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WO1999031271A1 - Analyse de la predisposition a des pathologies specifiques sur la base du polymorphisme du gene de la tripsine protease des voies aeriennes humaines - Google Patents

Analyse de la predisposition a des pathologies specifiques sur la base du polymorphisme du gene de la tripsine protease des voies aeriennes humaines Download PDF

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WO1999031271A1
WO1999031271A1 PCT/JP1998/005689 JP9805689W WO9931271A1 WO 1999031271 A1 WO1999031271 A1 WO 1999031271A1 JP 9805689 W JP9805689 W JP 9805689W WO 9931271 A1 WO9931271 A1 WO 9931271A1
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seq
intron
gene
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fragment containing
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Hiroshi Eguchi
Kazuyoshi Yamaoka
Kenichi Masuda
Susumu Yasuoka
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Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
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Publication date
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Priority to EP98961367A priority patent/EP1043406B1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the present invention relates to a constitution in which a specific disease is likely to develop by polymorphism analysis of a human airway trypsin-like enzyme, a method for predicting an effect on a treatment method for a patient with the disease, or a method for predicting a prognosis of treatment.
  • the human airway trypsin-like enzyme according to the present invention is purified from sputum of a patient with chronic airway disease (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-067640 and Yasuoka S. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , 16: 300-308, 1997), and its amino acid sequence and cDNA sequence have already been elucidated (JP-A-8-89246 and Yamaoka K. et al. J. Biol. Chem., 273 ( 19): 11895-11901, 1998).
  • JP-A-8-89246 and Yamaoka K. et al. J. Biol. Chem., 273 ( 19): 11895-11901, 1998 Several studies have been made on the activity of this enzyme in vitro.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the problems of the prior art, and as a result, primers for amplifying the intron portion on the genome of the human airway trypsin-like enzyme specifically expressed in the human respiratory tract.
  • the DNA sequence of both ends of the amplified gene fragment and the exon intron boundary was newly determined, and it was found that the amplified gene fragment and the newly determined DNA sequence had a gene polymorphism.
  • the present inventors have found for the first time the relationship between the genotype of an individual human respiratory tract trypsin-like enzyme and a disease, and have reached the present invention.
  • the present invention provides a method for predicting the constitution of an individual who is liable to develop a specific disease, the effect of treatment on a patient, or the prognosis of treatment by genetic polymorphism analysis of a human airway trypsin-like enzyme.
  • the present invention is a method for diagnosing abnormalities in the mucociliary biological defense system by genetic polymorphism analysis of a human airway trypsin-like enzyme, wherein the individual is liable to develop a specific disease, or a therapeutic effect on a patient, Or a method of predicting the prognosis of treatment.
  • the present invention is a gene fragment containing a part or all of the nucleotide sequence of an intron of a human airway trypsin-like enzyme.
  • Fig. 1 Agarose gel electrophoresis pattern of DNA fragment containing intron region of gene encoding mature protein of human airway trypsin-like enzyme obtained by gene amplification.
  • Lanes 1 and 5 are markers (top, 10Kb, 7Kb, 5Kb, 4Kb, 3Kb, 2.5Kb, 2Kb, 1.5Kb, 1Kb) and lane 2 is with primers Al (SEQ ID NO: 7) and A2 (SEQ ID NO: 8).
  • lane 3 is approximately 1.5 kb DNA fragment amplified by primers B1 (SEQ ID NO: 9) and B2 (SEQ ID NO: 10)
  • lane 4 is primer An approximately 3.4 Kb DNA fragment amplified by C1 (SEQ ID NO: 11) and C2 (SEQ ID NO: 12) is observed.
  • Figure 2 shows an agarose gel electrophoresis pattern of a DNA fragment containing the intron region of the gene encoding the human airway trypsin-like enzyme propeptide obtained by gene amplification.
  • Lanes 1 and 4 are markers (10Kb, 7Kb, 5Kb, 4Kb, 3Kb, 2.5Kb, 2Kb, 1.5Kb, 1Kb from the top) and lane 2 is primers Dl (SEQ ID NO: 13) and D2 ( Lane 5.5 shows a DNA fragment of approximately 5.5 Kb amplified by primers E1 (SEQ ID NO: 15) and E2 (SEQ ID NO: 16).
  • Figure 3 Relative positions of introns A, B, and C on the human respiratory tract trypsin-like enzyme genome, and the polymorphisms (RFLPs) detected by TaqI of intron A and MboI of intron C and BstUI. 1 shows an agarose gel electrophoresis pattern.
  • a method for predicting the association between an individual's constitution and a specific disease, and a gene fragment or DNA sequence used for gene analysis thereof is provided.
  • Specific diseases for which the predisposition to be likely to develop by the method of the present invention is determined, or specific diseases for which the effect of the treatment is determined or the prognosis of the treatment is predicted, include respiratory diseases, lung cancer, and especially chronic diseases. Examples include emphysema (PE), obstructive pulmonary disease (COPD), paranasal bronchiolitis, diffuse panbronchiolitis (DPB), bronchiectasis (BE), or abnormal mucociliary defense system.
  • PE emphysema
  • COPD obstructive pulmonary disease
  • DPB diffuse panbronchiolitis
  • BE bronchiectasis
  • the method for analyzing a polymorphism of a human airway trypsin-like enzyme includes analyzing a genotype classified by detecting one or more base mutations, and classifying by detecting one or more base mutations. Haplotype analysis is exemplified.
  • Methods for analyzing polymorphisms of the airway trypsin II enzyme include, for example, restriction by restriction enzyme cleavage. This is done by an analysis method using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).
  • the gene polymorphism analysis method of the present invention also includes a gene polymorphism analysis method that can be detected by Southern hybridization using the cDNA sequence of human airway trypsin II enzyme. That is, after genomic DNA is cleaved with a restriction enzyme capable of detecting the gene polymorphism disclosed in the present invention, gel electrophoresis is performed, and the resulting DNA is transferred to a nitrocellulose membrane or the like.
  • a method in which a DNA fragment is amplified by PCR so as to include a polymorphic site and then converted to a single strand and analyzed based on differences in electrophoretic mobility PCR—Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) method
  • SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
  • Other methods for detecting polymorphic sites include the mismatch PCR method, PCR using an aryl-specific oligonucleotide, the ASO (Allele Specific Oligo) method, a method using annealing using an oligo probe to determine, and direct gene multiplication.
  • ASO Allele Specific Oligo
  • the site for gene polymorphism analysis may be an intron, and the specific gene polymorphism analysis site includes the following gene fragments.
  • a gene fragment containing tron A that can be amplified using the primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8
  • a gene fragment containing a sequence portion recognized by a restriction enzyme B stU I, Mbo I, Ms el, or F ba I in intron C, and a restriction enzyme in intron A examples include a portion including a sequence portion recognized by MboI, TaqI, or AfaI, and one or more combinations of the polymorphic site shown in SEQ ID NO: 17. Analysis of these sites determines the genotype or haplotype classification.
  • the present invention relates to a gene fragment containing a part or all of the nucleotide sequence of an intron of a human airway trypsin-like enzyme. Particularly, the following gene fragments are exemplified.
  • the method for predicting a disease-related constitution by genetic polymorphism analysis of the human airway trypsin-like enzyme is not limited thereto.
  • the biological sample used for the gene amplification of the present invention is not particularly limited, and it is preferable because a powerful blood cell component can easily collect a sample and can easily extract DNA.
  • reaction solution composition 50 mM KC 1, 10 mM Tris-HC 1 (pH 9.0, 25 ° C), 0.1% TritonX—100, 1.5 mM MgCl 2 , 2 mM d N.TP s, 15M Forward Primer, 15 ⁇ Reverse Primer, lmgZ liter genomic DNA, 1 unit Taq DNA polymerase, total volume 50 1
  • Reaction cycle 94, 1 minute; 64 ° C, 1 minute; 72 ° C, 1 minute, 1 cycle, 40 cycles.
  • the following primers C1 (35 bases) and C2 (35 bases) are used.
  • composition of reaction solution for Mb o I 1 OmM Tris-HC 1 (pH 7.4), 10 mM MgCl 2 , 10 OmM NaCl, 1 OmM KC 1,
  • the electrophoresis buffer is 0.5XTBE.
  • 5XTBE contains 54 g of Tris base, 27.5 g of boric acid and EDTA ImM in 1 liter, and is adjusted to pH 8.0.
  • 1% or 3% agarose gel [Seakem GTA Arose (FMC Bioproducts) Use] (containing 0.5 gZm 1 of ethidium bromide) and run at 100 V for 30 minutes. Then observe the DNA band with a UV lamp.
  • Example 1 Acquisition of DNA fragment containing intron on human airway trypsin-like enzyme genome by gene amplification and analysis of its nucleotide sequence
  • primers were created with reference to the exon and intron configurations of the genome of several tryptase-related enzymes, and human genomic DNA was amplified.
  • human genomic DNA was amplified.
  • Primers C1 (SEQ ID NO: 11) and C2 (SEQ ID NO: 12) amplified a DNA fragment of about 3.4 Kb (FIG. 1).
  • intron A The intron sequences in the gene region encoding the mature protein of the human airway trypsin-like enzyme identified in the present invention are referred to as intron A, intron B, and intron C from the 5 'side, respectively (FIG. 3). .
  • the nucleotide sequences at the 5 'end and the 3' end of each identified intron are as shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, and 6, respectively. Further, the entire nucleotide sequence of intron C is shown in SEQ ID NO: 17.
  • primers D1 SEQ ID NO: 13
  • D2 SEQ ID NO: 14
  • E1 SEQ ID NO: 15
  • E2 SEQ ID NO: 16
  • Example 2 Analysis of gene polymorphism in intron of human airway trypsin-like enzyme
  • genomic DNA of 23 healthy subjects was extracted from whole blood. Extracted (standard procedure) and amplified with primers A1, A2 for intron A amplification, primers B1, B2 for intron B amplification, and primers C1, C2 for intron C amplification, respectively. Then, the cleavage patterns by various restriction enzymes were compared. As a result, it was found that in intron A, a polymorphism was observed by the restriction enzymes MboI, Taql, and AfaI.
  • intron B the restriction enzymes Tsp509AluNlaIIKMspl, BstUI, BfaI, HinPI, HaeIILMboI, Afal, Taql, Msel, C1a Genetic polymorphisms were observed by I, Nsil, EcoT14 I, Ndel, Pmll, ApalI, AatII, Apal, Kpnl, Bsml, HindIII, Sspl, EcoRV. Did not.
  • restriction enzymes MboI, BstUI, MseI, and FbaI were found to be observed with the restriction enzymes MboI, BstUI, MseI, and FbaI.
  • Genotype MM can be determined when a band appears at Kb, genotype mm when a band appears at 1.05 Kb, and genotype Mm when two bands at 1.3 Kb and 1.05 Kb appear together.
  • B st UI BB is 3.4Kb
  • bb is 2.45Kb and 0.95Kb
  • three Bb appear together.
  • FIG. 3 shows the electrophoretic patterns of the polymorphisms detected by Taq I of intron A, MboI of intron C, and Bst'UI.
  • the entire base sequence of the bm-type haplotype was determined from the DNA fragment obtained by PCR from the genome of a normal bb-mm-type healthy person (SEQ ID NO: 17). Genetic polymorphism sites detected by BstUI and MboI in the base sequence of intron C are indicated by white arrows.
  • nucleotide sequence of a BBmm BE patient genome was determined, the nucleotide sequence of the Bm haplotype BstUI gene polymorphism site was not cleaved by BstUI because CGCG became ACCG. all right.
  • Example 2 Among the polymorphisms disclosed in Example 2, whether or not it is possible to classify human airway trypsin-like enzyme-related diseases with respect to the polymorphisms detected by MboI and BstUI in intron C was considered.
  • the selected diseases were the respiratory diseases diffuse panbronchiolitis (DPB), bronchiectasis (BE), emphysema (PE), and bronchial asthma (BA).
  • DLB 29 diffuse panbronchiolitis
  • BE 38 bronchiectasis
  • PE 22 emphysema
  • BA 32 bronchial asthma
  • Tables 1 and 2 show the number and frequency of appearance of each genotype, and the number and frequency of appearance of each a1 leie type.
  • Table 1 Number of B st UI genotypes Number of occurrences Number of occurrences (allele)
  • G-squared value 4.177 G-squared p-value • 0410 percent (rows): 3 diseases, BB / Not BB contingency prayer coefficient .145
  • the table below shows the number of haplotypes and the frequency of occurrence of haplotypes based on the combination of both Mb o I gene polymorphisms. Examination of 238 individuals showed that none of the genotypes of Bb-MM bb-MM bb-Mm were present, suggesting that bM haplotypes are rarely present in Japanese.
  • the frequency of occurrence of a11e1e for each of three Japanese haplotypes was examined.
  • Bma a 1 e 1 e was more frequent in the three respiratory disease groups (DP B, BE, PE) belonging to C ⁇ PD than in healthy subjects.
  • DPB 29 71 100 Chi-square p-value (Yates correction) .0047 mouth 16 84 100 Fisher direct p-value .0045 Observed frequency: BE, Bm / NotBm Split table prayer statistics: BE, Bm / NotBm
  • the Bm type is considered to be closely related to respiratory diseases.Therefore, focusing on this type, individuals with no Individuals with heterogeneity (hetero) and individuals with two (homo) were classified and analyzed.
  • Fisher's direct method p-value 2639 isS measure: BA, Bm0.1 / Bm-2
  • intron gene polymorphism analysis of human airway trypsin-like enzyme showed that the Bm-type haplotype is related to chronic airway inflammation in respiratory diseases by some mechanism. Furthermore, it was shown that the involvement of human airway trypsin-like enzyme in diseases is different in BA from DPB, BE, and PE, which belong to chronic obstructive disease (COPD).
  • COPD chronic obstructive disease
  • the polymorphism of the human airway trypsin-like enzyme is not a definitive onset factor as in so-called genetic diseases, but an It can be said that. That is, when an environmental factor or the like is added to an individual having the B m haplotype, respiratory diseases such as BE, PE, and DPB are more likely to occur.
  • the present invention provides a method of determining an individual's disease-related constitution by a method for analyzing a polymorphism of a human airway trypsin-like enzyme. Therefore, if a disease associated with the human airway trypsin-like enzyme can be identified by this analysis, it can be estimated that an individual having a genotype of the human airway trypsin-like enzyme is more susceptible to a certain disease.
  • gene polymorphism analysis of human airway trypsin-like enzyme may be a means to determine the effect of administered drugs and to narrow down the effective patient group in drug development.

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Description

明 細 書 ヒト気道トリプシン様酵素遺伝子多型 ίこよる疾病体質解析 技術分野
本発明はヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により特定の疾患が発症し やすい体質ゃ該疾患患者の治療方法に対する効果の予測、 あるいは治療の予後を予 測する方法に関する。 背景技術
近年、 単一の遺伝子の欠損や変異による遺伝子疾患だけでなく、 いくつかの遺伝 子素因と環境要因とが絡み合って引き起こされる多因子疾患においても、 関係する 遺伝子の研究が進められてきた。 その結果、 それら多因子疾患に関わる遺伝子の欠 損や点変異、.およびァイソフォーム、 さらには、 実際に翻訳されるアミノ酸配列に 影響しない遺伝子部分 （イントロン、 プロモータ一） の変異が疾患のリスクファク 夕一として考えられるようになつてきた。
従来技術としては、 骨疾患分野においては骨密度とビタミン Dレセプターのイン トロンの遺伝子多型との相関が認められることが発表されている （Morrison, N. A. et aし， Nature, 367: 284-287, 1994) 。 循環器分野においてはアンジォテンシン 変換酵素の I型 （挿入型） と D型 （欠損型） の遺伝子多型が心筋梗塞の発症 (Cambie m, F. et al., Nature, 359: 641-644； 1992)に関係するという報告やアンジォテン シノーゲンの M 235 Tのアミノ酸置換と G— 6 Aのプロモータ一領域の多型が本 態性高血圧発症と関連しているという報告（Inoue, I. et al. , J. Clin. Invest., 99: 1786-1797, 1997)がなされている。 また、 神経系の分野では、 痴呆の発症と a p oE蛋白のァイソフォームとの関連性が報告されている。 さらに、 癌関連では、 グル夕チオン Sトランスフェラ一ゼの遺伝多型と癌の発症の関連性について多くの 研究がなされている。 呼吸器疾患分野としては喘息の発症や病態と、 TNF (Moffa tt, M. F. et aに Hum. Mo I. Genet.6 (4)： 551-554, 1997) やアンジォテンシン変 換酵素 （Benessiano, J. et aに J. Allergy Clin. Immunol.99 (1) : 53-57, 1997 ) の遺伝子多型の関連性が報告されている。
また、 疾患治療に用いられる薬剤の感受性が患者によって異なる原因の一つとし て遺伝的な背景が注目されており、 遺伝子多型診断により個々人の薬剤感受性に応 じた治療方法が選択されるという方向性が医療現場からも望まれている。 また、 臨 床治験において薬剤の効果の期待される患者群を遺伝子多型により選定して薬剤開 発を行うのは有効であると考えられる（Kleyn K. W. et al.： Science, 281: 1820- 1821, 1998) 薬剤感受性と遺伝子多型に関する従来の報告としては、 アンジォテン シン変換酵素 （AC E (Angiotensin Converting Enzyme) ) のイントロンの遺伝子多 型と ACE阻害剤の効果に関する報告（Yoshida, H. et al. , J.Clin. Invest. 96: 2 162-2169, 1995) や be 2- adrenergic receptorの遺伝子多型と asthmaに対する beta - agonistの効果に関するもの（Liggett, S. B. , Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1 56(4 Pt 2) : S156-162, 1997)などが挙げられる。
一方、 本発明に関わるヒト気道トリプシン様酵素は、 慢性気道疾患患者の喀痰中 より精製され （特開平 7— 067640号公報および Yasuoka S. et al., Am. J. R espir. Cell Mol. Biol. , 16: 300-308, 1997)、 そのアミノ酸配列および c DNA 配列がすでに明らかとなっている （特開平 8— 89 246号公報および Yamaoka K. et al. J. Biol. Chem. , 273 (19)： 11895 - 11901, 1998) 。 この酵素のもつ活性につ いては in vitroにおいていくつか検討がなされている。 粘液繊毛運動に対する関与 をはじめ、 ヒト気管支上皮細胞株からの I L— 8、 GM— CS Fなどのサイトカイ ンの産生増強作用 （寺尾紀子ら、 1998年度日本呼吸器学会） を有することから気道 炎症の病態への関与の可能性が考えられる。 また、 fibrinogenの分解活性および pla sminogen activator (pro- urokinase)活性化作用などの酵素活性 （吉永純子ら、 199 8年度病態と治療におけるプロテアーゼとインヒビ夕一研究会（Conference on Prote ases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics) ) を有してレ ること から気道粘膜面における Π br i n形成を介して抗炎症的に作用したり、 慢性気道疾患 ではその病態を修飾している可能性が想定され、 さらに癌転移などに関与している 可能性も考えられている。 し力、し、 この酵素の生体内での生理的な機能や病態にお ける関与についてはまだ充分に解明されておらず、 遺伝子に関しても実際に翻訳さ れるアミノ酸配列に該当しない遺伝子部分 （イントロン、 プロモーター） について は全く知られていなかった。 さらに、 このヒト気道トリプシン様酵素についての遺 伝子多型の有無や遺伝子多型と疾患との関連性についてはこれまで調べられたこと はない。
ところで、 遺伝子解析により疾病関連体質を予測することは、 特定疾患の発症の 予測、 治療予後の予測、 適切な治療法や投与薬剤の選定などに多くの情報を与える ことができる。 そのため、 多くの医者および患者から望まれており、 さらにこれら のことは発病予防、 早期治療を可能とするため、 多額の医療費を削減することに結 びつき、 将来の医療には欠かせないものとなると考えられる。
しかし、 疾患と関連する遺伝子を見つけだし、 その解析方法を確立することは非 常に困難であり、 既に述べたように、 疾患との関連性が認められている遺伝子解析 方法の例は少ない。 従って、 さまざまな疾病関連体質を予測しうる遺伝子解析手法 の開発は強く望まれている。
一方、 ヒト気道トリプシン様酵素が何の疾患に関連するかは現在のところまだ解 明されていない。 発明の開示
そこで本発明者は、 かかる従来技術の課題を鑑みて鋭意研究した結果、 ヒトの気 道において特異的に発現しているヒト気道トリプシン様酵素のゲノム上のィントロ ン部分を遺伝子増幅するためのプライマーをデザインし、 増幅された遺伝子断片の 両端およびェキソン イントロン境界部分の D N A配列を新規に決定し、 増幅され た遺伝子断片および新規に決定した D N A配列に遺伝子多型があることを見出した 。 さらに、 その遺伝子多型解析によって、 個々人のヒト気道トリプシン様酵素の遺 伝子型と疾患との関わりをはじめて見出し、 本発明に到達した。
すなわち本発明は、 ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により、 個々人 の特定の疾患が発症しやすい体質、 または患者に対する治療の効果、 または治療の 予後、 を予測する方法を提供する。
また、 本発明はヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により粘液繊毛生体 防御系の異状の診断をする方法であって、 個々人の特定の疾患が発症しやすい体質 、 または患者に対する治療の効果、 または治療の予後を予測する方法である。 さらに、 本発明はヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの塩基配列の一部もし くはすべてを含む遺伝子断片である。 図面の簡単な説明
図 1 遺伝子増幅により得られたヒト気道トリプシン様酵素の成熟タンパクをコ一 ドする遺伝子のイントロン領域を含む D N A断片のァガロースゲル電気泳動パ夕一 ンを示す。 レーン 1、 5はマーカー （上から 10Kb、 7Kb、 5Kb、 4Kb、 3Kb、 2. 5Kb, 2Kb、 1. 5Kb、 1Kb) 、 レーン 2はプライマー Al (配列番号 7) と A2 (配列番号 8) によって増幅された約 6 Kbの DNAフラグ メント、 レーン 3はプライマ一 B 1 (配列番号 9) と B2 (配列番号 10) によつ て増幅された約 1. 5Kbの DNAフラグメント、 レーン 4はプライマ一 C 1 (配 列番号 1 1) と C2 (配列番号 12) によって増幅された約 3. 4Kbの DNAフ ラグメントが観察される。
図 2 遺伝子増幅により得られたヒト気道トリプシン様酵素のプロペプチドをコー ドする遺伝子のイントロン領域を含む DNA断片のァガロースゲル電気泳動パター ンを示す。 レーン 1、 4はマ一カー （上から 10Kb、 7 Kb, 5Kb, 4Kb、 3Kb、 2. 5Kb、 2Kb、 1. 5 Kb, 1Kb) 、 レーン 2はプライマー D l (配列番号 13) と D2 (配列番号 14) によって増幅された約 5. 5Kbの DN Aフラグメント、 レーン 3はプライマー E 1 (配列番号 15) と E2 (配列番号 1 6) によつて増幅された約 5Kbの DNAフラグメントが観察される。
図 3 ヒト気道トリプシン様酵素ゲノム上のイントロン A、 B、 Cの相対的な位置 、 イントロン Aの T a q Iおよびイントロン Cの M b o I、 B s t U Iによって検 出される遺伝子多型 （RFLP) のァガロースゲル電気泳動パターンを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、 個々人の体質と特定の疾病との関連を予測する方法、 およびそ の遺伝子解析に用いる遺伝子断片あるいは D N A配列を提供する。
本発明の方法により発症しやすい体質が判別される特定の疾患、 あるいはその治 療の効果判定や治療の予後が予測される特定の疾患としては、 呼吸器系の疾患、 肺 ガン、 ことに慢性閉塞性肺疾患 （COPD) に属する肺気腫 （PE) 、 副鼻腔気管 支症候群、 びまん性汎細気管支炎 （DPB) 、 気管支拡張症 （BE) 、 または粘液 繊毛生体防御系の異常が例示される。
本発明のヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析方法は、 ひとつまたはそれ 以上の塩基変異を検出することにより分類される遺伝子型の解析、 ひとつまたはそ れ以上の塩基変異を検出することにより分類されるハプロタイプの解析が例示され る。
気道トリプシン搽酵素の遺伝子多型解析方法は、 例えば制限酵素切断による制限 酵素切断断片長多型 （Restriction Fragment Length Polymorphism： RFLP) に よる解析方法によりなされる。 本発明における遺伝子多型解析方法はヒト気道トリ プシン搽酵素の c D N A配列を用いてサザンハイブリダイゼーシヨンによつて検出 できる遺伝子多型解析方法も含んでいる。 つまり、 本発明で開示されている遺伝子 多型を検出しうる制限酵素でゲノム DNAを切断した後、 ゲル電気泳動を行い、 二 トロセルロース膜などに転写した後、 ヒト気道トリプシン様酵素 c DN Aをプロ一 ブとしてヒト気道トリプシン様酵素ゲノムの切断されたパターンをサザンハイブリ ダイゼーシヨンにより解析するという方法である。 また、 遺伝子多型部位を含むよ うに D N A断片を P C Rで増幅し、 その後一本鎖にして電気泳動の移動度の違いに より解析する方法 （PCR— S S CP (Single Strand Conformation Polymorphism) 法）などでも解析可能である。 多型部位を検出できる方法として他にもミスマッチ P CR法、 ァリル特異的なオリゴヌクレオチドを用いる PCR— ASO (Allele Speci fic Oligo)法、 オリゴプローブをもちいてアニーリングを行い判定する方法、 直接 遺伝子多型部位の塩基配列を決定するピンボイントシ一ゲンシング法など多数挙げ られ、 DNAチップなどを用いた遺伝子診断にも応用できる。
遺伝子多型解析の部位としては、 イントロンでもよく、 具体的遺伝子多型解析の 部位としては、 次の遺伝子断片が例示される。
( a ) 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマ一を用いて増幅されうるイント ロン領域を含む遺伝子断片
(b) 配列番号 9と配列番号 10に示されたプライマ一を用いて増幅されうるイン ト口ン領域を含む遺伝子断片
(c) 配列番号 11と配列番号 12に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
(d) 配列番号 13と配列番号 14に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
(e) 配列番号 15と配列番号 16に示されたプライマーを用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
(f ) 配列番号 1 1と配列番号 12に示されたプライマ一を用いて増幅されうる、 イントロン Cを含む遺伝子断片
(g) 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマーを用いて増幅'されうる、 トロン Aを含む遺伝子断片 ここで、 遺伝子多型解析の部位としては、 イントロン Cにおいては制限酵素 B s tU I、 Mbo I、 Ms e l、 または F b a Iによって認識される配列部分を含む 遺伝子断片、 イントロン Aにおいては制限酵素 Mb o I、 T a q I , または A f a Iによって認識される配列部分を含む部分、 配列番号 17に示される遺伝子多型部 位の 1つあるいはそれ以上の組合せが例示される。 これらの部位の解析により、 遺 伝子型もしくはハプロタイプ分類が判定される。
さらに、 本発明はヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの塩基配列の一部もし くはすべてを含む遺伝子断片であるが、 特に次の遺伝子断片が例示される。
(a) 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマーを用いて増幅されうるイント 口ン領域を含む遺伝子断片
(b) 配列番号 9と配列番号 10に示されたプライマ一を用いて増幅されうるイン ト口ン領域を含む遺伝子断片
(c) 配列番号 1 1と配列番号 12に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
(d) 配列番号 13と配列番号 14に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
(e) 配列番号 15と配列番号 16に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
( f ) 配列番号 1ないし配列番号 6のいずれかに示された塩基配列からなるヒト気 道トリプシン様酵素のイントロンの遺伝子断片、 またはそれらの塩基配列によって 挟まれたィントロン領域を含む遺伝子断片。
(g) 配列番号 17に示された塩基配列からなるヒト気道トリプシン様酵素ィント ロン Cの遺伝子断片 実施例
以下、 実施例によって詳細に説明するが、 本ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝 子多型解析による疾患関連体質予測法は、 これに限定されるものではない。
【標準的操作法】
以下、 本発明において用いることができる標準的な DN A抽出操作、 遺伝子増幅 操作、 制限酵素切断操作および電気泳動操作について説明する。
(a) 標準的な DN A抽出操作 本発明の遺伝子増幅に用いる生体試料には特に限定はない力 血球成分が検体を 採取しやすく、 また、 DN Aを抽出しやすいので好適である。
I. 全血 0. 5ml (2Na— EDTA抗凝固剤使用） を 1. 5m l容のマイクロ js'il、管に人れる。
2. 溶解液を 0. 5ml加えて、 チューブを数回軽く、 逆さにして液を混ぜる。
(下記の混合操作はこれに従う）
溶解液例： 1 X S S C
これは 1リットル中に N a C 1 175. 3 g、 クェン酸ナトリウム 88. 2 gを含む 1 ON NaOHでpH7. 0に調整した 20 XS SC を 10倍に希釈したものである。
3. 遠心 （10， 000 g、 20秒、 4°C) した後、 黒っぽいペレットが流出しな いように上清を除く。
4. 溶解液を lml加えて攪拌する。
5. 遠心 （10, 000 g、 20秒、 4で） した後、 上清を除く。
6. ステップ 4〜5をさらにもう 1回繰り返す。
7. 酵素反応液 200 1とタンパク分解酵素 10 β 1を加えて混合する。
酵素反応液例： 0. 04Μ DTT (ジチオスレイト一ル） 、
0. 2Μ NaOAc (酢酸ナトリウム） および 0. 4 % S D Sの混合液 タンパク分解酵素液例： 1 Omg/m 1プロティナ一ゼ （Proteinase K) 8. 37でで 1時間保温する。 （途中 2〜3回軽く振り混ぜる）
9. ヨウ化ナトリウム溶液を 300 1加えて混合する。
10. イソプロピルアルコールを 0. 5ml加えて、 白い線状の DNAが完全に見 えてくるまで、 混合する。
I I. 遠心 （10, 000 g、 10分、 室温） した後、 上清をゆつくり除く。 容器 を濾紙の上に逆さに置く等の方法で、 器壁に残った溶液を十分に除く。
12. 洗浄液 (A) を lml加えて混合する。 沈殿が器壁から剥がれる程度に十分 混合する。
洗浄液 （A) 例： 70%E t OH
13. 遠心 （10, 000 g、 5分、 室温） した後上清を除く。
14. 洗浄液 （B) を 1 m 1加えて混合する。 沈殿が器壁から剥がれる程度に十分 混合する。 洗浄液 （B) 例： 80 %E t〇H
1 5. 遠心 （10， 000 g、 5分、 室温） した後上清を除く。
16. DN A沈殿を軽く減圧乾燥する。 （乾燥しすぎると、 DNAが溶けにくいの で、 乾燥時間は 3分以内にする。 )
(b) 標準的な遺伝子増幅操作
遺伝子増幅法については、 いくつかの原理が知られているが、 ここではポリメレ —ス ·チェイン ·リアクション法 （PCR法） を標準的なものとして記載する。 反応液組成： 50mM KC 1、 10mM T r i s -HC 1 (pH 9. 0、 2 5°C) 、 0. 1 % Tr i t onX— 100、 1. 5 mM MgC l 2、 2 mM d N.TP s、 1 5 Mフォワードプライマ一 （Forward Primer) 、 15 Μリバース プライマ一 （Riverse Primer) 、 lmgZリットル ゲノム DNA、 1ユニット T a q DNAポリメラーゼ、 全容積 50 1
反応サイクル： 94で、 1分； 64°C、 1分； 72°C、 1分を 1サイクルとし、 40サイクル実施。
用いるプライマーは、 下記 C 1 (35塩基） と C2 (35塩基） を用いる。
C 1 ： 5 ' -GGAGC CATCT TGTCT GGAAT GCTGT G
TGCT GGAGT- 3 '
C 2 ： 5 ' -CACAA TAAAC CAAAG CCGCC GTGAG T CTTC TTGTA- 3 '
(c) 標準的な制限酵素切断操作
Mb o I用反応液組成： 1 OmM T r i s -HC 1 (pH7. 4) 、 10 mM MgC l 2、 10 OmM NaC l、 1 OmM KC 1、
ImM DTT、 100 g/m 1 B S A (ゥシ血清アルブミン）
Mb o Iを 10ユニット/ /20 ;u 1反応液の濃度で加え、 37°C、 3時間インキュ ペートする。
(d) 標準的な電気泳動操作
電気泳動用緩衝液は、 0. 5XTBEである。 但し、 5XTBEは 1リットル中 Tr i sベース 54g、 ホウ酸 27. 5 gおよび EDTA ImMを含有し、 pH 8. 0に調整してある。 上記緩衝液を用いて、 1 %もしくは 3 %ァガロースゲル [ S e akem GTA A a r o s e (FMC B i o P r oduc t s) 使用] (0. 5 gZm 1のェチジゥムブロマイド含有） を使用して、 電圧 10 0 Vで 30分間泳動する。 その後 UVランプで DN Aのバンドを観察する。
[実施例 1 ] ヒト気道トリプシン様酵素ゲノム上のィントロンを含む DN A断片 の遺伝子増幅による取得およびその塩基配列の解析
成熟ヒト気道トリプシン様酵素のゲノム上のィントロン部位を探索するため、 レ くつかのトリプタ一ゼ類縁酵素のゲノムのェキソン、 イントロンの構成を参考にし てプライマーを作成し、 ヒトゲノム DNAを増幅したところ、 プライマー A 1 (配 列番号 7) と A2 (配列番号 8) によって約 6Kbの DNAフラグメント （遺伝子 断片） 、 プライマ一 B 1 (配列番号 9) と B2 (配列番号 10) によって約 1. 5 Kb、 プライマ一 C 1 (配列番号 1 1) と C2 (配列番号 12) によって約 3. 4 Kbの DNAフラグメントが増幅された （図 1) 。
これらの DN Aフラグメントをゲルから切り出して精製し、 T Aクローニングべ クタ一 （インピトロジェン社製） にそれぞれのフラグメントを挿入した。 そのいく つかのクローンについてインサート DN Aの両サイド （5' 末端、 3' 末端） の塩 基配列を決定しこところ、 プライマ一の配列に続いてヒト気道トリプシン様酵素の cDNAの配列が存在し、 それに続き 5' 末端、 3' 末端共に、 両サイドにェキソ ンーイントロンの境界領域における共通配列が認められ、 増幅した DN A断片がヒ ト気道トリプシン様酵素のィントロン領域を含んだ DN A断片であることが判明し た。
本発明で明らかになったヒト気道トリプシン様酵素の成熟タンパクをコ一ドする 遺伝子領域のイントロンの配列は、 5' 側からそれぞれイントロン A、 イントロン Bおよびイントロン Cと呼ぶこととする （図 3) 。 明らかになったそれぞれのイン トロンの 5' 末端、 3' 末端の塩基配列は、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6で示 されるとおりである。 さらに、 イントロン Cに関しては、 全塩基配列を配列番号 1 7に示す。
一方、 ヒト気道トリプシン様酵素のプロペプチドをコードする領域に関しては、 いくつかのプライマーを作成し、 遺伝子増幅を行ったところ、 プライマー D 1 (配 列番号 13) と D2 (配列番号 14) によって約 5. 5Kbの DNAフラグメント 、 プライマー E 1 (配列番号 15) と E2 (配列番号 16) によって約 5Kbの D NAフラグメントが増幅されることが明らかになった （図 2) 。 これらの遺伝子断 片にはイントロンが含まれていると考えられる。
[実施例 2] ヒト気道トリプシン様酵素のィントロンにおける遺伝子多型の解析 イントロン A、 B、 Cにおいて遺伝子多型が存在するか否かを調べるために、 健 常人 23名のゲノム DNAを全血より抽出し （標準操作法） 、 これをそれぞれイン トロン A増幅用プライマ一 A 1、 A2、 イントロン B増幅用プライマー B 1、 B 2 、 イントロン C増幅用プライマ一 C 1、 C 2にて PC R増幅し、 各種制限酵素によ る切断パターンを比較した。 その結果、 イントロン Aにおいては、 制限酵素 Mb o I、 Taq l、 A f a Iによって遺伝子多型が観察されることを見出した。
逆に、 制限酵素 T s p 509 I、 A l u l、 N 1 allK Ms p l、 B s tU I、 B f a l、 H i nP I、 Ha eIII、 H i n dill, S s p l、 P s t l、 Ec oR I、 S a l I、 E c oRVによっては遺伝子多型は観察されなかった。
イントロン Bにおいては、 制限酵素 T s p 509 A l u N l aIIK Ms p l、 Bs tU I、 B f a I , H i nP I、 H a e IIL Mb o I , Af a l、 T a q l、 Ms e l、 C 1 a I , Ns i l、 Ec oT14 I、 Nde l、 Pml l、 A p aL I、 Aa t I I、 Ap a l、 Kpn l、 B sml、 H i ndIII、 S s p l、 E c o RVによって遺伝子多型は観察されなかった。
イントロン Cにおいては制限酵素 Mb o I、 Bs tU I、 Ms e l、 Fb a lに よって遺伝子多型が観察されることを見出した。 逆に、 制限酵素 A 1 u I、 N 1 al II、 Ms p I , B f a l、 H i nP I、 Ha ellK Af a l、 Taq l、 H i nd III、 S s p l、 Bg l II、 Ec oT14 I、 P v ull, Pvu l、 Ec oR I、 B amHI、 Ec oRV、 K p n Iによっては遺伝子多型は観察されなかった。
C 1—C 2のプライマーの組み合わせを用いて増幅したイントロン Cを含む DN Aフラグメントを Mb o Iまたは B s t U Iにより切断した場合、 Mb o Iによる 切断についての実験では、 電気泳動により 1. 3 Kbにバンドが現れる場合を遺伝 子型 MM、 1. 05 Kbにバンドが現れる場合を遺伝子型 mm、 1. 3Kbと 1. 05 Kbのバントが 2本一緒に現れる場合を遺伝子型 Mmと判定でき、 一方 B s t U Iの場合、 BBは 3. 4Kb、 bbは 2. 45Kbと 0. 95Kbであり、 Bb は 3本一緒に現れる。
イントロン Aの T a q Iおよびイントロン Cの Mb o I、 B s t'U Iによって 検出される遺伝子多型の電気泳動パターンを図 3に示す。 さらにイントロン Cに ついては一例の b b mm型の健常人のゲノムより P CRにより得られた DN Aフ ラグメントより bm型ハプロタイプの全塩基配列を決定した （配列番号 17) 。 イントロン Cの塩基配列の中で、 Bs t U Iおよび Mb o Iによって検出される 遺伝子多型部位を白抜きの矢印で示した。
BBmm型の BEの患者のゲノムを一例、 塩基配列決定をしたところ、 Bmハプ 口タイプの B s t U I遺伝子多型部位の塩基配列は CGCGが ACCGになって いるため B s t U Iによって切断されないことがわかった。
[実施例 3] ヒト気道トリプシン様酵素のィントロン遺伝子多型解析による疾患関 連体質の解析
統計学的解析に関しては、 統計解析ソフト S t a t V i ew4. 02 (Abacus Concepts社） を使用してカイ二乗検定により解析を行つた。 実施例 3一 1 遺伝子型分類による疾患関連体質の解析
実施例 2に開示されている遺伝子多型のうち、 イントロン Cにおける Mb o I、 B s t U Iによって検出される遺伝子多型について、 ヒト気道トリプシン様酵素の 関連する疾患を分類することが可能か否かを検討した。 対象として選んだ疾患は、 呼吸器疾患のびまん性汎細気管支炎 （DPB) 、 気管支拡張症 （BE) 、 肺気腫 ( PE) 、 気管支喘息 （BA) である。
健常人 106人、 びまん性汎細気管支炎 （DPB) 29人、 気管支拡張症 （BE ) 38人、 肺気腫 (PE) 22人、 気管支喘息 （BA) 32人を選び、 標準的操作 法に従い各人の遺伝子型を判定した。 制限酵素は、 Mb o Iおよび B s t U Iを用 いた。
各遺伝子型の出現人数および出現頻度、 各 a 1 l e i e型の出現数および出現 頻度は表 1および表 2のとおりであった。 表 1 B s t U I遺伝子型 出現人数 出現数 (allele)
BB Bo DO □ ST B L) ^ PT r r r
Normal i6 55 00 lUb Normal 87 1 0 L L o n O
DPB 8 1 L 9 y DPB 28 C o onU 0 o
BE 11 BE C
1 o 1 L 00 37 Q Q 7
10
PE 5 12 5 22 PE 11 L L
BA 2 12 18 32 BA 16 —48 64 出現頻度 （％) 出現頻度 （％)
BB Bb bb B b
Normal 15.1 51.9 33.0 Normal - 41.0 59.0
DPB 27.6 41.4 31.0 DPB .48.3 51.7
BE 28.9 39.5 31.6 BE 48.7 51.3
PE 22.7 54.5 22.7 PE 50.0 50.0
BA 6.3 37.5 56.3 BA 25.0 75.0 表 2 Mb o I遺伝子型 出現人数 (人） 出現数 (allele)
Figure imgf000014_0001
出現 （％) 出現頻度 (％)
Figure imgf000014_0002
表 1、 表 2より、 上記遺伝子型での判定で、 DPB、 BE、 ？£にぉぃて88型 の出現頻度が高い傾向を示していることがわかる。 すなわち、 この遺伝子型をもつ 個々人が DPB、 BE、 PEになりやすい体質であると判定しうることを示す。 さ らに DPB、 BE、 PEを慢性閉塞性疾患 （COPD) という分類で呼吸器 3疾患 患者群としてまとめると、 BB型の出現頻度が健常人と比較して統計学的に有意に 高いという結果を得た （カイ二乗 p値 =0. 04、 カイ二乗値 =4: 2) 。 観測度数 ： 3疾患，ΒΒ/NotBB 分割表分析統計量 3 , BB/Not BB
BB Not BB α I
欠測値数 63
Normal 16 90 106
自由度
呼吸器 3疾患 24 65 89
カイ 2乗値 4.182
40 155 195 カイ 2乗 p値 .0409
G2乗値 4.177 G2乗 p値 •0410 パーセント （行） ： 3疾患， BB/Not BB 分割表分祈係数 .145
BB Not BB 合計 .146
Normal 15 85 100
カイ 2乗値 （Yates補正） 3.489 呼吸器 3疾患 27 73 100
カイ 2乗 p値 （Yates補正） .0618
21 79 100
Fisherの直接法 p値 .0503 実施例 3-2 ハプロタイプ分類による疾患関連体質の解析
八プロタイプの出現頻度
健常人 106人、 びまん性汎細気管支炎 （DPB) 29人、 気管支拡張症 （BE ) 38人、 肺気腫 (PE) 22人、 気管支喘息 （BA) 32人における B s t U I
Mb o I遺伝子多型の両者の組み合わせによるハプロタイプの出現人数および出 現頻度を表に示す。 238人調べた結果、 Bb—MM bb—MM bb— Mmの 遺伝子型は一人も存在しなかったことから、 日本人には bMハプロタイプはほとん ど存在しないということを示唆している。
出現人数 （人）
BB-MM BB-Mra BB- mm Bb- MM Bb-Mm Bb-mra bb - MM bb - Mm bb - mm □ ΞΤ
Normal 10 6 0 0 34 21 0 0 35 106
DPB 3 2 3 0 5 7 0 0 9 29
BE 3 7 1 0 8 7 0 0 12 38
PE 3 0 2 0 6 6 0 0 5 22
BA 1 1 0 i 0 11 1 0 0 18 32
出現頻 I (%)
BB-MM BB-Mm BB- mm Bb-MM Bb-Mm Bb - mm bb-MM bb - Mm bb - mm A
□き oT
Normal 9.4 5.7 0.0 0.0 32.1 19.8 0.0 0.0 33.0 100¾
DPB 10.3 6.9 10.3 0.0 17.2 24.1 0.0 0.0 31.0 100%
BE 7.9 18.4 2.6 0.0 21. 1 18.4 0.0 0.0 31.6 薩
PE 13.6 0.0 9.1 0.0 27.3 27.3 0.0 0.0 22.7 画
BA 3.1 3.1 0.0 0.0 34.4 3.1 0.0 0.0 56.3 画 以下の解析に関しては、 日本人のヒト気道トリプシン様酵素遺伝子ハプロタイプ が BM Bm bmの 3種であることを前提に呼吸器疾患との関連を統計学的手法 (カイ二乗法） を用いて解析を進めた。 （以下の p値は、 出現数が 5以上の場合は カイ 2乗 p値、 出現数が 4以下のフレームを含む 2 X 2表の場合は Fisherの直接法 p値を示した。 ）
a 1 1 e 1 e分類 （ 1 )
日本人の 3種のハプロタイプについて各 a 1 1 e 1 eの出現頻度を調べたところ 、 COPDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) と健常人の間の出現頻 度に関して、 統計学的有意差をもって分布に偏りがあった （p = 0. 027) 。 特 に、 Bm a 1 1 e 1 eは健常人に比べて C〇 P Dに属する呼吸器 3疾患群 （DP B、 BE、 PE) における出現頻度が高かった。
疾患ごとにみても、 BE、 DPB、 PEにおける Bm a 1 1 e 1 eの出現率が 高かった。
逆に BAに関しては Bm a 1 1 e 1 eの出現頻度が低かった。 観測度数 ： 3疾患， allele 分割表分祈統計量 ： 3疾患, allele
Bm. BM b.m. 口 ΡΤ 欠測値数 107
Normal 27 60 125 ] 212 自由度 2 呼吸器 3疾患 41 46 91 178 カイ 2乗値 7.174
68 106 216 390 カイ 2乗 ρ値 .0277
G2乗値 7.164
.0278 パーセント （行） ： 3疾患， allele 分割表分析係数 .134
Bm. BM b.m. 口 αΤ Cramerの V値 .136
Normal
呼吸器 3疾患
Figure imgf000016_0001
100
合計 17 27 55 100 観測度数 - DPB. allele 分割表分析統計量 ： DPB,
Bm. BM b.m. 口 BT 欠測値数 227
Normal 27 60 125 212 自由度 2
DPB 15 13 30 58 カイ 2乗値 6.044
Q 42 73 155 270 カイ 2乗 p値 .0487
G2乗値 5.488
G 2乗 p値 .0643
パーセント （行） ：. DPB, allele 分割表分祈係数 .148
Bm. BM b.m. 口 oT Cramerの V値 .150
Normal 13 28 59 100
DPB 26 22 52 100
CJBT 16 27 57 100 分割表分祈統計量 BE, allele 観測度数 ： BE, allele
欠測値数 209
Figure imgf000017_0001
自由度 2
BE 16 21 39 76
カイ 2乗値 3.175
Normal 27 60 125 212
カイ 2乗 p値 .2044 口 aT 43 81 164 288
G2乗値 3.007 G2¾ ρίϋ .2224 分割表分析係数 .104 パーセン卜 （行) ： BE, allele
Cramerの V値 .105
Bm. BM b.m.
BE 21 28 51 100
Normal 13 28 59 100
口き + 15 28 57 100 観測度数 ： PE, allele
分割表分祈統計量 PE, allele
Bm. BM
欠測値数 241
PE 10 12 22 44
自由度
Normal 27 60 125 212
カイ 2乗値 3.040
"^き + 37 72 147 256
カイ 2乗 p値 .2187
G2乗値 2.765 バーセン卜 (行） ： PE, allele .2510
Bm. BM b.m. a o +T 分割表分析係数 .108
PE 23 27 50 100 Cramerの V値 .109
Normal 13 28 59 100
口 nT 14 28 57 100 観測度数 BA, allele 分割表分祈統計量 BA, allele
Bm. BM b.m. 口 nT 欠測値数 221
BA 2 14 48 64 自由度
Normal 27 60 125 212 カイ 2乗値 7.096
会 α + 29 74 173 276 カイ 2乗 p値 .0288
G2乗値 8.264
G2乗 p値 .0160
パ一'セント （行） ： BA, allele 分割表分析係数 .158
Bm. BM b.m. 合計 Cramerの V値 .160
BA' 3 22 75 100
Normal 13 28 59 100
き + 11 27 63 6 a 1 1 e 1 e分類 （2)
上記より Bm a 1 1 e 1 eが疾患と関わりが強いと思われるので、 特にこの型 に注目して Bm型の a 1 1 e 1 eの数と Bm以外の a 1 1 e 1 eの数とで疾患との 関連を解析した。
COPDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) でみると、 健常人と呼 吸器 3疾患患者群とを比べた場合、 呼吸器 3疾患患者群における Bm a 1 1 e 1 eの出現頻度は明らかに高く、 分布の偏りに関して統計学的有意差が認められた （ p = 0. 0002) 。 こうした比較により Bm型の a 1 1 e 1 eと COPDに属す る呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) の発症との関わりが示された。
疾患ごとにみても、 C〇PDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) は いずれも正常人に比し Bm型の出現頻度が高かった。 （BE ; p = 0. 012、 D PB ; p = 0. 0025、 PE； p = 0. 0052)
一方、 B Aにおいては Bm型の出現頻度が健常人と比べ有意に低かった。 （p = 0. 049)
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000018_0001
観測度数 ： DPB, Bm/NotBm 分割表分祈統計量 ： DPB, Bm/NotBm
Bm Not Bm a oT 欠測値数 227
Normal 27 185 212 自由度 1
DPB 17 41 58 カイ 2乗値 9.172
A 。き α + 1 44 22G 270 カイ 2乗 ρ値 .0025
G2乗値 8.202
G 2乗 ρ値 .0042 パーセント （行) ： DPB, Bm/NotBm 分割表分祈係数 .181
Bm Not Bm 口 oT フアイ .184
Normal 13 87 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 7.997
DPB 29 71 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .0047 口 16 84 100 Fisherの直接法 p値 .0045 観測度数 ： BE, Bm/NotBm 分割表分祈統計量 ： BE, Bm/NotBm
Bm Not Bm 。 a 1
BE 19 57 76
Normal 27 185 212
α αΓ 46 242 288 パーセント （行） ： BE, Bm/NotBm
Bm Not Bm a
BE 25 75 100
Normal 13 87 100
a 16 84 100
Figure imgf000019_0002
観測度数 ： PE, Bm/NotBm 分割表分析統計量 ： PE， Bm/NotBm
Bm Not Bm 欠測値数
PE 13 31 44 自由度
Normal 27 185 212 カイ 2乗値
合計 40 216 256 カイ 2乗 ρ値
G2乗値
G2乗 p値
バーセント （行） ： PE, Bm/NotBm 分割表分析係数
Bm Not Bm a フアイ '
ΡΕ 30 70 100 カイ 2乗値 （Yates補正）
Normal 13 87 100 カイ 2乗 p値 （丫 ates補正）
。 16 84 100 Fisherの直接法 p値
Figure imgf000019_0001
観測度数 ： BA, 8m/NotBm 分割表分祈統計量 ： BA, Bm/NotBm
Bm NotBm ca。 欠測値数 221
BA 2 62 64
自由度 1
Normal 27 185 212 カイ 2乗値 4.829
29 247 276 カイ 2乗 p値 .0280
G2乗値 6.035
G2乗 p値 .0140 パーセント （行） ： BA， Bm/NotBm 分割表分析係数 .131
Bm Not Bm フアイ .132
BA 3 97 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 3.861
Normal 13 87 100
カイ 2乗 p値 （Yates補正） .0494 αΤ 11 89 Fisherの直接法 p値 .0340 個体分類 （1)
a 1 1 e 1 e分類の解析結果から、 3ハプロタイプのうちとくに Bm型が呼吸器 疾患との関連が深いと考えられるので、 以下とくにこの型に注目して、 これをもた ない個体、 1個もつ個体 （ヘテロ） 、 2個もつ個体 （ホモ） とを分類し解析した。
CO PDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB BE PE) でみると、 健常人と呼 吸器 3疾患患者群とを比べた場合、 Bmに基づくハプロタイプ分類 Bm— 0 1 2の出現頻度に関して、 分布に有為差がみられた （p = 0. 0093)
疾患別にみると、 DP Bおよび P Eを発症した患者で分布の偏りに有為差がみら れ （DPB : p = 0. 0024 P E p = 0. 0069) 、 B Eでもその傾向が あった （p = 0. 089) 観測度数 ： 3疾患， Bm.
分割表分祈統計量 3疾患， Bm.
Bm - 0 ' Bm-1 Bm-2 a
欠測値数 63
Normal 79 27 0 106
自由度 2 呼吸器 3疾患 54 29 6 89
カイ 2乗値 9.360 口き+ 133 56 6 195
カイ 2乗 p値 .0093 G2乗値
G2乗 p値
パーセント （行） ： 3疾患， Bm. 分割表分析係数 .214
Bm-0 Bm-1 Bm-2
Cramerの V値 .219
Normal 75 25 0 100
呼吸器 3疾患 61 33 7 100
68 29 3 100 観測度数 ： DPB,Bm.
分割表分析統計量 DPB, Bm.
Bm-0 Bm-1 Bm-2
欠測値数 123
Normal 79 27 0 106
自由度
DPB 17 9 3 29
Aき + カイ 2乗値 12.040
96 36 3 135
カイ 2乗 p値 .0024 G2乗値
G2乗 p値
一セント （行） DPB, Bm.
分割表分祈係数 .286 Bm-0 Bm-1 Bm-2 口 PT
Cramerの V値
Normal .299
75 25 0 100
DPB 59 31 10 100
合計 71 27 2 100 観測度数 ： BE,Bm. 分割表分祈統計量 BE, Bm.
Bm-0 Bm-1 Bm - 2 a αΤ 欠測値数 114
BE 23 14 1 38 自由度
Normal 79 27 0 106 カイ 2乗値 4.834 + 102 41 1 144 カイ 2乗 ρ値 .0892
G2乗値
G 2乗 ρ値
パーセント （行） ： BE, Bm.
Bm - 0 分割表分析係数 .180
Bm-1 Bm-2
BE Cramerの V<直
61 37 3 100. .183
Normal 75 25 0 100
ΟαΓ 71 28 1 100
観測度数 ： PE,Bm.
Bm-0 Bm-1 Bm- 2 分割表分祈統計量 ： PE, Bm
PE 14 6 2 22 欠測値数 130
Normal 79 27 0 106 自由度 2
。 93 33 2 128 カイ 2乗値 9.957
カイ 2乗 p値 .0069
G2乗値
ーセン卜 （行） ： PE, Bm.
Bm-0 Bm-1 Bm •2 doT 分割表分祈係数 .269
ΡΕ 64 27 9 100 Cramerの V値 .279
Normal 75 25 0 100
al 73 26 2 100
個体分類 （2)
Bmハプロタイプを保有しているか否かで分析した （Bm— 0 v s Bm— 1 、 2) 。
COPDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) でみると、 健常人と比 ベた場合、 呼吸器 3疾患患者群における B mを保有している個体の出現頻度が高く 、 分布の偏りに関して有意差が認められた （p = 0. 039) 。 一方、 BAにおい ては逆に B mハプロタイプをもたなレ ^個体が多く、 健常人群と比較して分布に有為 な偏りが見られた （p = 0. 037) 。 観測度数 ： 3疾患， Bm-0/Bm1.2 分割表分析統計量 ： 3疾患， Bm-0/Bm1.2
Bm-0 Bm-1.2 口
Normal 79 27 106
呼吸器 3疾患 54 35 89
合計 133 62 195 f) ： 3疾患， Bm-0/Bml.
Bm-0 Bm-1.2 合計
Normal 75 25 100
呼吸器 3疾患 61 39 100
合計 68 32 100
Figure imgf000022_0001
観測度数 ： BA, Bm-0/Bm1.2 分割表分祈統計量 ： BA, Bm-O/Bml.2
Bm-0 Bm-1.2 aき。 +T 欠測値数 120
BA 30 2 32 自由度 1
Normal 79 27 106 カイ 2乗値 5.471
^.≡
口 n 1 109 29 138 カイ 2乗 p値 .0193
G2乗値 6.641
.0100 バーセント （行） BA, Bm-0/Bml .2 分割表分析係数 .195
Bm-0 Bm-1.2 αοΤ フアイ .199
BA 94 6 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 4.375
Normal 75 25 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .0365 合計 79 21 100 Fisherの直接法 p値 .0241 IS測度数 ： DPB, Bm-O/Bml .2 分割表分析統計量 ： DPB, Bm-0/Bm1.2
Bm-0 Bm-1.2 欠測値数 123
Normal 79 27 106 自由度 1
DPB 17 12 29 カイ 2乗値 2.805
、 96 39 135 カイ 2垂 値 .0940
2 値 2.674
G 2乗 p値 .1020 セン卜 （行） DPB, Bm-O/Bml.2 分割表分析係数 .143
Bm-0 Bm-1.2 口 s+
フ .144
Normal 75 25 100 カイ 2乗値 （丫 ates補正） 2.089
DPB 59 41 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .1484
71 29 100 Fisherの直接法 p値 .1086
IS測度数 BE. Bm-O/Bml.2 分割表分析統計量 ： BE, Bm-0/Bml .2
Bm-0 Bm-1.2 口 欠測値数 114
BE 23 15 38 自由度 1
Normal 79 27 106 カイ 2乗値 2.654
102 42 144 カイ 2乗 p値 .1033
G2乗値 2.564 2乗卩値 .1093 パーセン卜 （行） BE, Bm-O/Bml.2 分割表分析係数 .135
Bm-0 Bm-1.2 口 フアイ .136
BE 61 39 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 2.020
Normal 75 25 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .1552
71 29 100 Fisherの直接法 p値 .1444 観測度数 ： PE, Bm-0/Bml .2 分割表分析統計量 ： PE, Bm-O/Bml.2
Bm-0 Bm-1.2 α 欠測値数 130
PE 14 8 22 自由度 1
Normal 79 27 106 カイ 2乗値 1.088 f 93 35 128 カイ 2乗 p値 .2969
G2乗値 1.040
G2乗 p値 .3079 パーセント （行） PE, Bm-0/Bml .2 分割表分析係数 .092
Bm-0 Bm-1.2 合計 フアイ .092
PE 64 36 100 カイ 2乗値 （Yates補正） .609
Normal 75 25 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .4353 口 73 27 100 Fisherの直接法 p値 .3035 個体分類 （3)
さらに Bmハプロタイプをホモでもつ個体 （BBmm ; Bm— 2) とそうでない 個体 （Bm— 0、 1) で出現頻度を比較した （Bm—0、 1 v s Bm- 2) 。 CO PDに属する呼吸器 3疾患群 （DPB、 BE、 PE) でみると、 健常人と比べ た場合、 Bmハプロタイプをホモでもつ個体 (BBmm) とそうでない個体は出現 頻度に関して、 分布の偏りに統計学的有意差がみられ （p = 0. 021) 、 Bmホ モ型 （Bm— 2) の 6人は省、 COPDに属する呼吸器 3疾患 （DPB、 BE、 P E) のいずれかに罹患しており、 3人は DPB、 2人は PE、 1人は BEであった 。 健常人 106人中および BA32人中に Bmホモ型 （Bm— 2) は 1人もいなか つた。
疾患別にみると、 D P Bおよび P Eを発症した患者で分布の偏りに統計学的有意 差がみられた （DPB : p = 0. 0082、 PE ： p = 0. 029) 。 分割表分析統計量
観測度数 ： 3疾患， BmO.l/Bm-2 3疾患， Bm0.1/Bm-2 欠測値数
Bm-0.1 Bm-2 63
口 ST
自由度
Normal 106 0 106 1 カイ 2乗値
呼吸器 3疾患 83 6 89 7.373 カイ 2乗 p値
189 6 195 .0066
G2乗値 分割表分祈係数
パーセント （行） ： 3疾患， Bm0.1/Bm- .191
Bm-0.1 フアイ .194
Normal 100 0 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 5.295 呼吸器 3疾患 93 7 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正） .0214 口 厂 97 3 100 Fisherの直接法 p値 .0082 親測度数 ： DPB, Bm0.1/Bm-2 分割表分析統計量 ： DPB, Bm0.1/Bm-2
Bm-0.1 Bm-2 。。T 欠測値数
Normal 106 0 106 自由度
DPB 26 3 29 カイ 2乗値
き + 132 3 135 カイ 2乗 p値
G2乗値
G2乗 p値
ーセント （行） ： DPB, Bm0.1/Bm-2 分割表分析係数
Bm-0.1 Bm-2 合計 フアイ
Normal 100 0 100 カイ 2乗値 （丫 ates補正）
DPB 90 10 100 カイ 2乗 p値 （Yates補正）
口。T 98 2 100 Fisherの直接法 p値
Figure imgf000024_0001
観測度数 PE, BmO.l/Bm-2
Bm-0.1 Bm-2 a。 分割表分祈統計量 PE, BmO.l/Bm-2 欠測値数 130
PE 20 2 22
自由度 1
Normal 106 0 106
カイ 2乗値 9.789 a aj 126 2 128
カイ 2乗 p値 .0018 G2乗値
パーセント （行）
G2乗 p値.
Bm-0.1 Bm-2 ca
PE 91 9 100 分割表分析係数 .267
Normal 100 0 TOO フアイ .277 + 98 2 100 カイ 2乗値 （Yates補正） 4.771 カイ 2乗 p値 （丫 ates補正） .0289
Fisherの直接法 p値 .0284 分割表分析統計量 ： BE, BmO.T/Bm 観測度数 ： BE, BmO.l/Bm-2
欠測値数 114 Bm-0.1 Bm-2 。
自由度
BE 37 1 38
カイ 2乗値 809
Normal 106 0 106
カイ 2乗 p値 .0937
143 1 144
G2乗値
G 2乗 p値
パーセント （行） ： BE, BmO.l/Bm-2
分割表分祈係数 .138
Bm-0.1 Bm-2 。丁
フアイ 140
BE 97 3 100
カイ 2乗値 （Yates補正） 289
Normal 100 0 100
カイ 2乗 p値 （Yates補正） 5909 口 ol 99 1 100
Fisherの直接法 p値 2639 isS測度数 ： BA, Bm0.1/Bm-2
Bm-0.1 Bm-2 口
BA 32 0 32
Normal 106 0 106
α 138 0 138 パ一セン卜 （行） BA, BmO.l/Bm-2
Bm-0.1 Bm-2 合計
ΒΑ 100 0 100
Normal 100 0 100
き + 100 0 100 以上 ヒト気道トリプシン様酵素のイントロン遺伝子多型解析により、 B m型の ハプロタイプが何らかのメカニズムで呼吸器疾患における慢性気道炎症に関連して いることが示された。 さらにヒト気道トリプシン様酵素の疾患に対する関与が慢性 閉塞性疾患 ( C O P D) に属する D P B、 B E、 P Eの 3疾患と B Aでは異なるこ とも示された。
ただし、 ある遺伝子多型をもつ個体すべてがある疾患を発症するということでは ないので、 ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型はいわゆる遺伝病のような決定 的な発症因子ではなく、 易発症性因子とでもいえるものである。 すなわち、 B mハ プロタイプを保有する個体にさらに環境因子などが加わったとき B E、 P E、 D P Bなどの呼吸器疾患を発症しやすくなるのである。
これらの結果より、 ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型を用いることにより 、 ヒト気道トリプシン様酵素関連疾患の分類をすることができることが示された。 また、 このヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析方法は、 個々人におけるヒ ト気道トリプシン様酵素関連疾患の発病体質の予測や、 該疾患の治療に対する効果 や、 その予後の再発可能性の予測などに応用できる手段である。 産業上の利用可能性
本発明は、 ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析法により、 個々人の疾患 関連体質を判定する方法を提供する。 従ってこの解析によりヒト気道トリプシン様 酵素と関連する疾患が同定できれば、 そのヒト気道トリプシン様酵素のある遺伝子 型を有する個人がある疾患にかかりやすいことが推定できる。
すなわち疾患発病体質 （個人がある疾患に罹患しやすい体質を持っていること） を予測することにより、 上記個人の治療法に対する情報を早期に与えることが可能 となり、 早期診断、 早期治療に結びつく。 また、 治療後においてもその疾患が再発 する可能性を推定することができる。 すなわち治療の予後 （患者の治療後の治癒の 経過や再発の危険性） を予測することで、 医師は患者に対して十分な注意を払うこ とができ、 また適切な指導を行うことができる。
さらにヒト気道トリプシン様酵素が関与する病態において、 ヒト気道トリプシン様 酵素の遺伝子多型解析が投与する薬剤の効果判定や薬剤開発における投与薬剤の有効 な患者群を絞り込む手段となる可能性がある。
以上、 述べたように早期診断、 早期治療および適切な予防法の指導、 適切な投薬 、 治療後の適切なァフタ一フォローにより、 現在問題となっている多額の医療費を 削減することにつながる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒ ト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により、 個々人の特定の疾患が発 症しやすい体質、 または患者に対する治療の効果、 または治療の予後、 を予測する 方法。
2 . 遺伝子多型解析の方法が、 ひとつまたはそれ以上の塩基変異を検出することに より分類される遺伝子型の解析からなる、 請求の範囲第 1項に記載の方法。
3 . 遺伝子多型解析の方法が、 ひとつまたはそれ以上の塩基変異を検出することに より分類されるハプロタィプの解析からなる、 請求の範囲第 1項に記載の方法。
4 . 遺伝子多型解析の部位が、 イントロンである、 請求の範囲第 2項または第 3項 に記載の方法。
5 . 遺伝子多型解析の部位が、 次のいずれかの遺伝子断片である、 請求の範囲第 2 項または第 3項に記載の方法。
( a ) 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマーを用いて増幅されうるィント 口ン領域を含む遺伝子断片
( b ) 配列番号 9と配列番号 1 0に示されたプライマ一を用いて増幅されうるイン ト口ン領域を含む遺伝子断片
( c ) 配列番号 1 1と配列番号 1 2に示されたプライマーを用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
( d ) 配列番号 1 3と配列番号 1 4に示されたプライマーを用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
( e ) 配列番号 1 5と配列番号 1 6に示されたプライマーを用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
6 . 遺伝子多型解析の部位が、 配列番号 1 1と配列番号 1 2に示されたプライマー を用いて増幅されうる、 イントロン Cを含む遺伝子断片である、 請求の範囲第 2項 または第 3項に記載の方法。
7 . 遺伝子多型解析の部位が、 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマーを用 いて増幅されうる、 イントロン Aを含む遺伝子断片である、 請求の範囲第 2項また は第 3項に記載の方法。
8 . 遺伝子多型解析の部位が、 イントロン Cにおいては制限酵素 B s t U I 、 M b o I 、 M s e I、 または F b a Iによって認識される配列部分を含む遺伝子断片で ある、 請求の範囲第 6項に記載の方法。
9 . 遺伝子多型解析の部位が、 イントロン Aにおいては制限酵素 M b o I 、 T a q I、 または A f a Iによって認識される配列部分を含む遺伝子断片である、 請求の 範囲第 7項に記載の方法。
1 0 . 遺伝子多型解析の部位が、 配列番号 1 7に示される遺伝子多型部位のひとつ またはそれ以上の組合せである、 請求の範囲第 2項または第 3項に記載の方法。
1 1 . 遺伝子多型部位の解析方法が、 ひとつまたは 2つ以上の制限酵素切断により 判定される遺伝子型もしくはハプロタイプ分類によるものである、 請求の範囲第 5 項から第 1 0項のいずれかに記載の方法。
1 2 . 遺伝子多型部位の解析方法が、 イントロン Cにおいては制限酵素 B s t U I
、 M b o I 、 M s e I、 または F b a Iによって切断することにより判定される遺 伝子型もしくはハプロタイプ分類によるものである、 請求の範囲第 6項、 第 8項、 または第 1 0項に記載の方法。
1 3 . 遺伝子多型部位の解析方法が、 イントロン Aにおいては制限酵素 M b o I 、 T a q I、 または A f a Iによって切断することにより判定される方法である遺伝 子型もしくはハプロタイプ分類によるものである、 請求の範囲第 7項または第 9項 に記載の方法。
1 4 . ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析による特定の疾患の臨床診断で あって、 個々人の特定の疾患が発症しやすい体質、 または患者に対する治療の効果 、 または治療の予後、 を予測する方法。
1 5. 特定の疾患が呼吸器疾患である、 請求の範囲第 1項または第 1 4項に記載の 方法。
1 6. 特定の疾患が慢性閉塞性肺疾患である、 請求の範囲第 1 5項に記載の方法。
1 7. 特定の疾患が副鼻腔気管支症候群である、 請求の範囲第 1 5項に記載の方法。
1 8. 特定の疾患が肺気腫である、 請求の範囲第 1 5項に記載の方法。
1 9. 特定の疾患がびまん性汎細気管支炎である、 請求の範囲第 1 5項に記載の方 法。
20. 特定の疾患が気管支拡張症である、 請求の範囲第 1 5項に記載の方法。
2 1. ヒト気道トリプシン様酵素の遺伝子多型解析により粘液繊毛生体防御系の異 状の診断をする方法。
2 2. ヒト気道トリプシン様酵素のイントロンの塩基配列の一部もしくはすべてを 含む遺伝子断片。
23. 次のいずれかの遺伝子断片。
(a) 配列番号 7と配列番号 8に示されたプライマーを用いて増幅されうるイント 口ン領域を含む遺伝子断片
(b) 配列番号 9と配列番号 1 0に示されたプライマーを用いて増幅されうるイン ト口ン領域を含む遺伝子断片
(c) 配列番号 1 1と配列番号 1 2に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片 ( d ) 配列番号 1 3と配列番号 1 4に示されたプライマーを用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
( e ) 配列番号 1 5と配列番号 1 6に示されたプライマ一を用いて増幅されうるィ ントロン領域を含む遺伝子断片
2 4 . 配列番号 1ないし配列番号 6のいずれかに示された塩基配列からなるヒ ト気 道トリプシン様酵素のィントロンの遺伝子断片、 またはそれらの塩基配列によって 挟まれたィントロン領域を含む遺伝子断片。
2 5 . 配列番号 1ないし配列番号 6のいずれかに示された塩基配列からなるヒ ト気 道トリプシン様酵素のィントロンの遺伝子断片。
2 6 . 配列番号 1 7に示された塩基配列からなるヒ ト気道トリプシン様酵素ィント ロン Cの遺伝子断片。
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