WO1998013676A1

WO1998013676A1 - Method and instrument for polarization measurement

Info

Publication number: WO1998013676A1
Application number: PCT/JP1997/003391
Authority: WO
Inventors: Shuji Toyonaga; Masahisa Shiroshita; Takayuki Suga; Yoshitaro Nakano
Original assignee: Laboratory of Molecular Biophotonics
Current assignee: Laboratory of Molecular Biophotonics
Priority date: 1996-09-24
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 1998-04-02
Anticipated expiration: 1999-03-24
Also published as: US6025917A; JP2975991B2

Description

明細書偏光性測定方法及び装置技術分野

この発明は、試料に光が照射されたことにより発生する蛍光やラマン散乱光の偏光性を測定する偏光性測定装置および方法に関するものである。背景技術

試料に光を照射すると、その光と同一波長の光が反射光や散乱光として生じるが、その他にも、その照射光の波長とは異なる波長の光（例えば、蛍光、ラマン散乱光）も発生する場合がある。この蛍光やラマン散乱光の強度を測定することにより、その試料に関する有益な情報が得られるが、これらの偏光性を測定することによつても、試料に関する有益な情報が得られる。

例えば、蛍光プローブを含む試料に励起光を照射し、その試料から発生する蛍光の偏光解消を測定することにより、夕一ゲッ卜に結合した蛍光プローブが存在するか否かを知ることができる。すなわち、蛍光プローブを含む試料に直線偏光のパルス励起光が照射されると、その蛍光プローブから蛍光が発生する。その蛍光の偏光状態は、励起光照射当初は略直線偏光であるが、蛍光プローブがブラウン運動により不規則な回転を行うと、励起された蛍光プローブの分子軸が乱れ、そのために、時間の絰過とともに蛍光の偏光性は解消され、遂には非偏光状態となる。この偏光解消の速度は、蛍光プローブがターゲットに結合している場合と、フリーな場合とでは異なるので、その偏光解消の速度の差異を利用して、夕一ゲッ卜に結合した蛍光プローブの存否を知ることができる。

したがって、顕微鏡下で、この蛍光の偏光解消の度合いの 2次元像を測定することができれば、夕ーゲッ卜に結合した蛍光プローブが存在する位置を特定することができ、また、試料中のターゲットの挙動等を解析することができるので、例えば、細胞における諸機能の解明に貢献し得るものとして期待されている。同様に、顕微鏡下でラマン散乱光の偏光性の 2次元像を測定することによつても、試料に関する有益な情報が得られるものと期待されている。

ところで、蛍光の偏光状態の 2次元像を観察する技術が、 D.Axelrod, "Carboc yanine Dye Orientation in Red Cel l Membrane studied by Microscopic Fluor escence Polarization" , Biophys. J. , Vol .26, pp.557-574 ( 1979) および K. Su zuki , et al , "Spatiotemporal Relationships Among Early Events of Ferti li zation in Sea Urchin Eggs Revealed by Multiview Microscopy" , Biophys.J . , Vol .68, pp.739-748 ( 1995) に記載されている。

D.Axelrod の論文に記載されている技術は、顕微鏡下で定常光（直線偏光の励起光）照射により発生した蛍光の偏光状態を測定することにより、生体膜に導入された蛍光色素の配向および運動性を調べるものである。ここで用いられている光検出器は光電子増倍管であり、蛍光像面上の絞りを走査することにより 2次元的な蛍光偏光像を得ている。このような蛍光の偏光を測定するに際して問題となるのが、異なる偏光方位に対して偏光素子以外の光学系および光検出器が異なつた応答を示すことにより生じる測定誤差である。この論文に記載の技術では、全くの非偏光の光を受光光学系（試料から光検出器までの光学系）および光検出器に通すことにより、その測定誤差を補正（偏光応答補正）している。

K. Suzukiの論文に記載されている技術は、試料から発生した^光を偏光ビームスプリッ夕により互いに直交する直線偏光成分それぞれに分岐し、その 2分岐された蛍光の像それぞれを単一のカメラにより撮像することにより、試料の定常的な分子配向を解析するものである。この論文に記載の技術では、均質な試料を非偏光の励起光で励起し、その試料から発生する蛍光が全く無偏光であることを利用して偏光応答補正を行っている。

しかしながら、 D .Axelrod の論文や K. Suzuki の論文に記載されている技術では、非偏光の光を用いて偏光応答補正を行っているが、この非偏光の光は本来観察すべき蛍光とは異なるため補正精度は低く、したがって、偏光性の測定精度も低い。また、理想的な非偏光の光を作成するのは容易ではない。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、第 1の光束（励起光、照射光）が照射された試料から発生する第 2の光束（蛍光、ラマン散乱光）の偏光性を精度良く測定することができる偏光性測定方法および装置を提供することを目的とする。発明の開示

本発明に係る偏光性測定方法は、試料に照射する第 1の光束および試料から発生する第 2の光束のうち何れか一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、第 1の光束を光束分岐手段を経て試料に照射し、該照射により試料から発生し光束分岐手段を経た第 2の光束の偏光性を測定する偏光性測定方法であって、 ( 1 ) 第 1の光束を光束分岐手段に対して p偏光として試料に照射したときに発生する第 2の光束の p偏光成分の強度 I _{p p}および s偏光成分の強度 I _{P S}を測定する第 1のステップと、（2) 第 1の光束を光束分岐手段に対して s偏光として試料に照射したときに発生する第 2の光束の p偏光成分の強度 I _{S P}および s偏光成分の強度 I _{s s}を測定する第 2のステップと、（3) 偏光応答補正因子 Gを

^一 C ( Ι ρρ ·丄 s p) / 、ェ ps， I s s 」

なる式により求める第 3のステップと、（4) 偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正を行って第 2の光束の偏光性を求める第 4のステップと、を備える。この偏光性測定方法によれば、第 1のステップで、第 1の光束は光束分岐手段に対して p偏光として試料に照射され、これに伴い発生した第 2の光束の p偏光成分の強度 I _{P P}および s偏光成分の強度 I _{P S}が測定され、また、第 2のステップで、第 1の光束は光束分岐手段に対して s偏光として試料に照射され、これに伴い発生した第 2の光束の p偏光成分の強度 I _{s p}および s偏光成分の強度 I _{s s}が測定される。そして、第 3のステップで、偏光応答補正因子 Gが上記の式で求められ、第 4のステップで、この偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正がなされ、第 2の光束の偏光性が求められる。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第 2のステップで、第 1のステップの測定時と同じ配置の試料に対して第 1の光束を照射する。この場合には、試料中に第 2の光束を発生する物質がランダムに配向している系において第 2の光束の偏光性が測定される。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第 1のステップで、所定方向を屮心軸とする所定回転角度位置にある試料に対して第 1の光束を照射し、第 2のステツプで、中心軸について所定回転角度位置とは 90度異なる回転角度位置にある試料に対して第 1の光束を照射する。この場合には、試料中に第 2の光束を発生する物質が一定方向に配向している系において第 2の光束の偏光性が測定される。また、本発明に係る偏光性測定方法は、第 4のステップで第 2の光束の偏光性を

( Ipp-G- I_ps) / (Ipp+G- I_PS)

または、

P,(s)= (G- Iss- Isp) / (G- I _SS+ I SP)

なる式により求めてもよいし、

P_z(p)= (I_Pp-G- I_ps) / (Ipp+2-G- I_PS)

または、

P₂(s)= (G' I_ss- I _Sp) / (G- I ss+2-Isp)

なる式により求めてもよいし、

または、

P₃(s) = G - （ /し）

なる式により求めてもよいし、 P₄(P)= (Ipp Ips) 一 G

または、

P₄(s) = G- (I_ss/I _sp) — 1

なる式により求めてもよい。何れも、第 2の光束の偏光性を表すのに好適なパラメ一夕である。特に、 P₃および P₄は、少ない演算量で求めることができる。また、本発明に係る偏光性測定方法は、第 1の光束が、試料により多光子吸収され得る波長の光束であり、第 2の光束が、その多光子吸収に伴い発生する光束である。この場合には、第 2の光束の偏光性は、高感度かつ S/N比良く測定される。

本発明に係る偏光性測定装置は、試料に照射する第 1の光束および試料から発生する第 2の光束のうち何れか一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、第 1の光束を光束分岐手段を経て試料に照射し、該照射により試料から発生し光束分岐手段を経た第 2の光束の偏光性を測定する偏光性測定装置であって、 (1) 試料に照射する直線偏光の第 1の光束を出力する光源部と、（2) 光源部から出力された第 1の光束の偏光方位を回転させる偏光方位回転手段と、（3) 第 1の光束が試料に照射されて発生した光束のうち光束分岐手段を絰た第 2の光束の p 偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を検出する検出手段と、（4) 偏光方位回転手段により光束分岐手段に対して P偏光とされた第 1の光束が試料に照射されたときに検出手段により検出された第 2の光束の p偏光成分の強度 I _μρおよび s偏光成分の強度 I_PS、並びに、偏光方位回転手段により光束分岐手段に対して s偏光とされた第 1の光束が試料に照射されたときに検出手段により検出された第 2の光束の p偏光成分の強度 I _spおよび s偏光成分の強度 I _ssに基づいて、

G= [ (Ιρρ· I_SP) / (I_PS- I _SS) ] ^1/2

なる式により偏光応答補正因子 Gを求める補正因子演算手段と、（5) 偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正を行って第 2の光束の偏光性を求める偏光性演算手段と、を備える。この偏光性測定装置によれば、試料に照射される直線偏光の第 1の光束は、光源部より出力され、偏光方位回転手段により偏光方位が回転され、光束分岐手段を経て試料に照射される。第 1の光束が試料に照射されて発生した光束のうち光束分岐手段を経た第 2の光束は、検出手段により、 p偏光成分および s偏光成分それそれの強度が検出される。そして、偏光方位回転段により光束分岐手段に対して Ρ偏光とされた第 1の光隶が試料に照射されたときに検出手段により検出された第 2の光束の ρ偏光成分の強度 I _{Ρ Ρ}および s偏光成分の強度 I _{P S}、並びに、偏光方位回転手段により光束分岐手段に対して s偏光とされた第 1の光束が試料に照射されたときに検出ず段により検出された第 2の光束の p偏光成分の強度 I _{S P}および s偏光成分の強度 I _{s s}に基づいて、補正因子演算手段により、上記の式により偏光応答補正因子 Gが求められ、偏光性演算手段により、偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正がなされ、第 2の光束の偏光性が求められる。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、補正 W子演算手段が、一定配置にある試料について検出手段により検出された強度 I _P p， I _{P S} , I _{S P}および I _{s s}それそれに基づいて偏光応答補正因子 Gを求める。この場合には、試料中に第 2の光束を発生する物質がランダムに配向している系において第 2の光束の偏光性が測定される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、所定方向を中心軸として試料を回転させる試料回転手段を更に備え、補正因子演算手段は、中心軸について所定回転角度位置にある試料について検出手段により検出された強度 I _{P P}および I _{P S}、並びに、試料回転手段により中心軸について所定回転角度位置とは 9 0度異なる回転角度位置に設定された試料について検出手段により検出された強度 I _{S P}および I _{s s}に基づいて、偏光応答補正因子 Gを求める。この場合には、試料中に第 2の光束を発生する物質が一定方向に配向している系において第 2の光束の偏光性が測疋される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、偏光性演算手段が第 2の光束の偏光性 Pを

P.(p)= ( I pp - G - I _{p s} ) / ( I p_P + G - I _{P S} )

または、

P l(s) = · I s _s— I _S p) / I s s + I s p)

なる式により求めてもよいし、

P₂(p)= (I_PP— G'I_PS) / (I_PP+2-G-I_PS)

または、

P₂(s)= ( G - I _{s s} - I _{S P} ) / ( G - I s s+2- I _{s p})

なる式により求めてもよいし、

P₃(p)= 1 -G- (I_PS/I_PP)

または、

P₃(s) = G - (I_SP/I_SS)

なる式により求めてもよいし、

または、

P₄(s) = G- ( I _SS I _SP) - 1

なる式により求めてもよい。何れも、第 2の光束の偏光性を表すのに好適なパラメ一夕である。特に、 P₃および P₄は、少ない演算量で求めることができる。また、本発明に係る偏光性測定装置は、光源部が、試料により多光子吸収され得る波長の光束を第 1の光束として出力するとともに、検出手段が、その多光子吸収に伴い発生する光束を第 2の光束として検出する。この場合には、第 2の光束の偏光性は、高感度かつ S/N比良く測定される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、（1) 試料に照射する第 1の光束を出力する光源部と、（2) 第 1の光束を試料に照射し、該照射により試料から発生した第 2の光束を入力し、第 1の光束および第 2の光束のうち何れか一方を反射し他方を透過する第 1の光束分岐手段と、（3)第 1の光束分岐手段の分光特性と等しい分光特性を有し、第 1の光束分岐手段における第 2の光束に対する入射面と 9 0度異なる入射面を有し、第 1の光束分岐手段から出力された第 2の光束を入力する第 2の光束分岐手段と、（4 ) 第 2の光束分岐手段を経た第 2の光束の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を検出する検出手段と、（5 ) 検出手段により検出された第 2の光束の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度に基づいて第 2の光束の偏光性を測定する偏光性演算手段と、を備える。

この偏光性測定装置によれば、試料に照射される第 1の光束は、光源部より出力され、第 1の光束分岐手段を経て試料に照射される。第 1の光 ¾が試料に照射されて発生した第 2の光束は、第 1および第 2の光束分岐手段を順次経て、その P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度が検出手段により検出され、そして、これらの強度に基づいて偏光性が測定される。ここで、第 1および第 2の光束分岐手段は、互いに等しい分光特性を有し、第 2の光束に対して互いに 9 0度異なる入射面を有するので、第 1および第 2の光束分岐手段それぞれの分光特性が相殺され、これらに起因する偏光性測定誤差がなくなる。図面の簡単な説明

図 1は、 0次元（ポイント）の偏光性測定における G因子の求め方の説明図である。

図 2は、本発明に係る偏光性測定方法および装置における G因子の求め方の説明図である。

図 3は、本発明に係る偏光性測定方法および装置において試料中の蛍光プロ一ブの分子軸が配向して分布している場合の G因子の求め方の説明図である。

図 4は、 θ ,の回転相関時間を持つ蛍光分子からの励起光に平行および垂直な蛍光偏光成分強度の減衰曲線を示すグラフである。

図 5は、 6> ₂の回転相関時間を持つ蛍光分子からの励起光に平行および垂直な蛍光偏光成分強度の減衰曲線を示すグラフである。図 6は、偏光性 P!の減衰曲線を示すグラフである。

図 7は、偏光性 P₂の減衰曲線を示すグラフである。

図 8は、偏光性 Paの減衰曲線を示すグラフである。

図 9は、偏光性 P₄の減衰曲線を示すグラフである。

図 10は、本発明に係る偏光性測定装置の構成図である。

図 1 1は、試料から発生した蛍光の強度を偏光素子を通さないでそのまま測定したときの減衰曲線（太線）と、顕微鏡下での装置の応答関数（細線）とを示すグラフである。

図 12は、 p偏光のパルス励起光で励起したときに発生した蛍光の p偏光成分 (太線）および s偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。図 13は、 G因子による偏光応答補正を行って得られた異方性比 P₂の減衰曲線（太線）と、偏光応答補正を行わないで得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（細線）とを示すグラフである。

図 14は、本発明に係る偏光性測定装置において偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（太線）と、従来構成の偏光性測定装置において偏光応答補正を行って得られた異方性比 P₂の減衰曲線（細線）とを示すグラフである。

図 15は、 p偏光のパルス励起光で HDAF溶液を励起したときに発生した蛍光の P偏光成分（太線）および s偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。

図 16は、 p偏光のパルス励起光で HDAF染色 NG細胞を励起したときに発生した蛍光の p偏光成分（太線）および s偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。

図 17は、 HDAF溶液（細線）および HDAF染色 NG細胞（太線）を励起したときに発生した蛍光について G因子による偏光応答補 IEを行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線を示すグラフである。図 1 8は、フリーな蛍光プローブ（H D A F溶液）とターゲットに結合した蛍光プローブ（H D A F染色 N G細胞）が共存する試料の模式図である。

図 1 9は、フリー領域とバウンド領域の異方性比 P ₂の値とそのコントラストを示す図表である。

図 2◦ Aおよび図 2 0 Bそれぞれは、多光子励起の場合にも好適に用いられる偏光性測定装置の蛍光検出光学系の構成図であり、蛍光検出光学系の光軸に対して垂直であって且つ互いに垂直な 2方向それぞれから見た図である。

図 2 1は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それそれについて励起確率を示すグラフである。

図 2 2は、励起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸の方位との関係を説明する図である。

図 2 3は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の蛍光の異方性比 P 2の値を θ / τに対してプロットしたグラフである。

図 2 4は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の蛍光の異方性比 Ρ ₂の^ /てに対する傾斜をプロットしたグラフである。

図 2 5は、 1光子励起の場合および 2光 f励起の場合それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 P ₂および標準偏差びの測定値をまとめた図表である。

図 2 6は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 P ₂の測定値をプロットしたグラフである。

図 2 7は、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、グリセロール割合の 1 0 %増に対して、蛍光の異方性比 P ₂の増分 Δ Ρ ₂をまとめた図表である。図 28は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合の 10%増に対して、蛍光の異方性比 P₂の増分 ΔΡ 2の値をプロヅ卜したグラフである。

図 29は、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 P₂を標準偏差びで割った値（P₂/cr)、および、蛍光の異方性比 P₂の増分 ΔΡ₂を標準偏差びで割った値（ΔΡ₂/σ) をまとめた図表である。

図 30は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 Ρ₂を標準偏差びで割つた値（Ρ₂/σ) をプロットしたグラフである。

図 31は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 Ρ₂の増分 ΔΡ₂を標準偏差びで割った値（ΔΡ₂/σ) をプロットしたグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、以下では、蛍光の偏光性の測定について説明するが、ラマン散乱光の偏光性の測定についても同様である。また、「偏光性」なる語は、以下に述べる Ρ,， Ρ , Ρ₃および Ρ₄を総称したものを表す。

先ず、本発明に係る偏光性測定方法および装置の説明に先立って、偏光応答補正一般について説明する。偏光性測定に際して、測定誤差の大きな要因の 1つとなるのが、受光光学系（試料から光検出器までの光学系）および光検出器の偏光特性である。偏光素子以外の受光光学素子および光検出器は、理想的には、異なる偏光に対しても等しく応答すべきであるが、実際には、偏光方位によって異なる応答をする。したがって、真の蛍光の偏光性を求めるには、偏光応答を補正する必要がある。

この偏光応答の補正量は、通常、 G因子（偏光応答補正因子）と呼ばれ、 0次元（ポイント）の偏光性測定においては、以下めように定義されている。図 1は、 0次元（ポイント）の偏光性測定における G因子の求め方の説明図である。 p方位に偏光した直線偏光の励起光を試料に入射し、蛍光を発生させる。この入射方向に対して直交する方向から、偏光子を用いて p方位（励起光の p方位と平行な方位）および s方位（励起光の p方位に垂直な方位）それぞれの直線偏光成分の蛍光を測定し、それぞれの強度を I_PPおよび I_PSとする。そして、蛍光の偏光性を特徴付けるパラメ一夕として、偏光度 ( -般には、 pで表現される）が、ェ P P― I P

P »(P) = ―—— '··"）

I P P + I P s

で定義され、また、異方性比 P ₂ (—般には、 rで現される）が、

I P P一 I P s 、

P₂(p) 二 … ）

1 p p ~1~ *-« I p s

で定義されている。

しかし、実際に測定される蛍光強度は、受光光学系および光検出器を経て得られるため、それらの異方性を反映したものとなる。すなわち、受光光学系および光検出器の P偏光に対する応答を T_P とし、 s偏光に対する応答を T_s とすると、実際に測定される蛍光強度 I_Pp，および I_PS，それぞれは、真の蛍光強度 I_PPおよび I _PSそれぞれとの間に、

丄 pp 一 1 " 1 p p

) なる関係がある。したがって、偏光度および異方性比 P₂それぞれと実測蛍光強度 I_PP，， Ips' との間の関係は、（3)式を（1)式および（2)式それぞれに代入して、

I p ― ^J" * p

P P) = … ）

I P P + !，Ips

なる関係式で表される。ここで、（4)式および（5)式それぞれに現れる Gは、 G 因子と呼ばれる偏光応答補正因子であり、 p偏光に対する応答 T_P と s偏光に対する応答 T_s との比

T p

G = —— 6) T_s

で表される。

この G因子は、以下のようにして求める。 s偏光の励起光を試料に照射して、究生した蛍光の P偏光および s偏光それぞれの直線偏光成分の蛍光を測定し、それそれの強度を I_Sf,' および I _{s s}' とする。これらは真の蛍光強度 I _SPおよび I _ssそれぞれとの間に、（3)式と同様に、

s —— * I s p \ I s s —— I s ' I s s* " " ( なる関係がある。そして、 s偏光の励起光に対して発生する蛍光の p偏光成分の強度 I _SPと s偏光成分の強度 I _ssとは相等しいと考えられるので、（7)式から、

τ -¹ P T s p '

T_s I _ss

が得られ、したがって、（6)式で表される G因子は、実測された蛍光強度 I_SP' および I _ss，を用いて、

T s p '

G = —— -(9) で求められる。すなわち、この G因子による偏光応答補正を行うことにより、偏光度 P ,および異方性比 P ₂を高精度に求めることができる。

以上に述べた偏光応答補正は、 0次元（ポイント）の偏光性測定装置についてのものであるが、本発明に係る偏光性測定方法および装置のような顕微鏡下では、試料に対して励起光を照射する方向と蛍光を観察する方向とが同であるので、上述した方法では G因子を求めることはできない。そこで、この場合には、偏光応答補正を以下のようにして行う。図 2は、本発明に係る偏光性測定方法および装置における G因子の求め方の説明図である。なお、以下では、 G因子の求め方を、試料中の蛍光ブローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合と、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合とに分けて説明する。

先ず、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合における G因子の求め方について説明する。

光束分岐手段であるダイクロイツクミラーに対して p偏光の励起光の試料照射により発生した蛍光の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度（真値）を I I _PSとし、光検出器により検出される実測値を I _{Ρ Ρ}' ， I ps' とする。また、ダイクロイックミラーに対して s偏光の励起光の試料照射により発生した蛍光の P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度（真値）を I_SP, I _ssとし、光検出器により検出される実測値を I _{S P}， , I _ss' とする。このとき、これらの量と、受光光学系および光検出器の P偏光に対する応答 T_P と、 s偏光に対する応答 Τ _s との問には、

I P ―丄 ρ · _ ρρ ヽ l p s — 1 s " I p s * " " \ 10 )

I s 一丄ェ s p 、 l s s 一 1 s * I s s "·、11) なる関係がある。

また、 ρ偏光の励起光の照射について得られる異方性比 Ρ₂(Ρ)は、

I 一 I p s I ρ ρ ― ， / i s ) 丄 p s

P₂(P)= = -(12)

~ l p s I ρ + I s / l ps

なる式で表され、 s偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P₂(s) は、

I s ― 1 s p I s s ― ( 1 s/ 1 p ) I s p

P₂(s)= = 〜（13)

l s s + s p I s s H " ^ s/ ^l p 丄 s p なる式で表される。また、因子は、

τ

なる式で表されるから、（式および（式それぞれは、

一，

P P)= _Γ (15)

丄

r_T - τ ，一了 ,

P₂(s)= ；

G · I + Z I

で表される。

試料中の蛍光プローブの分子軸が全くランダムに分布している場合には、 p偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P₂(P)と、 s偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P₂(s)とは相等しく、

P₂(P) = P₂(s) -(17) となる。この（式に（15)式および（式を代入することにより、因子は、

二，，）

で与えられることになる。

すなわち、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合における G因子は、 p偏光および s偏光それぞれの励起光の試料照射により発生する蛍光の p偏光強度および s偏光強度を測定し、これらの強度に基づいて（式により求められる。そして、このようにして得られた因子による偏光応答補正を行うことにより、蛍光の偏光度 P ならびに異方性比 P ₂を高精度に求めることができる。

次に、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合における G 因子の求め方について説明する。なお、実際の測定対象はこのような系に近い場合が多い。

この場合において、前述の試料中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合における G因子の求め方を適用すると、偏光素子を除く受光光学素子や光検出器が偏光について異方性を有していない場合であつても、あたかも異方性を有しているかのように蛍光が測定されることになる。したがって、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合には、（1 7)式の仮定は成り立たず、 p偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P ₂ (P)と、 s偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P₂(s)とは般には異なり、

P₂(p)≠P₂(s) -(19) である。

すなわち、 p偏光の励起光の照射により試料から発生する蛍光のうちの P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を I _PPおよび I _PSとし、 s偏光の励起光の照射により試料から発生する蛍光のうちの P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を I _SPおよび I _ssとすると、試料中の蛍光プローブの分子軸が全くランダムに分布している場合には、

丄 s 丄 s p

—— = —— … 。）

I

であるが、蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合には、

-- p s -L a

—— ≠ —— (21)

I PP I s s

である。

そこで、蛍光ブローブの分子軸が配向して分布している場合には、 G因子を以下のようにして求める。すなわち、 p偏光の励起光の照射により試料から発生する蛍光のうちの P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度（真値）を I _PP(0) および I _PS(0) とし、光検出器により検出される実測値を Ι_ΡΡ(0)'および I_PS(0) ，とする。また、図 3に示すように励起光照射方向を中心軸として試料を 90度回転した後において、 s偏光の励起光の照射により試料から発生する蛍光のうちの P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度（真値）を I _SP(90)および I _ss(9 0)とし、光検出器により検出される実測値を I _SP(90)' および I_ss(90)' とする c このとき、これらの量と、受光光学系および光検出器の p偏光に対する応答 T_P と、 s偏光に対する応答 T_s との間には、

Ιρρ(0)'

—(22) I SP(90)' -T_P- I _SP(90)_N Iss(90)' =T_s-I_SS(90) -(23) なる関係がある。

また、試料を回転する前における異方性比 P₂(p，0)は、

_PP(0)，— (Tp/Ts) Ips(O)'

P₂(P，0) = •(24)

I PP(0)' + 2 (T_P/T_S) I _P"0)，

なる式で表され、試料を 90度回転した後における異方性比 P₂(s, 90) は、

(T_P/T_S) I _Ss(90)' - I _Sp(90)'

P₂(s,90) = •(25)

(T_P/Ts) I_ss(90)， + 2 I _SP(90)'

なる式で表される。こで、（14)式で表される G因子を用いると、（24)式および (25)式それぞれは、

>P(0)'-G ,(0)，

P₂(P，0) = '(26)

G- I_SS(90)'- I _SP(90)'

P₂(s，90) = •(27)

G- I _ss(90)' + 2- I _sp(90)'

で表される。

試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合には、励起光照射方向を中心軸として試料を 90度回転した後において s偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P₂(s, 90) は、試料を回転する前において p偏光の励起光の照射について得られる異方性比 P"p，0)と相等しい。すなわち、

P₂(s,90) = P₂(p,0) ー（28) である。したがって、（26)式と（27)式とを（28)式に代入して、 G-I_ss(90)' -I_sp(90)' I_PP(0)，一 G'I_PS(0)，

■(29)

G- I _ss(90)' +2'I_SP(90)， Ipp(0)' + 2G-I_PS(0)'

が得られ、これを解いて、 G因子を表す式として、

G二 [ (I_PP(0)，*I_sp(90)，）

/ (Ip_S(0)'-I_ss(90)') ] ^1/2 〜(30) が得られる。

すなわち、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合における G因子は、励起光照射方向を中心軸とする試料の回転角度を p偏光および s偏光それぞれの励起光の試料照射の場合で互いに 90度異なるものとし、これら p 偏光および s偏光それぞれの励起光の試料照射により発生する蛍光の p偏光強度および s偏光強度を測定し、これらの強度に基づいて（30)式により求められる。そして、このようにして得られた G因子による偏光応答補正を行うことにより、偏光度ならびに異方性比 P ₂を高精度に求めることができる。

さらに、本発明に係る偏光性測定方法および装置では、 h述の偏光度および異方性比 P ₂とは別に、偏光性を表す Sとして、

P₃(p) = 1 - G. - 〜（31) 丄 P P

P,(p) = - -G 〜（32) で表される偏光性を定義する。この偏光性 P₃および P₄は、偏光度および異方性比 P₂と比較的よい一致を示す量である。すなわち、いま蛍光寿命 rが同じで回転相関時間 0 (回転ブラウン運動の速さを特徴付ける量）の異なる 2種類の蛍光分子を考える。図 4および図 5は、 2種類の蛍光分子からの蛍光をそれぞれ別にパルス光励起により G= 1の系で測定したときの励起光の偏光方位に平行な蛍光偏光成分強度 I _ΡΡ'と垂直な蛍光偏光成分強度 I _PS 'をシミュレーションした結果である。但し、！をての。. 1倍、 0₂をの 10倍として計算した。このデータをもとに、偏光性を（4)式により、 P ₂を（5 )式により、 P ₃を（31 )式により、 P ₄を（32)式により求めた結果が図 6〜図 9である。図から判るように、偏光性 P P ₂ , P ₃および P ₄は、時間および 0の変化に対して略一致した減衰パターンをとつている。

また、（31 )式および（32)式を、偏光度 P ,および異方性比 P ₂それぞれの定義式である（4)式および（5 )式と比較すれば判るように、偏光性 P ₃および P ₄は、偏光度および異方性比 P ₂を求める演算よりも少ない演算量で求めることができる。したがって、（31 )式および（32 )式を用いた演算による偏光性 P ₃および P ₄の算出は、偏光性の変化をリアルタイムに測定する場合や、 2次元の大量のデ一夕について偏光性を求める場合のように、短時間に偏光性を求めたいときに極めて有効である。また、演算量が減少することから、演算時の誤差も低減される。次に、本発明に係る偏光性測定装置の構成について説明する。図 1 0は、本発明に係る偏光性測定装置の構成図である。

パルス励起光源 1は、試料 7中の蛍光プローブを励起するパルス励起光（第 1 の光束）を出力するものである。パルス励起光源 1から出力されたパルス励起光は、偏光子 2により直線偏光とされた後に、 1 / 2波長板（偏光方位回転手段） 3に入射して、ダイクロイツクミラー（光朿分岐手段） 5に関して p偏光方位および s偏光方位の何れかに回転させられる。そして、 p偏光または s偏光とされたパルス励起光は、対物レンズ 6により試料 7に照射される。すなわち、パルス励起光は、励起光導入光学系 4により所定の光束径および形状にされ、ダイク口イツクミラ一 5により反射され、対物レンズ 6により集光されて、試料ステージ (試料回転手段） 8に置かれた試料 7上の観察領域に照射される。この試料ステージ 8は、試料 7に入射するパルス励起光の光軸を中心として試料 7を回転させることができるものである。

試料 7にパルス励起光が照射されると、試料 7中の蛍光プローブから蛍光（第 2の光束）が発生する。その蛍光の強度分布は、検出手段により、励起光照射方向と同じ方向に出たものが p偏光と s偏光とに分離されて測定される。すなわち、試料 7から発した蛍光のうち対物レンズ 6に入射した光束は、対物レンズ 6を通過し、ダイクロイツクミラ一 5を透過し、バンドパスフィル夕 9を透過し、偏光ビームスプリヅ夕 1 0により p偏光成分と s偏光成分とに分岐され、その p偏光成分および s偏光成分それぞれの蛍光偏光像が結像レンズ 1 1および 1 2それそれによりゲート機能付イメージインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれの撮像面に結像され、そして、ゲート機能付イメージインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれにより強度分布が測定される。

ここで、バンドパスフィル夕 9は、蛍光を透過させるものであるが、試料 7で生じたパルス励起光の散乱光を吸収するものであり、偏光ビームスプリッ夕 1 0 は、蛍光の p偏光成分を透過させ、 s偏光成分を反射させるものである。ゲート機能付イメージインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれは、ゲートコント口 —ラ 1 5から出力されたゲー卜信号に基づいてゲ一卜を開閉し、ゲートが開いているときに撮像面に結像された蛍光偏光像を撮像するものである。また、ゲートコントローラ 1 5は、パルス励起光源 1からパルス励起光が出力されるタイミングを基準時刻として、時刻 t _u から時間 A tの間だけゲート機能付イメージインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれのゲートを開くよう指示するゲー卜信号を出力する。

ゲ一卜機能付イメージィンテンシファイア 1 3および 1 4それそれにより撮像された p偏光成分および s偏光成分それそれの蛍光偏光画像は、画像演算部 1 6 に入力される。画像演算部 1 6は、これらの蛍光偏光画像に基づいて、偏光応答補正を行い、偏光性（Ρ , , P ₂ , P ₃ , P ₄ ) の 2次元画像を求める。

次に、この偏光性測定装置を用いて偏光応答補正のなされた蛍光の異方性比 P ₂の 2次元画像を取得する方法について説明する。偏光度 P i， P ₂および P ₃それそれの 2次元画像も同様にして求められる。この偏光応答補正および蛍光の異方性比 P ₂の 2次元画像は、画像演算部 1 6における演算によって求められるものである。なお、以下では、試料 7中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合と、試料 7中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合とに分けて説明する。

試料 7中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合には、異方性比 P ₂の 2次元画像は以下のようにして取得される。

この場合、 1/2波長板 3の光学軸を適切に設定して、パルス励起光源 1から出力されたパルス励起光を p偏光として試料 7に照射する。このとき、ゲートコントローラ 15からのゲ一卜信号の指示により、時刻 t。から時間 Atの間にゲ ―ト機能付イメージィンテンシファイア 13および 14それぞれにより撮像された P偏光および s偏光それそれの蛍光画像を、 I_PP(t_u, Δ t )および I _PS( t Δ t )とする。

同様にして、 1/2波長板 3の光学軸を適切に設定して、パルス励起光源 1から出力されたパルス励起光を s偏光として試料 7に照射する。このとき、ゲートコントローラ 15からのゲート信号の指示により、ゲー卜機能付イメージィンテンシファイア 13および 14それぞれにより撮像された p偏光および s偏光それそれの蛍光画像を、 I_SP(t。， Δ t )および I _ss( t。， 1:)とする

そして、偏光応答補正に関する G因子を、

G= [ ( I _PP(t。，厶 t)' I (to,At))

/ (I_PS(to,At)-I_ss(to,At)) ] ^1/2 (33) で求め、異方性比 P₂(p， t o, At)を、

I _PP(to,At)-G- I "to,厶 t)

P P,t。，At) = -(34)

I (t₀,At)+ 2 G- I _ps(t₀₅At)

で求める。なお、蛍光画像 I_PP(t„， At) ， I_PS(t。， Δ t ) ， I_SP(t。，厶 t ) および I_ss(t。， Δ t ) 、 G因子ならびに異方性比 Ρ₂(ρ, t。， At) は、全て、試料 7に照射されるパルス励起光の光軸に垂直な面上の座標（X, y) の関数である。このようにして、試料中の蛍光プローブから発生した蛍光の異方性比 P の 2次元画像を高精度に測定することができる。

試料 7中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場合には、異方性比 P ₂の 2次元画像は以下のようにして取得される。

この場合、 1/2波長板 3の光学軸を適切に設定して、パルス励起光源 1から出力されたパルス励起光を p偏光として試料 7に照射する。このとき、ゲートコントローラ 15からのゲート信号の指示により、時刻 t。から時間 Atの間にゲ一卜機能付イメージィンテンシファイア 13および 14それぞれにより撮像された P偏光および s偏光それぞれの蛍光画像を、 I_PP(0, t o, 厶 ^ぉょびェ^ (0， t。， At )とする。

続いて、試料ステージ 8の回転により試料 7を 90度回転させた後、同様にして、 1/2波長板 3の光学軸を適切に設定して、パルス励起光源 1から出力されたパルス励起光を s偏光として試料 7に照射する。このとき、ゲートコントローラ 15からのゲート信号の指示により、ゲート機能付イメージインテンシフアイァ 13および 14それそれにより撮像された p偏光および s偏光それぞれの蛍光画像を、 I_SP(90, t ο, Δ t ) および I_ss(90， to, 厶 t )とする。

そして、偏光応答補正に関する G因子を、

G= [ (I (0,t„,At)-I_SP(90₅to,At))

/ ( I _PS(0，t₀,厶 t)' I _ss(90，t。，At)) ] ^1/ -(35) で求め、 p偏光の励起光の試料照射時における蛍光の異方性比 P P, to, Δ を、

I _PP(0，t。，At)— G' I _PS(0,t„,At)

P"p，t₀，At)= -(36)

I _P(0,to,At)+2 G- I _ps(0,t。，厶 t)

で求める。なお、蛍光画像 I_PP(0, t。，厶 t ) ， I_PS(0, to, At) 、 I_SP

(90, t。，厶 t ) および I _ss(90， t。，厶 t) ， G因子ならびに異方性比 P

₂(p, t o, Δ )は、全て、試料 7に照射されるパルス励起光の光軸に垂直な面上の座標（x， y) の関数である。このようにして、ターゲットに結合した蛍光プローブから発生した蛍光の異方性比 P 2の 2次元画像を高精度に測定することができる。

次に、本発明に係る偏光性測定装置における偏光応答補正について行った実験の結果について説明する。ここで用いた偏光性測定装置の具体的な構成は以下のとおりである。パルス励起光源 1は、モード同期チタンサファイアレーザ光源であり、試料 7に照射されるパルス励起光としては、これから出力される第 2高調波（波長 4 0 0 nm、パルス幅 2 0 0フェムト秒、繰り返し周波数 1 0 0 k H z ) を用いた。偏光子 2は、グランレーザプリズムであり、 1 / 2波長板 3は、フレネルロム 1 / 2波長板である。なお、ゲ一卜機能付イメージインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれに替えて、ここでは、マイクロチャンネルプレート内蔵型光電子增倍管を用いて、時間相関光子計数法（T C P C法）により蛍光強度を測定した。試料 7として、 F I T C (Fluorescein isothiocyanate) で標識された 1 7 merD N Aを用いた。この試料 7中では、蛍光プローブの分子軸は配向しておらず全くランダムに分布している。したがって、 G因子を（18)式で求め、蛍光の異方性比 P ₂を（15 )式で求めた。

図 1 1は、試料から発生した蛍光の強度を偏光素子を通さずそのまま測定したときの減衰曲線（太線）と、顕微鏡下での装置の応答関数（細線）とを示すグラフである。図 1 2は、 p偏光のパルス励起光で励起したときに試料 7から発生した蛍光の P偏光成分（太線）および s偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。なお、この図 1 2では、 s偏光成分（細線）の減衰曲線は、実測値に G因子を掛けた値で表示されている。

図 1 3は、 G因子による偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（太線）と、偏光応答補正を行わないで得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（細線）とを示すグラフである。すなわち、太線は、 p偏光および s偏光それぞれのパルス励起光で励起したときに試料 7から発生した蛍光の偏光測定の結果に基づいて G因子を求め、 p偏光のパルス励起光で励起したときに試料 7から発生した蛍光の P偏光成分および s偏光成分それぞれの強度の測定値について G因子による偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減 a曲線を示している。一方、細線は、実測値が真値であるとの仮定に下に、 G因子による偏光応答補正を行うことなく求めた異方性比 P ₂の減衰曲線を示している。 G因子の値は、 1.076であつた。なお、この装置において、ダイクロイツクミラー 5が G因子に主に寄与しているものと考えられる。

図 1 4は、本発明に係る偏光性測定装置のような顕微鏡下（図 2の構成）において偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（太線）と、従来構成の偏光性測定装置（¾ 1の構成）において偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線（細線）とを示すグラフである。この図に示すように、両者は良い一致を示している。すなわち、本発明に係る偏光性測定装置のような顕微鏡下においても偏光応答補正を行うことにより正確な異方性比 P ₂を測定することできることが確認できた。

次に、本発明に係る偏光性測定装慰を用いた蛍光偏光性の測定結果について説明する。ここで用いた偏光性測定装置の具体的な構成は以下のとおりである。パルス励起光源 1は、モード同期チタンサファイアレーザ光源であり、—試料 7に照射されるパルス励起光としては、これから出力される第 2高調波（波長 4 6 5 η m、パルス幅 2 0 0フエムト秒、繰り返し周波数 1 0 0 k H z ) を用いた。偏光子 2は、グランレーザプリズムであり、 1 / 2波長板 3は、フレネルロム 1 / 2 波長板である。なお、蛍光の減衰曲線を測定するときには、ゲート機能付ィメ一ジインテンシファイア 1 3および 1 4それぞれに替えて、マイクロチャンネルブレート内蔵型光電子増倍管を用いて、時間相関光子計数法（T C P C法）により蛍光強度を測定した。

試料 7は、 N G細胞（N G 1 0 8— 1 5 ) であり、蛍光プローブは、細胞膜に特異的に結合する H D A F (5-(N-hexadecanoyl )aminofluorescein) であり、染色濃度は 1 0〃Mであり、染色時間は 3 0分であった。この試料 7中では、蛍光プローブの分子軸は受光光軸に垂直な面では配向しておらず全くランダムに分布している。したがって、 G因子を（18)式で求め、異方性比 P₂を（15)式で求めた。図 15は、 p偏光のパルス励起光でフリーな蛍光プローブ（HDAF溶液） 'を励起したときに発生した蛍光の p偏光成分（太線）および s偏光成分（細線）それそれの減衰曲線を示すグラフである。なお、この図で、 s偏光成分（細線）の減衰曲線は、実測値に G因子を掛けた値で表示されている。図 16は、 p偏光のパルス励起光で夕ーゲッ卜に結合した蛍光プローブ（HDAF染色 NG細胞）を励起したときに発生した蛍光の p偏光成分（太線）および s偏光成分（細線）それそれの減衰曲線を示すグラフである。なお、この図でも、 s偏光成分（細線）の減衰曲線は、実測値に G因子を掛けた値で表示されている。

図 17は、 HDAF溶液（細線）および HDAF染色 NG細胞（太線）を励起したときに発生した蛍光について G因子による偏光応答補正を行って得られた異方性比 P ₂の減衰曲線を示すグラフである。すなわち、細線は、蛍光プローブがフリーな状態であるときの異方性比 P₂の減衰曲線であり、太線は、蛍光プロ一ブが夕一ゲッ卜に結合している状態であるときの異方性比 P₂の減衰曲線である。図から判るように、フリーな蛍光プローブは、ターゲットに結合しも蛍光プロ一ブに比べて速く偏光性が低下している（速く偏光解消している）。したがって、偏光解消の度合いを測定することにより、夕一ゲッ卜に結合した蛍光プローブとフリーな蛍光プローブの分離が可能となる。

そこで、図 18の模式図に示すようにフリーな蛍光プローブ（HDAF溶液）と夕一ゲットに結合した蛍光プローブ（HDAF染色 NG細胞）が共存する試料において蛍光の偏光性を 2次元的に解析した。まず。試料からの蛍光を偏光素子を通さずにそのまま測定したときの蛍光強度の 2次元分布（通常の蛍光画像）は、蛍光プローブがフリーに存在している領域（フリー領域）で平均値 1(F)二 36 655 (標準偏差び） = 1863) 、蛍光プローブが夕ーゲッ卜に結合している領域（バウンド領域）で平均値 I(B) = 43864 (標準偏差 cr(B)= 3378) であった。これらの値から、コントラスト C(I)を

1(B)— 1 (F)

C(I) 二ー(37)

KB)+ I(F)

により計算すると 0. 09であり非常に低く、また励起光強度の 2次元的なムラもあってフリ一領域とバウンド領域の差が明確ではなかった。次に、試料からの蛍光異方性比 P ₂の 2次元画像をゲート機能付イメージインテンシファイア 13 および 14のゲ一卜を常に開いた状態で測定した（DC測定）。その結果、図 1 9に示すように異方性比 P ₂の値は、フリー領域で平均値 P₂(F)= 0. 044、バウンド領域で平均値 P"B)= 0. 086であった、これらの値からコントラスト C(P₂)を

P_Z(B)-P₂(F)

C(P₂)= -(38)

P₂(B) + P₂(F)

により計算すると 0. 32であり、フリー領域とバウンド領域が明確に区別できるようになった。さらに、試料からの蛍光の異方性比 P₂をゲート機能付ィメージインテンシファイア 13および 14のゲートを時刻 t。= 2 n s (パルス光により励起された時刻を 0 n sとし、フリ一な蛍光プローブの偏光性が十分解消した時刻に設定した）から時間 3 nsの間だけ開いて測定した（時間分解測定）。その結果、図 19に示すように異方性比 P₂の値は、フリー領域で平均 P₂=◦ . 01 6、バウンド領域で平均 P 2 = 0. 069であった。これらの値からコントラストを（38)式により計算すると 0. 62になった。すなわち、異方性比 P₂の 2次元画像において、時問分解測定をすることによりフリー領域とバウンド領域のコントラストが DC測定に比べて向上した。以上のことから、顕微鏡下で蛍光の偏光性の 2次元画像を測定することにより、ターゲットに結合した蛍光プロ一ブが存在する位置を特定できることが分かる。

次に、本発明に係る偏光性測定装置における偏光応答補正因子に主に寄与していると考えられるダイクロイツクミラ一 5の偏光特性を物理的（光学的）に相殺する方法について述べる。

図 2 O Aおよび図 2 0 Bそれぞれは、ダイクロイツクミラー 5の偏光特性を相殺するための偏光性測定装置の検出光学系の構成図であり、検出光学系め光軸に対して垂直であって且つ互いに垂直な 2方向それぞれから見た図である。図 2 0 Aおよび図 2 0 Bに示す検出光学系は、図 1 0に示す偏光性測定装置における試料ステージ 8から偏光ビ一ムスプリッ夕 1 0に到るまでの検出光学系に相当するものであり、同一要素には同一符号が付されている。なお、この検出光学系以外の部分の構成は、図 1 0に示す偏光性測定装置において相当するものと同様の構成である。

図 2 O Aおよび図 2 0 Bに示す検出光学系は、図 1 0に示す偏光性測定装置の検出光学系において、第 1のダイクロイックミラ一 5とバンドバスフィル夕 9との間の光路上に、第 2のダイクロイヅクミラー 1 7を挿入したものである。この第 2のダイクロイツクミラ一 1 7は、第 1のダイクロイツクミラー 5と同一特性のものであって、第 1のダイクロイツクミラー 5を光軸の回りに 9 0度回転させた方位に配置されている。

この検出光学系によれば、ダイクロイツクミラー 5に対して p偏光または s偏光の直線偏光の励起光は、第 1のダイクロイックミラー 5に入射して反射され、対物レンズ 6を絰て、試料ステージ 8上の試料 7に照射される。励起光の照射により、試料 7で発生した蛍光は、対物レンズ 6を経て、ダイクロイツクミラ一 5 および 1 7それぞれを順次透過し、バンドパスフィルタ 9に到達する。ここで、ダイクロイツクミラー 5および 1 7それぞれの特性は同一であるから、ダイク口イツクミラ一 5および 1 7それぞれにおける p偏光に対する応答 T _P は互いに等しく、また、ダイクロイツクミラー 5および 1 7それぞれにおける s偏光に対する応答 T _s も互いに等しい。

したがって、試料 7で発生し対物レンズ 6を通過した蛍光の p偏光成分（ダイクロィヅクミラ一 5を基準）の強度を I _P(0)とすると、この偏光成分が第 1のダィクロイツクミラ一 5を透過した後の強度 I _P(l)は、

Ι_Ρ(1) = Τ_Ρ·Ι_Ρ(0) 〜（39) であり、さらに第 2めダイクロイツクミラー 17を透過した後の蛍光の ρ偏光成分の強度 I _Ρ(2)は、

I _P(2) = T_S-I _P(1)=T_S-T_P- I_P(0) 〜（40) である。

一方、試料 7で発生し対物レンズ 6を通過した蛍光の s偏光成分（ダイクロイックミラ一 5を基準）の強度を I _s(0)とすると、この偏光成分が第 1のダイク口ィックミラー 5を透過した後の強度 I _s(l)は、

I_S(1)=T_S'I_S(0) …( ）であり、さらに第 2のダイクロイツクミラ一 17を透過した後の蛍光の s偏光成分の強度 I _s(2)は、

I_S(2)=TVI_S(1)=T_P'T_S'I_S(0) —(42) である。

すなわち、

= Τ_Ρ·Τ₃ 〜（43)

であり、ダイクロイツクミラー 5および 17の応答は、蛍光の p偏光成分および s偏光成分の何れに対しても相等しい。

図 10に示す偏光性測定装置の受光光学系（試料から光検出器に到るまでの光学系）では、 p偏光および s偏光の蛍光（ダイクロイックミラー 5を基準）それそれに対する応答の相違は、主にダイクロイツクミラー 5に起因する。しかし、図 2 OAおよび図 20Bに示す検出光学系を有する偏光性測定装置の受光光学系では、ダイクロイツクミラー 5および 17における p偏光および s偏光の蛍光 (ダイクロイヅクミラ一 5を基準）それぞれに対する応答は相等しいので、受光光学系全体において P偏光および s偏光の蛍光それぞれに対する応答の相違は小さくなる。

したがって、図 2 O Aおよび図 2 0 Bに示す検出光学系を有する偏光性測定装置では、第 1のダイクロイックミラー 5に加えて第 2のダイクロイヅクミラ一 1 7を備えたことにより、受光光学系の偏光応答特性が改善され、また、 G因子に基づく偏光応答補正を行うので、高精度に蛍光の偏光性を測定することができる。以上に説明した偏光性測定方法および装置は、 1光子励起および多光子励起の何れの場合にも適用され得るものである。しかし、 1光子励起の場合と比較して、多光子励起の場合には更に顕著なる効果を奏する。そこで、次に、 1光子励起の場合と比較しつつ、 2光子励起の場合について説明する。

偏光性測定は、直線偏光の励起光を試料に照射することにより、試料中の蛍光プロ一ブのうちで特定の方位に分子軸を有するものを選択的に励起し、これにより生じる蛍光の偏光性を測定するものであり、この偏光性に基づいて蛍光プロ一ブの回転ブラウン運動の速さ等を検出するものである。したがって、励起光の偏光方位に平行な方位に分子軸を有する蛍光プローブのみが励起されるのが望ましレ、。しかし、実際には、励起光の偏光方位と異なる方位に分子軸を有する蛍光プローブも或る確率で励起される。

励起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸方位とがなす角度をひとすると、蛍光ブローブの分子軸方位の励起光の振幅成分は cosひに比例する。したがって、 1光子励起の場合に、蛍光プローブが励起される確率（励起確率） p _{1 P}は、その蛍光プローブの分子軸方位の励起光の強度（すなわち、振幅の 2乗）に比例するので、

p I ひ ) = p。 ^{l p} 'cos²ひ ---(44) で表される。ここで、 ρ _β ^{1 ρ} は、 1光子励起の場合において、励起光の偏光方位に平行な方位（ひ = 0 ) に分子軸を有する蛍光プローブの励起確率である。一方、 2光子励起の場合の励起確率 ρ は、その蛍光プローブの分子軸方位の励起光の強度の 2乗に比例するので、 p_2p (ひ） = p。^2p'cos⁴a 〜（45) で表される。ここで、 p。^2p は、 2光子励起の場合において、励起光の偏光方位に平行な方位'（ひ = 0 ) に分子軸をする蛍光プローブの励起確率である。

図 21は、 1光子励起の場合の励起確率 _P (ひ）および 2光子励起の場合の励起確率 p_2p (ひ）それぞれを示すグラフである。ここでは、ひ =0のときの励起確率である p。^lp および p。^2p それぞれの値を 1に規格化してある。この図に示すように、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、角度ひの絶対値が大きくなるに従い、励起確率は急激に減少している。すなわち、励起光の偏光方位に平行な方位（ひ =0) に分子軸を有する蛍光プローブの励起確率に対して、励起光の偏光方位と異なる方位（ひ≠0) に分子軸を有する蛍光プローブの励起確率は、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が小さい。したがって、試料中で蛍光プローブの分子軸の方位がランダムに配向している系において偏光性測定を行う場合には、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、励起光の偏光方位に平行な分子軸を有する蛍光プローブは、より選択的に励起される。

次に、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、上記の励起確率で励起された蛍光プローブから発生する蛍光の異方性比 P 2を求める。 ] 22は、励起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸の方位との関係を説明する図である。 X y z直交座標系を設定し、励起光の伝搬方向を X方向とし、励起光の偏光方位 Pを z方向とする。蛍光プローブの分子軸の方位 Aおよび蛍光の偏光方位 Eは、互いに同一であって、 z軸と角度ひをなし、 xy平面への投影が X軸と角度^をなすものとする。また、蛍光プローブの分子軸の方位はランダムに配向しているものとする。

この場合、蛍光プローブから発生する蛍光の強度を kとすると、その蛍光の z 軸方位の成分の強度 i _z 、 X軸方位の成分の強度 i_x および y軸方位の成分の強度 i _y それそれは、

i x= k «sin² a -cos²/? •••(46b) i _y= k -sin² a *sin² ? ·'·(46(;) で表される。

また、分子軸の方位 Αがひとひ + dひとの間および9と/? + d ?との間にある蛍光プローブの数は、

sina -ά -ά/3 ·'·(47) に比例する。したがって、励起光により励起された蛍光プローブのうちで、分子軸の方位 Α (すなわち、蛍光の偏光方位 E) がひとひ + dひとの間および/?と /3 + d ?との間にある蛍光プローブの数は、（44)式、（45)式および (47)式より、 1 光子励起の場合には、

cos^ - sina · ά ' d 0≡ Ω _{i p}( )' d a - d j3 ·'·(48) に比例し、 2光子励起の場合には、

cos⁴ 'sinひ -dひ ·ο! ?≡Ω2(Λひ ) 'dひ '··(49) に比例する。

また、一般に、励起光照射により励起された蛍光プローブのうちで分子軸の方位 Αが ζ軸に対し角度ひである蛍光プローブの分布を Ω (ひ）とすると、蛍光プローブの集団である試料から発生する蛍光の z蚰方位の成分の強度 I _z 、 X軸方位の成分の強度 Ix および y軸方位の成分の強度 I _y それぞれは、（46a), (46b), (46c)式より、

S cos²ひ. Ω (ひ ) · d α

= κ α ττ/2 ■(50a)

S Ω (ひ ) · dひ rr/2

K S sin²ひ · Ω (ひ ) · dひ

I χ= a

一 ■(50b)

2 Ω ( )· d

K S sin²ひ · Ω (ひ )' dひ

― . Q ^ •(50c)

2 S Ω( a)-d a で表され、また、

〜（51) である。なお、 Κは、比例定数である。

さらに、一般に、蛍光の異方性比 Ρ₂は、励起光の偏光方位に平行な蛍光偏光成分の強度 Ι_ζ と励起光の偏光方位に垂直な蛍光偏光成分の強度 Ιχ または Iy との差を、全蛍光量1_>(+1_>^+1_!! で割ったものであり、

P, = (I_z-Ix) / (Iz+ 2 Ix) … 2) で表される。この（52)式に（50a), (50b), (50c)式を代人すると、

= ( 3 ·く cos²ひ〉一 1 ) /2 〜（53) が得られる。ただし、

S cos² · Q( a)- d a

•icos^ひ > 一 Q ■(54)

S Ω (ひ） 'd a である。

以上より、 1光子励起の場合、励起直後（すなわち、蛍光プローブの回転ブラゥン運動により偏光解消を受ける前）の蛍光の異方性比 P 2'^p(0)の値は、（48)式の Ω _{l p} (ひ）を（54)式の Ω (ひ）に代入して（53)式より得られ、 Ρ₂ ^1ρ(0)= 2/5 = 0. 4 〜（55) である。一方、 2光子励起の場合、励起直後の蛍光の異方性比 P₂ ^2p(0)の値は、 (49)式の Ω_2Ρ (ひ）を（54)式の Ω (ひ）に代入して（53)式より得られ、

Ρ₂ ^2ρ(0)=4/7 = 0. 57 〜（56) である。

このように、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、蛍光の異方性比の初期値 Ρ₂(0)は、 1. 43倍（= 0. 57/0. 4) だけ大きい。したがつて、励起された蛍光プローブが回転ブラウン運動していると、蛍光プローブから発生する蛍光の異方性比 Ρ ₂の値は、上記（55)式または（56)式で示される初期値から次第に小さくなつていくので、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、偏光性測定のダイナミックレンジは、 1. 43倍広い。また、定常光励起の場合も同様である。

次に、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれにおける偏光性測定の感度について検討する。励起直後において、励起光の偏光方位と平行な蛍光偏光成分の強度 Ι _Ρ I J と、励起光の偏光方位に垂直な蛍光偏光成分の強度 I , (= I _y) との比は、 (50a), (50b), (50c)式より、

I _s i sin" a a) - d a

—— = —— ― (57)

I p 2 - S cos ひ · Ω (ひ ) · dひで表される。 1光子励起の場合には、（48)式の Ω_1Ρ (ひ）を（57)式の Ω (ひ）に代人して、

I

1/3 〜（58) が得られ、 2光子励起の場合には、（49)式の Ω_2Ρ (ひ）を（57)式の Ω(α)に代入して、

I _s/I_P= l/5 〜（59) が得られる。したがって、励起された蛍光プローブが回転ブラウン運動することにより、比 I_S/I _Pは、 1光子励起の場合には 1/3から 1まで変化するのに対して、 2光子励起の場合には 1/5から 1まで変化するので、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、偏光性測定の感度は高い。

次に、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれにおいて、一定の強度で連続的に励起されている蛍光プローブから発生する蛍光の偏光性の測定感度について検討する。蛍光寿命を" rとし、蛍光プローブの回転相関時間を 0とし、蛍光の異方性比の最大値（（55)式または（56)式でえられる値）を P₂(0) とすると、蛍光の異方性比 P₂は、

P₂(0)

P₂= 〜（60) l +r/θ

で表される。ここで、回転相関時間 0は、蛍光プローブの回転ブラウン運動の速さを特徴付ける量であり、夕ーゲッ卜に結合している蛍光プローブとフリー状態にある蛍光プローブとでは異なる値となる。回転相関時間^は、蛍光プローブが球状粒子である場合には、蛍光プローブの体積を Vとし、溶媒の絶対温度をてとし、溶媒の粘度を r?とし、ボルツマン定数を kとすると、

1 k-T

一 = —— (61)

Θ V- 7?

で表される。

図 23は、 1光子励起の場合（細線）および 2光了-励起の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の蛍光の異方性比 P '2 ((60)式）の値を 0/てに対してプロットしたグラフである。また、第 24図は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の蛍光の異方性比 P₂ ((60)式）のに対する傾斜をプロットしたグラフである。これらの図から判るように、 1光子励起の場合（細線）よりも、 2光子励起の場合 (太線）の方が、蛍光の異方性比 P₂の値は大きく、また、蛍光の異方性比 P₂の 0/てに対する傾斜も大きい。したがって、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、蛍光の異方性比 P₂は、 6>/rの変化に対して敏感である, 上記 (60)式を 6>に関して微分すると、

が得られる。 1光子励起の場合と 2光子励起の場合とで蛍光寿命 rが同一であれば、 (55)式および (56)式より、

P₂ ^2p(0) > Ρ ^1ρ(0) 〜（63) であるので、

d P dP

> ,(64) d Θ d θ

となる。すなわち、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、蛍光の異方性比 Ρ ₂は回転相関時間 0の変化に対して感度が高い。

次に、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれにおいて、 ffi光の偏光性測定値の S/N比について検討する。蛍光の異方性比 P ₂の平均値をく P₂>で表し、異方性比 P₂の標準偏差をびとし、励起光の偏光方位と平行な蛍光偏光成分の光検出器への入射光子数をく n_P>とし、励起光の偏光方位に 3直な蛍光偏光成分の光検出器への入射光子数をく n_s>とし、光検出器の光電変換面の量子効率を £とすると、蛍光の偏光性測定値の S/N比は、

S <P₂>

= <Ρ₂>· [£· (く n_P〉 + <n_s>)] ^1/2 '(65)

N a

で与えられる。定常光励起の場合、

P₂(0)

<P ₂> = ■(66)

1 +τ/θ

であるから、（65)式は、

S P₂(0)

[£'(<n_P> + <n_s>)] ^1/2 ■(67)

N 1+τ/θ となる。

したがって、 1光子励起の場合と 2光子励起の場合とで同一光子数の蛍光が得られれば、 1光子励起の場合より、 2光子励起の場合の方が、 S/N比は 1. 4 3倍大きい。また、 1光子励起の場合と 2光子励起の場合とで、て/ Sの同一値に対して同一の S/N比を得る為に必要な光子数の比は、

(<n_P>+<n_s>)

= P₂ ^lp(0)/P,^2p(0)) ²= 1/2 -(68)

(< n_P> + <n_s>) ip

である。すなわち、 1光子励起の場台と比較して、 2光子励起の場合には、て/ 0の同値に対して同一の S/N比を得る為に必要な光子数は、 1/2でよい。次に、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれにおいて、偏光性測定値の標準偏差（ノイズ）びが与えられたときの蛍光プローブの回転相関時間 0 の検出限界について検討する。回転相関時間の値 0に対する平均異方性比を <P ( (9 )>とし、回転相関時間に値 0 + に対する平均異方性比をく P (Θ + Α Θ)> とし、回転相関時間 ( の検出限界を Δ 6>とすれば、

<Ρ₂(Θ +Α Θ)> - <Ρ₂(6» )> = ο 〜（69) が成り立つ。これより、回転相関時間 0の検出限界を表す式として、

(θ + τ)²

ΑΘ = (70)

(ΡΛ )/σ)τ-(θ + τ)

が得られる。（63)式および (70)式より、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、 -ノイズの条件の下では回転相関時間 0の検出限界は高い。以上では、蛍光の異方性比 Ρ ₂について、 1光子励起の場合と 2光子励起の場合それぞれについて述べたが、他の偏光性（P h Ρ₃, Ρ-») についても同様である。また、 2光子励起の場合であっても、 1光子励起の場合と同様に、 G因子に基づく偏光応答補正を行うことにより、 ¾光の偏光性の 2次元画像を顕微鏡下で高精度に測定することができる。 2光子励起の場合には、これに加えて、励起光の偏光方位に平行な分子軸を有する蛍光プローブは選択的に励起されるので、偏光性（Ρ ^ P ₂， P _:i , P ₄ ) の初期値は大きく、偏光性測定のダイナミックレンジは広く、偏光性測定の回転相関時間 6)に対する感度は高く、偏光性測定値の S /N比は大きく、同一の S /N比を得る為に必要な光子数は少なくてよく、また、回転相関時間 0の検出限界は高く、 1光子励起の場合よりも更に優れた効果を奏する。

以上の理論を検証するため、以下のような実験を行った。蛍光プローブとして B O D I P Y色素を用い、この B O D I P Y色素をエタノールおよびグリセ口一ルを含む溶液中に溶かした溶液を試料とした。この蛍光プローブの回転相関時間 0すなわち回転ブラゥン運動の速さの調整は、溶液の粘度?？すなわちグリセロールの割合を調整することにより行った。なお、回転ブラウン運動の速さは、溶液の粘度 77に反比例する。

ここで用いた偏光性測定装置は、図 1 0に示した構成とし、顕微鏡下で偏光性の測定を行った。パルス励起光源 1としてモード同期チタンサファイアレーザ光源が用いられ、 2光子励起の場合には、このレーザ光源から出力されたレーザ光 (波長 9 2 0 n m、パルス幅 2 0 0フェムト秒、繰り返し周波数 7 6 M H z ) が励起光として用いられ、 1光子励起の場合には、その第 2高調波（波長 4 6 0 n m、繰り返し周波数 1 0 0 k H z ) が励起光として用いられた。対物レンズ 6として、倍率 2 0倍のものが用いられた。また、ゲート機能付イメージインテンシファイア 1 3 , 1 4のゲートが常に開いている状態で用いられた。

図 2 5は、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 P ₂および標準偏差びの測定値をまとめた図表である。また、第 2 6図は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 P ₂の測定値をプロットしたグラフである。これらの図から判るように、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合の何れも、グリセロール割合が多いほど、すなわち、溶液の粘度 ?7が大きく回転相関時間 ( が大きいほど、蛍光の異方性比 P 2が大きい。また、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、蛍光の異方性比 P₂が大きい。これらは、上述した理論に合致するものである。さらに、 1光子励起の場合に対する 2光子励起の場合の蛍光の異方性比 P₂の比は、グリセロール割合 50%で 1. 1 5であり、 60%で 1. 1 9であり、 70%で 1. 4 1であり、 80%で 1. 40であり、 90%で 1. 3 1であり、グリセロール割合 70%および 80%では理論値 1. 43に近い値が得られた。

図 27は、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、グリセロール割合の 10%増に対して、蛍光の異方性比 P ₂の増分 ΔΡ ₂をまとめた図表である。また、図 28は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合 (太線）それぞれについて、グリセロール割合の 1 0%増に対して、蛍光の異方性比 P₂の増分 ΔΡ₂の値をプロヅ卜したグラフである。これらの図から判るように、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、蛍光の異方性比 Ρ₂の増分 ΔΡ₂が大きい。これらは、上述した理論に合致するものである。さらに、 1光子励起の場合に対する 2光子励起の場合の蛍光の異方性比 Ρ₂の増分 ΔΡ ₂の比は、平均 1. 42であり、理論値 1. 43に近い値が得られた。

図 29は、 1光子励起の場合および 2光子励起の場合それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 Ρ₂を標準偏差びで割った値（Ρ₂/び）、および、蛍光の異方性比 Ρ₂の増分 ΔΡ₂を標準偏差びで割った値 (ΔΡ,/σ) をまとめた図表である。図 30は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 Ρ ₂を標準偏差びで割った値（Ρ₂ /び）をプロットしたグラフである。また、図 3 1は、 1光子励起の場合（細線）および 2光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比 Ρ₂の増分 ΔΡ ₂を標準偏差びで割った値（ΔΡ₂/(Τ) をプロットしたグラフである。これらの図から判るように、 1光子励起の場合よりも、 2光子励起の場合の方が、 S/N比（ = Ρ 2 /σ) は良く、また、回転相関時間 6>の検出限界 Δ6> ( = ΔΡ,/σ) も高い。次に、 2光子励起の場合に好適に用いられ得る偏光性測定装置の構成について説明する。

図 1 0に示した構成の偏光性測定装置は、 2光子励起の場合にも用いられ得るものである。しかし、ヒ述の理論および実験結果で示したように、 2光子励起により励起された試料中の蛍光プローブから発生する蛍光の偏光性測定は優れた効果を奏するものであるが、 2光子励起の場合には、励起光は非常に強力である必要があり、 1光子励起の場合と同程度の蛍光強度を得る為には、 1光子励起の場合の約 1 0 0倍の励起光強度が必要である。それ故、図 1 0に示した構成では、試料 7で反射 ·散乱されダイクロイックミラ一5を透過してゲ一ト機能付ィメ一ジインテンシファイア 1 3 , 1 4に達する励起光は、 1光子励起の場合よりも強く、無視し得ない場合がある。そこで、図 1 0に示した構成に加えて、ダイク口ィヅクミラ一 5とゲ一卜機能付イメージィンテンシファイア 1 3 , 1 4それぞれとの問の光路上に、励起光を遮断するフィル夕を追加して挿入するのが好適である。

また、より好適には、図 2 O Aおよび図 2 0 Bに示す検出光学系を有する偏光性測定装置が 2光子励起の場合に用いられ得る。すなわち、ダイク όイツクミラ一 1 7は、ダイクロイツクミラー 5のもつ偏光特性を相殺するだけでなく、強力な励起光の反射 ·散乱光を遮断するフィル夕としても機能し、偏光測定の S /Ν 比が改善される。

以上のように、本発明に係る偏光性測定方法および装置によれば、蛍光プロ一ブを含む試料から発生した蛍光の偏光性（P _{l 5} Ρ ₂， Ρ ₃ , Ρ ₄ ) の 2次元画像を顕微鏡下で得ることができる。しかも、本究明に係る偏光性測定装置のような顕微鏡下であっても、偏光応答補正を行うことで高精度な偏光性の測定を行うことができる。

なお、以上の実施形態の説明においては、偏光解消イメージングを例にして偏光性測定について説明したが、 2次元（イメージング）に限られるものではなく、 0次元（ポイント）や 1次元の偏光性測定にも本発明は適用可能であり、また、偏光解消の測定に限られるものではない。また、試料に励起光を照射して発生した蛍光の偏光性の測定について述べたが、ラマン散乱光の偏光性の測定についても全く同様である。産業上の利用可能性

以上のように、本発明に係る偏光性測定方法および装置は、試料に第 1の光束 (励起光、照射光）が照射されて発生した第 2の光束（蛍光、ラマン散乱光）の偏光性の 2次元画像を顕微鏡下で測定することができる。したがって、例えば、本発明が蛍光偏光解消イメージングに用いられる場合には、ターゲッ卜に結合した蛍光プローブが存在する位置を高精度に特定することができ、試料中のターゲッ卜の挙動等を解析することができるので、例えば細胞における諸機能の解明に貢献し得るものである。

Claims

請求の範囲

1. 試料に照射する第 1の光束および前記試料から発生する第 2の光束のうち何れか一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、前記第 1の光束を前記光束分岐手段を絰て前記試料に照射し、該照射により前記試料から発生し前記光束分岐手段を経た前記第 2の光束の偏光性を測定する偏光性測定方法であって、前記第 1の光束を前記光束分岐手段に対して p偏光として前記試料に照射したときに発生する前記第 2の光束の p偏光成分の強度 I _PPおよび s偏光成分の強度 I _PSを測定する第 1のステヅプと、

前記第 1の光束を前記光朿分岐手段に対して s偏光として前記試料に照射したときに発生する前記第 2の光束の p偏光成分の強度 I _SPおよび s偏光成分の強度 I _ssを測定する第 2のステップと、

偏光応答補正因子 Gを

G= [ (I_PP- I_SP) / (Ips- I ss) ] ^{1 2}

なる式により求める第 3のステップと、

前記偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正を行って前記第 2の光束の偏光性を求める第 4のステップと、

を備えることを特徴とする偏光性測定方法。

2. 前記第 2のステップは、前記第 1のステップの測定時と同じ配置の前記試料に対して前記第 1の光束を照射する、ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の偏光性測定方法。

3. 前記第 1のステップは、前記所定方向を中心軸とする所定回転角度位置にある前記試料に対して前記第 1の光束を照射し、

前記第 2のステップは、前記中心軸について前記所定回転角度位置とは 90度異なる回転角度位置にある前記試料に対して前記第 1の光束を照射する、ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の偏光性測定方法。

4. 前記第 4のステップは、前記第 2の光束の偏光性 Pを

Ρι(Ρ)二 ( I pp-G- I _ps) / ( I p + G- I _ps)

または、

(G' I_SS- I_SP) / (G- I _ss+ I _Sp)

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の偏光性測定方法

5. 前記第 4のステップは、前記第 2の光束の偏光性 Pを

P₂(p)= ( I _Pp-G- I _PS) / ( Ι ρρ+ 2 -G· I _PS)

または、

P₂(s)= (G- I _SS- I _SP) / (G- I _Si+ 2 - I _SP)

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 1頃記載の偏光性測定方法

6. 前記第 4のステップは、前記第 2の光束の偏光性 Pを

または、

P₃(s) = G— ( I _SP/I _{S S})

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の偏光性測定方法 c

7. 前記第 4のステップは、前記第 2の光束の偏光性 Pを

または、

FAs) = G- ( I _SS/I sp) - 1

8. 前第 1の光朿は、前記試料により多光子吸収され得る波長の光束であり、前記第 2の光束は、その多光子吸収に伴い発生する光束である、ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の偏光性測定方法。

9. 試料に照射する第 1の光束および前記試料から発生する第 2の光束のうち何れか一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、前記第 1の光束を前記光束分岐手段を経て前記試料に照射し、該照射により前記試料から発生し前記光朿分岐手段を経た前記第 2の光束の偏光性を測定する偏光性測定装置であって、試料に照射する直線偏光の第 1の光束を出力する光源部と、

前記光源部から出力された前記第 1の光束の偏光'方位を回転させる偏光方位回転手段と、

前記第 1の光束が前記試料に照射されて発生した光束のうち前記光束分岐手段を絰た前記第 2の光束の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を検出する検出手段と、

前記偏光方位回転手段により前記光束分岐手段に対して P偏光とされた前記第 1の光束が前記試料に照射されたときに前記検出手段により検出された前記第 2 の光束の P偏光成分の強度 I _PPおよび s偏光成分の強度 I _PS、並びに、前記偏光方位回転手段により前記光束分岐手段に対して s偏光とされた前記第 1の光束が前記試料に照射されたときに前記検出手段により検出された前記第 2の光束の p 偏光成分の強度 I _SPおよび s偏光成分の強度 I _ssに基づいて、

G二 [ (I pp- I sp) / ( - I _ss) ] ^1/2

なる式により偏光応答補正因子 Gを求める補正因子演算手段と、

前記偏光応答補正因子 Gに基づいて偏光応答補正を行って前記第 2の光束の偏光性を求める偏光性演算手段と、

を備えることを特徴とする偏光性測定装置。

10. 前記補正因子演算手段は、一定配置にある前記試料について前記検出手段により検出された前記強度 I _PP， I _PS， I _SPおよび I _ssそれぞれに基づいて、前記偏光応答補正因子 Gを求める、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置。

1 1. 前記所定方向を中心軸として前記試料を回転させる試料回転手段を更に備え、

前記補正因子演算手段は、前記中心軸について所定回転角度位置にある前記試料について前記検出手段により検出された前記強度 I_PPおよび I_PS、並びに、前記試料回転手段により前記中心軸について前記所定回転角度位置とは 90度異なる回転角度位置に設定された前記試料について前記検出手段により検出された前記強度 I _SPおよび I _ssに基づいて、前記偏光応答補正因子 Gを求める、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置。

12. 前記偏光性演算手段は、前記第 2の光束の偏光性 Pを

( I pp-G- I p_S) / (Ipp + G- I_PS)

または、

P.(s)= (G-I_SS-I_SP) / (G-I_SS+I_SP)

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置。

13. 前記偏光性演算手段は、前記第 2の光束の偏光性 Pを

P₂(p)= (Ipp-G-Ip_S) / (I_PP+2-G-I_PS)

または、

P₂(s)= (G-I_ss-I_Sp) / (G-I_s._s+2-I_SP)

14. 前記偏光性演算手段は、前記第 2の光束の偏光性 Pを

または、

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置 c

15. 前記偏光性演箅手段は、前記第 2の光束の偏光性 Pを

または、

P₄(s) = G- ( I _SS/I _Sp) ― 1

なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置 <

16. 前記光源部は、前記試料により多光子吸収され得る波長の光束を前記第 1 の光束として出力するとともに、前記検出手段は、その多光子吸収に伴い発生する光束を前記第 2の光束として検出する、ことを特徴とする請求の範囲第 9項記載の偏光性測定装置。

1 7 . 試料に照射する第 1の光束を出力する光源部と、

前記第 1の光束を前記試料に照射し、該照射により前記試料から発生した第 2 の光束を入力し、前記第 1の光束および前記第 2の光束のうち何れか方を反射し他方を透過する第 1の光束分岐手段と、

前 ffi第 1の光束分岐手段の分光特性と等しい分光特性を有し、前記第 1の光束分岐手段における前記第 2の光束に対する入射面と 9 0度異なる人射面を有し、前記第 1の光束分岐手段から出力された前記第 2の光束を入力する第 2の光束分岐手段と、

前記第 2の光束分岐手段を経た前記第 2の光束の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度を検出する検出手段と、

前記検出手段により検出された前記第 2の光束の p偏光成分および s偏光成分それぞれの強度に基づいて前記第 2の光束の偏光性を測定する偏光性演算手段と、を備えることを特徴とする偏光性測定装置。