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WO1999023237A1 - Vecteur peptidique de transfection, composition le contenant et leurs applications - Google Patents

Vecteur peptidique de transfection, composition le contenant et leurs applications Download PDF

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Publication number
WO1999023237A1
WO1999023237A1 PCT/FR1998/002344 FR9802344W WO9923237A1 WO 1999023237 A1 WO1999023237 A1 WO 1999023237A1 FR 9802344 W FR9802344 W FR 9802344W WO 9923237 A1 WO9923237 A1 WO 9923237A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
asp
ser
arg
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1998/002344
Other languages
English (en)
Inventor
Jadwiga Chroboczek
Pascal Fender
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to JP2000519092A priority Critical patent/JP2001521747A/ja
Priority to US09/530,560 priority patent/US6750058B1/en
Priority to AU10388/99A priority patent/AU1038899A/en
Priority to EP98952838A priority patent/EP1029070A1/fr
Publication of WO1999023237A1 publication Critical patent/WO1999023237A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a peptide transfection vector, to a composition containing said vector as well as to their applications in the treatment (drugs) and prevention (vaccines) of human and animal diseases.
  • Said vector is in particular capable of delivering to suitable target cells, nucleic sequences, proteins, peptides and chemical substances of interest.
  • transfection vectors There are basically two main types of transfection vectors:
  • - natural transfection vectors such as viruses or modified viruses, which are effective but which have limits of use: non-specific tissue, need to obtain constructs for each gene of interest and potential risks for 'environment, which lead to the establishment of costly and restrictive clinical infrastructure for the patient and staff; - non-viral agents (synthetic vectors), capable of promoting the transfer and expression of chemical substances such as DNA, in eukaryotic cells.
  • the latter strategy represents an alternative to viral vectors.
  • cationic polymers and cationic lipids.
  • the former are generally made up of polylysine, while there is a wide variety of cationic lipids (liposomes or pseudo-liposomes), each giving variable transfection efficiencies depending on cell types (DOTMA, etc.).
  • the lipid part which interacts with and / or destabilizes the membranes allows the fusion and entry of the DNA / liposome complex.
  • DNA transfection with liposomes although less immunogenic than that carried out using cationic polymers, is in fact a relatively ineffective process.
  • targeting is obtained for example by coupling ligands to polylysine polymers; targeting can also be done after internalization, by directing the complexes towards the nucleus (PCT International Application WO 95/31557) and
  • an endosolytic agent in the complex, such as adenoviral particles (Request PCT International WO 93/07283) or more recently synthetic peptides with endosomal activity, which increase the release of DNA into the cytoplasm.
  • compositions comprising (i) the nucleic acid to be transfected, (ii) a transfection agent, such as a cationic polymer and / or a lipofectant, (iii) a peptide compound involved in the condensation of the nucleic acid, consisting in whole or in part of peptide units having a majority of basic amino acids such as lysine, histidine, arginine (histones, nucleoline, protamine or their derivatives) ) and possibly (iv) a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid, such as an intracellular type ligand such as a nuclear localization signal sequence (NLS) which favors the accumulation of trans DNA - made within the nucleus and which can be associated with the peptide compound to form a chimeric peptide comprising a protein fragment (histone or protamine or nucleoline) and an NLS sequence.
  • a transfection agent such as a cationic polymer and / or
  • compositions for the transfection of eukaryotic cells which comprise the nucleic acid to be transfected, at least one cationic lipid at a suboptimal concentration and at least one acid peptide (active on the membrane) , which destabilizes the endosomal membrane and thus increases the efficiency of transfection.
  • the positive charge / negative charge ratio is between 0 and 3.
  • the peptides selected are derived from the Yinfluenza virus, to induce an effective rupture of the endosomes. The presence of lipids is necessary, in this composition, because the selected peptide does not allow the passage of the first cell membrane.
  • nucleic acid transfection complex which comprises a fusion protein consisting of a cellular factor (growth factor, viral antigen, toxin, integrin or lipoprotein) and a basic polycationic peptide comprising arginine and / or lysine residues.
  • a cellular factor growth factor, viral antigen, toxin, integrin or lipoprotein
  • a basic polycationic peptide comprising arginine and / or lysine residues.
  • a transfer peptide which comprises three parts: (1) a ligand L1 (peptide of 2 to 100 amino acids, capable of binding to a binding site on the surface of eukaryotic cells ( membrane receptor) (example: RGD peptide, binding domain for growth factors, hormones, viral antigens or lipoproteins; (2) an L2 ligand similar to L1 (peptide of 2 to 20 amino acids), which binds to the external nuclear membrane of eukaryotic cells, such as an NLS sequence and (3) an L3 ligand corresponding to a basic peptide (3 to 100 amino acids) (histone fragment H1 or H2B, for example).
  • L1 peptide of 2 to 100 amino acids, capable of binding to a binding site on the surface of eukaryotic cells ( membrane receptor)
  • RGD peptide binding domain for growth factors, hormones, viral antigens or lipoproteins
  • L2 ligand similar to L1 peptide of 2 to 20 amino acids
  • This Application therefore have a general ligand structure of a membrane receptor-ligand of the external nuclear membrane-basic peptide.
  • a structure has been proposed in order to improve the specificity of the complex with respect to target cells, but has a toxici tee of the same order as that of liposomes; in addition, the construction must be adapted according to the target cells (presence of specific receptors on the target cells) and
  • the synthetic peptide comprises a polymer chain risk of basic amino acids, preferably in the C-terminal position (10-50 amino acids, such as lysine, arginine and ornithine), an NLS peptide (6-15 amino acids, such as the NLS sequence of the SV40 T antigen, the NLS sequence of the polyome T antigen, the NLS sequence of adenovirus El a or the NLS sequence of adenovirus Elb, preferably in the N-terminal position and a hinge region of neutral amino acids (6-50 amino acids selected from glycine, alanine, leucine and isoleucine), between the polymer chain and the NLS peptide.
  • basic amino acids preferably in the C-terminal position (10-50 amino acids, such as lysine, arginine and ornithine
  • an NLS peptide (6-15 amino acids, such as the NLS sequence of the SV40 T antigen, the NLS sequence of the polyome T antigen, the NLS sequence of a
  • the preferred NLS sequence is the T antigen sequence of the SV40 virus (small basic amino acid sequence: PKKKRKV), which is effective in mammalian cells or a short hydrophobic sequence which contains one or more basic amino acids (KIPIK).
  • the hinge sequence comprises 6-26 neutral amino acids selected only from Gly (G), Ala (A), Leu (L) and Ile (I).
  • the ratio (by weight) pe ⁇ tide : DNA is between 1: 1 and 1:10.
  • the peptide described in this document hardly crosses the cell membrane and this is the reason why, in this International Application, it is recommended to treat the cells before transfection: the cells are treated with a hypertonic solution, then with a hypotonic solution in the presence of the nucleic acid-peptide complex.
  • the hypertonic solution may contain PEG (0.3 M-0.6 M) and sucrose (10-25%). These different complexes have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane; however, they are far from being as efficient as the viral vectors, in particular due to insufficient condensation of the DNA to be transfected and / or of the difficulties encountered by the transfected DNA to leave the endosome without being degraded and for penetrate the cell nucleus.
  • compositions comprising an adenoviral protein complex consisting of: A. an adenoviral protein complex, namely:
  • pentons each comprising at least one fiber and one penton base, to the exclusion of any other constituent element of the genome of an adenovirus, which fiber (s) and base of the penton are derived either from the same adenovirus, either of different adenoviruses, said pentons being linked by the penton bases and forming a dodecahedron structure, stable to proteolytic enzymes, which complex has a molecular weight of between 4.8 ⁇ 10 6 and 6.6 ⁇ 10 6 ;
  • penton bases to the exclusion of any other constituent element of the genome of an adenovirus, which penton bases are derived either from the same adenovirus or from different adenoviruses, and form a dodecahedron structure, stable to proteolytic enzymes and in that it has a molecular weight between 3.2.10 6 and 4.10 6 .
  • a ligand between the adenoviral protein complex and the nucleic acid such as peptides whose N-terminal part comprises the N-terminal amino acid sequence of an adenovirus fiber of any serotype (area of attachment to the adenoviral protein complex) and the C-terminal part of which comprises a polylysine or a polyarginine.
  • the transfection vectors described in this Application allow the internalization of the nucleic sequence to be transfected and increase the permeability of the endosomes; however, it is a relatively complex structure that mimics the behavior of adenoviruses; in fact, the adenovirus particles are relatively complex and comprise several substructures; in particular the external part or capsid is formed mainly of three proteins: the hexon, the base of the penton and the fiber; the fiber allows the attachment of the virion to a cellular receptor, while the base of the penton allows the internalization of the virion.
  • a peptide derived from the adenovirus fiber protein is capable of efficiently transferring nucleic acid sequences or proteins, in the absence of liposomes and cell processing.
  • the subject of the present invention is a peptide vector for transfection of a chemical substance selected from the group consisting of nucleic acid sequences, proteins, peptides and pharmacologically active chemical substances, characterized in that it contains, in addition to said chemical substance, at least one transfection peptide derived in whole or in part from an adenovirus fiber and comprising at least one zone consisting of at least 50% hydrophobic amino acids selected from the group consisting of alanine, valine, phenylalanine, isoleucine, leucine, proline and methionine.
  • said peptide is derived from a fiber of an adenovirus selected from the group consisting of Ad2, Ad3, Ad4, Ad7, Ad8, Ad9, Adll, Adl2, Adl5, Adl6, Ad21, Ad40, Ad41, F AVI (CELO) and FAV7 or a fragment of the V40 protein of the SV40 virus.
  • said transfection peptide comprises at least:
  • Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO: l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO: 2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO: 3), Xo-Lys- Arg-Leu-Arg (Xo-KRLR) (SEQ ID NO: 4), Xo-Lys-Arg-Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NOS), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg (XoPKKPR) (SEQ ID NO: 6), in which Xo is zero or represents Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) or Ser (S),
  • a hydrophobic sequence comprising between 7 and 50 amino acids, derived from an adenovirus fiber and selected from the group consisting of killed by at least one of the following sequences Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X 2 (X ⁇ FNPVYPYX 2 ) (SEQ ID NO: 7), X ⁇ -Phe-Asp-Pro-Val- Tyr-Pro-Tyr-X 2 (X1FDPV ⁇ PYX2) (SEQ ID NO: 8), in which:
  • Xi is zero or represents a sequence of at most 43 amino acids, preferably a sequence of 5 to 15 amino acids, comprising hydrophobic and / or polar and / or acid-charged amino acids, and in particular one of the following sequences: Leu -Ser-Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO: 9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO: 10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO: ll), Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO: 12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO: 13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu -Glu-Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO: 14) or X 3 -Glu-Asp-Asp (X3EDD)
  • X 2 is zero or represents a sequence of at most 43 amino acids, preferably a sequence of 5 to 15 amino acids, comprising hydrophobic and / or polar and / or charged amino acids, and in particular one of the following sequences: Glu -Asp-Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO: 16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO: 17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO: 18), Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO: 19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO: 20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) ( SEQ ID NO: 21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO: 22) or Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO: 23) and
  • - basic charged amino acids the following amino acids: Lys, Arg and ornithine; and - neutral polar amino acids, the following amino acids: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, His and Trp.
  • said transfection peptide is branched and comprises at least two fragments derived from an adenovirus fiber; said fragments each comprise a segment of an NLS sequence and a hydrophobic sequence, as defined above and are linked together by a polymeric sequence such as a polymeric sequence of basic amino acids.
  • the chemical is a nucleic acid sequence
  • it is selected from the genes which code for a polypeptide exhibiting therapeutic activity, the antisense sequences and the ribozymes.
  • a coding sequence also comprises a promoter active for the expression of the poly peptide.
  • Said promoter is in particular selected from the group consisting of constitutive promoters and inducible promoters.
  • such a transfection peptide vector comprising neither lipids (in the form of liposomes, for example) nor penton base is capable of efficiently transfecting, in particular nucleic acid sequences of any type. how big, down to the nucleus without poisoning the transfected cell.
  • the exogenous nucleic acid sequence, the protein of interest or any other chemical substance, associated with the said transfection vector enters the cell (internalization).
  • the transfection peptide-cell receptor interaction significantly increases both the internalization of the transfection vector and the permeability of the endosomes, which significantly increases the passage of nucleic acid. exogenous, protein of interest or any other chemical from the endosomes to the cytoplasm and to the nucleus, in comparison with the use of a vector including lipids (in the form of liposomes, for example).
  • peptide vectors for transfection prove to be more effective and less toxic than compositions containing liposomes (cationic lipids or lipofectants).
  • said transfection peptide comprises at least:
  • Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO: l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO: 2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO: 3), Xo-Lys- Arg-Leu-Arg (Xo-KRLR) (SEQ ID NO: 4), Xo-Lys-Arg-Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NO: 5), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg ( XoPKKPR) (SEQ ID NO: 6), in which Xo is zero or represents Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) or Ser (XoKRVR) (SEQ ID NO: l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO: 2),
  • a hydrophobic sequence comprising between 7 and 50 amino acids, derived from an adenovirus fiber and selected from the group consisting of at least one of the following sequences Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro- Tyr-X 2 (X ⁇ FNPVYPYX 2 ) (SEQ ID NO: 7), X ⁇ -Phe-Asp-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X 2 (X1FDPVYPYX2) (SEQ ID NO: 8), in which:
  • Xi is zero or represents a sequence of at most 43 amino acids, preferably a sequence of 5 to 15 amino acids, comprising hydrophobic and / or polar and / or acid-charged amino acids, and in particular one of the following sequences: Leu-Ser -Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO: 9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO: 10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO: ll) , Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO: 12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO: 13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu-Glu -Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO: 14) or X 3 -Glu-Asp-Asp (X3ED
  • X 2 is zero or represents a sequence of at most 43 amino acids, preferably a sequence of 5 to 15 amino acids, comprising hydrophobic and / or polar and / or charged amino acids, and in particular one of the following sequences: Glu-Asp -Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO: 16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO: 17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO: 18) , Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO: 19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO: 20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) (SEQ ID NO: 21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO: 22) or Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO: 23), which transfection peptide
  • the polymeric sequence of basic amino acids comprises between 10 and 50 amino acid residues, selected from the group consisting of lysine, arginine and ornithine.
  • the cationic polymer sequence is selected from the group consisting of polyamines and polymers of quaternary ammonium; a preferred polyamine is polyethyleneimine (PEI).
  • said poly alcohol is preferably C 3 -C 20, and in particular glycerol or dextrans.
  • the NLS sequence is at the N-terminus of the transfection peptide and the polymeric basic amino acid sequence is at the C-terminus of said transfection peptide.
  • the transfection peptide / nucleic acid ratio is understood between 0.3: 1 and 15: 1, preferably between 2: 1 and 6: 1, preferably between 4: 1 and 6: 1.
  • a subject of the invention is also a composition, characterized in that it essentially consists of a transfer vector as defined above and a suitable vehicle selected from the group consisting of bile salts, antiproteases, cyclodextrins and their derivatives, antiseptics and polyis.
  • a suitable vehicle selected from the group consisting of bile salts, antiproteases, cyclodextrins and their derivatives, antiseptics and polyis.
  • antiviral agents antisense sequences or ribozymes
  • the present invention also relates to a process for the in vitro transfection of eukaryotic cells with a chemical substance selected from the group consisting of nucleic acid sequences, proteins, peptides and pharmacologically active chemical substances, characterized in that that it comprises contacting and incubating a peptide transfection vector in accordance with the invention, in a dilution buffer comprising 100-150 mM NaCl with eukaryotic cells for 15 to 120 minutes at temperature ambient, the chemical substance to be transfected: transfection peptide ratio being between 0.3: 1 and 15: 1, preferably between 2: 1 and 6: 1, preferably between 4: 1 and 6: 1.
  • Figure 1 illustrates the transfer of the luciferase gene with peptide I, as a function of time ( Figure 1A) or as a function of the NaCl concentration ( Figure 1B).
  • FIG. 2 illustrates the kinetics of the expression of the luciferase gene; this figure comprises on the abscissa the transfection peptide / DNA or DOT AP / DNA ratios and on the ordinate, the percentage of transfection at J1 (B), J2 (H), J3 (B) and J6 (0); - Figure 3 shows the migrations obtained on a retardation gel, depending on the amount of transfection peptide;
  • FIG. 4 illustrates the transfections obtained with the DOSPER and DOTAP liposomes; this figure comprises on the abscissa the liposome / DNA ratios and on the ordinate the RLU (Related Light Unit) / 10sec / 10 5 cells;
  • FIG. 5 illustrates the kinetics of entry into the cells of a peptide (peptide I), observed by confocal microscopy; column A shows the fluorescent peptide and column B shows the cellular nucleic acids stained with propidium iodide;
  • FIG. 6 illustrates the inhibition of transfection with peptide I, after preincubation with an excess of peptide I.
  • the HeLa cells in plates comprising 24 wells are preincubated with peptide I for one hour at 4 ° C. at concentrations of 10 to 50 ⁇ g / ml, respectively;
  • - Figure 7 shows some sequences of adenovirus fibers.
  • the HeLa cells are cultured at 37 ° C. in an EMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum under an atmosphere containing 5% of CO 2 .
  • a luciferase reporter vector (plasmid pGL3, Promega), is used to demonstrate the transfection.
  • Peptide IC includes sequence # 2, sequence # 10, sequence # 7, sequence # 16, from the N-terminus to the C-terminus and 10 lysines; this peptide corresponds to the 20 N-terminal residues of the Ad3 fiber.
  • Peptide I contains these same 20 N-terminal amino acids of the Ad3 fiber and 20 lysines; the peptides were obtained by solid phase synthesis, followed by purification by HPLC.
  • This peptide I is labeled with fluorescein; peptides comprising 10 lysines instead of 20 were also prepared. The integrity of all the peptides is verified by mass spectroscopy.
  • plasmid DNA 500 ng of plasmid DNA (pGL3) are preincubated with different quantities of peptides for 5 min at room temperature, then subjected to electrophoresis on 1% agarose gel prepared in TBE buffer.
  • 1.5 to 12 ⁇ g of peptide I in 50 ⁇ l of dilution buffer (Tris 20 mM, pH 7.4, 150 mM NaCl) are incubated with 1.5 ⁇ g of plasmid pGL3 in 250 ⁇ l of EMEM medium for 15 to 30 min at room temperature.
  • the mixture of DOTAP or DOSPER with 1.5 ⁇ g of plasmid pGL3 is prepared according to the manufacturer's instructions (Boehringer). For studies on the effect of the peptide on transfection in the presence of liposomes, portions of peptides are mixed with DOTAP or DOSPER in the dilution buffer defined above for 15 to 30 min at room temperature, then 1.5 ⁇ g of plasmid pGL3 is added and incubated for 15 min at room temperature.
  • the transfections are carried out in plates comprising
  • Human erythrocytes are washed 3 times with PBS buffer. 10 6 erythrocytes are incubated with 6 ⁇ g of peptide I for different periods of time at 37 ° C. After centrifugation at 10,000 g for 5 min, the optical density of the supernatant is measured at 540 nm.
  • HeLa cells cultured on coverslips (10 5 cells / coverslip) are treated with 3% bovine serum albumin in EMEM for 15 min at 37 ° C.
  • the cells are washed twice with PBS buffer, incubated with 40 ⁇ g / ml of peptide I labeled with fluorescein for different durations at 37 ° C., fixed with 2% paraformaldehyde in PBS for 20 min at 37 ° C., washed with PBS and stained with 1 ⁇ g / ml of propidium iodide in PBS for 5 min at room temperature.
  • the slides are mounted on a microscope slide with 1,4-diazabicyclooctane (Sigma) and observed on a confocal microscope MRC600 (BioRad). * Results:
  • DNA / peptide complexes The behavior of DNA / peptide complexes is analyzed on delayed gels. Theoretically, 526 peptide molecules are necessary to neutralize the phosphate charges carried by the plasmid
  • FIG. 3 shows that the incubation with 250 ng of peptide causes a delay in the migration of DNA and the addition of 500 ng of peptide completely stops its migration, which is in agreement with the theoretical considerations set out above. .
  • the peptides according to the invention essentially comprise 3 domains, the nuclear localization signal, the hydrophobic domain and the basic polymer.
  • NLS domain peptide ID
  • polylysine peptide IA
  • hydrophobic zone K ⁇ o peptide and K20 peptide
  • Table III illustrates other results obtained with peptide I or peptide IA, in the presence of glycerol or PEI and the peptide LU.
  • the peptide vector comprising peptide I and PEI
  • Liposomes Two liposomes were used, the DOTAP liposome and the DOSPER liposome, both marketed by Boehringer. They consist of cationic lipids with internal ester bonds capable of being degraded by esterases or cellular lipases, which should confer on these liposomes a cytotoxicity lower than that observed with other liposomes.
  • the transfection conditions of the HeLa cells were optimized for the liposomes alone (FIG. 4). Transfection with the DOTAP liposome leads to lower efficiencies than those observed with the DOSPER liposome; however, transfections with the DOTAP liposome tend to exhibit a plateau above a certain DNA / liposome ratio, while transfections with the DOSPER liposome exhibit a peak.
  • the order in which these compounds are added is important, since a higher efficiency (increase in several factors) is observed, when the liposome is first mixed with the peptide (and not with DNA) then when the plasmid DNA is added after 15 min of incubation at room temperature.
  • the DOTAP liposome is mixed with 1.5 ⁇ g of plasmid pGL3 in a DOTAP / DNA ratio of 2 or 4 (v / p), in 300 ⁇ l of dilution buffer for 15 min at room temperature.
  • the signal is also observed in the nucleus and a very bright signal is observed in the nucleoli. This significant transfer to nucleoli is particularly surprising.
  • peptide I To determine if there are specific sites of attachment of peptide I to the plasma membrane, cells were preincubated with peptide I at 4 ° C. for 2 h, so as to try to saturate the possible sites of attachment of the peptide.
  • Light scattering can be used to measure the size of the complexes and their distribution, if there is a mixed population formation. Under these conditions, it is possible to study the effect of the incubation time on the formation of the transfecting complexes. The size is measured immediately after mixing and 1 hour after.
  • the complexes produced by mixing the DOTAP liposome with a DNA plasmid have a diameter of approximately 115 nm and their size does not change during incubation.
  • the DNA / peptide I complexes are larger and have a diameter of about 350-360 nm.
  • the formation of the complex is a dynamic process since a rapid increase in size is observed as a function of the incubation time when more than 90% of the complexes reaches a diameter of 660-1100 nm after 1 h.

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Abstract

Vecteur peptidique de transfection, composition contenant ledit vecteur et leurs applications dans le traitement et la prévention des maladies humaines et animales. Ledit vecteur peptidique de transfection d'une substance chimique sélectionnée dans le groupe constitué par des séquences d'acides nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques pharmacologiquement actives, contient outre ladite substance chimique, au moins un peptide de transfection dérivant en tout ou en partie d'une fibre d'adénovirus et comportant au moins une zone constituée d'au moins 50 % d'aminoacides hydrophobes sélectionnés dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la phénylalanine, l'isoleucine, la leucine, la proline et la méthionine.

Description

VECTEUR PEPTIDIQUE DE TRANSFECTION, COMPOSITION LE CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à un vecteur peptidique de transfection, à une composition contenant ledit vecteur ainsi qu'à leurs appli- cations dans le traitement (médicaments) et la prévention (vaccins) des maladies humaines et animales. Ledit vecteur est notamment apte à dispenser à des cellules cibles convenables, des séquences nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques d'intérêt.
Dans le domaine de la thérapie génique, de nombreuses compositions, utiles pour transfecter efficacement les cellules eucaryotes avec un matériel génétique sélectionné ont été décrites.
Il existe essentiellement deux grands types de vecteurs de transfection :
- les vecteurs de transfection naturels, tels que les virus ou les virus modifiés, qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d'intérêt et risques potentiels pour l'environnement, qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et le personnel ; - des agents non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de promouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN, dans les cellules eucaryotes. Cette dernière stratégie représente une alternative aux vecteurs viraux.
Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonctions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus, pour être efficaces ; toutefois, il apparaît que les différents vecteurs proposés dans l'art antérieur ne présentent pas ces deux fonctions, de manière optimale et peuvent, en outre, selon les cas, être toxiques pour les cellules.
Parmi ces agents non- viraux, on peut tout d'abord citer les polymères cationiques et les lipides cationiques. Les premiers sont générale- ment constitués de polylysine, alors qu'il existe une grande variété de lipides cationiques (liposomes ou pseudo-liposomes), chacun donnant des efficacités de transfection variable suivant les types cellulaires (DOTMA, etc.).
La partie lipidique qui interagit avec et/ ou déstabilise les membranes permet la fusion et l'entrée du complexe ADN/ liposome. Cependant, la transfection d'ADN par les liposomes, bien que moins immunogénique que celle réalisée à l'aide des polymères cationiques, est en fait un procédé relativement inefficace.
Le mécanisme majeur de l'entrée des complexes ADN/ liposomes, est, semble-t-il, l'endocytose ; en conséquence, l'ADN transfecté est piégé dans les vésicules intracellulaires et détruit par les enzymes lysosomales.
Même si une partie de l'ADN transfecté est libéré dans le cytoplasme par un effet d'action de masse, seulement une petite fraction de cet ADN se retrouve effectivement dans le noyau. Des agents capables d'augmenter la libération de l'ADN des vésicules endosomiques et son passage dans le noyau peuvent augmenter le taux de transfert génique.
Parmi ces agents, on distingue :
- ceux qui ciblent le complexe vers un autre point d'entrée : le ciblage est obtenu par exemple en couplant des ligands aux polymères de polylysine ; le ciblage peut aussi se faire après l'internalisation, en dirigeant les complexes vers le noyau (Demande Internationale PCT WO 95/31557) et
- ceux qui évitent la dégradation endosomale : pour échapper à la dégradation endosomale, il a été proposé d'incorporer un agent endoso- molytique dans le complexe, tel que des particules adénovirales (Demande Internationale PCT WO 93/07283) ou plus récemment des peptides synthétiques à activité endosomoly tique, qui augmentent la libération de l'ADN dans le cytoplasme.
Compte tenu de ce qui précède, différents types de complexes ont été proposés ; on peut citer, des complexes associant des liposomes et des peptides, tels que ceux décrits dans :
- la Demande Internationale WO 96/25508, qui décrit des compositions comprenant (i) l'acide nucléique à transfecter, (ii) un agent de transfection, tel qu'un polymère cationique et/ ou un lipofectant, (iii) un composé peptidique intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, constitué en tout ou partie de motifs peptidiques possédant une majorité d'acides aminés à caractère basique comme la lysine, l'histidine, l'arginine (histones, nucléoline, protamine ou leurs dérivés) et éventuellement (iv) un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique, tel qu'un ligand de type intracellulaire comme une séquence signal de localisation nucléaire (NLS) qui privilégie l'accumulation de l'ADN trans- fecté au sein du noyau et qui peut être associé au composé peptidique pour former un peptide chimère comprenant un fragment de protéine (histone ou protamine ou nucléoline) et une séquence NLS. Toutefois, ce système nécessite la présence d'un polymère cationique et/ ou d'un lipofectant, qui ont l'inconvénient d'êtres toxiques et/ ou coûteux.
- la Demande Internationale WO 97/30170 qui décrit également des compositions pour la transfection des cellules eucaryotes, qui comprennent l'acide nucléique à transfecter, au moins un lipide cationique à une concentration suboptimale et au moins un peptide acide (actif sur la membrane), qui déstabilise la membrane endosomique et augmente ainsi l'efficacité de la transfection. Le rapport charge positives/ charges négatives est compris entre 0 et 3. Les peptides sélectionnés sont issus du virus de Yinfluenza, pour induire une rupture effective des endosomes. La présence des lipides est nécessaire, dans cette composition, du fait que le peptide sélectionné ne permet pas le passage de la première membrane cellulaire.
De tels complexes ne permettent donc pas d'éviter les inconvénients liés à l'utilisation de liposomes. C'est sans doute la raison pour laquelle des complexes ne mettant en oeuvre que des peptides ont été proposés :
- la Demande de Brevet européen 0 544 292, qui décrit un complexe de transfection d'acide nucléique qui comprend une protéine de fusion constituée d'un facteur cellulaire (facteur de croissance, antigène viral, toxine, intégrine ou lipoprotéine) et d'un peptide polycationique basique comprenant des résidus arginine et/ ou lysine.
- la Demande Internationale WO 94/23751, qui décrit un peptide de transfert qui comprend trois parties : (1) un ligand Ll (peptide de 2 à 100 aminoacides, apte à se lier à un site de liaison à la surface des cellules eucaryotes (récepteur membranaire) (exemple : peptide RGD, domaine de liaison des facteurs de croissance, des hormones, des antigènes viraux ou des lipoprotéines ; (2) un ligand L2 similaire à Ll (peptide de 2 à 20 aminoacides), qui se lie à la membrane nucléaire externe des cellules eucaryotes, telle qu'une séquence NLS et (3) un ligand L3 correspondant à un peptide basique (3 à 100 aminoacides) (fragment d'histone Hl ou H2B, par exemple). Les peptides de transfert décrits dans cette Demande ont donc une structure générale ligand d'un récepteur membranaire-ligand de la membrane nucléaire externe- peptide basique. Une telle structure a été proposée afin d'améliorer la spécificité du complexe vis-à-vis de cellules cibles, mais présente une toxicité du même ordre que celle des liposomes ; en outre, il faut adapter la construction en fonction des cellules cibles (présence de récepteurs spécifiques sur les cellules cibles) et
- la Demande internationale WO 95/31557 qui décrit un vecteur de transfection comprenant un peptide synthétique et l'acide nucléique à transfecter. Le peptide synthétique comprend une chaîne polymé- rique d'aminoacides basiques, de préférence en position C-terminale (10-50 aminoacides, tels que lysine, arginine et ornithine), un peptide NLS (6-15 aminoacides, tels que la séquence NLS de l'antigène T de SV40, la séquence NLS de l'antigène T de polyome, la séquence NLS d'adénovirus El a ou la séquence NLS d'adénovirus Elb, de préférence en position N-terminale et une région charnière d'aminoacides neutres (6-50 aminoacides sélectionnés parmi la glycine, l'alanine, la leucine et l'isoleucine), entre la chaîne polymérique et le peptide NLS. La séquence NLS préférée est la séquence de l'antigène T du virus SV40 (petite séquence d'aminoacides basiques : PKKKRKV), qui est effi- cace dans les cellules de mammifère ou une séquence hydrophobe courte qui contient un ou plusieurs aminoacides basiques (KIPIK). La séquence charnière, comprend 6-26 aminoacides neutres sélectionnés uniquement parmi Gly (G), Ala (A), Leu (L) et Ile (I). Le rapport (en poids) peρtide:ADN est compris entre 1:1 et 1:10. Le peptide décrit dans ce document passe difficilement la membrane cellulaire et c'est la raison pour laquelle, il est préconisé, dans cette Demande internationale de traiter les cellules avant la transfection : les cellules sont traitées avec une solution hypertonique, puis avec une solution hypotonique en présence du complexe acide nucléique-peptide. La solution hypertonique peut contenir du PEG (0,3 M-0,6 M) et du saccharose (10-25 %). Ces différents complexes possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire ; toutefois ils sont loin d'être aussi performants que les vecteurs viraux, notamment en raison d'une condensation insuffisante de l'ADN à transfecter et/ ou des difficultés rencontrées par l'ADN transfecté pour sortir de l'endosome sans être dégradé et pour pénétrer dans le noyau cellulaire.
Cherchant à mettre au point de nouveaux vecteurs ne présentant pas les inconvénients des vecteurs viraux, les Inventeurs ont mis au point le vecteur décrit dans la Demande Internationale WO 97/18317, qui décrit des compositions comprenant un complexe protéique adénoviral constitué : A. d'un complexe protéique adénoviral, à savoir :
- soit de 12 pentons, comprenant chacun au moins une fibre et une base de penton, à l'exclusion de tout autre élément constitutif du génome d'un adénovirus, lesquelles fibre(s) et base du penton sont dérivées soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, lesdits pentons étant liés par les bases de penton et formant une structure en dodécaèdre, stable aux enzymes protéolytiques, lequel complexe présente un poids moléculaire compris entre 4,8.106 et 6,6.106 ;
- soit de 12 bases de pentons, à l'exclusion de tout autre élé- ment constitutif du génome d'un adénovirus, lesquelles bases de penton sont dérivées soit du même adénovirus, soit d'adénovirus différents, et forment une structure en dodécaèdre, stable aux enzymes protéolytiques et en ce qu'il présente un poids moléculaire compris entre 3,2.106 et 4.106.
B. d'une séquence d'acide nucléique à transfecter et C. d'un ligand entre le complexe protéique adénoviral et l'acide nucléique, tel que les peptides dont la partie N-terminale comprend la séquence en aminoacides N-terminales d'une fibre d'adénovirus de n'importe quel sérotype (zone d'attachement au complexe protéique adénoviral) et dont la partie C-terminale comprend une polylysine ou une polyarginine. Les vecteurs de transfection décrits dans cette Demande permettent l'internalisation de la séquence nucléique à transfecter et augmentent la perméabilité des endosomes ; il s'agit toutefois d'une structure relativement complexe qui mime le comportement des adénovirus ; en effet, les particules d'adénovirus sont relativement complexes et comprennent plusieurs sous-structures; en particulier la partie externe ou capside est formée majoritairement de trois protéines : l'hexon, la base du penton et la fibre ; la fibre permet l'attachement du virion à un récepteur cellulaire, alors que la base du penton permet l'internalisation du virion.
Poursuivant leurs recherches, les Inventeurs ont trouvé que de manière inattendue, un peptide dérivé de la protéine de fibre d'adénovirus est capable de transfecter, de manière efficace, des séquences d'acides nucléiques ou des protéines, en l'absence de liposomes et de traitement des cellules.
La présente invention a pour objet un vecteur peptidique de transfection d'une substance chimique sélectionnée dans le groupe constitué par des séquences d'acides nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques pharmacologiquement actives, caractérisé en ce qu'il contient outre ladite substance chimique, au moins un peptide de transfection dérivant en tout ou en partie d'une fibre d'adénovirus et comportant au moins une zone constituée d'au moins 50 % d'aminoacides hydrophobes sélectionnés dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la phénylalanine, l'isoleucine, la leucine, la proline et la méthionine.
Conformément à l'invention, ledit peptide dérive d'une fibre d'un adénovirus sélectionné dans le groupe constitué par Ad2, Ad3, Ad4, Ad7, Ad8, Ad9, Adll, Adl2, Adl5, Adl6, Ad21, Ad40, Ad41, F AVI (CELO) et FAV7 ou d'un fragment de la protéine Vp3 du virus SV40.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur de transfection, ledit peptide de transfection comprend au moins :
- un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides et incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences suivantes : Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO:l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO:2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO:3), Xo-Lys-Arg-Leu-Arg (Xo-KRLR) (SEQ ID NO:4), Xo-Lys-Arg-Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NOS), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg (XoPKKPR) (SEQ ID NO:6), dans lesquelles Xo est nul ou représente Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) ou Ser (S), ou un segment de la protéine Vp3 du virus SV40 et notamment la séquence GPNKKKRKL (SEQ ID NO:24),
- une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 amino- acides, dérivée d'une fibre d'adénovirus et sélectionnée dans le groupe consti- tué par au moins l'une des séquences suivantes Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro- Tyr-X2 (XιFNPVYPYX2) (SEQ ID NO:7), Xι-Phe-Asp-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X2 (X1FDPVΥPYX2) (SEQ ID NO:8), dans lesquelles :
Xi est nul ou représente une séquence d'au plus 43 amino- acides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés acides, et notamment l'une des séquences suivantes : Leu-Ser-Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO:9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO:10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO:ll), Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO:12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO:13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO:14) ou X3-Glu-Asp-Asp (X3EDD) (SEQ ID NO:15) dans laquelle X3 représente Ala (A), Val (V), Leu (L), Phe (F) ou Ile (I) et
X2 est nul ou représente une séquence d'au plus 43 amino- acides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés, et notamment l'une des séquences suivantes : Glu-Asp-Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO:16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO:17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO:18), Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO:19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO:20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) (SEQ ID NO:21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO:22) ou Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO:23) et
- une séquence polymérique d'aminoacides basiques ou une séquence polymérique cationique ou un polyalcool.
On entend par : - aminoacides hydrophobes, les aminoacides suivants : Ala,
Val, Leu, Ile, Pro, Phe et Met ;
- aminoacides chargés acides, les aminoacides suivants : Asp et Glu ;
- aminoacides chargés basiques, les aminoacides suivants : Lys, Arg et ornithine ; et - aminoacides polaires neutres, les aminoacides suivants : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, His et Trp.
De manière avantageuse, ledit peptide de transfection est branché et comprend au moins deux fragments dérivant d'une fibre d'adénovirus ; lesdits fragments comportent chacun un segment d'une séquence NLS et une séquence hydrophobe, tels que définis ci-dessus et sont reliés entre eux par une séquence polymérique telle qu'une séquence polymérique d'aminoacides basiques.
Lorsque la substance chimique est une séquence d'acide nucléique, elle est sélectionnée parmi les gènes qui codent pour un poly- peptide présentant une activité thérapeutique, les séquences anti-sens et les ribozymes.
Dans le cas d'une séquence codante, elle comprend en outre un promoteur actif pour l'expression du poly peptide. Ledit promoteur est notamment sélectionné dans le groupe constitué par des promoteurs constitutifs et des promoteurs inductibles.
De manière surprenante, un tel vecteur peptidique de transfection ne comprenant pas de lipides (sous forme de liposomes, par exemple), ni de base du penton est apte à transfecter, de manière efficace, notamment des séquences d'acide nucléique de n'importe quelle taille, jusqu'au noyau et ce sans empoisonner la cellule transfectée.
Dans tous les cas, la séquence d'acide nucléique exogène, la protéine d'intérêt ou toute autre substance chimique, associée au dit vecteur de transfection pénètre dans la cellule (internalisation). De manière surprenante, l'interaction peptide de transfection- récepteur cellulaire accroît, de manière significative, à la fois l'internalisation du vecteur de transfection et la perméabilité des endosomes, ce qui augmente, de manière significative, le passage de l'acide nucléique exogène, de la protéine d'intérêt ou de toute autre substance chimique des endosomes vers le cytoplasme et vers le noyau, en comparaison avec l'utilisation d'un vecteur incluant des lipides (sous la forme de liposomes, par exemple).
De tels vecteurs peptidiques de transfection se révèlent, de manière surprenante, plus efficaces et moins toxiques que des compositions contenant des liposomes (lipides cationiques ou lipofectants).
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur de transfection, ledit peptide de transfection comprend au moins :
- un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides et incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences suivantes : Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO:l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO:2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO:3), Xo-Lys-Arg-Leu-Arg (Xo-KRLR) (SEQ ID NO:4), Xo-Lys-Arg-Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NO:5), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg (XoPKKPR) (SEQ ID NO:6), dans lesquelles Xo est nul ou représente Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) ou Ser (S), ou un segment de la protéine Vp3 du virus SV40 et notamment la séquence GPNKKKRKL (SEQ ID NO:24),
- une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 aminoacides, dérivée d'une fibre d'adénovirus et sélectionnée dans le groupe consti- tué par au moins l'une des séquences suivantes Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro- Tyr-X2 (XιFNPVYPYX2) (SEQ ID NO:7), Xι-Phe-Asp-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X2 (X1FDPVYPYX2) (SEQ ID NO:8), dans lesquelles :
Xi est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés acides, et notamment l'une des séquences suivantes : Leu-Ser-Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO: 9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO:10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO:ll), Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO:12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO:13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO:14) ou X3-Glu-Asp-Asp (X3EDD) (SEQ ID NO:15) dans laquelle X3 représente Ala (A), Val (V), Leu (L), Phe (F) ou Ile (I) et
X2 est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés, et notamment l'une des séquences suivantes : Glu-Asp-Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO:16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO:17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO:18), Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO:19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO:20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) (SEQ ID NO:21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO:22) ou Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO:23), lequel peptide de transfection est associé à une séquence polymérique d'aminoacides basiques, un polymère cationique ou à un poly alcool.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur peptidique de transfection, la séquence polymérique d'aminoacides basiques comprend entre 10 et 50 résidus d'aminoacides, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'arginine et l'ornithine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur peptidique de transfection, la séquence polymérique cationique est sélectionnée dans le groupe constitué par les polyamines et les polymères d'ammonium quaternaire ; une poly aminé préférée est la polyéthylèneimine (PEI).
Conformément à l'invention, ledit poly alcool est de préférence en C3-C20, et notamment du glycérol ou des dextrans.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur peptidique de transfection, la séquence NLS est à l'extrémité N-terminale du peptide de transfection et la séquence polymérique d'aminoacides basiques est à l'extrémité C- terminale dudit peptide de transfection.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur peptidique de transfection, lorsque la substance chimique est un acide nucléique, le rapport peptide de transfection/ acide nucléique est compris entre 0,3:1 et 15:1, de manière préférée entre 2:1 et 6:1, de préférence entre 4:1 et 6:1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur peptidique de transfection, il est associé à un ligand de ciblage. L'invention a également pour objet une composition, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par un vecteur de transfert tel que défini ci-dessus et un véhicule convenable sélectionné dans le groupe constitué par les sels biliaires, les antiprotéases, les cyclodextrines et leurs dérivés, les antiseptiques et les poly ois. Les compositions selon l'invention ont de nombreuses applications comme médicaments, en médecine humaine et vétérinaire :
- en thérapie génique humaine et animale, notamment dans les maladies héréditaires,
- comme agents antiviraux (séquences anti-sens ou ribo- zymes),
- comme agents immunogènes ou vaccinaux,
- comme agents antibactériens, anticancéreux etc..
La présente invention a également pour objet un procédé de transfection in vitro de cellules eucaryotes avec une substance chimique sélec- tionnée dans le groupe constitué par des séquences d'acides nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques pharmacologiquement actives, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact et l'incubation d'un vecteur peptidique de transfection conforme à l'invention, dans un tampon de dilution comprenant du NaCl 100-150 mM avec des cellules euca- ryotes pendant 15 à 120 minutes à température ambiante, le rapport substance chimique à transfecter : peptide de transfection étant compris entre 0,3:1 et 15:1, de manière préférée entre 2:1 et 6:1, de préférence entre 4:1 et 6:1.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre le transfert du gène de la luciférase avec le peptide I, en fonction du temps (figure 1A) ou en fonction de la concentration en NaCl (figure 1B).
- la figure 2 illustre la cinétique de l'expression du gène de luciférase ; cette figure comporte en abscisse les rapports peptide de transfection/ ADN ou DOT AP/ ADN et en ordonnées, le pourcentage de transfection à Jl (B), J2 (H), J3 (B) et J6 (0) ; - la figure 3 représente les migrations obtenues sur un gel de retardement, en fonction de la quantité de peptide de transfection ;
- la figure 4 illustre les transfections obtenues avec les liposomes DOSPER et DOTAP ; cette figure comporte en abscisse les rapports liposomes/ ADN et en ordonnées les RLU (Related Light Unit)/ 10sec /105 cellules ;
- la figure 5 illustre la cinétique d'entrée dans les cellules d'un peptide (peptide I), observée en microscopie conf ocale ; la colonne A montre le peptide fluorescent et la colonne B montre les acides nucléiques cellulaires colorés au iodure de propidium ; - la figure 6 illustre l'inhibition de la transfection par le peptide I, après une préincubation avec un excès de peptide I. Les cellules HeLa dans des plaques comportant 24 puits sont préincubées avec le peptide I pendant une heure à 4°C à des concentrations de 10 à 50 μg/ml, respectivement ; - la figure 7 représente quelques séquences de fibres d'adénovirus.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Matériel et méthodes.
- Cellules, plasmide et peptides :
Les cellules HeLa sont cultivées à 37°C dans un milieu EMEM supplémenté en sérum de veau foetal à 10 % sous une atmosphère contenant 5 % de C02.
Un vecteur reporter de la luciférase (plasmide pGL3, Promega), est utilisé pour démontrer la transfection.
Le peptide IC comprend la séquence n° 2, la séquence n° 10, la séquence n° 7, la séquence n° 16, de l'extrémité N-terminale à l' extrémité C- terminale et 10 lysines ; ce peptide correspond aux 20 résidus N-terminaux de la fibre d'Ad3. Le peptide I contient ces mêmes 20 aminoacides N-terminaux de la fibre d'Ad3 et 20 lysines ; les peptides ont été obtenus par synthèse en phase solide, suivie d'une purification par HPLC.
Ce peptide I est marqué à la fluorescéine ; des peptides comprenant 10 lysines au lieu de 20, ont été également préparés. L'intégrité de l'ensemble des peptides est vérifiée par spectroscopie de masse.
- Gel de retardement :
500 ng d'ADN plasmidique (pGL3) sont préincubés avec différentes quantités de peptides pendant 5 min à température ambiante, puis soumis à une électrophorèse sur gel d' agarose à 1 % préparé dans un tampon TBE.
Après électrophorèse à 50 V dans le tampon TBE pendant 30 min, l'ADN sur le gel étant coloré au bromure d'éthidium et visualisé en lumière ultraviolette. - Transfections :
1,5 à 12 μg de peptide I dans 50 μl de tampon de dilution (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM) sont incubés avec 1,5 μg de plasmide pGL3 dans 250 μl de milieu EMEM pendant 15 à 30 min à température ambiante.
Le mélange de DOTAP ou de DOSPER avec 1,5 μg de plasmide pGL3 est préparé selon les instructions du fabricant (Boehringer). Pour les études de l'effet du peptide sur la transfection en présence des liposomes, des portions de peptides sont mélangées avec le DOTAP ou le DOSPER dans le tampon de dilution défini plus haut pendant 15 à 30 min à température ambiante, puis 1,5 μg de plasmide pGL3 est ajouté et incubé 15 min à température ambiante.
Les transfections sont réalisées dans des plaques comportant
24 puits (Beckton Dickinson) avec 1,5 x 105 cellules/ puits (confluence d'environ 50 %) pendant 1 h à 37°C. Après 24 h, l'émission lumineuse est mesurée dans les lysats cellulaires avec le test Promega Luciférase Assay System.
- Test hémolytique :
Des érythrocytes humains sont lavés 3 fois avec du tampon PBS. 106 érythrocytes sont incubés avec 6 μg de peptide I pendant différentes périodes de temps à 37°C. Après centrifugation à 10 000 g pendant 5 min, la densité optique du surnageant est mesurée à 540 nm.
- Internalisation du peptide :
Des cellules HeLa, cultivées sur lamelles (105 cellules/ lamelle) sont traitées avec de la sérum albumine bovine à 3 % dans du EMEM pendant 15 min à 37°C. Les cellules sont lavées deux fois avec du tampon PBS, incubées avec 40 μg/ml de peptide I marqué à la fluorescéine pendant différentes durées à 37°C, fixées avec du paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS pendant 20 min à 37°C, lavées avec du PBS et colorées avec 1 μg/ml d'iodure de propidium dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Les lamelles sont montées sur une lame de microscope avec du 1,4-diazabicyclooctane (Sigma) et observées sur un microscope confocal MRC600 (BioRad). * Résultats :
- Transfection cellulaire avec le peptide I :
Toutes les expériences ont été réalisées avec des cellules HeLa transfectées par le plasmide pGL3 (Stratagene) portant le gène de la luciférase. Pour des rapports peptide I/ADN égaux à 2, le temps optimal d'interaction entre les complexes transfectants et les cellules est compris entre 60 et 120 min
(figure 1A).
L'effet des concentrations de NaCl a été testé pendant 1 h de transfection sur l'expression génique mesurée 24 h après la transfection (figure 1B).
Il existe un optimum de transfection pour des rapports peptide I/ADN compris entre 4 et 6 et pour une concentration en NaCl de 125 mM. Les concentrations inférieures à 100 mM et supérieures à 150 mM semblent inhibitrices. L'expression du transgène peut être observée jusqu'à 6 jours après la transfection (figure 2). Cependant, l'addition de sérum à 2 % abolit complètement la transfection avec le peptide I.
Le comportement des complexes ADN/ peptide est analysé sur des gels à retardement. Théoriquement, 526 molécules de peptide sont nécessaires pour neutraliser les charges de phosphate portées par le plasmide
(5256 pb), ce qui signifie que 322 ng de peptide I sont nécessaires pour la neutralisation complète de 500 ng de plasmide.
La figure 3 montre que l'incubation avec 250 ng de peptide entraîne un retardement de la migration de l'ADN et l'addition de 500 ng de peptide stoppe complètement sa migration, ce qui est en accord avec les considérations théoriques exposées ci-dessus.
L'efficacité de transfection la plus importante est observée lorsque l'on a un excès de l'ordre de 4, de charges neutralisantes peptidiques par rapport à l'ADN (figure 1B), ce qui confirme que le transfert du gène n'intervient qu'en présence d'un excès de charges positives. - Paramètres intervenant sur l'efficacité de la transfection par le peptide selon l'invention :
Les peptides selon l'invention comprennent essentiellement 3 domaines, le signal de localisation nucléaire, le domaine hydrophobe et le polymère basique.
Pour étudier l'effet de la structure du peptide sur la transfection d'ADN, une série de peptides dans lesquels les différentes parties du peptide I ont été éliminées, dont les séquences sont illustrées au Tableau I ci- après : TABLEAU I
Figure imgf000019_0001
* dans lesquelles Xo = A.
Les résultats obtenus avec ces différents peptides sont illustrés au Tableau II ci-après. TABLEAU II
Figure imgf000020_0001
Les résultats présentés dans le Tableau II montrent que l'efficacité de transfection dépend de la présence de la séquence signal de localisation nucléaire de la protéine de fibre d'adénovirus.
Il n'y a aucune transfection lorsque l'on retire le domaine NLS (peptide ID), la polylysine (peptide IA) ou à la fois le domaine NLS et la zone hydrophobe (peptide Kαo et peptide K20). L'élimination du domaine hydrophobe entre la partie NLS et la partie polylysine induit un effet significatif : ce peptide (peptide IE) est environ 30 fois moins efficace que le peptide IC. Même si le peptide ID est encore capable d'attacher et de condenser l'ADN et d'entrer dans la cellule, il semble cependant incapable de transporter cet ADN dans le noyau. Il ressort également de ces résultats que lorsque l'on diminue le nombre de lysines présent dans le polymère polylysine (peptide IC), on observe un modeste effet négatif sur l'efficacité de transfection qui peut être contrebalancé en augmentant la quantité de peptide nécessaire pour un transfert efficace.
Le Tableau III ci-après illustre d'autres résultats obtenus avec le peptide I ou le peptide IA, en présence de glycérol ou de PEI et le peptide LU.
TABLEAU III
Figure imgf000021_0001
Le vecteur peptidique comprenant le peptide I et la PEI
(complexe covalent) est plus efficace que la PEI (polyéthylène imine) seule.
L'efficacité de transfection est significativement supérieure pour ce qui concerne le complexe covalent. On peut dire qu'l μg de peptide I/PEI donne 54 000-67 000
RLU, tandis qu'l μg de PEI donne 13 000-22 000 RLU.
- Effet du peptide sur la transfection en présence de liposomes :
Deux liposomes ont été utilisés, le liposome DOTAP et le lipo- some DOSPER, tous deux commercialisés par Boehringer. Ils sont constitués de lipides cationiques avec des liaisons esters internes capables d'être dégradées par les estérases ou les lipases cellulaires, ce qui devrait conférer à ces liposomes une cytotoxicité inférieure à celle observée avec d'autres liposomes. Les conditions de transfection des cellules HeLa ont été optimisées pour les liposomes seuls (figure 4). La transfection avec le liposome DOTAP conduit à des efficacités inférieures à celles observées avec le liposome DOSPER ; cependant, les transfections avec le liposome DOTAP ont tendance à présenter un plateau au dessus d'un certain rapport ADN/ liposome, tandis que les transfections avec le liposome DOSPER présentent un pic. Pour les transfections simultanées peptide/ liposome, l'ordre dans lequel ces composés sont ajoutés est important, puisque l'on observe une efficacité supérieure (augmentation de plusieurs facteurs), lorsque le liposome est d'abord mélangé avec le peptide (et non avec l'ADN) puis lorsque l'ADN plasmidique est ajouté après 15 min d'incubation à température ambiante.
Le Tableau IV ci-après illustre les résultats obtenus. TABLEAU IV RLU/10 sec/105 cellules x 103
Figure imgf000022_0001
Les résultats illustrés à ce Tableau IV ont été obtenus dans les conditions suivantes : des portions du peptide I sont mélangées avec 1,5 μg de plasmide pGL3 dans 300 μl de tampon de dilution pendant 15 min à température ambiante.
Le liposome DOTAP est mélangé avec 1,5 μg de plasmide pGL3 dans un rapport DOTAP/ ADN de 2 ou de 4 (v/p), dans 300 μl de tampon de dilution pendant 15 min à température ambiante.
De manière surprenante, ces résultats montrent qu'en l'absence de liposomes, on observe avec le peptide seul dans des rapports peptide/ ADN de 4, des résultats supérieurs à ceux observés avec le mélange liposome/ peptide.
- Localisation intracellulaire du peptide :
La distribution cellulaire du peptide I fluorescent est suivie en microscopie confocale (figure 5).
Les premières observations, effectuées 2 min après la transfec- tion, montrent une certaine quantité de signal à la périphérie de la cellule.
5 à 10 min après l'addition du peptide, on observe un signal cytoplasmique fort, indiquant l'entrée du peptide dans la cellule.
A 30 min, le signal est également observé dans le noyau et un signal très brillant est observé dans les nucléoles. Ce transfert important vers les nucléoles est particulièrement surprenant.
Les observations réalisées entre 60 et 120 min montrent le passage du peptide à nouveau dans le cytoplasme et à la périphérie de la cellule jusqu'à la perte totale du signal.
Les résultats illustrés à cette figure 4 ont été obtenus avec des concentrations en peptide deux fois plus importantes (40 μg/ml) que celles utilisées pour les essais de transfection d'ADN. Lorsque l'on utilise les concentrations habituelles pour les transfections, l'accumulation de peptides est plus lente, mais suit les mêmes étapes que celles précisées ci-dessus. >
- Mécanisme de l'internalisation du peptide :
Un test hémolytique réalisé avec le peptide I sur des érythrocytes donne des résultats négatifs qui montrent que l'interaction de la cellule avec le peptide I n'est pas liée à la formation de pores. Dans la mesure où l'on observe aucune expression de luciférase lorsque les transfections sont réalisées à 4°C, il semble que le mécanisme de l'internalisation du peptide dépend de l'endocytose et implique le cytosquelette.
Pour déterminer s'il existe des sites d'attachement spécifique du peptide I à la membrane plasmatique, des cellules ont été préincubées avec le peptide I à 4°C pendant 2 h, de manière à essayer de saturer les éventuels sites d'attachement du peptide.
Il en est résulté une inhibition totale de la transfection (figure 6), qui indique que cette dernière implique une endocytose récepteur dépendante. - Taille du complexe transfectant :
On peut utiliser la dispersion de la lumière pour mesurer la taille des complexes et leur distribution, s'il y a une formation de population mixte. Dans ces conditions, on peut étudier l'effet du temps d'incubation sur la formation des complexes transfectants. La taille est mesurée immédiatement après le mélange et 1 h après. Les complexes réalisés par mélange du liposome DOTAP avec un plasmide d'ADN ont un diamètre d'environ 115 nm et leur taille ne change pas pendant l'incubation.
Les complexes ADN/ peptide I sont plus grands et présentent un diamètre d'environ 350-360 nm. De plus, la formation du complexe est un processus dynamique puisque l'on observe une augmentation rapide de la taille en fonction du temps d'incubation lorsque plus de 90 % des complexes atteint un diamètre 660-1100 nm après 1 h.
La taille et la distribution des complexes avec le peptide I est similaire quel que soit le rapport peptide/ ADN (de 1 à 8). L'effet de la taille du complexe sur l'efficacité de la transfection a été étudié en utilisant des complexes préparés en faisant varier la période d'incubation à température ambiante. Les résultats sont illustrés au Tableau V ci-après. TABLEAU V
RLU/10 sec/105 cellules x 103
Figure imgf000025_0001
De manière surprenante, avec les complexes selon l'invention, même de très grands agrégats peuvent être transfectés.
Pour mesurer la taille de la substance transfectée, des mesures de dispersion de la lumière ont été réalisées avec un laser ion-argon (Spectra Physics 1161) à 488 nm et 150 mW (géométrie de dispersion à 90°). Le spectre est accumulé pendant 200 s en utilisant un corrélateur Malvern 7032 (Malvern Instruments) puis répété 1 h après. Tous les spectres sont en mode homodyne : les amplitudes de la fonction de corrélation d'intensité avec un retard nul sont consistantes avec le facteur de cohérence spécial β obtenu avec une suspension de latex dilué, à savoir β = 0,90.
Les rayons hydrodynamiques RH sont calculés en utilisant la procédure multimodale Malvern (Pike-Ostrowsky), pour caractériser les principaux taux de dégradation de la fonction de corrélation de champs avec la relation de Stokes-Einstein RH = kβTQ2/ (όπηTl), dans laquelle ri est le taux de dégradation principale, T est la température absolue du bain thermique (298 K), Q le vecteur d'onde de transfert et η la viscosité du solvant. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Vecteur peptidique de transfection d'une substance chimique sélectionnée dans le groupe, constitué par des séquences d'acides nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques pharma- cologiquement actives, caractérisé en ce qu'il contient outre ladite substance chimique, au moins un peptide de transfection dérivant en tout ou en partie d'une fibre d'adénovirus et comportant au moins une zone constituée d'au moins 50 % d'aminoacides hydrophobes sélectionnés dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la phénylalanine, l'isoleucine, la leucine, la proline et la méthionine.
2°) Vecteur de transfection selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide de transfection dérive en tout ou en partie d'une fibre d'un adénovirus sélectionné dans le groupe constitué par Ad2, Ad3, Ad4,
Ad7, Ad8, Ad9, Adll, Adl2, Adl5, Adl6, Ad21, Ad40, Ad41, FAV1 (CELO) et FAV7.
3°) Vecteur de transfection selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide dérive en partie de la protéine Vp3 du virus SV40.
4°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit peptide de transfection comprend au moins :
- un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides et incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences suivantes : Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO:l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO:2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO:3), Xo-Lys-Arg-Leu-Arg (XoKRLR) (SEQ ID NO:4), Xo-Lys-Arg-Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NO:5), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg (XoPKKPR) (SEQ ID NO:6), dans lesquelles Xo est nul ou représente Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) ou Ser (S), ou un segment de la protéine Vp3 du virus SV40 et notamment la séquence GPNKKKRKL (SEQ ID NO:24), - une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 aminoacides, dérivée d'une fibre d'adénovirus et sélectionnée dans le groupe constitué par au moins l'une des séquences suivantes Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro- Tyr-X2 (X1FNPVYPYX2) (SEQ ID NO:7), Xι-Phe-Asp-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X2 (XιFDPVYPYX2) (SEQ ID NO:8), dans lesquelles :
Xi est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés acides, et notamment l'une des séquences suivantes : Leu-Ser-Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO:9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO:10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO:ll), Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO:12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO:13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO:14) ou Xs-Glu-Asp-Asp (X3EDD) (SEQ ID NO:15) dans laquelle X3 représente Ala (A), Val (V), Leu (L), Phe (F) ou Ile (I) et
X2 est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés, et notamment l'une des séquences suivantes : Glu-Asp-Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO:16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO:17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO:18), Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO:19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO:20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) (SEQ ID NO:21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO:22) ou Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO:23) et
- une séquence polymérique d'aminoacides basiques ou une séquence polymérique cationique ou un polyalcool.
5°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides et incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences suivantes : Xo-Lys- Arg-Val-Arg (XoKRVR) (SEQ ID NO:l), Xo-Lys-Arg-Ala-Arg (XoKRAR) (SEQ ID NO:2), Xo-Lys-Arg-Ser-Arg (XoKRSR) (SEQ ID NO:3), Xo-Lys-Arg-Leu-Arg (Xo-KRLR) (SEQ ID NO:4), Xo-Lys-Arg^Thr-Arg (XoKRTR) (SEQ ID NO:5), Xo- Pro-Lys-Lys-Pro-Arg (XoPKKPR) (SEQ ID NO:6), dans lesquelles Xo est nul ou représente Thr (T), Ala (A), Ser-Lys (SK) ou Ser (S), ou un segment de la protéine Vp3 du virus SV40 et notamment la séquence GPNKKKRKL (SEQ ID NO:24),
- une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 aminoacides, dérivée d'une fibre d'adénovirus et sélectionnée dans le groupe consti- tué par au moins l'une des séquences suivantes Xi-Phe-Asn-Pro-Val-Tyr-Pro- Tyr-X2 (X1FNPVYPYX2) (SEQ ID NO:7), Xι-Phe-Asp-Pro-Val-Tyr-Pro-Tyr-X2 (X1FDPVYPYX2) (SEQ ID NO:8), dans lesquelles :
Xi est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés acides, et notamment l'une des séquences suivantes : Leu-Ser-Asp-Ser (LSDS) (SEQ ID NO:9), Leu- Ser-Thr-Ser (LSTS) (SEQ ID NO:10), Leu-Ser-Ser-Ser (LSSS) (SEQ ID NO:ll), Pro-Ser-Glu-Asp-Thr (PSEDT) (SEQ ID NO:12), Val-Asp-Asp-Gly (VDDG) (SEQ ID NO:13), Thr-Gln-Tyr-Ala-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp (TQYAEETEENDD) (SEQ ID NO:14) ou X3-Glu-Asp-Asp (X3EDD) (SEQ ID NO:15) dans laquelle X3 représente Ala (A), Val (V), Leu (L), Phe (F) ou Ile (I) et
X2 est nul ou représente une séquence d'au plus 43 aminoacides, de préférence une séquence de 5 à 15 aminoacides, comprenant des aminoacides hydrophobes et/ ou polaires et/ ou chargés, et notamment l'une des séquences suivantes : Glu-Asp-Glu-Ser (EDES) (SEQ ID NO:16), Asp-Thr- Glu-Thr (DTET) (SEQ ID NO:17), Asp-Ala-Asp-Asn (DADN) (SEQ ID NO:18), Asp-Pro-Phe-Asp (DPFD) (SEQ ID NO:19), Gly-Tyr-Ala-Arg (GYAR) (SEQ ID NO:20), Glu-His-Tyr-Asn (EHYN) (SEQ ID NO:21), Asp-Thr-Ser-Ser (DTSS) (SEQ ID NO:22) ou Asp-Thr-Phe-Ser (DTFS) (SEQ ID NO:23), lequel peptide de transfection est associé à une séquence polymérique d'aminoacides basiques, à un polymère cationique ou à un polyalcool.
6°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence polymérique d'aminoacides basiques comprend entre 10 et 50 résidus d'aminoacides, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'arginine et l'ornithine.
7°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence polymérique cationique est sélectionnée dans le groupe constitué par les aminés polymériques. 8°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la séquence NLS est à l'extrémité N- terminale du peptide de transfection et la séquence polymérique d'aminoacides basiques est à l'extrémité C-terminale dudit peptide de transfection. 9°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que lorsque la substance chimique est un acide nucléique, le rapport peptide de transfection/ acide nucléique est compris entre 0,3:1 et 15:1, de manière préférée entre 2:1 et 6:1, de préférence entre 4:1 et 6:1. 10°) Vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est associé à un ligand de ciblage.
11°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par un vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et un véhicule convenable sélectionné dans le groupe constitué par les sels biliaires, les antiprotéases, les cyclodextrines et leurs dérivés, les antiseptiques et les poly ois.
10°) Procédé de transfection in vitro de cellules eucaryotes avec une substance chimique sélectionnée dans le groupe constitué par des séquences d'acides nucléiques, des protéines, des peptides et des substances chimiques pharmacologiquement actives, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact et l'incubation d'un vecteur de transfection selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans un tampon de dilution comprenant du NaCl 100-150 mM avec des cellules eucaryotes pendant 15 à 120 minutes à température ambiante, le rapport substance chimique à transfecter sur peptide de transfection étant compris entre 0,3:1 et 15:1, de manière préférée entre 2:1 et 6:1, de préférence entre 4:1 et 6:1.
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