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WO1998033929A2 - Utilisation d'un polypeptide a titre de recepteur cellulaire des adenovirus - Google Patents

Utilisation d'un polypeptide a titre de recepteur cellulaire des adenovirus Download PDF

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WO1998033929A2
WO1998033929A2 PCT/FR1998/000184 FR9800184W WO9833929A2 WO 1998033929 A2 WO1998033929 A2 WO 1998033929A2 FR 9800184 W FR9800184 W FR 9800184W WO 9833929 A2 WO9833929 A2 WO 9833929A2
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WO
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ligand
residue
adenovirus
seq
ending
Prior art date
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PCT/FR1998/000184
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WO1998033929A3 (fr
Inventor
Pierre Boulanger
Saw See Hong
Lucie Karayan
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of all or part of an antigen of the major histocompatibility complex of class I and / or of a type III module of fibronectin to allow or facilitate the attachment of an adenovirus on a host cell and / or its entry therein.
  • the invention also relates to the use of a ligand capable of modulating the infectivity of an adenovirus with respect to a host cell, mediated by one or the other of the polypeptides mentioned above.
  • the invention relates to a bio-mulching method for identifying or selecting a cellular receptor for an adenovirus or one of these ligands, in particular of viral origin.
  • Adenoviruses are DNA viruses with a broad host spectrum. They have been found in many animal species and can infect various cell types. Many serotypes have been characterized within each species which have a comparable genomic organization and infectious cycle.
  • the adenoviral genome consists of a linear, double-stranded DNA molecule of approximately 3 kb containing the genes coding for the viral proteins and at its ends two reverse repeats (designated ITR) involved in replication and the packaging region.
  • ITR reverse repeats
  • Adenoviruses replicate in the nuclei of infected cells. The infectious cycle takes place in 2 stages. The early phase precedes the initiation of replication and makes it possible to produce the early proteins regulating the replication and transcription of viral DNA.
  • the structural proteins which constitute the viral particles are synthesized.
  • the assembly of new virions takes place in the nucleus.
  • the viral proteins assemble so as to form empty capsids of icosahedral structure, in which the adenoviral DNA is packaged. Viral particles are released and can infect other permissive cells.
  • the fiber and the base penton present on the surface of the capsids play a critical role in the cellular attachment of virions and their internalization.
  • the adenovirus binds to the surface of permissive cells via the trimeric fiber and a hitherto unidentified cellular receptor. Then, the particle is internalized by endocytosis by binding of the penton base to the cellular integrins ⁇ v ⁇ 3 and ⁇ v ⁇ s (Belin and Boulanger, 1993, J. Gen. Virol. 74, 1485-1497; Mathias et al., 1994 , J. Virol. 68, 681 1-6814; Nemerow et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4, 52-55; Wickham et al., 1993, Cell 73, 309-319; Wickham et al., 1994 , J. Cell Biol.
  • the Ad2 fiber contains 580 amino acids (aa), the sequence of which is disclosed in Hérissé et al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042). 0 That of Ad 5 has 582 amino acids (Chroboczek and Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554). Its molecular mass is 62 kDa, but the native fiber behaves like a molecule of 160-180 kDa confirming its assembly in the form of a trimer.
  • the fiber is made up of 3 domains (Chroboczek et al., 1995, Current Top. 5 Microbiol. Immunol. 199, 165-200):
  • the “stem” is a rod structure of variable length depending on the serotypes.
  • the stem of the Ad5 fiber contains 22 repeats of a pattern 0 of 15 residues which could adopt a ⁇ -sheet conformation. The number of these repetitions differs from one serotype to another, which explains the variations in length.
  • the "head” or terminal sphericle is a globular structure containing the trimerization signals (Hong and Engler, 1996, 5 J. Virol. 70, 7071-7078; Novelli and Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli and Boulanger, 1991, Virology 755, 365-376). Most experimental data show that it is the head area which is responsible for binding to permissive cells (Krasnykh et al., 1996, J. Virol. 70, 6839-6846).
  • the adsorbed phages which in theory express phagotopes interacting with a motif carried by the adenoviral protein, are then eluted either conventionally at acid pH or by competition with the other non-immobilized capsid partner (eluent).
  • eluent non-immobilized capsid partner
  • the immobilized ligand is constituted by the domain of the head of the Ad5 fiber and the eluent by a neutralizing antibody directed against the latter and isolated two classes of phagotopes according to the antibody used.
  • the first corresponds to a sequence conserved within the ⁇ -2 domain of major class I histocompatibility complex antigens ( ⁇ -2 MHC-I) and the second to a sequence found in modules III of human fibronectin ( FNIII).
  • ⁇ -2 MHC-I constitutes the primary receptor for adenoviruses of serotypes C and confirm the participation of FNIII as co-receptor or co-factor.
  • the regions of these two receptors and of the fiber interacting with each other have also been highlighted.
  • an antagonistic peptide reproducing the motif of the ⁇ -2 MHC-I domain was generated which neutralizes the attachment of adenoviruses and an agonist peptide reproducing the FNIII motifs which stimulates attachment.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown:
  • polypeptide means any molecule constituted by a chain of at least 6 and, preferably at least 8, amino acids.
  • polypeptide includes both peptide molecules of short length (from 6 to a few tens of residues) as molecules of greater length (up to several hundred residues), on the condition, however, of allowing the intended use.
  • a polypeptide in use in the context of the present invention can be derived from a native polypeptide as found in nature, in particular in humans, or from a part thereof. It can also be chimeric and include additional residues of any origin fused in N and / or C-terminal and / or inserted so as to form an open reading frame. It is also possible to use a mutant obtained by mutation, deletion, insertion and / or substitution of one or more amino acids with respect to the sequences disclosed in the sequence identifiers (SEQ ID).
  • a preferred polypeptide in the context of the present invention comprises in in addition to suitable elements to ensure its anchoring in a cell membrane or its presentation on the surface of a cell.
  • suitable elements are known to those skilled in the art.
  • other techniques for example chemical techniques, can also be used to anchor or bind a polypeptide to a membrane or a cell surface.
  • homologous amino acid sequence is meant a sequence having a degree of homology of at least 70%, advantageously of at least 80%, preferably of at least 90% with at least minus 6 continuous amino acids from one of the sequences listed.
  • the identical term refers to 100% homology.
  • Those skilled in the art know the general rules which make it possible to calculate the degree of homology between two sequences. This is generally done by aligning the sequences, possibly using specialized computer programs. It may be necessary to artificially introduce vacant locations. Once the optimal alignment is achieved, the degree of homology is established by counting all the positions in which the amino acids of the two sequences are found identically, compared to the total number of positions.
  • attachment of an adenovirus to a host cell is meant the binding of the viral particle to the cell.
  • entity of an adenovirus into a host cell is meant the penetration of the virus into the host cell.
  • the attachment and / or entry are preferably mediated at least in part by the polypeptide (s) in use in the context of the present invention by interaction with the adenoviral capsid.
  • polypeptide polypeptide
  • other polypeptide molecules or not can also participate in these processes recognized in the art field as complex and multifactorial.
  • an adenovirus can be of human or animal origin (canine, avian, bovine, etc.) or a hybrid comprising genome fragments. These viruses and their genome are described in the literature (see for example Graham and Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol 7; Gene Transfer and Expression Protocols; Ed: E.J. Murray, 1991, The Human Press Inc., Clinton, NJ). It is preferred to use a recombinant adenovirus defective for replication and expressing in particular a gene of therapeutic interest.
  • the adenoviral genome is modified by deletion or mutation of sequences essential for replication and, in particular, included in the regions E1, E2, E4 and / or L1-L5 (see for example international application WO 94/28152).
  • the subject of the present invention is the use of a polypeptide comprising an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown in SEQ ID NO: 1 starting with the leucine residue in position 1 and ending with the glutamine residue in position 25.
  • a polypeptide in use within the framework of the present invention comprises an amino acid sequence homologous or identical to all or part of an antigen of the major histocompatibility complex of class I (MHC-I) and, preferably , of the latter's heavy chain.
  • MHC-I major histocompatibility complex of class I
  • histocompatibility antigens All the cells of an organism present on their membrane molecules called histocompatibility antigens which define each individual. The corresponding genes, more than a dozen, are located on chromosome 6 in humans and exhibit significant polymorphism, which makes it possible to ensure great variability of these identity markers. There are two different categories of these histocompatibility antigens, respectively Class I and II, whose structure and functions are distinct. Class I molecules, called FILA (for Human Leukocyte Antigen in English) intervene to present antigenic peptides on the cell surface and play an essential role in immune responses 8/33929
  • antiviral drugs exerted by cytotoxic T lymphocytes.
  • the MHC-I molecules are heterodimers composed of a non-MHC light chain designated ⁇ 2-microglobulin ( ⁇ 2m) and a heavy chain coded by the MHC genes, linked noncovalently.
  • the heavy chain is a membrane protein whose N-terminal part is oriented outside the cell while the C-terminal part is cytoplasmic.
  • the first includes 3 domains designated ⁇ l, ⁇ 2 and ⁇ 3 of approximately 90 amino acids each. It is followed by a transmembrane region of approximately 25 amino acids and then by the C-terminal region of around thirty amino acids.
  • polypeptides suitable for the purposes of the present invention there may be mentioned more particularly the HLA antigens A, B, C, D, E and F or polypeptides derived therefrom.
  • the polypeptide used in the context of the present invention comprises a sequence homologous or identical to all or part of the C-terminal region of the ⁇ 2 domain of the heavy chain of MHC-I and, more particularly, to the part centered on the tryptophan residue in position 167, in particular that extending from residues 156 to 180 (SEQ ID NO: 1).
  • the numbering referred to is consistent with that used for example in Bjorkman and Parham (1990, supra).
  • a polypeptide in use in the context of the present invention comprises an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown: in SEQ ID NO: 2 starting with the residue asparagine in position 1 and ending with the asparagine residue in position 26, in SEQ ID NO: 3 starting with the valine residue in position 1 and ending with the asparagine residue in position 25, in SEQ ID NO: 4 starting with the serine residue in position 1 and ending with the arginine residue in position 25, and / or in SEQ ID NO: 5 starting with the asparagine residue in position 1 and ending with the serine residue in position 25 .
  • a preferred polypeptide comprises an amino acid sequence homologous or identical to fibronectin and, in particular, to at least one of its type III modules and, in particular, to modules FNIII 1, 4, 5 and / or 14. Good heard, he can understand several. One can also consider the use of human fibronectin or a peptide derived therefrom, for example by mutation or fragmentation. For information, fibronectin encoded by a single gene is a molecule involved in the phenomena of cell adhesion and contact. Its sequence and its characteristics are described in the literature accessible to the skilled person (see in particular Bork and Doolittle, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a polypeptide as defined above is more particularly intended to allow or facilitate the attachment of an adenovirus of serotype C to a host cell and / or its entry therein.
  • adenoviruses mention may be made more particularly of serotypes 2 and 5.
  • the present invention also relates to a host cell capable of expressing a polypeptide in use in the context of the present invention and its use to allow or facilitate the attachment of an adenovirus to its surface and / or the entry of said adenovirus.
  • host cells can be considered. They can be cells of any origin, for example microorganisms, yeasts, insects, plants, animals. A mammalian cell and in particular a human cell of primary type, tumor or from a line will be preferred. cultivable / ' /; vitro.
  • a particularly preferred cell is or is derived from line 293 established from. of embryonic kidney cells by integration of the El adenoviral region (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72).
  • polypeptides in use in the context of the present invention on the surface of a host cell not usually expressing MHC-I and / or fibronectin should allow its infectivity by an adenovirus . It could be used as a new cell producing adenoviral vectors.
  • an overexpression in a cell naturally expressing said polypeptide An overexpression line derived from line 293 should make it possible to improve the production yields of an adenovirus of interest.
  • the polypeptide used in the context of the present invention can be associated with the cell by chemical means or by means of a ligand recognizing a cell surface protein. However, one can also envisage expression by recombinant DNA techniques.
  • nucleotide sequence coding for the polypeptide in question can be isolated (by standard PCR or cloning techniques) or chemically synthesized before being inserted into a conventional expression vector under the control of appropriate regulatory elements , the vector being introduced into the host cell by any technique of the art.
  • the host cell used in the context of the present invention can also be modified so as to complement a defective adenovirus by transfection of appropriate fragment (s) of adenoviral genome.
  • the present invention also relates to the use of a ligand capable of influencing the attachment of an adenovirus to a host cell and / or its entry into the latter mediated by a polypeptide as defined above.
  • the ligand used in the invention can be of any nature. We can cite for example the peptides, hormones, antibodies or their derivatives and, in particular, single chain antibodies of the scFv type (for single chain fragment variable in English) and soluble receptors lacking their transmembrane region.
  • a ligand can be derived from a polypeptide used in the present invention.
  • the ligand can have a negative (antagonist) or positive (agonist) influence.
  • a preferred ligand has a dissociation constant with respect to the adenovirus of between 0.01 and 100 nM, advantageously between 0.1 and 50 nM and, most preferably, between 0.5 and 10 nM.
  • a particularly preferred ligand is based on a polypeptide as defined in SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 amino acids Continues included in the sequence as shown in SEQ ID NO: 6 starting with the arginine residue in position 1 and ending with the arginine residue in position 20. It will be preferred to use the peptide designated MH20 in the examples which follow.
  • the ligand used in the context of the present invention is used to allow or stimulate the attachment and / or entry of adenoviruses.
  • a ligand suitable for the purposes of the invention comprises an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown in SEQ ID NO: 7 starting with the arginine residue in position 1 and ending with the serine residue at position 20.
  • a preferred example consists of the peptide designated below FN20.
  • the present invention also relates to a ligand comprising an amino acid sequence which is ho ogue or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • a preferred ligand is derived from the fiber of an adenovirus, in particular from the part of the head interacting with the abovementioned polypeptides.
  • a peptide motif chosen in this region should therefore influence the infectivity of adenoviruses with respect to a host cell expressing the polypeptide.
  • a ligand of a polypeptide as defined by SEQ ID NO: 1 preferably derives from Ad5 and comprises an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids of the sequence as shown in SEQ ID NO: 8, starting with the amino acid leucine in position 1 and ending with the amino acid aspartic acid in position 18.
  • a ligand also conceivable can derive from the fiber of an adenovirus of serotype 2 and include a amino acid sequence homologous or identical to at least 6 amino acids of the sequence as shown in SEQ LD NO: 9 starting at the threonine residue in position 1 and ending at the valine residue in position 16.
  • the ligand of a polypeptide such as defined by SEQ ID NO: 2 to 5 is more particularly characterized by an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 amino acids of the sequence as shown in SEQ ID NO: 10 started both at the leucine residue in position 1 and ending at the threonine residue in position 14 (Ad5) or in SEQ ID NO: 11 starting at the asparagine residue in position 1 and ending at the asparagine residue in position 13 (Ad2).
  • the present invention also relates to the use of a ligand according to the invention, for the preparation of a medicament intended to inhibit or reduce an infection by an adenovirus.
  • an antagonist ligand will be preferred for a therapeutic or prophylactic purpose.
  • the use of a ligand according to the invention preferably an agonist, is suitable for the preparation of a medicament intended to promote or facilitate infection by an adenovirus, and, in particular, of a recombinant adenovirus carrying a gene therapeutic for gene therapy (curative) or anti-viral (AIDS) or anti-cancer.
  • Such a drug finds its usefulness for example in combination with gene therapy treatments in order to improve viral infection in a patient treated with a recombinant adenovirus.
  • a parenteral, oral or aerosol route of administration The administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate dosage and formulation vary according to different parameters, for example the individual, the disease to be treated, the desired effect, the route of administration or the adenovirus in question.
  • the present invention also relates to a method for selecting or identifying a cellular receptor for a virus in an appropriate sample, comprising: (a) immobilization on an inert support of a reagent of viral origin comprising all or part of a surface protein of said virus determining its attachment to the cellular receptor,
  • step (c) eluting the sample retained in step (b) with all or part of an antibody directed against said reagent of viral origin
  • the inert support can be without limitation in any form (cone, tube, well, beads or the like) and of any material (natural, synthetic such as polymers, chemically modified or not ).
  • the fixing of the reagent on the inert support can be carried out directly or indirectly. Directly, the procedure is preferably by adsorption, that is to say in a non-covalent manner although the establishment of covalent bonds can also be considered. Indirectly, an anti-reagent compound capable of interacting with the reagent can be fixed beforehand so as to immobilize the assembly on the inert support.
  • the sample consists of a library called random and, in particular of expression (genomic fragments, cDNA) or peptide or, preferably, phages expressing peptide motifs (phagotopes).
  • libraries are described in the literature or commercially accessible.
  • an anti- neutralizing fiber in order to select or identify a receiver cell of an adenovirus, all or part of the fiber and, in particular, of the head of an adenovirus and, as eluent, an anti- neutralizing fiber (inhibitor of virus attachment to the surface of the host cell).
  • the fiber or its fragments can be produced recombinantly and the antibodies by the hybridoma technique or by genetic engineering (production of single chain antibodies scFv, Fab ).
  • the present invention also relates to a method for selecting or identifying the part of a viral protein determining the attachment of a virus to a cellular receptor in an appropriate sample, comprising: (a) immobilization on an inert support of all or part of an antibody directed against said viral protein, (b) incubation for a determined time with said sample,
  • step (c) eluting the sample retained in step (b) with a reagent of viral origin comprising all or part of said viral protein
  • the present invention also relates to the use of a bifunctional ligand for targeting an adenovirus to a cell surface protein other than the natural cellular receptor of said adenovirus, said bifunctional ligand comprising a first ligand part capable of interacting with the fiber of said adenovirus, a second ligand part capable of interacting with said cell surface protein and, optionally, a spacer between said first and second ligand parts.
  • a bifunctional ligand is capable of interacting with two different entities, one preferably located on the surface of an adenovirus. and the other on the surface of a host cell, at the level of a cell surface protein other than the natural cellular receptor of said adenovirus.
  • the two ligand parts can optionally be separated by a spacer comprising from 1 to fifteen amino acids, preferably uncharged.
  • the order of the entities does not matter, the domain interacting with the adenoviral protein being able to be in N or in C-terminal of the bifunctional ligand, the C-terminal position being preferred.
  • bifunctional ligand makes it possible to target an adenovirus towards a host cell of interest, for example a tumor cell, an infected cell, a particular cell type or a category of cells carrying a specific surface marker.
  • a host cell of interest for example a tumor cell, an infected cell, a particular cell type or a category of cells carrying a specific surface marker.
  • the entity recognizing the adenoviral protein is exposed, which should create “decoys” of viral receptors of the same type as the primary receptors ( ⁇ 2 domain of MHC-I) and create or increase the number of primary adenovirus receptors on the surface of the host cell.
  • the ligand part interacting with the adenoviral fiber has the characteristics of the ligand defined above, it is in particular derived from the ⁇ 2 domain of MHCI and preferably comprises an amino acid sequence homologous or identical to at least 6 continuous amino acids included in the SEQ. ID NO: 6. Even more preferably, it consists of the peptide MH20 (SEQ ID NO: 6).
  • the ligand part interacting with the cell surface protein this is adapted to the host cell which it is desired to target.
  • the ligand may be a fragment of antibody against fusine, the CD4 receptor or against an exposed viral protein (envelope glycoprotein) or even the part HIV virus TAT protein extending from residues 37 to 72; (Fawell et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668).
  • a tumor cell As it is a tumor cell, the choice will be made on a ligand recognizing a specific tumor antigen (MUC-1 in the case of breast cancer, HPV papilloma virus antigens, etc.) or overexpressed (IL-2 receptor overexpressed in certain lymphoid tumors). If it is desired to target T cells, a T cell receptor ligand can be used. In addition, transferrin is a good candidate for liver targeting.
  • EGF abbreviation of Epidermal Growth Factor
  • GRP for Gastrin Releasing Peptide
  • GNHWAVGHLM sequence GNHWAVGHLM
  • the adenovirus to be targeted is recombinant and carries a cytotoxic gene or capable of inducing cellular apoptosis.
  • genes are well known. Mention may in particular be made of the gene coding for the thymidine kinase of the HSV-1 virus (herpes simplex virus type 1).
  • a bifunctional ligand comprising the peptide MH20 and the GRP.
  • the MH20 and GRP peptide domains can be oriented inversely: MH20-GRP respectively when the MH20 is in the N-terminal position and GRP-MH20 when the MH20 is in the C-terminal position.
  • Another embodiment uses a ligand having an MH20 entity and an antibody entity of the ScFv (Single Chain Fv fragment) type.
  • said bifunctional ligand comprises an amino acid sequence homologous or identical to all or part of the sequence as shown.
  • the present invention also relates to a bifunctional ligand as defined above and, in particular, the GRP-MH20 or MH20-GRP ligands.
  • the GRP-MH20 ligand is particularly preferred.
  • the present invention also relates to a cell carrying on its surface such a bifunctional ligand.
  • the advantage of such a cell is to increase the number of primary receptors of the MHCl- ⁇ 2 type.
  • Said cell is advantageously a mammalian cell of any origin (see above). It is preferably a complement cell for an adenovirus defective in function
  • El and possibly another function (E2, E4, E2 and E4, etc., see application WO94 / 28152).
  • a preferred example is line 293. It can be generated by recombinant DNA techniques (expression of the bifunctional ligand by means of an appropriate vector comprising the elements allowing expression on the cell surface, for example signal sequence and / or transmembrane region), by covalent chemical bond or not or by simple interaction between the cell and the ligand.
  • the present invention is illustrated by reference to the following figures:
  • Figure 1 shows the phagotopes obtained after bio-mulching using the antibody 1D6.3 (a) or 7A2.7 (b) as a ligand.
  • the phagotope peptide motifs are aligned with respect to the sequence of the Ad5 head (the methionine residue initiating the fiber representing +1.
  • the regions forming ⁇ -sheet structures (Xia et al., 1994, supra) are underlined and indicated by (D), (E) and (F). Identical or conserved residues in the sequences are indicated in bold.
  • Figure 2 shows the phagotopes obtained after bio-mulching using (a) the antibody 7A2.7 or (c) 1D6.3 as eluent, (b) and (d) the consensus sequences determined from the phagotopes (a) and (c) respectively as well as the homologous sequences found by analysis of the SWISS PROT database. Residues stored at similar positions are shown in bold.
  • FIG 3 illustrates the expression of the luciferase gene in HeLa cells infected with the Ad5Luc3 virus at a constant MOI (0.16 f ⁇ u / 10 cells).
  • Ad5Luc3 is added to the cells cooled to 0 ° C in the presence of increasing molarities of peptide
  • a) FN20 (0 to 500 ⁇ M) or
  • MH20 (0 to 50 ⁇ M).
  • the controls correspond to the incubation of the peptides after the attachment of Ad5Luc3 ( ⁇ ) or after endocytosis (D).
  • Figure 4 illustrates the expression of the luciferase gene in Daudi-
  • the Ad5Luc3 is brought into contact with the cells pre-cooled to 0 ° C for 1 h to allow viral attachment but not entry.
  • the luciferase activity is evaluated after 18 h of culture at 37 ° C.
  • the RLU values represent the average of three separate experiments.
  • Figure 5 illustrates the principle of the bifunctional ligand method mimicking the primary adenovirus receptors.
  • Figure 6 shows the luciferase enzyme activity as a function of the MOI of Ad5Luc3 on NIH (a), Swiss 3T3 (b) and HeLa (c) cells.
  • HeLa cells are cultured in monolayers according to the techniques of the art.
  • a DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • the Daudi HLA- (ATCC CCL213) and HLA + (Quille, et al., 1988, J. Immunol. 141, 17-20) cells are maintained in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 15% FCS.
  • Ad5Luc3 is an adenovirus competent for replication which contains the luciferase gene placed under the control of the SV40 virus early promoter (simian virus 40) inserted in the E3 region of the adenoviral genome (Mittal et al., 1993, Virus Research 28, 67-90).
  • the murine mAbs 1D6.3 and 7A2.7 were generated by conventional techniques by injecting the head of the Ad5 fiber produced in the bacteria recombinantly (Henry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239- 5246; Douglas et al., 1996, Nature Biotech 14, 1574-1578) to Balb / C mice.
  • the fusion and obtaining of hybridoma clones are conventional techniques within the reach of those skilled in the art.
  • the secreting clones are selected by their recognition of the antigen which served for immunization in ELISA. They are said to have neutralizing activity against virions (Michael et al., In preparation).
  • the reactivity of the antibodies is tested with regard to the fiber head domain of 3 different serotypes (Ad2, Ad5 and Ad3) prepared by recombinant route.
  • the corresponding sequences are isolated by PCR (Polymerase Chain Reaction) from viral genomic DNA and then introduced into the AcNPV virus (Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus) under the control of the polyhedrine promoter (Luckow and Summer, 1989, Virology 170, 31- 39).
  • Recombinant proteins are expressed in Sf9 insect cells (Spodoptera frugiperda).
  • the general technology is detailed in Karayan et al. (1994, Virology 202, 782-796) and Novelli and Boulanger (1991, Virology 185, 365-376).
  • the Ad5 sequences carrying the last repeated motif of the stem followed by the fiber head are cloned using the primers shown in SEQ ID NO: 12 and 13.
  • the sense primer corresponds to nucleotides 32164 to 32205 of the Ad5 genome (Chroboczek and Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554), includes 4 mismatches so as to create a BamHI site and to replace threonine at position 388 of the native fiber with an initiating ATG codon.
  • the antisense primer corresponds to nucleotides 32919 to 32883 of the Ad5 genome and makes it possible to create a Kpnl site to facilitate the subsequent cloning steps.
  • the recombinant protein harvested from the supernatants of Sf9 cells is designated F5-AT386.
  • the Ad2 head is produced from the baculovirus vector described in Louis et al. (1994, J. Virol. 68, 4104-4106).
  • the expression product designated F2-AT388 begins at position 388 (by replacing the Ala of the native sequence with a Met) and carries, in addition to the domain of the head, the last repeated motif of the stem.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 14) is used which is designed to introduce an Ncol cloning site and to replace the Asn and Ser codons at position 124 and 125 with Met and Ala codons respectively.
  • the antisense primer introduces a Kpnl site.
  • the expression product is designated F3-AT124.
  • the wells of an ELIS A plate are covered with the recombinant protein
  • F5-AT386, F2-AT388 or F3-AT124 on which the mAb 1D6.3 or 7A2.7 is reacted then a labeled anti-mouse antibody (for example with phosphatase or peroxidase).
  • a labeled anti-mouse antibody for example with phosphatase or peroxidase.
  • a positive reaction is observed with regard to the recombinant protein F5-AT386 native. No reaction is detected in the wells containing the F5-AT386 protein denatured in SDS or those containing the native or denatured products F2-AT388 and F3-AT124.
  • the cells in the semi-confluent state are put in the presence of a constant quantity of radioactive virions (10 ′ cpm for 5 ⁇ 10 cells) at a multiplicity of infection (MOI) of 1000 virions per cell for 1 h at 0 ° C in the presence of mAb 1D6.3 or 7 A2.7 (dilutions 1: 10, 1: 8, 1: 4 and 1: 2 of the supernatants of respective hybridomas whose concentration in mAb is estimated at 0 , 1- 0.2 ⁇ g / ml, which corresponds to an excess in mAb compared to the virions present in the inoculum of 100, 250, 500 and 1000 respectively).
  • MOI multiplicity of infection
  • the cells are then washed in the presence of PBS, fixed with 0.1% of paraformaldehyde in PBS, dried and covered with the K4 emulsion in the form of a gel (Ilford Nuclear Research). After a week-long exposure and development (development agent D19B, Kodak), the samples are stained briefly with 0.5% toluidine blue taken up in HO and examined under a microscope. The density of the reduced silver grains around the contour of the cells is representative of the number of virions [C] bound to the cell surface.
  • EXAMPLE 2 Identification of the epitopes of mAbs 1D6.3 and 7A2.7.
  • the immobilized antibodies are brought into contact with a phage library expressing hexapeptides (phages FUSES; Scott and Smith, 1990, Science 249, 386-390).
  • phages FUSES a phage library expressing hexapeptides
  • the phages retained are eluted either by a conventional acid elution buffer or, more selectively, by competition in the presence of an excess of recombinant protein F5-AT386.
  • the hexapeptide motifs (phagotopes) carried by the eluted phages are determined by sequencing the protein pIII fUSE5 by the method of Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
  • mAb 1D6.3 retains different phagotopes with overlapping sequences, and are homologous to the head of Ad5 extending between the residues Val at position 438 and Asp at position 462.
  • a central motif of sequence LAPISGTVQSAHLIIRFD corresponding to the amino acids at positions 445 to 462 (SEQ ID NO: 8). This motif is centered on the His residue at position 456, which corroborates the presence of histidine in several independent phagotopes.
  • three phagotopes contain histidine close to a serine (GISHTG and GASHTV) and a homologous sequence is found in the head QSAHLi).
  • the LAPIS sequence is represented in several phagotopes in the form L-P, VAP-S and LIPFNS.
  • WALFRS are homologous to the YWNFR motif. Based on this data, the mAb 7A2.7 epitope was mapped between residues 473 and 486 of the fiber.
  • Ad5 (SEQ ID NO: 10).
  • mAbs 1D6.3 and 7A2.7 recognize adjacent segments of 15 to 20 aa in the linear sequence of the Ad5 head, the residues extending from positions 445 to 462 and 473 to 486 respectively.
  • the two epitopes occupy continuous regions from a spatial point of view.
  • the epitope of mAb 1D6.3 covers part of the CD loop and of the ⁇ D sheet, while the epitope of mAb 7A2.7 is located at the level of the adjacent segment DE and of the two sheets ⁇ E and F.
  • the epitope 1D6.3 is located inside a sheet R while the epitope 7A2.7 is oriented more laterally with respect to sheet R.
  • FIG. 2a The phagotopes produced by competition with mAb 7A2.7 are shown in Figure 2a. Their analysis makes it possible to derive a consensus sequence (FIG. 2b) which exhibits homology with motifs 1, 3, 5 and 14 of the type III module of human fibronectin (SEQ ID NO: 2 to 5) (Main et al., 1992, Cell 77, 671-678). The latter are situated at the level of the ⁇ B sheet and of the adjacent loop BC of the module FNIII (Dickinson et al., 1994, J. Mol. Biol. 236, 1079-1092).
  • the sequence of the fusion product comprising a copy of the pentadecapeptide (designated GST-FNxl) can be diagrammed as follows: GST- (thrombin cleavage site-PGIS-GGGGG-ILDSMGRLE-RHILWTPANTPAMGY (V) -ELKLNS- stop. Constructions GST-FNx2 and GST-FNx3 have 2 and 3 repeats of the pentadecapeptide between the LE and EL residues of the cloning cassette, respectively.
  • the sense and antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 18 and 19) coding for the consensus sequence obtained by competition with mAb 1D6.3 ( Figure 2d) are inserted according to the same strategy as above at the C-terminal end of GST to give the constructions GST-MHCxl, GST-MHCx2 and GST-MHCx3 depending on the number of patterns present.
  • the chimeric proteins GST-FN and GST-MHC are produced in E. coli, extracted and affinity-purified on agarose-glutathione beads (Sigma) according to conventional methods (Smith and Johnson, 1988, Gene 67, 31-40 ).
  • the complete fibers of serotypes 2, 3 and 5 are produced recombinantly according to the baculovirus / Sf9 cell technology already used.
  • the F2-FL582 construction carrying the Ad2 fiber gene is described in Novelli and Boulanger (1991, Virology 185, 365-376).
  • the sequences coding for the Ad5 and Ad3 fibers are isolated by PCR using the viral DNA as a template and appropriate sense and antisense primers such as those reported in SEQ ID NO: 20 and 13 and 21 and 15.
  • the amplified segment is introduced into a baculovirus vector under the control of the polyhedrin promoter and the expression product recovered from the culture supernatants.
  • F5-FL581 and F3-FL320 are obtained corresponding to the fibers Ad5 and Ad3 respectively.
  • the capacity of the FNIII module and of the recombinant ⁇ -2 MHC-I domain to bind the adenoviral fiber is evaluated by immunotransfer after incubation / ' // vitro of the fusion proteins GST-FN and GST-MHC and of the recombinant fibers F2-FL582, F5-FL581 and F3-FL320.
  • the complexes formed are isolated on glutathione agarose beads under the conditions described by Johnson et al. (1995, J. Biol. Chem.
  • the luminograms (Hyperfiim ⁇ - max, Amersham) are analyzed at 610 nm using an automatic densitometer (REP-EDC, Helena Laboratories, Beaumont, TX) .
  • REP-EDC automatic densitometer
  • the antibody 4D2.5 recognizes the FNPVYP epitope of the tail domain conserved in most mammalian adenoviruses.
  • GST-FNxl, GST-FNx2 and GST-FNx3 bind to F5-AT386 and F2-AT388 with great efficiency while F3-AT124 is retained at a lower level.
  • a similar behavior is observed with the chimeric proteins GST-MHCxl, GST-MHCx2 and GST-MHCx.3 which retain F5-AT386 and F2-AT388 with an efficiency greater than F3-AT 124.
  • the Ad5 fiber binds to the GST-FN and GST-MHC fusion proteins and this with an affinity 2 to 3 times greater compared to the Ad2 fiber and 10 to 15 times greater compared to the Ad3 fiber.
  • the binding efficiency is not dependent on the number of motifs present in the fusion protein, the intensity being comparable and even sometimes lower between GST-FNxl and GST-FNx3 and GST-MHCxl and GST-MHCx3 . This can be explained by the fact that the tandem patterns can adopt a conformation which harms the bond.
  • the FN20 and MH20 peptides are tested for the attachment of the reporter adenovirus Ad5Luc3 to HeLa cells cultured in vitro.
  • the test is carried out in part at 0 ° C, a temperature which allows the attachment of viruses to the surface of permissive cells but, on the other hand, blocks the entry of viruses and the recycling of receptors.
  • Ad5Luc3 (MOI 0.16 pfu / 10 cells) is previously incubated with increasing amounts of peptides (0.01 to 500 nM) at room temperature for 2 hours then the mixture is added to a cell culture placed on ice.
  • the non-adsorbed viruses and the peptides are eliminated by washing and the culture is continued for 18 h at 37 ° C. after addition of a preheated medium.
  • the cell lysates are prepared in a conventional manner and the luciferase activity expressed in RLU (for Relative Light Units in English) is determined (Promega, Madison, WI substrate; Lumat LB-9501 luminometer, Brethold Bioanalytical, Wildbad, Germany).
  • the results of competition with the FN20 peptide are presented in Figure 3a. No significant effect is obtained up to a molarity of 10 ⁇ M then a progressive increase in the luciferase activity appears beyond 25 ⁇ M. In particular, the activity increases by a factor of 100 between 25 and 100 ⁇ M.
  • the FN20 peptide therefore has a stimulating effect on viral attachment. It does not confer any apparent cytotoxicity and has no negative effect on the expression of the luciferase gene once the virus is pre-attached (peptide added to cell culture after the viral attachment step at 0 ° C) or pre-endocytosed ( peptide added to cell culture after the virus attachment and penetration step).
  • the MH20 peptide FIG.
  • the wild adenoviruses Ad5, Ad2 Ad3 are preincubated for 2 h at room temperature with the inhibitor peptide MH20 at a constant molarity (25 ⁇ M), the MOI varying from 0.2 to 2 pfu / cell.
  • the mixture is placed in the presence of the HeLa cells for 1 h at 0 ° C. and the culture continued at 37 ° C. after removal of the non-adsorbed viruses under the same conditions as those described above.
  • the level of synthesis of the hexon, of the 100k protein, of the penton base and of the fiber is estimated by immunotitration (Wohlfart, 1988, J. Virol. 62, 2321-2328) on the cell extracts collected 48 h after the infection.
  • EXAMPLE 7 Affinity of the Ad5 fiber for the peptides FN20 and MH20.
  • the fiber adsorbed on either peptide is eluted with an adequate solution (1M urea, 1 M NaOH and 1% SDS) and then precipitated in the presence of trichloroacetic acid.
  • the radioactivity contained in the precipitate recovered on a GF / C filter is counted using a liquid scintillation spectrometer (Beckman LS-6500) and the dissociation constants (Kd) determined according to Scatchard (1949, Annls NY Acad. Sci . 57, 660-672).
  • EXAMPLE 8 The infectivity of Ad5 is dependent on the expression of MHC-I on the surface of permissive cells.
  • the Daudi line of B lymphoblastoids established from a lymphoma of
  • Burkitt is naturally deficient in the expression of ⁇ -2 microglobulin and, therefore, does not have on its surface HLA class I molecules (Daudi HLA-).
  • the Daudi-derived E8.1 cell line was generated by transfection of a gene coding for ⁇ -2 microglobulin in order to restore the expression of HLA class I molecules on their surface (Daudi-HLA +; Quillet et al., 1988, J. Immunol. 141, 17-20).
  • the attachment experiments of Ad5Luc3 at 0 ° C. were carried out on Daudi HLA- and Daudi-HLA + cells with an MOI of three orders of magnitude higher than that used in the case of HeLa cells (0.3 to 150 pfu / 30 cells).
  • the luciferase activity measured in the cell lysates 18 h post-infection is represented in FIG. 4.
  • the infection concerns Daudi-HLA + cells
  • the luciferase activity increases regularly in a dependent MOI manner until reaching a plateau above 5 pfu / 10 cells.
  • the luminescent signal is very weak (3 to 4 orders of magnitude) compared to to that observed with cells provided with functional HLA molecules on their surface.
  • This example describes the construction of a bifunctional peptide which contains two domains, one recognizing the head of the adenoviral fiber and the other a cellular surface protein.
  • a peptide is used below in which the MH20 is fused to GRP (Gastrin Releasing Peptide).
  • GRP Neuron Releasing Peptide
  • Two constructions are possible, orienting the two peptide domains in an inverted manner, N- versus C-terminal, giving rise to the peptide MH20-GRP (SEQ ID No: 22) and to the peptide with opposite orientation GRP- MH20 (SEQ ID No: 23 ).
  • the binding of this peptide to GRP receptors on the cell surface should create “decoys” of viral receptors of the same type as the primary receptors, ie the ⁇ 2 domain of class I molecules of MHC.
  • the apparent result is to create or increase the number of primary viral adenovirus receptors on the surface of cells having GRP receptors.
  • HeLa Human (HeLa) or murine cells (Swiss-3T3 or NIH-3T3, ATCC CRL-1658) are rinsed and incubated between 0 and 4 ° C with an isotonic solution (PBS) at 500 ⁇ M in peptide. After 1 h, the solution is removed and replaced with the viral inoculum (Ad5Luc3) according to a protocol already described (see above or Hong et al., 1997, EMBO J. 16, 2294-2306).
  • PBS isotonic solution
  • the virus is incubated for one hour between 0 and 4 ° C to allow its attachment, then the excess of non-adsorbed virus is rinsed with culture medium pre-cooled to 4 ° C and the cells are replaced at 37 ° C in the presence of culture medium preheated to 37 ° C.
  • the virus is endocytosed at 37 ° C and the viral cycle then takes place for 18 to 20 h at 37 ° C.
  • FIG. 6 it can be seen that the curves obtained in the absence of any peptide (control curves indicated: - peptide) and those in the presence of peptide in the orientation MH20 on the N-terminal side - linked to the GRP in C-terminal ( MH20 - GRP) have an identical slope.
  • GRP on the N-terminal side and
  • the increase in the number of adsorbed viruses is significant, as shown by the increase in luciferase activity: 8 to 10 times for NIH-3T3, 5 to 6 times for HeLa and 2 cells 3 times for Swiss-3T3.
  • the binding of the GRP portion of the bifunctional peptide, a ligand for GRP receptors, has made it possible to increase the apparent number of receptors for the AdS fiber, of the alpha 2 domain type of MHC class I molecules (MHC I- ⁇ 2) .
  • ORGANISM Mastadenovirus
  • STRAIN serotype 5

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans les identificateurs de séquence 1 à 5 à titre de récepteur et/ou co-récepteur cellulaire des adénovirus. Elle concerne également l'utilisation d'une cellule capable d'exprimer un tel polypeptide ainsi que celle d'un ligand capable d'influencer l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou son entrée au sein de ladite cellule hôte. Enfin, elle a également trait à une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus ou la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement du virus à son récepteur cellulaire ainsi qu'à l'utilisation d'un ligand bifonctionnel pour cibler un adénovirus vers une cellule hôte portant à sa surface une protéine de surface autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adénovirus.

Description

UTILISATION D'UN POLYPEPTIDE A TITRE DE RECEPTEUR CELLULAIRE DES ADENOVIRUS
La présente invention a pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et/ou d'un module de type III de la fibronectine pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus sur une cellule hôte et/ou son entrée au sein de celle-ci. L'invention vise également l'utilisation d'un ligand capable de moduler l'infectivité d'un adenovirus vis à vis d'une cellule hôte, médiée par l'un ou l'autre des polypeptides cités ci-dessus. Enfin, l'invention concerne une méthode de biorpaillage pour identifier ou sélectionner un récepteur cellulaire d'un adenovirus ou un de ces ligands, notamment d'origine virale
Les adenovirus sont des virus à ADN d'un large spectre d'hôte. Ils ont été mis en évidence dans de nombreuses espèces animales et peuvent infecter divers types cellulaires. De nombreux sérotypes ont été caractérisés au sein de chaque espèce qui présentent une organisation génomique et un cycle infectieux comparables. D'une manière générale, le génome adénoviral est constitué d'une molécule d'ADN linéaire, bicaténaire et d'environ 3όkb contenant les gènes codant pour les protéines virales et à ses extrémités deux répétitions inversées (désignées ITR) intervenant dans la réplication et la région d'encapsidation. Les adenovirus se répliquent dans les noyaux des cellules infectées. Le cycle infectieux se déroule en 2 étapes. La phase précoce précède l'initiation de la réplication et permet de produire les protéines précoces régulant la réplication et la transcription de l'ADN viral. Ces étapes sont suivies de la phase tardive au cours de laquelle sont synthétisées les protéines structurales qui constituent les particules virales. L'assemblage des nouveaux virions prend place dans le noyau. Dans un premier temps, les protéines virales s'assemblent de manière à former des capsides vides de structure icosaédrique, dans lesquelles l'ADN adénoviral est encapsidé. Les particules virales sont libérées et susceptibles d'infecter d'autres cellules permissives. A cet égard, la fibre et le penton base présents à la surface des capsides jouent un rôle critique dans l'attachement cellulaire des virions et leur internalisation.
L'adénovirus se lie à la surface des cellules permissives par l'intermédiaire de la fibre trimérique et d'un récepteur cellulaire jusqu'à présent, non identifié. Puis, la particule est internalisée par endocytose par liaison du penton base aux intégrines 5 cellulaires αvβ3 et αvβs (Belin et Boulanger, 1993, J. Gen. Virol. 74, 1485-1497 ; Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 681 1-6814 ; Nemerow et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4, 52-55 ; Wickham et al., 1993, Cell 73, 309-319 ; Wickham et al., 1994, J. Cell Biol. 127, 257-264). La fibre d'Ad2 comporte 580 acides aminés (aa) dont la séquence est divulguée dans Hérissé et al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042). 0 Celle d'Ad 5 présente 582 acides aminés (Chroboczek et Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554). Sa masse moléculaire est de 62 kDa, mais la fibre native se comporte comme une molécule de 160-180 kDa confirmant son assemblage sous forme d'un trimère.
La fibre est composée de 3 domaines (Chroboczek et al., 1995, Current Top. 5 Microbiol. Immunol. 199, 165-200) :
(1 ) En N-terminal, la "queue" très conservée d'un sérotype à l'autre, interagit avec le penton base et assure l'ancrage de la molécule dans la capside.
(2) La "tige" est une structure en bâtonnet de longueur variable selon les sérotypes. Par exemple, la tige de la fibre d'Ad5 contient 22 répétitions d'un motif 0 de 15 résidus qui pourraient adopter une conformation en feuillet β. Le nombre de ces répétitions diffère d'un sérotype à l'autre, ce qui explique les variations de longueur.
(3) Enfin, à l'extrémité distale de la tige, la "tête" ou sphéricle terminale est une structure globulaire contenant les signaux de trimérisation (Hong et Engler, 1996, 5 J. Virol. 70, 7071-7078 ; Novelli et Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303 ; Novelli et Boulanger, 1991 , Virology 755, 365-376). La plupart des données expérimentales montrent que c'est le domaine de la tête qui est responsable de la liaison aux cellules permissives (Krasnykh et al., 1996, J. Virol. 70, 6839-6846).
(4) La complexité de l'attachement, adénoviral laisse supposer qu'il serait sérotype dépendant et que plusieurs protéines cellulaires pourraient y participer. En ce qui concerne l'Ad2, Hong et Boulanger (1995, EMBO J. 14, 4714-4727) ont identifié un certain nombre de motifs peptidiques trouvés dans plusieurs protéines cellulaires de surface susceptibles d'interagir avec les protéines capsidaires (penton base et fibre), en particulier les modules de type III 5 et 14 de la fibronectine humaine. Les auteurs ont opéré par immobilisation sur un support inerte du penton base ou de la fibre (ligand) sur laquelle ils ont fait réagir une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides aléatoires (désignés phagotopes). Les phages adsorbés, qui en théorie expriment des phagotopes interagissant avec un motif porté par la protéine adenovirale, sont ensuite élues soit classiquement à pH acide ou par compétition avec l'autre partenaire capsidaire non immobilisé (éluant). Cependant, le récepteur cellulaire des adenovirus et la région de la tête précisément impliquée dans la liaison au récepteur n'ont à ce jour pas encore été clairement identifiés.
On a maintenant procédé à une nouvelle technique de "biorpaillage" (pour biopanning en anglais) dans laquelle le ligand immobilisé est constitué par le domaine de la tête de la fibre d'Ad5 et l'éluant par un anticorps neutralisant dirigé contre cette dernière et isolé deux classes de phagotopes selon l'anticorps mis en oeuvre. La première correspond à une séquence conservée au sein du domaine α-2 des antigènes du complexe majeur d'histoco patibilité de classe I (α-2 MHC-I) et la seconde à une séquence retrouvée dans les modules III de la fibronectine humaine (FNIII). Les données reportées dans les exemples qui suivent, soutiennent l'hypothèse que le α-2 MHC-I constitue le récepteur primaire des adenovirus de sérotypes C et confirment la participation des FNIII à titre de co-récepteur ou co- facteur. On a également mis en évidence les régions de ces deux récepteurs et de la fibre interagissant l'une avec l'autre. En outre, on a généré un peptide antagoniste reproduisant le motif du domaine α-2 MHC-I qui neutralise l'attachement des adenovirus et un peptide agoniste reproduisant les motifs FNIII qui stimule l'attachement.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée :
(a) dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25, (b) dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26,
(c) dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25,
(d) dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu serine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou
(e) dans la SEQ LD NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 25 ; pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule hôte. Aux termes de la présente invention, on entend par "polypeptide" toute molécule constituée par un enchaînement d'au moins 6 et, de préférence d'au moins 8, acides aminés. Le terme polypeptide comprend aussi bien des molécules peptidiques de courte longueur (de 6 à quelques dizaines de résidus) que des molécules de longueur plus importante (jusqu'à plusieurs centaines de résidus), à la condition toutefois de permettre l'utilisation envisagée. On précise qu'un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention peut dériver d'un polypeptide natif tel que trouvé dans la nature, en particulier chez l'homme, ou d'une partie de celui-ci. Il peut également être chimère et comprendre des résidus supplémentaires d'une origine quelconque fusionnés en N et/ou C-terminal et/ou insérés de manière à former un cadre de lecture ouvert. On peut également mettre en oeuvre un mutant obtenu par mutation, délétion, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés par rapport aux séquences divulguées dans les identificateurs de séquence (SEQ ID).
Un polypeptide préféré dans le cadre de la présente invention comprend en outre des éléments appropriés pour assurer son ancrage dans une membrane cellulaire ou sa présentation à la surface d'une cellule. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. A titre indicatif, on mentionne la présence d'un peptide signal généralement associé en position N-terminale et d'une région transmembranaire présentant un degré d'hydrophobicité élevé. Mais on peut également avoir recours à d'autres techniques, par exemple chimiques, pour ancrer ou lier un polypeptide à une membrane ou une surface cellulaire.
Par "séquence d'acides aminés homologue", on entend une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, de manière avantageuse, d'au moins 80 %, de manière préférée, d'au moins 90 % avec au moins 6 acides aminés continus d'une des séquences citées. Le terme identique fait référence à 100 % d'homologie. L'homme du métier connaît les règles générales qui permettent de calculer le degré d'homologie entre deux séquences. On procède généralement par alignement des séquences éventuellement à l'aide de programmes d'ordinateur spécialisés. Il peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions.
Par "attachement d'un adenovirus à une cellule hôte", on entend la liaison de la particule virale à la cellule. Par "entrée d'un adenovirus au sein d'une cellule hôte", on désigne la pénétration du virus à l'intérieur d.e la cellule hôte. L'attachement et/ou l'entrée sont de préférence médié(s) au moins en partie par le(s) polypeptide(s) en usage dans le cadre de la présente invention par interaction avec la capside adenovirale. Bien entendu, d'autres molécules polypeptidiques ou non peuvent également participer à ces processus reconnus dans le domaine de l'art comme complexes et multifactoriels. Ils peuvent être évalués par toute technique de l'art, telles que celles décrites ci-après mettant en oeuvre une lignée cellulaire permissive et des particules marquées radioactivement ou exprimant un gène reporter par exemple le gène de la luciférase A 0°C, seul l'attachement peut avoir lieu, la pénétration virale nécessitant une température de 37°C.
Aux fins de la présente invention, un adenovirus peut être d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine...) ou hybride comprenant des fragments de génome. Ces virus et leur génome sont décrits dans la littérature (voir par exemple Graham et Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol 7 ; Gène Transfer and Expression Protocols ; Ed : E.J. Murray, 1991, The Human Press Inc., Clinton, NJ). On préfère mettre en oeuvre un adenovirus recombinant défectif pour la réplication et exprimant notamment un gène d'intérêt thérapeutique. Avantageusement, le génome adénoviral est modifié par délétion ou mutation de séquences essentielles à la réplication et, en particulier, comprises dans les régions El , E2, E4 et/ou L1-L5 (voir par exemple la demande internationale WO 94/28152).
Selon une première variante, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25.
De manière avantageuse, un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence en acide aminé homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I) et, de préférence, de la chaîne lourde de ce dernier.
Toutes les cellules d'un organisme présentent sur leur membrane des molécules appelées antigènes d'histocompatibilité qui définissent chaque individu. Les gènes correspondants, plus d'une dizaine, sont localisés sur le chromosome 6 chez l'homme et présentent un polymorphisme important, ce qui permet d'assurer une grande variabilité de ces marqueurs d'identité. Il existe deux catégories différentes de ces antigènes d'histocompatibilité, respectivement de classe I et II, dont la structure et les fonctions sont distinctes. Les molécules de classe I, appelées FILA (pour Human Leukocyte Antigen en anglais) interviennent pour présenter les peptides antigéniques à la surface cellulaire et jouent un rôle essentiel dans les réponses immunitaires 8/33929
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antivirales exercées par les lymphocytes T cytotoxiques.
Les molécules MHC-I sont des hétérodimères composés d'une chaîne légère non MHC désignée β2-microglobuline (β2m) et d'une chaîne lourde codée par les gènes MHC, liées de manière non covalente. La chaîne lourde est une protéine membranaire dont la partie N-terminale est orientée à l'extérieur de la cellule alors que la portion C-terminale est cytoplasmique. La première comprend 3 domaines désignés αl, α2 et α3 d'environ 90 acides aminés chacun. Elle est suivie d'une région transmembranaire d'environ 25 acides aminés puis de la région C-terminale d'une trentaine d'acides aminés. La plupart des variations entre les produits des différents allèles sont localisées dans les domaines αl et α2, le domaine α3 étant relativement conservé et la β2m invariable (pour une revue et la comparaison de séquence entre les membres des MHC-I, voir Bjorkman et Parha , 1990, Annu. Rev. Biochem. 59, 253-288).
Parmi les polypeptides convenant aux fins de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les antigènes HLA A, B, C, D, E et F ou des polypeptides en dérivant.
D'une manière particulièrement avantageuse, le polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence homologue ou identique à tout ou partie de la région C-terminale du domaine α2 de la chaîne lourde des MHC- I et, plus particulièrement, à la partie centrée sur le résidu tryptophane en position 167, notamment celle s'étendant des résidus 156 à 180 (SEQ ID NO: 1). La numérotation à laquelle il est fait référence est conforme à celle utilisée par exemple dans Bjorkman et Parham (1990, supra).
Selon une autre variante, un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée : dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25, dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu serine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 25..
Un polypeptide préféré comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à la fibronectine et, en particulier, à l'un au moins de ses modules de type III et, notamment, aux modules FNIII 1, 4, 5 et/ou 14. Bien entendu, il peut en comprendre plusieurs. On peut également envisager l'utilisation de la fibronectine humaine ou d'un peptide en dérivant, par exemple par mutation ou fragmentation. A titre d'information, la fibronectine codée par un gène unique est une molécule intervenant dans les phénomènes d'adhésion et de contact cellulaire. Sa séquence et ses caractéristiques sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier (voir en particulier Bork et Doolittle, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8990- 8994 et Dickinson et al., 1994, 236, 1079-1092). Elle est composée de 14 modules dits de type III (numérotés de 1 à 14) dont la séquence primaire peut varier mais dont la conformation en feuillet β est conservée.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, un polypeptide tel que défini ci-dessus est plus particulièrement destiné à permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus de sérotype C à une cellule hôte et/ou son entrée dans cette dernière. Parmi les adenovirus envisageables, on peut citer plus particulièrement les sérotypes 2 et 5.
La présente invention concerne également une cellule hôte capable d'exprimer un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention et son utilisation pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus à sa surface et/ou l'entrée dudit adenovirus. Divers types de cellules hôtes peuvent être considérés. Il peut s'agir de cellules d'une origine quelconque, par exemple de microorganismes, levures, insectes, plantes, animales. On préférera notamment une cellule de mammifère et, en particulier, une cellule humaine de type primaire, tumorale ou issue d'une lignée cultivable /'/; vitro. Elle peut avoir une origine hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage...), hépatique, rénale, du système nerveux central, fibroblaste, épithéliale, pulmonaire ou musculaire (myocyte, myoblaste, cellule satellite, cardiomyocyte...). Une cellule particulièrement préférée est ou dérive de la lignée 293 établie à partir. de cellules de rein embryonnaire par intégration de la région adenovirale El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59- 72). On indique que l'expression d'un ou plusieurs polypeptides en usage dans le cadre de la présente invention à la surface d'une cellule hôte n'exprimant pas habituellement les MHC-I et/ou la fibronectine devrait permettre son infectivité par un adenovirus. Elle pourrait être utilisée comme nouvelle cellule productrice de vecteurs adénoviraux. On peut également envisager le cas d'une surexpression dans une cellule exprimant naturellement ledit polypeptide. Une lignée de surexpression dérivant de la lignée 293 devrait permettre d'améliorer les rendements de production d'un adenovirus d'intérêt. Bien entendu, le polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention peut être associé à la cellule par des moyens chimiques ou par l'intermédiaire d'un ligand reconnaissant une protéine de surface cellulaire. Mais, on peut également envisager une expression par les techniques de l'ADN recombinant. Un tel mode de réalisation est à la portée de l'homme de l'art. A titre indicatif, la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide en question peut être isolée (par les techniques standards de PCR ou clonage) ou synthétisée chimiquement avant d'être insérée dans un vecteur d'expression conventionnel sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, le vecteur étant introduit dans la cellule hôte par toute technique de l'art. La cellule hôte en usage dans le cadre de la présente invention peut également être modifiée de manière à complémenter un adenovirus défectif par transfection de fragment(s) approprié(s) de génome adénoviral.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand capable d'influencer l'attachement d'un adenovirus à une cellule hôte et/ou son entrée au sein de cette dernière médiés par un polypeptide tel que défini ci-dessus. Le ligand en usage dans l'invention peut être de nature quelconque. On peut citer par exemple les peptides, les hormones, les anticorps ou leurs dérivés et, notamment, les anticorps simple chaîne de type scFv (pour single chain fragment variable en anglais) et les récepteurs solubles dépourvus de leur région transmembranaire. En particulier, un tel ligand peut dériver d'un polypeptide en usage dans la présente invention. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, le ligand peut avoir une influence négative (antagoniste) ou positive (agoniste). De préférence, un ligand préféré présente une constante de dissociation à l'égard de l'adénovirus comprise entre 0,01 et 100 nM, avantageusement entre 0,1 et 50 nM et, de manière tout à fait préférée, entre 0,5 et 10 nM. Dans le cas d'un antagoniste, l'interaction du ligand avec la fibre permettra de diminuer ou inhiber les processus d'attachement et/ou d'entrée d'un adenovirus. Dans ce contexte, un ligand particulièrement préféré est basé sur un polypeptide tel que défini dans la SEQ ID NO: 1. A titre d'exemple, on peut citer un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 20. On préférera avoir recours au peptide désigné MH20 dans les exemples qui suivent.
Dans le cas d'une influence positive, le ligand en usage dans le cadre de la présente invention est utilisé pour permettre ou stimuler l'attachement et/ou l'entrée des adenovirus. Un ligand convenant aux fins de l'invention comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 7 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 20. Un exemple préféré consiste en le peptide désigné ci-après FN20.
La présente invention a également trait à un ligand comprenant une séquence en acides aminés ho ogue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 ou 7.
Mais, il peut également s'agir d'un ligand d'origine adenovirale. Selon ce mode de réalisation, un ligand préféré dérive de la fibre d'un adenovirus, en particulier, de la partie de la tête interagissant avec les polypeptides précités. Un motif peptidique choisi dans cette région devrait donc influencer l'infectivité des adenovirus à l'égard d'une cellule hôte exprimant le polypeptide. Avantageusement, on a recours à un ligand recouvrant les résidus 438 à 486 de la fibre d'un adenovirus. Plus particulièrement, un ligand d'un polypeptide tel que défini par la SEQ ID NO: 1 dérive de préférence d'un Ad5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 8, débutant à l'acide aminé leucine en position 1 et se terminant à l'acide aminé acide aspartique en position 18. Un ligand également envisageable peut dériver de la fibre d'un adenovirus de sérotype 2 et comprendre une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés de la séquence telle que montrée dans la SEQ LD NO: 9 débutant au résidu thréonine en position 1 et se terminant au résidu valine en position 16. Le ligand d'un polypeptide tel que défini par les SEQ ID NO: 2 à 5 est plus particulièrement caractérisé par une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 10 débutant au résidu leucine en position 1 et se terminant au résidu thréonine en position 14 (Ad5) ou dans la SEQ ID NO: 11 débutant au résidu asparagine en position 1 et se terminant au résidu asparagine en position 13 (Ad2).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber ou diminuer une infection par un adenovirus. Dans ce contexte, on préférera l'usage d'un ligand antagoniste dans un but thérapeutique ou prophylactique. L'utilisation d'un ligand selon l'invention, de préférence agoniste, convient à la préparation d'un médicament destiné à favoriser ou faciliter une infection par un adenovirus, et, en particulier, d'un adenovirus recombinant porteur d'un gène thérapeutique à visée de thérapie génique (curative) ou anti-virale (SIDA) ou anti-cancéreuse. Un tel médicament trouve son utilité par exemple en association avec les traitements de thérapie génique afin d'améliorer l'infection virale chez un patient traité par un adenovirus recombinant. On peut envisager une voie d'administration parentérale, orale ou encore par aérosol. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage et la formulation appropriés varient en fonction de différents paramètres, par exemple de l'individu, de la maladie à traiter, de l'effet désiré, de la voie d'administration ou encore de l'adénovirus en cause.
La présente invention concerne également une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant : (a) l'immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus déterminant son attachement au récepteur cellulaire,
(b) l'incubation pendant un temps déterminé avec l'échantillon,
(c) l'élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et
(d) l'analyse de l'échantillon élue à l'étape (c).
Le support inerte peut être sans limitation sous une forme quelconque (cône, tube, puits, billes ou analogues) et d'un matériau quelconque (naturel, de synthèse tels que les polymères, modifié chimiquement ou non...). La fixation du réactif sur le support inerte peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, on procédera de préférence par adsorption c'est à dire de manière non covalente bien que l'établissement de liaisons covalentes puisse également être considéré. De manière indirecte, on peut fixer préalablement un composé anti-réactif capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support inerte. Selon un mode de réalisation avantageux, l'échantillon est constitué par une bibliothèque dite aléatoire et, en particulier d'expression (fragments génomiques, cADN) ou peptidique ou, de manière préférée, de phages exprimant des motifs peptidiques (phagotopes). De telles bibliothèques sont décrites dans la littérature ou accessibles commercialement. Dans le but de sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un adenovirus, on met de préférence en oeuvre à titre de réactif d'origine virale, tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un adenovirus et, à titre d'éluant, un anticorps anti-fibre neutralisant (inhibiteur de l'attachement du virus à la surface de la cellule hôte). La fibre ou ses fragments peuvent être produits par voie recombinante et les anticorps par la technique d'hybridome ou par génie génétique (production d'anticorps simple chaîne scFv, Fab...). On indique que la plupart des anticorps anti-fibre sont neutralisants. L'analyse est réalisée par comparaison de la séquence de l'échantillon élue avec les banques de données. Une telle analyse est à la portée de l'homme de l'art. Enfin, la présente invention vise également une méthode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un échantillon approprié, comprenant : (a) l'immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ladite protéine virale, (b) l'incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon,
(c) l'élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et
(d) l'analyse de l'échantillon élue à l'étape (c).
Les modes de réalisation spécifiques cités précédemment peuvent également s'appliquer dans ce contexte.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand bifonctionnel pour le ciblage d'un adenovirus vers une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adenovirus, ledit ligand bifonctionnel comportant une première partie ligand capable d'interagir avec la fibre dudit adenovirus, une deuxième partie ligand capable d'interagir avec ladite protéine de surface cellulaire et, éventuellement, un espaceur entre lesdites première et deuxième parties ligand.
Au sens de la présente invention, un ligand bifonctionnel est capable d'interagir avec deux entités différentes l'une de préférence située à la surface d'un adenovirus et l'autre à la surface d'une cellule hôte, au niveau d'une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adenovirus. Par ailleurs, les deux parties ligands peuvent être éventuellement séparées par un espaceur comprenant de 1 à une quinzaine d'acides aminés, de préférences non chargés. Bien entendu, l'ordre des entités n'a pas d'importance, le domaine interagissant avec la protéine adenovirale pouvant être en N ou en C-terminal du ligand bifonctionnel, la position C-terminale étant préférée. L'utilisation d'un tel ligand bifonctionnel permet de cibler un adenovirus vers une cellule hôte d'intérêt, par exemple une cellule tumorale, une cellule infectée, un type cellulaire particulier ou une catégorie de cellules portant un marqueur de surface spécifique. Après liaison dudit ligand bifonctionnel à la protéine de surface cellulaire, l'entité reconnaissant la protéine adenovirale est exposée, ce qui devrait créer des «leurres» de récepteurs viraux du même type que les récepteurs primaires (domaine α2 des MHC-I) et créer ou augmenter le nombre de récepteurs primaires d'adénovirus à la surface de la cellule hôte. De préférence, la partie ligand interagissant avec la fibre adenovirale présente les caractéristiques du ligand défini précédemment, elle est notamment dérivée du domaine α2 du MHCI et comprend de préférence une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la SEQ. ID NO: 6. De manière encore plus préférée, elle est constituée par le peptide MH20 (SEQ ID NO: 6).
Pour ce qui est de la partie ligand interagissant avec la protéine de surface cellulaire, celle-ci est adaptée à la cellule hôte que l'on désire cibler. S'agissant d'une cellule infectée par le virus HIV (Human Immunodeficiency Virus), le ligand peut être un fragment d'anticorps contre la fusine, le récepteur CD4 ou contre une protéine virale exposée (glycoprotéine d'enveloppe) ou encore la partie de la protéine TAT du virus HIV s'étendant des résidus 37 à 72 ; (Fawell et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668). S'agissant d'une cellule tumorale, le choix se portera sur un ligand reconnaissant un antigène spécifique de tumeur (MUC-1 dans le cas du cancer du sein, antigènes du papilloma virus HPV ... etc) ou surexprimé (récepteur à l'IL-2 surexprimé dans certaines tumeurs lymphoïdes). Si l'on désire cibler les lymphocytes T, on peut employer un ligand du récepteur de cellule T. Par ailleurs, la transferrine est un bon candidat pour un ciblage hépatique. On peut également citer le peptide EGF (abréviation de Epidermal Growth Factor) permettant le ciblage vers les cellules exprimant le récepteur à l'EGF ou le peptide GRP (pour Gastrin Releasing Peptide) de séquence GNHWAVGHLM (Michael et al., 1995, Gène Ther. 2, 660-668) se liant au récepteur cellulaire GRP. D'une manière générale, les ligands qui peuvent être utilisés dans le contexte de l'invention sont largement décrits dans la littérature. Un ligand bifonctionnel en usage dans le cadre de la présente invention peut être obtenu par les techniques de l'ADN recombinant, par synthèse ou par couplage chimique des deux parties ligands en question. De préférence, l'adénovirus à cibler est recombinant et porte un gène cytotoxique ou capable d'induire l'apoptose cellulaire. De tels gènes sont parfaitement connus. On peut citer en particulier le gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-1 (Virus de l'herpès simplex de type 1).
A titre d'exemples préférés, on peut citer un ligand bifonctionnel comprenant le peptide MH20 et le GRP. Les domaines peptides MH20 et GRP peuvent être orientés de façon inversée : respectivement MH20-GRP lorsque le MH20 est en position N-terminale et GRP-MH20 lorsque le MH20 est en position C-terminale. Un autre mode de réalisation met en oeuvre un ligand ayant une entité MH20 et une entité anticorps de type ScFv (Single Chain Fv fragment). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit ligand bifonctionnel comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie de la séquence telle que montrée .
(i) dans la SEQ ID NO. 22 débutant au résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu methionine en position 35, ou
(ii) (ii) dans la SEQ ID NO: 23 débutant au résidu lysine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 35. La présente invention concerne également un ligand bifonctionnel tel que défini ci-avant et, en particulier, les ligands GRP-MH20 ou MH20-GRP. Le ligand GRP- MH20 est particulièrement préféré.
La présente invention a également pour objet une cellule portant à sa surface un tel ligand bifonctionnel. L'avantage d'une telle cellule est d'augmenter le nombre de récepteurs primaires de type MHCl-α2. Ladite cellule est avantageusement une cellule de mammifère d'une origine quelconque (voir ci-dessus). Il s'agit de préférence d'une cellule de complémentation d'un adenovirus défectif de la fonction
El et éventuellement d'une autre fonction (E2, E4, E2 et E4, etc., voir la demande WO94/28152). Un exemple préféré est la lignée 293. Elle peut être générée par les techniques de l'ADN recombinant (expression du ligand bifonctionnel au moyen d'un vecteur approprié comportant les éléments permettant l'expression à la surface cellulaire, par exemple séquence signal et/ou région transmembranaire), par liaison chimique covalente ou non ou par simple interaction entre la cellule et le ligand. La présente invention est illustrée par référence aux figures suivantes :
La Figure 1 présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilisant l'anticorps 1D6.3 (a) ou 7A2.7 (b) à titre de ligand. Les motifs peptidiques des phagotopes sont alignés par rapport à la séquence de la tête d'Ad5 (le résidu méthionine initiateur de la fibre représentant le +1. Les régions formant des structures feuillets β (Xia et al., 1994, supra) sont soulignées et indiquées par (D), (E) et (F). Les résidus identiques ou conservés dans les séquences sont indiqués en gras.
La Figure 2 présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilisant (a) l'anticorps 7A2.7 ou (c) 1D6.3 à titre d'éluant, (b) et (d) les séquences consensus déterminées à partir des phagotopes (a) et (c) respectivement ainsi que les séquences homologues trouvées par analyse de la banque de données SWISS PROT. Les résidus conservés à des positions analogues sont indiqués en gras.
La Figure 3 illustre l'expression du gène luciférase dans les cellules HeLa infectées avec le virus Ad5Luc3 à une MOI constante (0, 16 fτu/10 cellules). (O) l'Ad5Luc3 est ajouté aux cellules refroidies à 0°C en présence de molarités croissantes de peptide (a) FN20 (0 à 500 μM) ou (b) MH20 (0 à 50 μM). Les témoins correspondent à l'incubation des peptides après l'attachement de l'Ad5Luc3 (Δ) ou après l'endocytose (D). La Figure 4 illustre l'expression du gène luciferase dans les cellules Daudi-
HLA- (•) ou Daudi-HLA+ (O) infectées avec des concentrations croissantes d'Ad5Luc3 (0,3 à 150 ffu/10 cellules). L'Ad5Luc3 est mis en contact des cellules pré-refroidies à 0°C pendant 1 h afin de permettre l'attachement viral mais pas l'entrée. L'activité luciferase est évaluée après 18 h de culture à 37°C. Les valeurs RLU représentent la moyenne de trois expériences séparées.
La Figure 5 illustre le principe de la méthode du ligand bifonctionnel mimant les récepteurs primaires de l'adénovirus.
La Figure 6 représente l'activité enzymatique luciferase en fonction de la MOI d'Ad5Luc3 sur les cellules NIH (a), Swiss 3T3 (b) et HeLa (c).
EXEMPLES
Les cellules HeLa (ATCC CCL2) sont cultivées en monocouches selon les techniques de l'art. On utilise de préférence un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium ; Gibco) contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) inactivé à la chaleur, de la L-glutamine et des antibiotiques habituels. Les cellules Daudi HLA- (ATCC CCL213) et HLA+ (Quille, et al., 1988, J. Immunol. 141, 17-20) sont maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté avec 15 % de FCS.
L'Ad5 sauvage et l'Ad5Luc3 recombinant sont propagés dans les cellules HeLa par les techniques standards. A titre indicatif, Ad5Luc3 est un adenovirus compétent pour la réplication qui contient le gène luciferase placé sous le contrôle du promoteur précoce du virus SV40 (Virus simien 40) inséré dans la région E3 du génome adénoviral (Mittal et al., 1993, Virus Research 28, 67-90).
EXEMPLE 1 : Production d'anticorps monoclonaux (mAb) capable d'inhiber l'attachement de l'Ad5 aux cellules permissives.
Les mAbs murins 1D6.3 et 7A2.7 ont été générés par les techniques classiques en injectant la tête de la fibre d'Ad5 produite dans les bactéries par voie recombinante (Henry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246 ; Douglas et al., 1996, Nature Biotech 14, 1574-1578) à des souris Balb/C. La fusion et l'obtention de clones d'hybridomes sont des techniques conventionnelles à la portée de l'homme de l'art. Les clones sécrétant sont sélectionnés par leur reconnaissance de l'antigène qui a servi à l'immunisation en ELISA. On indique qu'ils présentent une activité neutralisante à l'égard des virions (Michael et al., en préparation).
Séro-réaclivité des anticorps onoclonaux 1D6.3 et 7A2.7.
La réactivité des anticorps est testée à l'égard du domaine de la tête de la fibre de 3 sérotypes différents (Ad2, Ad5 et Ad3) préparé par voie recombinante. Les séquences correspondantes sont isolées par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir d'ADN génomique viral puis introduites dans le virus AcNPV (Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus) sous le contrôle du promoteur polyhedrine (Luckow et Summer, 1989, Virology 170, 31-39). Les protéines recombinantes sont exprimées dans les cellules d'insecte Sf9 (Spodoptera frugiperda). La technologie générale est détaillée dans Karayan et al. (1994, Virology 202, 782-796) et Novelli et Boulanger (1991, Virology 185, 365-376). Plus précisément, les séquences Ad5 portant le dernier motif répété de la tige suivi de la tête de la fibre, sont clonées à l'aide des amorces représentées aux SEQ ID NO: 12 et 13. L'amorce sens correspond aux nucléotides 32164 à 32205 du génome Ad5 (Chroboczek et Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554), inclut 4 mismatch de manière à créer un site BamHI et à remplacer la thréonine en position 388 de la fibre native par un codon ATG initiateur. L'amorce antisens correspond aux nucléotides 32919 à 32883 du génome Ad5 et permet de créer un site Kpnl pour faciliter les étapes ultérieures de clonage. La protéine recombinante récoltée dans les surnageants de cellules Sf9 est désignée F5-AT386. La tête de l'Ad2 est produite à partir du vecteur baculovirus décrit dans Louis et al. (1994, J. Virol. 68, 4104-4106). Le produit d'expression désigné F2- AT388 débute en position 388 (par remplacement de l'Ala de la séquence native par une Met) et porte, outre le domaine de la tête, le dernier motif répété de la tige. Enfin, pour les séquences correspondantes de l'Ad3, on utilise une amorce sens (SEQ ID NO: 14) conçue pour introduire un site de clonage Ncol et remplacer les codons Asn et Ser en position 124 et 125 par des codons Met et Ala respectivement. L'amorce antisens (SEQ ID NO: 15) introduit un site Kpnl. Le produit d'expression est désigné F3-AT124. Les cupules d'une plaque ELIS A sont recouvertes par la protéine recombinante
F5-AT386, F2-AT388 ou F3-AT124 sur laquelle on fait réagir le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 puis un anticorps anti-souris marqué (par exemple à la phosphatase ou la péroxidase). Une réaction positive est observée à l'égard de la protéine recombinante F5-AT386 native. Aucune réaction n'est détectée dans les puits contenant la protéine F5-AT386 dénaturée au SDS ni ceux contenant les produits F2-AT388 et F3-AT124 natifs ou dénaturés. Ces données suggèrent que ces anticorps reconnaissent un épitope conformationnel spécifique du sérotype C.
Effet inhibiteur des anticorps monoclonaux ld6.3 et 7A2.7 sur l'attachement cellulaire de l'AdS.
On procède à un test de microliaison sur cellules HeLa en culture à l'aide de virions Ad5 marqués à la valine [ C] (activité spécifique de 2200 à 2500 cpm/ 10 virions) suivi d'une autoradiographie in situ (Silver et Anderson, 1988, Virology 165, 377-387). Pour ce faire, les cellules à l'état de semi confluence sont mises en présence d'une quantité constante de virions radioactifs (10' cpm pour 5x 10 cellules) à une multiplicité d'infection (MOI) de 1000 virions par cellule pendant 1 h à 0°C en présence de mAb 1D6.3 ou 7 A2.7 (dilutions au 1 : 10, 1 :8, 1 :4 et 1 :2 des surnageants d'hybridomes respectifs dont la concentration en mAb est estimée à 0, 1- 0,2 μg/ml, ce qui correspond à un excès en mAb par rapport aux virions présents dans l'innoculum de 100, 250, 500 et 1000 respectivement). Les cellules sont ensuite lavées en présence de PBS, fixées par 0, 1 % de paraformaldéhyde dans du PBS, séchées et recouvertes par l'émulsion K4 sous forme de gel (Ilford Nuclear Research). Après une exposition d'une semaine et développement (agent de développement D19B, Kodak), les échantillons sont colorés brièvement par 0,5 % de bleu de toluidine repris dans H O et examinés sous microscope. La densité des grains d'argent réduit autour du contour des cellules est représentatif du nombre de virions [ C] liés à la surface cellulaire.
En l'absence de mAb anti-tête ou à une concentration faible (dilution 1 : 10), un halo sombre de grains d'argent réduit est visible autour des cellules indiquant une adsorption des virions à leur surface. Une réduction du halo dépendante de la concentration en mAb est observée pour les dilutions 1 :8, 1 :4 et 1 :2. Ces résultats traduisent un blocage de la liaison de la tête adenovirale au récepteur cellulaire primaire dû aux mAb 1D6.3 et 7A2.7 dirigés contre cette partie de la fibre. Une comparaison de la surface des halos pour les mêmes dilutions montre que l'anticorps 1D6.3 est plus inhibiteur de l'attachement de l'AdS au récepteur cellulaire des HeLa que le mAb 7A2.7.
EXEMPLE 2 : Identification des épitopes des mAb 1D6.3 et 7A2.7.
Les épitopes de la fibre étant présumés être conformationnels (Fender et al., 1995, Virology 214, 1 10-117), la méthode classique d'identification des épitopes par balayage de peptides n'est pas appropriée. On procède selon une technique de biorpaillage dérivée de celles décrites par Smith et Scott (1993, Methods Enzymol. 277, 228-257) et Hong et Boulanger (1995, EMBO J 14, 4714-4727). Dans ce cas, le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 est adsorbé une nuit à 4°C sur une plaque de microtitration (Nunc Immunomodule MaxiSorp F8) à une concentration de 1 μg/puits dans un tampon carbonate de sodium 0, 1 M pH9,6. Les anticorps immobilisés sont mis en contact d'une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides (phages fUSES ; Scott et Smith, 1990, Science 249, 386-390). Dans une seconde étape les phages retenus sont élues soit par un tampon d'élution acide conventionnel soit, plus sélectivement, par compétition en présence d'un excès de protéine recombinante F5- AT386. Les motifs hexapeptidiques (phagotopes) portés par les phages élues sont déterminés par séquençage de la protéine pIII fUSE5 par la méthode de Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Les homologies de séquences avec les phagotopes sont recherchées dans la banque de données Swiss Prot et le programme FASTA 1.6 (Pearson et Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448) et les alignements de séquences réalisées en utilisant la version W(l;4) du programme Clustal (Higgins et Sharp, 1988, Gène 73, 237-244).
Comme le montre la Figure 1, le mAb 1D6.3 retient différents phagotopes dont les séquences se chevauchent, et sont homologues à la tête d'Ad5 s'étendant entre les résidus Val en position 438 et Asp en position 462. En dépit d'un certain degré de dégénération et de dispersion, on a pu déterminer un motif central de séquence LAPISGTVQSAHLIIRFD correspondant aux acides aminés en positions 445 à 462 (SEQ ID NO: 8). Ce motif est centré sur le résidu His en position 456, ce qui corrobore la présence d'histidine dans plusieurs phagotopes indépendants. De plus, trois phagotopes contiennent une histidine proche d'une serine (GISHTG et GASHTV) et une séquence homologue est trouvée dans la tête QSAHLi ). Du côté N-terminal, la séquence LAPIS est représentée dans plusieurs phagotopes sous la forme L-P, VAP-S et LIPFNS.
Les analyses de séquence des 15 phagotopes retenus par le mAb 7A2.7, ont mises en évidence la présence d'une proline à 4 reprises, de tryptophane et histidine 8 fois et l'association dans le même phagotope de deux résidus aromatiques est trouvée 5 fois. Il semble donc que l'épitope du mAb 7A2.7 contienne un résidu proline, tel que celui en position 475 de la fibre, à proximité d'un groupe de résidus aromatiques, tel que YWNF . En outre, deux phagotopes FWLAVR et
WALFRS sont homologues au motif YWNFR . Sur la base de ces données, l'épitope du mAb 7A2.7 a été cartographie entre les résidus 473 et 486 de la fibre Ad5 (SEQ ID NO: 10).
En résumé, les mAb 1D6.3 et 7A2.7 reconnaissent des segments adjacents de 15 à 20 aa dans la séquence linéaire de la tête d'Ad5, les résidus s'étendant des positions 445 à 462 et 473 à 486 respectivement. Selon le modèle tridimensionnel de la tête proposé par Xia et al. (1994, Curr. Biol. Structure 2, 1259-1270), les deux épitopes occupent des régions continues d'un point de vue spatial. L'épitope du mAb 1D6.3 recouvre une partie de la boucle CD et du feuillet β D, alors que l'épitope du mAb 7A2.7 est localisé au niveau du segment adjacent DE et des deux feuillets β E et F. L'épitope 1D6.3 se situe à l'intérieur d'un feuillet R alors que l'épitope 7A2.7 est orienté plus latéralement par rapport au feuillet R.
EXEMPLE 3 : Identification des récepteurs cellulaires de l'Ad5 par la technique de biorpaillage réverse.
Cette technique est dîte réverse par rapport à la précédente puisqu'on utilise la fibre comme ligand et le mAb comme éluant. On procède donc par immobilisation de la tête de la fibre de l'Ad5 sur laquelle on fait réagir la bibliothèque de phages exprimant des phagotopes hexapeptidiques. Les phages adsorbés peuvent être élues soit par un tampon acide conventionnel soit par le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 et la protéine pIII recombinante portant leurs phagotopes respectifs est séquencée. La recherche dans les banques de données est effectuée comme ci-dessus. Les motifs hexapeptidiques identifiés sont présentés à la Figure 2.
Les phagotopes produits par compétition avec le mAb 7A2.7 sont présentés à la Figure 2a. Leur analyse permet de dériver une séquence consensus (Figure 2b) qui présente une homologie avec les motifs 1, 3, 5 et 14 du module de type III de la fibronectine humaine (SEQ ID NO: 2 à 5) (Main et al., 1992, Cell 77, 671-678). Ces derniers se situent au niveau du feuillet β B et de la boucle adjacente BC du module FNIII (Dickinson et al., 1994, J. Mol. Biol. 236, 1079-1092).
Les phagotopes élues après action du mAb 1D6.3 sont décrits à la Figure 2c. L'ensemble des séquences se chevauchent et permettent de déterminer également une séquence consensus (Figure 2d). La recherche d'homologie avec les séquences répertoriées dans les banques de données révèle une homologie avec la région C- terminale du domaine α-2 de la chaîne lourde des molécules MHC de classe I (MHC-Iα-2) (position 156 à 180) (SEQ ID NO: 1 ).
EXEMPLE 4 : Interactions de la fibre adenovirale avec le module FNIII et le domaine MHC-Iα-2
L'interaction est étudiée /'// vitro à l'aide d'une protéine chimère issue de la fusion C-terminale de la protéine GST (Glutathion S-transférase) à un pentadecapeptide RHILWTPANTPAMGY reproduisant la séquence consensus homologue au feuillet β B et la boucle BC de FNIII (voir exemple précédent et Figure 2b). Pour ce faire, les oligonucléotides présentés aux identificateurs de séquences 16 et 17 sont hybrides et introduits dans le site Xhol du plasmide pGEX- KG (Guan et Dixon, 1991, Anal. Biochem. 192, 262-267). Il est à noter que les oligonucléotides une fois réhybridés génèrent un site Xhol à l'extrémité 5' si l'insert est clone dans l'orientation correcte. Ceci permet d'intégrer une seule copie ou de multiples copies en tandem au niveau du site Xhol reconstitué. La séquence du produit de fusion comprenant une copie du pentadecapeptide (désigné GST-FNxl) peut être schématisée de la manière suivante : GST- (site de clivage par la thrombine-PGIS-GGGGG-ILDSMGRLE-RHILWTPANTPAMGY(V)-ELKLNS- stop. Les constructions GST-FNx2 et GST-FNx3 comportent respectivement 2 et 3 répétitions du pentadecapeptide entre les résidus LE et EL de la cassette de clonage.
Les oligonucléotides sens et antisens (SEQ ID NO: 18 et 19) codant pour la séquence consensus obtenue par compétition avec le mAb 1D6.3 (Figure 2d) sont insérés selon la même stratégie que précédemment à l'extrémité C-terminale de la GST pour donner les constructions GST-MHCxl, GST-MHCx2 et GST-MHCx3 selon le nombre de motifs présents. Les protéines chimères GST-FN et GST-MHC sont produites dans E. coli, extraites et purifiées par affinité sur des billes d'agarose- glutathion (Sigma) selon les méthodes conventionnelles (Smith et Johnson, 1988, Gène 67, 31-40). En parallèle, les fibres complètes des sérotypes 2, 3 et 5 sont produites par voie recombinante selon la technologie baculovirus/cellules Sf9 déjà employée. La construction F2-FL582 portant le gène de la fibre Ad2 est décrite dans Novelli et Boulanger (1991, Virology 185, 365-376). Les séquences codant pour les fibres Ad5 et Ad3 sont isolées par PCR en utilisant l'ADN viral à titre de matrice et des amorces sens et antisens appropriées telles que celles reportées aux SEQ ID NO: 20 et 13 et 21 et 15. Le segment amplifié est introduit dans un vecteur baculovirus sous le contrôle du promoteur polyhédrine et le produit d'expression récupéré dans les surnageants de culture. On obtient F5-FL581 et F3-FL320 correspondant aux fibres Ad5 et Ad3 respectivement. La capacité du module FNIII et du domaine α-2 MHC-I recombinant à lier la fibre adenovirale est évaluée par immunotransfert après incubation /'// vitro des protéines de fusion GST-FN et GST-MHC et des fibres recombinantes F2-FL582, F5-FL581 et F3-FL320. Les complexes formés sont isolés sur billes d'agarose glutathion dans les conditions décrites par Johnson et al. (1995, J. Biol. Chem. 270, 24352-24360) puis analysés sur gel de polyacrylamide de 12,5 % (SDS-PAGE) en utilisant un système de tampon discontinu (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685). Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (0,8 mA/cnf ; système Cambridge Electrophoresis , UK) dans un tampon Tris-HCl 25 mM, glycine 192 mM, pH8,3 contenant 20 % de méthanol. Après traitement avec une solution de blocage (lait écrémé 5 %, sérum de veau 1 % dans du tampon TBS-T : 20 mM Tris- HCl pH7,8, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20), la membrane est mise en contact avec l'anticorps 4D2.5 (Hong et Engler, 1991, Virology 755, 758-767) puis un conjugué anti IgG marqué à la péroxydase de raifort. Là révélation par le substrat chimiluminescent péroxydase (SuperSignal, Pierce Chemicals) est réalisée selon Carrière et al. (1995, J. Virol. 69, 2366-2377) et les luminogrammes (Hyperfiim β- max, Amersham) sont analysés à 610 nm à l'aide d'un densitomètre automatique (REP-EDC, Helena Laboratories, Beaumont, TX). A titre indicatif, l'anticorps 4D2.5 reconnaît l'épitope FNPVYP du domaine de la queue conservé chez la plupart des adenovirus mammifères.
GST-FNxl, GST-FNx2 et GST-FNx3 se lient à F5-AT386 et F2-AT388 avec une grande efficacité alors que F3-AT124 est retenu à un moindre niveau. Un comportement similaire est observé avec les protéines chimères GST-MHCxl, GST- MHCx2 et GST-MHCx.3 qui retiennent F5-AT386 et F2-AT388 avec une efficacité supérieure à F3- AT 124.
La fibre Ad5 se lie aux protéines de fusion GST-FN et GST-MHC et ceci avec une affinité 2 à 3 fois supérieure par rapport à la fibre Ad2 et 10 à 15 fois supérieure par rapport à la fibre Ad3. De plus, l'efficacité de liaison n'est pas dépendante du nombre de motifs présents dans la protéine de fusion, l'intensité étant comparable et même parfois plus faible entre GST-FNxl et GST-FNx3 et GST-MHCxl et GST- MHCx3. Ceci peut être expliqué par le fait que les motifs en tandem peuvent adopter une conformation qui nuit à la liaison.
EXEMPLE 5 : Influence des peptides synthétiques dérivés de FNIII et MHC- Iα2 sur l'attachement des virus à la surface cellulaire.
Deux peptides synthétiques reproduisant les motifs FNIII et MHC-Iα2 ont été synthétisés chimiquement et purifiés selon les techniques de l'art. FN20 (SEQ ID
NO: 7) reproduit la séquence consensus des phagotopes élues par l'anticorps 7A2.7 et MH20 (SEQ ID NO: 6) correspond à celle des phagotopes élues par le mAb
1D6.3.
Les peptides FN20 et MH20 sont testés vis à vis de l'attachement de l'adénovirus rapporteur Ad5Luc3 à des cellules HeLa cultivées in vitro. Le test est réalisé en partie à 0°C, une température qui permet l'attachement des virus à la surface des cellules permissives mais, en revanche, bloque l'entrée des virus et le recyclage des récepteurs. L'Ad5Luc3 (MOI 0, 16 pfu/10 cellules) est préalablement incubé avec des quantités croissantes de peptides (0,01 à 500 nM) à température ambiante pendant 2 heures puis le mélange est ajouté à une culture cellulaire placée sur glace. Après 1 h à 0°C, les virus non adsorbes et les peptides sont éliminés par lavage et la culture est poursuivie pendant 18 h à 37°C après ajout d'un milieu préchauffé. Les lysats cellulaires sont préparés de manière conventionnelle et l'activité luciferase exprimée en RLU (pour Relative Light Units en anglais) est déterminée (substrat Promega, Madison, WI ; luminomètre Lumat LB-9501, Brethold Bioanalytical, Wildbad, Allemagne).
Les résultats de compétition avec le peptide FN20 sont présentés à la Figure 3a. Aucun effet significatif n'est obtenu jusqu'à une molarité de 10 μM puis une augmentation progressive de l'activité luciferase apparaît au delà de 25 μM. En particulier, l'activité croît d'un facteur 100 entre 25 et 100 μM. Le peptide FN20 a donc un effet stimulateur de l'attachement viral. Il ne confère aucune cytotoxicité apparente et n'a pas d'effet négatif sur l'expression du gène luciferase une fois le virus préattaché (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'étape d'attachement viral à 0°C) ou préendocytosé (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'étape d'attachement et de pénétration du virus). Dans le cas du peptide MH20 (Figure 3b), on observe une légère augmentation de l'expression du gène luciferase pour les molàrités comprises entre 0,05 et 2,5 μM (activité 5 à 6 fois plus élevée à 2,5 μM). Ce phénomène est suivi d'une diminution rapide des niveaux de luciferase lorsque les molàrités utilisées sont supérieures à 5 μM, avec une diminution d'un facteur 100 par rapport au contrôle à 25 μM et de presque quatre ordres de magnitude à 50 μM, montrant que lié au virus, il bloque la fixation au récepteur cellulaire. Comme précédemment, le peptide MH20 à des concentrations de 50 μM ne présente aucun effet cytotoxique et n'influence pas l'expression du gène reporter après le préattachement ou la préendocytosé de l'Ad5Luc3. L'inhibition presque totale de l'activité luciferase en présence de 50 μM de MH20 est le reflet d'une neutralisation complète du virus.
EXEMPLE 6 : Séro-spécificité de la neutralisation virale par les peptides synthétiques.
Les adenovirus sauvages Ad5, Ad2 Ad3 sont préincubés pendant 2 h à température ambiante avec le peptide inhibiteur MH20 à une molarité constante (25 μM), la MOI variant de 0,2 à 2 pfu/cellule. Le mélange est mis en présence des cellules HeLa pendant 1 h à 0°C et la culture poursuivie à 37°C après élimination des virus non adsorbes dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le niveau de synthèse de l'hexon, de la protéine 100k, du penton base est de la fibre est estimé par immunotitration (Wohlfart, 1988, J. Virol. 62, 2321-2328) sur les extraits cellulaires recueillis 48 h après l'infection.
L'infection des cellules HeLa par l'Ad5 ou l'Ad2 à une MOI de 0,2 à 2 pfu/cellule en présence de 25 μM de MH20 pendant la phase d'attachement du virus, est suivie d'une inhibition de la synthèse des protéines de la capside virale hexon, protéine 100 k, penton base et fibre 48 h après l'infection (facteur 15 à 30). Par contre, lorsque l'infection est réalisée dans les mêmes conditions par l'Ad3 sauvage, la synthèse des protéines structurales n'est réduite que d'un facteur 1,5 à 2, ce qui suggère que la neutralisation adenovirale par MH20 est sérotype dépendante.
EXEMPLE 7 : Affinité de la fibre Ad5 pour les peptides FN20 et MH20.
5, 10 et 25 μM de peptides synthétiques FN20 ou MH20 sont immobilisés sur la surface polystyrène d'une plaque de microtitration à 96 puits (Nunc, Maxisorb) pendant une nuit à 4°C. Après lavage puis blocage avec une solution d'albumine sérique bovine (BSA) 3 % dans du tampon PBS, on fait réagir des concentrations croissantes de fibres F5-FL581 reprises dans du tampon PBS et marquées radioactivement (marquage à la [ 35 S] méthi •onine et la [ 35 S] cystéine ; activité spécifique de 50000 à 65000 cpm/μg de protéine). La fibre adsorbée sur l'un ou l'autre des peptides est éluée avec une solution adéquate (urée 1M, NaOH 1 M et SDS 1 %) puis précipitée en présence d'acide trichloroacétique. La radioactivité contenue dans le précipité récupéré sur filtre GF/C est comptée à l'aide d'un spectromètre à scintillation liquide (Beckman LS-6500) et les constantes de dissociation (Kd) déterminées selon Scatchard (1949, Annls NY Acad. Sci. 57, 660- 672).
Le Kd de la fibre Ad5 marquée à l'égard du peptide MH20 est évalué à 3,0± 0,6 nM et celui trouvé pour le peptide FN20 est de 8,0± 1,9 nM (n=3 dans les deux cas).
EXEMPLE 8 : L'infectivité de l'Ad5 est dépendante de l'expression des MHC-I à la surface des cellules permissives.
La lignée Daudi de lymphoblastoides B, établie à partir d'un lymphome de
Burkitt, est naturellement déficiente en l'expression de la β-2 microglobuline et, de ce fait, ne possède pas à sa surface les molécules HLA de classe I (Daudi HLA-). La lignée cellulaire E8.1 dérivée des Daudi a été générée par transfection d'un gène codant pour la β-2 microglobuline afin de restaurer l'expression de molécules HLA de classe I à leur surface (Daudi-HLA+ ; Quillet et al., 1988, J. Immunol. 141, 17- 20).
Les expériences d'attachement de l'Ad5Luc3 à 0°C ont été menées sur les cellules Daudi HLA- et Daudi-HLA+ avec une MOI de trois ordres de magnitude plus forte que celle employée dans le cas des cellules HeLa (0,3 à 150 pfu/30 cellules). L'activité luciferase mesurée dans les lysats cellulaires 18 h post-infection est représentée à la Figure 4. Lorsque l'infection concerne les cellules Daudi-HLA+, l'activité luciferase augmente régulièrement d'une manière MOI dépendante jusqu'à atteindre un plateau au delà de 5 pfu/10 cellules. Pour ce qui est des cellules Daudi HLA-, le signal luminescent est très faible (3 à 4 ordres de magnitude) par rapport à celui observé avec les cellules pourvues de molécules HLA fonctionnelles à leur surface. Ces expériences montrent que l'expression du MHC-I à la surface cellulaire est nécessaire à l'infection Ad5.
EXEMPLE 9 : Ligand bifonctionnel mimant les récepteurs primaires de l'adénovirus.
Ce exemple décrit la construction d'un peptide bifonctionnel qui contient deux domaines, l'un reconnaissant la tête de la fibre adenovirale et l'autre une protéine cellulaire de surface. On utilise ci-après un peptide dans lequel le MH20 est fusionné au GRP (Gastrin Releasing Peptide). Deux constructions sont possibles, orientant les deux domaines peptidiques de façon inversée, N- versus C-terminal, donnant lieu au peptide MH20-GRP (SEQ ID No: 22) et au peptide à orientation inverse GRP- MH20 (SEQ ID No: 23). Comme illustré à la Figure 5, la liaison de ce peptide aux récepteurs GRP de la surface cellulaire devrait créer des «leurres» de récepteurs viraux du même type que les récepteurs primaires, c'est à dire le domaine α2 des molécules de classe I du MHC. Le résultat apparent est de créer ou d'augmenter le nombre de récepteurs viraux primaires de l'adénovirus à la surface de cellules possédant des récepteurs au GRP.
Les cellules humaines (HeLa) ou murines (Swiss-3T3 ou NIH-3T3, ATCC CRL-1658) sont rincées et incubées entre 0 et 4°C avec une solution isotonique (PBS) à 500 μM en peptide. Après 1 h, la solution est enlevée et remplacée par l'inoculum viral (Ad5Luc3) selon un protocole déjà décrit (voir ci-avant ou Hong et al., 1997, EMBO J. 16, 2294-2306). Le virus est incubé ) heure entre 0 et 4°C pour permettre son attachement, puis l'excès de virus non adsorbé est rincé avec du milieu de culture pré-refroidi à 4°C et les cellules sont replacées à 37°C en présence de milieu de culture pré-chauffé à 37°C. Le virus est endocytosé à 37°C et le cycle viral se déroule alors pendant 18 à 20 h à 37°C. Comme montré à la Figure 6, on constate que les courbes obtenues en absence de tout peptide (courbes témoin indiquées : - peptide) et celles en présence de peptide dans l'orientation MH20 côté N-terminal - lié au GRP en C-terminal (MH20 - GRP) présentent une pente identique. Par contre, dans le cas de l'orientation inverse, GRP du côté N-terminal, et
MH20 du côté C-terminal, l'augmentation du nombre de virus adsorbes est significative, comme le montre l'augmentation de l'activité luciferase : 8 à 10 fois pour le NIH-3T3, 5 à 6 fois pour les cellules HeLa et 2 à 3 fois pour les Swiss-3T3. La liaison de la portion GRP du peptide bifonctionnel, ligand des récepteurs GRP, a permis d'accroître le nombre apparent de récepteurs de la fibre d'AdS, de type domaine alpha 2 des molécules de classe I du MHC (MHC I-α2).
I STE DE SEQUENCES
( 1 ) INFORMATION GENERALE :
(l) DEPOSANT:
(A) NOM: Centre National de la Recherche Scientifique
(CNRS)
(B) RUE: 3 rue Michel Ange
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75794 Cedex 16
(G) TELEPHONE: (33) 01 44 96 40 00 (H) TELECOPIE: (33) 01 44 96 50 00
(il) TITRE DE L' INVENTION: Récepteurs cellulaires des adenovirus.
(111) NOMBRE DE SEQUENCES: 23
(IV) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: domaine alpha 2 des antigènes MHC-I
(positions 156 a 180)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyi 1 5 10 15
Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gin 20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ 1D NO: 2: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 1 de la fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asn Ser His Pro Ile Gin Trp Asn Ala Pro Gin Pro Ser His Ile Ser 1 5 10 15
Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn 20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 4 de la fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly 1 5 10 15
Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val Asn 20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(11) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 5 de la fibronectine humaine
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gin Ile Thr Gly 1 5 10 15
Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg 20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(i.i) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 14 de la fibronectine humaine
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ'lD NO: 5:
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly 1 5 10 15
Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Ser 20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
( l) TYPE DE MOLECULE: peptide (lll) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthèse MH20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Arg Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gin Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val 1 5 10 15
Asn Gly Ser Arg 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthèse FN20
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Arg His Ile Leu Trp Thr Pro Ala Asn Thr Pro Ala Met Gly Tyr Leu 1 5 10 15
Ala Arg Val Ser 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: sérotype 5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Pro Ile Ser Gly Thr Val Gin Ser Ala His Leu Ile Ile Arg 1 5 10 15 Phe Asp
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: sérotype 2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Val Ala Ser Val Ser Ile Phe Leu Arg Phe Asp Gin Asn Gly Val 1 5 10 15
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide
(lll) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: sérotype 5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe Arg Asn Gly Asp Leu Thr 1 5 10
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYFE DE MOLECULE: peptide (m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Asn Ser Ser Leu Lys Lys His Tyr Trp Asn Phe Arg Asn 1 5 10
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (nt32164
32205 Ad5)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CCTAAACTAG GATCCGGCCT TAGTTTTGAC AGCATGGGTG CC 42
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(in) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (B) SOUCHE: sérotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (nt
32919 32883 Ad5)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CTGTGAGTTT GATTAAGGTA CCGTGATCTG TATAAGC 3"7
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) ( n) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: GGTCTTACAT TTGACTCTTC CATGGCTATT GCACTG 36
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CAATAAAAAA TGTGGTACCT TATTTTTGTT GTCAG 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (séquence consensus FNIII)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: TCGAGAGGCA TATACTTTGG ACTCCTGCTA ATACACCGGC AATGGGGTAT G 51
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (séquence consensus FNIII)
(Xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ 'iD NO: 17: TCGACATACC CCATTGCCGG TGTATTAGCA GGAGTCCAAA GTATATGCCT C 51
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse codant pour la séquence consensus MHC-I
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: TCGAGAGGGC TATAGTTGGG TTTAGGGTGC AATGGCTTAG GCGGTATTTT GTGAATGGGT 60 CGAGG 65
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(m) HYPOTHETIQUE: NON
(ni) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse codant pour aa 157-176 du MHC-I
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: TCGACCTCGA CCCATTCACA AAATACCGCC TAAGCCATTG CACCCTAAAC CCAACTATAG 60 CCCTC 65
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (nt
31021-31050 Ad5) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CCATCCGCAC CCACTATGAT CACGTTGTTG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: sérotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthèse (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: CTTCATTTCT TTATCCCCCC ATGGCCA 27
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide (m) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: N-terminal
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: MH20/GRP
(XI) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Arg Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gin Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val 1 5 10 15
Asn Gly Ser Arg Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly 20 25 30
His Leu Met 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide (111) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: N-terminal
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: GRP/MH20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Arg 1 5 10 15
Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gin Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val Asn 20 25 30
Gly Ser Arg 35

Claims

Revendications
1. Utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée :
(a) dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25,
(b) dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26,
(c) dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25,
(d) dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu serine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou (e) dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 25 ; pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule hôte.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I) et, de préférence, de la chaîne lourde dudit MHC-I.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie du domaine α2 de ladite chaîne lourde.
5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène HLA A, B, C, D, E ou F.
6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins
6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée : dans la SEQ BD NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25, dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu serine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 25.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie de la fibronectine.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'au moins un module de type III de la fibronectine.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit adenovirus est de sérotype C.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit adenovirus est de sérotype 2 ou 5.
1 1. Cellule capable d'exprimer un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 10.
12. Cellule selon la revendication 1 1, caractérisée en ce que ladite cellule surexprime ledit polypeptide.
13. Utilisation d'une cellule selon la revendication 1 1 ou 12, pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adenovirus à ladite cellule et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule.
14. Utilisation d'un ligand pour influencer l'attachement d'un adenovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.
15. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, pour influencer de façon négative l'attachement d'un adenovirus à ladite cellule hôte et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 et 10.
16. Utilisation d'un ligand selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 20.
17. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, pour influencer de façon positive l'attachement d'un adenovirus à ladite cellule hôte et/ou l'entrée dudit adenovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10.
18. Utilisation d'un ligand selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 7 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 20.
19. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que ledit ligand a une constante de dissociation (kd) à l'égard dudit adenovirus de 0,01 à 100 nM, et notamment de 0,1 à 50 nM.
20. Ligand tel que défini dans la revendication 16, 18 ou 19.
21. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit ligand est d'origine adenovirale.
22. Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adenovirus et, notamment, du domaine de la tête.
23. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et ,9 et 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adenovirus de sérotype 5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 8 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu acide aspartique en position 18.
24. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 et 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adenovirus de sérotype 2 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 9 , commençant avec le résidu thréonine en position 1 et finissant avec le résidu valine en position 16. .
25. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adenovirus de sérotype 5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 10 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu thréonine en position 14.
26. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adenovirus de sérotype 2 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 1 1 commençant par le résidu asparagine en position 1 et se terminant au résidu asparagine en position 13.
27. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 26, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber ou diminuer une infection par un adenovirus.
28. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 26, pour la préparation d'un médicament destiné à favoriser ou faciliter une infection par un adenovirus et, en particulier, un adenovirus recombinant.
29. Méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes :
(a) immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus déterminant l'attachement dudit virus audit récepteur cellulaire,
(b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon,
(c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et (d) analyse de l'échantillon élue à l'étape (c).
30. Méthode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes :
(a) immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ladite protéine virale,
(b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon,
(c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et
(d) analyse de l'échantillon élue à l'étape (c).
31. Méthode selon la revendication 29 ou 30, caractérisée en ce que ledit échantillon est une bibliothèque peptidique ou une bibliothèque de phages exprimant des motifs peptidiques.
32. Méthode selon l'une des revendications 29 à 31, caractérisée en ce que ledit virus est un adenovirus, notamment de sérotype C, le réactif d'origine virale comprend à tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un adenovirus et l'anticorps est inhibiteur de l'attachement du virus à la surface de la cellule hôte.
33. Utilisation d'un ligand bifonctionnel pour le ciblage d'un adenovirus vers une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adenovirus, ledit ligand bifonctionnel comportant une première partie ligand capable d'interagir avec la fibre dudit adenovirus, une deuxième partie ligand capable d'interagir avec ladite protéine de surface cellulaire et, éventuellement, un espaceur entre lesdites première et deuxième parties ligands ; ladite première partie ligand ayant les caractéristiques du ligand tel que défini aux revendications 14 à 20.
34. Utilisation selon la revendication 33, selon laquelle ladite première partie ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la SEQ ID NO: 6 et plus particulièrement a une séquence en acides aminés identique à la SEQ ID NO:
6 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 20.
35. Utilisation selon la revendication 33 ou 34, selon laquelle ledit ligand bifonctionnel comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie de la séquence telle que montrée :
(i) dans la SEQ ID NO: 22 débutant au résidu arganine en position 1 et finissant avec le résidu methionine en position 35, ou
(ii) dans la SEQ ID NO: 23 débutant au résidu lysine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 35.
36. Ligand bifonctionnel tel que défini dans l'une des revendications 33 à 35.
37. Cellule portant à sa surface un ligand bifonctionnel selon la revendication 36.
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