WO1999000365A1

WO1999000365A1 - Novel nitroxyl compounds and drugs and reagents containing the same as the active ingredient

Info

Publication number: WO1999000365A1
Application number: PCT/JP1998/002868
Authority: WO
Inventors: Hideo Utsumi; Hiroaki Sano; Masaichi Naruse; Takashi Igarashi; Tetsuo Oi
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 1999-01-07
Anticipated expiration: 1999-12-27
Also published as: EP0995740A1; EP0995740A4; AU7934298A; US6239145B1; JP3350060B2

Description

明細書新規な二卜口キシル化合物並びにこれを有効成分とする医薬および試薬技術分野本発明は、新規な二トロキシル化合物並びにこれを利用する医薬もしくは試薬に関し、更に詳細には、生体内において加水分解を受ける新規なニトロキシル化合物および生体組織に存在する活性酸素ゃフリーラジカルに起因する虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害の疾患を治療する医薬や、脳、心臓あるいはそれ以外の生体組織中の活性酸素ゃフリ一ラジカルに関する情報を、磁気情報として得ることにより、腫瘍や虚血性疾患等の活性酸素もしくはフリ一ラジカルに関連する疾患を診断する試薬に関する。背景技術活性酸素とは、短寿命ながら反応性に富み、さまざまな生体内酸化反応に関与する酸素種と定義できる。その範囲は定義により違ってくるが、狭義の意味では、ヒドロキシルラジカル（. O H ) 、スーパ一才キサイド（0₂— ) 、一重項酸素（¹0 、過酸化水素（ H ₂0₂ ) を指す _c 広義の意味では、上記の活性種と生体成分（例えば不飽和脂肪酸 L ) との反応に由来するペル才キシラジカル（ L OO. ) やアルコキシラジカル（ L O . ；) および H₂〇₂と C 1—からミエ口ペル才キシダ一ゼなどとの反応で生成する次亜塩素酸イオン（C 1 0-) なども活性酸素である。

ヒドロキシルラジカル、スーパ一才キサイド、ペル才キシラジカルおよびアルコキシラジカルはラジカルであるが、ラジカルとは、 1個又はそれ以上の不対電子を有する原子あるいは分子と定義される。一方、 —重項酸素や過酸化水素はそれ自身ラジカルではないが、ある種のラジカル反応から生じたり、他のラジカル反応を起したりするものである。生体内でさまざまな生理活性を示す活性酸素やフリーラジカルが近年、生物学、医学及び薬学の分野で注目され、研究が進められている。この活性酸素や、フリーラジカルが生体内で生成する原因としては、紫外線、放射線、大気汚染、酸素、金属イオン、虚血 ·再灌流などが挙げられ o

これらの原因により発生した活性酸素や生体内フリーラジカルは、月旨質を過酸化し、蛋白を変性し、核酸を分解するなど各種の生体内反応を起こす。そして、このような現象にともなう疾患としては、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などが知られている。このように活性酸素や生体内フリーラジカルは、数々の疾患と関係しているので、これを体外より非侵襲的に検出できれば、数々の疾患の原因究明ができ、医学上有用な情報となりうる。

従来より知られているフリ一ラジカルの検出法としては、反応系に反応試薬をいれ、その結果起こる反応系の吸光度の変化や発光を検出する間接法とフリーラジカルの不対電子を直接検出する電子スピン共鳴（E1 ectoron Spi n Resonance ； E S R ) 法とがある _Q E S R法は溶液、固体の何れの試料でも測定でき、不透明のものゃ不均一系試料でも測定対象になるため、採取された生体試料中や生体中の活性酸素の検出にはきわめて有利となる。一 -

しかし、これまで一般的に使用されてきた E S R装置は、 x _バンド (約 9 . 5 G H z ) のマイク口波が用いられていたため、水による誘電損失が大きく、大容量の生体試料の計測は不可能であった。最近、低周波のマイク口波を用いる E S R装置（ 3 0 0〜2 0 0 0 M H z ) が開発され、水分の多い大容量試料、特に生物個体中のフリーラジカルのィン · ビボ（i n vi vo) 測定が可能になりつつある。

この二卜口キシル化合物をプローブとする生体計測 E S R法の原理は、生体内に投与された安定なラジカルが生体内で活性酸素ゃフリーラジカルなどと反応して還元を受け常磁性を失なうので、このシグナル変化を測定、解析することにより、非侵襲的に生体内活性酸素やフリーラジカル反応を画像化するというものである。従って、 E S R法を実施するためには、 E S R造影剤とでもいうべき安定なラジカル化合物を含有する診断剤の提供が必須であった。

—方、核磁気共鳴（Nucl ear Magneti c Resonance； N M R ) 法の原理は、 1 9 4 5年に発見されたが、それを医療用の画像化装置（Magneti c Resonance Imagi ng； M R I ) に応用したのは、 1 9 7 3年の Lauterbur が最初である。その後のこの診断法の進歩はめざましく、現在では、もっとも汎用される診断法の一つとなった。

M R Iは当初、造影剤の必要としない診断方法として登場したが、陰影のつきにくい病変部位の検出能を高めるのために、現在、造影剤の使用の有用性が認識され、一般化している。それに伴いより検出能の高い造影剤の出現が望まれている。

また、脳には多数の神経細胞があり、その活動に伴なう起電力の変化は脳電図（el ectroencephal ogram、 E E G ；脳波）として広く用いられている。一方、このような起電力に伴なう神経を流れる電流はその周囲に磁場を作り、これにより作られる磁界の記録を脳磁図（magnetoene 一一

phal ogram, M E G ) と呼ばれる。磁場の強さ及び方向は、電流の位置、強さ及び方向で決まるため、脳磁場の測定は、脳波の測定と基本的に等価である。脳電図は、生体の電気伝導度が一定でなく組織や骨などで大き〈変わること、電位の強度情報しか得られないことから、正確に活動部位を推定することは困難である。

これに対し、生体磁気に起因する磁場変化を計測する脳磁図は、生体組織中の磁場の透過率が空気中とほぼ等しく一定で磁場が歪まないので、正確に活動部位を推定することが可能である。しかしながら、脳からの磁界は地磁気の 1億分の 1 と極めて微弱なため、その計測には高感度な磁気センサ一が必要であり、困難であった。ところが、 2 0年ほど目リ、超電導量子干渉素子 ( Superconducti ng Quantum Interference Devi ce, S Q U I D ) を用いた磁束計が開発され、初めて安定した脳などの生体磁気記録が可能となった。現在では、この磁束計を利用して、脳内神経細胞の活動部位を非侵襲的に外部より画像化できる医療用機器が開発されている。

この診断法は、てんかん発作の焦点発見に利用され、てんかんの外科的治療の適用判定に有用な検査法となりつつある。将来は、アルッハィマ一病の初期症状診断に応用されると期待されているが、上述したように、脳からの磁界が極めて弱いので、これを補う有用な脳磁図用造影剤の登場が望まれている。

非侵襲的測定法である磁気共鳴法により、生体組織内の活性酸素ゃフリーラジカルに関する情報が生体画像として得られれば、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害などのような活性酸素やフリーラジカルが関与していると考えられる病態（以下、「活性酸素等関連疾患」という）の研究及びこれらの疾患又は症状の診断に有用である。一一

ところで、最近、 M R I用造影剤、 E S R用造影剤としての二卜ロキシル化合物の有用性や、その抗酸化作用が注目されている。例えば、医療における M R I診断において、病変部のコントラス卜をつけるために、通常ガドリニゥム等の常磁性無機化合物を造影剤として投与されているが、その毒性が問題となっており、ガドリニウムに代わる新しい M R I造影剤としてニトロキシル化合物が有望視されている。また、 E S Rイメージングが開発され、その有用性が注目されるにつれて、二卜口キシル化合物の画像化剤としての利用価値が高まりつつある。更に、二卜口キシル化合物の活性酸素消去剤としての可能性も示唆されている [例えば」 . Biol . Chem. 263： 17921； 1988 参照] 。

しかしながら、現在提供されているニトロキシル化合物は、生体内での分布状況等その挙動について未だ満足できるものではなく、薬剤としてより性質の優れた二卜口キシル化合物の提供が求められていた。発明の開示本発明者らは、生体内の活性酸素ゃフリ一ラジカルに関する情報を磁気共鳴法ゃ脳磁図による生体画像として得るために利用しうる安定なラジカル化合物を検索していたところ、特定な二卜口キシル化合物は、容易に活性酸素ゃフリ一ラジカルと反応することができ、しかも従来造影が困難であつた脳組織をも造影することができるため、活性酸素ゃフリ —ラジカルに関する情報を磁気共鳴法ゃ脳磁図による生体画像として得るのに有用であることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の式（ I ) -

ひ

(式中、 Aは水素原子または次の基

を、 Lは基一 C O O— または基一アルキレン一 C O O— を示し、 R、 R ,、 R 2 R 3および R 4はそれぞれ炭素数 1 から 4までのアルキル基を示し、 mは 0または 1 の数を、 nは 1 から 4までの数を示す）

で表される二卜口キシル化合物を提供するものである。

また本発明は、上記ニトロキシル化合物（ I ) を有効成分として含有する医薬もし〈は試薬を提供するものである。図面の簡単な説明図 1は、 3 —カルボキシ一プロキシルを用いた場合のマウス脳しバンド E S R— C T像を示す図面である。

図 2は、 3 —カルボキシ—プロキシルメチルエステルを用いた場合のマウス脳 Lバンド E S R— C T像を示す図面である。

図 3は、ァセ卜キシメチル 2 , 2 , 5， 5 —テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3—カルボキシレー卜を用いた場合のマウス脳 Lバンド E S R ― C T像を示す図面である。発明を実施するための最良の態様本発明で用いる二卜口キシル化合物において、基しにおける—アルキレン一 C 0 0—の例としては、メチレンカルボニル才キシ基、エチレンカルボニル才キシ基、テ卜ラメチレンカルボニル才キジ基、メチルェチレンカルボニル才キシ基等が挙げられる。また、基 Rとしては、メチル基、ェチル基、ブチル基、 n—プロピル基、 i —プロピル基等が、 R ,ないし R ₄の例としては、メチル基、ェチル基等がそれぞれ挙げられ o

本発明のニトロキシル化合物（ I ) は、下記式に従い、含窒素璟才キシルカルボン酸（ I I ) のカルボキシル基にハロゲン化エステル化合物 ( III ) を反応せしめることにより製造される。

L CH₂}]TOCOR

(式中、 xはハロゲン原子を、 A' は水素原子または— L Hを示し、 A、 L、 R、 R ι , R ₂、 R ₃、 R₄、 mおよび nは前記した意味を有する）上記反応の原料化合物である、含窒素環才キシルカルボン酸（ II ) およびハロゲン化エステル化合物（ III ) は共に公知であるか、公知化合物の製法に準じて容易に製造できる化合物である。

具体的な含窒素環才キシルカルボン酸（ II ) の例としては、下式で示される 3—カルボキジ一 2 , 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ、 3 _ ( 2 _カルボキシ一 1 —メチルェチル）一 2， 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ、 4—カルボキシー 2， 2 , 6， 6—テトラメチルビベリジニル才キシ、 4一（カルボキシメチル）一 2， 2， 6 , 6 ーテ卜ラメチルピベリジニル才キシ、 4— ( 2—カルボキシェチル）一 -

2 , 2， 6， 6—テ卜ラメチルピぺリジニル才キシ、 3 , 4—ジカルボキシ — 2 , 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ等が挙げられる。

一方、ハロゲン化エステル化合物（III ) の例としては、ァセ卜キシメチルプロミド、プロピオニル才キシメチルプロミド、 n—ブチリル才キシメチルプロミド、 i —ブチリル才キシメチルプロミド、ァセ卜キシェチルプロミド、プロピオニル才キシェチルプロミド、 n—プチリル才キ - -

シェチルプロミド等が挙げられる。

また、上記反応は、カルボキシル基のアルキル化反応であり、一般的なハロゲン化物のアルキル化の条件に従って実施することができる。斯くして得られる本発明の二卜口キシル化合物（ I ) を用いて、医薬や試薬を調製するには、当該化合物を適当な薬学的および化学的に許容される溶媒、例えば、生理食塩水、等張リン酸緩衝液等に溶解し、必要によりプロピレングリコール、ベンジルアルコール等の任意成分を添加して製剤化すれば良い。

本発明のニトロキシル化合物（ I ) を用いた医薬あるいは試薬の好ましい剤形としては、注射剤、点滴用剤、塗布剤、点眼剤等が挙げられる c 本発明二卜口キシル化合物（ I ) の医薬としての使用の例としては、診断用薬剤が挙げられる。この診断用薬剤は、脈管内投与により活性酸素ゃフリーラジカルの存在を検出する活性酸素等関連疾患診断剤として利用することができ、例えば、脳、心臓などの疾患の M R I用造影や脳磁図用あるいは E S R用造影のために用いることができる。

上記薬剤におけるニトロキシル化合物（ I ) の使用量は、その目的や対象となる臓器、疾患によっても異なるが、一般には 0 . 1〜5 0 0 m g / k gとなる程度の量を投与すれば良い。

—方、別の医薬の使用例としては、活性酸素や生体内ラジカルに起因する疾患の予防もしくは治療剤が挙げられる。この予防もし〈は治療剤は、活性酸素やフリーラジカルと反応し、これを消去するので、前記の活性酸素等関連疾患の予防や治療に有効である。

また、上記薬剤は、正常実験動物や疾患モデル実験動物に投与し、正常または疾患時における組織や臓器より発生する活性酸素ゃフリーラジカルを外部より検出し、画像化できる。この結果により、活性酸素ゃフリーラジカルがどの疾患に関与するかを調べるための検出試薬として用 - -

いることができ、医学上有用な情報が得られる。

更に、採取された生体試料を均質化し、適当な緩衝溶液と上記薬剤を加え、適当な時間反応させた後、 E S Rを測定することにより、生体組織中の活性酸素ゃフリ一ラジカルの有無や量を測定することができる検出用試薬として用いることができる。実施例以下、合成例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。実施例 1

ァセトキシメチル 2， 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシー 3—カルボキシレ一卜の合成：

( 1 ) ァセ卜キシメチルブ口ミドの合成

ァセチルブロミド 6.0 m l ( 8 1 .2 m m o 1 ) に室温でパラホルムアルデヒド 2.44 g (顆粒状、 8 1 .2 mm o 1 ) を加え、 80 °C で 30分攪拌した。パラホルムアルデヒドの顆粒が消失したのを確認した後、常圧蒸留（ 1 30— 1 38°C、 750 mm H g ) により精製を行い淡黄色油状物としてァセチルメチルブロミド 4.54 g (収率 3 7 %) を得た。

' H - N R ： 6

5.77 ( 2H，s ) ， 2.1 2 ( 3H, s ) .

( 2 ) ァセトキシメチル 2， 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3 _カルボキシレー卜の合成

3—カルボキシー 2 , 2， 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ - -

(以下、「3—カルボキシプロキシル」と略すことがある） 1 gを（ 5 · 3 7 mm o 1 ) をジメチルホルムアミド 8 m 1 に溶解した。これに室温で卜リェチルァミン 0.74 m l ( 5.3 7 m m o 1 ) を加えた後、 0°Cでァセトキシメチルブロミド 1 .3 1 g ( 8.1 8 mm o l ) を加え、室温で 1 7時間攪拌した。

反応混合物をジクロロメタン 40 m 1で希釈した後水洗し、水層をジク□□メタン 20 m lで抽出した。有機層を合し、水洗、乾燥（M g S 0₄) し、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜（へキサン—酢酸ェチル、 2 : 1 ) で精製した後、再結晶（エーテル—へキサン）を行い、黄色格子状結晶としてァセ卜キシメチル 2 , 2 , 5 , 5— テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3—カルボキシレー卜（ 3—カルボキシ—プロキシルァセ卜キシメチルエステル） 900m g (収率 6 5 %) を得た。

融点： 74 ~ 7 5 °C

I R ( K B r ) ：

3000, 2950, 2880, 1 760 , 1 460 , 1 390, 1 240, 1 1 59， 1 040 , 840 ( c m -¹;)

F A B— MA S S (m/z ; (相対強度））

258 (Μ+, 1 00 ) ， 244 (M⁺-CH_2j 28 ) , 1 86 ( 1 7 ) 】 1 72 ( 1 4 ) , 1 54 ( 2 5 ) , 1 36 ( 1 9 ) , 1 1 1 ( 9 ) 実施例 2

ァセチルブロミドを、他のァシルハライドに代える以外は実施例 1 ( 1 ) と同様にして表 1に示すァシル才キシアルキルハラィドを得た。このハライドを原料とし、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 1 に示すニトロキシル誘導体を合成した。 1

表

ハライドニトロキシル誘導体プロピオニルォキシメプロピオニルォキシメチル 2，2，5, チルブ口ミド 5—亍トラメチルピロリジニル才キシー 3—カルボキシレ一卜 n—ブチリルォキシメ n—プチリルォキシメチル 2,2,5，チルブ口ミド 5—テトラメチルピロリジニルォキシ一 3—カルボキシレ一ト i —ブチリルォキシメ i一プチリルォキシメチル 2,2，5, チルブ口ミド 5—亍トラメチルピロリジニルォキシ一 3—カルポキシレートァセトキシェチルブロァセ卜キシェチル 2,2,5，5—亍卜 5 ラメチルピ口リジニルォキシ一 3—

カルボキシレ一トプロピオニルォキシェプロピオニルォキシェチル 2,2，5, チルブ口ミド 5—テ卜ラメチルピロリジニルォキシー 3—カルボキシレート n—ブチリルォキシェ n—プチリルォキシェチル 2，2,5，チルブ口ミド 5—テトラメチルピロリジニルォキシー 3—カルボキシレ一ト

- -

実施例 3

実施例 1 ( 1 ) およびこれに準じて製造される実施例 2のアジル才キシアルキルハラィドを用い、 3 —カルボキシ一 2， 2 , 5 , 5 —テ卜ラメチルピロリジニル才キシに代えて、 3— ( 2 —カルボキシ— 1 —メチルェチル）一 2 , 2， 5， 5 —テ卜ラメチルピロリジニル才キシを用いる以外は、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 2に示すニトロキシル誘導体を合成した。

2

ハライドニトロキシル誘導体セトキンメナノレジ口ァセ卜キンメチレ 2— (2,2,5,

5 ド、 5—テトラメチルピロリジニルォキシ一3—ィル）ブチレ一卜プロヒォ一リレオキンメプロヒ才一ル才キンメチル 2— （2, チルブ口ミド 2,5,5—亍トラメチルピロリジニルォキシ一3—ィル）ブチレ一ト nーブチリルォキシメ n—ブチリルォキシメチル 2— （2, チルブ口ミド 2， 5， 5—亍トラメチルピロリジニルォキシ一3—ィル）ブチレ一ト i —ブチリルォキシメ ίーブチリルォキシメチル 2— （2, チルブ口ミド 2,5,5—亍トラメチルピロリジニルォキシ一3—^ rル）ブチレ一トァセトキシェチルブロァセトキシェチル 2— (2,2,5,5 5 ド、亍トラメチルピロリジニルォキシ一 3

一ィル）ブチレ一トプロピオニルォキシェプロピオニルォキシメチル 2— （2, ナソレブ口： i 卜 2, 5,b一丁トフメナルヒ口リン一ルォキシ _ 3—ィル）ブチレ一ト n—プチリルォキシェ n—プチリルォキシメチル 2— （2, チルブロミド 2,5,5—亍卜ラメチルピロリジニルォキシ一3—ィル）プチレート

- -

実施例 4

実施例 1 ( 1 ) およびこれに準じて製造される実施例 2のァシル才キシアルキルハラィドを用い、 3—カルボキシー 2， 2， 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシに代えて、 4—カルボキシ一 2， 2 , 6， 6—テ卜ラメチルピペリジニル才キシを用いる以外は、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 3に示す二卜口キシル誘導体を合成した。

3

ハライドニトロキシル誘導体ァセトキシメチルブロァセトキシメチル 2, 2, 6, 6—亍ト 5ド' ラメチルピペリジニルォキシ一4—

カルボキシレ一トプロピオニルォキシメプロピオニルォキシメチル 2,2,6, チルブ口ミド 6—テ卜ラメチルピペリジニルォキシー 4—カルボキシレート n—プチリルォキシメ n—プチリルォキシメチル 2,2,6，チルブ口ミド 6—テトラメチルビペリジニルォキシー 4一カルボキシレ一ト i 一プチリルォキシメ i 一プチリルォキシメチル 2，2,6, チルブ口ミド 6—亍トラメチルビペリジニルォキシ一 4一カルボキシレ一トァセトキシェチルブロァセトキシェチル 2，2,6,6—亍ト 5 ラメチルピペリジニルォキシ一 4一

カルボキシレー卜プロピオニルォキシェプロピオニルォキシェチル 2，2,6，チルブ口ミド 6—亍トラメチルビペリジニルォキシー 4一力ルポキシレート n—プチリルォキシェ n—ブチリルォキシェチル 2,2,6, チルブ口ミド 6—テトラメチルビペリジニル才キシー 4一力ルポキシレー卜

- -

実施例 5

実施例 1 ( 1 ) およびこれに準じて製造される実施例 2のアジル才キシアルキルハラィドを用い、 3—カルボキシー 2 , 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシに代えて、 4一（カルボキシメチル） — 2 , 2 , 6 , 6—テ卜ラメチルピペリジニル才キシを用いる以外は、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 4に示す二卜口キシル誘導体を合成した。

4

ハライドトロキシル誘導体ァセトキシメチルブロァセトキシメチル 2，2,6,6—亍ト 5ド、ラメチルピペリジニルォキシ一 4一

ァセテ一卜プロピオニル才キシメプロピオニルォキシメチル 2,2,6，チルブ口ミド 6—テトラメチルピペリジニルォキシ一 4—ァセ亍一卜 n—ブチリルォキシメ n—プチリルォキシメチル 2,2,6, チルブ口ミド 6—亍トラメチルビペリジニルォキシ一 4—ァセテ一ト i 一プチリルォキシメ i —ブチリルォキシメチル 2,2,6，チルブ口ミド 6—テトラメチルビベリジ二ルォキシ一 4—ァセ亍一トァセトキシェチルブロァセトキシェチル 2,2,6,6—テトラメチルピぺリジニルォキシ一 4 - ァセ亍一ト

プロピオニルォキシェプロピオニルォキシェチル 2,2,6，チルブ口ミド 6—テ卜ラメチルピペリジニルォキシ一 4一ァセテ一ト n—ブチリルォキシェ n—ブチリルォキシェチル 2,2,6，チルブ口ミド 6—テトラメチルビペリジニルォキシー 4ーァセテ一卜

- -

実施例 6

実施例 1 ( 1 ) およびこれに準じて製造される実施例 2のァシル才キシアルキルハラィドを用い、 3—カルボキシ一 2 , 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシに代えて、 4— ( 2—カルボキシェチル）一 2 , 2， 6， 6—テ卜ラメチルピペリジニル才キシを用いる以外は、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 5に示す二卜口キシル誘導体を合成した。

5

ハライドニトロキシル誘導体ァセトキシメチルブ口ァセトキシメチル 2— (2,2,6,

6—亍トラメチルビベリジ二ルォキシー 4一ィル）プロピオネート

B

フロヒォニルォキシメプロピオニルォキシメチル 2— （2，チルブロミド 2, 6，6—亍卜ラメチルピペリジニルォキシ一4一ィル）プロピオネート n—プチリル才キシメ n—プチリルォキシメチル 2— （2, チルブ口ミド 2,6,6—テトラメチルビペリジニル才キシ一 4一ィル）プロピオネート i 一プチリルォキシメ i 一プチリルォキシメチル 2— （2, チルブ口ミド 2，6,6—テトラメチルピペリジニルォキシ一 4一ィル）プロピオネートァセトキシェチルブロァセトキシェチル 2— (2,2,6, ミド、 6—テトラメチルビベリジ二ル才キシ一 4一ィル）プロピオネートプロピオニルォキシェプロピオニルォキシェチル 2— （2, チルブ口ミド 2,6,6—亍トラメチルピぺリジニルォキシ一 4—ィル）プロピオネート π—プチリルォキシェ π—プチリル才キシェチル 2— （2, チルブロミド 2， 6,6—テトラメチルピペリジニルォキシ一 4—ィル）プロピオネート

- -

実施例 7

実施例 1 ( 1 ) およびこれに準じて製造される実施例 2のァシル才キシアルキルハラィドを用い、 3—カルボキシ一 2 , 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシに代えて、 3， 4—ジカルボキシ— 2， 2 , 5， 5 ーテ卜ラメチルピロリジニル才キシを用いる以外は、実施例 1 ( 2 ) に準じて表 6に示す二トロキシル誘導体を合成した。

-

6

ハラィド二トロキシル誘導体ァセトキシメチルブロ 3,4—ビス（ァセトキシメチル） 5 ド、 2,2,5,5—亍トラメチルピロリジニルォキシー 3， 4ージカルボキシレー卜プロピ才ニル才キシメ 3,4—ビス（プロピオニルォキシメチルブロミドチル） 2,2,5,5—テトラメチルピ口リジニルォキシ一 3,4—ジカルボキシレート n—プチリル才キシメ 3,4—ビス（n—プチリルォキシメチルブロミドチル） 2, 2, 5，5—テトラメチリレビ口リジニルォキシー 3，4—ジカルボキシレート i 一プチリルォキシメ 3, 4—ビス（ i 一プチリルォキシメチルブロミドチル） 2, 2, 5, 5—テトラメチルピ口リジニルォキシ一 3,4—ジカルボキシレートァセトキシェチルブロ 3, 4—ビス (ァセトキシェチル） 5 2,2,5,5 - 'テトラメチルピロリジ二ル才キシ- -3,4—ジカルボキシレー卜プロピ才ニル才キシェ 3,4—ビス（プロピオニルォキシェチルブロミドチル） 2,2,5,5—亍卜ラメチルピ口リジニルォキシ一 3，4—ジカルボキシレ一ト

3,4—ビス（n—ブチリルォキシェ n—プチリルォキシェチル） 2,2,5,5—テトラメチルピチルブロミド口リジニルォキシー 3, 4—ジカルボキシレー卜 - -

実施例 8

トランス一 3,4—ビス（ァセ卜キシメチル） 2， 2, 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3 , 4ージカルボキシレー卜の合成：

( 1 ) 3—シァノ一 2， 2， 5， 5—テ卜ラメチルー 3—ピロリン一 1 一ィル才キジの合成

3—力ルバモイル一 2, 2, 5, 5—テ卜ラメチル一 3—ピロリン一 1 —ィル才キシ（AL D R I CH 1 5, 568— 3) をピリジン 6m l に溶解した。これに室温でパラトルエンスルホニルクロリド 3.26 g ( 1 7.1 mm o 1 ) を加え、室温で 20時間攪拌した後、 4% 水酸化ナトリウム水溶液 3 Omlを加え、 80°C で 1 0分攪拌した。反応混合物をエーテル 20m lで希釈し、 1 0 %塩酸水溶液（ 1 0 m 1 X 1 ) で洗浄した。水層をエーテル（ 1 0 m 1 X 1 ) で抽出した後、有機層を合し、飽和重曹水（ 1 0m 1 X 1 ) で洗浄、水洗、乾燥

(M g S 0₄) 、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（へキサン—酢酸ェチル、 1 : 1 ) 、次いで再結晶（へキサン）により精製し、黄色針状結晶として 3—シァノー 2 , 2， 5， 5—テトラメチル一 3—ピロリン一 1—ィル才キシ 1 .469 (収率 89%) を得た。

融点： 52〜 5 3°C

I R

3080, 2990， 2240， 1 460, 1 440, 1 370， 1 340, 1 280, 1 1 60 cm-¹.

(なお、上記の I R値は、サンプルのジクロロメ夕ン溶液をディスポーザブル I Rシ一卜に滴下した後、ジクロロメタンを揮散除去して測定した） - -

( 2 ) 3 , 4—ジシァノ一 2 , 2, 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシの合成

3—シァノ一 2， 2， 5， 5—テ卜ラメチル一 3—ピロリン一 1 ーィル才キシ 7.1 0 g ( 43.0 mm o 1 ) にジメチルホルムァミド 1 4 m 1 と水 1 40 m 1 を加えて均一な溶液とした。これに室温でシアン化カリウム 5.60 g ( 86.0 m m o 1 ) 及び塩化アンモニゥ厶 4. 60 g ( 86.0 mm o 1 ) を加えて 70°Cで 3時間攪拌した後、室温で 3日間攪拌した。

反応混合物をエーテル（ 200 m l ) で希釈した後、飽和重曹水（ 2 X 50 m 1 ) で洗浄、水洗、乾燥（M g S 0₄) した後、溶媒留去した _c 残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（へキサン一酢酸ェチル、 2 : 1 ) で精製した。第一画分より得られた黄色板状結晶をさらに再結晶（ジクロ口メタン一へキサン）により精製して卜ランス一 3， 4—ジシァノ一 2 , 2 , 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ 2.9 5 g (収率 36%) を得た。

融点： 1 42〜"！ 43°C

I R ( K B r ) ：

3000， 2950, 29 1 0， 22 50, 1 470, 1 440, 1 395 , 1 390, 1 305， 1 280, 1 250, 1 1 90, 1 1 40, 1 060 c m_¹.

さらに、第二画分より黄色格子状結晶としてシス一 3 , 4—ジシァノ — 2 , 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 1 .64 g (収率 20 %) を得た。本品は結晶化が遅いため、さらに再結晶による精製を行うことは困難であった。

融点： 8 1〜 82 °C

I R ( K B r ) ： - -

3000 - 2960, 2260, 1 470, 1 460, 1 400, 1 395 , 1 390, 1 330， 1 2 95 , 1 2 50, 1 1 9 5 , 1 1 80， 1 1 60, 1 1 35 , 1 080, 1 060 cm-¹. ( 3 ) トランス一 3 , 4—ビス（ァセトキシメチル） 2 , 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4ージカルボキシレ一卜の合成

トランス一 3 , 4—ジシァノ一 2， 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 2.95 g ( 1 5.3 mm o 1 ) をメタノール 30m l に溶解した後、 2 N—水酸化ナトリウム水溶液 30 m 1 を加えて 80°Cで 6 時間攪拌した。

反応混合物に 1 N—塩酸水溶液を加えて p H 1 とした後、溶媒留去した。残渣にジクロロメタン一メタノール（ 2 : 1 ) 混合溶媒を加え、可溶性成分をシリカゲルカラ厶クロマトグラフィ一（ジクロ口メタン一メタノ一ル、 2 ： 1 ) で精製し、黄色油状物として卜ランス一 3，4—ジカルボキシ一 2， 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 4.50 9を得た。本品は水溶性が高く、さらに精製を行うことが困難であったため、このままァセ卜キシメチル化を行った。

粗製のトランス一 3 , 4—ジカルボキシ一 2， 2 , 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニルォキシ 4.509をジメチルホル厶ァミド 80 m 1 に溶解し、室温で卜リェチルアミン 5.4 1 m l ( 3 9.0 mm o 1 ) を加えた後、 0°Cでァセ卜キシメチルブロミド 1 0.7 9 ( 70.2 mm o 1 ) を加え、室温で 7日間攪拌した。

反応混合物をジクロロメタン 200 m lで希釈し、水洗した。水層をジクロ口メタン 50 m 1 で抽出した後、有機層を合して水洗、乾燥 (M g S 0 、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ— （へキサン—酢酸ェチル、 1 : 1 ) 、次いで再結晶（ジク口ロメ -

タン一ジイソプロピルエーテル）による精製を行い、黄色針状結晶として卜ランス一 3 , 4—ビス（ァセ卜キシメチル） 2 , 2 , 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4—ジカルボキシレ一卜 1 .1 6 gを融点： 1 27〜 1 29 °C

I R ( K B r ) ：

3450 , 3 1 70, 2 980, 2940 1 760， 1 7 1 0,

1 700， 1 630， 1 460 - 1 405 1 380 - 1 360,

1 300 , 1 240, 1 1 90 - 1 1 40 1 1 00 , 1 050，

1 005 - 960 cm- ¹.

F A B— ma s s (m/z ； (相対強度））

375 (M H+, 50 ) , 345 ( 29 ) , 301 ( 1 00 ) ,

2 1 2 ( 56 ) ， 1 39 ( 83 ) . 実施例 9

シス一 3 , 4—ビス（ァセ卜キシメチル） 2, 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4—ジカルボキシレー卜の合成：

実施例 8の中間体として合成したシス一 3 , 4—ジシァノ— 2 , 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 1 .64 g ( 8.5 3 mm o 1 ) をメタノール 1 6 m l に溶解した後、 2 N—水酸化ナトリウム水溶液 1 6 m l を加えて 80°Cで 6時間攪拌した。

反応混合物に 1 N—塩酸水溶液を加えて p H 1 とした後、溶媒留去した。残渣にジクロロメタン一メタノール（ 2 : 1 ) 混合溶媒を加え、可溶性成分をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（ジクロロメタン一メタノ一ル、 2 ： 1 ) で精製し、黄色油状物としてシス一 3 , 4—ジカル - -

ボキシ一 2 , 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 2.27 gを得た。本品は水溶性が高く、さらに精製を行うことが困難であったため、このままァセ卜キシメチル化を行った。

粗製のシス一 3， 4—ジカルボキシ一 2 , 2 , 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 2.27 gをジメチルホルムアミド 1 8 m l に溶解し、室温で卜リェチルアミン 2.36 m l ( 1 7.1 m m o 1 ) を加えた後、 0°Cでァセ卜キシメチルブロミド 4.7 0 g ( 30.7 mm o l ) をカロえ、室温で 7日間攪拌した。

反応混合物をジクロロメタン 5 O m 1で希釈し、水洗した。水層をジク□□メタン 2 0 m Ί で抽出した後、有機層を合して水洗、乾燥 (M g S 0₄) 、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ— （へキサン—酢酸ェチル、 1 : 1 ) で精製し、黄色油状物としてシス一 3，4—ビス（ァセ卜キシメチル） 2 , 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4—ジカルボキシレ一卜 264 m gを得た。実施例 1 0

3 , 4—ビス（ァセ卜キシメチル） 2 , 2， 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4—ジカルボキシレー卜の合成： ( 1 ) 3 , 4—ジシァノ一 2， 2 , 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシの合成

3—シァノ一 2 , 2， 5， 5—テ卜ラメチル一 3—ピロリン一 1 —ィル才キシ 1 1 .9 1 g ( 72.1 mm o l ) 、ジメチルホルムアミド 20 m 1 と水 2 1 0 m 1 を加えて均一な溶液とした。これに室温でシアン化カリウム 9.3 9 g ( 1 44 m m 01 ) と塩化ァンモニゥ厶 7.7 1 g ( 1 44mm o 1 ) を加えて 70 °Cで 3時間攪拌した後、室温で 3日間攪拌した。 - -

反応混合物をエーテル 300 m lで希釈した後飽和重曹水（ 2 x 5 0 m l ) で洗浄、水洗、乾燥（M g S 0₄) 、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン一酢酸ェチル、 2 : 1 ) で精製して 3， 4—ジシァノ一 2， 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 1 0.5 29 (収率 76%) を得た。なおこの精製を行う際、卜ランス体とシス体は分離せず、反応で生じたジァステレオマ—比を保つたままの状態で精製品を得た（卜ランス体：シス体 = 1 .8 : 1 ) 。 ( 2 ) 3 , 4—ビス（ァセトキシメチル） 2， 2， 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3 , 4—ジカルボキシレ一卜の合成：

3， 4—ジシァノー 2 , 2 , 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 1

0.5 2 g ( 54.7 mmo ) をメタノール 1 00 m l に溶解し、 4 %水酸化ナトリウム水溶液 1 00 m l を加えて、 80°Cで 6時間攪拌した。

反応混合物に 1 N—塩酸水溶液を加えて p H 1 とし、溶媒留去した。残渣にジクロロメタン一メタノール（ 2 : 1 ) で精製し、黄色油状物として 3 , 4—ジカルボキシ一 2 , 2， 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ 1 1 .629を得た。本品は水溶性が高く、さらに精製を行うことが困難であったため、このままァセ卜キシメチル化を行った。

粗製の 3， 4—ジカルボキシ一 2， 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ 1 1 .6 2 gをジメチルホルムアミド 1 8 m l に溶解し、室温で卜リエチルァミン 2.36 m l ( 1 7.1 m m o 1 ) を加えた後、 0 °Cでァセトキシメチルブロミド 4.709 ( 30.7 mm o 1 ) を加え、室温で 7日間攪拌した。

反応混合物をジクロロメタン 50 m lで希釈し、水洗した。水層をジクロロメタン 20 m 1で抽出した後、有機層を合して水洗、乾燥（M g S 0₄) し、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜グラフ 0 -

ィ一（ジクロロメタン一メタノール、 2 ： 1 ) で精製し、黄色油状物として 3 , 4—ビス（ァセトキシメチル） 2 , 2 , 5 , 5—テトラメチルピロリジニル才キシ一 3， 4ージカルボキシレー卜 2.42 g ( 3， 4—ジシァノ一 2， 2， 5 , 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシからの収率 1 2%) を得た。

I R ( I Rシ— 卜）：

3480 - 3 200，3000， 2940 , 2880, 1 780 - 1 6 20, 1 480 - 1 360 , 1 240, 1 1 60, 840, 740 cm— ¹. 実施例 1 1

ァセトキシメチル 2 , 2， 6， 6—テトラメチルビペリジニル才キシ一 4—カルボキシレー卜の合成：

4—カルボキシ一 2， 2， 6， 6—テトラメチルピペリジニル才キシ ( A L D R I C H 38 , 2 00 - 0 ) 1 00 m g ( 0.49 9 m m o Ί ) をジメチルホルムアミド 1 m Ί に溶解し、室溫で卜リェチルアミン 0.06 9 m l ( 0.49 9 m m o 1 ) を加えた後、 0°Cでァセ卜キシメチルブロミド 1 37 m g (0.898mm o 1 ) を加え、室温で 7 日間攪拌した。

反応混合物をジクロロメタン（ 5 m l ) で希釈し、水洗、乾燥（M g S 0₄) 、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (へキサン—酢酸ェチル、 2 : 1 ) で精製して、淡赤色微細針状結晶としてァセトキシメチル 2 , 2 , 6， 6—テ卜ラメチルピペリジニル才キシ一 4—カルボキシレ— 卜 43.2 m g (収率 32%) を得た。

融点： 67〜 68 °C

I R ( K B r ) ： -

2 9 8 0 , 2 9 5 0， 1 7 6 0 , 1 7 4 0 , 1 3 8 0 , 1 3 7 5 , 1 3 8 0 , 1 3 7 5 , 1 3 1 0 , 1 3 0 0 , 1 2 4 0 , 1 2 0 0 , 1 1 7 0 , 1 0 7 0 , 1 0 1 0 , 9 9 5 , 9 8 0 c m-¹.

F A B - m a s s (m/z; (相対強度））

2 7 2 (M + ' 1 0 0 ) ， 2 5 8 (M ⁺— C H ₂, 5 6 ) ， 2 5 6 ( 1 4 ) ， 2 4 2 ( 7 ) ， 2 0 0 ( 3 9 ) , 1 8 4 ( 1 8 ) , ύ 1 5 4 ( 1 1 ) , 1 3 6 ( 1 2 ) , 1 2 3 ( 1 1 ) , 1 1 4 ( 1 0 ) . 実施例 1 2

加水分解試験：

3—カルボキシ一プロキシルメチルエステルおよび 3—カルボキシ —プロキシルァセトキシメチルエステルのエステラーゼによる加水分解率の時間変化を調べた。

5マイクロュニッ卜のエスラーゼ (Carboxy esterase, Carboxyl ic ester hydrolase； E C 3 . 1 . 1 . 1 シグマ社力夕口グ番号 E 3 1 2 8 ) 8 0 0 1 に、 1 0 m Μの被験試料溶液 2 0 0 1 を混ぜ、 1 0 秒、 1分、 3分、 5分、 1 0分および 3 0分間、 3 7 °Cでインキュベー卜した。その後、高速液体クロマ卜グラフィ一により分析を行い、未変化体とその加水分解物である 3—カルボキシ—プロキシルとの量比から加水分解率を算出した。

高速液体クロマ卜グラフィ一は東ソー製紫外可視検出器（ U V — 8 0 2 0 ) 、東ソ一製デュアルポンプ（C C P S ) 、東ソー製カラム（0 D S - 8 0 T s ) および東ソ一製 T S Kプレカラム（ B S A— 0 D S ) を用いた。

[ 高速液体クロマトグラフィーの測定条件 ] 紫外波長： 245 n m

移動相： 20 mM燐酸緩衝液（ p H 2.2 ) /メタノール =

60/40

流量： 0.5 m 1 /分

温度： 20— 2 5 °C

注入量： 20 1

[ 結果 ]

表 7に被験試料のエステラーゼによる加水分解率の経時変化を示す,

o o

7 力 Π 水分角 ¾ 率 f % )

被験試' 料

1 0秒 1分 3分 5分 1 0分 30分

3一カルボキシー 0.0 5 0.40 0.80 1 .3 5 2.54 8.25 プロキシルメチル ± 0.43 ±0.34 ± 0.4 9 ± 0. 49 ± 0. 0 8 土 1 . 5 1 エステル

3—カルボキシー 30.1 7 0.8 93.9 96.7 1 00. 0 1 00. 0 プロキシルァセ卜 ± 1 1 .9 ± 3.4 ± 1 .1 ± 2. 2 ± 0. 0 ± 0. 0 ル平均土標準偏差（n = 3)

- -

表 7から 3—カルボキシ一プロキシルァセトキシメチルエステルは 1 0秒後からわずかに分解されはじめ、 3分後には約 9 0 %、 1 0分後にはほぼ 1 0 0 %が加水分解を受けていた。一方、 3—カルボキシ—プ口キシルメチルエステルは 3 0分経過しても加水分解率は 1 0 %以下であった。

この結果から、 3—カルボキジ—プロキシルァセ卜キシメチルエステルは 3—カルボキシ—プロキシルメチルエステルに比べ、エステラ -ゼで短時間に加水分解を受けることが判明した。実施例 1 3

生体内分布：

被験試料として、 3—カルボキシープロキシル、 3—カルボキシ—プ口キシルメチルエステル、 3—カルボキシ一プロキシルェチルエステル、 2 —ェチルー 2 , 5， 5 — トリメチル才キサゾリジニル才キシおよび 3—カルボキシ一プロキシルァセトキシメチルエステルを用い、 E S Rによる生体内分布の試験を行った。

実験は、実験動物として、 1群 3匹のマウス（ d d丫、雌性） 4 8匹を用い、次の如くして行った。すなわち、マウスの尾静脈内に、ェ一テル麻酔下被験試料を 7 . 5 m o 1 ( 3 —カルボキシ—プロキシルァセ卜キシメチルエステルのみ 2 . 5 m o 1 ) 投与し、 3、 1 0、 3 0分間放置した。次いで、すばや〈脱血をおこない、脳を摘出した。続いて、摘出した脳の 9倍量の燐酸緩衝液を加え、ホモジナイズした。血液は、 9倍量の燐酸緩衝液で希釈した。これらの処理した組織の一部を取り、これにフェリシアン化力リゥム溶液を最終濃度 1 m Mとなるように加え、生体内の活性酸素等によりヒドロキシルァミン体となった被験試料を二トロキシドラジカルに再変換し（一電子酸化）、 E S R用試料を得た。一電子酸化後の被験試料の濃度を x—バンド E S Rで測定し、生体試料中の濃度とした。一方、マウスへ投与した量と同じ量の被験試料溶液を調製し、 9倍量のリン酸緩衝液を加える以降と同様の条件で処理し、被験試料の濃度を X—バンド E S Rで測定し、全投与量とした。各試料は 1 00 1のキヤビラリ一（長さ 1 1 6.5 mm) に 1 5 mm取り、これを石英セルに入れ E S Rスぺクトルを下記の条件で測定した。

( 測定条件）

測定装置電子スピン共鳴装置 [ J E S— R E 1 X (日本電子（株）） ]

外部磁場： 33 1 .5 ± 5 m T

磁場変調： 1 00 k H z

磁場変調幅： 0.1 m T

時定数： 0.03秒

マイク口波出力： 5 mW

掃引時間： 2分

測定温度：

[ 結果 ]

E S Rスぺクトルから、全投与量に対する脳および血液中の被験試料の割合（％d o s e ) 、この％d o s eを脳および血液の重さで割った値（％d o s e/g ) 、標的臓器である脳の％d o s e/gと血液の％ d o s e/gとの比を求めた。この結果をそれぞれ表 8から表 1 0に示す。 o

表 8

被検試料

3分 1 0分 30分 3分 1 0分 30分

3一カルボキシープロキシル 0 .05 0.30 0.1 6 1 4 .06 6.1 4 3.89

3—カルボキシ一プロキシル 1 .31 0.67 0.21 4 .62 2.68 2.1 8 メチルエステル

3—カルボキシープロキシル 0 .79 0.74 0.1 2 3 .46 2.92 3.38

0

一 || m

ナノレ _£Λτノレ

2—ェチルー 2,5,5—トリ

メチルォキサゾリジニルォ 1 .63 1.64 0.52 4 .52 3.69 0.81 キシ

3—カルボキシープロキシル 2 .26 2.77 1.98 6 28 4.41 4.21 ァセトキシメチルエステル

0

ro

o o

9

D凶

(% d o s e

被検試料

3分 1 0分 30分 3分 1 0分 30分

3—カルボキシープロキシル 0 .1 3 0.69 0.4 1 フ .89 4.43 2.58

3—カルボキシ一プロキシル 3 .1 4 1.82 0.48 2 .48 1 . / 4 1.36 メチルエステル

3—カルボキシープロキシル 1 .8 9 1.84 0.28 2 .02 2.20 2.1 1

I 1し 1 T ÷ Jし

2—ェチルー 2, 5,5—トリ

メチル才キサゾリジニルォ 3 .8 1 4.1 2 1 .21 2 .55 2.32 1 .30 キシ

3—カルボキシープロキシル 5 80 フ.1 7 5.82 3 26 2.2 1 2.02 ァセ卜キシメチルエステル

a.

(0

\ O O

0 脳と血液の比

被検試料

3分 1 0分 30分

3一カルボキシ一プロキシル 0 .02 0.1 6 0.03

3一カルボキシープロキシル 1 .27 1.05 0.1 4 メチルエステル

3—カルボキシープロキシル 0 .94 0.84 0.05 ェチルエステル

2—ェチル _ 2,5，5—卜リ

メチルォキサゾリジニル才 1 50 1.78 1.フ 2 キシ

3一カルボキシープロキシル 1 78 3.1 4 2.88 ァセトキシメチルエステル

- -

この結果から明らかなように、脳と血液の比は、 3—カルボキシ—プ口キシルでは 1 0分後で 0 . 1 6であるのに対し、他の 3種の化合物 ( 3—カルボキシ一プロキシルメチルエステル、 3—カルボキシ一プ口キシルェチルエステル、 2—ェチル— 2 , 5， 5 — 卜リメチル才キサゾリジニルォキシ）は 0 . 8 4〜1 . 7 8と高い値を示した。

一方、本発明化合物である 3—カルボキシ—プロキシルァセ卜キシメチルエステルはさらに高い 3 . 1 4を示した。また、他の 3種の化合物が時間とともに脳への集積が急速に低下するのに比べ、 3—カルボキシープロキシルァセ卜キシメチルエステルは 3 0分でも 2 . 8 8と高い値を示した。

この高い脳集積率持続の理由については、未だ明らかでない部分もあるが、本発明化合物の基 Lの中の一 C◦ 0—部分がエステラーゼによる加水分解を受け易く、この部分が脳内で— C O 0—となり、化合物全体としても電荷を有することになるため、脳から血中への再分布が阻止されることが理由と推定される。実施例 1 4

マウス脳 Lバンド E S R— C T像の測定：

ネンブタール麻酔（ 7 5 m g / k g、筋注）したマウスの尾静脈内に 3—カルボキシープロキシル、 3 _カルボキシ—プロキシルメチルェステル、およびァセトキシメチル 2， 2 , 5 , 5 —テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3—カルボキシレー卜を 2 . 5 At m o l 投与し、頭部横断面の Lバンド E S R— C T画像を下記条件で測定した。

( Lバンド E S R— C Tの測定条件）

測定装置：電子スピン共鳴装置 [ J E S— R E 3 1 (日本電子） ] 外部磁場 3 8.5 m T

磁場勾配 0.4 5 m T/ c m

掃弓 I 幅 1 .4 9 m T

サンプリング · ポイント 5

積算回数： 5

射影数 1 8 ( 1 0° 毎）

磁場変調 1 00 k Η ζ

磁場変調幅 0.2 m T

時定数 0.003秒

マイクロ波出力： 5.0 mW

測定温度：室温

[ 結果 ]

比較である 3—カルボキシ—プロキシルおよび 3—カルボキシ—プロキシルメチルエステルについてのマウス脳 Lバンド E S R— C T像を図 1 および図 2に、本発明のァセ卜キシメチル 2， 2 , 5 , 5—テ卜ラメ ' チルピロリジニル才キシ一 3—カルボキジレー卜のマウス脳 Lバンド E S R— C T像を図 3に示す。

この結果から明らかなように、 3—カルボキシ—プロキシルは脳部位外に高濃度に集まっており、脳内にほとんど移行していなかった。これに対し、 3—カルボキシ—プロキシルメチルエステルは、脳部位外にも集まっているが、脳部位にも高濃度に集まっていた。一方、ァセトキシメチル 2， 2 , 5， 5—テ卜ラメチルピロリジニル才キシ一 3—カルボキシレー卜は、脳部位外の集積が減少し、脳部位には更に高濃度に集まつており、明瞭なマウス脳 Lバンド E S R— C T像が得られた。産業上の利用性 - -

本発明の診断用薬剤の有効成分である二卜口キシル化合物は、十分な半減期を有し、生体内の活性酸素ゃフリーラジカルと相互作用するので、磁気共鳴法によるフリ一ラジカルの分布の生体画像を得るのに有用で、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害のような活性酸素やフリーラジカルが関与していると考えられる活性酸素等関連疾患又は症状の診断薬として使用することができる。

すなわち、二卜口キシル化合物を含む本発明の診断用薬剤を生体に投与した後、当該化合物の生体内でのシグナル変化を E S R、 N M R等で検出することにより、上記の活性酸素等関連疾患を診断することができる

特に、本発明のニトロキシル化合物は、脳血管関門を通過し、かつ脳内でフリ一ラジカルと相互作用するので、従来磁気共鳴法による画像化が困難であった、脳虚血、脳腫瘍について画像化が可能となる。

従って、本発明の診断用薬剤は、 M R I、脳磁図のために使用される他、ヒ卜頭部のような極めて大容量の生体試料の測定を可能にする E S R装置が開発された後は、 E S R法により脳内フリ—ラジカルの分布の画像を得て、活性酸素ゃフリーラジカルの関与する疾患又は症状の非侵襲的診断を行うことが期待できる。

—方、本発明のニトロキシル化合物は、生体内の活性酸素ゃフリーラジカルと反応し、これを消去するので、虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障、薬物による臓器障害のような活性酸素ゃフリーラジカルが関与していると考えられる活性酸素等関連疾患の予防もしくは治療薬剤として使用することができる。

また、ニトロキシル化合物は、正常実験動物や疾患モデル実験動物に - -

投与し、正常または疾患時における組織や臓器より発生する活性酸素やフリーラジカルを外部より検出し、画像化できる。この結果より、活性酸素ゃフリーラジカルがどの疾患に関与するかの検出用試薬として用いることができ、医学上有用な情報が得られる。

更に、採取された生体試料を均質化し、適当な緩衝溶液とニトロキシル化合物を加え、適当な時間反応させた後、シグナル強度を E S Rで測定することにより、生体組織中の活性酸素やフリーラジカルの有無、その量を測定することができる。

Claims

1 .次の式（ I )

主 S

の囲

(式中、 Aは水素原子または次の基

を、 Lは基一 C 00— または基一アルキレン一 C00— を示し、 R、 R i R₂、 R 3および R 4はそれぞれ炭素数 1 から 4までのアルキル基を示し、 mは 0または 1の数を、 nは 1から 4までの数を示す）で表されるニトロキシル化合物。

2. 次の式（ I )

(I) (式中 A、し、 R R , R ₂ R 3 s R₄ mおよび nは前記した意味を有する）

で表される二卜口キシル化合物を有効成分として含有する医薬もしくは

3. 活性酸素またはフリーラジカル捕捉剤である請求項第 2項記載の医薬もしくは試薬。

4. 虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障または薬物による臓器障害の予防若しくは治療剤である請求項第 2項または請求項第 3項記載の医薬若しくは試薬。

5. 活性酸素またはフリーラジカル検出用剤である請求項第 2項または第 3項記載の医薬もしくは試薬。

6. E S R N M Rまたは脳磁図用の造影剤である請求項第 2項または請求項第 3項記載の診断用薬剤。

7. 生体内に式（ I )

(式中、 Aは水素原子または次の基

一 L-(CH₂k0C0R

を、 Lは基一 C OO— または基一アルキレン一C OO— を示し、 R ！ ,、 R ₂、 R 3および R 4はそれぞれ炭素数 1 から 4までのアルキル基を示し、 mは 0または 1 の数を、 nは 1 から 4までの数を示す）で表される二卜口キシル化合物を投与することを特徴とする生体内の活性酸素またはフリ一ラジカルを検出する方法。

8 . 虚血性疾患、消化器疾患、癌、神経変性を伴う脳神経疾患、炎症、白内障または薬物による臓器障害を診断するためものである請求項第 7 項記載の方法。