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WO1997035974A1 - Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires - Google Patents

Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires Download PDF

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WO1997035974A1
WO1997035974A1 PCT/FR1997/000543 FR9700543W WO9735974A1 WO 1997035974 A1 WO1997035974 A1 WO 1997035974A1 FR 9700543 W FR9700543 W FR 9700543W WO 9735974 A1 WO9735974 A1 WO 9735974A1
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WO
WIPO (PCT)
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sequence
protein
gene
vector
expression
Prior art date
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Application number
PCT/FR1997/000543
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English (en)
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WO1997035974A9 (fr
Inventor
Denise Paulin
Victor Small
Herber Mossler
Zhenlin Li
Mathias Mericskay
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Paris Diderot Paris 7
Institut Pasteur
Original Assignee
Universite Paris Diderot Paris 7
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paris Diderot Paris 7, Institut Pasteur filed Critical Universite Paris Diderot Paris 7
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Priority to AU23907/97A priority patent/AU2390797A/en
Priority to JP9534091A priority patent/JP2000507819A/ja
Publication of WO1997035974A1 publication Critical patent/WO1997035974A1/fr
Publication of WO1997035974A9 publication Critical patent/WO1997035974A9/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Definitions

  • the present invention relates to sequences upstream of a gene expressed in smooth muscle cells such as SM 22, as well as to vectors containing them.
  • vectors and sequences in therapy, for example for the production of locally or systemically active polypeptides, in particular immunogenic polypeptides, endogenous regulatory polypeptides such as cytokmes, or also for the production RNA of therapeutic interest, for example an antisense RNA
  • the invention relates to the use of vectors and nucleotide sequences in the treatment of vascular diseases.
  • Atherosclerosis is a degenerative disease of the arteries associating lesions of arteriosclerosis and atheroma, and thus combining a hardening of the arteries and a fatty degeneration of their internal coat.
  • This coronary insufficiency is generally remedied by percutaneous coronary angioplasty consisting of introduce into the coronary artery network a catheter provided at its end with a balloon, advance the catheter to the level of the stenosis and inflate the balloon in order to crush the lesion against the wall and thus restore a coronary caliber allowing sufficient myocardial perfusion.
  • This myocardial revascularization technique is very widely used (50,000 procedures per year in France and 500,000 procedures per year in the United States) but is however limited by the reappearance, in the months following the operation, of a new lesion in the dilated site, or restenosis, in approximately 30% of cases
  • intimal hyperplasia is due to the proliferation of smooth muscle cells in the intima, which results in the synthesis of a bulky extra cellular matrix This activation would be induced by the local release of growth factors, and cytokines, as well as by the suppression of the synthesis of certain antiproliferative endothéaux peptides
  • arterial reshaping consists in a reduction of the caliber of the artery without modification of the thickness of the wall, and therefore without proliferation of cells.
  • the proteins constituting smooth muscles have been the subject of plot studies.
  • the protein SM 22 which constitutes one of the first markers to appear during the differentiation of smooth muscle cells, has been studied and the coding part of its gene has been sequenced in mice (SOLWAY and AL, 1995, J Biol Chem, 270 22, 13460-13469) and in rats (KEMP and AL 1995, BIOCHEM J 310, 1037-1043).
  • the gene coding for the protein SM 22 alpha in mice is composed of five exons and comprises 6.2 kb II is present in a single copy in the genome SOLWAY et al, have shown that the 441 base pairs upstream of the region coding gene were necessary and sufficient to induce a high level of transcription of a reporter gene in primary cell cultures of rat aortas and in A 7r5 lines. They also demonstrated that the messenger RNAs of this gene were expressed at high levels in the aorta, in the uterus, in the lungs and in the intestine.
  • OSBOURN and AL (1995 Gene 154, 249-253) have also studied the 5 'region upstream of the rat SM 22 gene. They have demonstrated the presence of two introns in this region.
  • the applicant set out to identify in vivo, on adult individuals, the activity of the various regions constituting the region upstream of the expressed coding sequence of the gene for the SM 22 II protein, on the other hand, endeavored to determine whether changes in this sequence induced changes in gene expression in different tissues.
  • the invention also relates to any nucleotide sequence or oligonucleotide of natural origin or obtained by chemical synthesis having a homology with the sequence SEQID No. 1 of at least 70%.
  • nucleotide sequence of natural origin is intended to mean a fragment of complementary DNA obtained by reverse transcription of cellular messenger RNA or alternatively a fragment of genomic DNA obtained after cleavage of cellular DNA using enzymes. restriction.
  • nucleotide sequence obtained by chemical synthesis means a DNA fragment of known sequence generated by automatic synthesis of polynucleotides, for example using a suitable automatic device.
  • protein or RNA of therapeutic interest means a molecule capable of inhibiting the growth of smooth muscle cells, activating the growth of endothelial cells, consolidating the arteries and / or capable of inducing a cellular or humoral immune response .
  • the term "strongly stringent conditions" is used in the sense given by Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, NY USA or one of its recent reissues
  • the hybridization conditions are as described by Maniatis (edition of 1982) Three washes intended to remove the non-hybrid fragments are necessary and are carried out at 65 ° C. in the presence of 0.2 SSC and 0.1 % SDS, in the absence of formamide.
  • said sequence comprises a fragment of the sequence between nucleotides -2126 and +4135, whose sequence SEQ ID No. 1 is given in the appendix, of the sequence between nucleotides
  • Such a fragment may in particular comprise at least part of the sequence SEQ ID No. 5 which corresponds to the part upstream of the 5 'end of the coding part comprised between the nucleotides -2126 and -1340.
  • sequence SEQ ID No. 5 the sequence of which is given in the appendix constitutes an object of the present invention.
  • sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 1 are included respectively in the plasmids p2126nlz and p2126INTnlz carried by the strains deposited on March 25, 1996 with the Collection
  • the subject of the invention is also the sequences hybndant under conditions of high stringency with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2. SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5.
  • sequences including the sequence of the first intron of the SM gene
  • sequence SEQ ID No. 1 constitute particularly advantageous modes of implementation of the present invention, because they allow expression of proteins or RNA of therapeutic interest, in adults, specific for arteries.
  • the present invention is however not restricted to sequences containing fragments of the mouse gene, but relates to any other sequence of any other species having the same properties, namely to specifically induce expression of a gene in artery cells .
  • a person skilled in the art may advantageously refer to the article by KEMP et AL (1995, previously cited) which describes the sequence upstream of the rat gene of the SM 22 protein.
  • the present invention also covers any sequence comprising fragments sequences upstream of genes of the SM 22 protein, modified for example by deletion of certain structures which retain identical or similar functions to those of the complete sequence.
  • the protein of therapeutic interest can be a protein inducing the formation of a cytotoxic compound, such as the thymidine kmase of the herpes virus.
  • This protein has the particularity of transforming ganciclovir (Merck Index, reference 4262), an analogue of the guanosine, a derivative which blocks the synthesis of DNA in replicating cells
  • transforming ganciclovir Merck Index, reference 4262
  • an analogue of the guanosine a derivative which blocks the synthesis of DNA in replicating cells
  • the introduction of a gene coding for this protein in the sequences according to the present invention therefore makes it possible to block the proliferation of cells in the case of intimal hyperplasia.
  • a sequence encoding thymidine kinase is described in particular by Caruso and Klatzmann (1992, Proc Natl Acad Sci., USA, 89, 182-186).
  • Said protein of therapeutic interest can also be a protein exhibiting a cytostatic effect, such as the protein encoded by the Rb gene (Chang et al., 1995 Science, 267, 518-522), or by the eNOS gene (Hamon et al ., 1994, Circulation, 90, 1357-1362).
  • a lipoprotein lipase Such proteins are coded by the sequences described by Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) and Ming Sun Liu (1994, J. Biol. Chem, 269-11417).
  • Such a protein can in particular be a mterleukin.
  • It can be a muscle protein, such as myosin, or organism, or a tissue structure protein such as collagen or elastin.
  • It can be a protein inducing an immune response as described in application WO 90 11092, and in particular a viral antigen such as the glycoprotein gp120 or the protein Nef of HIV (human immunodeficiency virus).
  • a viral antigen such as the glycoprotein gp120 or the protein Nef of HIV (human immunodeficiency virus).
  • said protein can be one or more proteins of therapeutic or vaccine interest, such as proteins of immunotherapeutic interest, for example mterleukins, growth factors, for example fibroblast growth factors (FGF) or NGF (Nerve Growth Factor), proteins which can induce an immune response, whether it is humoral, cytotoxic or cellular immunity, or proteins making it possible to complement the activity of a gene normally expressed in the individual to be treated but which no longer is, either by mutation or deletion of its sequence.
  • FGF fibroblast growth factors
  • NGF Neve Growth Factor
  • This sequence can also code for an RNA of therapeutic interest.
  • Such an RNA can be the antisense RNA of the protein p 53 or an RNA as described in application WO 90 11092 filed by the company VICAL.
  • the present invention further relates to vectors characterized in that they contain a sequence according to the invention, as described above.
  • a vector may contain any other DNA sequence necessary for the expression of the protein, or RNA, of therapeutic interest in the target tissues, and in particular may contain an origin of replication which is effective in artery cells, in particular in smooth muscle cells.
  • Such a vector may comprise sequences allowing homologous recombination in the organism treated, specific for the gene to be replaced, said sequences being placed upstream and downstream of the sequence according to the invention. Due to the presence of such sequences, the gene unwanted, present in the organism treated will be replaced by the gene carried by the vector or the sequence and which one wishes to see expressed in the organism.
  • Such a homologous recombination method can be of the type described by Le Mouellic et al, (1990, Proc. Nat Acad Sci USA, 87, 4712-4716) or in PCT application WO 91 / 06.667.
  • Such a vector can be a vector derived from an adenovirus
  • Adenoviruses suitable for the implementation of the present invention are in particular those described by FELDMAN and STEG (1996, previously cited) or OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781-784) or in application FR 94 03.151 (Institut Pasteur, Inserm) These viruses are generally rejected by the individual, due to their too strong immunogenicity Nevertheless, strains of these viruses have been selected in order to reduce their character immunogenic.
  • these vectors even having a strong immunogenicity, can be used in the context of the present invention, since the arteries are treated for relatively short periods of time of the order of a few weeks, compatible with the times of rejection of adenoviruses by the host's immune system. It should nevertheless be noted that the introduction of the sequences according to the present invention into the vectors described above is not essential, and that the cells of the arteries can be directly transfected with DNA comprising these sequences.
  • nucleic acid sequences according to the present invention can be introduced after covalent coupling of the nucleic acid with compounds promoting their penetration into cells or their transport to the nucleus, the resulting conjugates being optionally encapsulated in polymeric microparticles, as in international application WO 94/27238 from Meidsorb Technologies International.
  • the nucleic sequences can be included in a transfection system comprising polypeptides promoting their penetration into cells, as in international application WO 95/10534 from Seikagaku Corporation.
  • vectors or sequences can be administered in situ by any means known to a person skilled in the art.
  • they can be delivered in situ using a balloon catheter covered with channels, as described by FELDMAN and STEG (1996). , previously cited).
  • aorta can also be administered during an operation, or by stripping the aorta.
  • Another mode of administration consists in introducing a small mesh grid impregnated with DNA comprising these sequences, along the aorta, as described. by Feldman et al. (1995, J. Clin. Invest 95 2662-2671).
  • sequences or vectors can advantageously be administered in the form of a composition containing them, for example in a gel facilitating their transfection into artery cells.
  • a gel can be a complex of poly-L lysine and lactose, as described by MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21, n ° 4, 871 -878) or poloxamer 407 as described by PASTORE (1994, Circulation, 90, 1-517). They can also be dissolved in a buffered solution or be combined with liposomes.
  • the present invention further relates to medicaments containing such sequences, vectors or compositions, as well as to pharmaceutical compositions containing them in amounts pharmaceutically effective as well as pharmaceutically compatible excipients.
  • Such sequences, vectors or compositions can be advantageously used for the manufacture of medicaments for the delivery to the arteries of a DNA (cDNA or genomic DNA) which can express in particular a gene coding for a protein of interest, for the treatment of coronary heart disease, and in particular for the treatment of restenosis. They can nevertheless also be used for the manufacture of a medicament for the treatment of mutations which weaken the vessels.
  • a medicament could, for example, comprise a sequence or a vector according to the invention capable of expressing a gene coding for a normal protein of desmin or a muscle adhesion protein of the CAM type.
  • the present invention also relates to RNAs expressed from the sequences and vectors which are the subject of the present invention, and in particular messenger RNAs.
  • the present invention also relates to a method for screening molecules in vitro, with a view to testing their activity on the regulatory sequences of the gene coding for the SM protein 22.
  • a method for screening molecules in vitro will comprise, for example, a first step according to which one transfects cells with a sequence or a vector according to the invention, comprising a reporter gene placed under the control of all or part of the promoter sequence of the gene coding for the SM 22 protein.
  • the cells thus transfected are incubated in the presence of the molecule to be tested, then the expression of the reporter gene is quantified.
  • the cells used for the transfection are advantageously smooth muscle cells, in particular aortic cells, either in the form of a primary culture, or in the form of a stable cell line.
  • the quantification of the beta-galactosidase produced will advantageously be carried out by optical reading, for example using the detection kit sold by Boehringer under the reference 1 669 893 ( Boehringer catalog Mannheim - "Biochemicals”. 1996, page 236, beta-Gal Reporter Gène Assay, Chemilummescent).
  • the reporter gene is the gene coding for luciferase
  • the quantification of the expression of luciferase is advantageously carried out by chemiluminescence, for example by means of the diagnostic kit marketed by Boehringer under the reference 1 758 241 (Boehringer-Mannheim catalog "Biochemicals", 1996, Luciférase Reporter Gène Assay).
  • the present invention also relates to transgenic animals and in particular mice carrying a sequence or a vector as defined above in which the gene coding for the protein of therapeutic interest is replaced by a reporter gene
  • the present invention finally relates to a method for detecting mutations in the sequence upstream of the coding part of the gene for the protein SM22.
  • Such mutations are indeed capable of modifying the expression of the gene coding for the protein SM22, in particular reducing or even abolishing the expression of this gene in smooth muscles.
  • Such mutations would be likely to cause a modification of the functioning of smooth muscle, the SM22 protein being related to a family of proteins involved in the regulation of calcium binding, of the calponine type (Ayme-Southgate et al. 1989, J Cell . Biol.).
  • Such a mutation detection method can advantageously be the method which is the subject of French patent application FR-93 10821.
  • sequences according to the invention modified so that they allow an increase in the expression of the SM22 gene are also part of the invention.
  • transgenic mice can be used to screen molecules for their activity on the regulatory sequences gene coding for the SM 22 protein. Molecules can be administered to mice, then after sacrifice, histological sections are carried out in order to highlight the tissues stained by the reporter gene.
  • a person skilled in the art can advantageously refer to the following manual "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor
  • FIG. 1 represents the restriction map and the exon / intron structure of the SM 22 site, comprising the region -2474 to +6030 (relative to the site of initiation of transcription)
  • the exons are represented by white squares while the arrows indicate the position of repeated B1 type sequences.
  • FIG. 2 represents the alignment of three repetitive sequences of type B1, in which the basic exchanges are indicated
  • FIG. 3 is an autoradiogram illustrating the identification of the site of initiation of transcription.
  • the well P corresponds to the primer used.
  • FIG. 4A represents the sequence of the 5 ′ region upstream of the transcription initiation site, and of the exon of the SM 22 gene. The sites for the attachment of the different factors are indicated, as well as the various concensus sequences. The broken lines. indicate the position of repeated B1 type sequences.
  • Figure 4B is a schematic restriction map of the SM 22 gene.
  • Figure 4C is a detailed restriction map of the SM 22 gene.
  • Figure 5 illustrates the manufacture of the plasmid p352nlz.
  • FIG. 6 illustrates the manufacture of the plasmid p2126 nlz.
  • Figure 7 illustrates the manufacture of the plasmid p2126INTnlz.
  • FIGS. 8A and 8B illustrate the expression of the lacZ gene in embryos of transgenic mice.
  • FIGS. 8A, 8B represent embryos at the 12.5 and 15.5 day stages, respectively.
  • FIGS. 9A to 9D represent histological sections of embryos stained using lacZ
  • FIG. 9A represents a section of an embryo at the 12.5 day stage in the heart, showing an intense coloration exclusively in the myocardium of the ventricle right (RV) and in the artery walls (abbreviations: AA: elbow of the fourth aortic artery; CA: carotid artery; E: esophagus; Iv: left ventricle; PA: proximal part of the aorta; PT: pulmonary trunk; RA: right atrium; RV: right ventricle; T: trachea; V: right and left cardinal vein).
  • AA elbow of the fourth aortic artery
  • CA carotid artery
  • E esophagus
  • Iv left ventricle
  • PA proximal part of the aorta
  • PT pulmonary trunk
  • RA right atrium
  • RV right ventricle
  • T trachea
  • FIG. 9B represents a section through the abdominal region of an embryo at the 14.5 day stage, showing a coloration of the umbilical arteries (AU) and the absence of labeling of the viscera (B: bladder; D: duodenum; H: large intestine; L: liver; M: small intestine; ST: stomach).
  • AU umbilical arteries
  • Figure 9D is a section through the tail segments at the 12.5 day stage showing the labeling in the myotome (my) and the tail artery (a).
  • FIG. 9C is an enlargement of the part of the photograph corresponding to the umbilical artery at the 12.5 day stage, showing an exclusive marking of the muscular layer (m) and an absence of marking of the endothelium (e).
  • FIGS 10A to 10C illustrate the expression of the transgene in adult mice
  • FIG. 10A represents a top view of the whole of the heart showing an intense marking of the aorta (a) and of the pulmonary artery (pa) and an absence of marking of the vena cava (vc).
  • Figures 10B and 10C are sections through the smooth muscle layer (sm) of the adult colon and an adjacent mesentery artery (ma).
  • the lacZ labeling shows that the expression of the transgene is restricted to the artery while the immunofluorescence with SM 22 antibodies (FIG. 10C) highlights the expression of the endogenous SM 22 gene in the cells of the smooth muscle of both the artery and the colon.
  • Figure 11 represents a vector comprising the regulatory regions of the SM 22 gene and the gene encoding the thymidin kinase of the herpes virus.
  • FIGS. 12A to 12D illustrate the expression of the SM 445 nlz construction in embryos of 15.5 pc days (FIGS. 12A to 12C) and in an adult of 2 months (FIG. 12D).
  • phage delta-EMBL 3 Approximately 10 6 recombinant phages from a c57 / bl mouse genomic library constructed in phage delta-EMBL 3 (supplied by Dr D. Plachov Munster, Germany) were screened using the BAL 1 / Eco RV fragment of 890 bp from the complementary DNA of the mouse protein SM22 (Almendral et al, 1989; Exp. Cell Res 181, 518-530), as probe The probe was radioactively labeled by random initiation and the DNA was hybridized on filters left overnight at 65 ° C in Church buffer.
  • the sequence of the SM 22 gene was determined on both strands by the chain termination method (Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad Sci. 74, 5463) using the Sequenase V2.0 kit (United States Biochemical , Cleveland, Ohio).
  • RNA from cell lines and adult mouse tissue was isolated by the method of Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18.
  • the 5'RACE method was carried out using two synthetic 18 bp antisense oligonucleotides corresponding to the bases +112 to +129 (primer 2) and +162 to +179 (primer 1) of the complementary DNA SM 22, as described in substance by FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl. Acad Sci, 85, 8998-9002).
  • RNA polymerase T 7 RNA polymerase T 7 in the presence of 32 P-CTP.
  • the probe (3 X 10 5 cpm) was hybridized with 5 ⁇ g of messenger RNA from mouse uterus at 42 ° C. overnight After hybridization, the samples were incubated with RNases A and T (1 hour at 37 ° C), precipitated, and analyzed as described for primer extension analysis.
  • the NIH 3T3, 10T1 / 2 and 8/47 cell lines were cultivated in DMEM (Life Technologies, Inc, Vienna, Austria) supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone Inc., United States) at 37 ° C, in an atmosphere of Co2 at 7%.
  • DMEM Life Technologies, Inc, Vienna, Austria
  • 10% fetal calf serum Hyclone Inc., United States
  • Co2 Co2
  • the cells were removed from petri dishes with a cell scraper, centrifuged, resuspended in 150 ⁇ l of buffer Z
  • mice carrying the transgene were identified by PCR and Southern hybridization using a DNA probe.
  • the construction pnlz2126 made it possible to obtain three positive animals out of 17 mice, two of them transmitting and expressing this construction.
  • transgenic mice were backcrossed with c57 / bl mice and the histochemical stains were carried out with hemizygous mice for the transgene.
  • the histological sections were made with a thickness of 7 to 10 ⁇ m and again stained with Ehrhch hematoxline and eosin On the other hand, the embryos could be clarified again using a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate.
  • mice were fixed in 3% of paraformaldehyde in PBS buffer at 4 ° C for 3 hours, then coated in Tissue-Tek medium (Reichert-Jung, Vienna) and sectioned on a cryopreservation. microtome at thicknesses of 5 to 10 ⁇ m
  • the selected sections were mounted and stained using a monoclonal antibody directed against SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations, 55, 1-11), at a dilution 1 / 30 as well as using a secondary antibody labeled Cy3 (Biological Detection Systems, USA). The sections were examined using a fluorescence microscope.
  • the regions of interest have been subcloned and sequenced.
  • the sequence was determined between positions -2474 and +1 10 downstream of the polyadenylation site and was compared in the EMBL database.
  • the gene covers 5923 bp from the start of transcription site to the polyadenylation site and the coding sequence is divided into 5 exons ( Figure 1). All exon-intron boundaries correspond to consensus sequences.
  • the first exon contains only a 5 'leader sequence and the transcription start codon is therefore located in the second exon separated from the transcription start site by more than 4 kbp of intron sequence.
  • Two potential polyadenylation signals have been located at positions 5905 and 5913 and several TGT regions placed downstream of the polyadenylation site, presumably take part in the termination of transcription.
  • the transcription start site was mapped by primer extension analysis ( Figure 3).
  • An antisense oligonucleotide complementary to the 3 ′ end of exon 1 leads to the production of four extension products which differ only in a pair of bases (bp) in length, the longest of them being 65 bp.
  • the transcription product therefore starts with a G, 77bp upstream of the transcription initiation codon.
  • the shortest extension products were thought to be caused by premature termination of primer extension due to capping at the 5 'end of the messenger RNA.
  • the TTTAAA sequence in position -28bp ( Figure 4) is closely related to the TATAAA sequence and probably has the function of a TATA box.
  • Computer analysis of the 5 'sequence reveals the presence of several potential binding sites for factors as well as for elements which are known to contribute to the regulation of muscle gene transcription (Figure 4).
  • a total of 11 E-type boxes (CANNTG), four Mef-2 / rSRF-type patterns (YTAWAAATAR), four potential SRF linkers (CC (A / T) 6GG), five AP-2 link sites (CCCMNSSS) and five SP1 motifs (GGGCGG) have been located.
  • CCCMNSSS AP-2 link sites
  • GGGCGG five SP1 motifs
  • the plasmid pGEM7 (that is to say the plasmid pGEM-72F (+/-), marketed by Promega Corp., Madison, Wi, USA. Sequences available in Gen Bank, under the following numbers X65310 and X 65311) comprises an ampiciliin resistance gene, a lac Z gene and an origin of replication II comprises 3000 base pairs. It was digested with Nae 1 / Bsp 120I. The outgoing Bsp 120I end of the vector was made "blunt ends" with the Klenow enzyme, and the plasmid was closed in the presence of a 10 bp Sal I linker. The lacZ fragment of pGEM 7 was therefore deleted. a Sal I site introduced, and a Bsp 120I site restored.
  • a Pme I site was introduced by insertion of a Pme I linker with Nsi I outgoing single-stranded ends, into the Nsi I site of the construction.
  • lacZ gene coupled to the nuclear localization signal was isolated from pDes2.2nlz (Ll et al, 1993, cited above) with Hind III and Sac I giving two fragments of the reporter gene.
  • the two fragments were inserted between the Hind III and Sac I sites of the modified pGEM7 vector and checked for their orientation. This procedure gives the vector pnlz without promoter.
  • Figure 5 illustrates the manufacture of this plasmid.
  • the first construction, p2126nlz contains 2126 bp of the upstream region and the first exon (65 bp)
  • the second construction p2126INTnlz is identical to the first except for the addition of the first mtron and the first 12bp of the second exon.
  • each of the constructs gave rise to at least one transgenic mouse expressing the reporter gene.
  • the embryos obtained from 12.5 to 15.5 days after coitus (dpc) were stained so as to highlight the ⁇ gal activity.
  • the expressions of the two constructions are identical, at all stages observe although p2126INTnlz gives a little more intense coloring.
  • the sections show that the expression of the transgene is restricted to the myotomal region of the segments (FIG. 9D).
  • the expression takes place in the vascular system of the developing embryo. From 9.5 days, the expression is detected in the dorsal aorta. At 10.5 days, the coloration of the dorsal aorta and aortic elbows increases and at 11.5 days, the lacZ expression is clearly visible in the dorsal aorta, the aortic elbows the iliac arteries, the umbilical arteries, the carotid arteries and in the major vessels of the head.
  • lacZ is present in the major vessels including those of the limbs and of the tail, and the coloration of the pulmonary trunk becomes visible
  • Expression in the system vascular disease persists in adults and is clearly visible in the aorta. in the pulmonary trunk and in the right pulmonary artery ( Figure 10A), as well as in the vessels of the intestines ( Figure 10B), in the bladder and in the uterus.
  • FIG. 10B shows that the expression of the transgene is absent in the muscles of the colon whereas the mesentery vessel is very strongly colored by lacZ
  • FIG. 10B shows that the expression of the transgene is absent in the muscles of the colon whereas the mesentery vessel is very strongly colored by lacZ
  • the coloring by immunofluorescence of the section of a similar intestinal region shows that the endogenous SM 22 protein is present in both tissues (FIG.
  • SM 22 INT-TK herpes virus thymidine kinase
  • the HIV-LTR fragment (-167, + 80) is deleted from the plasmid pLTR-TK by Hind III digestion, the ends of which are made blunt with the Klenow enzyme, followed by Xho I digestion.
  • the plasmid closed by inserting a linker containing the Xhol sites in 5 ', the Hind III and Bsp 120I sites in the order 5' -> 3 'and a 3' blunt end to give the vector p-TK
  • a Bsp fragment 120I / H ⁇ nd III of 5 8 kb covering the region -2126 to + 3648 of the SM 22 locus is inserted into p- TK to obtain SM 22 INT-TK This fragment is included in the nucleotide sequence of SEQ ID N ° 1 .
  • the plasmid p2126nlz was cut by Xba I which has a unique site in the "polylinker" 5 'upstream of the sequence SM 22.
  • the protruding ends of the fragment were filled using the Klenow polymerase with dNTP.
  • the fragment injected into the eggs of mice was purified from a double digestion Pst 1 / Ns ⁇ I of the plasmid p2126nlz.
  • transient analysis consists in analyzing the expression pattern of the lacZ gene directly in founder FO embryos at a given stage
  • second method consists in establishing stable lines from adult FO founders.
  • the transient analysis made it possible to obtain four embryos having integrated the transgene p445nlz into their genome out of a total of 13 embryos.
  • the four positive embryos analyzed at 12.5 days of development one embryo did not express the transgene
  • the two lines p445nlz express lacZ very strongly in the walls of the esophagus and the respiratory trachea which are composed of smooth muscle at this stage.
  • the two lines show differences between them in certain regions of the embryo
  • the transgene is strongly expressed in the bronchioles in continuity of the trachea at 15.5 days which is not observed in line n ° 9 to 17.5 days when lacZ is found only in the trachea
  • This difference can be due either to a modification of the regulation due to different integration sites in the two lines, or to the difference in stage which makes that the expression of lacZ can be repressed between day 15.5 and 17.5
  • FIGS. 12A to 12D represent 15.5 day pc embryos (12A. 12B 12C) and a 2 month old adult (12 D) SM 445 nlz colored for ⁇ -galactosidase activity
  • FIGS. 12A to 12D represent 15.5 day pc embryos (12A. 12B 12C) and a 2 month old adult (12 D) SM 445 nlz colored for ⁇ -galactosidase activity
  • Myosin light chain 3F regulatory sequences confer regionalized cardiae and skeletal muscle expression in transgenic mice. J. of Cell Biol., 129/2, 383-396.
  • the 5'-flanking region of the mouse vascular smooth muscle ⁇ -ac tin gene contains evolutionarily co ns erv ed sequence motifs with in a functional promoter. J. Biol. Chem., 265/27, 16667-16675.
  • T ransgelin A transfomation and shape change sensitive actin-gelling protein. J. Cell Biol., 121/5, 1065-1073.
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Abstract

Séquences d'ADN comprenant: un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes; et une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique. Cette séquence, ou un vecteur la contenant, peut être utilisée pour le traitement des maladies coronariennes, en particulier de la resténose.

Description

SEQUENCES EN AMONT DU GENE SM 22, VECTEURS LES CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS THERAPEUTIQUES,
NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES VASCULAIRES
La présente invention est relative à des séquences en amont d'un gène exprimé dans les cellules du muscle lisse tel que SM 22, ainsi qu'à des vecteurs les contenant.
Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces vecteurs et séquences en thérapeutique, par exemple pour la production de polypeptides actifs localement ou de manière systémique, notamment des polypeptides immunogènes, des polypeptides régulateurs endogènes tels que les cytokmes, ou encore pour la production d'ARN d'intérêt thérapeutique, par exemple un ARN anti-sens De manière particulière, l'invention a pour objet l'utilisation des vecteurs et séquences nucléotidiques dans le traitement des maladies vasculaires.
L'athérosclérose est une maladie dégénérative des artères associant les lésions de l'artériosclérose et de l'athérome, et combinant ainsi un durcissement des artères et une dégénérescence graisseuse de leur tunique interne Cette insuffisance coronarienne est généralement remédiée par une angioplastie coronaire percutanée consistant à introduire dans le réseau artériel coronaire un cathéter muni à son extrémité d'un ballonnet, d'avancer le cathéter jusqu'au niveau de la sténose et de gonfler le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi et de rétablir ainsi un calibre coronaire permettant une perfusion myocardique suffisante.
Cette technique de revascularisation myocardique est très largement utilisée (50 000 interventions par an en France et 500 000 interventions par an aux Etats-Unis) mais est cependant limitée par la réapparition, dans les mois suivants l'opération, d'une nouvelle lésion au site dilaté, ou resténose, dans environ 30 % des cas
Les divers traitements proposés pour traiter ce type de lésions sont résumés dans l'article de FELDMAN et STEG "Perspective de la thérapie génique de la resténose" {Médecine/Sciences, synthèse 1996 12, 47-55). Deux mécanismes sont responsables des restérioses l'hyperplasie intimale et le remodelage artériel Le premier de ces mécanismes, l'hyperplasie intimale est due à la prolifération des cellules musculaires lisses dans l'intima, qui aboutit a la synthèse d'une volumineuse matrice extra cellulaire Cette activation serait induite par la libération locale de facteurs de croissance, et de cytokines, ainsi que par la suppression de la synthèse de certains peptides endothéhaux antiproliférants Le second mécanisme, le remodelage artériel, consiste en une réduction du calibre de l'artère sans modification de l'épaisseur de la paroi, et donc sans prolifération de cellules.
Ces auteurs décrivent diverses tentatives destinées à inhiber l'hyperplasie intimale, par thérapie génique, mais dont les résultats se sont révélés peu satisfaisants, pour diverses raisons L'inefficacité du transfert est une des raisons généralement invoquée pour expliquer ces résultats Ce problème a été partiellement résolu par l'utilisation de vecteurs adénoviraux, mais d'autres problèmes sont apparus, liés à l'immunogénicité de ces virus, au risque de recombinaison avec des adénovirus sauvages ou au risque de dissémination de ces vecteurs dans la circulation systémique
Ces auteurs citent en outre l'utilisation de séquences promotrices spécifiques des cellules vasculaires, comme la préproendothélme, ou des complexes adénovirus-hgand, comme constituant des voies de recherche très intéressantes, sans pour autant développer ces aspects
La demande WO 96/05 321 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) décrit aussi des adénovirus recombinants défectifs comportant un gène suicide pour le traitement de la resténose. Le gène suicide peut être placé sous le contrôle d'un promoteur actif dans les cellules musculaires lisses vasculaires Seul le promoteur de l'actine α du muscle lisse est cité dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre Aucun exemple d'utilisation d'une telle construction ne vient illustrer cette demande.
Les protéines constituant les muscles lisses ont fait l'objet d'études parcellaires Ainsi la protéine SM 22, qui constitue un des premiers marqueurs à apparaître lors de la différenciation des cellules de muscles lisses, a été étudiée et la partie codante de son gène a été séquencée chez la souris (SOLWAY et AL, 1995, J Biol Chem, 270 22, 13460- 13469) et chez le rat (KEMP et AL 1995, BIOCHEM J 310, 1037-1043).
Les séquences du gène de poulet et du gène humain ont aussi ete détermines (Nishida et al, 1991 , Biochem Int ., 23,663-668 pour le gène de poulet Thweatt et al 1992, Biochem Biophyse Res Comm 187, 1 - 7 pour le gène humain).
Le gène codant pour la protéine SM 22 alpha chez la souris est composé de cinq exons et comprend 6,2 kb II est présent en une seule copie dans le génome SOLWAY et al, ont montré que les 441 paires de base en amont de la région codante du gène étaient nécessaires et suffisantes pour induire un taux important de transcription d'un gène reporteur dans des cultures cellulaires primaires d'aortes de rats et dans les lignées A7r5. Ils ont d'autre part mis en évidence que les ARN messagers de ce gène étaient exprimés a des taux importants dans l'aorte, dans l'utérus, dans les poumons et dans l'intestin.
KEMP et al (1995 BIOCHEM. J. 310, 1037-1043.) ont clone et séquence le fragment de 1 ,9 kb en amont de la séquence codante du gène SM 22 de rat. Des délétions effectuées dans le fragment ont montré que la région du promoteur comprise entre les nucléotides +65 et -303 étaient plus actives qu'un fragment de 1 ,5 kb comprenant une partie importante de la région du gène non traduite, ce qui suggérerait la présence de séquences régulatrices à l'extrémité 5' du promoteur
OSBOURN et AL (1995 Gène 154, 249-253) ont aussi étudié la région 5' en amont du gène SM 22 du rat Ils ont mis en évidence la présence de deux introns dans cette région.
On notera que ces études ont été faites in vitro en utilisant des cultures de cellules primaires de l'aorte, et non in vivo Or, ces conditions d'expérimentation ne sont pas représentatives de l'activité des gènes dans les cellules de l'organisme.
De plus, elles ne concernent qu'une région très limitée de la partie non codante du gène située à l'extrémité 5', c'est-à-dire la partie en aval du nucléotide -441.
Plus récemment Li et al. (1996, J Cell Biol, 132, 849-859) ont étudié la régulation du gène SM22 à l'aide de souris transgéniques. Néanmoins, cet article ne mentionne aucune application de vecteurs portant des fragments de ce gène, et en tout état de cause aucune application thérapeutique.
En outre un nombre limité de constructions ont été fabriquées, et de manière générale seul l'effet sur des embryons, et non sur des adultes a été testé.
Les auteurs déduisent de leur étude que les séquences comprises entre les nucleotides -2735 et -445 ne contiennent pas d'éléments régulateurs musculaires essentiels.
Le demandeur s'est attaché à identifier in vivo, sur des individus adultes l'activité des diverses régions constituant la région en amont de la séquence codante exprimée du gène de la protéine SM 22 II s'est d'autre part attaché a déterminer si des modifications dans cette séquence induisait les changements dans l'expression du gène dans les différents tissus.
Il a mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible , en modifiant la région en 5' du gène de la protéine SM 22 de souris, d'obtenir, chez des individus adultes, une expression spécifique d'un gène reporteur dans les muscles lisses des artères et en particulier de l'aorte.
Il a en outre montré que les séquences identifiées par Ll et al (1996, précédemment cités) comme ne contenant pas de séquences régulatrices essentielles, contenaient au contraire des séquences indispensables à une expression spécifique du gène SM 22 chez l'adulte.
II a enfin montre de manière surprenante que des séquences introniques étaient nécessaires pour l'induction d'une expression spécifique dans les artères.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions fortement stringentes à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo de ce gène dans des cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique .
L'invention concerne également toute séquence nucleotidique ou oligonucléotide d'origine naturelle ou obtenue par synthèse chimique présentant une homologie avec la séquence SEQID n°1 d'au moins 70 %.
On entend par séquence nucleotidique d'origine naturelle, un fragment d'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse de l'ARN messager cellulaire ou encore un fragment d'ADN génomique obtenu après clivage de l'ADN cellulaire à l'aide d'enzymes de restriction.
On entend par séquence nucleotidique obtenue par synthèse chimique un fragment d'ADN de séquence connue généré par synthèse automatique de polynucléotides, par exemple à l'aide d'un appareil automatique adapté.
On entend par protéine ou ARN d'intérêt thérapeutique une molécule susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéhales, de consolider les artères et/ou capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale.
Pour la présente invention, le terme "conditions fortement stringentes" est utilisé dans le sens donné par Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions A titre préféré, les conditions d'hybridation sont telles que décrites par Maniatis (édition de 1982). Trois lavages destinés à éliminer les fragments non hybrides sont nécessaires et sont effectués à 65°C en présence de 0,2 SSC et 0, 1 % SDS, en l'absence de formamide.
De manière avantageuse, ladite séquence comprend un fragment de la séquence comprise entre les nucleotides -2126 et +4135, dont la séquence SEQ ID n°1 est donnée en annexe, de la séquence comprise entre les nucleotides
-2126 et +65 dont la séquence SEQ ID n° 2 est donnée en annexe ou encore de la séquence comprise entre les nucleotides -2126 et -445 dont la séquence SEQ ID N°3 est donnée en annexe. Elle peut aussi comprendre un fragment de la séquence SEQ ID Nº 4.
Un tel fragment peut en particulier comprendre au moins une partie de la séquence SEQ ID N°5 qui correspond a la partie en amont de l'extrémité 5' de la partie codante comprise entre les nucleotides -2126 et -1340. Une telle séquence SEQ ID N°5 dont la séquence est donnée en annexe constitue un objet de la présente invention.
Les séquences SEQ ID n° 2 et SEQ ID n° 1 sont comprises respectivement dans les plasmides p2126nlz et p2126INTnlz portées par les souches déposées le 25 mars 1996 auprès de la Collection
Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n° 1-1685 et 1-1686.
L'invention a également pour objet les séquences hybndant dans des conditions de forte stringence avec les séquences SEQ ID n° 1 , SEQ ID n° 2. SEQ ID n° 3 et SEQ ID N° 5.
Les séquences incluant la séquence du premier intron du gène SM
22, et en particulier la séquence SEQ ID N° 1 constituent des modes de mise en oeuvre particulièrement avantageux de la présente invention, car elles permettent une expression de protéines ou ARN d'intérêt thérapeutique, chez l'adulte, spécifique des artères.
La présente invention n'est néanmoins pas restreinte à des séquences contenant des fragments du gène de souris, mais concerne toute autre séquence de toute autre espèce ayant les mêmes propriétés à savoir d'induire spécifiquement une expression d'un gène dans les cellules des artères. Ainsi, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'article de KEMP et AL (1995, précédement cité) qui décrit la séquence en amont du gène de rat de la protéine SM 22 La présente invention couvre aussi toute séquence comprenant des fragments des séquences en amont de gènes de la protéine SM 22, modifiées par exemple par délétion de certaines structures qui conservent des fonctions identiques ou similaires à celles de la séquence complète.
La protéine d'intérêt thérapeutique peut être une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique, telle que la thymidine kmase du virus de l'herpès Cette protéine présente la particularité de transformer le ganciclovir (Merck Index, référence 4262), un analogue de la guanosine, en un dérive qui bloque la synthèse de l'ADN dans les cellules en réplication L'introduction d'un gène codant pour cette protéine dans les séquences selon la présente invention permet donc de bloquer la prolifération des cellules dans le cas de l'hyperplasie intimale. Une séquence codant la thymidine kinase est notamment décrite par Caruso et Klatzmann (1992, Proc Natl Acad Sci., USA, 89, 182-186).
Ladite protéine d'intérêt thérapeutique peut aussi être une protéine présentant un effet cytostatique, telle que la protéine codée par le gène Rb (Chang et al., 1995 Science, 267, 518-522), ou par le gène eNOS (Hamon et al., 1994, Circulation, 90, 1357-1362)..
Elle peut aussi être une protéine présentant une activité lipolytique telle qu'une lipoprotéine lipase De telles protéines sont codées par les séquences décrites par Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) et Ming Sun Liu (1994, J. Biol. Chem, 269-11417).
Elle peut aussi être un facteur de croissance des cellules endothéliales Une telle protéine peut être en particulier une mterleukine.
Elle peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, ou l'actme, ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le collagène ou l'élastine.
Elle peut être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90 11092, et en particulier un antigène viral tel que la glycoprotéine gp120 ou la protéine Nef du VIH (virus de l'immunodéficience humaine).
De manière générale, ladite protéine peut être une ou plusieurs protéines présentant un intérêt thérapeutique ou vaccinal, telles que des protéines d'intérêt immunothérapeutique, par exemple des mterleukines , les facteurs de croissance, par exemple les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou le NGF (Nerve Growth Factor), des protéines pouvant induire une réponse immunitaire, que ce soit une immunité humorale, cytotoxique ou cellulaire, ou des protéines permettant de complémenter l'activité d'un gène normalement exprimé chez l'individu à traiter mais qui ne l'est plus, soit par mutation ou délétion de sa séquence. Cette séquence peut aussi coder pour un ARN d'intérêt thérapeutique Un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p 53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90 11092 déposée par la société VICAL.
La présente invention a en outre pour objet des vecteurs caractérises en ce qu'ils contiennent une séquence selon l'invention, telle que décrite ci-dessus Un tel vecteur peut contenir tout autre séquence d'ADN nécessaire à l'expression de la protéine, ou de l'ARN, d'intérêt thérapeutique dans les tissus cibles, et en particulier peut contenir une origine de réplication efficace dans les cellules des artères, en particulier dans les cellules du muscle lisse.
Un tel vecteur peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène a remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la séquence selon l'invention Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité sera remplacé par le gène porté par le vecteur ou la séquence et que l'on désire voir s'exprimer dans l'organisme.
Une telle méthode de recombinaison homologue peut être du type de celle décrite par Le Mouellic et al , (1990, Proc. Nat Acad Sci USA , 87, 4712-4716) ou dans la demande PCT WO 91/06.667.
Un tel vecteur peut être un vecteur dérivé d'un adénovirus Des adénovirus adaptes à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux décrits par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité) ou OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781-784) ou encore dans la demande FR 94 03.151 (Institut Pasteur, Inserm) Ces virus sont généralement rejetés par l'individu, du fait de leur trop forte immunogénicité Néanmoins, des souches de ces virus ont été sélectionnées afin de diminuer leur caractère immunogène. En tout état de cause, ces vecteurs, même présentant une forte immunogénicité peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, car les artères sont traitées durant des périodes de temps relativement courtes de l'ordre de quelques semaines, compatibles avec les temps de rejet des adénovirus par le système immunitaire de l'hôte. On notera néanmoins que l'introduction des séquences selon la présente invention dans les vecteurs décrits ci-dessus n'est pas indispensable, et que les cellules des artères peuvent être directement transfectees par de l'ADN comprenant ces séquences.
Les séquences nucléiques selon la présente invention peuvent être introduites après couplage covalent de l'acide nucléique avec des composés favorisant leur pénétration dans les cellules ou leur transport vers le noyau, les conjugues résultants étant éventuellement encapsulés dans des microparticules polymères, comme dans la demande internationale WO 94/27238 de Meidsorb Technologies International .
Selon un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être incluses dans un système de transfection comprenant des polypeptides favorisant leur pénétration dans les cellules, comme dans la demande internationale WO 95/10534 de Seikagaku Corporation.
Ces vecteurs ou séquences peuvent être administrés in situ par tout moyen connu de l'homme du métier Ainsi, ils peuvent être délivrés in situ à l'aide d'un cathéter à ballonnet recouvert de canaux, tel que décrit par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité) .
Ils peuvent aussi être administrés au cours d'une opération, ou en dénudant l'aorte Un autre mode d'administration consiste à introduire un grillage de faible maillage imprégné d'ADN comprenant ces séquences, le long de l'aorte , tel que décrit par Feldman et al. (1995, J. Clin. Invest 95 2662-2671 ).
Ces séquences ou vecteurs peuvent avantageusement être administrés sous la forme d'une composition les contenant, par exemple dans un gel facilitant leur transfection dans les cellules des artères Un tel gel peut être un complexe de poly-L lysine et de lactose, tel que décrit par MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21 , n°4, 871 -878) ou du poloxamer 407 tel que décrit par PASTORE (1994, Circulation, 90, 1- 517). Ils peuvent aussi être mis en solution dans une solution tamponnée ou être associés à des liposomes.
La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant de telles séquences, vecteurs ou compositions, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques les contenant en quantités pharmaceutiquement efficaces ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles.
De tels séquences, vecteurs ou compositions peuvent être avantageusement utilisés pour la fabrication de médicaments pour la délivrance au niveau des artères d'un ADN (ADNc ou ADN génomique) pouvant exprimer notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, pour le traitement des maladies coronariennes, et en particulier pour le traitement de la resténose. Elles peuvent néanmoins être aussi utilisées pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de mutations fragilisant les vaisseaux. Un tel médicament pourrait, par exemple, comprendre une séquence ou un vecteur selon l'invention capable d exprimer un gène codant pour une protéine normale de ia desmine ou une protéine d'adhésion du muscle du type CAM.
La présente invention a aussi pour objet des ARN exprimés à partir des séquences et vecteurs objets de la présente invention, et en particulier des ARN messager.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de criblage de molécules in vitro, en vue de tester leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM 22. Un tel procédé comprendra, par exemple, une première étape suivant laquelle on transfecte des cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'invention, comprenant un gène reporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la protéine SM 22. Dans une seconde étape, les cellules ainsi transfectées sont incubées en présence de la molécule à tester, puis l'expression du gène reporteur est quantifiée.
Les cellules utilisées pour la transfection sont avantageusement des cellules de muscle lisse, en particulier des cellules de l'aorte, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme d'une lignée cellulaire stable.
Dans le cas où les cellules sont transfectées par des constructions telles que p2126nlz ou ρ2126INTnlz, la quantification de la bêta-galactosidase produite sera avantageusement effectuée par lecture optique, par exemple en utilisant la trousse de détection commercialisée par Boehringer sous la référence 1 669 893 (catalogue Boehringer Mannheim - « Biochemicals ». 1996, page 236, béta-Gal Reporter Gène Assay, Chemilummescent).
Dans un autre mode de réalisation du procédé de criblage in vitro selon l'invention, te gène reporteur est le gène codant pour la luciférase Dans ce cas, la quantification de l'expression de la luciférase est avantageusement effectuée par chimioluminescence, par exemple au moyen de la trousse de diagnostic commercialisée par Boehringer sous la référence 1 758 241 (catalogue Boehringer-Mannheim « Biochemicals », 1996, Luciférase Reporter Gène Assay).
La présente invention est aussi relative à des animaux transgéniques et en particulier des souris portant une séquence ou un vecteur tel que défini ci-dessus dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacée par un gène reporteur
La présente invention est enfin relative à un procédé de détection de mutations de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22. De telles mutations sont en effet susceptibles de modifier l'expression du gène codant pour la protéine SM22, en particulier diminuer ou même abolir l'expression de ce gène dans les muscles lisses. De telles mutations seraient de nature à entraîner une modification du fonctionnement du muscle lisse, la protéine SM22 étant apparentée à une famille de protéines impliquées dans la régulation de la fixation du calcium, du type calponine (Ayme-Southgate et al. 1989, J Cell. Biol.). Un tel procédé de détection de mutations peut être avantageusement le procédé objet de la demande de brevet français FR-93 10821.
De manière complémentaire, des séquences selon l'invention modifiées de telle sorte qu'elles permettent une augmentation de l'expression du gène SM22 font également partie de l'invention.
De telles souris transgéniques peuvent être utilisées pour cribler des molécules pour leur activité sur les séquences régulatrices gène codant pour la protéine SM 22. Des molécules peuvent être administrées à des souris, puis après sacrifice, des coupes histologiques sont effectuées afin de mettre en évidence les tissus colorés par le gène reporteur. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer au manuel suivant "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor
Laboratory Press New York 1989), ou à l'une de ses récentes rééditions.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent :
La figure 1 représente la carte de restriction et la structure exon/intron du site SM 22, comprenant la région -2474 à +6030 (par rapport au site d'initiation de la transcription) Les exons sont représentés par des carrés blancs tandis que les flèches indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 2 représente l'alignement de trois séquences repétées de type B1 , dans lesquelles les échanges de base sont indiquées
La figure 3 est un autoradiogramme illustrant l'identification du site d'initiation de la transcription Le puits P correspond à l'amorce utilisée
La figure 4A représente la séquence de la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription, et de l'exon du gène SM 22 Les sites de fixation des différents facteurs sont indiqués, ainsi que les différentes séquences concensus Les lignes discontinues indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 4B est une carte de restriction schématique du gène SM 22.
La figure 4C est une carte de restriction détaillée du gène SM 22. La figure 5 illustre la fabrication du plasmide p352nlz.
La figure 6 illustre la fabrication du plasmide p2126 nlz.
La figure 7 illustre la fabrication du plasmide p2126INTnlz.
Les figures 8A et 8B illustrent l'expression du gène lacZ dans des embryons de souris transgéniques Les figures 8A, 8B, représentent respectivement des embryons aux stades 12,5 et 15,5 jours
Les figures 9A à 9D représentent des coupes histologiques d'embryons colorés a l'aide de lacZ La figure 9A représente une coupe d'un embryon au stade 12,5 jours au niveau du coeur, montrant une coloration intense exclusivement dans le myocarde du ventricule droit (RV) et dans les parois des artères (abréviations : AA : coude de la quatrième artère aortique ; CA : artère carotidienne ; E : oesophage ; Iv : ventricule gauche ; PA : partie proximale de l'aorte ; PT : tronc pulmonaire ; RA : atrium droit ; RV : ventricule droit ; T : trachée ; V : veine cardinale droite et gauche).
La figure 9B représente une coupe à travers la région abdominale d'un embryon au stade 14,5 jours, montrant une coloration des artères ombilicales (UA) et l'absence de marquage des viscères (B : vessie ; D : duodénum ; H : gros intestin ; L : foie ; M : intestin grêle ; ST : estomac).
La figure 9D est une coupe à travers les segments de la queue au stade 12,5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a).
La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant à l'artère ombilicale au stade de 12,5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m) et une absence de marquage de l'endothélium (e).
Les figures 10A à 10C illustrent l'expression du transgène dans des souris adultes
La figure 10A représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc). Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma). Le marquage de lacZ (figure 10B) montre que l'expression du transgène est restreinte à l'artère tandis que l'ιmmunofluorescence avec des anticorps SM 22 (figure 10C) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon.
La ftgure 11 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidme kinase du virus de l'herpès.
Les figures 12A à 12D illustrent l'expression de la construction SM 445 nlz dans des embryons de 15,5 jours p.c. (figures 12A à 12C) et dans un adulte de 2 mois (figure 12D). EXEMPLES:
Matériels et méthodes
1. Clonage et caractérisation du gène de la souris SM 22
Environ 106 phages recombinants d'une banque genomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D. Plachov Munster, Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL l/Eco RV de 890 bp de l'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 ( Almendral et al, 1989 ; Exp. Cell Res 181 , 518-530), comme sonde La sonde a été marquée radioactivement par initiation aléatoire et l'ADN a été hybridée sur des filtres laissés durant une nuit à 65°C dans un tampon de Church Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0,1 % SDS à 65°c et des plaques positives ont été purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques L'un des clones isolés s'est révélé contenir un locus SM 22 entier. II a été ensuite cartographie à l'aide d'enzymes de restriction et sous-cloné. Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de l'ADN genomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées.
La séquence du gène SM 22 a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad Sci. 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).
2. Hybridation de type Northern, extension par amorce, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse
De l'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18.
5294-5299) modifiés Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex
(Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilisé en suivant les instructions du fabricant.
Les analyses par hybridation de type Northern ont été effectuées en utilisant des gels d'agarose contenant du formaldéhyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hybond-N (Amersham Life
Science, Little Chalfont Royaume Uni) selon les méthodes connus de l'homme du métier. Pour les analyses par extension d'amorce, un oligonucléotide synthétique de 30 nucleotides (P27N1 ) complémentaire de la séquence +36 a +65 de l'ADN complémentaire du gène SM 22 présentant la séquence SEQ ID N° 6 :
(5'-AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGAAGGAG-3), a été marqué par de la polynucléotide kinase T4 5 μg d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybrides a 55ºC avec 1 -2 X 105 cpm de sonde purifiée et la réaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier Les résultats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide dénaturants à 6 % Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription.
La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +112 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1 ) de l'ADN complémentaire SM 22, tel que décrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl. Acad Sci, 85, 8998-9002).
En vue des analyses de protection par la RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabriqué et clone par la méthode des bouts collants dans le site HinC II du vecteur pBluescript SK+. La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I à la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32P-CTP. La sonde (3 X 105 cpm) a été hybridée avec 5 μg d'ARN messager d'utérus de souris à 42°C durant une nuit Après hybridation, les échantillons ont été incubés avec des RNases A et T (1 heure à 37°C), précipités, et analysés comme décrits pour l'analyse par extension d'amorce.
3. Culture cellulaire et transfection
Les lignées cellulaires NIH 3T3, 10T1/2 et 8/47 ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies, Inc, Vienne, Autriche) complementées avec 10 % de sérum de foetus de veau (Hyclone Inc., Etats-Unis) à 37°C, dans une atmosphère de Co2 à 7%. Pour les expériences de transfection, des cellules confluentes ont été étalées, repiquées dans des boîtes de Petri de 6 cm, et laissées croître jusqu'à obtenir approximativement une confluence de 75 % avant ajout du mélange de transfection.
Les transfections ont été effectuées en utilisant le réactif
Lipofectamine commercialisé par Life Technologies Inc..
En résumé 24 μg de Lipofectamine ont été ajoutés à 6 μg de plasmide portant le gène reporteur superenroulé et 2 μg de PCMVß gai comme témoin interne Après ajout de 3 ml de DMEM, le cocktail de transfection a été ajouté aux cellules Au bout de 6 heures, ce mélange a été remplacé avec du milieu de croissance contenant 10 % de sérum et à nouveau changé au bout de 12 heures. L'expression du produit du gène reporteur a été analysée après 24 heures. Pour les expériences de stimulation par le sérum, des cellules transfectées ont été placées dans du DMEM contenant 20 % de sérum, 24 heures avant d'être récoltées.
4. Dosage de la CAT et de la β-galactosidase
Les cellules ont été prélevées sur des boîtes de pétri avec un racloir à cellules, centrifugées, resuspendues dans 150 μl de tampon Z
(100 mM de phosphate de sodium, pH 7,5, 1 mM MgCI2, 10 nM KCI, 50 nMβ - mercaptoethanol) et lysées par trois cycles de congélation/décongélation Les débris ont été éliminés par centrifugation à basse vitesse et l'activité de la β-galactosidase a été déterminée à partir de 2 à 20 μl de surnageant selon les procédés connus de l'homme du métier. Pour la détermination de l'activité CAT selon GORMAN et al (1982 Mol. Ce». Biol., 2, 1044-1051 ), de 10 à 100 μl de lysat ont été utilisés. Afin de tenir compte des variations dans l'efficacité de transfection, l'activité CAT a été normalisée avec l'activité βgal.
5. Production des souris transgénigues
Des inserts des plasmides pnlz2126 et p2126INTnlz. déposés auprès de la CNCM respectivement sous les n°l-1685 et n°l-1686, ont été isolés par digestion avec Sal l/Pme I, suivie d'une électrophorèse sur gel, puis d'une purification utilisant le kit Geneclean (Bio 101. la Jolla. CA) puis resuspendus dans 10 mM de Tris Hcl pH 7,5, 0,25mM EDTA. Les animaux transgéniques ont été produits comme décrits précédemment par Ll et al (1993, Development, 177/3, 947-959)
Des souris portant le transgene ont été identifiées par PCR et hybridation de type Southern en utilisant une sonde ADN La construction pnlz2126 a permis d'obtenir trois animaux positifs sur 17 souris, deux d'entre elles transmettant et exprimant cette construction .
Pour la construction p2126INTnlz deux animaux positifs sur les 28 testés ont été obtenus et à nouveau un seul exprime et transmet cette construction.
Les souris transgéniques ont été rétro-croisées avec des souris c57/bl et les colorations histochimiques ont été effectuées avec des souris hemizygotes pour le transgène.
6. Colorations histochimigues
Des embryons entiers ou des tissus d'adultes ont été fixés durant 15 à 30 minutes à 4°C dans du formaldéhyde à 1 % dans du tampon A (100 mM de phosphate de sodium , pH 7,3,2 mM Mgcl2, 0, 1 % de sodium de deoxycholate, et 0 2 % NP-40) Après rinçage, les spécimens ont été colorés durant une nuit à 30 °C dans du tampon A contenant 1 mg/ml de X - gal (Sigma, St Louis, Missouri), 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5mM de ferncyanure de potassium, et 20 mM de Tris-CI pH 7,3. Les échantillons colorés ont alors été rincés, déshydratés à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, clarifiés dans du xylène, et enrobés dans de la paraffine Les coupes histologiques ont été effectuées avec une épaisseur de 7 à 10 μm et à nouveau colorées avec de l'hématoxline d'Ehrhch et de l'éosine Les embryons ont d'autre part pu être à nouveau clarifiés à l'aide d'un mélange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle.
Pour l'immunohistocoloration, les tissus de souris ont été fixes dans 3 % de paraformaldéhyde dans du tampon PBS à 4°C durant 3 heures, puis enrobés dans un milieu Tissue-Tek (Reichert-Jung, Vienne) et sectionnés sur un cryo-microtome à des épaisseurs de 5 à 10 μm Les coupes sélectionnées ont été montées et colorées en utilisant un anticorps monoclonal dirige à rencontre de la SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations, 55, 1 -11 ), à une dilution 1/30 ainsi qu'en utilisant un anticorps secondaire marque Cy3 (Biological Détection Systems, USA). Les coupes ont été examinées à l'aide d'un microscope a fluorescence.
EXEMPLE 1.
Caractérisation du locus SM 22
Le criblage par hybridation de la banque genomique de souris a conduit à l'isolement de trois clones se recouvrant, contenant le gène complet de la SM 22 Une carte de restriction, qui est partiellement reproduite sur la figure 1 a été établie et les exons ont été localisés par hybridation à l'aide de sondes oligonucléotidiques synthétiques.
Les régions présentant un intérêt ont été sous clonées et séquencées.
La séquence a été déterminée entre les positions -2474 et +1 10 en aval du site de polyadenylation et a été comparée dans la banque de données EMBL. Le gène couvre 5923 bp à partir du site de début de la transcription jusqu'au site de polyadenylation et la séquence codante est partagée en 5 exons (figure 1 ). Toutes les frontières exon-intron correspondent à des séquences consensus.
Le premier exon contient seulement une séquence leader en 5' et le codon de départ de la transcription est donc localisé dans le second exon séparé du site de départ de la transcription par plus de 4kbp de séquence d'intron .
Deux signaux de polyadenylation potentiels ont été localisés au position 5905 et 5913 et plusieurs régions TGT placées en aval du site de polyadenylation, prennent vraisemblablement part dans la terminaison de la transcription.
L'analyse de la séquence révèle de plus la présence de trois séquences répétées (figure 2) qui présentent des homologies importantes avec les éléments répétés de type B1 , dont certains sont transcrits par la RNA polymérase III et codent pour des ARN 5S. On notera que toutes les séquences répétées sont dans une orientation inverse par rapport au locus SM 22.
Le site de départ de la transcription a été cartographiée par analyse par extension d'amorce (figure 3). Un oligonucléotide antisens complémentaire de l'extrémité 3' de l'exon 1 conduit à l'obtention de quatre produits d extension qui diffèrent seulement par une paire de bases (bp) en longueur, le plus long d'entre eux étant de 65 bp. Le produit de la transcription démarre donc avec un G, 77bp en amont du codon d'initiation de la transcription.
Les produits d'extension les plus courts ont été vraisemblablement causés par une terminaison prématurée de l'extension de l'amorce due à des modifications (capping) à extrémité 5' de l'ARN messager.
Ces résultats ont été confirmés par l'analyse par protection par la RNAse , qui conduit à un fragment protégé de 65bp et par le clonage et le séquençage du produit d'extension dérivé d'une réaction indépendante avec une amorce antisens située dans le second exon du gène.
Ces résultats sont en accord avec ceux de Solway et al (1995 précédemment cité). Des différences de séquences mineures entre ces deux résultats sont vraisemblablement dues à des variations alléliques entre les différentes souches de souris.
La séquence TTTAAA en position -28bp (figure 4) est en relation étroite avec la séquence TATAAA et a vraisemblablement la fonction d'une boîte TATA. L'analyse par ordinateur de la séquence en 5' révèle la présence de plusieurs sites potentiels de liaison pour des facteurs ainsi que pour des éléments qui sont connus comme contribuant à la régulation de la transcription de gène musculaires (figure 4). Au total 11 boîtes de type E (CANNTG), quatre motifs du type Mef-2/rSRF (YTAWAAATAR), quatre éléments de liaison SRF potentiels (CC(A/T)6GG), cinq sites de liaision AP-2 (CCCMNSSS) et cinq motifs SP1 (GGGCGG) ont été localisés. Enfin, un élément similaire au motif TGT3-3, récemment identifié comme site de liaison d'un facteur nucléaire du muscle lisse et comme contribuant à la régulation de la transcription de l'actine alpha du muscle lisse, a été localisé (figure 4).
EXEMPLE 2
Clonage et construction de plasmides recombinants pour la création de souris transgénigues
1. Fabrication de pnlz
Le plasmide pGEM7 (c'est-à-dire le plasmide pGEM-72F (+/-), commercialisé par Promega Corp., Madison, Wi, USA. Séquences disponibles dans Gen Bank, sous les numéros suivants X65310 et X 65311 ) comprend un gène de résistance à l'ampiciliine, un gène lac Z et une origine de réplication II comprend 3000 paires de base. Il a été digéré avec Nae l/Bsp 120I. L'extrémité sortante Bsp 120I du vecteur a été rendue « bouts francs » avec l'enzyme de Klenow, et le plasmide a été refermé en présence d'un linker Sal I de 10 pb Le fragment lacZ de pGEM 7 a donc été délété. un site Sal I introduit, et un site Bsp 120I restauré.
Un site Pme I a été introduit par insertion d'un linker Pme I avec des extrémités simple-brin sortantes Nsi I, dans le site Nsi I de la construction.
Finalement, le gène lacZ couplé au signal de localisation nucléaire a été isolé à partir de pDes2.2nlz (Ll et al, 1993, précédemment cité) avec Hind III et Sac I donnant deux fragments du gène rapporteur.
Les deux fragments ont été insérés entre les sites Hind III et Sac I du vecteur pGEM7 modifié et vérifiés pour leur orientation Cette procédure donne le vecteur pnlz sans promoteur.
2. Fabrication de p352nlz
La figure 5 illustre la fabrication de ce plasmide.
Un fragment PCR de 417 pb couvrant la région -352 à +65 du gène SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N° 1 qui comprend l'enchaînement des nucleotides - 2126 à + 4135, a été produit et inséré dans le site Hinc II rendu bout-franc du vecteur pBluescrιptSK+ La séquence du fragment PCR a été vérifiée. Le fragment est récupéré par les sites Xba I et Xho I et inséré dans le plasmide pBLCAT 3 dans les sites correspondants, générant le recombinant p352CAT. Pour créer p352nlz, le fragment Xba l/Xhol de p352CAT a été inséré dans les sites correspondants de pnlz.
3. Fabrication de p2126nlz
Pour créer ρ2126nlz, un fragment Bsp 120I/Sph I de 1 ,9 kb recouvrant la région -2126 à -206 du locus SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N° 1 qui comprend l'enchaînement des nucleotides - 2126 à + 4135, a été inséré dans les sites respectifs de p352nlz. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n° 1-1685. Sa fabrication est illustrée par la figure 6 4. Fabrication de p2126INTnlz
La fabrication de ce plasmide est illustrée par la figure 7.
Un fragment Bsp 120I/Hιnd III de 5,8 kb recouvrant la région -2126 à +3651 du locus SM 22 a ete insère dans les sites correspondants de pnlz donnant pINt-nlz Ensuite un fragment PCR de 496 pb de la base +3648 à +4143 du locus SM 22 a été généré en utilisant une amorce en amont et une amorce en aval conçue pour introduire un site Hind III en position 4135-4140 Ce produit de PCR a été digéré avec Hind III et lié dans le site Hind III de pINT-nlz pour donner p2126INT-nlz La construction p2126INTnlz contient donc 2126 paires de bases de la région en 5' du début de transcription le premier exon, le premier mtron entier et 15 paires de bases du deuxième exon avec les quatre dernières paires de bases mutées de CATG en GCTT pour éliminer le codon d'initiation de traduction et introduire un site Hind III comme mentionné ci-dessus La partie de l'insert dérivé du promoteur de SM 22 contenu dans le plasmide p2126 INTnlz est constitué par la séquence SEQ ID N°1 Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n°l-1686 Sa fabrication est illustrée par la figure 7
EXEMPLE 3 :
Expression des constructions p2126 nlz et p2126 INTnlz dans les animaux transgénigues
Deux constructions utilisant le gène reporteur lacZ avec signal de localisation nucléaire du virus SV 40 ont été fabriquées, comme décrit dans l'exemple 2 .
La première construction, p2126nlz contient 2126 bp de la région en amont et le premier exon (65 bp) La seconde construction p2126INTnlz est identique à la première à l'exception de l'addition du premier mtron et des premières 12bp du second exon.
Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, chacune des constructions a donné naissance à au moins une souris transgénique exprimant le gène reporteur.
Les embryons obtenus de 12,5 à 15,5 jours après le coït (dpc) ont été colorés de manière a mettre en évidence l'activité βgal Les expressions des deux constructions sont identiques, à tous les stades observes bien que p2126INTnlz donne une coloration un petit peu plus intense.
L'expression a été détectée en premier lieu au jour 8,5 dans la région du coeur de l'embryon et dans les vaisseaux de l'enveloppe cardiaque Au jour 9 5 l'expression de lacZ dans le coeur augmente et est confinée au ventricule droit aux artères.
Entre 12,5 et 15 5 jours une ségrégation du marquage en fonction des régions devient évident, le marquage étant confiné au ventricule droit (figures 8A et 8B) Les coupes montrent que l'expression a lieu dans le myocarde du ventricule droit, avec des marquages mineurs dans le ventricule gauche et dans l'adrium droit (figure 9A).
Cette expression dans le coeur est seulement transitoire et n'apparaît pas chez l'adulte Elle est vraisemblablement inhibée dans les phases tardives du développement des foetus L'expression précoce est aussi observée dans les segments du rostre à partir de 9,5 jours qui s'étend aux segments caudaux à 10,5 jours, et atteint des niveaux importants à 11 ,5 jours.
L'expression diminue à partir de 12,5 jours dans les segments du rostre (figure 8B) et finalement n'est plus détectable à 14,5 jours (figure 10E).
Les coupes montrent que l'expression du transgène est restreinte à la région myotomale des segments (figure 9 D).
La plus grande partie de l'expression a lieu dans le système vasculaire de l'embyron en développement. A partir de 9,5 jours, l'expression est détectée dans l'aorte dorsale. A 10,5 jours, la coloration de l'aorte dorsale et des coudes aortiques augmente et à 11 ,5 jours, l'expression lacZ est clairement visible dans l'aorte dorsale, les coudes aortiques les artères iliaques, les artères ombilicales, les artères de la carotide et dans les vaisseaux majeurs de la tète.
L'expression du transgene dans les vaisseaux augmente a partir de 12 5 jours date à laquelle les vaisseaux intercostaux peuvent être facilement vus (Figure 8A).
A 15 5 jours (figure 8B) lacZ est présent dans les vaisseaux majeurs incluant ceux des membres et de la queue, et la coloration du tronc pulmonaire devient visible L'expression dans le système vasculaire persiste chez l'adulte et est clairement visible dans l'aorte. dans le tronc pulmonaire et dans l'artère pulmonaire droite (figure 10A), ainsi que dans les vaisseaux des intestins (figure 10B), dans la vessie et dans l'utérus.
Des coupes histologiques révèlent mieux les différences dans l'expression du transgene dans les artères et dans les veines La section de l'embryon à 12.5 jours (figure 9A) montre un niveau d'expression très élevée dans les couches musculaires des artères de la carotide, de la quatrième artère du coude de l'aorte, du tronc pulmonaire proximal et de la partie proximale de l'aorte ascendante, tandis que les parties gauche et droite des veines cardinales antérieures restent non colorées L'absence d'expression du transgène dans les veines musculaires ressort à l'évidence des coupes du ductus venosus, ainsi que des veines portales et ombilicales La même situation est observée chez l'adulte, où l'expression ne peut jamais être détectée dans les veines caves (figure 10A) ni dans les veines pulmonaires.
Ces observations mettent en évidence des différences qui n'avaient jusqu'alors pas été mises en évidence entre les couches de muscles lisses des artères et des veines D'autres vues des artères montrent que l'expression est restreinte à la couche de muscles et est absente de l'endothelium (figure 9C).
Il est de plus évident, au vu de l'ensemble des observations (figures 8A 8B), que l'expression du transgène est absente des muscles lisses des viscères Ceci est inattendu, car le gène SM 22 endogène est supposé être exprimé dans les tissus musculaires lisses vasculaires et des viscères Dans les coupes histologiques de la région abdominale d'embryon à 14 5 jours, les couches de muscles de l'estomac, de l'intestin et de la vessie en développement sont facilement reconnaissables (figure 9C). L'expression du transgène dans cette région est clairement détectée dans les artères ombilicales, mais pas dans les couches de muscles des viscères de l'estomac, du duodénum, de l'intestin grêle et du gros intestin, et de la vessie, où aucune expression lacZ n'est observée En outre, aucune expression n'est observée dans l'oesophage et dans la trachée (figure 9A), ainsi que dans les bronches du poumon. La coloration du tissu musculaire de l'adulte donne essentiellement les mêmes résultats La figure 10B montre que l'expression du transgene est absente dans les muscles du colon alors que le vaisseau mésentère est très fortement coloré par lacZ Par contre, la coloration par immunofluorescence de la coupe d'une région intestinale similaire montre que la protéine SM 22 endogène est présente dans les deux tissus (figure 10C). L'absence d'expression du transgène dans les muscles lisses des viscères de l'adulte est de plus confirmée par des colorations de l'oesophage, de la trachée, de la vessie, du canal déférent et de l'utérus pour l'activité ßgal En aucun cas, il ne peut être détectée une expression ßgal dans les couches musculaires de ces tissus.
Curieusement une coloration importante est observée dans le cytoplasme des cellules épithéliales du lumen du canal déférent et dans l'épithélium des conduits rénaux Ceci est vraisemblablement dû à une activité galactosidase endogène, la coloration étant aussi visible dans les animaux non transgéniques témoins.
EXEMPLE 4 :
Fabrication d'une construction comportant des régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès (SM 22 INT-TK).
Le fragment HIV-LTR (-167, + 80) est délété du plasmide pLTR- TK par digestion Hind III dont les extrémités sont rendues bout franc avec l'enzyme de Klenow, suivie d'une digestion Xho I . Le plasmide refermé en insérant un linker contenant les sites Xhol en 5', les sites Hind III et Bsp 120I dans l'ordre 5'->3' et une extrémité 3' bout-franc pour donner le vecteur p-TK Un fragment Bsp 120I/Hιnd III de 5 8 kb recouvrant la région -2126 à + 3648 du locus SM 22 est inséré dans p- TK pour obtenir SM 22 INT-TK Ce fragment est compris dans l'enchaînement de nucleotides de la SEQ ID N°1 .
Cette construction est schematiquement représentée sur ta figure 11.
EXEMPLE 5:
Fabrication du plasmide p445 nlz portant le fragment -445 à + 65 du gène SM22 fusionné au gène lacZ, et obtention de transgènes Matériels et méthodes
Construction de p445nlz
Le plasmide p2126nlz a ete coupe par Xba I qui a un site unique dans le « polylinker » en 5' en amont de la séquence SM 22 Les extrémités 5 protudantes du fragment ont été remplies à l'aide de la polymérase Klenow par du dNTP.
Apres précipitation le fragment a été coupé par Pst I qui a un site unique en position -445 relativement au nucleotide +1 de début de la transcription.
Les extrémités 3' protudantes de la coupure Pst I ont été
hydrolysees à la polymérase Klenow sans dNTP Le fragment
comprenant les séquences plasmidiques plus la séquence SM 22 de - 445 à + 65 fusionnée au gène lacZ a été purifié à partir d'un gel d'agarose et refermé par la hgase T4.
Pour les expériences de transgénèse le fragment injecté dans les oeufs de souris a été purifié à partir d'une double digestion Pst 1/Nsι I du plasmide p2126nlz.
Les résultats obtenus avec cette construction et ceux obtenus avec p2126 INTIacZ et p2126lacZ pour comparaison, figurent dans le tableau ci-après.
Les propriétés de régulation transcriptionnelle de la séquence du gène SM 22 entre les nucleotides -445 et +65 ont été analysées in vivo dans des souris transgéniques par deux méthodes La première méthode appelée analyse transitoire consiste à analyser le patron d'expression du gène lacZ directement dans les embryons fondateurs FO à un stade donné La deuxième méthode consiste à établir des lignées stables à partir de fondateurs FO adultes.
1. Analyse transitoire
L'analyse transitoire a permis d'obtenir quatre embryons ayant intégre le transgene p445nlz dans leur génome sur un total de 13 embryons Parmi les quatre embryons positifs analysés à 12.5 jours de développement, un embryon n'exprimait pas le transgène Deux embryons présentaient un patron d'expression identique à celui de la lignée p2126 INT nlz au même stade, c'est-à-dire spécifique des cellules musculaires lisses artérielles et enfin un troisième embryon présentait les mêmes territoires d'expression artérielle additionnés de divers sites d'expression ectopique essentiellement diffus dans le mésenchyme embryonnaire .
2. Lignées stables
Deux lignées stables indépendantes ont été établies à partir d'un mâle (lignée n°1 ) et d'une femelle (lignée n°9).
L'expression du transgene a été analysée dans l'embryon au stade
15,5 jours pour la lignée 1 et 17,5 jours de développement dans la lignée 9 Les deux lignées présentent le même type d'expression dans les artères au niveau du coeur, le transgène est exprimé dans l'aorte dorsale et le tronc pulmonaire artériel.
A la différence des lignées obtenues avec les transgenes p2126nlz et p2126 INTnlz, les deux lignées p445nlz expriment lacZ très fortement dans les parois de l'oesophage et de la trachée respiratoire qui sont composées de muscle lisse à ce stade.
Les deux lignées présentent des différences entre elles dans certaines régions de l'embryon Pour la lignée nº1 , le transgène s'exprime fortement dans les bronchioles en continuité de la trachée à 15,5 jours ce qui n'est pas observé dans la lignée n°9 à 17,5 jours où lacZ n'est trouvé que dans la trachée Cette différence peut être due soit à une modification de la régulation due à des sites d'intégration différents dans les deux lignées, soit à la différence de stade qui fait que l'expression de lacZ peut être réprimée entre le jour 15,5 et 17,5
Dans les deux lignées on trouve donc une expression du transgene dans des organes qui contiennent une forte composante de cellules musculaires lisses Il est intéressant de noter qu'il s'agit d'une partie au moins des cellules musculaires lisses de type respiratoire, la trachée, et une partie des cellules musculaires lisses de type viscéral, l'oesophage.
Enfin des sites d'expression ectopiques différents, c'est-à-dire où la présence de la protéine ou de l'ARN SM 22 endogène n'a pas été reportée ont été trouves dans les deux lignées La lignée 1 présente entre autre une expression forte très localisée dans les deux doigts postérieurs de chaque membre La lignée 9 exprime fortement lacZ dans les régions antérieures du cerveau. L'expression de cette construction à deux stades de l'évolution est illustrée par les figures 12A à 12D qui représentent des embryons de 15 ,5 jours p c (12A. 12B 12C) et un adulte de 2 mois (12 D) SM 445 nlz colorés pour l'activité β-galactosidase On note l'expression dans le tissu musculaire lisse des artères, de l'oesophage et des bronches sur les figures 12A B, C ainsi que dans des sites ectopiques comme la moëlle épinière (12B) ou les deux doigts postérieurs de chaque membre (12A). On note aussi l'absence d'expression dans l'aorte thoracique ou le tronc pulmonaire artériel chez l'adulte (12D) Seule une expression dans la trachée est maintenue.
Les résultats obtenus montrent qu'une séquence de 450 paires de bases est suffisante pour garder la même expression dans l'embryon et le foetus mais pas chez l'adulte.
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Claims

REVENDICATIONS
1 Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes, et
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
2 Séquence d'ADN selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo d'un gène dans les cellules des artères, et
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
3. Séquence selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine , ou ledit ARN, est susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les parois des artères et/ou d'induire une réponse immunitaire.
4 Séquence selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucleotides -2126 et +4135 du gène de souris de la protéine SM22 (SEQ ID n° 1.)
5 Séquence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucleotides - 2126 à +65 du gène de souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N°2).
6 Séquence selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle contient au moins une partie de la séquence située entre les nucleotides -2126 et -445 du gène de la souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N° 3).
7 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine induisant la formation d'un compose cytotoxique.
8 Séquence selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine est la thymidine kinase du virus de l'herpès
9 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente un effet cytostatique .
10 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente une activité hpoiytique.
11 Séquence selon la revendication 10, caractérisée en que ladite protéine est la lipoprotéine lipase.
12 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est un facteur de croissance des cellules endothéhales
13 Séquence selon la revendication 11 , caractérisée en ce que ledit facteur est une interleukine.
14 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine musculaire ou de structure tissulaire.
15 Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'ARN d'interèt thérapeutique est l'ARN antisens de la protéine p53.
16 Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de souris de la protéine SM 22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID N°5 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes :
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Figure imgf000057_0001
17. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n° 1 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes :
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18. Séquence dADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n° 2 suivante, ou une séquence s hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
19 Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n°1-1685 portant le plasmide p2126nlz comprenant la séquence selon la revendication 18.
20 Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n° 1-1686 portant le plasmide p2126INTnlz comprenant la séquence selon la revendication 17.
21 Vecteur caractérise en qu'il contient une séquence selon l'une des revendications 1 à 16.
22 Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il contient une origine de réplication efficace dans les cellules des artères
23 Vecteur selon l'une des revendications 21 et 22 caractérise en ce qu'il est un dérivé d'un adénovirus.
24 ARN caractérise en ce qu'il est capable d'être exprime par une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 23
25 Composition caractérisée en ce qu'elle contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23
26 Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que la séquence ou le vecteur sont compris dans une composition facilitant leur transfection dans les cellules.
27 Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend un gel qui est un complexe de poly-L-lysine et de lactose.
28 Médicament caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23.
29 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une séquence nucléique ou d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 a 23, et des excipients pharmaceutiquement compatibles.
30 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies coronariennes.
31 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 a 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de la restenose.
32 Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 a 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des mutations fragilisant les vaisseaux.
33 Animaux transgéniques caractérisés en ce qu'ils portent une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 a
23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur.
34 Procédé de criblage de molécules m vitro pour leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour ta protéine SM22 comprenant les étapes suivantes:
- transfection de cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 a 23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur,
- incubation des cellules transfectées avec la molécule à tester, et
- quantification de l'expression du gène réporteur.
35. Procédé de détection de mutations sur la région comportant la séquence selon l'une des revendications 1 à 16 ou le vecteur selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé par une altération de l'expression du gène placé en aval de ladite séquence.
36. Procédé d'expression de protéines d'intérêt thérapeutique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les produits selon l'une des revendications 1 à 24.
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