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WO1999024069A1 - Medicaments preventifs et therapeutiques pour des affections pulmonaires diffuses - Google Patents

Medicaments preventifs et therapeutiques pour des affections pulmonaires diffuses Download PDF

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WO1999024069A1
WO1999024069A1 PCT/JP1998/005025 JP9805025W WO9924069A1 WO 1999024069 A1 WO1999024069 A1 WO 1999024069A1 JP 9805025 W JP9805025 W JP 9805025W WO 9924069 A1 WO9924069 A1 WO 9924069A1
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WO
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lung disease
fas
diffuse lung
diffuse
apoptosis
Prior art date
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PCT/JP1998/005025
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuyoshi Kuwano
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Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • Fas is a monoclonal antibody obtained by immunizing a mouse with human fibroblasts.
  • the Fas antibody (Yonehara S. et al., J. Ex. Med., 169, 1747 — 1756, 1989) and is a cell surface antigen that transmits apoptotic signals to cells.
  • the Fas gene is cloned by E. toto (It0h) N. et al.
  • Fas is a protein on the cell membrane of about 45 kD, and its amino acid sequence is transformed into a TNF receptor family. (Ce 11, 66, 233-243, 1991).
  • the mouse Fas gene has been cloned (Watanabe-Fukunaga), et al., J. Immunol., 148, 1247-1279, 1992). It was confirmed to be expressed in the thymus, liver, lung, heart, and ovary of mice.
  • Human Fas ligand is a polypeptide reported by Nagata et al. As a biomolecule that induces apoptosis in cells expressing Fas (Takahashi T. et al.). , I nternational I mmu nolo gy, Volume 6, 1 5 6 7—1 5 74, 1 994). Human Fas ligand is a type II glycoprotein belonging to the TNF family and having a molecular weight of about 40 kD, and is thought to form a trimer in vivo in the same manner as TNF (Tanaka ) M. et al., EMB ⁇ Journal, Vol. 14, Vol. 11, pp. 119-195, p.
  • Fas-mediated apoptosis is associated with various diseases and physiological phenomena.
  • Fas-mediated apoptosis may be involved in hepatocellular death and certain autoimmune diseases in viral fulminant hepatitis.
  • Diffuse pulmonary disease is a group of disorders including diffuse interstitial pneumonia / pulmonary fibrosis. Etiologically, they are broadly classified into those of unknown cause, those associated with collagen disease, and those of apparent cause. Unknown causes include idiopathic interstitial pneumonia. Interstitial pneumonia / pulmonary fibrosis is a disease in which lung inflammation leads to alveolar remodeling, fibrosis, which causes the lungs to shrink and harden, often with serious life-threatening consequences.
  • steroid administration is used as standard therapy as a symptomatic treatment, but side effects are also widely known, and drugs for which administration timing, amount, duration, etc. are problematic (Today's Therapeutic Guidelines 1997, supervised by Shigeaki Hinohara (H inohara S.), etc., idiopathic pulmonary fibrosis, Sonoko Nagai (Nagai S.), 300-3'01, 1 997 Year) .
  • the antitumor agent bleomycin is known to cause diffuse alveolar damage in the acute phase and interstitial pneumonia / pulmonary fibrosis in the chronic phase.
  • administration of bleomycin resulted in early inflammatory changes, a corresponding increase in fibroblasts and cell matrix, followed by an increase in collagen concentration, followed by fibrosis in the interstitium, pleura and fibrosis. It can be seen around the bronchi. For this reason, many studies have been conducted as a model of human interstitial pneumonia Z pulmonary fibrosis (Shinobu Sato (SatoS.), Respiration, 16: 70-75, 1997).
  • the present inventors have intensively studied the relationship between apoptosis and the disease in order to rescue patients with diffuse lung disease.However, to improve the disease state in a diffuse lung disease model with a substance that suppresses apoptosis, for example, We found that an anti-Fas angianist, which has the effect of suppressing apoptosis in a bleomycin-induced interstitial pneumonia model, improves histological pathology and bronchoalveolar findings. Completed the invention.
  • the present invention relates to the following prophylactic and therapeutic agents.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for diffuse lung disease containing a substance that suppresses apoptosis as an active ingredient.
  • Diffuse lung diseases targeted by the preventive and therapeutic agents of the present invention include various diseases It is. When classified by etiology, it is found in interstitial lung disease of unknown cause, collagen disease and diseases related to collagen disease-diffuse lung disease, drug-induced diffuse lung disease, neoplastic diffuse lung disease, pneumoconiosis And diffuse pulmonary diseases associated with pneumoconiosis, epithelioid cell granulomatous diffuse lung disease, infectious diffuse lung disease or diffuse lung disease due to other causes.
  • the present invention is applied to interstitial lung disease of unknown cause, collagen disease and diffuse lung disease found in collagen-related diseases, and drug-induced diffuse lung disease.
  • the agent of the present invention is used as a prophylactic agent when the disease is the cause of the disease, the disease can be prevented from becoming diffuse lung disease, or Deterioration can be prevented.
  • Acute idiopathic interstitial pneumonia of unknown cause chronic idiopathic interstitial pneumonia (idiopathic pulmonary fibrosis), lymphocytic interstitial pneumonia, isolated interstitial pneumonia, diffuse Hamartomatous pulmonary angiomyomatosis, Hermanski-Padrack syndrome, Histocytosis X, Alveolar proteinosis, Diffuse alveolar hemorrhage (hemotheroterosis) Alveolar microlithiasis, Eosinophil pneumonia (PIE syndrome) And BOOP (obstructive bronchiolitis-organized pneumonia).
  • Antibiotics antibacterials, nitrated hydantoin for drug-induced diffuse lung disease
  • Drugs sulfa drugs, antiarrhythmic drugs, anti-inflammatory drugs, gold preparations, penicillin derivatives, interferon, Sho-saiko-to, antitumor drugs, radiation or paraquat-induced diseases.
  • Neoplastic diffuse lung disease includes bronchiolar alveolar epithelial carcinoma, carcinomatous lymphangiosis, carcinomatous lung metastasis, malignant lymphoma, lymphogranulomatous disease, and positron sarcoma.
  • Pneumoconiosis and the related diffuse lung diseases of the pneumoconiosis include silicosis, asbestos lung, chronic berylliosis, dideichiosis, aluminum lung and superalloy lung.
  • Epithelioid cell granulomatous diffuse lung disease including hypersensitivity pneumonia and sarcoidosis.
  • Infectious diffuse lung disease includes bacterial pneumonia, viral pneumonia, Carini pneumonia, Chlamydia pneumonia, Mycoplasma pneumonia, miliary tuberculosis and fungal tuberculosis.
  • Other diffuse lung diseases include high altitude pulmonary edema, diffuse lung disease associated with HIV, and lung disease associated with HTLV-1 infection.
  • pulmonary diseases that diffusely spread to the lungs or exhibit diffuse lung shadows
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • inflammatory lung diseases substances that suppress apoptosis suppress the apoptosis that occurs in each disease, resulting in the prevention and treatment of the disease.
  • Fas angonist and the Fas-Fas ligand there are substances that inhibit the binding of the Fas angonist and the Fas-Fas ligand. They can either generate or transmit signals by Fas. It is not particularly limited as long as it blocks at a stage and suppresses the function or biological action of the Fas-Fas ligand system, particularly apoptosis, and suppresses the action, function or expression of Fas ligados or Fas. That interact with the Fs ligand extracellular domain or the Fas extracellular domain, those that inhibit the interaction of the Fas ligand with Fas, those that interact with the Fs intracellular domain and the intracellular factors that interact with it.
  • Fas-mediated apoptosis Fas derivative, anti-Fas antibody, anti-Fas ligand antibody, antisense oligonucleotide to Fas or Fas ligand gene or mRNA, Substances that interact with the intracellular region of Fa s or ICE inhibitors.
  • Fas and Fas ligand are preferably human-derived, and the anti-Fas antibody and anti-Fas ligand antibody are preferably anti-human Fas antibody and anti-human Fas ligand antibody, respectively.
  • it is a humanized anti-Fas ligand antibody.
  • the humanized anti-Fas ligand antibody preferably has a constant region and a framework region derived from human and a complementarity determining region derived from non-human.
  • Fas gonist used in the present invention is described in International Patent Application Publication No. WO 95/13293 and the like. Those which suppress apoptosis of Fas-expressing cells by an appropriate Atsay method are preferable. -'The references cited in the present specification are hereby incorporated by reference.
  • These antibodies are not particularly limited as long as they have a function of inhibiting the biological action of the F s -F a s ligand system, particularly the F a mediated apoptosis by binding to the F a s ligand or F a s.
  • the anti-Fas ligand antibody or anti-Fas antibody used in the present invention may be of any origin, type (monoclonal or polyclonal) and production method, but is preferably a mammalian-derived monoclonal antibody.
  • the animal species of the cells producing the monoclonal antibody used in the present invention is preferably a mammal, and may be derived from humans or non-human mammals.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal other than a human a rabbit antibody or a rodent-derived monoclonal antibody is preferable.
  • the rodent is not particularly limited, but a mouse, a rat, and a hummus are preferred. This is because monoclonal antibodies can be easily prepared using these animals.
  • the Monoclonal antibodies recognize antigens by ordinary immunological means such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), and immunofluorescence (Immunofluorescence Analysis). It is preferable to measure the apoptosis-suppressing activity of Fas-expressing cells by an appropriate Atsey method described in International Patent Application Publication No. WO 95/1 3293 or the like.
  • the anti-Fas ligand antibody and the anti-Fas antibody used in the present invention can be prepared, for example, by using the method described in International Patent Application Publication No.W095 / 1329. Can be manufactured.
  • a monoclonal antibody When a monoclonal antibody is used in the present invention, it may be prepared using a known technique.For example, a conventional immunization method using Fas or a Fas ligand or a partial peptide thereof as a sensitizing antigen may be used.
  • the target animal is immunized according to the method described above, the obtained immune cells are fused with known parent cells by a usual cell fusion method, and the monoclonal antibody-producing cells are screened by a usual screening method.
  • the sensitizing antigen is a human Fas ligand or a fragment thereof, Takanashi (Takahashi) T. 1 ⁇ 2, International Using the gene sequence of human Fas ligand disclosed in Immunolgy, Vol. 6, pp. 1567-574, 1994, the gene sequence was inserted into a known expression vector system, and After transforming the host cell, it is preferable to purify the desired Fas ligand protein from the host cell or from the culture supernatant, and use the purified Fas ligand protein as a sensitizing antigen.
  • Suitable methods can be used to immunize animals with the sensitizing antigen. After immunization in this manner and confirming that the level of the desired antibody in the serum increases, immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion. Preferred immune cells include splenocytes, in particular. No.
  • the monoclonal antibody used in the present invention produced in this manner is produced.
  • the hybridomas can be cultured according to a conventional method, and obtained from the culture supernatant, or the hybridomas can be transplanted into a mammal compatible with the hybridomas and grown.
  • a method of obtaining the ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the monoclonal antibody used in the present invention obtained by the above method may be purified to a high purity by using a known purification means such as a salting out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • a known purification means such as a salting out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to the method using a hybridoma, but can also be prepared using a method using antibody-producing cells immortalized by EBV or the like, or a method using genetic engineering. .
  • mouse monoclonal antibodies have drawbacks in the treatment of humans, in repeated therapeutic regimens.
  • mouse monoclonal antibodies have a relatively short circulating half-life and, when used in humans, lack the functional properties of other important immunoglobulins.
  • non-human monoclonal antibodies contain a peptide of a length that is substantially immunogenic when injected into a human patient. That is, many studies have shown that after injection of a foreign antibody, the patient may be immunized against the antibody. Responses can be very strong and have been shown to essentially eliminate the therapeutic benefit of antibodies after initial treatment. In the future, monoclonal antibodies with antigenicity to humans of various mice or other organisms will be developed, after the first or initial few treatments with any of the different non-human antibodies, followed by unrelated Even therapeutic treatments can be ineffective due to cross-reactivity or can themselves be dangerous substances.
  • a reshaped (reshaped) human antibody (humanized antibody) can be used in the present invention.
  • This is the substitution of the complementarity-determining regions (CDRs) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, with the complementarity-determining regions of a human antibody. That is, it is preferable that the constant region and the framework region are derived from human and the complementarity determining region is derived from non-human.
  • Preferred examples of the reshaped human antibody useful in the present invention include a mouse antibody F919-9-18 CDR disclosed in International Patent Application Publication No. WO 97/022990. Things.
  • one or more amino acids in the framework (FR) region of the variable region of the antibody may be substituted, deleted or added so that the complementarity-determining region of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site. Is also good.
  • Fa s derivatives having a deletion at the N-terminus of Fa s are also preferred.
  • FERM B P- Fa s derivative s hFa s (nd 29) — F c and s hFa s (nd) encoded by a plasmid (pMl 304 and pMl 3 17) contained in Escherichia coli, which has 5854 and accession number FERM BP-5855) 29) — hinge is a derivative containing a Fas extracellular region lacking the amino acids 1 to 29 at the N-terminus of known human Fas.
  • the shFas (nd29) -1Fc and shFas (nd29) -1 hinge have high activity and are suitable examples as active ingredients of the preventive / therapeutic agent for diffuse lung disease of the present invention.
  • Fas derivatives used in the present invention have an activity of binding to a Fas ligand or an activity of suppressing apoptosis via Fas by an appropriate Atsushi method.
  • the sequence of the antisense oligonucleotide to Fas or Fas ligand gene or mRNA used in the present invention is not limited as long as it suppresses the expression of Fas or Fas ligand.
  • Examples include antisense oligonucleotides of Fas ligand disclosed in Patent Application Publication No. WO 95/1 3293 (this specification is incorporated herein by reference).
  • the preventive / therapeutic agent for diffuse lung disease of the present invention can be used as a therapeutic agent for diffuse lung disease patients.
  • the preventive / therapeutic agent for diffuse lung disease of the present invention is characterized by containing the substance for suppressing the above-mentioned apoptosis, and comprises at least one pharmaceutical carrier or medium, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil , Mineral oil, higher alcohols, higher fatty acids or harmless organic solvents, etc., as required, excipients, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, anti-adsorption agents, stabilizers It can be in the form of a pharmaceutical composition kit by appropriately combining it with preservatives, antioxidants, buffers, tonicity agents, soothing agents, etc., orally, or intravenously, intracoronarily, subcutaneously It can be administered parenterally, intramuscularly, transdermally, by inhalation, rectally, or topically.
  • a pharmaceutical carrier or medium for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil , Mineral oil, higher alcohols, higher fatty acids
  • it can be administered parenterally, systemically or locally, rapidly or continuously.
  • the dosage for humans varies depending on the patient's condition, age, or administration method. It is necessary to select an appropriate amount. For example, in the case of systemic administration, it is possible to select an appropriate fractionation volume in the range of about 0.01 to 10 Omg ZKg.
  • the use of the agent for preventing and treating diffuse lung disease of the present invention is not limited to these administration methods and dosages.
  • a combination of multiple apoptosis-regulating substances, Fas antagonists, substances that inhibit the binding of Fas-Fas ligand, anti-Fas ligand antibodies or humanized anti-Fas ligand antibodies May be used in combination with other drugs.
  • injectable preparations include purified substances that inhibit apoptosis,
  • the substance that suppresses apoptosis used in the preventive and therapeutic agent for diffuse lung disease of the present invention is used in a diffuse lung disease model (particularly, a bleomycin-induced lung fibrosis / interstitial lung disease model as described in Examples). It shows the effect of suppressing tissue damage. Furthermore, in the examples, experiments were performed using a mouse model. Therefore, an anti-mouse Fas ligand antibody was used to demonstrate the inhibitory effect on organ and tissue damage using an anti-mouse Fas ligand antibody. The same effect as in the example can be expected by the human Fas ligand antibody.
  • the agent for preventing or treating diffuse lung disease of the present invention has no toxicity and can be used safely as shown in the examples. That is, the preventive and therapeutic agent for diffuse lung disease of the present invention is expected to have a preventive, therapeutic or ameliorating effect on diffuse lung disease.
  • the body weight was measured once every two days from the day of administration. On the 14th day from the start of administration, blood was collected from the fundus vein and the blood cell count was measured. Then, plasma was prepared, and GOT, GPT and creatinine were measured. After the blood collection was completed, necropsy was performed, and changes in major organs (lung, heart, liver, kidney, spleen and intestine) were visually examined. Measurement of blood cell count The measurement was performed using a dynamic blood cell analyzer K-2000 (Sysmex). G ⁇ T, GPT and creatinine were measured using an auto analyzer COBASFARA (Roche).
  • mice Male, 6-week-old, ICR mice (manufactured by Kudo Co., Ltd.) were used for the experiment. After weight measurement, pentobarbital (manufactured by Dynabot) was administered intraperitoneally and anesthetized. A bleomycin hydrochloride (Nippon Kayaku) solution (50 id 1) dissolved in physiological saline to a concentration of 4 mg / kg was administered to the lungs.
  • shFas (nd29)-Fc was administered by the method shown below. Intravenous administration of shF as (nd 29) —F c was administered at a dose of 50 gZ mice 7 or 10 days after bleomycin administration.
  • s hFa s (nd 29) Inhalation of F c into the lungs is performed by placing 50 ml of 50 gZm 1 of shF as (nd 29) -F c solution in an Ultrasonic nebulizer (OMRON). 30 minutes after 2, 4, 6, and 8 days or 2, 4, 6, 8, 10, and 12 days after administration of bleomycin Inhalation was performed. Mice that received only bleomycin and no shFas (nd29) — Fc were used as control groups. '
  • Inflammation site inflammatory cell infiltration site
  • fibrosis site inflammatory cell infiltration site
  • Inflammation site inflammatory cell infiltration site
  • fibrosis site inflammatory cell infiltration site
  • Inflammation site inflammatory cell infiltration site
  • fibrosis site inflammatory cell infiltration site
  • Table 2 B Histological evaluation on day 14 of administration Histological group of inflammation and fibrosis Score Confirmed the existence of individuals Number of individuals Number (%) Mean soil SD control I 0 I 0 0 I.7 3 earth
  • mice Fourteen days after the administration of bleomycin, mice were anesthetized by intraperitoneal administration of pentobarbital. After exposing the lungs and inserting a tracheal tube, bronchoalveolar lavage was performed using 5 ml of room temperature physiological saline through a tube that had been subjected to force modulation. The collected washing liquid was passed through a metal mesh to remove mucus. Cells in the alveolar lavage fluid were measured using a hemocytometer. The number of macrophages, lymphocytes, neutrophils, and eosinophils was determined by measuring the proportion of each cell in the 100 cells stained using Diff-Quik (Baxter Diagnosis). It was calculated by multiplying the total cell number in bronchoalveolar lavage fluid.
  • shFas (nd 29) -Fc-treated group showed all or some of the total cell number, macrophage, Fewer.
  • the shFas (n d 29) -Fc administration group had a smaller amount of hydroxyproline in the lung tissue than the control group. Since hydroxyprolin is an amino acid peculiar to collagen, which is an indicator of fibrosis, the shFas (nd 29) -Fc administration group has a lower amount of collagen in lung tissue than the control group, and shFas (nd 29) A fibrosis-suppressing effect was observed in one Fc.
  • Mouse Fas ligand extracellular domain and mouse CD40 ligand extracellular domain derived from mouse Fas ligand WX2 (J. Immunolgy, 157, 3918-3924, 1996) using genetic engineering techniques
  • the gene encoding the chimeric protein fused with the transmembrane domain and a part of the extracellular domain (78 amino acids from the N-terminus) was transformed into a human cell-longation factor-1 (EF) promoter (Mizushima- Nagata), Nuclear Acids Reseach (18, 5322, 1990).
  • EF human cell-longation factor-1
  • Hypridoma FLIM58 was cultured in a serum-free medium, Hy bridoma—SFM (GI BCO BRL), and the culture supernatant was purified using a protein-A column (PROSEP—A, Bioprocessing). Obtained. The protein concentration was calculated from the absorbance at 280 nm.
  • Body weight gain, hematology (red blood cells, white blood cells, platelets), and blood biochemistry (GOT, GPT, urea nitrogen) after administration of the FLIM 58-administered anti-mouse As ligand antibody compared to the control group No difference was observed. No abnormalities were observed in the group treated with the anti-mouse Fas ligand antibody FLIM58, even by visual necropsy findings.

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Description

びまん性肺疾患予防 ·治療剤 技術分野
本発明はアポト一シスを抑制する物質を有効成分として含有することを特徴と するびまん性肺疾患の予防 ·治療剤に関する。 背景技術
F a sは、 ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られるモノクロ一ナル抗体で ある F a s抗体 （ヨネハラ （Yo n e h a r a) S. 等、 J. E x . Me d. , 1 69巻、 1 747— 1 756頁、 1 98 9年） によって認識され、 アポトーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原である。 ィ トウ ( I t 0 h) N. 等によって、 F a s遺伝子がクロ一ニングされ、 F a s が約 4 5 kDの細胞膜上の蛋白質であり、 そのァミノ酸配列から TNFレセ プ夕一ファミリ一に属することが判明した （Ce 1 1， 66巻、 233— 243 頁、 1 9 9 1年） 。 また、 マウス F a s遺伝子もクロ一ニングされ （ワタナベ— フクナガ CWa t a n a b e— F u k u n a g a) 等、 J. Immun o l . ， 1 48巻、 1 274— 1 279頁、 1 9 92年） 、 F a s mRNAが、 マウス の胸腺、 肝、 肺、 心臓、 卵巣で発現していることが確認された。
ヒ ト F a s リガン ドは、 F a sを発現する細胞に対してアポトーシスを 誘導する生体内分子として、 長田 （Na g a t a) 等により報告されたポリ ぺプチドである （タカハシ （Ta k a h a s h i ) T. 等、 I n t e r n a t i o n a l I mmu n o l o gy、 6巻、 1 5 6 7— 1 5 74頁、 1 9 9 4年） 。 ヒ ト F a s リガン ドは、 TNFフア ミ リーに属する分子量 約 40 kDの II型糖蛋白質で、 TNFと同様に、 生体内で 3量体を形成すると考 えられている （夕ナカ （Ta n a k a) M. 等、 EMB〇 J ou r n a l, 1 4巻、 1 1 2 9— 1 1 3 5頁、 1 9 9 5年） 。 また、 ヒ ト F a s リガンド はラッ ト F a s リガンド （スダ （ S u d a ) T. 等、 C e 1 1 , 7 5巻、 1 1 6 9 - 1 1 7 8頁、 1 9 9 3年） やマウス F a s リガン ド （タカハシ (Ta k a h a s h i ) T. 等、 C e l l , 7 6巻、 9 6 9— 9 7 6頁、 1 9 94年） と細胞外領域において高いホモロジ一を有しており、 ヒト Fa sリ ガンドはヒト F a sのみでなくマウス F a sをも認識し、 アポトーシスを誘導す ることができる。 逆に、 ラッ ト Fa sリガンド及びマウス Fa sリガンドも、 ヒ ト F a sを認識してアポト一シスを誘導することができる。
また、 F a sを介するアポト一シスの細胞内シグナル伝達機序に関しても 研究が進んでおり、 F a sの細胞内領域、 特にデスドメイン （D e a t h d oma i n) と呼ばれる領域と相互作用してシグナルを伝達または抑制する因 子の同定及びクローニングが報告されている他、 インターロイキン— 1変換酵素 ( I CE) 関連チオールプロテア一ゼが F a sを介するアポト一シスのシグナル 伝達に寄与している可能性が示唆されている。
近年、 アポト一シス、 特に F a sを介するアポト一シスと種々の疾患及び生理 現象との関連が示唆されている。 たとえば、 ウィルス性劇症肝炎における肝細胞 死及びある種の自己免疫疾患等において、 Fa sを介するアポト一シスの異常が 関与する可能性が示唆されている。
また、 F a s— F a sリガンド系はアポトーシス以外の機能、 たとえば、 好中 球に作用して起炎症性に働く作用等も担っている可能性が示唆されている
(力ャガキ CKa y a g a k i ) N. 等、 臨床免疫 28巻、 6 67'— 675 頁、 1 9 9 6年） 。
びまん性肺疾患はびまん性に病変が拡がる間質性肺炎/肺線維症をはじめとす る疾患群である。 病因的にみると、 原因不明のもの、 膠原病に伴うもの、 及び原 因の明らかなものに大別される。 原因不明のものには特発性間質性肺炎などがあ る。 間質性肺炎/肺線維症は肺の炎症から肺胞構造の改築に至り、 線維化し、 そ のために肺が縮小、 硬化し、 生命に重大な結果をもたらすことが多い疾患 である。
肺の線維化の原因はいまだ明らかではないが、 免疫複合体により肺胞 マクロファージが活性化し、 それに伴い好中球が集積、 活性化し、 細胞障害性の オキシダント、 プロテアーゼおよびミエ口ペルォキシダ一ゼを分泌し、 肺実質を 破壊する。 また、 活性化肺胞マクロファ一ジはフイブロネクチン、 成長因子を分 泌して線維芽細胞を刺激し、 結果 I型コラーゲンの分泌、 沈着が高まり肺の線維 化が進むと考えられている （ェ藤翔二 （Ku d 0 u S.)、 内科、 7 7巻、 5 9 4— 5 9 5頁、 1 9 9 6年、 呼吸器病学、 太田保世 （00 t a Y.) 等編、 本間行彦 （H o nma Y.)等著、 4 8 - 6 3頁、 1 9 9 0年、 中 外医学社、 カンテイ ン （C a n t i n) A. 等、 I n t . A r c h s A l l e r gy a p p 1. Immu n. 、 7 6巻、 s u p p 1. 1、 8 3 - 9 1頁、 1 985年） 。
現在のところ、 対症療法としては、 ステロイド薬投与が標準療法として用いら れているが、 副作用も広く知られており、 投与時期、 量、 期間等が問題となる薬 物である （今日の治療指針 1 9 9 7、 日野原重明 （H i n o h a r a S.) 等監修、 特発性肺線維症、 長井苑子 （N a g a i S .)著、 300 - 3' 0 1頁、 1 997年） 。
抗腫瘍剤ブレオマイシンは、 副作用として急性期にはびまん性肺胞障害を、 慢 性期には間質性肺炎/肺線維症を起こすことが知られている。 動物実験において もブレオマイシンの投与により、 早期に炎症性変化、 それに呼応した線維芽細胞 及び細胞マトリックスの増加、 引き続いて、 コラーゲン濃度の増加が見られ、 次 第に線維化が間質、 胸膜及び細気管支周囲にまで認められるようになる。 このた め、 ヒト間質性肺炎 Z肺線維症のモデルとして多くの研究がされている （佐藤忍 (S a t o S.), 呼吸、 1 6巻、 70— 75頁、 1 9 97年） 。
発明者らは、 マウス肺にブレオマイシンを吸入させると、 気管支及び肺胞上皮 細胞にアポトーシスが起こること、 及び肺胞上皮細胞に Fa s、 及び浸潤 T細胞 に Fa sリガンドの発現が認められることを報告している （Am. J. R e s p i r. C e l l . Mo 1. B i o l. 1 6巻、 9 1一 1 0 1頁、 1 997年） 。 また、 発明者らは特発性間質性肺炎若しくは膠原病に伴う肺線維症において、 気 管支上皮及び肺胞上皮にアポト一シスが認められること、 気管支上皮及び肺胞上 皮に F a sの発現が確認されること、 及び気管支肺胞洗浄液に回収された細胞中 に Fa sリガンドの発現が確認されることを報告した （第 1 7回日本炎症学会 プログラム予稿集、 1 30頁、 演題番号 1 6、 1 9 9 6年） 。
しかしながら、 上記びまん性肺疾患の病態に F a s、 F a sリガンドを介した アポトーシスが、 直接若しくは間接的に関与しているかどうかは依然として不明 であり、 アポト一シスを抑制することによるびまん性肺疾患の予防剤 ·治療剤は 知られていない。 発明の開示
本発明の課題は、 アポトーシスを抑制するという新規な作用機序による びまん性肺疾患の予防■治療剤を提供することである。 より詳しくは、 本発明は アポトーシスを抑制する物質を有効成分とするびまん性肺疾患の予防 ·治療剤及 び治療方法を提供しょうとする。
本発明者らは、 びまん性肺疾患患者を救うべく、 アポトーシスと当該疾患の関 連性を鋭意研究してきたが、 アポトーシスを抑制する物質によりびまん性肺疾患 モデルにおいて病態を改善すること、 例えば、 ブレオマイシン誘発間質性肺 炎モデルにおいてアポト一シスを抑制する作用を有する抗 F a sアン夕ゴニスト により、 組織学的に病態が改善されること及び気管支肺胞所見が改善されること を見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 下記の予防 ·治療剤に関するものである。
( 1 ) アポトーシスを抑制する物質を有効成分とするびまん性肺疾患の予防，治 療剤。
(2) 前記アポトーシスを抑制する物質が Fa sアン夕ゴニストである （1) に 記載の予防 ·治療剤。
(3) 前記アポト一シスを抑制する物質が Fa s -Fa sリガンドの結合を抑制 する物質である （ 1) に記載の予防 ·治療剤。
(4) 前記アポト一シスを抑制する物質が Fa s誘導体である （ 1) に記載の予 防 ·治療剤。 (5) 前記アポトーシスを抑制する物質が抗 Fa sリガンド抗体である （1 ) に 記載の予防 ·治療剤。 '
(6) 前記アポトーシスを抑制する物質がヒ ト化抗 F a s リガン ド抗体で ある （1 ) に記載の予防，治療剤。
(7) 前記びまん性肺疾患が原因不明の間質性肺疾患、 膠原病及び膠原病の関連 疾患にみられるびまん性肺疾患、 薬剤誘起性びまん性肺疾患、 腫瘍性びまん性肺 疾患、 じん肺及びじん肺の関連するびまん性肺疾患、 類上皮細胞肉芽腫性 のびまん性肺疾患、 感染性のびまん性肺疾患、 およびその他の原因による びまん性肺疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つであることを特徴 とする （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
(8) 前記びまん性肺疾患が原因不明の間質性肺疾患であることを特徴と する （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
( 9 ) 前記びまん性肺疾患が膠原病及び膠原病の関連疾患にみられるびまん性肺 疾患であることを特徴とする （ 1) 〜 （6) のいずれかに記載の予防，治療剤。 (1 0) 前記びまん性肺疾患が薬剤誘起性びまん性肺疾患にみられるびまん性肺 疾患であることを特徴とする （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
(1 1) アポト一シスを抑制する物質を投与することからなるびまん性肺疾患の 予防 ·治療方法。 発明を実施するための最良の形態
以下にさらに詳細に本発明を説明する。
本発明の予防■治療剤の対象となるびまん性肺疾患には種々の疾患が含ま れる。 病因別に分類すると、 原因不明の間質性肺疾患、 膠原病及び膠原病の関連 疾患に見られ-るびまん性肺疾患、 薬剤誘起性びまん性肺疾患、 腫瘍性び'まん性肺 疾患、 じん肺及びじん肺の関連するびまん性肺疾患、 類上皮細胞肉芽腫性の びまん性肺疾患、 感染性のびまん性肺疾患若しくはその他の原因によるびまん性 肺疾患に大別される。 好ましくは、 原因不明の間質性肺疾患、 膠原病及び膠原病 の関連疾患に見られるびまん性肺疾患、 薬剤誘起性びまん性肺疾患に適用 される。
なお、 原因や因果関係が予測されるびまん性肺疾患の場合は、 その原因となる 疾病である時に予防剤として本発明の剤を用いればびまん性肺疾患になることを 予防し、 または病状の悪化を防ぐことができる。
原因不明の間質性肺疾患には急性特発性間質性肺炎、 慢性特発性間質性 肺炎 （特発性肺線維症） 、 リンパ球性間質性肺炎、 剝離性間質性肺炎、 びまん性 過誤腫性肺脈管筋腫症、 ヘルマンスキ一ーパドラック症候群、 ヒスチォサイ トーシス一 X、 肺胞タンパク症、 びまん性肺胞出血 （へモジテロ一シス） 肺胞微 石症、 好酸球肺炎 （P I E症候群） 及び B O O P (閉塞性細気管支炎 -器質化肺 炎） が含まれる。
膠原病及び膠原病の関連疾患に見られるびまん性肺疾患には全身性強皮症、 慢 性関節リウマチ、 皮膚筋炎、 多発性筋炎、 全身性エリテマトーデス、 多発性結節 性動脈炎、 混合性結合組織病、 シ ーグレン症候群、 ベーチニッ ト病、 強直性脊 椎炎、 ゥヱグナー肉芽腫症若しくはチュルグ—ストラウス症候群に起因する疾患 が含まれる。
薬剤誘起性びまん性肺疾患には抗生物質、 抗菌薬、 ニトロ化ヒダントイン 製剤、 サルファ剤、 抗不整脈薬、 消炎剤、 金製剤、 ペニシリン誘導体、 インター フ ロン、 小柴胡湯、 抗腫瘍薬、 放射線若しくはパラコートに誘発される疾患が 含まれる。
腫瘍性びまん性肺疾患には細気管支肺胞上皮癌、 癌性リンパ管症、 癌血行性肺 転移、 悪性リンパ腫、 リンパ性肉芽腫症および力ポジ肉腫が含まれる。
じん肺及びじん肺の関連するびまん性肺疾患には珪肺症、 アスベスト肺、 慢性 ベリ リウム症、 ジデ口一シス、 アルミニウム肺及び超合金肺が含まれる。
類上皮細胞肉芽腫性のびまん性肺疾患 (こは過敏性肺炎及びサルコイドーシスが 含まれる。
感染性のびまん性肺疾患には細菌性肺炎、 ウィルス性肺炎、 カリニ肺炎、 クラミジァ肺炎、 マイコプラズマ肺炎、 粟粒結核及び真菌性結核が含まれる。 その他のびまん性肺疾患には高地肺水腫、 H I Vに合併するびまん性肺病変及 び H T L V— 1感染に合併する肺病変が含まれる。
これらの他にもびまん性に肺に病変が拡がる、 またはびまん性肺陰影を呈する 肺疾患、 成人呼吸促迫症候群 （A R D S ) および炎症性肺疾患等も含まれる。 これらの疾患において、 アポト一シスを抑制する物質が各疾患で起こっている アポトーシスを抑制し、 疾患の予防 ·治療効果をもたらす。
なお、 治療対象としてはヒトが重要であるが、 ヒト以外の哺乳類も含みうる。 本発明で使用されるアポトーシスを抑制する物質とは、 アポトーシスを抑制若 しくは阻害するものであれば特に限定されない。
具体的には F a sアン夕ゴニスト及び F a s - F a s リガンドの結合を抑制す る物質がある。 これらは、 F a sによるシグナルの発生または伝達をいずれかの 段階で遮断し、 F a s - F a s リガン ド系の機能若しくは生物作用、 特に アポトーシスを抑制するものであれば、 特に限定されず、 F a sリガソド若しく は F a sの作用、 機能若しくは発現を抑制するもの、 F a sリガンド細胞外領域 若しくは F a s細胞外領域と相互作用するもの、 F a sリガンドと F a sの相互 作用を抑制するもの、 Fa s細胞内領域とそれと相互作用する細胞内因子との相 互作用に影響するもの、 若しくは F a sを介するアポトーシスのシグナル伝達に 関する細胞内因子 （例えば I CE様プロテア一ゼ） の活性を抑制するもの等のさ まざまな作用機序を有するものが含まれる。 また、 タンパク質性の高分子物質及 び低分子の化合物のいずれもが含まれる。
より具体的には、 Fa sを介するアポトーシスを抑制する活性を有する、 Fa s誘導体、 抗 F a s抗体、 抗 F a sリガンド抗体、 F a s若しくは F a sリガン ドの遺伝子若しくは mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 Fa s の細胞内領域と相互作用する物質若しくは I CE阻害剤が挙げられる。
ここで、 本発明で用いるアポト一シスを抑制する物質としては、 Fa sを介す るアポトーシスを抑制する作用を有する、 Fa s誘導体、 抗 Fa s抗体、 又は抗 F a s リガンド抗体が好ましい。 さらに、 F a s及び F a s リガンドはヒ ト 由来のものが好ましく、 抗 F a s抗体及び抗 F a s リガンド抗体はそれぞれ 抗ヒト F a s抗体及び抗ヒト F a sリガンド抗体が好ましく、 抗 F a sリガンド 抗体は、 ヒト化抗 F a s リガンド抗体であるのが好ましい。 ヒ ト化抗 F a s リガンド抗体とは、 定常領域と、 フレームワーク領域がヒト由来で、 相補性決定 領域が非ヒト由来であるのが好ましい。 また、 本発明で用いる F a sアン夕 ゴニストは、 国際特許出願公開番号 WO 95/ 1 3293などに記載されている 適当なアツセィ法において F a s発現細胞のアポト一シスを抑制するものが好ま しい。 - ' なお、 本明細書において引用する上記文献はこれらをもつて本明細書の一部と 成す。
なお、 本発明で用いられる抗体はポリクロ一ナル抗体であってもモノクローナ ル抗体であってもよく、 また、 本発明に使用される抗体の分子種は特に限定され ない。 通常の形態の抗体分子であってもよいし、 さらには抗原に結合し、 Fa s を介するアポト一シスを阻害するかぎり抗体の断片、 例えば、 F a b、 F (ab')2、 Fv、 又は H鎖と L鎖の F vを一本鎖となるよう適当なリンカ一 で連結させたシングルチェイン F V (s c F v) も使用することができる。 また、 いずれのクラス、 サブクラス及びイソタイプに分類される免疫グロブリン であってもよい。 これら抗体は F a s リガンド又は F a sと結合することに より、 F a s— F a s リガンド系の生物作用、 特に、 F a sを介するアポ トーシスを阻害する機能を有するものであれば特に限定されない。
本発明で使用される抗 F a sリガンド抗体又は抗 F a s抗体はその由来、 種類 (モノ クローナル、 ポリクロ一ナル） 及び製法を問わないが、 哺乳動物由来 のモノクローナル抗体が好ましい。 また、 本発明に用いるモノクローナル抗体の 産生細胞の動物種は哺乳類が好ましく、 ヒト由来またはヒト以外の哺乳動物由来 であってよい。 ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、 ゥサギ あるいはげつ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。 げっ歯類としては、 特 に制限されないが、 マウス、 ラッ ト及びハ厶ス夕一などが好ましく例示される。 これらの動物を用いるとモノクローナル抗体作製が簡便だからである。 また、 該 モノクローナル抗体としては、 放射免疫測定法 （R I A) 、 酵素免疫測定法 (E I A, EL I S A) 、 蛍光抗体法（Imm un o f l u o r e s c e n c e An a l y s i s) 等の通常の免疫学的手段により抗原を認識し、 また、 国際特 許出願公開番号 W〇 95/1 3293などに記載されている適当なアツセィ法に より Fa sを発現する細胞のアポトーシスに対する抑制活性が測定されるものが 好ましい。
これらのうちでも特に、 平成 7年 6月 2 2日付で日本国茨城県つくば巿 東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し （受託番号 P— 1 5002 ) 、 さらに平成 8年 5月 9日付で原寄託から国際寄託に移管した (受託番号 FERM BP— 5535 ) ハイプリ ドーマ F 9 1 9— 9— 1 8によ り産生されるマウス F 9 1 9— 9— 1 8抗体が好ましい例である。
本発明で用いる抗 F a s リガンド抗体及び抗 F a s抗体は、 例えば、 国際 特許出願公開番号 W09 5 / 1 3 2 9 3. 国際特許出願公開番号 W09 5/ 02290等に記載されている方法を用いて作製することができる。
本発明においてモノクローナル抗体を用いる場合は、 公知技術を使用して作製 してもよく、 例えば、 F a sもしくは F a sリガンド又はそれらの部分べプチド 等を感作抗原として使用して、 通常の免疫方法にしたがって対象動物を免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常の スクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ一ニングする ことによって作製できる。
より具体的には、 感作抗原が、 ヒ ト F a s リガンド又はその断片の場合、 タカノヽシ (T a k a h a s h i ) T. ½、 I n t e r n a t i o n a l Immun o l ogy、 6巻、 1 567— 1 574頁、 1 9 94年に開示された ヒト Fa sリガンドの遺伝子配列を用い、 該遺伝子配列を公知の発現べ 'クタ一系 に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清中から目的の F a s リガンドタンパク質を精製し、 この精製 F a s リガンドタンパク質を感作抗原として用いるのが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 ゥサギ等が使用できる。
感作抗原で動物を免疫するには、 公知の方法を用いることができる。 このよう に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物か ら免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付されるが、 好ましい免疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 特に限定されないが、 哺乳動物、 特にマウス等の公知の種々のミエローマ細胞株、 例えば、 P 3 ( P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 ) (J. I mmn o l . 1 2 3 : 1 5 4 8， 1 978 ) 等が好適に使用される。 前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合 は基本的には公知の方法、 たとえば、 ミルスティン （Mi 1 s t e i n) 等の方 法 （Me t h o d s En z ymo 1. 73 ： 3 - 4 6, 1 98 1 ) 等に準じて 行うことができる。
次いで、 公知の方法により、 目的とする本発明で用いる抗体を産生するハイブ リ ドーマのスクリ一ニング及び単一クローン化が行われる。
このようにして作製される、 本発明で用いるモノクロ一ナル抗体を産生す るハイブリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリ ドーマ を通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清から得る方法、 あるいは イブリ ドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、 その腹水から得る方 法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
さらに、 前記の方法により得られる本発明に用いるモノクローナル抗体は、 塩 析法、 ゲル濾過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法等の公知の精製手段を 利用して高純度に精製してもよい。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマを用いる方法に限 られず、 E B V等によって不死化した抗体産生細胞を用いる方法、 遺伝子工学的 に作製する方法を用レ、て作製することもできる。
また、 本発明で用いる抗 F a sリガンド抗体及び抗 F a s抗体は、 ヒトに対す る異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したキメラ抗体また はヒト化抗体がより好ましい。
これは、 非ヒトモノクロ一ナル抗体、 例えばマウス抗体の使用は、 ヒトの治療 において、 繰り返し行なう治療療養法において欠点を有するからである。 その第一は、 マウスモノ クローナル抗体は、 比較的短い循環半減期を有し、 そして、 ヒ トに用いられた場合は、 他の重要な免疫グロブリ ンの機能的特性を欠 くことである。
第二は、 非ヒトモノクローナル抗体は、 ヒト患者中に注入されたときに実質的 に免疫原性となる長さのペプチドを含むことである。 すなわち、 多くの研究によ り、 外来の抗体の注入後、 患者によって引き起こされる抗体に対する免疫 応答が、 非常に強くなることがあり、 最初の処置後の抗体の治療的有用性を本質 的に排除して まうと示されている。 さらに今後種々のマウス若しくは他の生物 のヒトに対する抗原性を有するモノクローナル抗体が開発されると、 いずれかの 異なった非ヒト抗体を用いた最初若しくは初期数回の処置の後、 それに続く関連 のない療法のための処置でさえ、 交叉反応性のために効果がなかったり、 若しく はそれ自身が危険な物質となることがあり得る。
本発明で用いる事ができるキメラ抗体は、 ヒ ト以外の哺乳動物、 例えば、 マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒ ト抗体の定常領域とからなる。 この ようなキメラ抗体は、 既知のキメラ抗体の製造方法、 特に遺伝子組換技法を用い て製造することができる。
さらに好ましくは、 再構成 （ r e s h a p e d) したヒ ト型抗体 （ヒ ト 化抗体） を本発明に用いることができる。 これはヒト以外の哺乳動物、 たとえば マウス抗体の相補性決定領域 （CDR) をヒト抗体の相補性決定領域へ置換した ものである。 すなわち、 定常領域と、 フレームワーク領域がヒト由来で、 相補性 決定領域が非ヒト由来であるのが好ましい。 本発明に有用な再構成ヒト型抗体の 好適な例としては、 国際特許出願公開番号 WO 97/0 22 9 0に開示されてい るマウス抗体 F 9 1 9 - 9 - 1 8抗体の CDRを有するものが挙げられる。 なお、 必要に応じ、 ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成 するように抗体の可変領域のフレームワーク （FR) 領域の 1以上のアミノ酸を 置換、 欠失または付加してもよい。
本発明に用いるヒト化抗体を製造するには、 リーチマン等、 Na t u r e、 3 3 2巻、 32 3頁、 1 9 8 8年、 ヨーロッパ特許公報第 0 2 3 94 0 0号公報、 クィーン （Qu e en) 等、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 8 6巻、 1 0029号、 1 989年、 国際特許出願公開公報 WO 90/078 6 1、 国際特許出願公開公報 WO 92/1 1 0 1 8、 コ— （Co) 等、 P r o Na t l . A c a d. S c i . USA, 8 8巻、 2 8 6 9頁、 1 9 9 1年、 コ一 （C o) 等、 Na t u r e、 3 5 1巻、 5 0 1頁、 1 9 9 1年及びコ一 (C 0) 等、 J. I mmu n 01. 、 1 48巻、 1 1 4 9頁、 1 9 92年等に開 示されている方法を用いることができる。
本発明で使用される F a s誘導体は、 少なくとも F a sリガンドとの結合能を 有するか、 若しくは F a s リガンドによるアポトーシスを抑制するものであ れば、 特に限定されない。 公知の F a sアミノ酸配列中に 1若しくは数個の ァミノ酸の欠失、 置換若しくは付加といつた任意の変異を有し、 F a sリガンド との結合活性を維持したまま、 F a s— F a s リガンド系の生物作用、 特 に、 F a sを介するアポトーシスを抑制するものが含まれる。 さらに該 Fa s誘 導体には、 F a s変異体、 切断型 （t r u n c a t e d f o rm) F a s、 キメラタンパク質、 融合タンパク質および化学的に修飾されたものも含まれる。 なお、 その由来となる Fa sは上記の性質を有する限り、 その動物種を問わない 力 抗原性を考慮すればヒト由来のものを使用するのが好ましい。
具体的には、 公知の F a sの細胞外領域、 膜貫通領域を欠失した F a s及 び F a s細胞外領域と他のタンパク質とのキメラタンパク質、 例えばヒト F a s 細胞外領域とヒ ト免疫グロプリンの F c領域のキメラタンパク質であるヒ ト Fa s—F c (hF a s— F c) 等が挙げられる。 F a s誘導体は、 いずれの製 法によるものでも良く、 公知の配列及び公知の遺伝子組換技術等により製造する ことができる。 例えば、 国際特許出願公開公報 WO 95 / 1 3293の実施例中 などに記載されている製法が使用できる。 ' また、 Fa sの N末端に欠失を有する Fa s誘導体も好まし.く、 平成 8年 3月 1 4日付けで日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業 技術研究所に寄託し （受託番号 P— 1 55 1 4及び受託番号 P - 1 55 1 5) 、 さらに平成 9年 3月 6日付で原寄託から国際寄託に移管 （受託番号 FERM B P- 5854及び受託番号 FERM BP- 5855 ) されている大腸菌が含む プラスミ ド （pMl 304及び pMl 3 1 7) にコードされている Fa s誘導体 s hFa s (n d 29) — F cおよび s hFa s (n d 29) — h i ng eは、 公知のヒ ト F a sの N末端の 1番目から 2 9番目までのァミノ酸を欠失した F a s細胞外領域を含有する誘導体である。 この s h F a s (n d 2 9 ) 一 F cおよび s hF a s (n d 2 9) 一 h i n g eは、 活性が高く、 本発明の びまん性肺疾患予防 ·治療剤の有効成分として好適な例である。
これらの本発明に用いる F a s誘導体は、 適当なアツセィ法により F a s リガンドに結合活性若しくは F a sを介するアポトーシスの抑制活性を有するこ とがわかる。
本発明で使用される F a s若しくは F a sリガンドの遺伝子若しくは mRN A に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 Fa sまたは Fa sリガンドの発 現を抑制するものであれば、 その配列は限定されず、 例えば国際特許出願公開公 報 W〇 95/1 3293に開示されている Fa sリガンドのアンチセンスオリゴ ヌクレオチド等が挙げられる （本明細書はこの文献の引用をもって本明細書 の一部と成す） 。 本発明のびまん性肺疾患の予防 ·治療剤は、 びまん性肺疾患患者に対して治療 剤として使用することが可能である。 また、 びまん性肺疾患原因物質を取り扱う 際、 及び、 びまん性肺疾患原因物質が他の疾患の治療目的で投与される際等の予 防剤、 ならびに、 びまん性肺疾患の再発防止等に対する予防剤として使用するこ とが可能である。
本発明のびまん性肺疾患の予防■治療剤は、 上述のアポトーシスを抑制する物 質を含有することを特徴とし、 少なくとも一種の医薬用担体、 若しくは媒体、 例 えば滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 鉱油、 高級アルコール、 高級脂肪酸若しくは 無害性有機溶媒等、 さらには必要に応じて賦形剤、 着色剤、 乳化剤、 懸濁剤、 界 面活性剤、 溶解補助剤、 吸着防止剤、 安定化剤、 保存剤、 酸化防止剤、 緩衝剤、 等張化剤、 無痛化剤等と適宜組み合わせて医薬組成物ゃキッ 卜の形態を取ること ができ、 経口的に、 若しくは静脈内、 冠動脈内、 皮下、 筋肉内、 経皮、 吸入、 直 腸内、 若しくは局所で非経口的に投与することができる。
好ましくは非経口的に、 全身若しくは局部的に、 急速若しくは持続的に投与す ることができる。
ヒ トに対する投与量は患者の病態、 年齢、 若しくは投与方法により異なる 力^ 適宣適当な量を選択することが必要である。 例えば、 全身投与の場合、 約 0 . 0 1— 1 0 O m g ZK gの範囲で適当な分割容量を選択することが可能で ある。 しかしながら、 本発明のびまん性肺疾患予防 ·治療剤の使用はこれらの投 与方法および投与量に制限されるものではない。 さらに、 複数のアポト一シスを 制御する物質、 F a sアン夕ゴニスト、 F a s— F a s リガンドの結合を抑制す る物質、 抗 F a s リガンド抗体若しくはヒト化抗 F a s リガンド抗体を組み合わ せて使用したり、 他の薬剤と併用しても良い。
本発明のびまん性肺疾患予防 ·治療剤は常法に従って製剤化することが できる。 例えば、 注射用製剤は、 精製されたアポトーシスを抑制する物質、
F a sアン夕ゴニスト、 F a s— F a s リガンドの結合を抑制する物質、 F a s 誘導体、 抗 F a s リガンド抗体若しくはヒト化抗 F a s リガンド抗体を生理食塩 水若しくは緩衝液等の溶剤に溶解し、 必要に応じて吸着防止剤等を加えたもので あり、 または、 使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであっても 良く、 凍結乾燥のための一般的な賦形剤を使用することができる。
本発明のびまん性肺疾患予防 ·治療剤に用いるアポト一シスを抑制する物質は びまん性肺疾患モデル （特に実施例の様なブレオマイシン誘発肺線維化/間質性 肺疾患モデル） において、 臓器及び組織の障害の抑制効果を示す。 さらに、 実施 例では、 マウスを用いたモデルで実験を行っているため、 抗マウス F a s リガンド抗体を使用し臓器及び組織の障害の抑制効果を示している力、 ヒ卜に用 いる場合は抗ヒト F a s リガンド抗体により実施例と同様の効果が期待できる。 なお、 本発明のびまん性肺疾患予防■治療剤は、 実施例において示すとおり毒 性がなく、 安全に使用できる。 すなわち、 本発明のびまん性肺疾患予防，治療剤 は、 びまん性肺疾患に対して予防、 治療または改善作用が期待される。
以下に実施例をもって、 本発明をいつそう具体的に説明するが、 これらは実施 の一例として示すものであり、 本発明はこれらにより何ら限定されるものではな い。 また、 以下の記載において用いる略号は当該分野において慣例として用いら れる略号に基づくものである。
本発明のアポトーシスを抑制する物質に含まれる F a s誘導体である s h F a s (n d 2 9 ) — F c及び s hF a s ( n d 2 9 ) — h i n g eの製法並び にアポトーシス抑制活性は国際特許出願公開公報 WO 97/423 1 9 ©実施例 2， 3, 5， 6及び 8に開示されている。 また、 本発明のアポト一シスを抑制す る物質に含まれる抗 F a sリガンド抗体の製法及びアポトーシス抑制活性は国際 特許出願公開公報 WO 97/ 02290に開示されている。
実施例 1 s hFa s (n d 29) F cの毒性試験
( 1 ) 試験方法
雄性、 6週令、 BD F 1マウス （日本チャールズリバ一製） に s h F a s (n d 29) — F cを 1 0及び 3 OmgZk gの用量で 2日に 1回、 1 2日間、 計 7回尾静脈内から投与し、 その影響を調べた。 実験は、 コントロール群、 s hF as(n d 29) -F c 1 Omg/k g投与群及び s hF as(n d 29) 一 F c 3 Omg/kg投与群の 3群で、 各群 3例づっ行つた。 なお、 各投与群 の投与タンパク質量を 3 Omg/k gと等しくするために、 コントロール群には 3 O mg/k gのヒ ト血清アルブミ ンを、 s h F a s(n d 2 9 ) — F c 1 OmgZk g投与群には s hF as(n d 2 9) —F c 1 Omg/k gと ヒ ト血清アルブミ ン 2 0 mgZk gを、 s h F as(n d 2 9 ) — F c 3 Omg/k g投与群には s hF as(n d 29) — F c 3 Omg/kgのみを 投与した。
投与開始日から、 2日に 1回、 体重測定を行った。 投与開始日から 1 4日目に 眼底静脈より採血を行い血球数を測定後、 血漿を調製し、 GOT、 G PT 及びクレアチニンを測定した。 また、 採血終了後、 剖検を行い、 目視により主要 臓器 （肺、 心臓、 肝臓、 腎臓、 脾臓及び腸） の変化を調べた。 血球数の測定は自 動血球測定装置 K— 2000 (Sy sme x) を用いて行った。 G〇T、 GPT 及びクレアチニンはオートアナライザー COBASFARA (ロッシュ製） を用 いて測定した。
( 2 ) 試験結果
1 0及び 3 Omg/kgの s hFas(n d 29) — F cを 2日に 1回、 1 2日 間、 計 7回マウスに投与しても体重増加、 血球数、 肝臓 （G〇T、 GPT) 、 腎 臓 （クレアチニン） 及びその他の主要臓器 （肉眼的所見） への有意な影響は認め られなかった。
実施例 2 s hFa s (n d 29) — F cのマウスブレオマイシン誘発肺線維化 モデルの改善作用
( 1 ) ブレオマイシン誘導肺線維症モデルの作製
実験には雄性、 6週齢、 I CRマウス （九動 （株） 製） を用いた。 体重測 定の後、 ペントバルビタール （ダイナボッ ト社製） を腹腔内に投与し、 麻酔 した。 4 m g / k gとなるように生理食塩水に溶解したブレオマイシン塩酸 塩 （日本化薬） 溶液 50 id 1を肺に投与した。
(2) s hFa s (n d 29) — F cの投与
s h F as(n d 2 9 ) — F cは以下に示した方法で投与した。 s hF a s (n d 29) —F cの静脈内投与は、 ブレオマイシン投与 7日または 1 0日後に 5 0 gZマウスの用量で投与した。 s hFa s (n d 29 ) — F cの肺への吸 入投与は、 1 0m 1の 5 0 gZm 1の s hF as(n d 2 9) - F c溶液を ウルトラソニックネブライザ一 （オムロン） にセッ トし、 ブレオマイシン 投与 2、 4、 6及び 8日後または 2、 4、 6、 8、 1 0及び 1 2日後に 30分間 吸入させ行った。 ブレオマイシンのみ投与し、 s hFa s (n d 2 9) — F cを 投与しないマウスをコントロール群とした。 '
( 3 ) 組織学的評価 ブレオマイシン投与 1 4日後に開胸し、 生理食塩水を用いて肺動脈血を洗い出 した後、 肺を摘出した。 摘出した右肺を 1 0%ホルマリン溶液を用いて 24時間 固定した。 パラフィン包埋後、 切片をへマトキシリンーェォジン染色した。 得ら れた切片を光学顕微鏡下で評価した。 組織学的スコアは表 1に示した基準を用い て三人の判定者がそれぞれスコアリングを行い、 その平均値を各個体の組織学的 o
組織学的スコア 症 状
0 異常なし
炎症部位 （炎症細胞浸潤部位） または線維化部位が
1
肺実質の 25 %未満
炎症部位 （炎症細胞浸潤部位） または線維化部位が
2
肺実質の 25 %以上 5 0 %未満
炎症部位 （炎症細胞浸潤部位） または線維化部位が
3
肺実質の 5 0 %以上 結果を以下の表 2に示す c
表 2 ブ 与 1 4日目における組織学的評価 炎症と線維化の 組織学的 群 存在が確認された スコア 個体の割合 例数 (%) 平均土 SD コントロ一ル I 0 I 0 0 I . 7 3土
0. 6 2 s hF a s (n d 2 9) — F c 8 3 8 0. 3 3土 5 0〃 gZマウス 0. 4 7 7日目静脈内投与 s hF a s (n d 2 9) — F c 4 25 0. 0 8土 5 0 gZマウス 0. I 7 1 0日目静脈内投与 s hF a s (n d 29) — F c 8 75 0. 9 2土 5 0 ^ g/m 1 I . 0 0
2, 4, 6, 8,10,12 日目吸入投与 s hFa s (n d 2 9) 一 F c 4 I 0 0 I . 5 0土 5 0 / g/m 1 0. 5 8
2, 4, 6 8日目吸入投与 ( 4 ) 気管支肺胞洗浄
ブレオマイシン投与 1 4日後にペントバルビタールをマウス腹腔内に投与して 麻酔した。 肺を露出させ、 気管チューブを挿入した後、 力二ユレーシヨン したチューブを通して 5m 1の室温にした生理食塩水を用いて気管支肺胞洗浄を 行った。 回収した洗浄液を金属製のメッシュに通し、 粘液を除去した。 肺胞洗浄 液中の細胞は血球計算板を用いて測定した。 マクロファージ、 リ ンパ球、 好 中球、 好酸球の細胞数は D i f f — Qu i k (B a x t e r D i a gn o s t i c s) を用いて染色した 1 00個の細胞中に占める各細胞の割合を測定し、 気管支肺胞洗浄液中の全細胞数を乗じて算出した。
気管支肺胞洗浄液の解析結果を以下の表 3に示す。
表 3 ブレオマイシン投与 1 4日目における気管支肺胞洗浄液の解析結果 平均細胞数土 S D ( X 1 0 5 Zm I )
群 例数
全細胞数 マ ク ロ リ ン パ数 好中球 好酸球
フ ァ ー ジ
コン トロール 8. 3 1土 5. 80土 2. 2 6土 0. 2 5士 0. 0 0士
3 1. 2 3 1. 2 3 0. 2 1 0. 0 9 0. 0 0 s h F a s ( n d 2 9 ) - F c 4. 80土 3. 1 6士 1. 4 5 ± 0. 1 9土 0. 0 0土 5 0〃 gZマウス 4 3. 0 0 1. 8 1 1. 0 9 0. 2 1 0. 0 0 7日目静脈内投与
s h F a s ( n d 2 9 ) 一 F c 2. 8 1土 2. 2 6土 0. 4 6土 0. 0 9土 0. 0 0土 5 0 gZマウス 4 1. 84 1. 2 7 0. 5 1 0. 1 2 0. 0 0 1 0日目静脈内投与
s h F a s ( n d 2 9 ) 一 F c 7. 0 6土 5. 5 7土 1. 2 0土 0. 2 9土 0. 0 0土 5 0 g / m I 8 7. 1 0 5. 5 1 1. 3 6 0. 4 2 0. 0 0
2, 4, 6, 8,10,12 日目吸入投与
s h F a s ( n d 2 9 ) 一 F c 4. 5 1 土 3. 2 0土 1. 0 7土 0. 1 7土 0. 0 0土 5 0 g / m I 4 2. 2 2 1. 0 5 0. 8 8 0. 1 9 0. 0 0
2， 4, 6， 8日目吸入投与
(5) ヒ ドロキシプロリンの測定 ブレオマイシン投与 1 4日後に肺を摘出し、 液体窒素を用いて凍結した。 均一の大きさになるよう細かく刻み、 6 N塩酸中で 1 6時間、 1 2 0 °Cに 加温して加水分解した。 各サンプル中のヒドロキジプロリン量は、 ヮセナ一 (Wo e s s n e r) の方法 (Ar c h. B i o c h em. B i o p hy s. 、 1 9 6 1年） で測定した。 1 mgの肺乾燥重量に対するヒドロキシプロリン量を 指標に各群間の比較を行った。 ヒドロキシプロリン量の測定結果を以下の表 4に示す。
表 4 ブレオマイシン投与 1 4日目における肺中ヒドロキシプロリン: 肺 1 mg中のヒドロ
群 例 数 キシプロリン量
平均土 S. D.
( / g ) コントロール 3 5 6. 1 ± 6. 8 8 s h F a s (n d 29) 一 F c 3 1 4. 6 ± 1 8. 1
5 0 g/マウス
7日目静脈内投与 s hFa s (n d 29) — F c 3 1 7. 2± 1 3. 0
5 0〃 g/マウス
1 0日目静脈内投与 s hFa s (n d 29) — F c 3 1 3. 7 ± 20. 7
5 0 g/m 1
2, 4, 6, 8,10,12 日目吸入投与 (6)結果
組織学的解析では、 shFa s (n d 29) — F c投与群は、 炎症ま'たは線維 化に伴う組織の障害がコントロール群よりも軽度であった。
気管支肺胞洗浄液中の細胞数の解析では、 shFa s (n d 29) - Fc投与 群はコントロール群に比較し、 全細胞数、 マクロファージ、 リンパ球及び好中球 の細胞数のすべて若しくは一部が少なかつた。
ヒドロキシプロリンの測定の結果、 shFa s (n d 29) 一 Fc投与群は、 コントロール群よりも肺組織中のヒドロキシプロリン量が少なかった。 ヒドロキ シプロリ ンは、 線維化の指標であるコラーゲンに特有なァミノ酸であること から、 shFa s (n d 29) 一 Fc投与群は、 コントロール群よりも肺組織中 のコラーゲン量が少なく、 s hFa s (n d 29) 一 Fcに線維化抑制効果が認 められた。
実施例 3 抗マウス F a sリガンド抗体の作製、 生産及び精製
( 1 )抗マウス F a sリガンド抗体の作製
遺伝子工学的手法を用いたマウス F a sリガンド WX2(J. I mmu n o l ogy, 157巻、 3918— 3924頁、 1 996年） 由来のマウス Fa s リガンド細胞外領域とマウス CD 40リガンドの細胞内領域、 膜貫通領域および 細胞外領域の一部 （N末端から 78アミノ酸） を融合したキメラ蛋白質をコード する遺伝子をヒトェロンゲーシヨンファクタ一 （EF) プロモー夕 （ミズシマ— ナガ夕 （M i zush ima— Naga t a) 、 Nuc l e i c Ac i d s Re s ea r ch, 1 8巻、 5322頁、 1 990年） の下流に有するプラスミ ドを作製した。 上記プラスミ ドを WR 1 9 L細胞にトランスフ ク トし、 細胞膜上にマウス F a sリガンドを発現している組換え細胞 W40 L F Lを 得て、 投与抗原として用いた。 免疫動物としてアルメニアハムスターを用いた。 フロイント完全アジュバントと混合した 1 X 1 07 個の W40 LFLをアルメニ ァハムスターの皮下に投与し、 1ヶ月後に PBSに懸濁した 2 X 1 07 個の W40 LFLを皮下に投与した。 さらに 1ヶ月後、 PBSに懸濁した 5 X 1 06 個の W40 LFLをフッ トパッ ドに投与した。 3日後、 リ ンパ節細胞を取り 出し、 マウスミエロ一マ細胞 P 3 -X 63 -Ag 8 -U 1 (P 3 -U 1 ) と 細胞融合した。 HAT培地 （ヒポキサンチン—了ミノプテリ ン—チミジン） によ る選択の後、 生育したハイプリ ドーマの中から、 その培養上清中にマウス F a s リガンドによる細胞障害性を中和する活性を有するハイプリ ドーマ FL IM58 を得た。
(2) FL IM58の生産および精製
ハイプリ ドーマ F L I M 5 8を無血清培地 Hy b r i d oma— SFM (G I BCO BRL) にて培養し、 その培養上清をプロティン— Aカラム (PROSEP— A、 B i o p r o c e s s i n g) で精製し、 精製抗体 FL IM58を得た。 蛋白濃度は 280 nmの吸光度より算出した。
実施例 4 抗マウス Fa sリガンド抗体 FL IM58の毒性試験
(1)方法
雄性、 8週齢、 DBA/ 1 Jマウスおよび C 3 HZH eマウス （日本 チヤ一ルス · リバ一） を用いた。 抗マウス F a sリガンド抗体 F L I M 5 8 を 1 0 Omg/30m 1 Zk gの用量で尾静脈から投与した。 またコントロール 群には生理食塩水を 3 0m l k gの用量で尾静脈から投与した。 2種の 系統ともに各群 3例とした。 観察期間を 7日間とし、 体重測定、 血液学的 検査 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査 （GOT、 GPT、 尿素窒素） 、 肉眼による剖検を行った。
(2)結果
抗マウス F a sリガンド抗体 F L I M 58投与群の投与後の体重増加、 血液学 的検査値 （赤血球、 白血球、 血小板） 、 血液生化学的検査値 （GOT、 GPT、 尿素窒素） はコントロール群と比べて差を認めなかった。 また、 肉眼による剖検 所見においても抗マウス Fa sリガンド抗体 FL IM58投与群に異常は認めら れなかった。
実施例 5 マウス Fa sリガンド抗体 FL IM58のマウスブレオマイシン誘発 発肺線維化モデルの改善作用
( 1 ) ブレオマイシン誘導肺線維症モデルの作製
ブレオマイシン誘導肺線維症モデルは 1 UZk gとなるように生理食塩水に溶 解したブレオマイシン塩酸塩 （日本化薬） 溶液を用いて、 実施例 2と同様に作成 した。
(2) FL IM58の投与
F L I M 58は、 ブレオマイシン投与の翌日及び 7日後に各 1 00〃 gZ マウス （計 200〃g/マウス） の用量、 またはブレオマイシン投与の 7日後に 200 gZマウスの用量で尾静脈内から投与した （各々 4例および 10例） 。 ブレオマイシンのみ投与し、 FL I M58を投与しないマウスをコントロール群 ( 1 0例） とした。 ( 3 ) 組織学的評価
組織学的評価は実施例 2と同様に行った c
組織学的評価の結果を表 5に示す。 表 5 ブ 1 4日目における組織学的評価
Figure imgf000031_0001
(4) 結果
組織学的解析では、 FL IM58投与群は、 炎症または線維化に伴う組織の障 害がコントロール群よりも軽度であった。 産業上の利用可能性
本発明のアポトーシスを抑制する物質を有効成分とするびまん性肺疾患予防 · 治療剤は、 アポトーシスの抑制作用により、 特に、 F a sを介した細胞の死に代 表される F a s - F a s リガンド系の生物作用等、 アポトーシスが関与するびま ん性肺疾患の予防または治療効果を有する。 従って、 本発明のアポト一シスを抑 制する物質は、 F a sを介した細胞の死等、 アポトーシスが関与するびまん性肺 疾患予防 ·治療剤として期待される。

Claims

請求の範囲
1 . アポトーシスを抑制する物質を有効成分とするびまん性肺疾患の予防 ·治 療剤。
2 . 前記アポト一シスを抑制する物質が F a sアン夕ゴニストである請求項 1 に記載の予防 ·治療剤。
3 . 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s - F a s リガンドの結合を抑制 する物質である請求項 1に記載の予防■治療剤。
4 . 前記アポトーシスを抑制する物質が F a s誘導体である請求項 1に記載の 予防 ·治療剤。
5 . 前記アポト一シスを抑制する物質が抗 F a s リガンド抗体である請求項 1 に記載の予防 ·治療剤。
6 . 前記アポトーシスを抑制する物質がヒト化抗 F a s リガンド抗体である請 求項 1に記載の予防 ·治療剤。
7 . 前記びまん性肺疾患が原因不明の間質性肺疾患、 膠原病及び膠原病の関連 疾患にみられるびまん性肺疾患、 薬剤誘起性びまん性肺疾患、 腫瘍性びまん性肺 疾患、 じん肺及びじん肺の関連するびまん性肺疾患、 類上皮細胞肉芽腫性の びまん性肺疾患、 感染性のびまん性肺疾患、 およびその他の原因によるびまん性 肺疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つであることを特徴とする請求 項 1〜6のいずれかに記載の予防，治療剤。
8 . 前記びまん性肺疾患が原因不明の間質性肺疾患であることを特徴とする請 求項 1〜 6のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
9 . 前記びまん性肺疾患が膠原病及び膠原病の関連疾患にみられるびまん性肺 疾患であるこ-とを特徴とする請求項 1〜 6のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
1 0 . 前記びまん性肺疾患が薬剤誘起性びまん性肺疾患にみられるびまん性肺 疾患であることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれかに記載の予防 ·治療剤。
1 1 . アポトーシスを抑制する物質を投与することからなるびまん性肺疾患の 予防 ·治療方法。
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