sont soigneusement lavées et les nodules sont comptés. De 20 à 40 plantes ont été utilisées dans au moins 2 expériences indépendantes. Le contrôle par l'azote de la nodulation a été testé en cultivant les plantes dans des boîtes de Pétri à la vermiculite (contenant 10 ml de milieu sans azote) et, 10 jours après l'infection par S meliloti. les racines sont traitées par 300 μl d'une solution de KNO à 20 mM. Aux jours 1, 4, 8 et 16, après ce traitement, les racines sont lavées pour déterminer le nombre de nodules. De 10 à 20 plantes ont été utilisées dans au moins 2 expériences indépendantes. - Tests de croissance racinaire
Traitement par les facteurs Nod
Un facteur NodRm-IV (Cl 6: 2, S) purifié (Schultze et al, 1992) à des concentrations allant de 10"7 à 10'10 M, du tétraacétyl-chitotétraose (Sigma) à 10"7 M et un contrôle aqueux sont utilisés. De même que pour l'inoculation rhizobiale, une suspension (300 μl, densité optique à 600 nm : 0,4) a été appliquée autour de l'extrémité de la racine de chaque semence cultivée dans des boîtes de Pétri à la vermiculite. Deux jours plus tard, les racines des plantes, soigneusement lavées pour enlever la vermiculite, ont été fixées dans du FAA comme décrit par McKhann et Hirsch, 1993. La région de la pointe racinaire est examinée au microscope pour déceler, dans chaque semence, les divisions cellulaires. En parallèle, la longueur racinaire primaire a été mesurée 23 jours après le traitement par le facteur Nod. Dans chaque condition opératoire, 10 à 20 plantes ont été utilisées dans au moins 2 expériences indépendantes. Traitements hormonaux Après la germination sur les boîtes d'agar, les semences sont trans- férées sur de nouvelles boîtes d'agar contenant un milieu pauvre en azote, de l'ACC (acide 1 -aminocyclopropane carboxylique) à des concentrations variant de 10"5 M à 10'9 M. Cinq jours plus tard, les longueurs racinaires sont mesurées. Dans chaque condition opératoire, de 10 à 20 plantes ont été utilisées dans au moins 2 expériences indépendantes. - Analyses de l'expression des gènes de nodulines
L'ARN total a été préparé à partir des derniers 1 ,5 cm des racines de 40 plantes, à l'exclusion des pointes racinaires (1 mm), en utilisant la méthode au chlorure de guanidium (Charon et al, 1997). Pour éviter toute contamination génomique d'ADN, l'ARN total (10 μg) a été traité pendant 30 minutes à 37°C avec 10 U de DNase I, sans RNase, dans un volume de 24 μl et en présence de Tris-HCl 40 mM (pH 7,5), de MgCl 6 mM et de 12 U de RNAguard (Pharmacia). Après l'inactivation par la chaleur de la DNase I, l'ARN est précipité par de l'éthanol et remis en suspension dans de l'eau traitée au DEPC.
L'ARN traité par la DNase (1-2 μg) est transcrit de façon inverse par 50 U de transcriptase inverse MMLV H- superscript (Gibco BRL) dans un milieu réactionnel (30 μl) contenant 100 pmol d'oligo(pdT)12-18, un tampon correspondant (Gibco BRL), du DTT 10 mM, du dNTP 0.8 mM et du RNAguard 14,4 U (Pharmacia) pendant 1 heure à 37°C. Après l'inactivation de l'enzyme par la chaleur, des quantités égales de ADNcs (en général, un dixième du milieu réactionnel) ont été utilisées dans 100 μl de tampon 1 x Eurobio Taq (Eurobio, Les Ulis, France) contenant du MgCl
1.5 mM, du dNTP 0,25 mM, 200 pmol d'amorce de gène 5' et 3' et 1.5 U de Taq polymérase (Eurobio, Les Ulis, France). L'amplification a été réalisée pendant 15-25 cycles comme suit : 1 minute, 94°C ; 1 minute, 55°C ; 2 minutes, 72°C. Le contrôle de la RT-PCR est effectué par co-amplification du gène MSc27, exprimé de façon endo- gène. Un dixième des produits PCR est séparé sur un gel d'agarose TBE 1,2%, transféré sur des membranes de nylon chargées positivement. Les sondes correspondant à MsCAl (Coba de la Pena et al, 1996), enodl2A (Bauer et al, 1994) et Msc27 (Gyôrgyey et al, 1991) ont été préparées en utilisant le kit de marquage d'ARN DIG (SP6/T7) (Boehringer Mannheim, France). Les protocoles d'hybridation et de détec- tion par le substrat chimioluminescent CDP-star ont été réalisés selon les consignes du fabriquant et les modifications décrites par Dessaux et al. (1995).
- Analyse histologique de l'activité β-Gal
Les racines des semences traitées de M. truncatula ont été récoltées, immédiatement immobilisées dans du FAA comme décrit par Charon et al, (1997), et blanchies pendant 15 minutes dans une solution commerciale (1,75% de chlore actif) pour permettre l'analyse microscopique. Chaque premier centimètre de la racine, proche de la pointe racinaire, a été criblé en utilisant un agrandissement de 10 x 0,8 et en contraste d'interférence (pour permettre une bonne visualisation des cellules) afin de déceler les groupes de cellules corticales en division. La préfixation et les colorations au β-Gal ont été réalisées selon
Bauer et al. (1997), en utilisant du X-D-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galac- topyranoside) ou du magenta-D-Gal (5-bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyrano- side). Les tissus ont été blanchis comme décrit ci-dessus.
Pour effectuer les coupes de sémifine, les racines ont été fixées et immobilisées dans du paraplaste selon la procédure décrite par McKhann et Hirsch (1993), et les coupes ont été effectuées avec un micro-Biocut 2035 (Reicher et Jung). Pour les observations, les coupes ont été déparaffinées.
- Analyse du rendement de culture
Des plantes de Medicago truncatula normales (contrôle) ou trans- géniques Se40 (5 à 10 plantes par génotype) cultivées en condition aéroponique sur un milieu pauvre en azote (Charon et al., 1997, précité) ont été inoculées par Rhizobium
S. meliloti (Rm41). Quinze jours après l'infection, les parties aériennes des plantes ont été récoltées, séchées et leur poids sec moyen (en grammes) a été déterminé.
- Analyse statistique Pour chaque condition opératoire dans laquelle la longueur racinaire primaire ou le poids sec moyen ont été mesurés, les valeurs moyennes des mesures ont été données avec une déviation standard (± SEM). Pour chaque condition opératoire dans laquelle le nombre de nodules a été compté, la valeur moyenne des mesures a été donnée avec une déviation standard divisée par la racine carrée du nombre de plantes (+ SEM). Les résultats, analysés par un test t de Student, sont significatifs. 2) RESULTATS
- Des plantes de Medicago truncatula transgéniques surexprimant enod40 présentent une cinétique de nodulation accélérée.
Plusieurs plantes Medicago truncatula transgéniques surexprimant le gène Mtenod40 (construction comprenant le promoteur 35S du virus de la mosaïque de choux-fleur (plantes Se40)) ont été obtenues, conformément à la technique décrite dans Charon et al, 1997.
Des lots (20-40 plantes) de lignées transgéniques indépendantes F2 (en particulier, à partir de lignées Se40 (Charon et al., 1997)), cultivées en en présence de vermiculite, ont été inoculés par Sinorhizobium meliloti Rm41 de type sauvage, et 18 jours après l'infection (j.a.i. ou d.p.i., pour days posi infection), les plantes ont été analysées. Deux phénotypes résultant de l'inoculation bactérienne ont été détectés chez les plantes transgéniques : un nombre de nodules plus élevé et une croissance racinaire primaire accrue (figure 1A). Comme cela ressort des figures 1B-1C, les plantes Se40 présentent plus de nodules par rapport aux plantes contrôle (figure IB). En outre, la majorité des nodules transgéniques apparaissent dans une région proche de la pointe racinaire (figure IB).
Pour analyser la cinétique de nodulation de plantes inoculées par S. meliloti Rm41 de type sauvage, les nodules ont été comptés différents jours après l'infection bactérienne. En fait, l'augmentation significative du nombre de nodules à 18 j.a.i. (observée pour les plantes Se40) est due à une accélération dans la cinétique de nodulation (figure 1D). Dans les conditions opératoires, les premiers nodules apparaissent à 4-6 j.a.i. sur les racines transgéniques enod40, alors qu'ils apparaissent à 8-10 j.a.i. sur les racines des plantes contrôle. L'écart se maintient jusqu'à ce que les plantes transgéniques et les plantes contrôle atteignent un nombre maximum de nodules.
Une accélération significative de la nodulation est confirmée en utilisant un test t aux jours 18 (P<0,01) et 23 (P<0,05). Au jour 32, les différences ne sont plus significatives. Le phénotype racinaire est aussi dû à une interaction symbiotique, puisque aucune différence significative dans la longueur des racines n'est obser- vée en l'absence d'inoculation bactérienne, que ce soit en présence ou en l'absence d'azote combiné dans le milieu (Charon et al, 1997). Pendant la symbiose, la longueur racinaire moyenne des plantes transgéniques est faible, mais stimulée de façon significative (figure 1E).
Une analyse microscopique des racines infectées et des nodules en développement a été réalisée après infection avec une souche dérivée de Rm41, exprimant de façon constitutive lacZ, ce qui permet la détection des bactéries. Quelques jours après l'infection des racines transgéniques enod40, une coloration bleue, spécifique de la β-gal montre que les bactéries sont principalement présentes autour de la zone pilifère de croissance racinaire et ont déjà commencé à pénétrer dans la racine de la plante au niveau des filaments absorbants (figure 2B). Sur les racines des plantes contrôle, seuls quelques bactéries et filaments infectés ont pu être observés (figure 2A). Ainsi, il semble que les racines transgéniques révèlent plusieurs infections rhizobiales persistantes donnant lieu à la formation de nodules dans des régions situées au niveau de la pointe racinaire (figure 2D). En outre, au même stade de développement, les primordia sont plus grands dans les racines transgéniques, comme cela est confirmé par agrandissement de la zone pilifère de croissance racinaire (figure 2D comparée à la figure 2C). Des coupes transversales et longitudinales des racines transgéniques enod40, au niveau de la zone de nodulation, confirment la présence d'une division accrue dans le cortex, les cellules se divisant à la fois de façon anticlinale et périclinale dans l'ensemble du cortex (figures 2F et 2G), et sont significativement différentes des coupes racinaires des plantes contrôle, à la même étape de nodulation (figure 2E).
Dans le péricycle racinaire, aucune augmentation du nombre de divisions cellulaires n'a toutefois été observée. A un stade de nodulation plus avancé, des bactéries ont été détectées depuis la région d'invasion jusqu'à la région symbiotique centrale (figure 2H). Dans les racines transgéniques enod40, les nodules arrivés à maturité sont semblables à ceux induits dans les plantes contrôle, bien qu'une région de division cellulaire corticale étendue enveloppe les nodules en développement (figures 21 et 2J). Ce phénotype de prolifération n'a pas pu être détecté dans les racines contrôles. Au contraire, les nodules apparaissant dans la partie supérieure des racines transgéniques sont similaires à ceux observés dans les plantes de contrôle (figure 2B).
Puisque ce phénotype de nodulation accélérée est localisé dans la région de pointe racinaire, l'expression des gènes des nodulines dans cette région a été vérifiée par des études de RT-PCR.
Une analyse de l'expression de Mtenodl2 (Bauer et al. , 994) et MtCAl (Coba de la Pena et al, 1997) a montré que ces gènes sont induits plus tôt dans les racines transgéniques (6 j.a.i. ; figure 2B), confirmant à un niveau moléculaire, l'accélération de la cinétique de nodulation dans les racines exprimant de façon constitutive enod40.
Ainsi, les plantes transgéniques Se40 inoculées par S. meliloti présentent des réponses spécifiques à la prolifération, associées à l'expression de enod40 : une croissance racinaire accrue et une nodulation accélérée, accompagnées par des divisions cellulaires corticales extensives dans la région proche de la pointe racinaire. La surexpression de enod40 a également pour conséquence une perturbation dans le positionnement des cellules corticales en division pendant la symbiose précoce. La synergie d'action observée par les Inventeurs, ente la surexpression du gène enod40 et la symbiose, dans les légumineuses entraîne, du fait d'une fixation significativement accrue de l'azote, une accélération significative de la nodulation ainsi qu'une augmentation de la croissance racinaire (en relation avec le taux de division du méristème apical). Ceci a notamment pour conséquence un rendement significativement amélioré des récoltes.
- Les réponses à la prolifération, induites dans des plantes transgéniques surexprimant enod40 dépendent du facteur Nod.
Pour étudier la formation de nodules bloqués à différents stades de développement, des racines transgéniques ont été inoculées : - par un mutant Bac S meliloti incapable de se différencier en bacté- roïdes,
- par un mutant EPS S. meliloti incapable d'envahir les nodules par les filaments absorbants (nodules non contaminés par les bactéries), et
- par un mutant NodC S. meliloti incapable de produire les signaux du facteur Nod.
23 jours après l'infection, des analyses microscopiques des racines infectées par le mutant NodC ont révélé seulement une augmentation significative du nombre de divisions cellulaires corticales dans les racines transgéniques, par rapport aux racines des plantes contrôle (figure 4A), de façon similaire au phénotype observé en l'absence de Rhizobium (Charon et al, 1997). D'autre part, les plantes transgé- niques infectées soit par des mutants EPS, soit par des mutants Bac présentent une cinétique de nodulation accélérée. En effet, des nodules vides apparaissent sur les racines transgéniques à 20 j.a.i. avec le mutant EPS, alors qu'ils n'apparaissent qu'environ une semaine plus tard sur les racines des plantes contrôle. En outre, des nodules rassemblés ainsi qu'une prolifération extensive des cellules corticales sont observés, comme dans le cas d'une infection bactérienne de type sauvage (figures 4B et C). Les racines des plantes transgéniques infectées par EPS et Bac sont également plus longues, suggérant que les deux réponses à la prolifération des plantes transgéniques Se40 sont liées à l'action des facteurs Nod.
Pour confirmer ce résultat, l'effet des facteurs Nod purifiés a été testé sur des plantes transgéniques. Deux jours après un traitement par NodRmΙV(S), une analyse microscopique des plantes contrôles et des plantes transgéniques Se40 a révélé des réponses racinaires au facteur Nod dans la zone pilifère de croissance racinaire, comprenant la déformation et la courbure des poils racinaires (figure 4E), ainsi que des divisions des cellules corticales (figure 4D). Une analyse détaillée de cette région a révélé trois types de zones de cellules en division, qui se distinguent par la localisation et l'orientation des divisions. Ces zones sont soit (i) des cellules en division dans le péricycle et le cortex (primordia putatifs latéraux racinaires, figure 4F), soit (ii) des cellules en division anticlinale dans toutes les couches cellulaires du cortex, avec une quantité élevée de poils racinaires (figure 4G), soit (iii) des groupes de cellules dans le cortex interne qui se divisent à la fois de façon anticlinale et périclinale (primordia putatifs nodulaires, indiqués par un crochet noir sur les figures 4D et 4H). Après un traitement des racines transgéniques et des racines des plantes contrôle avec un facteur Nod à différentes concentrations, une augmentation significative du nombre de zones de type (iii) dans le premier cm de la région proche de la pointe racinaire a été décelée dans les plantes transgéniques surexprimant enod40 (figure 41). Aucune différence n'a été décelée dans le nombre des deux autres types de zones. En outre, la principale longueur racinaire des racines transgéniques Se40 est plus élevée que celle des plantes contrôle avec un traitement par le facteur Nod 10"7M (figure 4K). L'importance de la différence de longueur a été confirmée à l'aide d'un test t (P<0,05). Aucune différence significative n'a été trouvée après un traitement au chitotétraose (figure 4J). Ces résultats montrent que les différentes réponses observées après une infection par un Rhizobium, dans des racines de plantes transgéniques sont dues à une synergie entre le facteur Nod et les actions de enod40.
- Contrôle de l'action de enod40 par l'azote et l'éthylène L'apport limité d'une source d'azote est indispensable à l'initiation et au développement nodulaire. Il a été précédemment montré que la surexpression de enod40 dans des plantes privées d'azote entraîne une dé-différenciation et une division des cellules corticales racinaires accrues, cet effet n'étant pas observé quand la croissance des plantes n'est pas limitée par la quantité d'azote combiné (Charon et al, 1997). Pour tester si une limitation en azote est également requise pour le phénotype de nodulation accélérée observé, des plantes transgéniques Se40 ont été cultivées dans un milieu contenant respectivement 1 mM, 2 mM ou 5 mM de nitrate de potassium. Les plantes ont ensuite été inoculées par S meliloti pendant 8 jours après la germination, et les nodules ont été comptés 18 jours après. Comme cela ressort de la figure 5A, la nodulation accélérée induite par l'action de enod40 est réprimée par l'azote à partir d'une concentration de 1 mM en nitrate de potassium (nombre de nodules réduit de 50 %). Pour tester si l'action de enod40 peut être régulée par l'azote une fois que les nodules sont formés, une solution de nitrate a été appliquée aux plantes transgéniques à 10 j.a.i. (plantes portant des nodules en développement). A différents jours après le traitement azoté, un comptage des nodules a indiqué que l'ajout de nitrate de potassium bloque la nodulation aussi bien dans les plantes contrôle que dans les plantes transgéniques Se40 (figure 5B). Huit jours plus tard, un nombre plus élevé de nodules est détecté, probablement à cause de la métabolisation par la plante, de l'azote ajouté (figure 5B). Ainsi, une expression constitutive (indépendante d'un ajout d'azote) de enod40 ne permet pas aux plantes de surmonter le contrôle, par l'azote, du développement nodulaire. Comme cela a été mentionné ci-dessus, les plantes transgéniques Se40 inoculées présentent un nombre de nodules accru ainsi qu'une dérégulation du positionnement des cellules corticales en division (figure 2F). ce qui pourrait indiquer un affaiblissement du contrôle par l'éthylène dans les plantes dérégulées par rapport à l'expression d'enod40. Ainsi, des semences ont été cultivées sur un milieu agar solidifié contenant peu d'azote, enrichi avec de l'ACC à différentes concentrations, et observées cinq jours plus tard. Pour les plantes contrôle et les plantes Se40, l'AAC a induit plusieurs réponses, dont l'inhibition de la croissance racinaire, l'élongation de l'hypo- cotyle et la formation d'un crochet d'hypocotyle. Aucune différence n'a été observée en ce qui concerne la longueur racinaire primaire après des traitements avec différentes concentrations d'ACC (figure 6A). Une inhibition de l'élongation racinaire a été observée dans tous les cas, indiquant que les plantes de Medicago contrôle et transgéniques enod40 sont sensibles à l'hormone. En outre, les plantes ont été traitées par l'ACC (acide 1-aminocyclopropane carboxylique, précurseur immédiat de l'éthylène) ou par l'AVG (aminoéthoxyvinyl-glycine, un inhibiteur de l'ACC synthase) en absence ou de façon concomitante à une inoculation par S. meliloti. Les expériences ont confirmé la régulation négative de la nodulation induite par l'éthylène dans les plantes de M. truncatula, puisqu'une réduction significative du nombre de nodules a été observée à 15 j.a.i. ainsi qu'à 23 j.a.i. après un traitement par de l'ACC à 10'5 M ou 10"7 M, en combinaison avec une infection bactérienne (figure 6B). Malgré la répression de la formation nodulaire par l'ACC dans les plantes transgéniques Se40, leur cinétique de nodulation différentielle a été maintenue. D'autre part, l'inhibiteur d'éthylène AVG (10"7 M) a été appliqué aux racines en combinaison avec une infection bactérienne. Les plantes contrôle traitées par l'AVG ont montré une accélération de leur cinétique de nodulation, comme pour les plantes transgéniques Se40 (figure 6B). Toutefois, des analyses microscopiques de leurs racines ont révélé des divisions cellulaires corticales extensives seulement dans quelques cas.
Ainsi, même si la nodulation des plantes Se40 est contrôlée par l'éthylène et l'azote et que les racines sont également sensibles à l'ACC, l'action de enod40 peut être partiellement imitée par un traitement des racines infectées par un inhibiteur de l'éthylène. - Des plantes de Medicago truncatula transgéniques surexprimant enod40 semblent présenter un rendement de culture amélioré (Figure 7), par rapport à des plantes contrôles.
Des plantes de Medicago truncatula transgéniques surexprimant enod40, cultivées dans un milieu pauvre en azote combiné pour initier la nodulation, infectées par Rhizobium S. meliloti (Rm41) et récoltées 15 jours après l'infection ont un poids sec moyen (0,11g + 0,013) statistiquement supérieur à celui des plantes normales (0,056g ± 0,012).
L'ensemble de ces résultats montre que la nodulation accélérée et la croissance racinaire accrue des plantes transgéniques surexprimant enod40 permet un meilleur développement de la partie aérienne, sans doute due à une fixation plus efficace de l'azote. Les plantes transgéniques surexprimant enod40 permettent donc d'obtenir de meilleurs rendements agricoles dans des conditions où l'azote combiné est limitant, plus proches des conditions réelles de culture au champ. REFERENCES
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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'une plante transgénique surexprimant le gène enod40 et vivant en symbiose avec un Rhizobium pour l'obtention d'une plante enrichie en produits azotés. 2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite plante est une légumineuse.
3°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite légumineuse est Medicago truncatula.
4°) Procédé d'enrichissement de plantes en azote, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une plante transgénique surexprimant le gène enod40, en présence d'un Rhizobium.
5°) Plantes enrichies en produits azotés, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à l'aide du procédé selon la revendication 4.
6°) Plantes selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles sont, de manière préférée, des légumineuses.
7°) Matériel végétal, caractérisé en ce qu'il est issu des plantes selon la revendication 5 ou la revendication 6.
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