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WO1998039647A1 - Asymmetrische fluss-feldflussfraktionierungs-vorrichtung - Google Patents

Asymmetrische fluss-feldflussfraktionierungs-vorrichtung Download PDF

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WO1998039647A1
WO1998039647A1 PCT/EP1998/001192 EP9801192W WO9839647A1 WO 1998039647 A1 WO1998039647 A1 WO 1998039647A1 EP 9801192 W EP9801192 W EP 9801192W WO 9839647 A1 WO9839647 A1 WO 9839647A1
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WO
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flow
flow rate
separation
measuring
channel
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP1998/001192
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French (fr)
Inventor
Thorsten Klein
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Original Assignee
Individual
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Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
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Publication of WO1998039647A1 publication Critical patent/WO1998039647A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/0005—Field flow fractionation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/0005—Field flow fractionation
    • G01N2030/0015—Field flow fractionation characterised by driving force
    • G01N2030/0025—Field flow fractionation characterised by driving force cross flow FFF
    • G01N2030/003—Asymmetrical flow

Definitions

  • the present invention relates to an asymmetrical flow field flow fractionation device, a flow field flow fractionation method in which this device is used, and the use of this device or this method for the separation of particle-containing liquid samples, in particular physiological liquids such as e.g. Blood sera.
  • Particles also include macromolecules, e.g. Proteins, understood.
  • Asymmetric flow field flow fractionation (hereinafter asymmetric flow FFF) represents a method for separating particle-containing samples into its components, the principle of which was first described by ahlund and Giddings (K.-G. Wahlund, JC Giddings, Anal.Che., 59, 1987, p. 1332).
  • Figure 2 shows the principle of separation in the asymmetrical flow-field flow fractionation process schematically.
  • the sample separation usually takes place in a thin, laminar flow channel (1).
  • the sample is transported through the channel with a carrier flow (2), part of this flow escaping through a semipermeable membrane (4), which is usually attached to the bottom of the channel.
  • the particles in the carrier flow are pressed to different degrees according to their size in the direction of the semipermeable membrane, which is impermeable to the particles. Due to their larger diffusion coefficient, smaller particles (5) are pressed less strongly towards the membrane than samples with a larger particle diameter (6). Since there is a laminar flow profile in the channel, the flow velocity is greatest in the middle of the channel and drops towards the upper and lower limits of the channel (3). So the small particles are eluted first when the strength of the flow drawn through the membrane is one Allows back diffusion towards the center of the channel. This is the normal procedure for asymmetric flow FFF.
  • the channel flow (3) will first detect particles with a larger diameter. In any case, the particle size determines the characteristic retention time in the flow FFF.
  • the asymmetric flow field flow fractionation method is significantly different in a number of respects from the symmetrical flow field flow fractionation (e.g., U.S.-A-4,147,621).
  • a so-called cross-flow is generated in that a flow perpendicular to the channel flow is introduced through an opening at the top of the channel and discharged again through a semipermeable membrane at the bottom.
  • This cross flow does not exist in the asymmetrical flow FFF, but instead the channel flow is divided into two partial flows, one escaping through the semipermeable membrane and the other leaving the channel through an ordinary channel outlet, in order to usually be fed to a detector.
  • JJ Kirkland et al. in J. Chromatography 1992, 339-355 disclose an asymmetrical flow FFF method in which the outflow from the channel is programmed to be changed by means of a pump. However, this method does not allow a precise adjustment of the flow rate to a certain absolute value or a regulation of the actual flow rate. Kirkland et al. do not measure and regulate the flow and therefore cannot prevent fluctuations in the actual flow rate and the associated retention time.
  • Litzen (Anal. Chem. 65, 1993, 461-470) discloses an asymmetrical flow FFF method in which the flow rate is determined by a flow meter from the company Phase Separation Ltd., Queensferry, GB (p .464).
  • This measuring device is switched into the channel outflow and in principle represents a glass tube with a defined volume, the time until the glass tube is filled and the tube is then emptied.
  • the filling time depends on the flow rate.
  • a characteristic filling time is of the order of at least 20 seconds and can even be a few minutes under high separation performance conditions. With this measuring device, however, retention times cannot be measured reproducibly.
  • the present invention is therefore based on the problem of improving the accuracy, reproducibility and at the same time the separation performance of the known methods.
  • an asymmetrical flow field flow fractionation device which has a continuously operating device for measuring the flow rate which responds within 1 second and a device for controlling the flow rate within 1 second with an accuracy of ⁇ 10% or less, based on the flow rate.
  • the asymmetrical flow field flow fractionation method according to the invention which is characterized in that the flow rate is measured continuously at least once per second and within one second with an accuracy of ⁇ 10% or less, based on the flow rate, adjusted to a predetermined value.
  • the device according to the invention can in particular additionally contain one or more detectors for the qualitative or quantitative determination of the separated analyte.
  • detectors are, in particular, UV / Vis detectors for detecting proteins and antibodies, among other things, fluorescence detectors, in particular for compounds with aromatic groups and Light scatter detectors for larger particles.
  • on-line detection based on an enzymatic reaction is used.
  • Such an enzyme reaction can be, for example, the reaction of cholesterol, which is contained in separated lipoprotein fractions, with lipase / cholesterol oxidase and detection of the H2O2 formed by peroxidase reaction with TMB (trimethylbenzidine).
  • the selective staining of lipoproteins with a lipophilic dye, for example Sudan red, and subsequent optical detection is also preferred.
  • the lipoprotein fractions HDL, LDL, lipoprotein A (Lp a ) and VLDL which can be separated by the method according to the invention can be quantitatively detected.
  • the flow FFF method according to the invention can also be used to separate sera in antibody fractions (eg IgG, IgM). Compared to known chromatographic separation processes, it is much faster (typical measuring time 10-20 min) and easier to carry out. The activity of the antibodies and other biological analytes is also retained.
  • the method according to the invention is therefore also outstandingly suitable for purifying biological material, for example labeled DNA. Purification also means an exchange of the solvent (eg desalination).
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a device according to the invention
  • FIG. 4 shows a fractogram of a protein mixture
  • FIG. 5 shows a fractogram of a lipoprotein mixture
  • 6 shows a fractogram of a rabbit serum
  • the device according to the invention is explained below with reference to the schematic drawing of Figure 1.
  • the analyte is usually separated in a separation channel (1) which is supplied with a carrier stream by one or more pumps (2).
  • the carrier liquid can be any aqueous or organic liquid; PBS buffers are preferably used for the separation of biological samples.
  • the sample is usually injected through an injection unit (3), which e.g. can be a pump or a syringe. However, it is also possible to introduce the sample into the channel in another way, e.g. directly with the carrier stream.
  • Part (4) of the carrier stream is discharged from the channel through a semipermeable membrane; another part leaves the channel through a normal outlet and is passed through an optional detector (5) and the control unit (6) and measuring unit (7) according to the invention.
  • the sequence of control unit (6), measuring unit (7) and possibly detector (5) can be permuted as desired.
  • An asymmetrical flow field flow fractionation device in the sense of the invention is understood to mean any device which operates on the principle of asymmetrical flow field flow fractionation; the present invention is not limited to the preferred arrangement indicated in FIG. 1.
  • An essential element of the asymmetrical flow FFF device is a device for measuring the flow rate.
  • Flow rate is understood here to mean the speed of the carrier liquid transporting the sample through the channel (unit: ml / min).
  • the device according to the invention continuously measures the flow rate at least once per second (responds within 1 second), preferably more than 5 times per second, particularly preferably 50 times per second or more. At least one measured value should be output per second.
  • the measuring device used for the purposes of this invention can advantageously be a hot wire resistance measuring device, a differential pressure measuring device, a laser Doppler anemometer or an ultrasonic measuring device.
  • a hot wire resistance measuring device is particularly preferred, in which the flow rate is measured by the cooling of a resistance wire heated by current and the associated change in resistance.
  • the measuring range of the measuring device is advantageously 1 ⁇ l / min to 10 ml / min, more preferably it ranges up to 50 nl / min.
  • the measuring accuracy should advantageously be 1-2% of the absolute measured value.
  • Another essential element of the invention is the control unit for quickly and precisely adjusting the flow rate.
  • This device is suitable for controlling the flow rate with an accuracy of ⁇ 10% or less, preferably ⁇ 1% or less, based on the flow rate, within 1 second.
  • the flow is preferably set by a mechanically or pneumatically controlled valve, the degree of opening of which can be precisely regulated and whose characteristic curve preferably has the largest possible linear range.
  • a particularly preferred device according to the present invention is characterized in that the device for adjusting the flow rate is a stepper motor-controlled needle valve. The degree of opening of this preferred needle valve is defined by the number of steps of the stepper motor and a potentiometer; if necessary, an additional light barrier can also be used.
  • the devices for measuring the flow rate and for regulating the flow can advantageously be linked via a computer and controlled by suitable software.
  • the computer receives information about the current flow rate from the flow meter at least once per second.
  • the software calculates the number of steps required by the stepper motor in order to regulate the flow rate to the desired setpoint.
  • the separation usually takes place in a thin, usually between 70 and 500 ⁇ m deep, 20 to 30 cm long and 2 to 4 cm wide separation channel (1) which is fed by a carrier flow (2) in the range of 1-6 ml / min and in which a laminar parabolic flow profile (3) is built up.
  • a carrier flow in the range of 1-6 ml / min and in which a laminar parabolic flow profile (3) is built up.
  • Part of the carrier flow escapes through a semipermeable membrane (4).
  • This membrane normally has dimensions in the area of the separation channel dimensions; it is often the actual underside of the separation channel; but it can also be larger or smaller.
  • the cutoff of the semipermeable membrane is usually 10,000 daltons, preferably about 5000 daltons.
  • suitable materials are polysulfones, polyether sulfones and preferably regenerated cellulose. Due to the suction generated when the partial flow is drawn off, the analytes are pressed towards the semipermeable membrane to different extents, depending on their size. The diffusion force is directed against this pull. Samples with smaller particle dimensions (5) (in normal mode) are pressed less strongly towards the membrane due to their larger diffusion coefficient than samples with larger particle diameters (6). Since there is a laminar flow profile (3) in the channel, the flow speed is greatest in the middle of the channel and drops towards the upper and lower limits of the channel. Smaller samples are therefore located in the area of faster flow lines and are flushed out of the channel in front of the larger particles. In this way, samples can be taken with ß J ⁇
  • 0.5 mg / ml aprotinin (molecular weight 6,500 Da), 0.3 mg / ml carbonic anhydrase (molecular weight 29,000) and 0.5 mg / ml bovine serum albumin (BSA, molecular weight 66,000) are in phosphate-buffered saline (PBS buffer) with a total molarity of 128 mmol / 1 and 20 ⁇ l of this solution are added to the canal by an injection pump.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline
  • the separation channel has dimensions of 30 cm length, 2 cm width and 500 ⁇ m channel thickness and is provided on the underside with an ultrafiltration membrane made of regenerated cellulose with a cutoff of 5000 daltons.
  • the PBS buffer described above is used as the carrier flow.
  • a 1-minute rinsing step with a flow rate of 6 ml / min is followed by the injection of the sample and the focusing.
  • the flow rate during the 3 s injection was 2 ml / min. Focusing took place at a total flow rate of 2.5 ml / min for 120 s.
  • the sample is then separated at a flow rate of 6 ml / min, with 82.75% of the laminar flow being diverted through the semipermeable membrane.
  • the detection takes place in a downstream UV detector at 210 nm.
  • the control unit downstream of the detection ensures that the channel outflow is kept constant at a flow rate of 1.035 ml / min ⁇ 1 ⁇ l.
  • the control unit consists of a PC with software, a D / A converter card and a stepper motor-controlled needle valve.
  • the stepper motor (Nanotech) is equipped with integrated control electronics and its position is monitored by a potentiometer to ensure independent control of the stepper motor position.
  • the needle valve (Fa. Swagelock) regulates flows in the range from a few ⁇ l to ml / min.
  • the PC is also connected to the detector and displays a measured value on the screen every second.
  • FIG. 4 shows the separation of aprotinin (1), carbonic anhydrase (2) and bovine serum albumin (3, 4, 5).
  • the device according to the invention also enables the different agglomerates of bovine serum albumin BSA to be separated into the monomer (3), the dimer (4) and the trimer (5).
  • the smallest protein so far separated with an asymmetric flow FFF device has been cytochrome C with a molecular weight of 12,400 (Kirkland, J. Chromatogr., 593, 1992, 339-355).
  • the separation performance can be increased so that proteins with a smaller molecular weight, e.g. Aprotinin or even smaller proteins can be separated.
  • the BSA trimer has also not been isolated using the FFF or any other separation method.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • Lp a Lipoprotein A
  • 4.3 mg / ml LDL and 2 mg / ml Lp a were mixed in the PBS buffer according to Example 1 and injected into the channel.
  • the focusing time was 30 s with a total flow of 1.5 ml / min and the laminar flow was 2 ml / min. 48.62% of the laminar flow was drained through the semipermeable membrane and the flow rate was adjusted to 1.028 ml / min.
  • Fig. 5 shows the first successful field flow fractionation of the two lipoproteins LDL (1) and Lp a (2).
  • Lp a plays an important role in coronary heart disease.
  • FIG. 6 shows the separation of a native rabbit serum into the main components, the serum protein (1), the antibody fraction IgG (2) and the antibody fraction IgM (3).
  • the experimental conditions correspond to Example 1, except for the flow rate, which is 2 ml / min, and the derived flow, which is 53.07% of the flow rate. It is regulated to a flow rate of 0.939 ml / min.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierungs-Vorrichtung mit einer innerhalb von 1 Sekunde ansprechenden, kontinuierlich arbeitenden Vorrichtung zur Messung der Flußrate und einer Vorrichtung zur Einstellung der Flußrate mit einer Genauigkeit von ± 10% oder weniger, bezogen auf die Flußrate, innerhalb on 1 Sekunde, und ggf. einem Detektor. Sie betrifft außerdem ein Fluß-Feldflußfraktionierungs-Verfahren, bei dem die Flußrate kontinuierlich mindestens 1 mal pro Sekunde gemessen und innerhalb von höchstens 1 Sekunde mit einer Genauigkeit von ± 10% oder weniger, bezogen auf die Flußrate, auf einen vorgegebenen Wert einregelt wird. Die erfindungsgemäße Vorrichtung läßt sich insbesondere zur raschen und kostengünstigen Auftrennung von Seren in Antikörperfraktionen und/oder die Lipoproteinfraktionen HDL, LDL, Lpa, und VLDL verwenden.

Description

Asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierungs-Vorrichtung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine asymmetrische Fluß- Feldflußfraktionierungs-Vorrichtung, ein Fluß- Feldflußfraktionierungs-Verfahren, bei dem diese Vorrichtung eingesetzt wird, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung bzw. dieses Verfahrens zur Auftrennung partikelhaltiger flüssiger Proben, insbesondere von physiologischen Flüssigkeiten wie z.B. Blutseren. Unter Partikeln werden hier auch Makromoleküle, z.B. Proteine, verstanden.
Die asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierung (nachstehend asymmetrische Fluß-FFF) stellt ein Verfahren zur Trennung von partikelhaltigen Proben in seine Bestandteile dar, dessen Prinzip zuerst von ahlund und Giddings beschrieben wurde (K.-G. Wahlund, J.C. Giddings, Anal.Che ., 59, 1987, S.1332). Figur 2 stellt das Prinzip der Auftrennung im asymmetrischen Fluß-Feldflußfraktionierungs-Verfahren schematisch dar. Die Probentrennung findet dabei gewöhnlich in einem dünnen, laminar durchflossenen Kanal (1) statt. Die Probe wird mit einem Trägerfluß (2) durch den Kanal transportiert, wobei ein Teil dieses Flusses durch eine semipermeable Membran (4) , die in der Regel am Kanalboden angebracht ist, entweicht. Dadurch werden die im Trägerfluß befindlichen Partikel gemäß ihrer Größe unterschiedlich stark in Richtung der semipermeablen Membran gedrückt, die für die Partikel undurchlässig ist. Kleinere Partikel (5) werden aufgrund ihres größeren Diffusionskoeffizienten weniger stark zur Membran hin gedrückt als Proben mit höherem Partikeldurchmesser (6) . Da im Kanal ein laminares Strömungsprofil herrscht, ist die Flußgeschwindigkeit in der Mitte des Kanals am größten und fällt zur oberen und unteren Begrenzung des Kanals hin ab (3) . Es werden also zuerst die kleinen Partikel eluiert, wenn die Stärke des durch die Membran abgezogenen Flusses eine Rückdiffusion in Richtung Kanalmitte zuläßt. Dies ist die normale Verfahrensweise bei der asymmetrischen Fluß-FFF. Ist dagegen der abgezogene Fluß so stark bzw. sind die Partikel so groß, daß im wesentlichen alle Partikel an die Membran gedrückt werden (sterischer Modus) , so wird die Kanalströmung (3) zuerst Partikel mit größerem Durchmesser erfassen. In jedem Fall bestimmt die Partikelgröße die charakteristische Retentionszeit in der Fluß-FFF.
Trotz seiner Namensähnlichkeit ist das asymmetrische Fluß- Feldflußfraktionierungs-Verfahren in einer Reihe von Aspekten von der symmetrischen Fluß-Feldflußfraktionierung (z.B. US-A- 4,147,621) wesentlich verschieden. Bei der symmetischen Fluß- FFF wird ein sogenannter Querfluß erzeugt, indem ein Fluß senkrecht zur Kanalströmung durch eine Öffnung an der Oberseite des Kanals eingeleitet und durch eine semipermeable Membran an der Unterseite wieder abgeleitet wird. Dieser Querfluß existiert bei der asymmetrischen Fluß-FFF nicht, sondern der Kanalfluß wird stattdessen in zwei Teilströme unterteilt, wobei einer durch die semipermeable Membran entweicht und der andere den Kanal durch einen gewöhnlichen Kanalauslaß verläßt, um meist einem Detektor zugeleitet zu werden.
Veröffentlichungen zur asymmetrischen Fluß-FFF von Wahlund und Mitarbeitern befassen sich vor allem mit speziellen Anwendungen, z.B. der Trennung von monoklonalen Antikörperaggregaten (Anal. Biochem. 212, 1993, 469-480) sowie von Proteinen, Nukleinsäuren und Viren (J. Chromatography, 476, 1989, 413-421), von Plasmiden, Polysacchariden und Einzellern (J. Chromatography, 461, 1989, 73-87) und der Bestimmung von saurer Phosphatase in Zellmedien (J. Biochem., 37, 1994, 291-295). Als theoretische und praktische Arbeiten über die asymmetrische Fluß- Feldflußfraktionierung sind außerdem A. Litzen, Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Pharmacy, Uppsala 1992; T.Schauer, GIT Fachz . Lab. 10-95, 922-927; und J.J.Kirkland et al . , J . Chromatography 1992, 339- 355 zu nennen. C.Tank, Macromol . Chem. Phys . 197 (1996) befaßt sich mit der Charakterisierung von wasserlöslichen Polymeren und Kolloiden mit der asymmetrischen Fluß- Feldflußfraktionierung. Neuere Veröffentlichungen über die asymmetrische Fluß-FFF aus dem Arbeitskreis Wahlund finden sich in Langmuir, 12, 5999-6005 (1996), Macro olecules , 29, 268-276 (1996) und J. Cereal Sei., 23, 113-119 (1996).
Die bekannten asymmetrischen Fluß-FFF-Techniken der o.a. Autoren erlaubten die Auftrennung von Proteingemischen (z.B. Human- und Weizenproteine) , DNA-Fragmenten, Viren, Algen und Antikörpern, und zwar deutlich schneller und schonender als herkömmliche chromatographische oder elektrophoretische Trennverfahren. Sie sind auch der symmetrischen Fluß-FFF überlegen.
J.J.Kirkland et al . offenbaren in J. Chromatography 1992, 339- 355 ein asymmetrisches Fluß-FFF-Verfahren, bei dem der Ausfluß aus dem Kanal mittels einer Pumpe programmiert verändert wird. Durch dieses Verfahren ist jedoch weder eine präzise Einstellung der Flußrate auf einen bestimmten Absolutwert noch eine Regelung der tatsächlichen Flußrate möglich. Kirkland et al . messen und regeln den Fluß nicht und können dadurch Schwankungen in der tatsächlichen Flußrate und der damit verbundenen Retentionszeit nicht verhindern. Litzen (Anal. Chem. 65, 1993, 461-470) offenbart ein asymmetrisches Fluß-FFF-Verfahren, bei dem die Flußrate durch ein Flußmeßgerät (Flow-Meter) der Firma Phase Separation Ltd., Queensferry, GB, bestimmt wird (S.464). Dieses Meßgerät wird in den Kanalausfluß geschaltet und stellt im Prinzip ein Glasröhrchen mit definiertem Volumen dar, wobei die Zeit bis zur Füllung des Glasröhrchens gemessen und das Röhrchen anschließend entleert wird. Die Füllzeit ist abhängig von der Flußrate. Eine charakteristische Füllzeit liegt in der Größenordnung von mindestens 20 Sekunden und kann bei hohen Trennleistungsbedingungen sogar einige Minuten betragen. Mit dieser Meßvorrichtung sind aber Retentionszeiten nicht reproduzierbar meßbar.
Es zeigte sich, daß die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Fraktionierung mit den bekannten asymmetrischen Fluß-FFF- Vorrichtungen besonders bei hohen Trennleistungen unzureichend war. Der vorliegenden Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und zugleich die Trennleistung der bekannten Verfahren zu verbessern.
Zusammenfassuncr der Erfinduncr
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch eine asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierungs-Vorrichtung gelöst, die eine innerhalb von 1 Sekunde ansprechende, kontinuierlich arbeitende Vorrichtung zur Messung der Flußrate und eine Vorrichtung zur Regelung der Flußrate innerhalb von 1 Sekunde mit einer Genauigkeit von ±10 % oder weniger, bezogen auf die Flußrate, enthält.
Weiterhin wird dieses Problem durch das erfindungsgemäße asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierungs-Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Flußrate kontinuierlich mindestens 1 mal pro Sekunde mißt und innerhalb einer Sekunde mit einer Genauigkeit von ±10 % oder weniger, bezogen auf die Flußrate, auf einen vorgegebenen Wert einregelt .
Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der nachstehenden Unteransprüche. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere zusätzlich einen oder mehrere Detektoren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des aufgetrennten Analyten enthalten. Beispiele für solche Detektoren sind insbesondere UV/Vis-Detektoren zum Nachweis u.a. von Proteinen und Antikörpern, Fluoreszenzdetektoren insbesondere für Verbindungen mit aromatischen Gruppen und Lichtstreudetektoren für größere Partikel . Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine on-line Detektion auf Grundlage einer enzymatischen Reaktion eingesetzt. Eine solche Enzymreaktion kann z.B. die Reaktion von Cholesterin, das in aufgetrennten Lipoproteinfraktionen enthalten ist, mit Lipase/Cholesterinoxidase und Nachweis des entstandenen H2O2 durch Peroxidasereaktion mit TMB (Trimethylbenzidin) sein. Bevorzugt ist auch die selektive Anfärbung von Lipoproteinen mit einem lipophilen Farbstoff, z.B. Sudanrot, und anschließende optische Detektion. So lassen sich z.B. die durch das erfindungsgemäße Verfahren trennbaren Lipoproteinfraktionen HDL, LDL, Lipoprotein A (Lpa) und VLDL quantitativ nachweisen. Das erfindungsgemäße Fluß-FFF-Verfahren ist auch zur Auftrennung von Seren in Antikörperf aktionen (z.B. IgG, IgM) verwendbar. Gegenüber bekannten chromatographischen Trennverfahren ist es wesentlich schneller (typische Meßzeit 10-20 min) und einfacher durchführbar. Auch bleibt die Aktivität der Antikörper und anderer biologischer Analyten erhalten. Daher eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch hervorragend zur Aufreinigung von biologischem Material, z.B. markierter DNA. Unter Aufreinigung wird hier auch ein Austausch des Lösungsmittels (z.B. Entsalzung) verstanden.
Kurze Beschreibuncr der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen erläutert, in denen:
Fig.l eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt,
Fig.2 εchematisch das Prinzip der asymmetrischen Fluß- Feldflußfraktionierung zeigt,
Fig.3 einen schematischen Aufbau eines Trennkanals (Explosionsdarstellung) zeigt,
Fig.4 ein Fraktogramm einer Proteinmischung zeigt, Fig.5 ein Fraktogramm einer Lipoproteinmischung zeigt, Fig.6 ein Fraktogramm eines Kaninchenserums zeigt
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird nachstehend anhand der Schemazeichnung von Figur 1 näher erläutert. Die Trennung des Analyten erfolgt gewöhnlich in einem Trennkanal (1) , der durch eine oder mehrere Pumpen (2) mit einem Trägerstrom versorgt wird. Die Trägerflüssigkeit kann eine beliebige wäßrige oder organische Flüssigkeit sein; bevorzugt werden für die Auftrennung biologischer Proben PBS-Puffer verwendet. Die Injektion der Probe erfolgt meist durch eine Injektionseinheit (3), die z.B. eine Pumpe oder eine Spritze sein kann. Es ist aber auch möglich, die Probe auf anderem Wege in den Kanal einzubringen, z.B. direkt mit dem Trägerstrom. Ein Teil (4) des Trägerstroms wird durch eine semipermeable Membran hindurch aus dem Kanal abgeleitet; ein anderer Teil verläßt den Kanal durch einen gewöhnlichen Auslaß und wird durch einen optionalen Detektor (5) , sowie die erfindungsgemäße Regeleinheit (6) und Meßeinheit (7) geleitet. Die Reihenfolge von Regeleinheit (6), Meßeinheit (7) sowie ggf. Detektor (5) kann beliebig permutiert werden. Unter einer asymmetrischen Fluß-Feldflußfraktionierungs- Vorrichtung im Sinne der Erfindung wird jede beliebige Vorrichtung verstanden, die nach dem Prinzip der asymmetrischen Fluß-Feldflußfraktionierung arbeitet; auf die in Figur 1 angegebene bevorzugte Anordnung ist die vorliegende Erfindung nicht beschränkt.
Ein wesentliches Element der erfindungsgemäßen asymmetrischen Fluß-FFF-Vorrichtung ist eine Vorrichtung zur Messung der Flußrate. Unter Flußrate wird hierbei die Geschwindigkeit der die Probe durch den Kanal transportierenden Trägerflüssigkeit verstanden (Einheit: ml/min) . Die erfindungsgemäße Vorrichtung mißt die Flußrate kontinuierlich mindestens 1 mal pro Sekunde (spricht innerhalb von 1 Sekunde an) , vorzugsweise mehr als 5 mal pro Sekunde, besonders bevorzugt 50 mal pro Sekunde oder mehr. Pro Sekunde sollte mindestens ein Meßwert ausgegeben werden. Die für die Zwecke dieser Erfindung verwendete Meßvorrichtung kann vorteilhaft eine Hitzedraht-Widerstandsmeßvorrichtung, eine Differenzdruck- eßvorrichtung, ein Laser-Doppler-Anemometer oder eine Ultraschall-Meßvorrichtung sein. Besonders bevorzugt ist eine Hitzedraht-Widerstandsmeßvorrichtung, bei der die Messung der Flußrate durch die Abkühlung eines durch Strom aufgeheizten Widerstandsdrahtes und die damit verbundene Widerstandsänderung erfolgt . Der Meßbereich der Meßvorrichtung beträgt vorteilhaft 1 μl/min bis 10 ml/min, noch stärker bevorzugt reicht er bis 50 nl/min. Die Meßgenauigkeit sollte vorteilhaft 1-2% des Absolutmeßwerts betragen.
Ein weiteres wesentliches Element der Erfindung ist die Regeleinheit zur schnellen und präzisen Einstellung der Flußrate. Diese Vorrichtung eignet sich zur Regelung der Flußrate mit einer Genauigkeit von ±10 % oder weniger, vorzugsweise ±1% oder weniger, bezogen auf die Flußrate, innerhalb von 1 Sekunde. Die Einstellung des Flusses geschieht dabei bevorzugt durch ein mechanisch oder pneumatisch gesteuertes Ventil, dessen Öffnungsgrad exakt reguliert werden kann und dessen Kennlinie vorzugsweise einen möglichst großen linearen Bereich hat. Eine besonders bevorzugte Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Einstellung der Flußrate ein schrittmotorgesteuertes Nadelventil ist. Der Öffnungsgrad dieses bevorzugten Nadelventils wird über die Schrittzahl des Schrittmotors und ein Potentiometer definiert; ggf. kann hierzu auch eine zusätzliche Lichtschranke eingesetzt werden.
Die Vorrichtungen zur Messung der Flußrate und zur Regelung des Flusses können vorteilhaft über einen Rechner verknüpft und durch geeignete Software gesteuert werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erhält der Rechner mindestens einmal pro Sekunde Informationen über die aktuelle Flußrate von dem Flußmeßgerät. Nach einem Vergleich von Soll- und Istwert berechnet die Software die erforderliche Schrittzahl des Schrittmotors, um die Flußrate auf den gewünschten Sollwert einzuregeln.
Die asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierung wird unter Bezugnahme auf Fig.2 nun näher erläutert. Die Trennung findet üblicherweise in einem dünnen, gewöhnlich zwischen 70 und 500 μm tiefen, 20 bis 30 cm langen und 2 bis 4 cm breiten Trennkanal (1) statt, der von einem Trägerfluß (2) im Bereich von 1-6 ml/min gespeist wird und in dem sich ein laminares parabolisches Strömungsprofil (3) aufbaut. Denkbar ist aber auch eine Trennung in einer Hohlfaser. Ein Teil des Trägerflusses (von 0,01 bis 99,99%) entweicht durch eine semipermeable Membran (4) . Diese Membran hat normalerweise Abmessungen im Bereich der Trennkanalabmessungen; oft ist bildet sie die eigentliche Unterseite des Trennkanals; sie kann aber auch größer oder kleiner sein. Der Cutoff der semipermeablen Membran liegt gewöhnlich bei 10.000 Dalton, vorzugsweise bei etwa 5000 Dalton. Als Material kommen z.B. Polysulfone, Polyethersulfone und bevorzugt regenerierte Cellulose in Frage. Durch den beim Abzug des Teilstroms entstehenden Sog werden die Analyten gemäß ihrer Größe unterschiedlich stark in Richtung der semipermeablen Membran gedrückt. Die Diffusionskraft ist diesem Sog entgegengerichtet. Proben mit kleineren Partikelabmessungen (5) werden (im normalen Modus) aufgrund ihres größeren Diffusionskoeffizienten weniger stark zur Membran hin gedrückt als Proben mit höherem Partikeldurchmesser (6) . Da im Kanal ein laminares Strömungsprofil (3) herrscht, ist die Strömungsgeschwindigkeit in der Mitte des Kanals am größten und fällt zur oberen und unteren Begrenzung des Kanals hin ab. Kleinere Proben liegen somit im Bereich schnellerer Strömungslinien und werden vor den größeren Partikeln aus dem Kanal ausgespült. Auf diese Weise lassen sich Proben mit ß J Φ
4-1 4J 4-1 Φ Φ u 04 4J 5π Φ CQ
Figure imgf000011_0001
Retentionszeiten in einem Fluß-FFF-Verfahren möglich geworden. Die durch die Erfindung erzielbaren vorteilhaften Effekte werden näher in den folgenden Beispielen erläutert.
Beispiel 1
0,5 mg/ml Aprotinin (Molekulargewicht 6.500 Da), 0,3 mg/ml Carboanhydrase (Molekulargewicht 29.000) und 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Molekulargewicht 66.000) werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-Puffer) mit einer Gesamtmolarität von 128 mmol/1 gelöst und 20 μl dieser Lösung durch eine Injektionspumpe in den Kanal gegeben. Der Trennkanal hat Abmessungen von 30 cm Länge, 2 cm Breite und 500 μm Kanaldicke und ist an der Unterseite mit einer Ultrafiltrationsmembran aus regenerierter Cellulose mit einem Cutoff von 5000 Dalton versehen. Als Trägerfluß wird der oben beschriebene PBS-Puffer verwendet. Auf einen 1-minütigen Spülschritt mit einer Flußrate von 6 ml/min folgt die Injektion der Probe und die Fokussierung. Die Flußrate während der 3 s dauernden Injektion betrug 2 ml/min. Die Fokussierung erfolgte bei einer Gesamtflußrate von 2,5 ml/min während 120 s. Mit einer Flußrate von 6 ml/min wird dann die Probe aufgetrennt, wobei 82,75% des Laminarflusses durch die semipermeable Membran abgeleitet werden. Die Detektion erfolgt in einem nachgeschalteten UV-Detektor bei 210 nm. Die der Detektion nachgeschaltete Regeleinheit sorgt dafür, daß der Kanalausfluß konstant bei einer Flußrate von 1,035 ml/min ± lμl gehalten wird. Sie wird von der ihr nachgeschalteten Hitzedraht-Widerstandsmeßvorrichtung mit 50 Meßwerten der Flußrate pro Sekunde versorgt und reagiert auf diesen Input quasi augenblicklich. Die Regeleinheit besteht aus einem PC mit Software, einer D/A-Wandlerkarte und einem schrittmotorgesteuerten Nadelventil. Der Schrittmotor (Fa. Nanotech) ist mit einer integrierten Steuerelektronik versehen und wird in seiner Position durch ein Potentiometer überwacht, um eine unabhängige Kontrolle der Schrittmotorposition sicherzustellen. Das Nadelventil (Fa. Swagelock) reguliert Flüsse im Bereich von wenigen μl bis ml/min. Der PC ist außerdem mit dem Detektor verbunden und zeigt pro Sekunde einen Meßwert am Bildschirm an.
Die Ergebnisse der Proteintrennung sind aus Fig.4 ersichtlich, die die Trennung von Aprotinin (1) , Carboanhydrase (2) und Rinderserumalbumin (3, 4, 5) zeigt. Wie aus der Figur hervorgeht, ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung neben der Auftrennung der drei Proteine zusätzlich die Auftrennung der unterschiedlichen Agglomerate von Rinderserumalbumin BSA in das Monomer (3) , das Dimer (4) und das Trimer (5) . Das kleinste bisher mit einer asymmetrischen Fluß-FFF-Vorrichtung abgetrennte Protein war bisher Cytochrom C mit einem Molekulargewicht von 12.400 (Kirkland, J.Chromatogr . , 593, 1992, 339-355). Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Trennleistung so erhöht werden, daß nun auch Proteine mit einer kleineren Molmasse, z.B. Aprotinin oder noch kleinere Proteine, abgetrennt werden können. Auch das Trimer des BSA ist bisher weder mit der FFF noch mit einer anderen Trennmethode isoliert worden.
Beispiel 2
Mit der gleichen Anlage wie in Beispiel 1 wurde eine künstliche Mischung der beiden Lipoproteine LDL (Low Density Lipoprotein) (1) und Lpa (Lipoprotein A) aufgetrennt. 4,3 mg/ml LDL und 2 mg/ml Lpa wurden im PBS-Puffer gemäß Beispiel 1 gemischt und in den Kanal injiziert. Abweichend von Beispiel 1 betrug die Fokussierzeit 30 s bei einem Gesamtfluß von 1,5 ml/min und der Laminarfluß 2 ml/min. 48,62% des Laminarflusses wurden durch die semipermeable Membran abgeleitet und die Flußrate auf 1,028 ml/min eingeregelt.
Fig. 5 zeigt die erstmals geglückte Feldflußfraktionierung der beiden Lipoproteine LDL (1) und Lpa (2) . In den letzten Jahren wurde zunehmend bekannt, daß Lpa eine wichtige Rolle bei koronaren Herzerkrankungen innehat .
Beispiel 3
Fig. 6 zeigt die Trennung eines nativen Kaninchenserums in die Hauptbestandteile, das Serumprotein (1) , die Antikörperfraktion IgG (2) und die Antikörperfraktion IgM (3) . Eine solche gleichzeitige und rasche Trennung von Serum in seine Hauptbestandteile ist bisher noch nicht beschrieben worden. Die experimentellen Bedingungen entsprechen Beispiel 1, mit Ausnahme der Flußrate, die 2 ml/min beträgt, und dem abgeleiteten Fluß, der 53,07% der Flußrate ausmacht. Eingeregelt wird auf eine Flußrate von 0,939 ml/min.

Claims

Patentansprüche
1. Asymmetrische Fluß-Feldflußfraktionierungs-Vorrichtung, gekennzeichnet durch eine innerhalb von 1 Sekunde ansprechende, kontinuierlich arbeitende Vorrichtung zur Messung der Flußrate und eine Vorrichtung zur Regelung der Flußrate innerhalb von 1 Sekunde mit einer Genauigkeit von +10% oder weniger, bezogen auf die Flußrate.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie außerdem einen oder mehrere Detektoren zum Nachweis der aufgetrennten Analyten enthält.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Messung der Flußrate eine Hitzedraht-Widerstandsmeßvorrichtung, eine Differenzdruckmeßvorrichtung, ein Laser-Doppler-Anemometer oder eine Ultraschall-Meßvorrichtung ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung zur Einstellung der Flußrate ein mechanisch oder pneumatisch gesteuertes Ventil ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung zur Einstellung der Flußrate ein schrittmotorgesteuertes Nadelventil ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Messung der Flußrate eine Hitzedraht-Widerstandsmeßvorrichtung ist.
7. Asymmetrisches Fluß-Feldflußfraktionierungs-Verfahren, dadurch gekennzeichnet , daß man die Flußrate kontinuierlich mindestens 1 mal pro Sekunde mißt und die Flußrate innerhalb von höchstens 1 Sekunde mit einer Genauigkeit von ±10% oder weniger, bezogen auf die Flußrate, auf einen vorgegebenen Wert einregelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet , daß man nach der Auftrennung die fraktionierte Probe mit einem oder mehreren Detektoren nachweist.
9. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-6 zur Au trennung von Seren in Antikörperfraktionen.
10.Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-6 zur Auftrennung von Seren in die Lipoproteinfraktionen HDL, LDL, Lpa, und VLDL.
11.Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-6 zur Aufreinigung von biologischem Material.
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