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WO1997037028A2 - Ribose-5-phosphat isomerase (d-ribose-5-phosphat ketol isomerase, ec 5.3.1.6) - Google Patents

Ribose-5-phosphat isomerase (d-ribose-5-phosphat ketol isomerase, ec 5.3.1.6) Download PDF

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WO1997037028A2
WO1997037028A2 PCT/EP1997/001539 EP9701539W WO9737028A2 WO 1997037028 A2 WO1997037028 A2 WO 1997037028A2 EP 9701539 W EP9701539 W EP 9701539W WO 9737028 A2 WO9737028 A2 WO 9737028A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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phosphate
ribose
phosphate isomerase
sequence
protein
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP1997/001539
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WO1997037028A3 (de
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Ralf-Michael Schmidt
Jens Lerchl
Martin William
Claus Schnarrenberger
Josef Kellermann
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • Ribose 5-phosphate isomerase (D-ribose 5-phosphate ketol isomerase, EC 5.3.1.6)
  • the present invention relates to proteins with Ribcse-5-phosphate isomerase activity, their use in test systems, and to nucleic acids which code for these proteins.
  • Plants are able to form organic compounds with the formation of oxygen using light energy from atmospheric carbon dioxide. This process is called photosynthesis.
  • the complex reactions that lead to carbon dioxide fixation are divided into light and dark reactions.
  • the light reaction serves to provide energy in the form of ATP and reduction equivalents in the form of NADPH.
  • the dark reaction reductive pentose phosphate cycle or Calvin cycle
  • these compounds are used for the synthesis of organic carbon compounds.
  • Some of the known herbicides e.g. dichlorophenylmethyl urea or paraquat
  • the dark reaction is not used as a target for herbicides.
  • the plastidic ribose 5-phosphate isomerase occupies a special position, which catalyzes the following reaction:
  • the enzyme has an amphibolic function, i.e. it is part of both the reductive pentosephosphate cycle (Calvin cycle) and the oxidative pentosephosphate pathway and thus has an important function in photosynthetic and non-photosynthetic tissues.
  • Ribose 5-phosphate is converted via the phosphoribosyl pyrophosphate synthetase into phosphoribosyl pyrophosphate, which acts as a ribose 5-phosphate donor molecule in tryptophan and nucleotide biosynthesis.
  • the erythrose-4-phosphate, sedoheptulose-7-phosphate, glyceraldehyde-3-phosphate and fructose are derived from the ribose-5-phosphate and ribulose-5-phosphate via the plastid transketolase and the ribulose-5-phosphate-3-epimerase - 6-phosphate.
  • Erythrose-4-phosphate is an intermediary between primary and secondary metabolism.
  • erythrose-4-phosphate flows into the shikimate path, which leads to the synthesis of aromatic amino acids and phenolic substances.
  • Exported triose phosphates serve as substrates for glycolysis and gluconeogenesis in the cytoplasm.
  • Fructose-6-phosphate is used as a precursor for the production of starch in the plastids.
  • Ribulose-5-phosphate is converted, depending on ATP, by the phosphoribulokinase into ribulose-1, 5-bisphosphate, which functions as the primary carbon dioxide acceptor.
  • the plastid ribose 5-phosphate isomerase is present as a homodimer with a relative molecular mass of approx. 53 kDa ⁇ Rutner,
  • the object of the present invention was to provide a vegetable 35 ribose-5-phosphate isomerase in pure form by cloning the corresponding gene.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO 2 is based on the translation of the cDNA sequence shown in SEQ ID NO 1.
  • the protein shown in SEQ ID NO 2 is a so-called precursor protein consisting of 289 amino acids.
  • the mature protein arises from the precursor form by splitting off the chloroplastic där transit peptide, which consists of 50 amino acids according to an N-terminal sequencing of the mature protein.
  • Both the precursor protein and proteins derived therefrom by substitution, deletion or insertion of amino acids and which still have ribose 5-phosphate isomerase activity belong to the proteins according to the invention.
  • Substitution means the exchange of one or more amino acids by one or more other amino acids. So-called conservative exchanges are preferably carried out, in which the new amino acid has a similar property to the original amino acid, for example replacement of Glu by Asp, Val by Ile, Ser by Thr.
  • Deletion is the replacement of an amino acid with a direct link; preferred positions for deletions are the termini of the polypeptide and the links between the individual protein domains.
  • Inserts are insertions of amino acids into the polypeptide chain, whereby a direct bond is formally replaced by one or more amino acids.
  • Proteins which are formed from N-terminal shortenings by 20 to 100 amino acids from SEQ ID NO 2 are particularly preferred.
  • the invention further relates to nucleic acids which code for the abovementioned proteins.
  • Suitable nucleic acid sequences can be obtained by back-translating the polypeptide sequence according to the genetic code. Those codons are preferably used for this which are frequently used according to the organism-specific "codon usage". The codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the organism in question.
  • ribose 5-phosphate isomerase If the plant ribose 5-phosphate isomerase is to be expressed, for example, in a bacterium, it is often advantageous to use the "codon usage" of the bacterium for the back translation.
  • the invention furthermore relates to vectors for producing transgenic plants which contain the nucleic acids coding for the ribose 5-phosphate isomerase according to the invention together with functional regulation signals.
  • Regulatory signals include the constitutive gene expression-promoting promoters such as the 35S CaMV promoter ⁇ Franck et al. , 1980, Cell 21, 285-294 ⁇ as well as termination signals such as the polyadenylation signal of the Ti plasmid pT ⁇ ACH5 ⁇ Gielen et al., 1984. EMBO J. 2, 835-846 ⁇ and translation enhancers such as the 5 'guide sequence from tobacco mosaic virus ⁇ Gallie et al. , 1987, Nucl. Acids Res. 15, 5 8693-8711 ⁇ .
  • the proteins according to the invention are particularly suitable for the identification of herbicidal active substances, in particular for the detection of riosbose-5-phosphate isomerase-specific inhibitors.
  • the proteins can be used, for example, in an enzyme test in which the activity of the rbose-5-phosphate isomerase is determined in the presence and absence of the active substance to be tested.
  • a comparison of the two activity determinations 5 can be used to make a qualitative and quantitative statement about the inhibitory behavior of the active substance to be tested.
  • the invention further relates to herbicides which can be identified using a test system described above.
  • the invention also consists in a process for the preparation of herbicidal compositions which inhibit a vegetable r ⁇ bose-5-phosphate isomerase, which is characterized in that known chemical compounds are tested in a test described above and those with an inhibitory effect are customary with 0 Carrier and auxiliary substances formulated.
  • the method reproducibly allows a large number of substances to be selectively selected from those with a high potency, in order to subsequently carry out further in-depth tests known to the person skilled in the art.
  • the activity of the ribose 5-phosphate isomerase was determined in 40 mM potassium phosphate pH 7.4, 5 mM magnesium chloride, 0.5 U ribose 5-phosphate isomerase, 1 U transketolase, 1 U triose phosphate Isomerase and 1 U glycerol-3-phosphate dehydrogenase, 240 mM NADH, 10 mM R ⁇ bose-5-phosphate.
  • R ⁇ bose-5-phosphate isomerase was obtained as a commercially available preparation (Sigma). The purification was carried out by ion exchange chromatography with DEAE 1 '- Fractogel (Merck) equilibrated in 10 mM potassium phosphate, pH 7.5, 10 mM ethylene diammotetraacetate (EDTA) and 10 mM 2-mercaptoethanol. After dialysis against column buffer, the protein was added to the column and eluted through a gradient of 0-0.3 M potassium chloride in column buffer. Fractions with R ⁇ bose-5-phosphate isomerase activity were concentrated using polyethylene glycol 20000 and then dialyzed against column buffer.
  • the native molecular weight was determined via HPLC gel filtration at a flow rate of 1.0 ml / mm over Bio-Sil TSK 250 (Merck). The latter material was equilibrated in 50 mM sodium sulfate, 20 mM sodium dihydrogen phosphate pH 6.8. Beta-galactosidase (465 kD), immunoglobulin G (150 kD), antigen-binding antibody fragment (Fab, 50 kD) and myoglobm (17 kD) were used as protein standards. The native molecular weight was determined by interpolation of the graph from the retention time against the logarithm of the molecular weight.
  • Purified protein was cleaved using cyanogen bromide or with endoprotemase LysC as described ⁇ Eckerskorn and Lott arrived, 1989, Chromatographia 28,
  • the resulting peptides were separated using a 2 x 125 mm Supersher 60 RP select B column (Merck). A flow rate of 200 ⁇ l / mm m and a 1% / mm gradient of trifluoroacetic acid (0.1% (v / v)) in water and trifluoroacetic acid (0.1% (v / v)) in acetonitrile were used .
  • the resulting peptides were degraded in an automatic Porton 3600 sequencer (Beckman) via amino terminal degradation ⁇ Edman and Begg, 1967, Eur. J. Biochem., 80-91 ⁇ and the amino acids were identified using the Microbore HPLC System Gold (Beckman) .
  • Cloning processes such as restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, ligation approaches, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) ⁇ Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6 ⁇ .
  • the PCR amplification of the R ⁇ bose-5-phosphate isomerase was carried out in a DNA thermal cycler from Perkm Elmer.
  • the oligonucleotides used are shown in Figure 5.
  • the reaction mixtures contained 8 ng / 1 double-stranded leaf-specific spinach cDNA, 0.5 ⁇ M of the corresponding oligonucleotides, 50 ⁇ M
  • Nucleotides (Pharmacia), 50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C), 1.5 mM magnesium chloride, and 0.02 U / 1 Taq polymerase (Perkin Elmer).
  • the amplification conditions were set as follows: Addition temperature ' : 45 ° C, 1 min denaturation temperature: 92 ° C, 1 min elongation temperature: 72 ° C, 1 min number of cycles: 35
  • the above sequence of 119 base pairs was used as hybridization probe (Clal / Xhol fragment of the plasmid pPCRrpil), which was carried out with the aid of a “Multiprime DNA labeling System” (Amersham Buchler) in the presence of ⁇ - 32 P-dCTP (Amersham; specific activity 3000 Ci / mmol) were radioactively labeled according to the manufacturer's instructions.
  • the membranes were hybridized after prehybridization at 60 ° C.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with an automatic laser fluorescence DNA sequencer (A.L.F.) from Pharmacia using fluorescent
  • the DNA sequence of the longest cDNA sequence of the clone pRI12 is shown in SEQ ID N01 (Genbank Accession number L43068).
  • the 1118 base pair long cDNA clone pRI12 contains an open reading frame of 870 bases and codes for a protein with 239 amino acids.
  • Analysis of the polypeptide using the peptide sequences of the microsequencing showed that a sequence with typical characteristics of a chloroplastic transit peptide of 50 amino acids is present at the N-termmus of the protein.

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Abstract

Protein mit Ribose-5-Phosphat Isomerase Aktivität, enthaltend eine Aminosäuresequenz, die eine Teilsequenz von mindestens 100 Aminosäuren aus SEQ ID NO 2 darstellt, sowie für dieses Protein kodierende Nukleinsäuren und seine Verwendung zur Identifizierung von herbiziden Wirkstoffen.

Description

Ribose-5-Phosphat Isomerase (D-Ribose-5-Phosphat Ketol Isomerase, EC 5.3.1.6)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine mit Ribcse-5-Phosphat Isomerase Aktivität, ihre Verwendung in Testsystemer., sowie Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren.
Pflanzen sind in der Lage, unter Verwendung von Lichtenergie aus atmosphärischem Kohlendioxid organische Verbindungen unter Sauer- Stoffbildung aufzubauen. Dieser Vorgang wird als Photosynthese bezeichnet.
Es ist anzunehmen, daß die effiziente Bildung, Nutzung und Ver¬ teilung der Photosyntheseprodukte das Wachstum einer Pflanze stark beeinflussen.
Da Pflanzen auf eine funktionierende Photosynthese angewiesen sind und vergleichbare Reaktionen in tierischen Organismen nicht vorkommen, bietet sich der Photosyntheseapparat als ideales Ziel für den Einsatz von Herbiziden an.
Die komplexen Reaktionen, die zur Kohlendioxidfixierung führen unterteilt man in Licht- und Dunkelreaktion. Die Lichtreaktion dient der Bereitstellung von Energie in Form von ATP und von Reduktionsäquivalenten in Form von NADPH. In der Dunkelreaktion (reduktiver Pentosephosphatzyklus oder Calvin Zyklus) werden diese Verbindungen zur Synthese organischer Kohlenstoffver- bindungen genutzt.
Einige der bekannten Herbizide (z.B. Dichlorphenylmethyl-harn- stoff oder Paraquat) wirken durch eine Inhibierung der Lich- treaktion. Die Dunkelreaktion wird nach bisherigen Erkenntnissen als Angriffspunkt für Herbizide nicht genutzt.
Die Enzymreaktionen des reduktiven Pentosephosphatzyklus werden in drei Abschnitte unterteilt:
a) Carboxylierung b) Reduktion c) Regenerierung.
Bei der Carboxylierung reagiert Kohlendioxid mit dem Akzeptor- molekül Ribulose-Bisphosphat (RuBP) , wodurch zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat (3-PGA) gebildet werden. Anschließend wird 3-PGA nach Phosphorylierung zu Glycennaldehyd-3-Phosphat (GAP) reduziert. In der Regenerationsphase wird das Akzeptormolekül RuBP aus dem entstandenen GAP resynthetisiert. Von sechs gebilde¬ ten Molekülen GAP kann ein Molekül für andere Stoffwechselwege eingesetzt werden.
Eine Vielzahl der am reduktiven Pentosephosphatzyklus beteiligten Enzyme stellen potentielle Angriffspunkte für Herbizide dar. Eine besondere Stellung nimmt dabei die plastidäre Ribose-5-Phosphat Isomerase ein, die folgende Reaktion katalysiert:
Rιbose-5-Phosphat ^ ^ Ribulose-5-Phosphat
Das Enzym hat eine amphibolische Funktion, d.h. es ist sowohl Teil des reduktiven Pentosephosphatzyklus (Calvin-Zyklus) als auch des oxidativen Pentosephosphatweges und hat somit eine wich¬ tige Funktion m photosynthetischen und nicht-photosynthetischen Geweben.
Ribose-5-Phosphat wird über die Phosphoribosylpyrophosphat Synthetase in Phosphoribosyl-pyrophosphat übergeführt, das als Ribose-5-Phosphat-Donormolekül in der Tryptophan- und Nukleotid- biosynthese fungiert. Zudem leiten sich vom Ribose-5 -Phosphat und Rιbulose-5-Phosphat über die plastidäre Transketolase und die Ribulose-5-Phosphat-3-Epimerase das Erythrose-4-Phosphat, Sedoheptulose-7-Phosphat, Glyceraldehyd-3-Phosphat und Fruktose- 6-Phosphat ab. Erythrose-4-Phosphat ist ein Mittler zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel. Verknüpft mit Phosphoenol - pyruvat mundet Erythrose-4-Phosphat in den Shikimat-Weg, der zur Synthese aromatischer Aminosäuren und phenolischer Substanzen führt. Exportierte Triosephosphate dienen im Zytoplasma als Substrate für Glykolyse und Gluconeogenese. Fruktose-6-Phosphat wird als Vorläufermolekül zur Herstellung von Stärke in den Plastiden genutzt. Ribulose-5-Phosphat wird ATP-abhangig durch die Phosphoribulokinase in Ribulose-1, 5-Bisphosphat überführt, welches als primärer Kohlendioxidakzeptor fungiert.
Wegen Ihrer zentralen Bedeutung an der Synthese dieser Vorläufer- molekule von essentiellen Stoffwechselwegen kommt der Ribose-5- Phosphat Isomerase eine besondere Bedeutung zu.
Ursprunglich wurde in verschiedenen Pflanzenspezies eine Isoform der Rιbose-5-Phosphat Isomerase nachgewiesen {Heber et al . , 1967, Z. Naturf. 22b. 1200-1215}. Später wurden m pflanzlichen Geweben zwei Ribose-5-Phosphat Isomerase-Isoformen beschrieben, die sich in ihrer subzellulären Kompartimentierung unterscheiden {Ander¬ son, 1971, Biochim Biophys Acta 215., 507-512}.
Solche Berichte führten zur verbreiteten Meinung, daß zytosoli- 5 sehe Isoenzyme des oxidativen und reduktiven Pentosephosphatweges allgemein in Pflanzen vorkommen. Neuere Untersuchungen weisen je¬ doch daraufhin, daß der oxidative/reduktive Pentosephosphatweges nur in den Chloroplasten vollständig abläuft, da die Enzyme mit Ausnahmen (z.B. Triosephosphat Isomerase und Glukose-6-Phosphat 10 Dehydrogenase) nur im plastidären Kompartiment nachweisbar sind {Schnarrenberger et ai . , 1995, Plant Physiol. 10J., 609-614}.
Die plastidäre Ribose-5-Phosphat Isomerase liegt als Homodimer mit einer relativen Molekularmasse von ca. 53 kDa vor {Rutner,
15 1970, Biochem., 178-184}. Für die Ribose-5-Phosphat Isomerase- Aktivitätsmessung sind keine Cofaktoren bekannt, jedoch sind Ethylendiamintetraacetat (EDTA) als Chelator und Mercaptoethanol als Oxidationsschutz in vitro für die Aktivitätsmessung not¬ wendig. Nukleotide haben keine inhibierende Wirkung auf die
20 Ribose-5-Phosphat Isomerase-Aktivität {Rutner, 1970, Biochem., 178-184} .
Gene, die für Ribose-5-Phosphat Isomerase kodieren, wurden bisher aus E. coli {Hove-Jensen und Maigaard, 1993, J. Bacteriol. 175 ,
25 5628-5635; Sorensen und Hove-Jensen, 1996, J. Bacteriol. 178, 1003-1011) und Maus {Apel et al. , 1995, Gene 156. 191-197} isoliert und beschrieben. Durch Datenvergleiche lassen sich Ribose-5-Phosphat Isomerase-ähnliche Sequenzen identifizieren, deren Funktion unbekannt ist (Caenorhabditis elegans, Haemophilus
30 influenzae, Synechocystis PCC6803; siehe Genbank U10428, U32729, D64002) . Gene pflanzlicher Ribose-5-Phosphat Isomerasen sind bisher nicht bekannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine pflanzliche 35 Ribose-5-Phosphat Isomerase in reiner Form durch Klonierung des entsprechenden Gens zur Verfügung zu stellen.
Demgemäß wurde ein Protein mit Ribose-5-Phosphat Isomerase Aktivität, enthaltend die in SEQ ID NO 2 dargestellte Aminosäure- 40 sequenz, gefunden.
Die in SEQ ID NO 2 dargestellte Aminosäuresequenz beruht auf der Translation der in SEQ ID NO 1 dargestellten cDNA Sequenz.
45 Das in SEQ ID NO 2 dargestellte Protein ist ein sogenanntes Vor¬ läuferprotein bestehend aus 289 Aminosäuren. Das reife Protein entsteht aus der Vorläuferform durch Abspalten des chloroplasti- dären Transitpeptides, das gemäß einer N-terminalen Sequenzierung des reifen Proteins aus 50 Aminosäuren besteht.
Sowohl das Vorläuferprotein, als auch durch Substitution, Deletion oder Insertion von Aminosäuren davon abgeleitete Proteine, die noch über eine Ribose-5-Phosphat Isomerase- Aktivität verfügen, gehören zu den erfindungsgemäßen Proteinen.
Unter Substitution ist der Austausch einer oder mehrerer Amino- säuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die neue Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Val durch lle, Ser durch Thr.
Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung; bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.
Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid- kette, wobei formal eine direkte Bindung durch eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.
Besonders bevorzugt sind Proteine, die durch N-terminale Ver¬ kürzungen um 20 bis 100 Aminosäuren aus SEQ ID NO 2 entstehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren, die für die oben genannten Proteine kodieren. Geeignete Nukleinsäure- Sequenzen sind durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich. Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismus spezifischen "codon usage" häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus' leicht ermitteln.
Soll die pflanzliche Ribose-5-Phosphat Isomerase beispielsweise in einem Bakterium exprimiert werden, so ist es häufig vorteil¬ haft, die "codon usage" des Bakteriums bei der Rückübersetzung zu verwenden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Vektoren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die die für die erfindungsgemäße Ribose-5- Phosphat Isomerase kodierenden Nukleinsäuren zusammen mit funk- tionellen Regulationssignalen enthalten. Regulationssignale sind u.a. der konstitutiv Genexpression vermittelnde Promotoren wie der 35S CaMV Promotor {Franck et al. , 1980, Cell 21, 285-294} sowie Termmationssignale wie das Polyadenylierungssignal des Ti-Plasmids pTιACH5 {Gielen et al., 1984. EMBO J. 2, 835-846} und Translationsverstarker wie die 5' -Fuhrungssequenz aus Tabak Mosaic Virus {Gallie et al . , 1987, Nucl. Acids Res. 15., 5 8693-8711} .
Die erfindungsgemaßen Proteine eignen sich besonders zur Identi¬ fizierung von herbiziden Wirkstoffen, insbesondere zur Auffindung von Rιbose-5-Phosphat Isomerase spezifischen Hemmstoffen. 0
Dazu können die Proteine beispielsweise m einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der Rιbose-5-Phosphat Isomerase in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs er¬ mittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitatsbestimmungen 5 laßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen.
Mit Hilfe des erfindungsgemaßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide 0 Eigenschaften überprüft werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Herbizide, die mit einem oben bescnriebenen Testsystem identifizierbar sind.
5 Die Erfindung besteht außerdem in einem Verfahren zur Herstellung von herbiziden Mitteln, die eine pflanzliche Rιbose-5-Phosphat Isomerase inhibieren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man bekannte chemische Verbindungen in einem oben bescnriebenen Test verfahren überprüft und solche mit inhibierender Wirkung mit 0 üblichen Trager- und Hilfsstoffen formuliert.
Daß die Rιbose-5-Phosphat Isomerase inhibierende Eigenschaft einer Substanz allem nicht ausreicht für die Eignung als Herbizid, sondern noch weitere Prüfungen durchzufuhren sind, 5 ist jedem Fachmann gelaufig.
Das Verfahren gestattet es jedoch reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstarke auszu¬ wählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fach- 0 mann gelaufige vertiefte Prüfungen durchzufuhren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter ver¬ anschaulicht. Beispiele
A. Biochemische Verfahren, die den Ausfuhrungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Enzymassay
Wie beschrieben {Schnarrenberger et al. , 1995, Plant Physiol. 108, 609-614} wurde die Aktivität der Ribose- 5-Phosphat Isomerase bestimmt in 40 mM Kaliumphosphat pH 7,4, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,5 U Rιbose-5-Phosphat Iso¬ merase, 1 U Transketolase, 1 U Triosephosphat Isomerase und 1 U Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase, 240 mM NADH, 10 mM Rιbose-5-Phosphat.
2. Proteinreinigung
Rιbose-5-Phosphat Isomerase wurde als kommerziell erhält¬ liche Präparation bezogen (Sigma) . Die Aufreinigung erfolgte über Ionenaustausch-chromatographie mit DEAE1'- Fractogel (Merck) aquilibriert m 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 10 mM Ethylendiammotetraacetat (EDTA) und 10 mM 2-Mercaptoethanol. Nach Dialyse gegen Saulenpuffer wurde das Protein auf die Säule gegeben und über einen Gradien- ten von 0-0,3 M Kaliumchlorid in Saulenpuffer eluiert. Fraktionen mit Rιbose-5-Phosphat Isomerase Aktivität wurden mithilfe von Polyethylenglykol 20000 konzentriert und dann gegen Saulenpuffer dialysiert.
3. Native Molekulargewichtsbestimmung
Das native Molekulargewicht wurde über HPLC Gelfiltration bei einer Flußrate von 1,0 ml/mm über Bio-Sil TSK 250 (Merck) bestimmt. Letzteres Material wurde in 50 mM Natriumsulfat, 20 mM Natriumdihydrogenphosphat pH 6,8, aquilibriert. Als Proteinstandards wurden beta-Galaktosi- dase (465 kD) , Immunglobulin G (150 kD) , Antigen-bmden- des Antikörper-Fragment (Fab, 50 kD) und Myoglobm (17 kD) verwendet. Das native Molekulargewicht wurde durch Interpolation des Graphen aus Retentionszeit gegen den Logarithmus des Molekulargewichts bestimmt.
Diethylaminoeihyl 4. Proteinsequenzierung
Gereinigtes Protein wurde mithilfe von Cyanbromid oder mit Endoprotemase LysC wie beschrieben gespalten {Eckerskorn und Lottspeich, 1989, Chromatographia 28 ,
92-94}. Die resultierenden Peptide wurden uoer eine 2 x 125 mm Supersher 60 RP select B Säule (Merck) getrennt. Es wurde bei einer Flußrate von 200 μl/mm m einem 1%/mm Gradienten von Trifluoressigsäure (0,1 % (v/v)) in Wasser und Trifluoressigsäure (0,1 % (v/v)) in Aceto¬ nitril gearbeitet. Die resultierenden Peptide wurden in einem automatischen Porton 3600 Sequenziergerat (Beckman) über aminoterminale Degradation {Edman und Begg, 1967, Eur. J. Biochem., 80-91} abgebaut und die Aminosäuren über das Microbore HPLC System Gold (Beckman) identifi¬ ziert.
B. Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie Restriktionsspaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Ligationsansatze, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenz- analyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) {Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6} beschrieben durchgeführt.
2. PCR-Amplifikation eines Fragmentes der Rιbose-5-Phosphat Isomerase mithilfe degenerierter Oligonukleotide
Die PCR-Amplikation der Rιbose-5-Phosphat Isomerase wurde m einem DNA-Thermal Cycler der Firma Perkm Eimer durchgeführt. Die verwendeten Oligonukleotide sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Reaktionsgemische enthielten 8 ng/1 doppelstrangige Blatt-spezifische Spinat cDNA, 0, 5 μM der entsprechenden Oligonukleotide, 50 μM
Nukleotide (Pharmacia) , 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C) , 1,5 mM Magnesiumchloπd) und 0,02 U/1 Taq Polymerase (Perkin Eimer) . Die Ampli- fikationsbedmgungen wurden wie folgt eingestellt: Anlagerungstemperatur': 45°C, 1 min Denaturierungstemperatur: 92°C, 1 min Elongationstemperatur: 72°C, 1 min Anzahl der Zyklen: 35
Es resultierte ein Fragment von 119 Basenpaaren2) , das in den mit dem Restriktionsenzym HincII geschnittenen Vektor pBluescriptSK+ (Stratagene) ligiert wurde. Mit dem Liga- tionsansatz wurde E. coli nm522 transformiert und das Plasmid pPCRrpil erhalten.
3. Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek mittels einer DNA- Sonde
Die Konstruktion der genutzten cDNA-Bank aus Spinat ist beschrieben bei Henze et al. , 1994, Plant Mol. Biol. 26. 1961-1973. Es wurden 4xl04 rekombinante Lambda Phagen der blattspezifischen cDNA-Bibliothek aus Spinat auf Agarplatten mit E. coli P0P13 als Bakterienstamm aus - plattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels Standardverfahren {Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6} auf Nitrocellulosefilter (Gelman Sciences) überführt und auf den Filtern fixiert. Als Hybridisierungssonde (Clal/Xhol-Fragment des Plas- mides pPCRrpil) diente die o.g. Sequenz aus 119 Basen¬ paaren, die mit Hilfe eines "Multiprime DNA labelling Systems" (Amersham Buchler) in Anwesenheit von α-32P-dCTP (Amersham; spezifische Aktivität 3000Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wurden. Die Hybri- disierung der Membranen erfolgte nach Prähybridisierung bei 60°C in 3 x SSPE, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (w/v), 0,02 % Polyvinylpyrolidon (w/v), 0,02 % Ficoll 400 3) (w/v) und 50 μg/ml Kalbsthymus DNA für 12-16 Stunden {Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6}. Anschließend wurden die
Filter 60 Minuten in 2 x SSPE, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (w/v) bei 60°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und durch Standardtechniken gereinigt und vereinzelt.
4. Ξequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem automatischen Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer (A.L.F.) der Firma Pharmacia unter Verwendung Fluores-
2) dies sind die Basen 511 -629 der SEQ ID NO 1. •^ von Serva zenz-markierter Oligonukleotide nach der Methode von Sanger {Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 , 5463-5467}. Es wurden drei Sequenzen codierend für Rιbose-5-Phosphat Isomerase erhalten.
Die DNA Sequenz der längsten cDNA Sequenz des Klons pRI12 ist in SEQ ID N01 dargestellt (Genbank Accession Nummer L43068) . Der 1118 Basenpaar lange cDNA-Klon pRI12 enthalt einen offenen Leseraster von 870 Basen und kodiert für ein Protein mit 239 Aminosäuren. Die Analyse des Poly- peptides unter Verwendung der Peptidsequenzen der Mikro- Sequenzierung ergab, daß am N-Termmus des Proteins eine Sequenz mit typischen Charakteristika eines chloroplasti- daren Transitpeptids von 50 Aminosäuren vorhanden ist.
5. Vergleich der plastidären Rιbose-5-Phosphat Isomerase aus Tabak mit bekannten Rιbose-5-Phosphat Isomerase Protein¬ sequenzen über Homologievergleiche der abgeleiteten Ammosauresequenz des Klons pRI12 {mithilfe der GCG Soft- wäre (Univeritat von Wisconsin, U.S.A.)} mit publizierten Rιbose-5-Phosphat Isomerase-Sequenzen ergaoen, daß bis zu 36% Aminosaureidentitat zu den Sequenzen aus Caenorhab- ditis elegans, Haemophilus mfluenzae und Synechocystis PCC6803 bestehen. Aufgrund des Fehlens hochkonservierter Bereiche ist eine Isolation einer pflanzlichen Sequenz mithilfe degenerierter Oligonukleotide abgeleitet aus einem Sequenvergleich dargestellter Sequenzen unwahr¬ scheinlich.
Abbildungen
1. Stellung der Ribose-5-Phosphat Isomerase im oxidativen (OPPP) und reduktiven Pentosephosphatweg (Calvin Zyklus)
2. Nukleotidsequenz der plastidären Ribose-5-Phosphat Isomerase aus Spinat am Beispiel des Klons pRI12
3. Aminosäuresequenz der plastidären Ribose-5-Phosphat Isomerase aus Spinat abgeleitet vom Beispiel des Klons pRI12
4. Aminosaurevergleich der plastidären Ribose-5-Phosρhat Isome¬ rase aus Spinat mit der Ribose-5-Phosphat Isomerase aus Maus, E. coli, Caenorhabditis elegans, Synechocystis PC C 6803 und Haemophilus influenzae
5. Peptidsequenzen und Oligonukleotide zur PCR-Arr.plifikation der plastidären Ribose-5-Phosphat Isomerase
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Cari-3osch-Strasse 38
(C) ORT: Ludwigshafen
(E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(G) TELEPHON: 0621/6048526
(K) TELEFAX: 0621/6043123
(I) TELEX: 1762175170
(ii) ANMELDETITEL: Ribose-5-Phosphat Isomerase aus Pflanzen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1118 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (A) ORGANISMUS: Spinat (ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 25-894
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CCGCTCTCAAACTCAAACTCTCCAATGGCTTCCGCCGCTTTCTCTCTCCTCCCCTCCACC 60
M A S A A F S L L P S T TCCTCCACCACCTTTAACCGCCATGCCACCACCAAACTCCTCAACCTCAAATTCCTCCAC 120 S S T T F N R H A T T K L L N L K F L H AACCACCGTAACAAACCCTTCTTCACCACCACAATCAAATCTCTCTCTTCTCCCTCCCCA 180 N H R N K P F F T T T I K S L S S P S P ACACCAGTCTTAACTCAAGACGATCTCAAGAAACTCGCCGCCGAAAAAGCCGTCGACTCC 240 T P V L T Q D D L K K L A A E K A V D S GTCAAATCCGGCATGGTTCTCGGTCTCGGAACCGGAAGTACTGCCGCATTTGCTGTCTCG 300 V K S G M V L G L G T G S T A A F A V S CGAATCGGCGAGCTTCTCTCTGCCGGAAAACTGACCAACATCGTTGGAATTCCTACCTCG 360 R I G E L L S A G K L T N I V G I P T S AAGCGGACCGCAGAGCAGGCGGCGTCTCTTGGAATTCCGCTCTCCGTTCTCGATGATCAT 420 K R T A E Q A A S L G I P L S V L D D H CCTCGAATTGACCTCGCCATTGATGGCGCCGATGAGGTTGATCCTGATCTTAATCTGGTT 480 P R I D L A I D G A D E V D P D L N L V AAGGGGCGCGGTGGGGCGCTCTTGAGAGAAAAGATGGTTGAAGCTGCTAGTGATAAATTT 540 K G R G G A L L R E K M V E A A S D K F ATTGTTGTTGTTGATGATACTAAGCTTGTTGATGGTTTGGGTGGTAGTCGTCTTGCTATG 600 I V V V D D T K L V D G L G G S R L A M CCTGTTGAAGTTGTTCAATTTTGCTGGAAATATAATCTCAAGAGATTACAGGAGATCTTT 660 P V E V V Q F C W K Y N L K R L Q E I F AAGGAGCTGGGTTGTGAGGCAAAATTGAGAATGGAAGGGGATAGCAGTCCTTATGTGACT 720 K E L G C E A K L R M E G D S S P Y V T GACAACTCGAATTACATCGTGGATTTATACTTCCCGACCTCGATTAAGGATGCTGAAGCT 780 D N S N Y I V D L Y F P T S I K D A E A GCAGGGAGAGAAATTTCGGCCTTGGAAGGCGTAGTAGAACATGGGTTGTTCTTGGGTATG 840 A G R E I S A L E G V V E H G L F L G M GCTAGCGAAGTCATCATTGCTGGGAAAACTGGAGTTAGTGTGAAAACCAAGTGATTTTTG 900 A S E V I I A G K T G V S V K T K Stop ttggtttgattggttgacttccgggtatggaatagtctccctctccccagaatacctact 960 tgttttcattttatatatgttctctctcacttcatgtaatgtttagatgagtttctgggg tctggtttgatatttttgcatctgttgtatctgttfttgttttgattttagctaattgt g-_tatgaagtgtagatgaggaatcaatggcgagagcgg 1118 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 289 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
MET ALA SER ALA ALA PHE SER LEU LEU PRO SER THR SER SER THR 15
THR PHE ASN ARG HIS ALA THR THR LYS LEU LEU ASN LEU LYS PHE 30
LEU HIS ASN HIS ARG ASN LYS PRO PHE PHE THR THR THR ILE LYS 45
SER LEU SER SER PRO SER PRO THR PRO VAL LEU THR GLN ASP ASP 60
LEU LYS LYS LEU ALA ALA GLU LYS ALA VAL ASP SER VAL LYS SER 75
GLY MET VAL LEU GLY LEU GLY THR GLY SER THR ALA ALA PHE ALA 90
VAL SER ARG ILE GLY GLU LEU LEU SER ALA GLY LYS LEU THR ASN 105
ILE VAL GLY ILE PRO THR SER LYS ARG THR ALA GLU GLN ALA ALA 120
SER LEU GLY ILE PRO LEU SER VAL LEU ASP ASP HIS PRO ARG ILE 135
ASP LEU ALA ILE ASP GLY ALA ASP GLU VAL ASP PRO ASP LEU ASN 150
LEU VAL LYS GLY ARG GLY GLY ALA LEU LEU ARG GLU LYS MET VAL 165
GLU ALA ALA SER ASP PHE LYS ILE VAL VAL VAL ASP ASP THR LYS 180
LEU VAL ASP GLY LEU GLY GLY SER ARG LEU ALA MET PRO VAL GLU 195
VAL VAL GLN PHE CYS LYS TRP TYR ASN LEU LYS ARG LEU GLN GLU 210
ILE PHE LYS GLU LEU GLY CYS GLU ALA LYS LEU ARG MET GLU GLY 225
ASP SER SER PRO TYR VAL THR ASP ASN SER ASN TYR ILE VAL ASP 240
LEU TYR PHE PRO THR SER ILE LYS ASP ALA GLU ALA ALA GLY ARG 255
GLU ILE SER ALA LEU GLU GLY VAL VAL GLU HIS GLY LEU PHE LEU 270
GLY MET ALA SER GLU VAL ILE ILE ALA GLY LYS THR GLY VAL SER 285
VAL LYS THR LYS STOP

Claims

Patentansprüche
1. Protein mit Rιboεe-5-Phosphat Isomerase-Aktivitat, enthaltend 5 eine Ammosauresequenz, die eine Teilsequenz von mindestens
100 Aminosäuren aus SEQ ID NO 2 darstellt.
2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Ammosauresequenz die Teilsequenz 50-239 aus SEQ ID NO 2 ent- 0 halt.
3. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Ammosauresequenz die m SEQ ID NO 2 dargestellte Sequenz enthalt. 5
4. Nuklemsaure, codierend für ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Nuklemsaure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0 aus der m SEQ ID NO 1 dargestellten Sequenz besteht.
6. Vektoren, enthaltend eine Nuklemsaure gemäß Anspruch 4 oder 5 zusammen mit funktionellen Regulationssignalen.
5 7. Verwendung eines Proteins mit Rιbose-5-Phosphat Isomerase- Aktivitat gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Identifizierung von herbiziden Wirkstoffen.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die 30 Identifizierung mittels eines m vitro Testsystems erfolgt.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Testsystem ein Enzymhemmtest eingesetzt wird.
35 10. Testsystem zur Identifizierung von Rιbose-5-Phosphat
Isomerase-Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die potentiellen Inhibitoren mit einem Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 mkubiert und anschließend die Ribose- 5-Phosphat Isomerase-Aktivitat bestimmt.
40
11. Herbizide Wirkstoffe, identifizierbar mittels eines Test¬ systems gemäß Anspruch 10.
45
12. Verfahren zur Herstellung von herbiziden Mitteln, die eine pflanzliche Ribose-5-Phosphat Isomerase inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß man bekannte chemische Verbindungen in einem Testverfahren gemäß Anspruch 10 überprüft und solche mit inhibierender Wirkung mit üblichen flüssigen und/oder festen Träger- und Hilfsstoffen als Herbizid formuliert.
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