WO1998048033A1

WO1998048033A1 - SOUCHE PRODUISANT UNE QUANTITE IMPORTANTE DE ε-POLY-L-LYSINE ET PROCEDE POUR PRODUIRE DE LA ε-POLY-L-LYSINE AU MOYEN DE CETTE SOUCHE

Info

Publication number: WO1998048033A1
Application number: PCT/JP1997/001403
Authority: WO
Inventors: Toshiharu Iwata; Yumiko Iwasawa; Shinji Shiraishi; Jun Hiraki
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 1999-10-23
Also published as: JPH09173057A; JP3525190B2

Description

明細書 ε —ポリ一 Lーリジンを著量に生産する菌株及びそれを用いた £—ポリ— L— リジンの製造法技術分野

本発明は、 £ 一ボリ一 L一リジン（以下、 ε P Lという）を著量に生産する菌株と該菌株を用いて発酵法により ε P Lを製造する方法に関する。

£ P Lは、必須ァミノ酸である L一リジンのポリマーであるため安全性が高く、また、カチオン含量が高いので、特異な物性を有する。したがってトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途が期待できる。特に食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。背景技術

従来、発酵法による £ P Lの製造法としては、自然界から分離されたストレブトマイセス属に属する P L生産株であるストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピ一シス' · リジノホリメラス (Streptomyc es albulus subsp. lys i nopolymer us) No. 346- D株（微ェ研菌寄第 3834号）を培地に培養し、得られる培養物から £ P Lを分離、精製して得る方法が知られている（特公昭 59- 20359号公報）。また、該ストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス No. 346- D株を、 L— リジンのアナログ物質である S— （2—アミノエチル）一 L一システィンに耐性を有する変異株に変異処理して、得られた変異株であるストレプトマイセス ·アルブラス · リジノポリメラス 11011A-1株（微ェ研条寄第 1109 号）を培地に培養して、得られる培養物から、分離、精製して該 £ P Lを得る方法も知られている（特公平 3-42070号公報、特公平 3-78998号公報）。

しかしながら、種々の用途に対応しうる安価な ε P Lを製造するには、該 11011A- 1株を用いても、 ε P Lの生産量及び対糖収率は未だ充分ではないとう点もあり、さらに ε Ρ L生産能を高めた改良株及び該改良株を用いて工業的に安価で効率的な ε P Lの製造法の開発が望まれていた。本発明者らは、従来の £ PL生産株またはその変異株にくらべて、 e PL生産能をさらに高めた ε P L生産株を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、 lOmg/ml以上の高濃度の S— (2—アミノエチル） —L一システィン（以下、 A E Cという）に対して耐性を有する変異株が ε P Lを著量に生産することのできる菌株になることを見いだすとともに、該菌株を好気的に培地に培養することにより、 £ PLを著量に生産することができることを見い出し、これらの知見に基づき、本研究を完成した。

以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、従来の £ PL生産株またはその改良株に比べてさらに ε PLの生産能が高く、 ε PLの生産性を向上させることのできる菌株を提供するとともに、該菌株を用いて £ PLを安価で、著量に製造する方法を提供することである。発明の開示

本発明は以下の技術的手段で構成される。

( 1 ) ε—ポリ一 L一リジンの生産能を有するストレブトマイセス 'アルブラス ( Streptomyces albulus) 種の微生物を変異処理して得られ、 lOmg/ml以上の高濃度の S— (2—アミノエチル） —L一システィンに対して耐性を有する £ーポリー L—リジンを著量に生産する菌株。

( 2 ) ストレブトマイセス ·アルブラス .サブスピ一シズ · リジノポリメラス (Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)11011A- 1株 (微ェ研条寄第

1109号）を変異処理して得られ、 10mg/ml以上の高濃度の S— （2—アミノエチル） —L一システィンに対して耐性を有する ε—ポリ— Lーリジンを著量に生産する B21021株（寄託番号 FERM Β Ρ - 5 9 2 6号）。

(3) 10mg/ml以上の高濃度の S— (2—アミノエチル） —L一システィンに対して耐性を有し、かつ ε—ポリ— Lーリジン生産能を有するストレブトマイセス属に属する微生物を、好気的に培地に培養し、培養液中に生成蓄積した一ポリ — L—リジンを採取することを特徴とするど—ポリ— L—リジンの製造法。

(4) 前記第 2項記載の B21021株を好気的に培地に培養し、培養液中に生成蓄積した £一ポリ一 L—リジンを採取することを特徴とする £一ポリ一 Lーリジンの製造法。

本発明で用いる A E Cは、 L一リジンの構造類似物質（アナログ物質）であり、 Lーリジンとは、 4位の炭素原子が硫黄原子と交換されていることのみが異なつた構造の化合物である。該 A E Cを培地中に添加すると菌の生育阻害を引き起こすが、さらに Lースレオニンを組み合わせることにより、生育阻害が明らかにより強く示される。

特公平 3-42070 号公報に開示の 11011A- 1株は、 L一リジンのアナログ物質である A E Cに対する耐性を有する £ P L生産株ではあるが、 2mg/mlの濃度の A E C 存在下でスクリーニングしたものであり、その生育範囲は A E C濃度がせいぜい 5 mg/ml以下の場合だけで、 A E C濃度が 10mg/ml 以上では全く生育を示さない _c 本発明の改良株は、 10mg/ml以上の濃度の A E C存在下でスクリ一ニングしたもので、 A E C濃度が 40mg/mlでも生育可能な耐性度を有するストレブトマイセス属に属する微生物であり、さらに菌学的性質も親株である 11011A- 1株とは一部で違いが認められる。

かかる改良株を得る際に使用される親株としては、 ε P Lを生産するストレブトマイセス属の微生物であれば使用できるが、ストレブトマイセス .アルブラス • リジノポリメラス 1101 1A- 1 株（微ェ研条寄第 1109号）が好ましい。

本発明で変異処理とは、 ε P Lを生産するストレブトマイセス属の微生物（菌株）を、 lOmg/ml以上の高濃度の A E Cに対して耐性を有する改良株に変異させる処理のことをいい、かかる変異処理の方法としては、 N—メチルー N' —二トロー N—ニトロソグァ二ジン（以下 N T Gという）を、緩衝液 lml当たり 0. lmg 〜3mgの濃度になるように添加して、 1 0分間〜 2時間該菌株と該 N T Gを接触させる方法や、紫外線を照射線量 100〜1000J/cm2で該菌株に照射する方法、 5 -プロモウラシル等の薬剤で処理する方法、その他慣用の化学的もしくは物理的変異処理方法を挙げることができる。

変異処理した菌株をスクリーニングする方法としては、培地 lml当たり A E C を 10mg以上になるように、さらに L—スレオニンを培地 lml当たり lmgになるように添加した最少寒天培地上に接種し、該培地上に生育してくる菌株を採取する方法を挙げることができる。以下に本発明を詳細に説明する。

A E C高濃度耐性株である本発明の改良株の具体的な取得方法の 1つは、 £ P L生産株であるストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス 11011A-1 株の胞子をトリス—マレイン酸緩衝液（pH 6.0)に懸濁し、 NT Gを該緩衝液 lmL当たり 1.5 mgとなるように該緩衝液に添加して、 3 7 °Cで 6 0 分間接触させる。その後、遠心分離により胞子を集め、リン酸緩衝液（0.05M，pH 7.0)で洗浄したあと、液体栄養培地（グルコース 5 %、硫酸アンモニゥム 1 %、酵母エキス 0.5%、 K₂HP0₄ 0.08 %、 KH₂P0₄ 0.136%、 MgS0₄-7H₂0 0.05 %、 ZnS0₄-7H₂0 0.004%, FeS0₄-7H₂0 0.003% pH6.8、ただし、 %とは g/dl%をいう）中で一夜培養する。培養後、遠心分離で菌体を集め、リン酸緩衝液 (0.05M, pH 7.0)で洗浄したのち、培地 lml当たり A E Cを 20mg及び培地 lml当たり L一スレオニンを l_mg含む最少寒天培地（グルコース 5 %、硫酸アンモニゥム 1 %、

K₂HP0₄ 0.08%. KH₂P0₄ 0.136%. MgS0₄-7H₂0 0.05 %、 ZnS0₄-7H₂0 0.004 %、 FeS0₄-7H₂0 0.003% pH6.8、寒天 1.5 %、ただし、 ^ :g/dl%をいう）上に塗布し、 3 0°Cで 3〜4日間培養し、生育したコロニーを採取する。こうして得られた AE C高濃度耐性株について ε PLの生産性の評価を行い、最も生産性の高い菌株がストレプ小マイセス■アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス B21021 株〔通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（〒3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）、国際受託番号： FERM BP- 5 9 2 6、平成 9年（ 1 9 9 7年） 4月 1 8日に原寄託（FERM P— 1 5 1 9 3、原寄託日：平成 7年 9月 2 0日）からブ夕ブスト条約に基づく国際寄託へ移管〕であり、これに続くのが B22107株、 Β222(Π株である。

得られた改良株である A E C高濃度耐性株の A E Cに対する耐性度は、次のようにして測定する。すなわち、後述の表一 1に記載した各濃度の AECと Lースレオニンを培地 lmg当たり 1ml添加した最少寒天培地（前記）のそれぞれに該耐性株を塗布して、 3 0°Cで 2日〜 7日間培養し、生育を肉眼で観察することにより、耐性度を比較する。その結果を表 1に示した。親株である 11011A-1株は、 A E C濃度が 5mg/nd では生育が認められるが、 10mg/mlの濃度では全く生育を示さないのに対して、高濃度耐性株である B2102 朱は、八£(：濃度が401^/1111 でも生育が認められる。この様に、本発明の改良株は、高濃度の A E Cに対するの耐性を有するという点で、親株と明確に区別することができる。

表 1 試験菌株 A E C濃度培養日数 (曰）

(mg/ml) 2 3 4 5 6 7

B21021 5 + + + + + +

1 0 + + + + + +

2 0 + + + + + +

4 0 ― + + + +

B22107 5 + + + + + +

1 0 + + + + + +

2 0 + + + + + +

4 0 + + +

B22201 5 + + + + + +

1 0 + + + + + +

2 0 + + + + + +

4 0 + + + + +

(親株） 2 土 + +

5 + + +

1 0

2 0 注） + ：生育あり土：ごくわずカこ生育あり生育なし

次に、 B2102 朱の菌学的性質を示すと次の通りである,

( 1 ) 形態学的性質

①胞子形成菌糸の分技法及び形態

単純分枝、閉鎖らせん状（c l osed sp i ral )

②胞子の数：数 10個 ③胞子の表面構造及び大きさ

胞子は円ないし楕円形で大きさは約 1. 2 1. 5 であり、その表面構造はスパイ二一（Spiny) である。

④鞭毛、菌核、胞子のうの有無：認められない。

⑤胞子柄の着生位置：気菌糸上

( 2 ) 各種培地上における培養性状

表 2の各種培地上における性状はそれぞれ 3 0 °Cで 10 14日間培養後の観察結果である。

表 2 培地気菌糸溶解性色素シュークロース · 生育なし生育なしなし硝酸塩寒天培地グルコース · ァスパ白色〜淡黄色灰褐色なし

ラギン寒天培地グリセロール · ァス淡黄色白色、粉状なし

パラギン寒天培地チロシン寒天培地淡褐色白色褐色

栄養寒天培地黄色白色なし

生育わずかイースト ·麦芽寒天黄褐色灰褐色、粉状なし

培地オートミール寒天培黄褐色白色なし

地 ( 3 ) 生理的性質

①生育温度範囲

約 1 5〜 4 0 °C。生育最適温度： 3 0で付近。

②ゼラチンの液化、でんぷんの加水分解及び脱脂牛乳のぺプトン化

すべて陽性

③脱脂牛乳の凝固：陰性

④メラニン様色素の生成

チロシン寒天培地上では褐色の色素を生成する。

⑤細胞壁組成

細胞壁組成成分中のジァミノピメリン酸の型についてベッカー（Becker) らの方法 [アプライド 'マイクロバイオロジー（Appl i ed Mi crobi ol ogy) 第 1 3巻、 p 2 3 6 (1965年） ] により分析した結果、 L , L型であった。

( 4 ) 炭素源の利用性（プリドハム ·ゴットリーブ寒天培地）

Lーァラビノース一

D—キシロース一

D—グルコース +

D—フラクトース +

L一ラムノース一

D—ガラクトース +

シユークロース一

ラフイノース一

D—マンニトール +

イノシトール +

サリシン +

+ ：利用する、一：利用しない

以上記述したように、本発明の改良株の 1つである B21021株の菌学的性質は、親株である 11011A-1株の菌学的性質といくつかの点において違いが認められる _c 例えば、炭素源の利用性において、 11011A- 1株はサリシンを利用できないが、 B2102 朱は利用できる。また、培養性状においても、シユークロース ·硝酸塩寒天培地上で、 11011A- 1株は灰褐色の気菌糸が生育するが、 B21021株は生育しない _c 栄養寒天培地上では、 11011A- 朱は白色の気菌糸が豊富に生育するが、 B21021株では気菌糸の生育がわずかである。さらに溶解性色素が、 11011A- 朱ではグルコース ·ァスパラギン寒天培地及びグリセロール ·ァスパラギン寒天培地でも認められるのに対して、 B21021株では両方の培地ともに認められない。この様に、菌学的性質においても B21021株は親株である 11011A- 1株と明確に区別ができる。得られた改良株を用いて £ PLを生産するには、該改良株を培地に接種して培養し、培養液から生成蓄積した ε PLを分離、精製する。培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他栄養物を適当に含有する培地ならばいずれも使用できる。炭素源としては、グルコース、フラクト一ス、グリセリン、スターチ等の該改良株が資化可能なものなら制限されず、その含有量は 1〜5 % は g/dl%) が好ましい。窒素源としては、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸、無機アンモニゥ厶塩等いずれでもかまわないが、好ましくは硫酸アンモニゥ厶である _c 窒素源の含有量は、 0.2 〜2%(%は g/dl%)が好ましい。培養途中で、炭素源及び窒素源を逐次添加しても良い。無機物としてはリン酸イオン、カリウムィォン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等が挙げられる。また酵母エキスを 0.1 〜 0.5 % (%は g/dl%) 含有させると、菌の生育を良好にし、 ε PLの生産においても好ましい結果を与える。

培養は、好気的条件下で振とう培養、撹拌培養等で行う。培養温度は 2 5〜3 5°Cが好ましい。培地の pHは中性付近（pH 6〜8) が好ましいが、培養開始後、菌の生育とともに pHは低下する。 pHが 4まで低下した時点で、アルカリを添加して pHを 4に維持させる。添加するアル力リはアンモニア水が好ましい力、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等でも差し支えない。通常 1〜7日間で ε P Lは培養液中に蓄積される。

上記培養液から遠心分離もしくはフィルタ一で菌体を除いたのち、菌体除去液を精製、脱色し、これを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより、 £ PLが得られる。発明を実施するための最良の形態

本発明を実施例により更に詳細に説明する。

培養液中の P L生産量の測定は、ィッアキ（Itzhaki)らのアナリティカルバィォケミストリ（Analytical Biochemistry), 50, 569、（1972)に記載の方法により測定した。すなわち、培養液を遠心分離して菌体を除いたのち、上澄液（ε Ρ L： 0 〜200〃g ) 2mlと 1 mMメチルオレンジ水溶液 2ndとを混合し、室温で 3 0分放置後、生じた ε PL—メチルオレンジコンプレツクスを遠心分離で除き、その上澄水の 4 6 5 nmにおける吸光度を測定し、培養液中の e P L量を求める _c また、実施例、比較例中の％は特に断らない限り重量（g)/容量（dl)%である。〔実施例 1〕

グルコース 5 %、酵母エキス 0.5%、硫酸アンモニゥ厶 1 %、 K₂HP0₄ 0.08%、 KH₂P0₄ 0.136%、 MgS0₄ ·7Η₂0 0.05 %、 ZnS0₄-7H₂0 0.004%、 FeS0₄'7H₂0 0.003%、 pH 6.8 の培地 2リットルを調製し、 3リットル容ジャーに入れ、これに取得した改良株であるストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス B21021株の前培養液 100mlを接種し、 3 0 °C、 7 0 0 rpm、通気量 3リットルノ分で 7 2時間、好気培養を行った。ただし、 pHの調整は、 10 %アンモニア水を用いて p H 4に維持した。また、グルコース及び硫酸アンモニゥムについては、残存濃度が低下した時点で逐次添加を行った。

7 2時間培養後の £ PL生産量及び対糖収率を表 3に示した。ここで対糖収率

(%) とは（£ PL生産量 Zグルコース消費量） X I 0 0で表される値のことである。

〔実施例 2〕

ストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピ一シズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、ストレプトマイセス ·アルブラス 'サブスピ一シズ · リジノポリメラス B22107株を用いる以外は実施例 1に準拠して培養し、培養液中の £ PL量を測定した。 72時間培養後の £ PL生産量及び対糖収率を表 3に示した。

〔実施例 3〕

ストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピ一シズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、ストレプトマイセス 'アルブラス 'サブスピ一シズ ' リジノポリメラス Β222(Π株を用いる以外は実施例 1に準拠して培養し、培養液中の £ PL量を測定した。 7 2時間培養後の ε PL生産量及び対糖収率を表 3に示した。

〔比較例 1〕

ストレブトマイセス 'アルブラス■サブスピ一シズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、親株であるストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス 11011A- 朱を用いる以外は実施例 1に準拠して行った。 7 2時間培養後の P L生産量及び対糖収率を表 3に示した。表 3 菌株 P L生産量対糖収率

( g/1) (¾)

B21021 (実施例 1 ) 16.2 12.1

B22107 (実施例 2 ) 15.6 11.1

B22201 (実施例 3 ) 14.3 13.0

11011A-1 (比較例 1 ) 9.2 7.7

〔実施例 4〕

グルコース 5 %、酵母エキス 0.5%、硫酸アンモニゥ厶 1 %、 K₂HP0 0.08%、 KH2PO4 0.136%、 MgS0₄-7H₂0 0.05 %、 ZnS0₄'7H₂0 0.004%、 FeS0₄-7H₂0 0.003%、 pH 6.8 の培地 2 リットルを調製し、 3 リットル容ジャーに入れ、これに取得した改良株であるストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ - リジノポリメラス B2102 朱の前培養液 100mlを接種し、 3 0で、 7 0 0 rpm 、通気量 3 リットル Z分で 1 6 8時間、好気培養を行った。ただし、 pHの調整は、 10%アンモニア水を用いて pH 4に維持した。また、グルコース及び硫酸アンモニゥ厶については、残存濃度が低下した時点で逐次添加を行った。 1 6 8時間培養後の £ P L生産量及び対糖収率を表 4に示した。

〔実施例 5〕

ストレプトマイセス 'アルブラス ·サブスピ一シズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、ストレプトマイセス 'アルブラス 'サブスピーシズ · リジノポリメラス B22107株を用いる以外は実施例 4に準拠して培養し、培養液中の ε PL量を測定した。 1 6 8時間培養後の s PL生産量及び対糖収率を表 4に示した。〔実施例 6 )

ストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、ストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス B222CU株を用いる以外は実施例 4に準拠して培養し、培養液中の ε PL量を測定した。 1 6 8時間培養後の ε PL生産量及び対糖収率を表 4に示した。〔比較例 2〕

ストレプトマイセス ·アルブラス ·サブスピ一シズ · リジノポリメラス B21021 株の代わりに、親株であるストレブトマイセス ·アルブラス ·サブスピーシズ · リジノポリメラス 11011A-1株を用いる以外は実施例 4に準拠して行った。 1 6 8 時間培養後の £ PL生産量及び対糖収率を表 4に示した。

表 4 菌株 P L生産量対糖収率

( g/1) (¾)

B21021 (実施例 4 ) 31.0 12.4

B22107 (実施例 5 ) 28.6 12.6

B22201 (実施例 6 ) 25.0 11.4

11011A-1 (比較例 2 ) 19.1 7.8

〔実施例 7〕実施例 4で 1 6 8時間培養した培養液について、この培養液を遠心分離して菌体を除き、 PH7.5に調整してから、 I RC— 5 0 (カチオン交換樹脂）、 I R A- 4 0 2 (ァニオン交換樹脂）、 XT— 1 0 0 6 (カチオン交換樹脂）の各ィオン交換樹脂で分離、精製し、逆浸透膜（RO) で濃縮して ε PLを得た。その収量を表 5に示した。

〔比較例 3〕

比較例 2で 1 6 8時間培養した培養液について、実施例 7と同様に培養液を遠心分離して菌体を除き、 PH7.5に調整してから、 I RC— 5 0 (カチオン交換樹脂）、 I RA— 4 0 2 (ァニオン交換樹脂）、 XT— 1 0 0 6 (カチオン交換樹脂）の各イオン交換樹脂で分離、精製し、逆浸透膜で濃縮して、？しを得た: その収量を表 5に示した。表 5

¾ 株 ε P L収量

( S )

B21021 (実施例 7 ) 3 9

11011A-1 (比較例 3 ) 2 4

表 3、表 4及び表 5の結果から明かなように、 B21021株の ε P L生産量及び対糖収率はともに、 11011A- 朱のそれに比べて顕著に増大していることが分かる。産業上の利用可能性

本発明の A EC高濃度耐性を有する改良株は、高生産かつ高収率で ε PLを生産する能力を有し、該生産株を用いることにより、高い生産性と高収率で PL を製造することが可能である。

Claims

請求の範囲

1 . £—ポリ一 L —リジンの生産能を有するストレブトマイセス■アルブラス（ Streptomyces albulus) 種の微生物を変異処理して得られ、 10mg/ml以上の高濃度の S— ( 2—アミノエチル）一 L一システィンに対して耐性を有するど一ポリ一 Lーリジンを著量に生産する菌株。

2 . ストレプトマイセス · アルブラス ·サブスピ一シズ · リジノポリメラス (Streptomyces albu l us subsp. lys i nopo l ymerus) 11011A-1株（微ェ研条寄第 1109号）を変異処理して得られ、 lOmg/ml以上の高濃度の S— （2 —アミノエチル） — L—システィンに対して耐性を有する £—ポリ一 Lーリジンを著量に生産する B21021株（寄託番号 F E R M B P - 5 9 2 6号）。

3 . iOmg/ml以上の高濃度の S— ( 2 —アミノエチル） —L—システィンに対して耐性を有し、かつ ε —ポリ一 L—リジン生産能を有するストレプトマイセス属に属する微生物を、好気的に培地に培養し、培養液中に生成蓄積した ε —ポリ一 L—リジンを採取することを特徴とする ε —ポリ一 Lーリジンの製造法。

4 . 請求の範囲第 2項記載の B2102 朱を好気的に培地に培養し、培養液中に生成蓄積した —ポリ— L—リジンを採取することを特徴とする £ 一 L—リジンの製造法。