WO1999064023A1

WO1999064023A1 - Lactic acid bacterium-containing compositions, drugs and foods

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Publication number: WO1999064023A1
Application number: PCT/JP1999/003017
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Ishikawa; Nobuyuki Suzuki; Seigo Nakaya; Haruhisa Hirata
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2000-12-05
Also published as: CN1304313A; AU4059999A; EP1082964A1; KR20010071416A; CA2334370A1

Description

明細書

乳酸菌含有組成物、医薬及び食品技術分野

本発明は、乳酸菌を含有する組成物、これを用いる医薬及び食品に関する。背景技術

元来、乳酸菌を含有する製剤は、我国では整腸薬として効能が認められ、長い間の使用経験から極めて安全性に優れた医薬品とされてきた。また、乳酸菌製剤の有効成分である局外規ビフィズス菌、局外規ラクトミンに含まれるラクトバシラス ·ァシドフィルス、ストレプトコッカス ·フエカリス等はヒ卜の腸内細菌として腸内に生息し、健康維持及び増大に極めて重要な働きをしていることが判つている。

このような乳酸菌に対して、その薬理効果が確実であること、副作用が少ないこと等から、現在、新しい開発研究が続けられている。

なかでも、近年、乳酸菌適用について目ざましい発展が期待されているのが、抗胃炎、抗潰瘍、及び、泌尿生殖器における抗感染症の分野である。

消化性潰瘍の治療薬として、従来、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン等の H 2—受容体拮抗薬、オメブラゾール等のプロトンポンプ阻害剤、更に胃粘膜保護剤が開発され、これらの薬剤は優れた治療成績をおさめてきた。しかしながら、完治したはずの潰瘍が再発 ·再燃を繰り返す症例が見受けられ、その原因が、胃粘膜の生検組織に存在するへリコパクター ' ピロリ（H e 1 i c o b a c t e r p y 1 o r i ) であることが判明した。

へリコパクター . ピロリは胃粘膜に感染するグラム陰性の微好気性、らせん状の桿菌である。本菌はその強いゥレアーゼ活性によって、寄主由来の尿素をアンモニァに分解して胃酸を中和し、胃の中での生育を可能にしているものと考えられている。

へリコパク夕一 ·ピロリの除菌療法が消化性潰瘍における新しい治療法として世界中に認知されることになり、これまでペニシリンゃァモキシシリン、アンピシリン等の /3—ラクタム剤、エリスロマイシンやクラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン等のマクロライド剤、アルべカシンやゲン夕ミシン等のアミノ配糖体抗生物質、テ卜ラサイクリン系抗生物質及び抗原虫薬として使用されているメトロニダゾール、更にはビスマス製剤を用いたへリコパクター • ピロリの除菌効果が明らかにされ、実際に欧米では使用されている。

また、近年 H2—受容体拮抗剤、プロトンポンプ阻害剤等の抗潰瘍剤において、へリコパク夕一·ピロリに対する抗菌活性を併せ持つ化合物の開発が行われ、製品化されつつある。以上のように、胃炎又は胃 '十二指腸潰瘍の治療及び再発防止を目的としてへリコパクター 'ピロリに抗菌活性を有する抗生物質等で除菌する試みがなされてきた。

しかしながら、これら従来の抗生物質の投与では通常の感染治療に使用する量よりはるかに多量の投与が必要であり、また投与期間も長くなるため、新たな耐性菌の発現のおそれがあり、また副作用の併発の危惧があった。

へリコパクター .ピロリの除菌のために用いられるこれら抗生物質に代わるものとして、乳酸菌等のプロバイオテクスによる方法が考えられた。特許第 267 2247号公報には、ラクトバシラス 'ァシドフィルスの菌株が、腸及び胃細胞からへリコパクター · ピロリを排除する効果を有する旨が開示されている。しかしながら、ラクトバシラス 'ァシドフィルスを実際に患者に投与した結果、期待した効果が得られないことが判つた。

特開平 9— 241 173号公報には、ラクトバシラス 'サリバリウス、ラクトバシラス ·ブレビスの菌株が抗胃炎、抗潰瘍作用等を有する旨が開示されている。これらは一定の効果を有するものの、乳酸菌を経口投与した場合-、速やかに胃や十二指腸から排出される可能性が高く、このためにへリコパクター 'ピロリを排除する効果は著しく減弱する欠点があった。

乳酸菌適用についての目ざましい発展が期待されている二つめの分野は、腸管出血性大腸菌 (En t e r oh emo r r h a g i c E s c h e r i c h i a c o 1 i ; EHEC) の除菌への適用である。

1977年に発見された EHECは、その血清型の半数以上が O 157 ： H7 であるため、病原性大腸菌 Ol 57として知られる病原菌である。この病原菌の感染症は、汚染食物や水の摂取が原因となる集団食中毒事例が多く、下痢、腹痛等の初期症状に始まり、強い腹痛と血便を伴う出血性大腸炎を呈するうえ、重症者は合併症として溶血性尿毒素症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、脳症を併発し、最悪の場合死に至る。本感染症の病原因子は EHECの産生するべ口毒素（V e r o t ox i n ; VT) である。 VTは、志賀赤痢菌の産生する志賀毒素と同じ VT 1と、生物活性は VT 1に似るが、物理化学的性質や免疫学的性質の異なる VT 2の 2種類に分類され、別名志賀毒素様毒素（Sh i g a- 1 i k e t o x i n) とも呼ばれている。

VTの毒力は細胞毒素の中で最も強力で、その RNA N—グリコシダ一ゼ活性が引き起こす蛋白合成阻害作用によって、強いマウス致死作用、細胞毒性、腸管毒性を発現する。 EHEC感染症に対しては、ホスホマイシン、ノルフロキサシン、カナマイシン等の抗菌剤が使用されているが、現在適切な治療法がなく、新しい治療方法の開発が望まれている。

乳酸菌適用についての目ざましい発展が期待されている三つめの分野は、食物アレルギー治療への適用である。

食物ァレルギ一罹患者の数は世界的規模で増加する傾向にあり、特に先進国において著しい。食物アレルギーの治療及び又は予防には原因食物の除去ゃ抗ァレルギ一剤の投与が行われていたが、原因食物の除去には、肉体的、精神的負担が大きく、家庭生活や集団生活上の制限等の多くの問題がある。抗アレルギー剤の長期投与には、副作用のおそれが大きい。

先進国における近年の食物アレルギー患者数の増加の原因として、ヒ卜が種々の病原微生物に感染する機会が減少したため、ヒ卜がこれら抗原刺激に対して過剰に反応する体質となってしまったとする説がある。実験的に作製された無菌動物の生体防御機構の特徴の一つとして、食物抗原の侵入に対して過剰に反応することが知られている。

人工栄養で育った乳児は、母乳栄養の乳児に比較して、アレルギー疾患の罹患率が有意に高く、高 I gE血症の発症率も有意に高いことが判っているが、人工栄養児では母乳栄養児に比べ、糞便菌叢を調べるとビフィズス菌の菌数が有意に低く、逆にクロストリジゥム、シュ一ドモナスの菌数及び検出率が高いことが判つている（乳児栄養と腸内フローラ、光岡知足編「腸内フローラと栄養」 1 3頁、学会出版センター、 1 9 8 3年）。

近年、アレルギーの発症には T h 1細胞と T h 2細胞のバランスが関与しており、 T h 1細胞の比率が減少すると、アレルギーの発症につながること（最新医学、 7 2— 7 9頁、 5 3巻、 1 2号、 1 9 9 8年）、 T h 1細胞は I L一 1 2により誘導されること（医学のあゆみ、 8 5— 8 9頁、 1 8 0卷、 1 9 9 7年）、また、乳酸菌が I L一 1 2産生促進作用を有すること（特開平 1 0— 1 3 9 6 7 4号公報）等が報告されている。

そこで、乳酸菌、特にビフィズス菌を摂取させることにより、食物アレルギーを予防し治療することが期待されている。

このように乳酸菌の新しい適用分野はますます広くかつ重要になりつつあるものの、乳酸菌を投与した場合、乳酸菌はすみやかに消化管から排出されてしまうので、これに抗して薬理作用を維持し増加させる有効な方法が存在しないことが、本質的な問題となっていた。

ところで、乳酸菌についての目ざましい発展が期待されている四つめの分野は、泌尿生殖器における感染症の治療及び/又は予防への適用である。

正常で健康な女性の膣内には乳酸桿菌ラクトバシラスを主とするバランスのとれた細菌叢が形成されている。しかし、膣自浄作用の低下、子宮内避妊具の装着、化学的 ·機械的刺激、エストロゲン機能の失調、性交感染等により膣内細菌叢のバランスが崩れると、ラクトバシラスが多数の複数の菌種に置き代わり、細菌性膣症や真菌性膣炎の発症に到る。また、ラクトバシラスは、尿道末端においても防御バイオフィルムを形成すると考えられており、これにより、大腸菌等のグラム陰性桿菌が肛門周囲から上行し、尿道末端に感染するのを防いでいる。このため、ラクトバシラスによる防御バイオフィルムが破壊されると、再発性尿路感染症の発症に繋がる場合もある。

これら細菌性膣症や再発性尿路感染症等を放置すると、骨盤内感染症や術後感染症、周産期感染症等の更に重篤な疾患に発展するおそれがあり、また、細菌性膣症に罹患している患者は H I Vに感染しやすいという報告もある（A I D S、 1 6 9 9— 1 7 0 6頁、 1 2巻、 1 9 9 8年）。これら泌尿生殖器における感染症に対して、乳酸菌のプロバイオテクスを使用する試みがなされている（Th e J a p an e s e J ou r n a l o f An t i b i o t i c s, 51— 12頁、 759巻（39号）、 1998年； F EMS I mm n o 1 o g y and Me d i c a l M i c r o b i o l o gy、 251— 264頁、 6巻、 1993年）。しかし、これらの泌尿生殖器における感染症は、沈静化しても再発を繰り返し、完治が困難であるという特徴を有する。

このように乳酸菌の新しい適用分野はますます広くかつ重要になりつつあるものの、乳酸菌を投与した場合、乳酸菌はすみやかに泌尿生殖器から流出しててしまうので、これに抗して薬理作用を維持し増加させる有効な方法が存在しないことが、本質的な問題となっていた。発明の要約

本発明は、上記現状に鑑み、消化管及び/又は泌尿生殖器への薬理作用を有する乳酸菌の当該薬理作用を増加させ、乳酸菌が消化管及び又は泌尿生殖器から排出されることに抗することができる乳酸菌含有組成物を提供することを目的とするものである。

即ち、本発明は、消化管及び Z又は泌尿生殖器に対する薬理作用を有する乳酸菌を含有する乳酸菌含有組成物であって、前記薬理作用を増大させるために乳酸菌の消化管及び又は泌尿生殖器への付着性を向上させたことを特徴とする乳酸菌含有組成物である。発明の詳細な開示

本発明は、消化管及び又は泌尿生殖器に対する薬理作用を有する乳酸菌を含有する乳酸菌含有組成物であって、上記薬理作用を増大させるために乳酸菌の消化管及び Z又は泌尿生殖器への付着性を向上させたことを特徴とする乳酸菌含有組成物である。

本発明者らは、薬理作用を有する乳酸菌を含有し、摂取又は投与された乳酸菌含有組成物が、消化管及び Z又は泌尿生殖器から排出されることに杭して当該薬理作用を増大させるためには、消化管及び又は泌尿生殖器に長期間滞留せしめることが有効であること、そのためには、消化管及び又は泌尿生殖器への乳酸菌の付着性を向上させることが有効であることに想到し、本発明を完成させたものである。

薬理作用の増加、消化管及び Z又は泌尿生殖器への長期間滞留、消化管及び Z 又は泌尿生殖器への付着性向上、という一連の工夫は、机上では容易に考えられるものであるかも知れないが、乳酸菌に対してこのような発想を抱くことは、乳酸菌の消化管及び/又は泌尿生殖器への付着が技術的に困難な状況下においては、極めて困難なことであった。後に詳述する付着性向上効果を有する具体的物質を取得することにより、本発明者らは、初めて本発明に到達することができたものである。

本明細書において消化管とは、消化 '吸収を行う管の総称であり、例えば、口腔、食道、胃、小腸、大腸、直腸等を挙げることができる。本明細書において泌尿生殖器とは、尿の生成 ·排出に関与する器官、生殖に関与する器官の総称であり、例えば、女性外陰、膣、男性性器、尿路等を挙げることができる。本明細書において、消化管及び又は泌尿生殖器とは、消化管のみ、泌尿生殖器のみ、並びに、消化管及び泌尿生殖器の両方の、いずれをも意味する。

本明細書において乳酸菌含有組成物とは、乳酸菌を含有してなる組成物を意味する。本明細書において乳酸菌の消化管及び Z又は泌尿生殖器への付着とは、乳酸菌が消化管及び又は泌尿生殖器粘膜上皮細胞表面に存在している状態が継続することを意味し、乳酸菌の消化管及び Z又は泌尿生殖器への付着性の向上とは

、消化管及び/又は泌尿生殖器粘膜上皮細胞表面に存在している状態が継続する乳酸菌の菌数が増加することを意味する。本発明においては、上記菌数（付着個数ともいう）の増加は、無処理の場合に対して最低でも 2倍程度、通常 1 0〜1 0 0倍という極めて多量に及ぶものである。

乳酸菌の消化管及びノ又は泌尿生殖器への付着性が向上することにより、乳酸菌が有する薬理作用が増加することは、本発明者らの実験により確認されている。従って、乳酸菌の消化管及び又は泌尿生殖器への付着性の向上は、極めて有効な薬理作用の増加方法であることが明白である。また、薬理作用を増加させるためには、消化管及び/又は泌尿生殖器へ付着させる乳酸菌は、生菌であることが好ましいことも判明している。

本発明の乳酸菌含有組成物は、乳酸菌を含有する。上記乳酸菌は、ヒト又は動物に有用な乳酸桿菌として、例えば、ラクトバシラス ·サリバリウス、ラクトバシラス 'ァシドフィルス、ラクトバシラス 'ブレビス、ラクトバシラス · ラムノサス、ラクトバシラス 'プラン夕ラム、ラクトバシラス 'ヘルべティカス、ラクトバシラス · フアーメンタム、ラクトバシラス 'パラカゼィ、ラクトバシラス · カゼィ、ラクトバシラス 'デルブリュッキイ、ラクトバシラス · ロイテリ、ラクトバシラス ·ブルネリ、ラクトバシラス ·ガッセリ、ラクトバシラス ·ジョンソニイ、ラクトバシラス ·ケフィァ等を挙げることができる。

また、乳酸球菌として、例えば、ラクトコッカス ' ラクテイス、ラクトコッカス 'プラン夕ラム、ラクトコッカス ' ラフイノラクテイス、ェンテロコッカス ' フエカリス、ェンテロコッカス ' フエシゥム、ストレプトコッカス 'サ一モフィルス、ロイコノストック · ラクテイス、ロイコノストック ·メセンテロイデス等を挙げることができる。

更に、ビフィズス菌として、例えば、ビフイドバクテリウム ·アニマリス、ビフイドバクテリウム · ビフィダム、ビフイドバクテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバクテリウム ·インファンテイス、ビフイドパクテリゥム ' ロンガム、ビフイドバクテリウム ·シュ一ドロンガム、ビフイドバクテリゥム 'サーモフィラム、ビフィドバクテリゥム ·ァドレセンティス等を挙げることができる。

これらの乳酸菌は、一種又は二種以上の菌種を配合して用いることができる。これらの乳酸菌は、乳酸菌培養の常法に従って任意の条件で培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま本発明のために用いることができる。

本発明は上記乳酸菌の消化管及び Z又は泌尿生殖器への付着性を向上させたことを特徴とするものであり、乳酸菌の消化管及び又は泌尿生殖器への付着性を向上させる方法であればいかなる方法も適用することができるが、例えば、高分子物質を含有させる方法、好ましくは、塩基性高分子物質を含有させる方法を適用することができる。 o

上記塩基性高分子物質とは、高分子物質であって塩基性を有するものであれば特に限定されない。また、両性高分子物質であっても、例えば、等電点がアル力リ側にある塩基性夕ンパク質のように、 P Hが等電点より小さい場合に電荷としては塩基性を示す高分子物質は、本明細書にいう「塩基性高分子物質」に該当するものである。更に、本明細書において「高分子物質」の用語は、例えばキトサンテトラマ一等のような分子量が 8 0 8程度の物質をも含めて用いられる。上記塩基性高分子物質としては、例えば、キトサン、ポリリジン、コレスチラミンレジンゃコレスチミド等の高脂血症用陰イオン交換樹脂、プロ夕ミン、ゼラチン、アミノアルキルメタクリレートコポリマー E、アミノアルキルメタクリレ —トコポリマー R S、ラクトフエリン、リゾチーム等を挙げることができる。上記キトサンは、力二の甲羅、ェビの殻、イナゴ、カイコ、サナギ等の昆虫の表皮、椎茸、エノキダケ等のキノコ類、クモノスカビ等の接合菌類の細胞壁の成分等の主成分であるキチン質を化学処理して得られる高分子多糖類であり、抗癌性、抗菌性、免疫機能向上作用等を有するものとして公知の物質である。

特開平 8— 1 6 5 2 4 6号公報には、高核酸素材とキトサンを含有してなる生理活性促進剤が開示され、特開平 1 0— 1 9 1 9 2 8号公報には、キトサンとビフィズス菌を含有する健康食品が開示されている。しかしながら、キトサンが乳酸菌の消化管及び又は泌尿生殖器への付着性向上に寄与する効果を有するとの知見は得られておらず、本発明の奏する効果を考慮すると本発明に到達することは困難であつたと思われる。

本発明で使用されるキトサンは、天然より得られるキチンをアルカリ処理して得られる脱ァセチル化物である。このキトサンは、平均分子量のサイズにより、また脱ァセチル化度の度合いにより、多くの種類があるが、本発明に用いるキトサンはこれら各種のキトサン（キトサンオリゴ糖を含む）を意味する。良く知られているように、キトサンは食品であり、安全性が高く本発明の目的に非常に良く合致している。

本発明における乳酸菌に対するキトサンの使用量は、乳酸菌 1 X 1 0 ⁹ 個に対して 0 0 0 1 5 m g以上が好ましい。より好ましくは、 0 . O O l m g以上である。 WO ft9/64023 _g PCT/JP99/03017 本発明で使用されるポリリジンは、必須アミノ酸である L—リジンのホモポリマーであって、 L—リジンの ε—Ν末端と C末端とがアミド結合により η個結合され、重合度（η) は、約 20〜25である。ポリリジンは既に公知の化合物であつて微生物増殖抑制作用等の活性も明らかにされている。

本発明における乳酸菌に対するポリリジンの使用量は、乳酸菌 1 X 1 0⁹ 個に対して 00015mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. O O lm.g 以上である。

本発明で使用される高脂血症用陰ィォン交換樹脂としては特に限定されず、例えば、、コレスチラミンレジン（Cho l e s t y r am i n e Re s i n) 、コレスチミド（C o 1 e s t i m i d e) 等を挙げることができる。上記コレスチラミンレジンは、合成強塩基ァニオン交換樹脂のコレステロール吸着剤として既に公知の化合物であり、ダウエックス 1—X2— C 1 ； MK— 135として巿販されている物質であって、メルクインデックスにもナンバー 2257として記載されている。上記コレスチミドは、高脂血症用剤として既に公知の化合物であり、コレバインとして市販されている物質である。

本発明における乳酸菌に対する高脂血症用陰イオン交換樹脂の使用量は、乳酸菌 1 X 10⁹ 個に対して 0. 0001 5 mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. 00 lmg以上である。

本発明で使用されるプロ夕ミンは、主として魚類の精細胞核に DNAと結合した核タンパク質（ヌクレオプロ夕ミン）として存在する塩基性の強いタンパク質であって、例えば、 J. An t i b a c t. An t i f u n g. Ag e n t s Vo l . 23, No l O, pp 635〜642 (1995) 等に記載された既に公知の物質である。プロ夕ミンは、現在ではその抗菌性を利用して食品保存料として主として食品分野において使用されており、そのアミノ酸組成や立体構造等についても判明している。

本発明における乳酸菌に対するプロ夕ミンの使用量は、乳酸菌 1 X 1 0⁹ 個に対して 0. 00015mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. 00 lmg 以上である。

本発明で使用されるゼラチンは、例えば、動物の骨、じん帯又はけんを酸又はアルカリで処理した得られる粗コラーゲンを水で加熱抽出して調製することができるタンパク質であって、日本薬局方にも記載された公知の物質である。

ゼラチンを本発明に使用するときには、酸処理して得られたゼラチンを用いることが好ましい。上記酸処理して得られたゼラチンの等電点は、 pH7. 0〜9 • 0であり、 pHが等電点より小さいときは、十の電荷を有するものであって、本明細書にいう塩基性高分子物質のひとつである。

本発明における乳酸菌に対するゼラチンの使用量は、乳酸菌 1 X 10⁹ 個に対して 00015mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. O O lmg以上である。

本発明で使用されるァミノアルキルメ夕クリレ一トコポリマー Eは、メタクリル酸メチル Zメタクリル酸ブチルノメタクリル酸ジメチルァミノェチル三元共重合体であって、例えば、医薬品錠剤や顆粒のコーティング剤として使用されている既に公知の物質であり、例えば、オイドラギット E (レーム社製）として市販されているものである。アミノアルキルメタクリレートコポリマー Eは有機溶媒には溶け水にはほとんど溶けないが、塩基性を示すことから本明細書にいう塩基性高分子物質のひとつである。

本発明における乳酸菌に対するアミノアルキルメタクリレートコポリマー Eの使用量は、乳酸菌 1 X 1 0⁹ 個に対して 0. 000 1 5 mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. O O lmg以上である。

本発明で使用されるァミノアルキルメタクリレートコポリマー RSは、ァクリル酸ェチル /メタクリル酸メチル /メタクリル酸塩化トリメチルァンモニゥムェチル三元共重合体であって、例えば、医薬品錠剤や顆粒のコーティング剤として使用されている既に公知の物質であり、例えば、オイドラギット RS、オイドラギットリタード、オイドラギット RL (レーム社製）として市販されているものである。アミノアルキルメタクリレ一トコポリマー RSは有機溶媒には溶け水にはほとんど溶けないが、塩基性を示すことから本明細書にいう塩基性高分子物質のひとつである。

本発明における乳酸菌に対するアミノアルキルメタクリレ一トコポリマ一 RS の使用量は、乳酸菌 1 X 10⁹ 個に対して 0. 000 1 5 mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. O O lmg以上である。

本発明で使用されるラクトフエリンは、例えば、ヒトゃ動物の乳中に存在する多機能性タンパク質として既に公知の物質である。ラクトフエリンは、分子量約 8万のタンパク質であって、ヒト由来のラクトフエリン、牛由来のラクトフエリンのアミノ酸配列は既に決定されている。ラクトフエリンは塩基性を示すことから、本明細書にいう塩基性高分子物質のひとつである。

本発明における乳酸菌に対するラクトフエリンの使用量は、乳酸菌 1 X 10⁹ 個に対して 0. 00015mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. 001m g以上である。

本発明で使用されるリゾチームは、細菌細胞壁のムコぺプチド等の N—ァセチルムラミン酸と N—ァセチルダルコサミン間の /31— 4結合を加水分解する酵素として既に公知の物質である（EC3. 2. 1. 17. ) 。例えば、ニヮトリ卵白由来のリゾチームは、 129個のアミノ酸からなる 1本鎖ポリペプチドで、分子量 14300、等電点 1 1であって、本明細書にいう塩基性高分子物質のひとつである。

本発明における乳酸菌に対するリゾチームの使用量は、乳酸菌 1 X 10⁹ 個に対して 00015mg以上が好ましい。より好ましくは、 0. O O lmg 以上である。

本発明においては、上記塩基性高分子物質は、単独で、又は、 2種以上を併用して用いることができる。

本発明の乳酸菌含有組成物は、ヘリコバクタ一 'ピロリの除菌のために用いることができる。既に述べたように乳酸菌はへリコバクタ一 ' ピロリの除菌効果を有するが、本発明の消化管及び/又は泌尿生殖器への付着性を向上させた乳酸菌含有組成物は、へリコパクター 'ピロリの除菌に対して、乳酸菌を単独で含有する組成物に比較して極めて優れた効果を発現する。

本発明の乳酸菌含有組成物は、腸管出血性大腸菌の除菌のために用いることができる。既に述べたように乳酸菌は腸管出血性大腸菌の除菌効果を有するが、本発明の消化管への付着性を向上させた乳酸菌含有組成物は、腸管出血性大腸菌の除菌に対して、乳酸菌を単独で含有する組成物に比較して極めて優れた効果を発現する。

本発明の乳酸菌含有組成物は、食物ァレルギ一症治療のために用いることができる。既に述べたように乳酸菌は食物ァレルギ一症治療効果を有することが確認されているが、本発明の消化管への付着性を向上させた乳酸菌含有組成物は、食物ァレルギ一症治療に対して、乳酸菌を単独で含有する組成物に比較して極めて優れた効果を発現する。

本発明の乳酸菌含有組成物は、泌尿生殖器における感染症の治療及びノ又は予防のために用いることができる。既に述べたように乳酸菌は泌尿生殖器における感染症の治療及び又は予防を有することが確認されているが、本発明の泌尿生殖器への付着性を向上させた乳酸菌含有組成物は、泌尿生殖器における感染症の治療及び Z又は予防に対して、乳酸菌を単独で含有する組成物に比較して極めて優れた効果を発現する。

上記泌尿生殖器における感染症としては特に限定されず、例えば、細菌性膣症、真菌性膣炎、再発性尿路感染症等を挙げることができる。

本発明の乳酸菌含有組成物は、各種の方法で製造することができる。例えば、塩基性高分子物質粉末と乳酸菌懸濁液を混合する方法、塩基性高分子物質を水に溶解又は懸濁した液と乳酸菌懸濁液を混合する方法、塩基性高分子物質を水に溶解又は懸濁した液と乳酸菌粉末を混合する方法によって、本発明の乳酸菌含有組成物が得られる。

更に、これらに適切な安定化剤を加えて凍結乾燥等の乾燥によって粉末化することもできる。その混合する際の条件としては、濃度に特に制限はないが、温度や p Hは乳酸菌の安定性を考慮して設定することが望ましい。

例えば、乳酸菌懸濁液及び塩基性高分子物質水溶液又は塩基性高分子物質懸濁液の温度は 6 O t:以下、 p Hは 2から 9が好ましい。また、塩基性高分子物質粉末と乳酸菌粉末を混合する方法によっても本発明の乳酸菌含有組成物が得られる。塩基性高分子物質としてキ卜サン又はアミノアルキルメタクリレートコポリマ — Eを用いる場合、キトサン水溶液又はァミノアルキルメタクリレートコポリマ一 E水溶液を調製する際は、キトサン又はアミノアルキルメタクリレートコポリマ一 Eは通常酸性条件で膨潤溶解するので、酸成分を添加することが好ましい。上記酸成分としては特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、アジピン酸、コハク酸、リンゴ酸、クェン酸、酒石酸等を挙げることができる。

このようにして得られた本発明の乳酸菌含有組成物は、医薬又は食品としてヒト又は動物に対して投与又は摂取される。本発明の乳酸菌含有組成物からなる医薬もまた、本発明の一つであり、本発明の乳酸菌含有組成物からなる食品もまた、本発明の一つである。

上記医薬又は食品とするためには、常法に従って種々の形態とされる。消化管に対する投与形態としては例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、トローチ、シロップ剤等が好ましく経口的に安全に投与することができる。泌尿生殖器に対する投与形態としては例えば、座薬、錠剤、カプセル剤、クリーム、ゲル、軟膏、ローション、洗浄剤、灌注液等を挙げることができる。

これらの各種製剤は常法に従って、乳酸菌含有組成物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、滑沢剤等の医薬又は食品の製剤技術分野において通常使用しうる添加剤を用いて製剤化することができる。

ヒトに対する投与量は、対象疾患、疾病の程度によって異なるが、例えば成人に対して生菌数で 1日 1 X 1 0 ⁶ 個以上を、好ましくは 1 X 1 0 ⁸ 〜1 X 1 0 ¹ ²個を必要に応じて 1日 1回又は数回に分けて投与することができる。

賦形剤としては例えば、白糖、乳糖、マンニトール、グルコース等の糖類、トゥモロコシデンプン、バレイショデンプン、コメデンプン、部分ひ化デンプン等のデンプン類等を挙げることができる。

結合剤としては例えば、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、グァーガム、アラビアゴム、寒天等の多糖類、トラガント、ゼラチン、グルテン等の天然高分子類、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシプロピルェチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリゥム等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、酢酸ビニル榭脂等の合成高分子等を挙げることができる。

崩壊剤としては例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、カルボキシメチルスターチナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コメデンプン、部分 α化デンプン等のデンプン類等を挙げることができる。

滑沢剤としては例えば、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイダルシリカ、含水二酸化ケイ素、ワックス類.、硬化油等を挙げることができる。

コーティング剤としては例えば、ジメチルアミノエチルメ夕ァクリレート ·メ夕アクリル酸共重合体、ポリビニルァセタ一ルジェチルァミノアセテート、ァクリル酸ェチル ·メタアクリル酸共重合体、アクリル酸ェチル ·メタアクリル酸メチル ·メタアクリル酸塩化トリメチルアンモニゥムェチル共重合体、ェチルセルロース等の水不溶性高分子、メタアクリル酸 'アクリル酸ェチル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセル口一スフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセル口 —スアセテートサクシネート等の腸溶性高分子、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子等を挙げることができる。

本発明の乳酸菌含有組成物は食品に添加することもできる。食品としては特に制限はされないが、例えば、ヨーグルト等の発酵乳を挙げることができる。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例、試験例及び処方例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

なお、本発明の効果の検討では、主として胃細胞のモデルとして常法で用いられている様にヒト胃癌細胞 ΜΚΝ45 ( J CRB 0254、山ロ晴之ら、感染症学雑誌、 72巻、 487頁、 1998年）、腸管細胞のモデルとして常法で用いられているようにヒト大腸癌細胞 C a c o 2 (ATCC HTB— 37、 Co c onn i e r MHら、 FEMS M i c r ob i o l . L e t t. 1 10巻、 299頁、 1993年）、食物アレルギーのモデル系として、乳酸菌により I L— 12を分泌する単球型白血病細胞 THP— 1 (I n f e c t Immun 1 ο

64卷、 1906頁、 1996年）、泌尿生殖器細胞のモデルとして常法で用いられているようにヒト子宮癌細胞 He L a (RCB 007、 Ge y GOら、 C an c e r Re s. 12卷、 264頁、 1952年）を用いているが、これは i n V i t r oでの検討を容易にするためのことである。実施例 1

乳酸菌を MRSブロス（ディフコ社製）に接種後、 37で、 16時間液体培養を行った。培養終了後、 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い培養液の濃縮菌体を得た。更に、得られた濃縮菌体に、 1N塩酸で pHを 5に調整したリン酸緩衝生理食塩液（以下「PBS (pH5) 」という。日水製薬社製）を加えて乳酸菌を 2 X 10⁹個ノ mL又は 3 X 10⁹個 mL含む懸濁液を得た。

キトサン（キトサン 10 脱ァセチル化度 80%以上 0. 5%粘度 5〜20 センチポアズ和光純薬工業社製）を蒸留水 3 OmLに懸濁し、続いて 1N塩酸を用いて溶解した後、 0. 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを 5に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しキトサン水溶液を得た。続いて、乳酸菌懸濁液 1 OmLとキトサン水溶液 1 OmLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た本発明の効果は次のようにして検討した。胃癌細胞 MKN45を細胞濃度が 5 X 10⁴個 ZmLになるように 10 %牛胎児血清を含む RPM 1 1640培地に懸濁させ、 9 6穴マイクロプレートに 1穴あたり 1 0 O 1分注した。 3 7でで 3日間培養後、マイクロプレートに付着した胃癌細胞 ΜΚΝ 45を PBSで 3回洗浄し胃癌細胞 ΜΚΝ 45の単層を調製した。別に、大腸癌細胞 Ca c o 2を細胞濃度が 5 X 10⁴個 ZmLになるように 20 %血清を含むイーグル MEM培地に懸濁させ、 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 1 0 0 1分注した。 3 7でで 3日間培養後、マイクロプレートに付着した大腸癌細胞 C a c o 2を PBSで 3回洗浄し大腸癌細胞 C a c o 2の単層を調製した。乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液を PBS (pH5) で 2倍希釈した液 0. lmLを胃癌細胞 MK N 45又は大腸癌細胞 C a c o 2の単層に加えて、 37で、 10分間インキュべ一卜した後、細胞を PBSで洗浄した。次に、乳酸菌をグラム染色し、光学顕微鏡を用いて細胞に付着した乳酸菌をカウントした。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 ΜΚΝ 4 5及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 1、 2 ) 。

表 1 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4) 生菌数キトサン濃度付着個数士 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ 10000 m²)

Lactobacillus salivarius WB1004 0 45±10

1 X10⁹

(FREM P- 15360) 1.25 491士 78**

Lactobacillus salivarius WB1004 0 45±10

1X10⁹

(FREM P- 15360) 0.15 368士 39**

Lactobacillus brevis WB1005 0 0

1.5X10⁹

(FREM P- 15361) 0.075 458±43**

Lactobacillus rhamnosus 0 3土 3

1.5X10⁹

(JCM1136) 0.6 514±226

Lactobaci 1 lus paracasei subsp. 0 0

1.5X10⁹

paracasei (CIP103918) 0.075 140土 28**

Lactobacillus casei 0 0

1.5X10⁹

(CIP103137) 0.075 77±21**

Lactobacillus plantarum 0 0

1.5X10⁹

(JCM1149) 0.075 181±56**

Lactobacillus salivarius subsp. 0 39±9

1.5X10⁹

salivarius(CIP103140) 1.25 353土 73**

Lactobacillus salivarius subsp. 0 9土 2

1.5X10⁹

salicinius(JCM1150) 1.25 213土 25**

Lactobacillus helveticus 0 7±2

1.5X10⁹

(JCM1120) 0.3 632±136**

Lactobacillus fermentum 0 12土 3

1.5X10⁹

(JCM1173) 0.3 831±248

Lactobacillus delbruecki i siibsp. 0 9土 4

1.5X10⁹

bulgaricus(JCM1002) 0.6 351±72**

Lactobacillus delbruecki i subsp. 0 6士 3

1.5X10⁹

lactis(JCM1248) 1.25 509±126*本表 1 (つづき）

Student's t- test**：有意差有り P<0.01

表 2 大腸癌細胞 C a c o 2への付着 (n = 4)

生菌数トサン暹

乳酸菌

(個/ ml) (nff/m] )

Lactobacillus sal ivarius WB1004 o

1X10⁹

(FREM P- 15360) 1, 25

Lactobacillus brevis WB1005 o 3士 2

1.5X10⁹

(FREM P- 15361) 0.075 1774： 7B**

Lactobacillus casei o 3士 1

1.5X10⁹

(CIP103137) 0.075 71 +¾4*

Lactobacillus plantarum 0 2±2

1.5X10⁹

(JCM1149) 0· 075 324土 169**

Lactobacillus acidophilus 0 11土 4

1.5X10⁹

(CIP76.13) 0.3 134土 58ί

Lactobacillus reuteri 0 65土 8

1X10⁹

(JCM1112) 0.6 1127±431

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01

Student's t- test* ：有意差有り Pく 0.05 実施例 2

乳酸菌を 1 %となるようにグルコースを添加した GAMブイヨン（日水製薬社製）に接種後、 37 、 24時間液体培養を行った。培養終了後、 3000 r p m 5分間遠心分離を行い培養液の濃縮菌体を得た。更に、得られた濃縮菌体に PBS (pH5) を加えて乳酸菌を 2 X 10⁹個ノ mL含む懸濁液を得た。

得られた乳酸菌懸濁液 1 OmLと、実施例 1と同様に調製したキトサン水溶液 1 OmLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 3 4) 表 3 胃癌細胞 MKN 45への付着性 (n = 4)

生菌数キトサン濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ 10000 m²)

Enterococcus faecal is 0 0

1X10⁹

(ATCC29212) 0.15 582土 114#ネ

Enterococcus faecal is 0 0

1X10⁹

(JCM5803) 0.075 312士 21**

Enterococcus faecium 0 0

1X10⁹

(JCM5804) 0.15 338土 73

Student's t- test**：有意差有り P<0.01

表 4 大腸癌細胞 C a c o 2への付着 (n = 4)

生菌数キトサン濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ 10000 ID²)

Enterococcus faecium 0 0

1X10⁹

(JCM5804) 0.15 314士 38**

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 3

実施例 1と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液 1 OmLと、実施例 1と同様に調製したキトサン水溶液 10 m Lとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 5、 6) 。表 5 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 4

実施例 2と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液 1 OmLと、実施例 1と同様に調製したキ卜サン水溶液 1 OmLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は大腸癌細胞 Ca c o 2への高い付着性を示した（表 7)

表 7 大腸癌細胞 C a c o 2への付着 t (n = 4)

生菌数キトサン濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ 10000 zra²)

Bifidobacterium bifidum WB1003 0 110±10

1X10⁹

(FREM P- 12612) 0.6 194士 35**

Bifidobacterium breve 0 11士 16

1X10⁹

(腿 192) 0.6 499士 34**

Bifidobacterium infant is 0 0

1X10⁹

(腿 222) 0.15 403土 61**

Bifidobacterium longum WB1001 0 0

1X10⁹

(FREM P - 12610) 0.3 362土 50**

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 5

特定保健用食品「明治ブルガリアヨーグルト」（明治乳業社製）及び「おなかへ GG！」（夕カナシ乳業社製）を滅菌 PBSで適宜希釈した後、 BL寒天培地に 0. lmL塗布した。 37°C、 3日間嫌気培養し、出現した集落を釣菌した。分離した菌株は、グラム染色とアビ 50 CL (日本ピオメリュー 'バイオテック社製）により同定を行った。「明治ブルガリアヨーグルト」からは、ラクトバシラス 'デルブリュッキイ亜種ブルガリカスとストレプトコッカス 'サリバリウス亜種サ一モフィラスを、「おなかへ GG！」からは、ラクトバシラス ' ラムノサスを分離同定した。分離同定した乳酸菌を実施例 1と同様に液体培養し乳酸菌を 3 X 10⁹個 ZmL含む懸濁液を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 8、 9) 。表 8 胃癌細胞 MKN 45への付着性 (n = 4)

生菌数キトサン濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ lOOOOjum²)

Lactobacillus delbruecki i subsp. 0 6土 1

1.5X10⁹

bulgaricus (明治乳業) 0.6 164土 10**

Streptococcus sal ivarius subsp. 0 44土 26

1.5X10⁹

thermophilus (明治乳業) 0.3 1356土 102

Lactobacillus rhamnosus 0 8土 3

1.5X10⁹

(夕カナシ乳業） 0.3 366±43幸本

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01

表 9 大腸癌細胞 C a c o 2への付着 (η = 4)

生菌数キトサン濃度付着個数士 SD 乳酸菌

(個/ ml) (mg/ml) (個/ 10000 m²)

Lactobacillus delbruecki i subsp. 0 7士 3

1.5X10⁹

bulgaricus (明治乳業) 0.15 1210±637

Streptococcus sal ivarius subsp. 0 37士 26

1.5X10⁹

thermophilus (明治乳業) 0.15 1159士 305本 *

Lactobacillus rhamnosus 0 10土 3

1.5X10⁹

(夕カナシ乳業） 0.15 1797±239

Student's t-test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 6

実施例 1で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液及びラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004組成物懸濁液を凍結乾燥し、ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004粉末及びラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物粉末を得た。

本発明の効果は、ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004粉末及びラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物粉末を日局 1液（pH 1. 2) に懸濁させ、実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 ΜΚΝ45への高い付着性を示した（表 10) 。

表 10 胃癌細胞 ΜΚΝ 45への付着性（η = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 7

実施例 1と同様の方法で得たラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液 5mLを 3000 r pm、 5分間遠心分離を行いラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004の濃縮菌体を得た。

各種のキトサン（キトサンオリゴ糖を含む）を蒸留水 3 OmLに懸濁し、続いて 1N塩酸を用いて溶解した後、 0. 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しキトサン水溶液を得た。続いて、乳酸菌の濃縮菌体にキトサン水溶液 1 OmLを加えて乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 1 1、 12) 。

表 1 1 胃癌細胞 MKN 45への付着性（n = 4)

キトサン溶液キ卜サン濃度付着個数士 SD キトサン

(DH) tmcr/ml Cflil/1 nnnn m² キトサン 100 脱ァセチル化 0 36士 17 度 80 %以上 0. 5 %粘度

5

50 L 50センチポアズ 0.25 205土 23 和光純薬

キトサン 100 脱ァセチル化 u

度 80%以上 0. 5%粘度

5

300 700センチポアズ 0.3 200±17 和光純薬

キトサン 1000 脱ァセチ化 0 36土 17 度 75 90% 0. 5 %粘度

5

800 1 300センチポアズ 0.25 190土 20** コ一ョ一キトサン脱ァセチ化 0 36士 17 度 46. 1 % 0. 5%粘度

2

3 " 5セ ^、チポアズ、 υ. υυυι ο 1 Uo ± Z1 甲陽ケミカル

キトサン脱ァセチル化度 7% 0 36土 17 0. 5%粘度 430センチポア 5

0.75 648土 163*本ズ焼津水亲化^:

キミツキトサン脱ァセチル化 0 36土 17 度 75~85% 0. 5 %粘度

4.5

5 20センチポアズ υ 14 ¾ΠU - ϋ Q7 ί± +± 君津化学

キミツキトサン脱ァセチル化 0 36±Π 度 95%以上 0. 5%粘度 5 6.5

2.5 173±40** ~20センチポアズ君津化学 (つづき）

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 8

実施例 1と同様の方法で得たラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液 5mLを 3000 r pm、 5分間遠心分離を行いラクトバシラス ·サリノ'リウス WB 1004の濃縮菌体を得た。

キトサン（キトサン 10 脱ァセチル化度 80%以上 0. 5%粘度 5〜20 センチポアズ和光純薬社製、又は、キトサン LL 脱ァセチル化度 80%以上

0. 5%粘度 20センチポアズ以上焼津水産化学社製）を蒸留水 3 OmLに懸濁し、各種の酸を用いて溶解した後、 0. 1N水酸化ナトリウムを添加して p Hを 3又は 5に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しキトサン水溶液を得た。続いて乳酸菌の濃縮菌体にキトサン水溶液 1 OmLを加えて乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MK N 4 5及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 1 3 ) 。

表 13 胃癌細 f ISMKN45への付着性（n = 0

キトサンを溶解キトサン溶液キトサン濃度付着個数土 SD

キトサン

した酸成分 pH ung/ml) (個/ 10000 m²)

0 36±17 酢酸キトサン 10 3

0.075 229±31**

0 36土 Π 乳酸キトサン 10 3

0.075 295±70**

0 36土 17 クェン酸キトサン 10 3

0.15 367±26**

0 36±17 ァスコルビン酸キトサン 10 3

0.075 364士 85**

0 36士 17 コハク酸キトサン 10 3

0.075 662士 144

0 36土 17 酒石酸キトサン 10 3

0.075 346±38**

0 36±17 リンゴ酸キトサン 10 3

1.25 353±92**

0 29±7 ァスパラギン酸キトサン LL 5

0.15 1802土 162

0 32士 2 グルタミン酸キトサン LL 5

0.15 1811土 196

0 105士 25 アジピン酸キトサン LL 5

0.15 1802±358**

0 105土 25 マレイン酸キトサン LL 5

0.15 1931±134*本

0 105土 25 ニコチン酸キトサン LL 5

0.15 Π06土 93

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 9

ァモキシシリン（シグマ社製）を 200 xgZmL、バンコマイシン（塩野義製薬社製）を 10 gZmLとなるように飲水に添加し、 I CRマウス（雄、 5 週齢）を 5日間飼育し、胃内の菌を除菌した。続いて、飲水を滅菌水に変え、一晚絶食させた後に実施例 1、実施例 17、実施例 19と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物懸濁液及びラクトバシラス •サリバリウス WB 1004懸濁液を PBSで 2倍希釈した液を 0. 5mL (8 X 10⁸個）経口投与した。 30分後、マウスを屠殺して胃を摘出し、胃内容物を除いた後、更に PBSで洗浄した。胃重量の 9倍量の 0. 5M NaC lを加えてガラスホモジナイザーでホモジナイズし、得られたホモジネートを 0. 5M

NaC 1で適宜希釈してから、変法 LBS寒天培地（光岡知足、腸内菌の世界、叢文社）のシャーレに塗布した。シャーレを 37 、 24時間嫌気培養して出現したコロニー数により胃に付着した菌数を求めた。また、出現したコロニ一の数個をアビ 50CH (日本ピオメリュー 'バイテック社製）により同定したところ投与したラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004であることを確認した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物はマウス胃への高い付着性を示した（表 1 4) 。

表 14 マウス胃への付着性（n = 4〜5)

Student's t-test *:有意差有り P<0. 0 5

Student's t-test **:有意差有り P<0. 0 ] 実施例 10

胃癌細胞 ΜΚΝ45を細胞濃度が 5 Χ 10⁴個 mLになるように 10 %牛胎児血清を含む RPM I 1640培地に懸濁させ、 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 0. lmL分注した。 37°Cで 3日間培養後、マイクロプレートに付着した胃癌細胞 MKN45を PB Sで 3回洗浄し胃癌細胞 MKN45の単層を調製した。

実施例 1で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液又はラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物懸濁液 0. lmLを胃癌細胞 MKN 45の単層に加えて、 30分間インキュベートした後、胃癌細胞 MKN 45を PB Sで 3回洗浄した。次に PBS O. lmLを添加し、超音波破砕装置 (モデル 7250、セイコー電子工業社製）により超音波処理を 20 kHz、 5 秒間行って、胃癌細胞 MKN45を可溶化するとともに、細胞に付着したラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004を分散させた。その後超音波処理液を PB Sで適当に希釈して、 MRS寒天平板培地に塗布し、ラクトバシラス 'サリバリウス WB 1004の生菌数を測定した。その結果、胃癌細胞 MKN45への付着生菌数はラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液を用いた場合、 1穴の細胞あたり 10⁴· ⁸±°· ¹であったのに対し、本発明のラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物の懸濁液を用いた場合、 10⁶· ³±⁰· ¹であり約 30倍向上することがわかった。実施例 1 1

ポリリジン（50%ポリリジン、アサマ化成社製）を PBS l O OmLに溶解した。このポリリジン溶液 1 OmLと、実施例 1又は 2と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（PH 7、 2 X 10⁹個 ZmL) 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。ただし、大腸癌細胞 C a c o 2への付着試験は、 pH 7で 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 15、 16) 。表 15 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P〈0.01

表 16 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 12

コレスチラミンレジン（シグマ社製）を PBS 10 OmLに懸濁した。このコレスチラミンレジン懸濁液 10 m Lと、実施例 1又は 2と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（pH 7、 2 X 10⁹個 ZmL) 10 mLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。ただし、大腸癌細胞 Ca c o 2への付着試験は、 PH7で 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 17、 18) 。表 17 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t-test**：有意差有り Pく 0.01

表 18 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 13

プロ夕ミン（アサマ化成社製）を水 6 OmLに溶解した後、更に塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した。 1N塩酸を添加して pHを 4に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整し 2. 5%及び0. 15 %のプロ夕ミン水溶液を得た。このプロ夕ミン水溶液 1 OmLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリゾリウス WB 1004懸濁液（pH4、 3 X 10⁹個 ZmL) 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45 及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 19、 20)

表 1 9 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 14

硫酸プロ夕ミン（鮭製、和光純薬社製）を水 6 OmLに溶解した後、更に塩化ナトリウム 9 gを加えて溶解した。 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを 7に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整し、 0. 06〜0. 5%のプロ夕ミン水溶液を得た。このプロ夕ミン水溶液 1 OmLと、実施例 1又は 2と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（pH7、 3 X 10⁹個 ZmL) 10mLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本組成物の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。ただし、付着試験は pH 7で 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 21) 。表 21 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 15

実施例 1、実施例 5と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（3 X 10⁹個/ m L) 1 OmLを 3000 r pm、 10分間遠心分離し乳酸菌の濃縮菌体を得た。ゼラチン（タイプ AP— 100 新田ゼラチン社製）を水 8 OmLに懸濁し、 50°Cで加温溶解した後放冷した。塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した後、 1 N塩酸を添加して pHを 3に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しゼラチン水溶液を得た。続いて、乳酸菌の濃縮菌体にゼラチン水溶液 2 Om Lを添加し乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法にて検討した。ただし付着試験は 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 22、 23) 。

表 22 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 16

低分子ゼラチン（宮城化学工業社製） 10 gを水 8 OmLに溶解し、更に塩化ナトリウム 9 gを加えて溶解した。 1N塩酸を添加して pHを 3に調整し、水を加えて液量を 10 OmLに調整し、低分子ゼラチン水溶液を得た。この 10 %低分子ゼラチン水溶液 1 OmLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液（pH3、 3 X 10⁹個 mL) 10 mLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。ただし、付着試験は 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45への高い付着性を示した（表 24) 。

表 24 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 17

アミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 RS (オイドラギット RL 100 、レーム社製）を水 8 OmLに懸濁し、続いて攪拌下 80でで 2時間加熱してァミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 RSを分散した（平均粒子径 49. 3 nm) 。 PBS粉末（ダルベッコ PBS (-) 、日水製薬社製） 0. 96 gを加えて溶解し、更に、水を加えて液量を 10 OmLに調整した後、フィルタ一（1 . 2 urn) 濾過し、アミノアルキルメタァクリレートコポリマ一gS水分散液を得た。このアミノアルキルメタァクリレ一トコポリマ一 RS水分散液 1 OmLと、実施例 1、実施例 5と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（pH7、 3 X 10 9個 ZmL) 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 25、 26 表 25 胃癌細胞 MKN 45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 Student's t - test* ：有意差有り Pく 0.05

表 26 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01

Student's t- test* ：有意差有り P〈0.05 実施例 18

アミノアルキルメタァクリレートコポリマー RS (オイドラギット RS 100 、レーム社製）を水 80mLに懸濁し、続いて攪拌下 80 で 2時間加熱してァミノアルキルメタァクリレートコポリマー RSを分散した（平均粒子径 60. 9 nm) 。塩化ナトリウム 0. 9 gを溶解し、 1 N塩酸を添加して pHを 4に調整し、更に水を加えて 10 OmLに調整した後、フィルタ一（1. 2 zm) 濾過しアミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 RS水分散液を得た。このアミノアルキルメタァクリレートコポリマー RS水分散液 1 OmLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液（pH4、 3 X 10⁹個 ZmL) 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 Ca c o 2への高い付着性を示した（表 27 、 28) 。

表 27 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test* ：有意差有り P<0.05 実施例 19

実施例 1、実施例 5と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（3 X 10⁹個/ m L) 1 OmLを 3000 r pm、 10分間遠心分離し乳酸菌の濃縮菌体を得た。アミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 E (オイドラギット E 100、レーム社製）水 6 OmLに懸濁し、続いて 1N塩酸を用いて溶解した後、更に塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した。 0. 1 N水酸化ナトリウムを添加して p Hを 5に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整し、アミノアルキルメ夕ァクリレートコポリマ一 E水溶液を得た。続いて、乳酸菌の濃縮菌体にアミノアルキルメタァクリレートコポリマー E水溶液 20 m Lとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。ただし、付着試験は 30分間行った。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 4 5及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 29、 30) 。表 29 胃癌細胞 MKN 45への付着性（n = 4)

Student's t-tes *：有意差有り Pく 0.01 Student's t- test* ：有意差有り P<0.05

表 30 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 20

ラクトフエリン（和光純薬社製） 5 gを水 6 OmLに溶解した後、更に塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した。 1N塩酸を添加して pHを 4に調整し、水を加えて液量を 10 OmLに調整した後、フィルタ一（1. 2 m) 濾過しラクトフエリン水溶液を得た。この 5%ラクトフエリン水溶液 1 OmLと、実施例 1 と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液（p H4、 3 X 1 0⁹個 ZmL) 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45への高い付着性を示した（表 31) 。表 31 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 21

卵白リゾチーム（和光純薬社製）を水 6 OmLに溶解した後、更に塩化ナトリゥム 0. 9 gを加えて溶解した。 1N塩酸を添加して pHを 4に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整し、リゾチーム水溶液を得た。このリゾチーム水溶液 1 OmLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス 'サリノリウス WB 1004懸濁液（pH4、 3 10⁹個/111 ） 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45及び大腸癌細胞 C a c o 2への高い付着性を示した（表 32、 33) 。

表 32 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 表 33 大腸癌細胞 C a c o 2への付着性（n = 4)

Student's t - test* ：有意差有り P<0.05 実施例 22

実施例 1と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（3 10⁹個 1111^) lmL を3000 111、 5分間遠心分離して乳酸菌の濃縮菌体を得た。ここに、実施例 1、実施例 15、実施例 17、実施例 20と同様の方法で得られたキトサン水溶液、ゼラチン水溶液、オイドラギット RL 100懸濁液、ラクトフエリン水溶液を混合した液 1 mLを添加し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45への高い付着性を示した（表 34) 。

表 34 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り Pく 0.01 実施例 23

実施例 1、実施例 5と同様の方法で得られた乳酸菌培養液（3ズ 10⁹個 111 L) を3000 01、 5分間遠心分離して乳酸菌の濃縮菌体を得た。得られた濃縮菌体に P B Sを加えて乳酸菌を 3 X 1 0⁹個 mL含む懸濁液を得た。

キトサン（キトサン 10) を蒸留水 3 OmLに懸濁し、続いて 1N塩酸を用いて溶解した後、 0. 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを 5に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しキトサン水溶液を得た。続いて、乳酸菌懸濁液 1 mLとキトサン水溶液 lmLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果は次のようにして検討した。単球型白血病細胞 THP— 1を細胞濃度が 6 X 10⁶個 mLになるように PBSに懸濁させ、 96穴マイクロプレ —卜に 1穴あたり 50 1分注した。

乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液を PBSで 2倍希釈した液 50 1 を先に分注した単球型白血病細胞 THP— 1に加えて、 37 、 30分間インキュペートした。 15%ショ糖を含む PBSを 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 200 1分注し、これに 30分間インキュベートした単球型白血病細胞 TH P— 1細胞と乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液の反応液 20 1を重層した後、 500 r pm、 5分間遠心分離を行い細胞沈査を得た。更に、得られた細胞沈査に PBS 200 1を加えて洗浄し、再度 500 r pm、 5分間遠心分離を行い細胞沈查を得た。次に、乳酸菌をグラム染色し、光学顕微鏡を用いて細胞に付着した乳酸菌をカウントした。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は単球型白血病細胞 THP— 1への高い付着性を示した（表 35) 。

表 35 単球型白血病細胞 THP— 1への付着性（n = 4)

Student's t- test：有意差有り *:Pく 0.05, **:P<0.01 実施例 24

実施例 23と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液 lmLと、実施例 17と同様の方法で得られたァミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 RS水分散液 1 m Lとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 23と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は単球型白血病細胞 THP— 1への高い付着性を示した（表 36) 。表 36 単球型白血病細胞 THP— 1への付着性（n = 4)

Student's t- test：有意差有り *:P<0.05, **:P<0.01 実施例 25

実施例 23と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液 lmLと、実施例 1 9と同様の方法で得られたァミノアルキルメタァクリレートコポリマー E水分散液 1 m L とを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果は次のようにして検討した。単球型白血病細胞 THP— 1を細胞濃度が 6 X 1 0⁶個/ mLになるように生理食塩液（pH 5) に懸濁させ、 96 穴マイクロプレートに 1穴あたり 50 1分注した。

乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液を生理食塩液（PH5) で 2倍希釈した液 50 1を先に分注した単球型白血病細胞 THP— 1に加えて、 37 , 60分間インキュベートした。 1 5%ショ糖を含む PBSを 96穴マイクロプレ一卜に 1穴あたり 200 1分注し、これに 60分間インキュベートした単球型白血病細胞 THP 1細胞と乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液の反応液 20 ^ 1を重層した後、 500 r pm、 5分間遠心分離を行い細胞沈査を得た。更に、得られた細胞沈査に PBS 200 1を加えて洗浄し、再度 500 r p m、 5分間遠心分離を行い細胞沈査を得た。次に、乳酸菌をグラム染色し、光学顕微鏡を用いて細胞に付着した乳酸菌をカウントした。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は単球型白血病細胞 THP— 1への高い付着性を示した（表 37)

Student's t- test：有意差有り *:Pく 0.05, **:P<0.01 実施例 26

実施例 23と同様の方法で得られた乳酸菌培養液（3 X 10⁹個 1111^) を 3 000 r pm、 5分間遠心分離して乳酸菌の濃縮菌体を得た。得られた濃縮菌体に生理食塩液（pH4) を加えて乳酸菌を 3 X 10⁹個 ZmL含む懸濁液を得たゼラチン（タイプ ΑΡ— 100 新田ゼラチン社製）を水 80mLに懸濁し、 50°Cで加温溶解した後放冷した。塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した後、 1 N塩酸を添加して pHを 4に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しゼラチン水溶液を得た。続いて、乳酸菌懸濁液（生理食塩液、 pH4) lm Lとゼラチン水溶液 1 mLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果は次のようにして検討した。単球型白血病細胞 THP— 1を細胞濃度が 6 X 10⁶個/ mLになるように生理食塩液（pH4) に懸濁させ、 96 穴マイクロプレートに 1穴あたり 50 1分注した。

乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液を生理食塩液（PH4) で 2倍希釈した液 50 [1 1を先に分注した単球型白血病細胞 THP_ 1に加えて、 37 ：、 90分間インキュベートした。 15%ショ糖を含む PBSを 96穴マイクロプレ —卜に 1穴あたり 200 1分注し、これに 90分間インキュベートした単球型白血病細胞 THP— 1細胞と乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液の反応液 20 1を重層した後、 500 r pm、 5分間遠心分離を行い細胞沈査を得た。更に、得られた細胞沈査に PBS 200 1を加えて洗浄し、再度 500 r p m、 5分間遠心分離を行い細胞沈査を得た。次に、乳酸菌をグラム染色し、光学顕微鏡を用いて細胞に付着した乳酸菌をカウン卜した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は単球型白血病細胞 THP— 1への高い付着性を示した（表 38)

表 38 単球型白血病細胞 THP— 1への 1【寸着性（n = 4)

高分子濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(mg/ml) (個/細胞）

Lactobacillus gasseri 0 1土 1

(JCM 1131) 0.32 5土 *

Lactobacillus johnsoni i 0 2±2

(CNCM 〖-1225) 1.3 12±9

Lactobacillus rhamunosus 0 0.2土 0.1 (夕カナシ乳業） 0.32 10士 3*

Lactobacillus plantarum 0 1±0.3

(JCM 1149) 0.08 2士 1*

Enterococcus faecium 0 1±2

(JCM 5804) 5.0 16士 9*

Bifidobacterium infant is 0 1士 1

(JCM 1222) 5.0 11土 13孝

Student's t- test：有意差有り *:P<0.05, **:P<0.01 実施例 27

本発明の乳酸菌含有組成物による薬理作用の増大効果を調べるため、薬理作用物質の一つである乳酸に着目し、細胞に付着した乳酸菌の産生する乳酸量を、以下の方法により測定した。実施例 1、実施例 12、実施例 14、実施例 15、実施例 17、実施例 19と同様の方法で得た乳酸菌（ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004又はェンテロコッカス ·フエシゥム J CM5804) 含有組成物を、実施例 1と同様の方法で胃癌細胞 MKN 45に付着させた。 P BSで 3回洗浄した後、ハンクス平衡塩溶液（ギブコ社製、以下 HBS Sという） 0. lmL を添加して、 37 で、 3時間インキュベートした。上清中に産生した乳酸をメ夕ノール硫酸によりメチルエステル化した後、クロ口ホルムにより抽出し、ガスクロマトグラフィーで定量した。その結果、細胞に付着した本発明の乳酸菌含有組成物は高い乳酸産生量を示した（表 39) 。表 39 胃癌細胞 MKN45に付着した乳酸菌による乳酸産生

実施例 28

本発明の乳酸菌含有組成物による薬理作用の増大効果を調べるため、薬理作用物質の一つである乳酸に着目し、細胞に付着した乳酸菌の産生する乳酸量を、以下の方法により測定した。実施例実施例 15、実施例 17、実施例 19と同様の方法で得た乳酸菌（ラクトバシラス 'サリバリウス WB 1004) 含有組成物を、実施例 1と同様の方法で大腸癌細胞 Ca c o 2に付着させた。 PBSで 3 回洗浄した後、 HBS S O. lmLを添加して、 37 で、 3時間インキュべ一卜した。上清中に産生した乳酸をメタノール硫酸によりメチルエステル化した後、クロ口ホルムにより抽出し、ガスクロマトグラフィーで定量した。その結果、細胞に付着した本発明の乳酸菌含有組成物は高い乳酸産生量を示した（表 40) 表 40 大腸癌細胞 C a c o 2に付着した乳酸菌による乳酸産生

実施例 29

水溶性キトサン誘導体（CHGA、東京化成品社製）を水に溶解した。 0. 5 N水酸化ナトリウムを添加して PHを 5に調整し、更に水を加えて液量を 100 mLに調整し水溶性キトサン誘導体水溶液を得た。この水溶性キ卜サン誘導体水溶液 1 OmLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリノリウス WB 1004懸濁液 1 OmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN45への高い付着性を示した（表 41) 。

表 41 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test**：有意差有り P<0.01 実施例 30

キトサンオリゴ糖（キトサンテトラマ一、キトサンペン夕マ一、キトサンへキサマー、生化学工業社製）をそれぞれ水に溶解した。 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを 7に調整し、更に水を加えて液量を lmLに調整しキトサンオリゴ糖水溶液を得た。このキトサンオリゴ糖水溶液 0. 5mLと、実施例 1と同様の方法で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004懸濁液 0. 5mL ズ pH7、 2 X 10⁹個 Zml) とを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 1と同様の方法で検討した（インキュベート時間は 30分間）。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は胃癌細胞 MKN 45への高い付着性を示した（表 42) 。

表 42 胃癌細胞 MKN45への付着性（n = 4)

Student's t- test*：有意差有り Pく 0.05

Student's t - test**：有意差有り P<0.01 実施例 31 一

実施例 1、実施例 5と同様の方法で乳酸菌懸濁液（3 10⁹個 01 ）を得た。

キトサン（キトサン 10 脱ァセチル化度 80%以上 0. 5%粘度 5〜20 センチポアズ和光純薬社製）を水 50mLに懸濁し、続いて 1N塩酸を用いて溶解した後、 0. 1N水酸化ナトリウムを添加して pHを 5に調整し、更に水を加えて液量を 10 OmLに調整しキトサン水溶液を得た。続いて乳酸菌懸濁液を 3000 r pm、 10分間遠心分離して得た乳酸菌の濃縮菌体（ 1. 5 X 10⁹ 個）にキトサン水溶液 lmLとを混合し、乳酸菌含有組成物を得た。

本発明の効果は次のようにして検討した。子宮癌細胞 He L aを細胞濃度が 5 X I 0⁴個 mLになるように 10 %血清を含むイーグル MEM培地に懸濁させ、 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 100 1分注した。 37 で 3日間培養後、マイクロプレートに付着した子宮癌細胞 H e L aを PBSで 3回洗浄し子宮癌細胞 H e L aの単層を調整した。乳酸菌含有組成物懸濁液又は乳酸菌懸濁液を PBS (pH5) で 2倍希釈した液 0. lmLを子宮癌細胞 He L aの単層に加えて、 37で、 10分間インキュベートした後、細胞を PBSで洗浄した。次に乳酸菌をグラム染色し、光学顕微鏡を用いて細胞に付着した乳酸菌をカウン卜した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は子宮癌細胞 He L aへの高い付着性を示した（表 43) 。

表 43 子宮癌細胞 He Laへの付着性（n = 4)

高分子濃度付着個数士 S D 乳酸菌

(mg/ml) (個/ 10000 zm²)

Lactobacillus sal ivarius WB1004 0 17士 6 (FREM P- 15360) 0.5 601士 168

Lactobacillus sal ivarius subsp. 0 17土 3 salivarius(CIP103140) 0.5 554±50ネネ

Lactobacillus sal ivarius subsp. 0 9土 2 salicinius (腹 150) 0.25 1790±335**

Lactobacillus acidophilus 0 23士 8 (CIP76.13) 0.5 395±79**

Lactobacillus brevis WB1005 0 32±5 (FREM P-15361 ) 0.25 355士 74ネ *

0 3土 2

Lactobacillus casei (CIP103137)

2.5 330士 108

0 47±16

Lactobaci 1 lus helveticus (JCM1120)

0.3 632士 Π1=

0 11土 3

Lactobacillus plantarumdCMl 149)

0.6 657±21 ネ

Lactobacillus paracasei 0 4土 2 subsp. paracasei (CIP103918) 0.6 1824士 361*本

0 6土 3

Lactobacillus rhamnosus (JCM1136)

0.6 756土 50^

0 1±1

Lactobacillus fermentum(JM1173)

0.3 1486士 414

Lactobacillus delbruecki i 0 3士 2 subsp. lactis(JCM1248) 0.15 1301士 364*ネ

Lactobacillus delbruecki i 0 2±1 subsp. bulgaricus(JCM1002) 1.25 447士 36=^ 表 43 (つづき）

Student's t- test**：有意差有り P<0. 0 実施例 32

実施例 17と同様の方法で得られたアミノアルキルメタァクリレートコポリマ一 RS分散液 ImLと実施例 31と同様の方法で得られた乳酸菌懸濁液（3X 1 0⁹個 ZmL) ImLとを混合し乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果を実施例 31と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は子宮癌細胞 He L aへの高い付着性を示した（表 44) 。

表 44 子宮癌細胞 He L aへの付着性（n = 4)

高分子濃度付着個数土 SD 乳酸菌

(mg/ml) (個/ 10000 m²)

Lactobacillus sal ivarius WB1004 0 7土 2 (FREM P- 15360) 0.16 1736±427

Lactobaci 1 lus sal ivarius subsp. 0 17土 3 salivarius(CIP103140) 0.5 563±90

Lactobacillus sal ivarius subsp. 0 9土 2 salicinius()CM1150) 0.125 352土 79**

Lactobacillus acidophilus 0 23±8 (CIP76.13) 0.5 177±25

Lactobacillus brevis WB1005 0 32士 5 (FREM P - 15361) 0.125 323±59**

0 3土 2

Lactobacillus casei (CIP103137)

2.5 38±9**

0 47±16

Lactobacil lus helveticus (JCMl 120)

0.28 150±21**

0 11土 3

Lactobacillus plantarum(JCMl 149)

0.28 654±195

Lactobaci 1 lus paracasei 0 4土 2 subsp. paracasei(CIP103918) 0.09 503士 127*本

0 6土 3

Lactobacillus rhamnosus (JCMl 136)

0.8 331土 79**

0 t土 1

Lactobacillus fermentuin(JMl 173)

0.8 253土 27

Lactobacillus delbruecki i 0 3土 2 subsp. lactis(JCM1248) 2.5 438±64**

Lactobacillus delbruecki i 0 2±1 subsp. bulgaricus(JCM1002) 0.28 324土 94** 表 44 (つづき）

Student's t- test**：有意差有り P<0. 0 実施例 33

実施例 1、実施例 5と同様の方法で液体培養した乳酸菌を P B Sに 3 X 10⁹ 個 Zm Lになるように懸濁した。

続いて乳酸菌懸濁液を 3000 r pm、 10分間遠心分離して得た乳酸菌の濃縮菌体（1. 5 X 10⁹個）に実施例 19と同様の方法で得られたアミノアルキルメ夕ァクリレートコポリマー E水溶液 1 m Lを添加し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果は実施例 31と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は子宮癌細胞 He L aへの高い付着性を示した（表 45) 。表 45 子宮癌細胞 He Laへの付着性（n = 4)

Student's t-test**：有意差有り P<0. 0 1

Student's t- test* ：有意差有り P<0. 05 実施例 34

実施例 1と同様の方法で液体培養した乳酸菌を PBSに 3 X 10⁹個/111 になるように懸濁した。

続いて乳酸菌懸濁液を 3000 r pm、 10分間遠心分離して得た乳酸菌の濃縮菌体（1. 5 X 10⁹個）に実施例 15と同様の方法で得られたゼラチン水溶液 ImLを添加し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果は実施例 31と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は子宮癌細胞 He La への高い付着性を示した（表 46) 。表 46 子宮癌細胞 He Laへの付着性（n = 4)

高分子濃度付着僩数士 S 乳酸菌

(mg/ml) (個/ 10000 "m²)

Lactobacillus sal ivarius WB1004 0 3士 2 (FREM P - 15360) 16 169±42本本

Lactobacillus sal ivarius subsp. 0 11土 6 salivarius(CIP103140) 6.4 259士 84^

Lactobacillus sal ivarius subsp. 0 8土 5 salicinius(JCM1150) 6.4 314±105ネネ

Lactobacillus acidophilus 0 3土 1 (CIP76.13) 1.0 20士 5**

0 4土 2

Lactobacillus casei (CIP103137)

16 11 ±4*

0 47土 7

Lactobacillus helvet icus (JCMl 120)

1.0 75士 14*

0 13土 8

Lactobacillus plantarum(JCM1149)

16 117±40ネネ

Lactobacillus paracasei 0 6土 2 subsp. paracasei (CIP103918) 1.0 33土 9

0 10土 4

Lactobacillus rhamnosus (JCMl 136)

16 150土 15**

Lactobacillus delbrueckii 0 28士 7 subsp. lactis (JCM1248) 6.4 428±101**

Lactobacillus delbrueckii 0 1土 I subsp. bulgaricus(JCM1002) 40 29土 9**

Lactobacillus johnsonii 0 3土 2 (CNCM 1-1225) 16 26士 8**

0 92士 9

Lactobacillus gasseri (JCMl 131)

1.0 236土 33** 表 46 (つづき）

Student's t-test**：有意差有り Pく 0. 0 1

Student's t- test* ：有意差有り P<0. 0 5 実施例 35

実施例 1、実施例 5と同様の方法で液体培養した乳酸菌を PBSに 3 X I 0⁹ 個 m Lになるように懸濁した。

ゼラチン（タイプ LCP 新田ゼラチン社製）を水 80mLに溶解した。更に塩化ナトリウム 0. 9 gを加えて溶解した後、 1 N塩酸を添加して pHを 3に調整し、更に水を加えて 10 OmLに調整しゼラチン水溶液を得た。続いて乳酸菌懸濁液を 3000 r pm、 10分間遠心分離して得た乳酸菌の濃縮菌体（ 1. 5 X 10⁹個）にゼラチン水溶液 lmLを添加し、乳酸菌含有組成物を得た。本発明の効果は実施例 31と同様の方法で検討した。その結果、本発明の乳酸菌含有組成物は子宮癌細胞 He L aへの高い付着性を示した（表 47) 。

表 47 乳酸菌含有組成物

Student's t- test**：有意差有り P<0. 01

Student's t- test* ：有意差有り P<0. 05 実施例 36

本発明の乳酸菌含有組成物による薬理作用の増大効果を調べるため、薬理作用物質の一つである乳酸に着目し、細胞に付着した乳酸菌の産生する乳酸量を、以下の方法により測定した。実施例 31〜35と同様の方法で得た乳酸菌（ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004又はェンテロコッカス ·フエシゥム J CM 5804) 含有組成物を、実施例 31と同様の方法で子宮癌細胞 H e L aに付着させた。 PBSで 3回洗浄した後、 HBSS 0. lmLを添加して、 37 で、 3時間インキュベートした。上清中に産生した乳酸をメタノール硫酸によりメチルエステル化した後、クロ口ホルムにより抽出し、ガスクロマトグラフィーで定量した。その結果、細胞に付着した本発明の乳酸菌含有組成物は高い乳酸産生量を示した（表 48) 。表 48 子宮癌細胞 He L aに付着した乳酸菌による乳酸産生

試験例 1

ラクトバシラス ·サリノリウス WB 1004含有組成物によるヘリコバクタ一 ' ピロリの胃癌細胞表面への存在に対する抑制試験

1) ヒト胃癌細胞 MKN 45の単層の調製

ヒト胃癌細胞 MKN45を 5 X 10⁴個/ mLとなるように 10 %牛胎児血清を含む PRM 1 1640培地に懸濁し、 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 0 . lmL分注した。 37 :で 3日間培養後、マイクロプレートに付着した細胞を PBSで 3回洗浄し、単層を調製した。

2) ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004の培養と菌懸濁液及び乳酸菌含有組成物の調製

ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004を MRSブロスに接種後、 37 °C 、 16時間液体培養を行った。培養終了後、 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い培養液の濃縮菌体を得た。得られた濃縮菌体に PBSを加えてラクトバシラ •サリバリウス WB 1004を 3 X 10⁹個 ZmL含む菌懸濁液を得た。菌懸濁液を一部取り、これに等量のキトサン 10 (0. 25%水溶液）、オイドラギット R L ( 0. 008 %水懸濁液）、オイドラギット E 100 (0. 008 %水溶液）の溶液を添加して混合し、乳酸菌含有組成物を得た。

3) ヘリコバク夕一 · ピロリの培養と菌懸濁液の調製

ヘリコバク夕一 · ピロリ ATCC43504を、 5 %ゥマ脱繊血を含むブレインハートインフュージョン（BH I) 寒天培地（ディフコ社製）で、 37で、 4 日間微好気培養した。培養後、白金耳にて適量菌体を採集し、 HBS Sで洗浄後、 HB S Sにて濁度（ 540 nm) が 5になるように懸濁した（約 5 X 10⁸個 /mL) 。

4) 細胞表面への存在に対する抑制試験

MKN45細胞の単層にラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004の菌懸濁液又は乳酸菌含有組成物の懸濁液（それぞれ 1. 6 X 10⁹個 ZmL) を 100 l添加し、 37 λ 1時間細胞に付着させた。対照には、 PBSを用いた。 P BSで細胞を 3回洗浄後、ヘリコバクタ一 ' ピロリの菌懸濁液を 50 β 1加え、更に 37°C、 2〜4時間インキュベートした。 PB Sで MKN45細胞の単層を 3回洗浄した後、細胞表面に存在するへリコパク夕一 ·ピロリの生菌数を以下の方法で測定した。

細胞の単層に、 0. 5%トリプシン（ギブコ社製）を添加し、 37°C 、 2分間作用させ、マイクロプレートから細胞を浮遊させた。 5%牛胎児血清を含む BH I液体培地（ディフコ社製）を 100 x l添加し、トリプシンの作用を停止させ、希釈液で適宜希釈して 5%ゥマ脱繊血を含む BH I寒天平板培地に塗布し、 1穴の細胞単層あたりの存在菌数を測定した。培地には、ラクトバシラス •サリバリウス WB 1004の生育を抑えるため、 5 n g/mLトリメトプリム及び 10 g/mLバンコマイシンを添加し、 37°C、 3日間微好気培養を行つた。

その結果、乳酸菌含有組成物の懸濁液はへリコパク夕一 · ピロリの胃癌細胞表面への存在を著しく抑制した。一方、ラクトバシラス 'サリバリウス WB 100 4の菌懸濁液はほとんど抑制しなかった（表 49) 。表 49 乳酸菌含有組成物によるへリコパク夕一 · ピロリの胃癌細胞表面への存在に対する抑制

試験例 2

ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物による大腸菌の大腸癌細胞表面への存在に対する抑制試験

1) ヒト大腸癌細胞 C a c o 2の単層の調製

ヒト胃癌細胞 MKN45を 5 X 10⁴個/ mLとなるように 20 %牛胎児血清を含むイーグル MEM培地に懸濁し、 96穴マイクロプレートに 1穴あたり 0. lmL分注した。 37 で 3日間培養後、マイクロプレートに付着した細胞を P BSで 3回洗浄し、単層を調製した。

ラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004を MRSブロスに接種後、 37で、 16時間液体培養を行った。培養終了後、 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い培養液の濃縮菌体を得た。得られた濃縮菌体に PBSを加えてラクトバシラ •サリバリウス WB 1004を 3 X 10⁹個/ mL含む菌懸濁液を得た。菌懸濁液を一部取り、これに等量のキトサン 10の 0. 25%水溶液を添加して混合し、乳酸菌含有組成物を得た。 3) 大腸菌の培養と菌懸濁液の調製

大腸菌 ATCC 25922を、 BH I液体培地で、 30 、 6時間好気培養した。培養後、 3000 r pm、 5分間遠心分離を行い培養液の濃縮菌体を得た。得られた濃縮菌体に MRSブロスを加えて大腸菌 ATCC 25922を約 6 X 1 0⁵個 mL含む菌懸濁液を得た。

4) 細胞表面への存在に対する抑制試験

C a c o 2細胞の単層にラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004の菌懸濁液又は乳酸菌含有組成物の懸濁液（それぞれ 1. 6 X 10⁹個/ mL) を 100 l添加し、 37 ：、 30分間細胞に付着させた。対照には、 PBSを用いた。 PBSで細胞を 3回洗浄後、大腸菌の菌懸濁液を 100 μ 1加え、更に 37 t：、 3時間インキュベートした。？83でじ & ( 02細胞の単層を 3回洗浄した後、細胞表面に存在する大腸菌の生菌数を以下の方法で測定した。細胞の単層に、 0 . 5%トリプシンを 50 x 1添加し、 37で、 2分間作用させ、マイクロプレー卜から細胞を浮遊させた。 BH I液体培地を 10 1添加し、トリプシンの作用を停止させ、希釈液で適宜希釈して DHL寒天平板培地（日水製薬社製）に塗布し、 1穴の細胞単層あたりの存在菌数を測定した。

その結果、乳酸菌含有組成物の懸濁液は大腸菌の大腸癌細胞表面への存在を著しく抑制した（表 50) 。

表 50 乳酸菌含有組成物による大腸菌の大腸癌細胞表面への存在に対する抑制

処方例 1

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 09

含有組成物 10 OmLに白糖 50 g、ァスコルビン酸 l g、香料を加えて、シロップ剤を得た。処方例 2

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 含有組成物 10 OmLに白糖 50 g、ァスコルビン酸 l g、ゼラチン 10 gを溶解した液と香料を加えて、冷却しゼリー剤を得た。処方例 3

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 含有組成物 10 OmLを凍結乾燥して粉末化し市販のヨーグルト 100 g (明治ブルガリアヨーグルト、明治乳業社製）に添加してラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物入りのヨーグルトを得た。処方例 4

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 含有組成物 10 OmLを凍結乾燥して粉末化した後にアルミ袋に分包し、市販のヨーグルト（明治ブルガリアヨーグルト、明治乳業社製）と併せて服用時に用時混合するラク卜バシラス ·サリバリウス WB 1004含有組成物入りのョ一ダルトを得た。処方例 5

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 含有組成物 10 OmLを凍結乾燥して粉末化し、得られた粉末に乳糖 100 g、コーンスターチ 10 gヒドロキシプロピルセル口一ス 10 g、硬化油 5 gを加えて混合した後、打錠機を用いて圧縮成型し、 1錠 24 Omgの錠剤を得た。処方例 6

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1004 含有組成物 1 0 O m Lを凍結乾燥して粉末化し、得られた粉末に乳糖 1 0 0 g、コーンスターチ 1 0 g、ヒドロキシプロピルセルロース 1 0 gを加えて混合した後、流動層造粒機を用いて造粒及び乾燥した。更に、 3 0メッシュふるいを用いて整粒し、細粒剤を得た。処方例 7

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1 0 0 4 含有組成物 1 0 O mLを凍結乾燥して粉末化し、得られた粉末に流動パラフィン 5 gを加えて混和した。別に、白色ワセリン 7 5 gをあらかじめ溶融しておき、混和物に少量ずつ加えながら混合した。容器のまわりを水で冷やしながら混合しつつ固め、軟膏型坐剤を得た。処方例 8

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1 0 0 4 含有組成物 1 0 O mLを凍結乾燥して粉末化し、得られた粉末とマクロゴール 1 5 0 0 9 gとマクロゴール 4 0 0 0 2 gの混練物を放冷し、 1 0個に分割した後、坐剤型にかけて成型し、坐剤を得た。処方例 9

実施例 1と同様の操作で得られたラクトバシラス ·サリバリウス WB 1 0 0 4 含有組成物 1 0 O m Lを凍結乾燥して粉末化し、得られた粉末に乳糖 1 0 0 g、コーンスターチ 1 0 g、ステアリン酸マグネシウム 5 gを加えて混合した後、打錠機にて圧縮成型し、錠剤型坐剤を得た。産業上の利用可能性

本発明は、上述の構成よりなるので、消化管及び又は泌尿生殖器への薬理作用を有する乳酸菌の当該薬理作用を増加させ、乳酸菌が消化管及びノ又は泌尿生殖器から排出されることに抗することができるため、極めて有効なヘリコバクタ一 · ピロリ除菌、腸管出血性大腸菌除菌、食物アレルギー治療、泌尿生殖器における感染症の治療及び又は予防のための医薬及び食品を提供することができる

Claims

請求の範囲

1 . 消化管及び/又は泌尿生殖器に対する薬理作用を有する乳酸菌を含有する乳酸菌含有組成物であって、前記薬理作用を増大させるために乳酸菌の消化管及び

Z又は泌尿生殖器への付着性を向上させたことを特徴とする乳酸菌含有組成物。

2 . 乳酸菌の消化管及び Z又は泌尿生殖器への付着性の向上は、高分子物質を含有させることにより行うものである請求の範囲 1記載の乳酸菌含有組成物。

3 . 高分子物質は、塩基性高分子物質である請求の範囲 2記載の乳酸菌含有組成物。

4 . 塩基性高分子物質は、キトサンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物

5 . 塩基性高分子物質は、ポリリジンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

6 . 塩基性高分子物質は、コレスチラミンレジンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

7 . 塩基性高分子物質は、プロ夕ミンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

8 . 塩基性高分子物質は、ゼラチンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物

9 . 塩基性高分子物質は、アミノアルキルメ夕クリレートコポリマー Eである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

10. 塩基性高分子物質は、アミノアルキルメ夕クリレートコポリマー RSである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

1 1. 塩基性高分子物質は、ラクトフエリンである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

12. 塩基性高分子物質は、リゾチームである請求の範囲 3記載の乳酸菌含有組成物。

13. 薬理作用は、へリコパクター ' ピロリの除菌である請求の範囲 1、 2、 3 、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1又は 12記載の乳酸菌含有組成物。

14. 薬理作用は、腸管出血性大腸菌の除菌である請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1又は 12記載の乳酸菌含有組成物。

1 5. 薬理作用は、食物アレルギー症治療作用である請求の範囲 1、 2、 3、 4 、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1又は 12記載の乳酸菌含有組成物。

16. 薬理作用は、泌尿生殖器における感染症の治療及びノ又は予防作用である請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1又は 12記載の乳酸菌含有組成物。

17. 泌尿生殖器は、膣である請求の範囲 16記載の乳酸菌含有組成物。

18. 請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 12、 1 3、 14、 15、 16又は 17記載の乳酸菌含有組成物からなることを特徴とする医薬。

19. 請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 12、 1 3、 14又は 15記載の乳酸菌含有組成物からなることを特徴とする食品。