WO1998006422A1

WO1998006422A1 - Hematopoietic stem cell proliferating agents

Info

Publication number: WO1998006422A1
Application number: PCT/JP1997/002818
Authority: WO
Inventors: Yoshimasa Saito; Yoshiko Ueda; Kouichi Tamura; Yoko Takada; Choji Yamada; Tatsuo Yamashita; Masakazu Kobayashi
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 1999-02-13
Also published as: US20030068820A1; US6495365B1; US20030113912A1; EP0953354A1; US7037892B2; EP0953354A4

Description

明細書

造血幹細胞増殖剤技術分野

本発明は、造血幹細胞の増殖剤および增殖方法に関する。詳細には、インシュリン成長因子 I単独もしくは各種のコロニー刺激因子ゃ增殖因子と組み合わせてなる造血幹細胞の增殖剤および増殖方法に関する。背景技術

血液系に関する増殖因子は種々検討されており、赤血球の増殖剤としてエリスロポイエチン（EPO) 、白血球の増殖剤として頼粒球コロニー刺激因子（G— CS F) 等が実用化されている。造血幹細胞の増殖方法については、幹細胞增殖因子（SCF) 、マクロファージコロニー刺激因子（M— CS F) 等の様々なサィトカインについて種々検討されてきたが、造血幹細胞を未分化なまま十分に增殖させることはできなかった。

本発明者等は鋭意研究の結果、インシユリン様成長因子 I ( I G F— I ) を SCF, M-C S F及び G— CS Fから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と併用することにより、造血幹細胞を未分化なまま十分に増殖させることができることを見いだし、本発明を完成した。発明の開示

本発明は、 I GF— Iを含有する造血幹細胞の増殖剤、 SCF、 M— CS F及び G— CS Fから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と I GF— I とを含む造血幹細胞の増殖剤、及び、 SCF、 M— CSF及び G— CS Fから選択された少なくとも】種類の蛋白質と I GF—〖を含む培地で、造血幹細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増殖方法に係わる。さらに、本発明は、 I GF— 1単独もしくは 1 GF— Iを SCF、 M— CS F及び G— CS Fから選択された少なくとも 1つの蛋白質組み合わせてなる哺乳動物の造血幹細胞の増殖方法に関するものである。本発明の造血幹細胞の増殖剤または増殖方法を用いることにより、造 ώι幹細胞を未分化なまま、体內または体外で増殖させることができるので、放射線治療や制ガン剤等の化学療法剤による血球減少症の改善、リンパ球減少に起因する感染症の予防、骨髄形成不全症や骨髄抑制等の骨髄疾患の治療、白血病.高度 W障害 · 骨髄抑制等の骨髄疾患の治療、骨髄移植時におけるエングラフメント生着率の改善、遣伝的疾患に由来する低血球症の治療、 in vitro における造血幹細胞の培養 ·增菔、遣伝子治療時における組換え幹細胞の体外培養等に用いることができる。

本発明で使用される I G F— I としては、遣伝子組换ぇ技術（例えば I G F 一 Iは特開昭 61-1396号公報参照）、ペプチド合成法、細胞培養法等により製造されたヒト、ゥシ等の哺乳動物由来の蛋白質が含まれ、さらに遣伝子組み換え技術などにより製造された I G F— Iのァミノ酸配列の 1部がァミノ酸の匱换、挿入、付加、欠失した I G F— I活性を有する変異蛋白質（例えば W089/05822 公報参照）も含まれる。

本発明で使用される S C F、 M—C S Fまたは G— C S Fとしては、遺伝子組換え技術、ペプチド合成法、細胞培養法等により製造されたヒト、ゥシ等の喃乳動物由来の蛋白質が含まれ、さらに遗伝子組み換え技術などにより製造された S C F、 M - C S Fまたは G— C S Fのァミノ酸配列の一部がァミノ酸の置換、挿入、付加、欠失した S C F、 M— C S Fまたは G— C S Fの活性を有する変異蛋白質も含まれる。また、糖鎖が存在していてもいなくても良い。

本発明の造血幹細胞增殖剤は I G F— 1と S C F、 M— C S Fまたは G— C S Fとを併用する場合、それらが体内に同時に存在する状態になる様、投与される限り、これらの製剤、投与順序、投与経路は特に制限はない。例えば、両者またはそれ以上の成分が混合された製剤として投与してもよいし、別々の製剤として同時にまたは別々に、同一経路または別個の経路で投与してもよい。

本発明の造血幹細胞增殖剤は、 I G F— Iは単独で、または S C F， M - C S Fまたは G— C S Fから選択された少なくとも 1種類以上の蛋白質を含み、さらに担体（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖注射液など）、安定化剤（例えば、アルブミン、クェン酸ナトリウム、アルギニン、デキストランなど）、 pH調整剤（例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、その他の添加剤とともに、通常、経口剤あるいは非経口剤、例えば注射剤、点滴剤、経皮剤、経獒剤、外用剤、坐剤などとして調製される。 ¾該製剤には、さらに SCF、 M— CSF、 G— CSF、 E P Oおよび I L— 3等の増殖因子を一種または 2種以上配合させてもよい。

当該造血幹細胞增舷剤の投与量は、患者の体重、性別、症状などより異なる力；、一般に成人 1回当たり I GF— I力 i 1 〜1000 g/kg体重程度で、好ましくは 5〜500/i gZk g体重程度であり、また、 SCF、 M— CS Fまたは G— CS Fを併用する場合は S CF、 M— CS Fまたは G— CS Fは I GF— I と同量もしくは、 0. 0 :1〜 100倍の量で配合しうる。

当該造血幹細胞增殖剤の投与経路としては、経口あるいは非経口、例えば静注、点滴静注、皮下注、冠動脈內投与、経皮、経鼻、直腸内投与などが挙げられる。

I GF— I と SCF、 M-C S Fまたは G— C S Fは、同一の製剤中に酉 Ϊ1合しても良いが、別の製剤の形で別々または同時に、同一経路または別個の経路により投与される。別々に投与する場合、どちらを先に投与してもよレ、。

本発明の造血幹細胞増殖剤を放射線治療や制ガン剤等の化学療法剤による血球減少症の改善に用いるときは、本発明の造血幹細胞増殖剤を単独で用いてもよいし、さらに E POや M— C S F、 SCF、 I L _ 3及び G— C S F等と同時に用いても良い。リンパ球减少に起因する感染症の予防に用いるには、 GM— CS F等を同時に用いても良い。さらに、骨髄形成不全症や骨髄抑制等の骨髄疾患の治療、白血病 ·髙度臂障害 ·骨雠抑制等の骨髄疾患の治療、骨髓移植時におけるエングラフメント生着率の改善、遗伝的疾患に由来する低血球症の治療においては、必要により EPO、 G— CS Fや GM— CS F等の適当な増殖因子を組み合わせて用いても良い,，

また、 in vitro における造血幹細胞の培赛 ·增殖、遣伝子治療時における糾換え幹細胞の体外培養等にぉレ、ても他の適当な増殖因子を組み合わせて用いることができる。 in vitro における骨髄細胞の培赛は基本的に新生化学実験講座 1 8 細胞培養技術（日本生化学会編、東京化学同人発行、 1989) に'準じて行うこ 1

とがで +-> きる。例えば RD培地（RPMI1640:D EM=1:1(V/V)混合培地）等を用い、ィンスリン、トランスフェリン、 2—メ Λ ^カプトエタノ一、エタノールァミン、亜セレン酸および HEPE S等とともに、さらに SCF (1〜1000/i gZm I )、 M— C S F (1 〜1000μ g/m 1 ) 及び G— C S F (1〜1000 / g/m 1 ) から遴択された少なくとも 1種類の蛋白質と I GF— I (1〜100ϋμ gZm 1 ) を添加し、 CO 2インキュベータ—を用いて培赛することができる。明を実施するための最良の形態

本発明をより詳細に説明するために、以下の実施例に従ってこれを説明する。実施例 1 造血幹細胞の取得

雄性 C57BLマウス（10匹）の大腿骨から α-ΜΕΜ培地（5 ml, 日研生物医学研究所）を用いて骨髄細胞を採取した。浮遊液を遠心（1,200 rpm, 10 分）して上淸を吸引除去し，細胞を 10 % FCSを含む _α- EM培地（5 ml)に浮遊させた。この操作で，マウス一匹あたり約 3X 10⁷個の骨髄細胞が得られた。

実施例 2 FACS

得られた骨髄細胞から Fac-Scanフ口一サイトメ一ター（Becton - Dickinson) により， Sea - 1+, Lin" c-kit⁺細胞を集めた。用いた標識抗体を表 1に示す。この様に分画した細胞群がマウスの造血幹細胞を含むことはで文献的に公知である [Okada, S. et el. (1992) Blood 80, 3044 - 3050]。

表 1 FACSに用 1/、た標識抗体

マ一力一標識抗体特異性

し in ピオチン化抗 CD3 ί (クローン 500Α2) T細胞

ビォチン化抗 CD45R (Β220) B細胞

ビォチン化抗マゥス赤血球（TER119) 赤血球

ピオチン化抗 CDllb(Mac-l) 単球/マクロファージピオチン化抗骨髄球分化抗原 (Grl) 顆粒球

Sc& - 1 PE搮識抗マゥス SCA-1 (E13-161.7) 幹細胞

PITC標識抗マウス CD117(3CI) SCF受容体実施例 3 I G F- Iの作用

造血幹細胞を 50個/ Ο % FCS- a- MEM (ΙΟΟμ 1)Zゥエルになるように 96ゥェル U底マイクロタイタープレート（ヌンク，デンマーク）に移した。

各ゥエルに I G F— I (メカセノレミン，遗伝子組換え，藤沢薬品）（lOOng/ml), S C F (遣伝子組换え， Genzyme) (1.5, 3.0, 6.0, 12.5, 25ng/ml) + I G F— I (100 ng/ml), M-C S F (遣伝子組換え， R&Dシステム）（0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10, 30, 100 ng/ml) + I G F— I (100 ng/ml)を加え， 37 の C0₂インキュべ—ターにて， 10日間培養した。

培養 6日後に，各ゥヱルの細胞数をカウン卜した。

培恭 10 日後に，各ゥヱルから培養液をァスピレーシヨンにて除き，細胞質内のァシッドフォスファタ一ゼを文献記載の方法で定量した [Ueda et al. (1994) Neurosci. Lett. , 165, 203 207]。

実施例 4 結果

得られた結果を表 2にまとめた。

表 2 IGF— Iと SCFまたは M - CSFとの併用による効果

ND:検出限界以下表 2から明らかなように， I G F— Iは S CFまたは M— CS Fと併用することにより実施例 2で分画した骨髄細胞の細胞質内ァシッドフォスファターゼ活性を増加させている。細胞質内ァシッドフォスファターゼ活性は細胞数の増加に対応していることが知られている。従って， I G F— Iは S C Fまたは M—C S F と併用することにより造血幹細胞増殖作用を示していることは明らかである。 S C F及び M— C S Fは各々単独では，造血幹細胞の增殖作用を示さないことは文献的に公知であり [Okada, S. et a J. ( 1992) Blood 80， 3044-3050] , 発明者も確認した。突施例 5 FACS

実施例 2と同様の操作にて， LirT, Sea - 1 +, c-kit⁺. CD34—細胞を集めた。 CD34一の細胞を選別するために新たにビォチン化抗マウス CD34 (RAM34) (ファーミジェン， San Diego, CA) を用いた。得られた細胞全骨髄細胞の約 0. 04 %であった。この細胞群が，造血幹細胞であることは文献的に公知である（大沢. 屮内 1995 年日本分子生化学会 S4B-3；大沢ら 1995年血液幹細胞シンポジウム講演要旨集）。実施例 6 I G F - 1の効果

ACDUにより実施例 5で得た細胞を各 1個づっ 96ゥエルのプレー卜に移し，約 50ゥヱルづっを一群とした。

各ゥエルに S C F (25ng/ml) + I G F - I (100 ng/ml) , M— C S F ( 100 ng/ml) + I G F - I (100 ng/ml) , S C F (25ng/ml) + 11,-3 (10 ng/ml )を加え， 37\の C0₂インキュベータ一にて， 10日問培養した。

培養 6日後に，各ゥエルの細胞数をカウントした。

培養 10 日後に，各ゥ-ルから培養液をァスピレーシヨンにて除き，細胞質内のアシッドフォスファターゼを定量した。実施例 7 結果

得られた結果を表 3にまとめた。表 3 単一細胞に対する IGF-Iと SCFまたは M - CSFとの併用効果

NT:カウン卜せず表 3から明らかなように， I GF— Iは S CFまたは M— CS Fとの併 /Πにより 1個の造血幹細胞を増殖させる作用を有している。実施例 8 免疫染色

実施例 2と同様にして、 Sea- 1⁺， Lin" c-kit+細胞を集めた。得られた細胞を 1 00個 Zウエルチヤンバースライド（Lab- Tek、ヌンク社）にまいた。增殖因子 [ I G F— I (lOOng/ml) , SCF (25ng/ml) を含む 1 0 % F C S— α -MEM (Ιθθμ l) とともに 3 71の C Ο ₂インキュベーターにて、 8日間培赛した。

培養した細胞をアセトン（一 20¾：) でスライド上に固定した。 1 %B S A 一リン酸緩衝液で非特異的な結合を抑え、表 4に示す抗体で処理した。

いずれの抗体によっても染色されず、特定の細胞種に分化する傾向のないことがわかった。 I GF— 1と SCFの併用による増殖効果は幹細胞の分化による增殖ではなく、未分化のままで増殖である。

表 4 FACSに用いた標識抗体

マ一力一標識抗体特異性

し in ビォチン化抗 CD3 ί (クローン 500Λ2) T細胞

ビォチン化抗 CD 5R(B220〉 B細胞

ビォチン化抗マウス赤血球（TER119) 赤血球

ビォチン化抗 CDllbOtec - 1) 単球 Zマクロファージピオチン化抗骨髄球分化抗原 (Grl) 頼粒球

Sca-1 PE標識抗マゥス SCA- 1 (E13-161.7) 幹細胞実施例 9 ヒ卜G— CSFとヒト I GF— Iの作用

造血幹細胞を 50個 Zl 0%FCS— a— MEM (l00/ 1 ) ゥヱルになるように 96ゥエル U底マイクロタイタ一プレート（ヌンク、デンマーク）に移した。

各ウエノレにヒト I GF— I (メカセルミン、遺伝子組み換え、藤沢薬品工業） ( 100 n g/m 1 ) 、ヒト G— C S F (遣伝子組み換え、 R&D s y s t e m) ( 5 , 50 500m g / 1 ) + I G F - I (100η g /m 1 ) を加え、 37t の CO ₂インキュベータ一にて、赛した。

培養 7日後に、各ゥエルから培溶液をァスビレ一シヨンにて除き、細胞質内のァシッドフォスファタ一ゼを文献記載の方法（Ueda et al. (1994) Neurosci. Lett.. 165, 203-207) で定量した。実施例 10 結果

得られた結果を表 5にまとめた。表 5

表 5から明らかなように、 I GF— Iは G— CS Fと併用する事により実施例 2で分画した骨髄細胞の細胞質內ァシッドフォスファタ一ゼ活性を増加させている。細胞質内ァシッドフォスファタ一ゼ活性は細胞数と正の相関性があることが知られている。従って、 1 G F— Iは G— C S Fと併用することにより造血幹細胞增殖作用を示していることは明らかである。 G— C S Fは単独で、効果は見られな力つた。実施例 1 1 ヒト S CFとヒト I G F— Iの作用

造血幹細胞を 5 0個ノ 1 0%FC S—ひ一 MEM (100 μ 1 ) Ζゥエルになるように 9 6ゥエル U底マイクロタイタープレート（ヌンク、デンマーク）に移した。

各ゥエルにヒト S CF (遣伝子組み換え、 R&D s y s t e m) ( 5、 50、 500m g/m 1 ) + I GF— I (100η g/m 1 ) を加え、 3 7。Cの C0₂インキュべ—ターにて、培凝した。

培養 7日後に、各ゥュルの血球数をカウントした。実施例 1 2 結果

得られた結果を表 6にまとめた。表 6

S C F (ng/ml) 平均士 SE 平均土 SE

(1GF-I lOOng/ml) (IGF-I Ong/ml)

800 200 ±0.0 75.7 ±26.4

400 175±21.5 36.0±14.3

200 58.0±16.7 14.8±8.2

100 31.5±6.2 9.8±1.6

50 16.0±5.5 6.5±5.0

25 6.3±2.9 3.5 ±0.5

12.5 3.8±1.5 2.0±0.7

6.25 3.3±0.8 3.0±3.7

3.0 3.5±1.1 2.3±1.1

0 2.8±2.2 1.0±1.0 表 6から明らかなように、 I G F— Iは S C F造血幹細胞増殖作用を顕著に促進する作用を有している。従って、造血幹細胞の維持 ·増殖に有用であることがわかる„ 実施例 1 3 製剤例

表 7の各種成分を溶解した水溶液 5 m 1を入れたバイャルを凍結乾燥し造血幹細胞增砥剤を得る。

表 7 造血幹細胞增垴剤の製剤例

産業上の利用可能性

以上の搽に、本発明の造血钤細胞増殖剤または増殖方法を用いることにより、造血幹細胞を未分化なまま、体内または体外で増殖させることができるので非常に有用である。

Claims

請求の範囲

1. I GF- Iを含有する造血幹細胞増殖剤。

2. M_CSF、 SCF及び G— CS Fから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と I G F— Iを含有する請求の範囲第 1項記載の造血幹細胞増殖剤。

3. M— CSFと I GF— Iを含有する請求の範囲第 2項の造血幹細胞増殖剤。

4. SCFと I GF— Iを含有する請求の範囲第 2項の造血幹細胞増殖剤。

5. G— CSFと IGF— Iを含有する請求の範囲第 2項の造血幹細胞増殖剤。

6. M_CSF、 SCF及び G— CSFから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と I GF— Iを含む培地で、造血幹細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増殖方法。

7. I GF- Iを哺乳動物に投与することからなる造血幹細胞の増殖方法„

8. M— CSF、 SCF及び G— CS Fから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と I GF— Iを投与することからなる請求の範囲第 7項記載の造血幹細胞の増殖方法。

9. M— CS Fと I GF— Iを投与することからなる請求の範囲第 8項記載の造血幹細胞の増殖方法。

10. SCFと I GF— Iを投与することからなる請求の範囲第 8項記載の造血幹細胞の増殖方法。

1 1. G— CS Fと I GF— Iを投与することからなる請求の範囲第 8¾記載の造血幹細胞の增殖方法。

12. 哺乳動物の造血幹細胞を増殖させるための、 I GF— 1の使用。

13. 哺乳動物の造血幹細胞を増殖させるための、 M— CS F、 SCF及び G— CS Fから選択された少なくとも 1種類の蛋白質と I GF— Iの使用。

1 4· 哺乳動物の造血幹細胞を増殖させるための、 M— CS Fと I GF— Iの使用。

1 5. 哺乳動物の造血幹細胞を増殖させるための、 S C Fと I G F— Iの使用。

16. 哺乳動物の造血幹細胞を増铳させるための、 G— CS Fと I GF— 1の使