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WO1998012717A1 - Kugelförmige magnetische partikel - Google Patents

Kugelförmige magnetische partikel Download PDF

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WO1998012717A1
WO1998012717A1 PCT/EP1997/004828 EP9704828W WO9812717A1 WO 1998012717 A1 WO1998012717 A1 WO 1998012717A1 EP 9704828 W EP9704828 W EP 9704828W WO 9812717 A1 WO9812717 A1 WO 9812717A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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magnetic particles
particles
atoms
monospheres
coated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1997/004828
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Anselmann
Martin Geoffrey Pellatt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Priority to AU45532/97A priority Critical patent/AU4553297A/en
Publication of WO1998012717A1 publication Critical patent/WO1998012717A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/01—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of inorganic materials
    • H01F1/03—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of inorganic materials characterised by their coercivity
    • H01F1/032—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of inorganic materials characterised by their coercivity of hard-magnetic materials
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    • H01F1/11—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of inorganic materials characterised by their coercivity of hard-magnetic materials non-metallic substances, e.g. ferrites, e.g. [(Ba,Sr)O(Fe2O3)6] ferrites with hexagonal structure in the form of particles
    • H01F1/112—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties of inorganic materials characterised by their coercivity of hard-magnetic materials non-metallic substances, e.g. ferrites, e.g. [(Ba,Sr)O(Fe2O3)6] ferrites with hexagonal structure in the form of particles with a skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
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    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/84—Polymer coating, e.g. gelatin
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/86—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids the coating being pre-functionalised for attaching immunoreagents, e.g. aminodextran

Definitions

  • the invention relates to spherical magnetic particles based on monodisperse Si0 2 particles, their production and their use.
  • magnetic particles for the immobilization and separation of biological materials is becoming increasingly important.
  • these particles consist of a magnetic core and a protective layer made of a metal oxide, on which there is a polymer layer which enables the biological material to be reversibly bound to the magnetic particles.
  • US 4,343,901 describes magnetic particles for the immobilization of enzymes which consist of an inorganic oxide and ferromagnetic particles which are obtained by a sol-gel technique.
  • the surface of the calcined particles is impregnated with a cross-linked polyamine and glutaraldehyde.
  • US 4 152 210 describes a biochemically active substance which consists of ferromagnetic particles and an enzyme adhering to them.
  • the particles consist either of iron coated with nickel or of precipitated iron oxide. In both cases they are coated with aminopropyltriethoxysilane and glutaraldehyde. The particles are used to separate biologically active material from fermentation solutions.
  • US 4,280,918 describes a dispersion of magnetic particles which is produced by mixing a dispersion of Fe 2 0 3 or cobalt-doped Fe 3 0 with a positive charge with colloidal Si0 2 with a negative charge and subsequent treatment with ultrasound.
  • EP 0 343 934 describes magnetic particles which consist of a core made of a magnetic material and a shell made of an inorganic oxide.
  • the preparation is carried out by emulsifying the solution of a salt or an aqueous sol of the magnetic material and a solution of a salt or an aqueous sol of the inorganic oxide in a water-immiscible liquid, forming discrete drops.
  • the drops are converted into a gel by introducing ammonia, then separated from the liquid phase, dewatered and calcined.
  • the magnetic particles known from the prior art have the disadvantage that they do not have a uniform size, agglomerates cannot be prevented and the mass ratio between the magnetic core and the cladding layer is subject to fluctuations.
  • the particles show no uniform behavior in the magnetic field, which has a negative effect on the separation process.
  • the object of the invention is to provide monodisperse magnetic particles with a largely uniform size and an adjustable ratio between magnetic material and other constituents.
  • This object is achieved according to the invention by monodisperse magnetic particles with a particle size of 50 to 1500 nm, with a spherical core made of silicon dioxide, which is selectively coated with magnetic particles with a maximum particle size of 60 nm and has a cover layer made of silicon dioxide.
  • the magnetic particles are silanized in a known manner.
  • this object is achieved according to the invention by a process for producing the magnetic particles by dispersing silica gel monospheres in deionized water at 20 ° C. in a first stage and by adding a solution of iron (II) sulfate and iron (III) sulfate with a metering rate of 0.05 to 3 mg Fe 3 0 per minute and per m2 surface area of the monospheres, a pH value of 8 being maintained by simultaneous addition of a base, spot coating with Fe 3 0 4 and in a second step to the suspension of the coated monospheres an aqueous, acetic acid tetraethyl orthosilane solution at a rate of 0.1 to 5 mg Si0 2 per min. and per m?
  • the uncoated monospheres are metered in, then the suspension is adjusted to a pH of 9 within 30 minutes by adding a base and subsequently heated to 75 ° C. and then the magnetic particles obtained (monospheres magnetic beads) are separated off and washed with water and dried at 60 to 100 ° C, optionally in vacuo.
  • the monospher magnetic beads obtained can be silanized in a third stage by known processes.
  • the invention also relates to the use of the magnetic particles according to the invention for the isolation of nucleic acids and biotin and biotinylated proteins from aqueous solutions.
  • the spherical monodisperse Si0 2 particles to be used as starting material are known per se from the prior art.
  • a sol of primary particles is first produced.
  • the tetraalkoxysilane is placed in an aqueous-alcoholic-ammoniacal hydrolysis mixture and mixed thoroughly.
  • Suitable tetraalkoxysilanes which can be used are all readily hydrolyzable ortho esters of aliphatic alcohols.
  • the esters of aliphatic alcohols with 1-5 C atoms, such as methanol, ethanol, n- or i-propanol, and the isomeric butanols and pentanols are primarily considered here. These can be used individually or in a mixture.
  • the silicic acid orthoesters of the C r C 3 alcohols are preferred.
  • the hydrolysis mixture should contain from about 0.5 to about 8 mol / l ammonia and from about 1 to about 15 mol / l water on white.
  • Aliphatic CrC 3 alcohols, preferably CrC 3 alcohols, are suitable as the alcohol component such as methanol, ethanol and n- or i-propanol. These can be present individually or in a mixture with one another in the hydrolysis mixture.
  • the tetraalkoxysilane is preferably added to the hydrolysis mixture in one portion, the reactant being able to be present in pure form or in solution in one of the alcohols mentioned.
  • a concentration of tetraalkoxysilane in the hydrolysis mixture between about 0.01 and about 1 mol / l can be selected to generate the primary particles.
  • reaction mixture shows opalescence or turbidity due to the resulting particles. After generally not more than 15-30 minutes, or longer in unfavorable special cases, the reaction has ended.
  • particles with an average diameter between about 0.01 and about 2 ⁇ m can be obtained in accordance with known methods
  • samples can be taken from the sol of primary particles in order to examine the particles for their particle size, shape accuracy and particle size distribution, for example with the aid of electron microscopy.
  • a slow, continuous metering of further tetraalkoxysilane into the sol of primary tech takes place. It is essential here that the rate of metering is controlled so that an immediate, complete reaction with the particles present in the sol takes place without an excess of tetraalkoxysilane being formed, from which nuclei for new primary particles can form. Controlled regrowth of the particles in the sol is achieved under this process measure of metered addition of tetraalkoxysilane, controlled in accordance with the reaction, whereby the particle size ultimately to be achieved depends on the amount of the total added tetraalkoxysilane.
  • the amount of the total alkoxysilane to be added is in principle not critical as long as the hydrolysis mixture is present in excess, or - b -
  • the regrowth process is preferably carried out at an elevated temperature, around 40 ° C.
  • Monodisperse spherical silica particles with a particle size of 50 to 1500 nm can be produced by this method, a desired size being able to be set very precisely, since the standard deviation from the mean particle diameter is only 2 to 5%.
  • the punctiform coating of the silica monospheres with magnetite is carried out by precipitation from a solution of iron (II) and iron (III) salts, preferably from a solution of iron (II) and iron (III) sulfate.
  • the molar ratio between the divalent and trivalent iron salt is 1: 1. It should be noted that the precipitation solutions must be protected against oxidation. The presence of oxidizing or reducing agents is not necessary during the precipitation.
  • the pH of the monosphere dispersion is adjusted to values between 7 and 9, preferably 7.5 to 8.5.
  • the pH is kept constant during the precipitation reaction by adding a base, preferably 25% aqueous ammonia solution is used.
  • the temperature of the suspension is set at 0 to 40 ° C.
  • the metering rate of the iron (II) iron (III) salt solution is between 0.05 to 3 mg Fe 3 0 4 per minute and per ms surface, preferably between 0.2 to 1 mg Fe 3 0 4 per minute and per ms surface of the monospheres.
  • the magnetite is deposited in a punctiform manner on the surface of the monospheres.
  • the size of the magnetite particles is a maximum of 60 nm.
  • the suspension of the monospheres coated with magnetite is set to a temperature of 0 to 40 ° C., preferably 10 to 30 ° C., and an aqueous, vinegar-based solution is used at a pH of 7 to 9, preferably 7.5 to 8.5. acidic solution of tetraethylorthosilane metered.
  • Silane in the solution is 10 to 50, preferably 20 to 40 g Si0 2 / l.
  • the metering rate is set to 0.1 to 5 mg Si0 2 per minute and per m2 surface of the uncoated monospheres, preferably 1 to 2 g Si0 2 per minute and per m ⁇ surface.
  • the suspension is heated to 60 to 90 ° C., preferably 70 to 80 ° C., and the pH is raised to 8 to 10 with 25% ammonia solution within 30 minutes and the suspension is heated for 30 minutes. kept at this temperature and at this pH.
  • the magnetic particles coated with SiO 2 are separated off and washed free of salt with deionized water. They are then redispersed in deionized water.
  • the magnetic particles according to the invention consist of an Si0 2 core, coated with 5 to 60, preferably 20 to 40,% by weight of magnetite, based on the Si0 2 core and an SiO 2 post-coating of 5 to
  • the surface of the magnetic particles can be modified by covalently bound organic groups.
  • the silanes used for this are constructed in such a way that they have functional groups with which a reversible binding of the material to be separated off to the magnetic particles can be achieved.
  • Suitable silanizing agents are compounds of the formula I.
  • R2 R3 alkyl with 1-6 C atoms or the meaning of R '
  • X is a single bond, O, NH, CONH, NHCONH
  • the top layer of Si0 2 located on the magnetic particles has free or hydrated element-O or element-OH groups on the surface, which are accessible to a chemical reaction with the silanizing agent to form covalent silicon-oxygen-silicon compounds.
  • the magnetic particles are reacted with the silanizing agent in an aqueous-alcoholic suspension, the ratio of water to ethanol being 2.5: 1.5. Details of the silanization can be found in DE 42 33 396 and DE 43 16 814, from which the above-mentioned silanizing agents are also known.
  • the magnetic particles according to the invention can be used for the isolation of nucleic acids from aqueous solutions and for the isolation and purification of biotin and biotinylated proteins from aqueous solutions.
  • nucleic acids are bound directly to silicon dioxide, a subsequent coating of the magnetic particles, for example with silanes, is not necessary.
  • a piece of the gel treated with ethyl bromide is transferred into a suitable vessel and a silica-binding buffer with a pH of 8.0 is added.
  • the gel is resuspended and mixed with magnetic particles. After heating the suspension to 50 ° C for 10 minutes, the particles are drawn to the vessel wall with the help of a magnet and the remaining liquid is removed. After redispersing and washing the magnetic particles once with the abovementioned buffer solution, the washing is repeated with a buffer containing ethanol having a pH of 7.2.
  • the magnetic particles are then dried in one
  • Tris-HCl buffer with a pH of 8.0 resuspended and eluted after heating to 50 ° C for 5 minutes.
  • the magnetic particles are separated from the buffer solution containing the DNA in a magnetic field.
  • the buffer solutions required for the separation of DNA from aqueous solutions with the aid of magnetic particles are offered by Merck KGaA.
  • the most important components are NaCI0 4 , Tris-HCl and EDTA. This separation process has been described in more detail by the following authors: Vogelstein, B .; Gillespie, D. (1979).
  • the binding capacity of the magnetic particles according to the invention is approximately 5 ⁇ g / mg beads for DNA.
  • the binding capacity is very dependent on the substance to be isolated.
  • the spherical magnetic particles according to the invention have the advantage that they are monodisperse, non-porous and can be produced in different sizes.
  • the standard deviation from the mean diameter is less than 5%.
  • the mass ratio between the magnetic material and the other components can be adjusted within narrow limits. As a result, the particles show the same behavior in the magnetic field.
  • a 10% aqueous ammonia solution is transferred to a closed storage vessel to keep the pH constant.
  • the iron sulfate solution is then metered in over 2 hours to the monosphere dispersion heated to 20 ° C., the pH being adjusted to 7.7 by simultaneous addition of the ammonia solution. After half an hour of post-reaction, the Si0 2 coating is started.
  • the dispersion is washed five times with 6 l of completely deionized water, the sedimentation speed of the magnetic particles being accelerated by applying a magnetic field.
  • the dispersion obtained is adjusted to a mass content of 20%.
  • Particles are added to 190 ml of ethanol in order to set a volume ratio of water to ethanol of 2.5: 1.5.
  • a mixture of 57.5 g of ⁇ -aminopropyltriethoxysilane in 57.5 g of ethanol is then added.
  • the mixture is boiled under reflux for a further 10 hours, then the solvent is removed, the particles are washed with ethanol and redispersed in water, the dry matter content being adjusted to 20% by weight.
  • the magnetic particles have terminal amino groups bonded to the surface. The magnetic particles are used further in the form of the aqueous dispersion.

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Abstract

Monodisperse magnetische Partikeln einer Teilchengröße von 50 bis 1500 nm mit einem kugelförmigen Kern aus Siliciumdioxid, der punktuell mit Magnetitpartikeln einer Teilchengröße von weniger als 60 nm beschichtet ist und einer Deckschicht aus Siliciumdioxid. Die Partikeln werden für die Isolierung von Nucleinsäuren und Biotin, biotinylierten Nucleinsäuren sowie biotinylierter Proteine oder anderer mit Biotin markierter Moleküle aus wäßrigen Lösungen verwendet.

Description

Kugelförmige magnetische Partikel
Die Erfindung betrifft kugelförmige magnetische Partikel auf der Basis von monodispersen Si02-Partikeln, ihre Herstellung und ihre Verwendung.
Die Verwendung magnetischer Partikel für die Immobilisierung und Trennung von biologischen Materialien gewinnt zunehmend an Bedeutung. Im allgemeinen bestehen diese Partikel aus einem magnetischen Kern und einer Schutzschicht aus einem Metalloxid, auf der sich eine Polymer- schicht befindet, die eine reversible Bindung des biologischen Materials an die magnetischen Partikel ermöglicht.
US 4 343 901 beschreibt magnetische Partikel für die Immobilisierung von Enzymen, die aus einem anorganischen Oxid und ferromagnetischen Partikeln bestehen, die durch eine Sol-Gel-Technik erhalten werden. Die Oberfläche der kalzinierten Partikel ist mit einem vernetzten Polyamin und Glutaraldehyd imprägniert.
US 4 152 210 beschreibt eine biochemisch aktive Substanz, die aus ferro- magnetischen Partikeln und einen daran haftenden Enzym besteht. Die Partikel bestehen entweder aus mit Nickel beschichtetem Eisen oder aus gefälltem Eisenoxid. In beiden Fällen sind sie mit Aminopropyltriethoxy- silan und Glutaraldehyd beschichtet. Die Partikel werden zur Abtrennung von biologisch aktivem Material aus Fermentationslösungen eingesetzt.
US 4 280 918 beschreibt eine Dispersion magnetischer Partikel, die durch Mischen einer Dispersion von je Fe203 oder Kobalt dotiertem Fe30 mit positiver Ladung mit kolloidalem Si02 mit negativer Ladung und nachfolgender Behandlung mit Ultraschall hergestellt wird.
EP 0 343 934 beschreibt magnetische Partikel, die aus einem Kern aus einem magnetischen Material und einer Hülle aus einem anorganischen Oxid bestehen. Die Herstellung erfolgt durch Emulgieren der Lösung eines Salzes oder eines wäßrigen Sols des magnetischen Materials und einer Lösung eines Salzes oder eines wäßrigen Sols des anorganischen Oxids in einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wobei diskrete Tropfen gebildet werden. Durch Einleiten von Ammoniak werden die Tropfen in eine Gel umgewandelt, anschließend von der flüssigen Phase getrennt, entwässert und kalziniert. Die erhaltenen Partikel haben überwiegend eine kugelförmige Gestalt.
Die aus dem Stand der Technik bekannten magnetischen Partikel haben den Nachteil, daß sie keine einheitliche Größe besitzen, Agglomerate nicht verhindert werden können und das Masseverhältnis zwischen magnetischem Kern und Hüllschicht Schwankungen unterworfen ist.
Dadurch zeigen die Partikel kein einheitliches Verhalten im Magnetfeld, was sich negativ auf den Trennprozeß auswirkt.
Aufgabe der Erfindung ist es, monodisperse magnetische Partikel mit einer weitestgehend einheitlichen Größe und einem einstellbaren Verhältnis zwischen magnetischem Material und übrigen Bestandteilen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch monodisperse magnetische Partikel einer Teilchengröße von 50 bis 1500 nm, mit einem kugelförmigen Kern aus Siliciumdioxid, der punktuell mit Magnetikpartikeln einer Teilchengröße von maximal 60 nm beschichtet ist und eine Deckschicht aus Siliciumdioxid besitzt. In einer besonderen Ausführungsform sind die magnetischen Partikel in bekannter Weise silanisiert.
Weiterhin wird diese Aufgabe gemäß der Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung der magnetischen Partikel, indem in einer ersten Stufe Kieselgel-Monospher in vollentsalztem Wasser bei 20 °C dispergiert und durch Zugabe einer Lösung aus Eisen(ll)-sulfat und Eisen(lll)-sulfat mit einer Dosiergeschwindigkeit von 0,05 bis 3 mg Fe30 pro Min. und pro m2 Oberfläche der Monospher, wobei durch gleichzeitige Zugabe einer Base ein pH-Wert von 8 eingehalten wird, mit Fe304 punktuell beschichtet werden und in einer zweiten Stufe zu der Suspension der beschichteten Monospher eine wäßrige, essigsaure Tetraethylorthosilanlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 5 mg Si02 pro Min. und pro m? Oberfläche der unbeschichteten Monospher zudosiert wird, anschließend innerhalb von 30 Min. durch Zugabe einer Base die Suspension auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und nachfolgend auf 75 °C erwärmt wird und danach die erhaltenen magnetischen Partikel (Monospher-Magnetbeads) abgetrennt, mit Wasser gewaschen und bei 60 bis 100 °C, gegebenenfalls im Vakuum, getrocknet werden.
Gegebenenfalls können die erhaltenen Monospher-Magnetbeads in einer dritten Stufe nach bekannten Verfahren silanisiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen magnetischen Partikel für die Isolierung von Nucleinsäuren und Biotin sowie biotinylierter Proteine aus wäßrigen Lösungen.
Die als Ausgangsmaterial zu verwendenden kugelförmigen monodispersen Si02-Partikel sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt.
Die grundliegenden Reaktionsbedingungen zur Herstellung von Si02- Partikeln durch hydrolytische Polykondensation sind beispielsweise aus den Publikationen von W. Stöber et al. in J. Colloid and Interface Science 26, 52(1968) und 30, 568(1969) sowie dem US-Patent 3,634,588 zu entnehmen. Die so hergestellten Partikel zeigen aber oft große Standardabweichungen für die Teilchendurchmesser und weisen eine gewisse Porosität auf.
Für die Herstellung von hochmonodispersen, unporösen, kugelförmigen Sι02-Partιkeln, die eine Standardabweichung von nicht mehr als 5 % aufweisen, wird auf EP 0 216 278 hingewiesen, die ein entsprechend abgestelltes Herstellungsverfahren auf Basis von hydrolytischer Poly- kondensation offenbart. Kern dieses Verfahrens, das für die Herstellung der Sι02-Partιkel gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt wird, ist eine zweistufige Vorgehensweise Hierbei wird zunächst durch hydrolytische Polykondensation von Tetraalkoxysilanen in wäßπg-alkahsch-ammonia- kahschem Medium ein Sol bzw eine Suspension von Pπmarteilchen gebildet, die man daran anschließend durch dosierte Zugabe von weiterem Tetraalkoxysilan auf die gewünschte Endgröße bringt. Das Verfahren zur Herstellung von hoch monodispersen, unporösen kugelförmigen Siθ2-Partikel erfolgt in zwei Schritten.
In einem ersten Schritt wird zunächst ein Sol von Primärteilchen herge- stellt. Hierzu wird das Tetraalkoxysilan in ein wäßrig-alkoholisch-ammo- niakalisches Hydrolysegemisch gebracht und innig durchmischt. Als geeignete Tetraalkoxysilane können alle problemlos hydrolysierbaren Kieselsäureorthoester aliphatischer Alkohole eingesetzt werden. In erster Linie kommen hierbei die Ester aliphatischer Alkohole mit 1-5 C-Atomen in Betracht wie etwa von Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol sowie der isomeren Butanole und Pentanole. Diese können einzeln, aber auch im Gemisch eingesetzt werden. Bevorzugt sind die Kieselsäureorthoester der CrC3-Alkohole, insbesondere Tetraethoxysilan. Das Hydrolysegemisch sollte neben aliphatischen Alkoholen einen Gehalt von etwa 0,5 bis etwa 8 mol/l Ammoniak und von etwa 1 bis etwa 15 mol/l Wasser auf wei seo Als Alkoholkomponente sind geeignet, aliphatische CrC3-Alkohole, bevorzugt CrC3-Alkohole wie Methanol, Ethanol sowie n- oder i-Propanol. Diese können einzeln, aber auch im Gemisch miteinander im Hydrolysegemisch vorliegen Die Zugabe des Tetraalkoxysilans zum Hydrolysegemisch erfolgt vorzugsweise in einer Portion, wobei der Reaktand in reiner Form oder auch in Lösung in einem der genannten Alkohole vorliegen kann. Zur Erzeugung der Pnmärteilchen kann eine Konzentration von Tetraalkoxysilan im Hydrolysegemisch zwischen etwa 0,01 bis etwa 1 mol/l gewählt werden. Nach dem Zusammenbringen der Reaktanden setzt die Reaktion sofort oder nach wenigen Minuten ein, was sich durch eine alsbaldige
Opaleszenz bzw. Trübung des Reaktionsgemisches durch die entstehenden Teilchen zeigt Nach im allgemeinen nicht mehr als 15-30 Minuten, in ungünstigen Spezialfallen auch langer, ist die Reaktion abgelaufen. Je nach Wahl der Reaktanden sowie ihrer Konzentrationen im Reaktions- gemisch lassen sich in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren Teilchen mit mittlerem Durchmesser zwischen etwa 0,01 und etwa 2 μm erhalten Bevorzugt wird in diesem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Reaktionsgemischen gearbeitet, die 3-13 mol/l Wasser, 0,5 bis 4,5 mol/l Ammoniak, 10 bis 25 mol/l Alkohol und 0,1-0,5 mol/l Tetraalkoxysilan enthalten. Man erhält hierbei Primärteilchen mit mittleren Durch- messern zwischen 0,01 und 1 μm. In diesem Stadium können dem Sol von Primärteilchen Proben entnommen werden, um die Teilchen beispielsweise mit Hilfe der Elektronenmikroskopie auf ihre Teilchengröße, Formtreue und Teilchengrößenverteilung zu untersuchen.
Durch Isolation von Teilchenproben besteht die Möglichkeit, die Porosität der Primarteilchen beispielsweise durch Gasadsorptionsmessung zu bestimmen.
Als vorteilhaft hat sich erwiesen, die Reaktion zur Erzeugung der Primär- teilchen bei höherer Temperatur durchzuführen. Günstig sind hierbei Temperaturen zwischen 35 und 75 °C, vorzugsweise zwischen 40 und 65 °C. Es zeigte sich, daß bei erhöhter Temperatur die Teilchengrößenstreuung abnimmt, allerdings auch die mittlere Teilchengröße. Bei niedrigeren Temperaturen, d.h. um Raumtemperatur, erhält man bei sonst gleichen Bedin- gungen größere Teilchen mit höherer Größenstreuung. Weiterhin ist hier auch vermehrt unerwünschte Agglomeratbildung zu verzeichnen.
Im zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt bei gleichmäßiger Durchmischung ein langsames, kontinuierliches Zudosieren von weiterem Tetra- alkoxysilan zu dem Sol von Primärteitchen. Hierbei ist es wesentlich, daß die Geschwindigkeit des Zudosierens so gesteuert wird, daß ein sofortiges, vollständiges Abreagieren mit den im Sol vorliegenden Teilchen erfolgt, ohne daß ein Überschuß Tetraalkoxysilan entsteht, aus dem sich Keime für neue Primärteilchen bilden können. Unter dieser Verfahrens- maßnähme des nach Maßgabe des Abreagierens kontrollierten Zudosierens von Tetraalkoxysilan wird ein gesteuertes Nachwachsen der Teilchen im Sol erreicht, wobei sich die letztendlich zu erzielende Teilchengröße nach der Menge des insgesamt zugesetzten Tetraalkoxysilans richtet. Die Menge des insgesamt zuzusetzenden Alkoxysilans ist im Prinzip unkri- tisch, solange das Hydrolysegemisch im Überschuß vorhanden ist, bzw. - b -
durch eventuelles Nachgeben von Hydrolysegemisch im Überschuß gehalten wird. Ein zeitliches Limit bei der Zugabe des Tetraalkoxysilans ist nicht gesetzt; die Zugabe kann sich über Stunden bis Tage erstrecken. Auch Unterbrechungen und Wiederaufnahme des Nachwachsens sind möglich, da die Teilchen in allen Stadien ihres Wachstums stabil sind.
Auch im Nachwachsvorgang wird bevorzugt bei erhöhter Temperatur, etwa um 40 °C, gearbeitet.
Nach diesem Verfahren können monodisperse kugelförmige Kieselsäure- Partikel mit einer Partikelgröße von 50 bis 1500 nm hergestellt werden, wobei eine gewünschte Größe sehr genau einstellbar ist, da die Standardabweichung vom mittleren Teilchendurchmesser nur 2 bis 5 % beträgt.
Die punktförmige Beschichtung der Kieselsäure-Monospher mit Magnetit erfolgt durch Ausfällen aus einer Lösung von Eisen(ll)- und Eisen(lll)- salzen, bevorzugt aus einer Lösung von Eisen(ll)- und Eisen(lll)-sulfat. Das Mol-Verhältnis zwischen dem zweiwertigen und dreiwertigen Eisensalz ist 1 :1. Es ist zu beachten, daß die Fällungslösungen vor Oxidation geschützt werden müssen. Während der Fällung ist die Gegenwart von Oxidations- oder Reduktionsmitteln nicht erforderlich.
Der pH-Wert der Monospherdispersion wird für die Fällung des magnetischen Fe304 (Magnetit) auf Werte zwischen 7 bis 9, bevorzugt 7,5 bis 8,5 eingestellt. Der pH-Wert wird während der Fällungsreaktion durch Zugabe einer Base konstant gehalten, bevorzugt wird 25%ige wäßrige Ammoniaklösung verwendet. Die Temperatur der Suspension wird auf 0 bis 40 °C eingestellt.
Die Dosiergeschwindigkeit der Eisen(ll)-Eisen(lll)-salzlösung liegt zwi- sehen 0,05 bis 3 mg Fe304 pro Min. und pro ms Oberfläche, bevorzugt zwischen 0,2 bis 1 mg Fe304 pro Min. und pro ms Oberfläche der Monospher. Unter den angegebenen Bedingungen erfolgt eine punktförmige Abscheidung des Magnetits auf der Oberfläche der Monospher. Die Größe der Magnetitpartikel beträgt maximal 60 nm.
Die weitere Beschichtung der magnetischen Partikel mit Si02 erfolgt durch
Hydrolyse von Tetraalkylorthosilanen, bevorzugt Tetraethylorthosilan. Hierfür wird die Suspension der mit Magnetit beschichteten Monospher auf eine Temperatur von 0 bis 40 °C, bevorzugt 10 bis 30 °C eingestellt und bei einem pH-Wert von 7 bis 9, bevorzugt 7,5 bis 8,5 eine wäßrige, essig- saure Lösung von Tetraethylorthosilan zudosiert. Die Konzentration des
Silans in der Lösung beträgt 10 bis 50, bevorzugt 20 bis 40 g Si02/l. Die Dosiergeschwindigkeit wird auf 0,1 bis 5 mg Si02 pro Min. und pro m2 Oberfläche der unbeschichteten Monospher, bevorzugt 1 bis 2 g Si02 pro Min. und pro m≥ Oberfläche eingestellt. Nach dem Beenden des Zu- dosierens wird die Suspension auf 60 bis 90 °C, bevorzugt 70 bis 80 °C erwärmt und der pH-Wert innerhalb von 30 Min. auf 8 bis 10 mit 25%iger Ammoniaklösung angehoben und die Suspension 30 Min. bei dieser Temperatur und bei diesem pH-Wert gehalten. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden die mit Si02 beschichteten magnetischen Partikel abge- trennt und mit vollentsalztem Wasser salzfrei gewaschen. Anschließend werden sie in vollentsalztem Wasser redispergiert.
Die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel bestehen aus einem Si02-Kern, beschichtet mit 5 bis 60, bevorzugt 20 bis 40 Gew.-% Magnetit, bezogen auf den Si02-Kern und einer Si02-Nachbeschichtung von 5 bis
30, bevorzugt 10 bis 20 Gew.-% Si02, bezogen auf den Si02-Kern.
In einer besonderen Ausführungsform kann die Oberfläche der magnetischen Partikel durch kovalent gebundene organische Gruppen modifiziert werden. Die hierfür verwendeten Silane sind so konstruiert, daß sie funk- tionelle Gruppen aufweisen, mit denen sich eine reversible Bindung des abzutrennenden Materials an die magnetischen Partikel erreichen läßt. Geeignete Silanisierungsmittel sind Verbindungen der Formel I
[R"R2R3]Si-(CH2)ι-X-R4 (I) worin
Ri Cl oder Alkoxy mit 1-6 C-Atomen
R2, R3 Alkyl mit 1-6 C-Atomen oder die Bedeutung von R'
1 die Zahlen 1-6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
-Z
Figure imgf000010_0001
I
(CH2) -C-Z o
Figure imgf000010_0002
Z = OR oder zwei Reste Z gemeinsam -o- • / NR und m, n die Zahlen 0-6,
oder
CR'R" II -C-COOR
wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R*. R" = H oder Alkyl mit 1 -6 C-Atomen. Die auf den magnetischen Partikeln befindliche Deckschicht aus Si02 besitzt freie oder hydratisierte Element-O- oder Element-OH-Gruppen an der Oberfläche, die einer chemischen Reaktion mit dem Silanisierungsmittel unter Ausbildung kovalenter Silicium-Sauerstoff-Siliciumverbin- düngen zugänglich sind. Die magnetischen Partikel werden in einer wäßrigen-alkoholischen Suspension, wobei das Verhältnis von Wasser zu Ethanol 2,5:1 ,5 beträgt, mit dem Silanisierungsmittel umgesetzt. Einzelheiten der Silanisierung können DE 42 33 396 und DE 43 16 814 entnommen werden, aus denen auch die obengenannten Silanisierungsmittel bekannt sind.
Die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel können für die Isolierung von Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen und für die Isolierung und Aufreinigung von Biotin und biotinylierten Proteinen aus wässrigen Lösungen verwendet werden.
Da Nucleinsäuren direkt an Siliciumdioxid gebunden werden, ist eine Nachbeschichtung der magnetischen Partikel, beispielsweise mit Silanen, nicht erforderlich.
Für die Extraktion von DNA aus Agarose-Gel wird ein Stück des mit Ethi- diumbromid behandelten Gels in ein geeignetes Gefäß überführt und ein Silica bindender Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 zugegeben. Das Gel wird resuspendiert und mit magnetischen Partikeln vermischt. Nach Erwär- men der Suspension auf 50 °C für 10 Min. werden mit Hilfe eines Magneten die Partikel an die Gefäßwand gezogen und die verbleibende Flüssigkeit entfernt. Nach einmaligem Redispergieren und Waschen der magnetischen Partikel mit der obengenannten Pufferlösung wird das Waschen mit einem Ethanol enthaltenden Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 wieder- holt. Anschließend werden die magnetischen Partikel getrocknet, in einem
Tris-HCI Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 resuspendiert und nach Erwärmen auf 50 °C für 5 Min. elυiert. Die magnetischen Partikel werden von der Pufferlösung, die die DNA enthält, im Magnetfeld abgetrennt. Die Pufferlösungen, die für die Abtrennung von DNA aus wäßrigen Lösungen mit Hilfe magnetischer Partikel benötigt werden, werden von der Merck KGaA angeboten. Sie enthalten als wesentlichste Bestandteile NaCI04, Tris-HCI und EDTA. Dieses Trennverfahren ist von folgenden Autoren näher beschrieben worden: Vogelstein, B.; Gillespie, D. (1979).
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Für die Isolierung und Aufreinigung von Biotin und biotinylierten Proteinen oder Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen mit Hilfe von magnetischen Partikeln, an die Streptavidin gekoppelt ist, ist eine Modifizierung der Oberfläche der magnetischen Partikel mit organischen Gruppen notwendig. Hierfür sind die oben erwähnten Silane, beispielsweise γ-Aminopro- pylsilan, geeignet. Die Kopplung von Streptavidin wird noch verbessert, wenn nach der Silanisierung der Si02-Oberfläche noch eine Modifikation mit Aziacton erfolgt. Dieses Verfahren für die Gewinnung von Biotin und biotinylierten Proteinen oder Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen wird von folgenden Autoren näher beschrieben: Hultman T, Stahl S, Hornes E, Uhlen M. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Aeids Research 1989; 17(13):4937-4946; Ahmed ARH, Olivier GWJ, Adams G, Erskine ME, Kinsman RG, Branch SK, Moss SH, Notarianni LJ, Pouton CW. Isolation and partial purification of a melaπocyte-stimulating hormone receptor from B16 murine melanoma cells; A novel approach using a cleavable biotiny- lated photoactivated ligand and streptavidin-coated magnetic beads.
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Die Bindekapazität der erfindungsgemäßen magnetischen Partikel liegt für DNA bei ca. 5 μg/mg Beads. Für die Streptavidin beschichteten Partikel ist die Bindekapazität sehr stark abhängig von der zu isolierenden Substanz.
Die erfindungsgemäßen kugelförmigen magnetischen Partikel haben den Vorteil, daß sie monodispers, unporös und in verschiedenen Größen her- stellbar sind. Die Standardabweichung vom mittleren Durchmesser beträgt weniger als 5 %. Das Masseverhältnis zwischen dem magnetischen Material und den übrigen Bestandteilen ist in engen Grenzen einstellbar. Dadurch zeigen die Partikel ein gleiches Verhalten im Magnetfeld.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu begrenzen.
Beispiel 1
700 g Monospher (bez. auf Si02-Gehalt) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 500 nm werden unter Rühren in 1500 g vollentsalztes Wasser eingeführt und das Gemisch eine Stunde mit einem Ultra-Torrax dispergiert. Anschließend wird mit 1 1800 g vollentsalztem Wasser die Dispersion auf einen Si02-Gehalt von 5 % eingestellt und auf 20 °C terπpe- riert.
210 g Eisen(ll)-sultat-heptahydrat (Artikel-Nr. von Merck KGaA: 1.03965) und 380 g Eisen(lll)-sulfathydrat 80 % (Artikel-Nr. von Merck KGaA: 3926) werden unter Rühren in 4500 g vollentsalztem Wasser gelöst und in ein verschließbares Vorratsgefäß gegeben.
Weiterhin wird eine 10%ige wäßrige Ammoniaklösung zur Konstanthaltung des pH-Wertes in ein geschlossenes Vorratsgefäß überführt. Die Eisensulfatlösung wird nun innerhalb von 2 Stunden zu der auf 20 °C temperierten Monospherdispersion zudosiert, wobei durch gleichzeitige Zugabe der Ammoniaklösung der pH-Wert auf 7,7 eingestellt wird. Nach einer halben Stunde Nachreaktion wird mit der Si02-Beschichtung begon- nen.
350 g Tetraethylorthosilan werden unter Rühren in einer geschlossenen Apparatur in einem Gemisch aus 290 g Eisessig und 2275 g vollentsalztem Wasser innerhalb von 30 Min. gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 120 ml/Min. der Dispersion der mit Magnetit beschichteten Monospher zudosiert. Danach wird innerhalb von 30 Min. der pH-Wert mit der wäßrigen Ammoniaklösung auf 9,0 angehoben und die Dispersion auf 75 °C erwärmt und für 30 Min. auf diesem Wert gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Dispersion aufgearbeitet.
Innerhalb von 8 Stunden wird die Dispersion fünfmal dekantierend mit 6 I vollentsalztem Wasser gewaschen, wobei die Sedimentationsgeschwindigkeit der magnetischen Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes beschleunigt wird. Die erhaltene Dispersion wird auf einen Massegehalt von 20 % eingestellt.
Beispiel 2
Zu 400 ml einer nach Beispiel 1 erhaltenen Suspension magnetischer
Partikel werden 190 ml Ethanol zugesetzt, um ein Volumenverhältnis von Wasser zu Ethanol von 2,5:1 ,5 einzustellen. Dann wird ein Gemisch von 57,5 g γ-Aminopropyltriethoxysilan in 57,5 g Ethanol zugesetzt. Es wird noch 10 Stunden am Rückfluß gekocht, danach das Lösungsmittel ent- fernt, die Partikel mit Ethanol gewaschen und in Wasser redispergiert, wobei der Gehalt an Trockensubstanz auf 20 Gew.-% eingestellt wird. Die magnetischen Partikel besitzen an der Oberfläche gebundene endständige Amino-Gruppen. Die weitere Verwendung der magnetischen Partikel erfolgt in Form der wäßrigen Dispersion.

Claims

8/12717 . -, 3 .Patentansprüche
1. Monodisperse magnetische Partikel einer Teilchengröße von 50 bis 1500 nm mit einem kugelförmigen Kern aus Siliciumdioxid, der punktuell mit Magnetitpartikeln einer Teilchengröße von weniger als
60 nm beschichtet ist und darauf eine Deckschicht aus Siliciumdioxid besitzt.
2. Partikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Verbindung der Formel I
[RiR2R3]Si-(CH2)rX-R4 (I)
worin
R* Cl oder Alkoxy mit 1 -6 C-Atomen
R≥, Ra Alkyl mit 1 -6 C-Atomen oder die Bedeutung von R'
1 die Zahlen 1 -6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
Figure imgf000015_0001
-Y
I
(CH2) -C-Z o
Figure imgf000015_0002
Z = OR oder zwei Reste Z gemeinsam — 0- - / NR und m, n die Zahlen 0-6, oder
CR'R"
II -C-COOR
wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R\ R" = H oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen modifiziert sind.
3. Verfahren zur Herstellung monodisperser magnetischer Partikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß in einer ersten Stufe Kieselgel-Monospher in vollentsalztem Wasser bei 20 °C dispergiert und durch Zugabe einer Lösung von Eisen(ll)-sulfat und Eisen(lll)- sulfat mit einer Dosiergeschwindigkeit von 0,05 bis 3 mg Fe304 pro Min. und pro m2 Oberfläche der Monospher, wobei durch Zugabe einer Base ein pH-Wert von 8 eingehalten wird, mit Fe304 punktuell beschichtet werden und in einer zweiten Stufe zu der Suspension der beschichteten Monospher eine wäßrige, essigsaure Tetraalkylortho- silanlösung mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 5 mg Si02 pro Min. und pro m Oberfläche der unbeschichteten Monospher zudosiert wird, anschließend die Suspension auf 75 °C erwärmt und innerhalb von 30 Min. durch Zugabe einer Base auf einen pH-Wert von 9 ein- gestellt wird und danach die erhaltenen magnetischen Partikel abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in vollentsalztem Wasser redis- pergiert werden.
4. Verfahren zur Herstellung monodisperser magnetischer Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Dispersion der magnetischen Partikel Ethanol in einer Menge zugegeben wird, bis ein Volumenverhältnis von Wasser zu Ethanol von 2:1 ,5 erreicht ist und anschließend in einer ethanolischen Lösung eine Verbindung der Formel I
[R*R2R3]Si-(CH2)rX-R4 (I)
worin
R' Cl oder Alkoxy mit 1 -6 C-Atomen
R2, R3 Alkyl mit 1 -6 C-Atomen oder die Bedeutung von R'
1 die Zahlen 1 -6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
-Z
Figure imgf000017_0001
I
(CH2) -C-Z o
Figure imgf000017_0002
Z = 0R oder zwei Reste Z gemeinsam -0- 'NR
und m, n die Zahlen 0-6,
oder
CR'R"
II -C-COOR wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R\ R" = H oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen, zugegeben wird und nach Kochen am Rückfluß für 5 bis 24 Stunden die modifizierten magnetischen Partikel abgetrennt, gewaschen und in vollentsalztem Wasser redispergiert werden.
Verwendung der magnetischen Partikel nach den Ansprüchen 1 oder
2 für die Isolierung von Nucleinsäuren und Biotin sowie biotinylierter Proteine aus wäßrigen Lösungen.
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