WO1997035612A1 - Antigene a fragment fonctionnel de la toxine du tetanos, et vaccin contre le tetanos - Google Patents

Description

一 明 細 書 破傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原及び破傷風ワ ク チン

技術分野

本発明は、 破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原及びそれ を用いる破傷風ワ ク チンに関する。 更に詳しく は、 本発明は、 全長破傷風毒素分子を抗原と して用いる破傷風ワ ク チンに比 較して、 副作用が著しく 低く 、 しかも免疫原性については実 質的に同等の免疫原性を示 し、 ワ ク チンの抗原と して優れて 有用な、 破傷風毒素分子の特定の機能的フ ラ グメ ン ト抗原、 それを有効成分とする優れて安全かつ有効な破傷風ワ ク チン (破傷風 ト キ ソィ ド） 、 及び該ヮ クチンと他種ワクチンとの 混合ワ ク チン、 並びにこれ等の製造方法に関する。 従来技術

衆知の通 り 、 破傷風は、 正視に耐えない弓な リ緊張や呼吸 困難等の悲惨な症状を伴い死に至ら しめる、 極めて致死率の 高い恐ろ しい感染症である。 また、 破傷風菌は芽胞の状態で、 土壌や人畜の糞便等に広く 常在し、 誰もが刺傷や創傷等の外 傷部位から常時これに感染する危険性に さ ら されている。 し かも、 いったん破傷風に罹患する と、 抗生物質や筋弛緩剤等 を用いる常套の化学療法はほとんど致命率に変化を与えず、 また、 破傷風抗毒素 疫グロブ リ ン） を以て しても、 高齢 患者の場合、 糖尿病や高血圧等の基礎疾患の制約を受け、 治 療が困難でぁ リ 、 先進諸国では近年、 この年齢層に死亡例が 集中 している。

更に、 たと え、 小児期に基礎免疫や追加免疫の予防接種を 受けていて も、 成人での持続免疫は、 地震、 火災、 交通事故 等での不慮の外傷によ る破傷風罹患の予防には必ずしも十分 ではないので、 40 ~ 50 歳以上の成人、 特に、 高齢者には事前 に追加免疫のための個人的予防接種を受けてお く 日頃の備え が涵養である。

一方、 少な く と も先進諸国では、 産院内分娩、 生活環境や 衛生観念の向上、 トキ ソィ ドゃ抗毒素を備えた救命救急医療 の充実、 低年齢層への予防接種の強制等に伴い、 この半世紀 の間に破傷風患者数が約 1 / 3 0以下に激減した。 しかも、 破傷 風は、 人から人に伝染しない非流行性の毒素性疾患であるた め、 と もすれば予防の重要性が社会的に忘れられがちな病気 である。 しかし、 開発途上国での新生児破傷風を含め、 破傷 風によ る世界の推計死亡者数は、 現在もなお年間約 1 0 0万例 である。 また、 最近では、 薬物乱用によ る不潔な注射針から の感染罹患が增加しつつある。

かかる実情から、 破傷風は、 治療の対象ではな く 、 予防あ るいは予防接種の対象とすべき疾患と して再認識され、 それ への対策が推し進め られている。 例えば、 W H Oが提唱の世 界予防接種拡大計画 "（ E P I ) では、 破傷風予防接種を重要 課題と して採択し、 活動が進め られている。 また、 これを背 景と して、 破傷風に関する問題だけを討議する 「国際破傷風 会議」 が 1 963年以来、 ほぼ 3年ごと に世界各地で開催されて いる。

この様に、 破傷風は、 根絶が不可能な 自然界の常在菌によ る疾患であ り 、 その予防接種は、 老若男女を問わず、 全ての 人類に と って極めて重要であるばかり でな く 、 現在のみな ら ず将来もまた必須である と言っても過言ではない。

破傷風の予防接種には破傷風 ト キソィ ドがワ クチンと して 用いられ、 その有効成分はホルマ リ ンで無毒化した破傷風毒 素である。 かかる トキソイ ドは、 アジュバン ト を添加しない 単味製剤、 あるいはアジュバン ト と して少量のアルミ ニウム 塩を添加した沈降製剤、 また、 ジフテ リ ア ト キソイ ド、 百日 せき ワ クチン、 イ ンフルエンザ b 型菌ワ クチン等と の混合製 剤のかたちで実用に供されている。 なお、 破傷風 トキソィ ド の使用に関し、 通常、 乳幼児にはジフテ リ ア （ D ) 、 破傷風 ( T ) 及び百日せき （ P ) の混合ワ ク チン、 いわゆる D P T 混合ワ クチンが、 一方、 外傷時の緊急を要する破傷風予防処 置の場合には、 D T混合 トキソィ ド又は単独の T ト キソィ ド が、 それぞれ世界で広く 使用 されている。 そ して、 その顕著 な効果に基づき、 該 T トキソィ ドは最も有効かつ重要なワク チンの 1 つと して世界的に高く 評価されている。 しかしなが ら、 現行の破傷風 ト キ-ソィ ドには様々 な欠陥と課題が轡積し ている。 例えば、 多様な副作用の随伴、 製造者の違いによ る 品質のばらつき 、 約 5〜 1 0年と いう 限られた免疫持続期間、 多数回接種や追加接種の煩雑さ等の観点、 換言すれば、 ワク チンの安全性、 均質性、 効能持続、 更に、 経済性を考慮した 予防接種の省力化と全世界への拡大等々 の観点から、 その質 と量産と の両側面に立脚した改良すべき課題が山積している。 以下、 これ等の課題の う ち、 本発明の主なる 目的である と こ ろの、 ワ クチン抗原と して副作用が極めて少なく 、 しかも 高い免疫原性を発揮する破傷風毒素抗原の提供と い う観点か ら、 従来技術を展望する。

従来の破傷風 ト キ ソィ ドには様々な副作用が知られている。 例えば、 注射部位の発赤、 圧痛、 腫張、 浮腫、 無菌膿瘍等の 散発する局所反応や全身発熱、 更に、 希ではあるが、 ァナフ イ ラキシ一、 血清病様の ΠΙ型過敏症、 遅延型過敏症等のァ レ ルギ一、 末梢神経障害、 リ ンパ節障害、 腕神経叢障害、 ギラ ン · バレー症候群、 急性横断脊髄炎等の重篤な全身反応が報 告されている （ S. A. P 10 t k i n and E. A. Mo r t ime r 編 " Va ccine" 、 第 2版、 75- 77 頁、 W.B.Saunders Company 1994 年発行 ； G. L. Mand e 11 ら編 " Mande 11 , Douglas and Benn et t' s pr inc iples and pract ice of infect ious di seases" 、 第 4版、 2781頁、 Churchi l l Livingstone & Son， 1 n c .1995年 発行 ； Journal of the American Medical Associat ion, 26 4(18) , p.2448, 1990 及び 271 (20)， p.1629, 1994； Lancet ,

339, pp.1111-1112, 2 May 1992 ) 。 そのため、 これ等の 副作用の軽減や克服を 目的とす 種々の改良、 例えば、 高度 精製に係る工夫、 アジュバン トの再検討、 さ らには後述する 破傷風毒素の A、 B及び Cフラ グメ ン ト ないしはサブュニッ ト をワ クチンの有効成分と して用いる創意等が試行されてい る。 これ等の う ち、 特に、 破傷風毒素フ ラ グメ ン ト を用いる 技術に関 しては、 例えば、 破傷風毒素を ト リ プシン及び Z又 はパパイ ンで消化し調製した Cフ ラ グメ ン ト （特開昭 50 - 71 820 号、 特開昭 5卜 82719 号、 及び特開昭 52-83928 号） 、 パパイ ンで消化 · 調製した A— B フラ グメ ン ト （特開昭 53- 26319 号） 、 Cフラ グメ ン ト遺伝子を大腸菌、 酵母又はサル モネラ菌で発現させて得た抗原 （特開平 3-285681 号、 特表 平 4-506005 号又は PCT特開 W0 90/ 15871 号、 PCT特開 W0 9 4/03615 号、 欧州特開 EP 209281 号、 及び米国特許第 373862 号） 、 Cフラ グメ ン トの合成ェピ ト一プ （ PCT特開 W0 94/00 48 号） 等々が知られている。 しかしながら、 これ等の破傷 風毒素フラ グメ ン ト · ワ ク チンは、 全長破傷風毒素分子を用 いる現行の破傷風 トキソィ ドに比べ、 いずれも、 抗原性や免 疫原性が劣るため、 未だ実用化されていない。 また、 破傷風 毒素遺伝子 D N Aのク ローニングとその全塩基配列の決定並 びに該毒素の全長ァ ミ ノ酸配列の解読が行われ [EMBO Journa 1 , 5(10)， 2495-2501 , 1986； Nucleic Acid Research, 14(1 9) , 7809 -7812 , 1986 ; よお、 全長破傷風毒素分子の全長ア ミ ノ酸配列を配列番号 ： 1 に示す]、 これに基づく 種々の該遺 伝子 D N A断片の発現や合成べプチ ドによ リ 、 破傷風毒素の ェピ トープ領域が検索されている [Inf ect ion and Immun i t y, 57 (11) , 3498-3505, 1989； Mo l ecu lar Immuno logy, 31 (15) , 1141- 1148, 1994 ]。 しかし、 かかるェピ トープを有効成分 と して用いる破傷風ワ クチンは未だ知られていない。 発明の概要

本発明者は、 破傷風毒素の高度精製が未達成であ り 、 その 性状も不詳であった 1970年代前半から現在に至る 2 0数年に わた り 、 破傷風菌とその産生毒素に関する基礎を築く と共に、 それに立脚し、 系統的に研究を進めた。 そ して、 全長破傷風 毒素分子を抗原と して用いる従来の破傷風 ト キ ソィ ドに比し て、 副作用が著しく 低く 、 しかもその免疫原性が上記の従来 のヮ ク チンのそれに劣らない破傷風ヮ ク チンのヮ クチン抗原 を開発すべく 鋭意研究を行なった。 その結果、 意外にも、 破 傷風毒素に由来の機能的フラグメ ン ト抗原 （Funcに iona l Fra gment a l ly Ant igen; 以下、 屡々 、 「 F F A」 と略記する） が破傷風ワ クチン用抗原と して有効であ り 、 しかも副作用が 著し く 低い、 と い う驚く べき知見を得た。 本発明は、 この新 規な知見に基いて完成されたものである。

従って、 本発明の主なる 1 つの 目 的は、 全長破傷風毒素分 子を抗原と して用いる-従来の破傷風 トキ ソィ ドに比して、 副 作用が著し く 低く 、 しかもその免疫原性が上記の従来の トキ ソィ ドのそれと実質的に同等の破傷風ワ ク チンのワ クチン抗 原を提供する こ と にある。

本発明の他の 1 つの目的は、 副作用が著 し く 低く 、 しかも その免疫原性が上記の従来の トキソィ ドのそれと実質的に同 等の破傷風ワ クチンを提供する こ とにある。

本発明の更に他の 1 つの 目的は、 上述の破傷風ワ クチンの 製造方法を提供する こ と にある。

本発明の更に他の 目的は、 破傷風ワク チン抗原と しての上 記した破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原の製造方法を提 供する こ と にある。

本発明の上記及びその他の諸目的、 諸特徴ならびに諸利益 は、 次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。 配列表の簡単な説明

配列表において ：

配列番号 1 は、 本発明に用いられる全長破傷風毒素分子の全 長ア ミ ノ酸配列の一態様である。 図面の簡単な説明

図 1 は、

( a ) 全長破傷風毒素分子の構造の概要を示す図でぁ リ 、 ( b ) 全長破傷風毒 分子の nicked form を示す図であ リ 、

( c ) 全長破傷風毒素分子の 「三部分 [ A · B · C ] 分子 モデル」 を示す図でぁ リ ；

図 2 は、

( a ) F F Aの N末端領域のア ミ ノ酸配列の多様性を示す 図でぁ リ 、

( b ) 全長破傷風毒素分子の概要モデルを示す図である。 符号の説明

S— S ： ジスルフ イ ド架橋

* 切れ目 (nick)

非共有結合

ア ミ ノ 酸配列におけるア ミ ノ酸残基の一字表記の意味

A ァラニン C システィン D ァスパラギン酸

E グルタミン酸 F フエ二ルァラニン G グリシン

H ヒスチジン I イソロイシン K リ ジン

L ロイシン M メチォニン N ァスパラギン

P プロ リ ン Q グルタミン R アルギニン

S セリ ン T トレオニン V ノくリ ン

W ト リプトファン Y チロシン 発明の詳細な説明 本発明によれば、 全-長破傷風毒素分子の全長ア ミ ノ酸配列 の N末端側に存在するジスルフ ィ ド架橋に関与する 2 つのシ スティ ン残基間の部分ア ミ ノ酸配列中の各ア ミ ノ酸を結合す るペプチ ド結合の中の少な く と も 1 つを開裂する と共に、 該 ジスルフ ィ ド架橋を開裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構 成するア ミ ノ酸残基間相互の非共有結合 [後述説明の図 2 ( b ) ] を開裂する こ とによって得られる少な く と も 1種の フラ グメ ン ト と実質的に同一のフラ グメ ン ト よ リ な り 、 S D S - ポ リ ア ク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動法によ リ 測定された分子量 が 9 万〜 1 1 万でぁ リ 、 等電点電気泳動法にょ リ 測定された 等電点が 7 . 2 5 ± 0 . 5であって、 その免疫原性が全長破傷風毒 素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴とする破 傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原が提供される。

次に、 本発明の理解を容易にするために、 まず発明の基本 的諸特徴及び好ま しい態様を列挙する。

1 . 全長破傷風毒素分子の全長ァ ミ ノ酸配列の N末端側に存 在する ジスルフ ィ ド架橘に関与する 2 つのシスティ ン残基間 の部分ァ ミ ノ 酸配列中の各ァ ミ ノ酸を結合するぺプチ ド結合 の中の少な く と も 1 つを開裂する と共に、 該ジスルフ ィ ド架 橋を開裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するア ミ ノ酸 残基間相互の非共有結合を開裂する こ と によって得られる少 なく と も 1種のフラグメ ン ト と実質的に同一のフラ グメ ン ト よ り な リ 、 S DS -ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動法にょ リ測 定された分子量が 9 万-〜 1 1 万であ り 、 等電点電気泳動法に よ リ測定された等電点が 7.25 ± 0.5であって、 その免疫原性 が全長破傷風毒素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴とする破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原。

2 . 上記の少なく と も 1種のフラグメ ン トが、 各々独立に、 下記のァ ミ ノ酸配列（1)〜（8)よ リ なる群から選ばれるァ ミ ノ 酸配列を N末端配列と して有する こ と を特徴とする前項 1 に 記載の破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原。

(1) KI IPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(2) I IPPTN IRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK

(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK

(5) NRTASし TDLGGELCIK

(6) TASLTDLGGELC1K

(7) SLTDLGGELCIK

(8) GGELC1K

3 . 固定化剤によ り 固定化された、 前項 1 または 2に記載の 破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原。

4 . 前項 1 から 3のいずれかに記載の破傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原を、 有効成分と して免疫を奏する量含有して なる破傷風ワ ク チン。

5 . 前項 1 から 3のいずれかに記載の破傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原を、 混合された複数の有効成分の一つと して 免疫を奏する量含有し-てなる混合ワクチン。

6 . 破傷風菌の培養液から菌体外毒素を精製採取の後、 該菌 体外毒素分子内の N末端側に存在するジスルフィ ド架橋を開 裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するア ミ ノ酸残基間 相互の非共有結合を開裂するこ と によって得られる少なく と も 1種のフ ラ グメ ン ト と 実質的に同一のフラ グメ ン ト ょ リ な り 、 SDS-ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法にょ リ 測定され た分子量が 9万〜 1 1 万でぁ リ 、 等電点電気泳動法にょ リ 測 定された等電点が 7.25±0.5であって、 その免疫原性が全長 破傷風毒素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴 とする破傷風毒素の機能的フラグメ ン ト抗原を固定化剤で固 定化する こ と を特徴とする破傷風ワ ク チンの製造方法。

7. 前項 1 または 2 に記載の破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原をコー ドする D N Aをべク タ一に挿入連係し、 該べク ターを破傷風菌とは異なる別の宿主に移入し発現させる こ と を特徴とする上記のフラ グメ ン ト抗原の製造方法。

以下、 本発明について詳細に説明する。

尚、 本発明において、 A I a はァラニン、 A r g はアルギ ニン、 A s nはァスパラギン、 A s p はァスパラ ギン酸、 C y s はシスティ ン、 G 1 nはグルタ ミ ン、 G 1 uはグノレタ ミ ン酸、 G 1 y はグリ シン、 H i s はヒ スチジン、 I 1 e はィ ソ ロイ シン、 L e uはロイ シン、 L y s は リ ジン、 M e t は メ チォニン、 P h e はフエ二ルァラニン、 P r o はプロ リ ン、 S e r はセ リ ン、 T h- r はス レオニン、 T r p は ト リ プ ト フ ア ン、 T y r はチロ シン、 V a 1 はバ リ ンである。

本発明の機能的フ ラ グメ ン ト抗原は、 上記したよ う に、 全 長破傷風毒素分子の全長ア ミ ノ酸配列の N末端側に存在する ジスルフィ ド架橘に関与する 2 つのシスティ ン残基間の部分 ア ミ ノ 酸配列中の各ア ミ ノ 酸を結合するぺプチ ド結合の中の 少な く と も 1 つを開裂する と共に、 該ジスルフ イ ド架橋を開 裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するア ミ ノ酸残基間 相互の非共有結合 [後述説明の図 2 ( b ) ] を開裂する こ と によ って得られる少なく と も 1種のフ ラ グメ ン ト と実質的に 同一のフラ グメ ン ト よ リ なる。 本発明の機能的フラグメ ン ト 抗原の好ま しい態様と しては、 上記の少なく と も 1種のフラ グメ ン トが、 各々独立に、 下記のア ミ ノ 酸配列（ 1)〜（8)ょ リ なる群から選ばれるア ミ ノ酸配列を N末端配列と して有する こ と を特徴とする破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原を挙 げる こ とができ る。

(1) KI IPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(2) I IPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK

(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK

(5) NRTASLTDLGGELCIK

(6) TASLTDLGGELCIK

(7) SLTDLGGELCIK (8) - GGELCIK

更に、 本発明の機能的フラ グメ ン ト抗原は固定化剤によ リ 固定化されていてもよい。

次に、 本発明の基本的特徴を更に明かにするために、 本発 明の完成に至る経緯を追いながら、 本発明に包含される技術 的諸特徴について説明する。

高度に毒素産生する破傷風菌 ： 本発明においては高度に毒 素産生する破傷風菌が用い られる。 本発明者は周知の破傷風 菌 Harva rd株 [ATCC(Amer i can Type Cu l t ure Co l lec t ion)寄 託番号 10779 ] に由来の Harvard A47 株から高度毒素産生破 傷風菌の亜株を単コ ロ ニー分離し、 C 10 s t r i d i um t e t an i Ha r vard A47株 B i k e nサブス ト レイ ン （以下 「ビケン亜株」 とい う） を得る と共に、 該菌体内のプラス ミ ド D N Aによる毒素 産生の支配を も見いだした （B en Journa l , 20 , 105- 115 , 1 977 ) 。 そ して、 プラス ミ ド D N Aによ る毒素産生能の支配 を考慮した培養方法を用い、 ビケン亜株の培養によ り破傷風 毒素の量産に成功 し、 その量的確保と高度精製を達成した。 従って、 本発明では先ず、 シー ドと して用いる高度毒素産生 破傷風菌を選択し確保する必要がある。 破傷風菌シー ドと し ては、 上記の高度毒素産生破傷風菌のみな らず、 後述する F F Aをコー ドする D N Aを用い、 遺伝子工学的手法にょ リ酵 母、 大腸菌、 古草菌等に形質転換した微生物等も毒素生産用 のシー ドと して用いる こ とができ る。 破傷風毒素の産生様-式と 毒素活性 ： 破傷風毒素は、 先ず 菌体内で分子量約 1 5 万の単鎖ポ リ ペプチ ド （以下、 屡々 、 菌体内毒素 という） と して生産された後、 菌の 自 己融解に伴 ぃ菌体外の培地中に放出される （以下、 屡々 、 菌体外毒素と い う ） 。 その際、 菌が産生するプロテアーゼによ り 、 全長破 傷風毒素分子の全長ア ミ ノ 酸配列の N末端側に存在するジス ルフ ィ ド架橋に関与する 2 つのシスティ ン残基間の部分ア ミ ノ酸配列中の各ア ミ ノ酸を結合するぺプチ ド結合の中の少な く と も 1 つが開裂し、 少な く と も 2本のペプチ ド鎖になる。 但し、 かかる両ペプチ ド鎖は、 毒素分子內のジスルフ ィ ド架 橘で連係されたかたち、 即ち n i c k e d form になってぉ リ [図 1 (a) と (b) ; Biochemical and Biophys ical Research Com municat ions, 57 , 1257- 1262, 1974； 同前， 68, 668-674, 197 6 ； 同前 77 , 268 - 274 , 1977 ] 、 更に、 これ等のぺプチ ドを構 成するア ミ ノ酸残基間で相互に非共有結合している [図 2(b) ] 。 そ して、 かかる nicked ί o r mの形成に伴い、 毒素活性が数 倍に上昇する。 従って、 毒素の機能的フラグメ ン トの調製ェ 程の省力化を考慮する と 、 出発材料には既に n i c k e d f o r mに なっている菌体外毒素 [図 1 (b) ] の使用が好ま しい。

破傷風毒素のサブュニッ ト構造と毒作用発現機構 ： 本発 明者の創意的研究にょ リ 、 全長破傷風毒素分子を用い、 L (l ight ) 鎖と H (heavy ) 鎖を得た。 これら断片はそれぞ れ単独では毒性はないが、 再構成によ る全長破傷風毒素分子 活性の再現が可能なほど十分 nat i ve 状態で単離精製するこ と に成功した。 また、 H鎖 C末端側の半分 （フ ラ グメ ン ト お 、 全長破傷風毒素分子から C断片を除いた部分 （フラ グメ ン ト A— B ) 、 及び該 A— Bからフラ グメ ン ト Aを除いた部分

(フ ラ グメ ン ト B ) の分離精製も達成した。 更に、 全長破傷 風毒素分子フラ グメ ン ト A B及び C並びにその隣接複合体 をそれぞれ調製した後、 これ等の構造の相違に基づく 機能の 違い及び破傷風毒素分子のサブュニッ ト構造と破傷風毒素分 子発現機構と の関連を解析 し、 破傷風毒素分子の 「三部分

[ A · B · C ] 分子モデル」 を提唱した [図 1 (c)； Bi ken Journa l , 26 133- 143, 1983； L. L. Simpson 編 "Botu l inum

Neuroto in and Tet anus Toxin" pp.69- 92 (第 4章） ， A cadem i c Press 1989 年発行] 。

この分子モデルは、 第 8 回国際破傷風会議 （ 1987年） にお いて最も適切な分子モデルと して認められている。 上記のフ ラ グメ ン ト Cは破傷風毒素分子の中枢神経系への運搬 （ C a r r i er) を、 フ ラ グメ ン ト Bは破傷風毒素分子の神経細胞シナ ブス前部への結合 （ B ind ing) と細胞質内への侵入輸送を、 そ して、 フ ラ グメ ン ト Aが酵素活性によ る毒性の発揮 （ A ct ive ) をそれぞれ分担している （ G. Ni s t coら編 "Eighth I nt ernat i ona l Conf erence on Tetanus pp. 170 - 171 Ph y t h a go r a Press, Rome - Mi l an 1989 年発行 ； In f ect ion and I n iけ， 57 , 3588-3593 , 1989 Tocx i con, 27 , 385-392, 1 989及び 28， 737 -74 lr 1990 ) 。

破傷風毒素分子のフラ グメ ン トの多様性 ： 上記の A、 B及 び C各断片べプチ ド鎖の長さ と分子量並びに名称は、 1989年 の時点で、 世界の研究者の間でまちまちで多様でぁ リ 、 研究 者間や国際会議での円滑な討論に支障を来た し、 これ等のフ ラ グメ ン トの統一あるいは定義による共通の基盤が期待され た。 そのため、 本発明者は、 世界に先駆け、 前記の [三部分] 分子モデルを提唱する と 同時に、 既報のフ ラ グメ ン トが多様 な現状を指摘し、 統一すべきだと提案した [前記 しし Simp son 編 "Bot u l inum Neuroto i and Tet anus Tox in , pp. o 9-92 (第 4章） ] 。 かかる全長破傷風毒素分子よ り得られる フラグメ ン トの多様性は， 破傷風菌シー ドの遺伝学的相違の みならず、 毒素とそのフラ グメ ン トを調製する際の種々 の条 件、 例えば、 シー ドの培養、 既に n i cked f ormになっている 菌体外毒素を得るための培養菌体の自 己融解、 抽出した菌体 内毒素分子のプロテア一ゼによる消化及び還元剤、 変性剤、 可溶化剤な どによ る処理に用いる酵素や試薬の種類、 温度、 時間、 濃度、 P H、 攪拌、 振と う 、 静笸等を含む諸条件の微 妙な相違によ る と考え られる。

本発明における 「 F F A」 の定義 ： 本発明による機能的フ ラ グメ ン ト抗原 （ F F A ) は、 全長破傷風毒素分子の全長ァ ミ ノ酸配列の N末端側に存在する ジスルフ ィ ド架橋に関与す る 2つのシスティ ン残基間の部分ァ ミ ノ 酸配列中の各ァ ミ ノ 酸を結合するぺプチ ド-結合の中の少なく と も 1 つを開裂する と共に、 該ジスルフ ィ ド架橋を開裂し、 更に、 該毒素分子べ プチ ドを構成するア ミ ノ 酸残基間相互の非共有結合 [後述説 明の図 2 ( b ) ] を開裂する こ と によって得られる少な く と も 1種のフラ グメ ン ト と実質的に同一のフラ グメ ン ト よ り な リ 、 SDS-ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法にょ リ測定され た分子量が 9万〜 1 1 万でぁ リ 、 等電点電気泳動法にょ リ測 定された等電点が 7.25±0.5であって、 その免疫原性ない し 力価が全長破傷風毒素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴とする破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原であ る。 本発明者の研究にょ リ 、 多様な F F Aの N末端ア ミ ノ酸 配列が見出された [図 2(a) を参照] 。 本発明において、 図 2(a) に示された 8種の各ア ミ ノ 酸配列から選ばれる少なく と も 1 種のア ミ ノ酸配列を N末端配列と して有する、 破傷風 毒素の機能的フラグメ ン ト抗原が好ま しい。 そ して、 ヮ クチ ン用抗原と しての F F Aの免疫原性は、 全長破傷風毒素分子 のそれと実質的に同等でぁ リ 、 しかも、 破傷風ワ ク チンと し ての F F Aの副作用は従来の破傷風 トキ ソィ ドのそれに比べ 著しく 低い。 なお、 上記の免疫原性とは、 破傷風発症防御能 を意味する。 また、 本発明において、 F F Aの免疫原性が全 長破傷風分子のそれと実質的に同等である と は、 F F A及び 参考例 1 4 に記載の方法に従い調製される全長破傷風毒素分 子それぞれを用いて作成した試作ワ ク チンの免疫原性の測定 P

1 8

を実施例 1 ( 5 ) に記載の毒素攻撃法 [免疫動物での L D ₅₀ (Med i an Lethal Dose)を測定する ] によって行い、 参考例 1 5 に記載のスコア法によ り解析したと き、 相対力価 （ F F A : 全長破傷風毒素分子） が 1 ± 0 . 2 である こ と を意味す る。

以上に基づき、 本発明は、 破傷風毒素の F F Aを有効成分 と して用いる破傷風 トキソ イ ドの単味製剤、 沈降製剤及びこ れ等の乾燥製剤、 また、 該 トキソイ ドを有効成分の 1 つと し て含有する D P T混合製剤、 D T混合製剤、 更に、 イ ンフル ェンザ b型菌、 不活化ポ リ オ、 不活化 B型肝炎、 不活化日本 脳炎等の各ワ ク チンの 1 種以上と の混合製剤を提供する と共 に、 これ等の量産法の確立によ り 、 前記課題を解決するもの である。

次に本発明の F F A-の調製、 調製された F F Aを用いたヮ ク チンの調製、 得られたワ ク チンの評価試験な どについて説 明する。

( I ) 破傷風菌シー ド ：

本発明の機能的フ ラ グメ ン ト抗原 （ F F A ) を得るために は用いられるシー ドと しては、 高度に破傷風毒素を産生する 菌であれば特に限定されないが、 破傷風菌 Harvard株又はこ れと 同等以上の毒素産生能を有する株が挙げられる。 具体的 には、 周知の破傷風菌 Harvard株 [ ATCC (Am e r i c a n Type Cu 1 ture Co 1 lec t ion)寄託番号 10779 ] に由来の Harvard A47 株 から高度毒素産生破傷風菌の亜株を単コ ロニー分離する こ と によ リ得られたビケン亜株 （参考例 1 ) が好ま しい。 又、 F F Aをコー ドする遺伝子を用い、 遣伝子工学的手法によ リ酵 母、 大腸菌、 枯草菌等に形質転換した微生物等も毒素生産用 のシー ドと して用いる こ と ができ る。 具体的には、 参考例 2 に記載の方法によ リ得られた、 後述する破傷風菌が保有の F F A遺伝子 D N Aを挿入連係し構築した多量発現べク タ一を 形質転換した大腸菌もシー ドと して用いる こ と ができ る。

( 2 ) 培地 ：

毒素産生用のシー ドの培養に用いる培地は、 公知の組成を 用いる こ とができ る。 例えば、 前述の破傷風菌シー ドの培養 には、 嫌気性菌の常用液体培地を用いる こ と ができ る。 具体 的には、 例えば、 ク ック ト · ミー ト培地、 P Y G (Pepton, Yeas t ex t ract , Gluco~se) 培地、 G A M ( G i f u Anaerob i c M ed ium) ブイ ヨ ン 、 仔ゥシ肉浸出液ブイ ヨ ン、 肉肝 （ V F ) ブイ ヨ ン、 脳培地、 チォグ リ コール酸塩培地、 肝片ー肝ブイ ヨ ン、 R C M (Re inf orced Clos t r i d i a l Med ium) ブイ ヨ ン、 D R ^ M ^Di f f erent i a l Re inf orced Clos t r id i a l Med ium) ブイ ヨ ン等が挙げられる。 これ等の培地は、 菌の増殖性や低 酸化還元電位の維持等を考慮し、 成分の置換、 付加、 削除等 や用量の変更にょ リ 、 随時、 改良 し、 変法培地と して使用で き る。 これ等の う ち、 シー ドの調製には肝片ー肝ブイ ヨ ンが、 また、 毒素の産生には発明者が考案の La tham 変法培地 （参 考例 3 ) の使用が好ま しい。

( 3 ) 培養条件 ：

破傷風菌シー ドの培養条件は特に限定されないが、 例えば、 高度毒素産生破傷風菌株は以下の条件で培養を行う。 培養温 度は約 3 0 〜 3 7 °C、 好ま しく は約 3 4 〜 3 6 °Cであ り 、 培 養時間は約 1 〜 8 日 、 望ま しく は、 菌体内毒素の採取には約

1 〜 2 日 、 菌体外毒素の場合は約 4 〜 7 日 である。

( 4 ) F F Aを調製するための出発材料 ：

本発明においては、 上述の方法によ リ 培養した菌体よ リ得 られる全長破傷風毒素分子を用いて F F Aを調製する。 用い られる全長破傷風毒素分子を含有する出発材料と しては、 上 述のよ う に菌体を培養する こ とによ リ得られる培養菌体の柚 出液 （菌体内毒素を含有） 、 又は培養菌を 自 己融解させた培 養物中の菌体残渣を遠-心や濾過によ り 除去した培養上清や培 養濾液 （菌体外毒素を含有） を使用する こ とができ る。 菌体 内毒素の場合は、 毒素分子をプロテアーゼ、 例えば ト リ プシ ンゃキモ ト リ プシンなどによ リ n i c k e d f o r πιに変えるか又は 消化して開列する前処理が必要である。 従って、 かかる調製 工程の省力化を考慮する と 、 出発材料には既に n i c k e d f o r m になっている菌体外毒素を含有する培養上清や培養濾液の使 用が望ま しい。

( 5 ) 毒素の粗精製 ：

出発材料中の全長破傷風毒素分子は、 例えば、 硫安塩析、 アルコール沈殿、 ゲルや活性炭等への吸着と溶出、 市販の膜 濾過等の常法にを用いて精製でき る。 本発明では、 かかる精 製によ リ得られる全長破傷風毒素分子を粗精製全長破傷風毒 素分子とする。

( 6 ) 毒素の高度精製 ：

上記 （ 5 ) の方法で得られた粗精製全長破傷風毒素分子の 高度精製は、 例えば、 密度勾配超遠心と平衡密度勾配超遠心 と を併用する技術 （ 日本国特公平 7 - 8 9 9 5 1号） 、 また、 超遠 心、 ゲル濾過、 イオン交換ク ロマ ト グラ フィ 、 高速液体ク ロ マ ト グラ フィ等の既知の技術を組合わせて用いる こ と によ リ 達成でき る。 本発明では、 かかる精製にょ リ得られる全長破 傷風毒素分子を精製全長破傷風毒素分子と して、 本発明の F F Aの調製に用いる こ とができ る。 なお、 精製全長破傷風毒 素分子については、 F F Aの調製前に、 全長破傷風毒素分子 と しての適格性を確認する必要がある。 これには、 例えば、 毒素の M L D (Minimum Lethal Dose； 参考例 4 ) 、 L f 単 位 (Limi t f locculat ion Un i t； 参考例 5 ) 、 タ ンパク量 （ 参考例 6 ) 等を測定する。

( 7 ) F F Aの調製 ：

本発明の F F Aの調製には前述の精製毒素断片が用いられ る。 精製毒素が菌体内毒素の場合には、 プロテア一ゼ、 例え ば、 ト リ プシンゃキモ ト リ ブシン等で毒素分子を前処理 ' 消 化し、 予め nicked f o rmに変えるか又は開裂する必要がある。 毒素断片は、 nicked formの精製毒素のジスルフ ィ ド架橋の 還元剤によ る開裂、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するァ ミ ノ 酸残基間相互の非共有結合の変性剤や可溶化剤によ る開 裂にょ リ調製でき る。 これには、 還元剤と して公知のもの、 例えば、 チォグ リ コ ール酸ナ ト リ ウム、 ァス コルビン酸、 d i thiothre itoi (以下 「 D T T」 と略記する） 、 ダルタチオン、 メノレカプ トエタ ノール、 システィ ン、 硫化水素、 水素化ホウ 素ナ ト リ ウム、 硫化ナ ト リ ウム、 硫化ア ンモニ ゥム等が用い られる。 また、 変性剤や分散剤と して常用のもの、 例えば、 グァニジンチオシァネー ト、 尿素、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 エチ レンジァ ミ ン四酢酸、 エチ レングリ コール四酢酸等も使 用でき る。 本発明においては、 これ等の う ち、 D T T と尿素 の使用が好ま しい。 好ま しい使用法と しては、 例えば、 毒素 タ ンパク約 ：！ 〜 1 0 m - g / m 1 液中での D T Tの最終濃度は 1 0〜 2 0 0 mM、 好ま し く は 5 0 〜 1 5 0 mMであ り 、 反 応温度 1 5 〜 3 5 °Cにおいて反応時間は 2 0〜 1 8 0分であ る。 又尿素は約 0 . 5 〜 ： L 0 M、 好ま し く は ：！ 〜 5 Mであ リ 、 その処理温度は 5 〜 3 5 °C、 処理時間は 1 0秒〜 1 5分であ る。 上述の濃度になる よ う にこれ等の試薬を出発材料に添加 混合する。 本発明において、 D T Tは溶液 （参考例 8 ； 以下

[ D T T ト リ ス緩衝液」 と い う） と し、 出発材料にその約 5 〜 5 0培容を添加混合し反応させる。 尿素は飽和溶液または 結晶を直接、 添加混合して用いる。

上記の D T T と尿素処理によ り 、 全長破傷風毒素分子が開 列 し、 F F Aが生じる。 該 F F Aは、 密度勾配超遠心と平 衡密度超遠心と を併用する技術 （ 日本国特公平 7-89951号） 、 SDS - PAGE (Sodium Do d e c 1 Sul f ate-Polyacrylamide Ge l E I ec t r o pho r e s i s ) 、 ゲル、濾過、 膜濾過、 イ オン交換ク ロマ ト グラフィ 、 高速液体ク ロマ ト グラ フィ等にょ リ 吸光度 280nm

(参考例 7 ) を指標と して分画又は分離し、 それぞれ精製毒 素フラ グメ ン 卜 と して回収できる。 回収 された 2つのピーク の う ち、 F F Aは分子量の大きい方の画分に含まれてお リ 、 これを F F A破傷風ワ ク チ ンの抗原と して用いる。 なお、 全 長破傷風毒素分子 （参考例 13) の調製は後述の通 り である。

F F A及び全長破傷風分子の分子量、 抗原特異性、 ア ミ ノ酸 配列等は、 例えば、 SDS-PAGE (参考例 10) 、 ゲル内沈降反応 (参考例 1 1 ) 、 ペプ ドシーケンサー （参考例 1 2 ) 等にょ リ 測定でき る。

( 8 ) F F Aの固定化 ：

本発明の機能的フ ラ グメ ン ト抗原は、 毒素活性 A断片領域 の全部又は大部分が既に除去されている こ と から、 無毒であ リ 、 そのまま トキソイ ドと して使用でき る。 しかし、 抗原の 立体構造の安定化を図るには、 毒素断片の固定化が望ま しい。 固定化剤 と しては、 常用の無毒化剤、 例えば、 ホルマ リ ン、 ダルタルジアルデヒ ド、 P —プロ ピオラ ク ト ン等が使用でき る。 例えば、 ホルマ リ ンを使用の場合、 その添加量は約 0 . 0 0 0 4 〜 0 . 7 % (V/V) 、 固定化温度は約 3 〜 3 7 °C、 固定化時間は約 5 〜 1 8 0 日 である。 かかる固定化にょ リ 抗原性が損なわれる場合には、 固定化剤の濃度や固定化温度 の低下、 中性ア ミ ノ 酸、 例えばグ リ シン、 セ リ ン等、 や塩基 性ア ミ ノ 酸、 例えば、 リ ジン、 アルギニン等の添加混合等を 行い、 固定化条件の緩和を行う。 また、 こ の工程で残存する 遊離ホルムアルデヒ ドは、 必要なら、 等量の亜硫酸水素ナ ト リ ウムを添加混合して中和するか、 膜濂過ゃ透析にょ リ 除去 でき る。 固定化完了後の F F A液は、 4 °Cに保存し、 破傷風 毒素ワ ク チ ンの原液と して爾後のワ クチン調製に供する。 な お、 固定化工程を経た毒素断片及び毒素全分子を トキソイ ド と呼ぶ。

( 9 ) F F A破傷風ワ ク チンの調製 ： 上記 （ 8 ) の方法によつて得られた ト キ ソィ ドの原液を希 釈し、 ワ ク チン中の毒素断片の抗原量が免疫を奏する量の抗 体産生を誘導する よ う に調製する こ とができ る。 例えば、 毒 素断片タ ンパク量が、 単味 ト キソィ ドでは 2 0〜 2 0 0 μ g、 また、 沈降 ト キ ソイ ドでは 8〜 8 0 g になる よ う 等張 の塩類溶液、 緩衝液、 組織培養液等で希釈 · 調整する。

その際、 ワ ク チンの耐熱性を增強するための安定化剤や、 免疫原性を高める補助剤と してのアジュバン ト等を添加混合 でき る。 安定化剤は、 ワ ク チン l m fi に対して 0 . 0 1 〜 1 0 % ( w / V ) 添加 して用いられる。 アジュ ノ ン トはヮ クチ ン l m fi に対して 0 . ：! 〜 5 0 m g添加 して用いられる。 例 えば、 安定化剤と しては、 糖類、 ア ミ ノ酸、 ゼラチン加水分 解物、 ヒ トアルブミ ン等、 また、 沈降 ト キソィ ド用のアジュ バン ト と しては、 リ ン酸カルシウ ム、 リ ン酸アル ミ ニ ウ ム、 硫酸アル ミ ニ ウム、 アルミ ナ、 ベン トナイ ト等の抗原徐放性 のゲル、 更に、 ムラ ミルペプチ ド誘導体、 ク レスチン、 ピシ バニ一ル等の抗体産生誘起性物質などの公知のものを適宜採 用でき る。

次いで、 単味あるいは沈降ワ ク チンをア ンプル、 バイ アル 瓶等の小容器に小分 · 分注の後、 溶封あるいは密封し、 液状 又は沈降製剤と して実用に供する。 また、 小分 · 分注後に凍 結乾燥すれば、 乾燥製剤と して提供でき る。 更に、 D T 2種 混合、 D P T 3種混合、 あるいは 4種混合等の混合製剤と し て提供でき る。 これ孥の製剤は、 トキソイ ドあるレ、はヮ クチ ンと しての適格性に関する検定を行う。 即ち、 厚生省告示第 217号 「生物学的製剤基準」 に規定の 「破傷風 ト キソィ ド」 、 「沈降破傷風 ト キソイ ド」 、 「ジフテ リ ア破傷風混合 ト キソ イ ド」 、 「百日せき ジフテ リ ア破傷風混合ワ ク チン」 等の該 当条項に準拠し、 有効性、 安全性及び均質性に関する各種試 験を行い、 ワ ク チン と しての適格性を確認する。 そ して、 か かる検定に合格した製剤のみを実用に供し、 通常、 被接種者 当た り 、 た と えば 0 . 5 ml ずつ皮下又は筋肉內に接種する。 なお、 乾燥製剤は接種前に滅菌蒸留水で溶解し元の体積に戻 して使用する。

( 1 0 ) F F A破傷風ワ クチンの力価試験 ：

本発明の破傷風ワク チンの力価試験は、 厚生省告示第 217号 「生物学的製剤基準」 に規定の 「破傷風 ト キ ソイ ド」 又は 「沈降破傷風 トキソイ ド」 の条項に準拠し、 モルモ ッ ト又は マウスを用い、 免疫動物での LD50 (Median Lethal Dose) を 測定する毒素攻撃法、 又は免疫動物の血中抗毒素価測定法に よって行う。 更に、 本発明では、 これ等の試験法の上に、 毒 素攻撃法においてス コア法 （参考例 15) を採用 し全長毒素分 子 ト キ ソィ ドに対する相対力価を測定する。

( 1 1 ) F F A破傷風 ト キ ソィ ドの副作用に関する動物試 験 ：

本発明の破傷風ワ ク チンの副作用に関する動物試験は以下 の方法に従って行われ-た。 破傷風フラ グメ ン ト ' ト キソイ ド による副作用の指標と して、 例えば、 即時型ア レルギーに関 するラ ッ ト の受身皮瘠アナフ ィ ラ キシー （ P C A ) 反応 （参 考例 17) 、 また、 遅延型ア レルギーに関するマ ウ スの足摭反 応 （参考例 18) やモルモ ッ トの皮內反応 （参考例 19) 等が採 用でき る。 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明につき実施例および参考例をあげて具体的に 説明する。 但し、 本発明はこれ等の実施例及び参考例に限定 される ものではない。

まず、 本発明を具体的に実施するためのガイ ドライ ンを次 の参考例によって示す。

[参考例 1 ] 高度毒素産生能を有する破傷風菌株の単コ ロ ニー分離 ：

Ze i s s l e rの血液寒天培地 （市販の普通寒天培地に最終濃度 2% (W/V) グルコース及び 20 % (V/V) ゥシ脱線維素血液を それぞれ添加混合） の平板上に破傷風菌 Ha rva r d A47 株のコ ロ ニーを形成させた後、 各コ ロ ニーごと に Latham 変法培地 (参考例 3 ) で培養する。 次に、 各培養液について参考例 5 に記載の要領で L f を測定し、 L f が最高値のコ ロ ニーを選 定 * 分離し、 高度毒素産生能を有する破傷風菌 Ha r va r d A47 株ビケン亜株 （サブス ト レイ ン） を得る。 [参考例 2 ] 高度毒素断片産生能を有する形質転換体の作 成

破傷風毒素遺伝子 D N A [E BO JOURNAL, 5 ( 10 ) , 2495-25 02 , 1986； Nucleic Ac id Research 14 ( 19) , 7809-7812, 1986] から、 F F Aをコー ドする D N A断片、 即ち制限酵素を用い て得られた 2.7 kb 断片 （ n I -Bsp HI)を調製の後、 これ を大腸菌の多量発現ベク ター PSN508 (米国特許第 4， 703，0 05号） に挿入連係して発現ベク ターを構築し、 この発現べク ターを大腸菌 CSH26株に移入し形質転換体を作出する。 かか る形質転換体の培養によ る毒素断片の直接生産では、 後述す るプロテアーゼによ る毒素分子の消化、 尿素や D T Tによ る 処理等を要さない。

[参考例 3 ]

L a t h a m変法培地の組成 （ 1 β 中） ポ リ ペプ ト ン 2 0 g ゥシ心筋エキス 1 0 g グノレ コ 一 ス 8 . 0 g 塩化ナ ト リ ウム 2 . 5 g 硫酸マグネシウム （ 7水塩） 0 g シスチン 0 2 5 μ g ノヽ⁰ン トテン酸カルシウム 1 . 0 m g ゥラ シル 1 . 2 5 m g ニコチン酸 0 . 2 5 m g チア ミ ン - 0 . 2 5 m g リ ボフ ラ ビン 0 . 2 5 m g ピ リ ドキシン 0 . 2 5 m g ピオチン 2 . 5 μ g ビタ ミ ン B , ₂ 0 . 0 5 μ g 葉酸 1 0 0 g 三塩化鉄 （ 6水塩） 3 2 m g 硫酸鉄 （ 7水塩） 0 . 2 g

(7N NaOH で pH 7.0 に調製する） [参考例 4 ] M L D (Mi n imun Letha l Dose)

対数間隔で階段希釈した毒素液 0.1-0.5 ml を 0F1マ ウ ス (体重 20- 25 g ) の左大腿内側に皮下接種し、 毒素接種量と マウスの生残時間との相関に基づき測定する ["Proceedings 0 f the 6th Internat iona l し oni erence on Tet anus (Lyon, 1981) " ， pp.21-32] 。

[参考例 5 ] L〖 単位 (Limi t Floccu l at i on Uni t )

先ず 2倍階段希釈した破傷風抗毒素血清 （抗体） の一定量 に、 一定希釈の毒素 （抗原） 一定量を添加混合し Floccu lat i onを指標と して測定した最適比に基づき抗毒素 1 単位を決定 する。 次に、 抗毒素 1 単位と反応する毒素量 l L f を測定す る。 例えば、 複数の毒素液 に、 抗毒素 100単位/ ml の抗 毒素液を 0.1 ml 間隔で順次増量混合し、 抗毒素液 0.6 ml 混合のと こ ろで Floccu l at ionが初発の場合、 この被検体毒素 液は 60 L i /ml とする。 この約束に従い、 本発明では、 SR ID (Single Radia l Immunodi f f usion) によ リ L f を測定す る ( Immunochemi s t ry, 2， 235-254 , 1965 ) 。

[参考例 6 ] タンパクの定量

フ エ ノ ール試薬を用いる タ ンパク の呈色反応を比色法で測 定する 「 Low ryらによ る改良法」 によ り 定量する。 以下、 「 フ エ ノ ール試薬法」 と レ、 う。

[参考例 7 ] タ ンパク画分の検出とその濃度の比較

波長 280 nm の紫外線に对する吸光度 （以下、 「吸光度 2 80nmj と レ、 う） を測定する こ と によ り行 う。

[参考例 8 ] D T T ト リ ス緩衝液 （lOOmM の場合） の調製

50 mM t r i s ( h y d r 0 X y m e t h y I ) am 1 n om e t h a n e_Hし 1 (以下、 「 卜 リ ス」 と い う ) 、 lmM ethylenediaminetet raacetate—4N a (以下、 「EDTA」 と レヽ う） 、 及び lOOmM DTT力 らなる溶液 であ リ 、 1/10 M HC1で ρΗ 8· 2に調整する。

[参考例 9 ] リ ン酸緩衝液の調製

所望の濃度の リ ン酸一水素ナ ト リ ゥム溶液と 同濃度の リ ン 酸二水素カ リ ウム溶液と を混合し調製する。 その際、 所望の ΡΗ になる よ う混合量を調整する。

[参考例 10] SDS-PAGEによる分子量の測定

ゲル濃度が、 7.5% (W/V) , 7.0 % (W/V) (2Μ 尿素を含 有） 、 5.0 % (W/V) 等の SDS-PAGEが採用でき る。 緩衝液と し ては、 例えば、 10 mM ト リ ス — 77mM グ リ シン緩衝液 （ρΗ 8· 6 ) を用い、 泳動後 ゲノレは Coomass i e b r i l l i an t b lue で 染色する。 被検体タ ンパク の移動距離と 、 マーカー色素や分 子量が既知のタンパク の移動距離との間の比に基づき、 分子 量を求める。 これによれば、 F F A及び毒素分子の分子量 ( X 10⁴ ) は、 それぞれ、 約 1 0万及び約 1 5 万であった。

[参考例 11] ゲル内沈降反応によ る抗原特異性の判定

50 mM ト リ ス ー 0.6 Mグ リ シン緩衝液 （pH 8.5, 1 mM EDT Aを添加） での 1 % (W/V) ァガロ ー ス 、 及び非特異性抗体を 除去したゥマ抗破傷風毒素血清を用いるォク タ ロ ニ 一法によ り行う。 こ の方法にょ リ判定の結果、 F F A及び全長毒素分 子の 2者間で抗原性の交差が確認された。

[参考例 12] ア ミ ノ酸配列の決定

ア ミ ノ酸自動分析装置、 例えば、 App l i ed Biosys tern Proc i se 492 型 （米国、 Pe rk in Elmer 社製） を用いて行う。

その結果、 後述する実施例 1 で得られた F F Aの N末端のァ ミ ノ酸配列は （ 7 ) 式、 また、 実施例 7 で得た F F Aのそれ は （ 4 ) 式であった。 更に、 破傷風菌の培養条件を変える こ と にょ リ （ 8 ) 式に示す N末端のア ミ ノ 酸配列を有する F F Aが調製された。 なお、 （ 1 ) 〜 （ 3 ) 式及び （ 6 ) 式に示 す N末端のァ ミ ノ酸配列を有する F F Aは、 破傷風菌体内の 毒素分子を ト リ プシンで消化し ni cked f orm に変える際の 該酵素の濃度及び反応の時間と温度を調整する こ と によ リ得 る こ とができ る。 また、 （ 5 ) 式に示す F F Aは破傷風菌体 内の毒素分子をキモ ト リ プシンで消化し n icked f orm に変 える こ と によ り調製でき る。 このよ う に して、 N末端のア ミ ノ酸配列が図 2 に記載の （ 1 ) 〜 （ 8 ) 式に示す合計 8種の F F Aが得られ、 これ等の 8種の う ち、 少な く と も 1 種の F F Aを、 破傷風ワク チンの有効成分と して使用でき る。

[参考例 13] 等電点の測定

市販のゲル、 例えば、 商品名 Phas t Ge l I EP 3-9 [ス ゥヱ —デン国、 Pharmac i a Biotech社製] を用いて、 等電点電気 泳動 （ i s c e 1 e c t r 0 ί 0 c u s i n g ) によ り 測定する。 本発明に係る F F Aの等電点の範囲は、 7.25 ± 0.5と判断された。

[参考例 14] 全長破傷風毒素分子の調製

参考例 1 で得たシー ドと培地 （参考例 3 ) を用い 44 時間 培養 した菌体を遠心 （10、 000 g , 4 °C、 25分） によ リ集め、 その菌体に元の培養液の 1/30 容の 1M NaC 1 溶液 （0.1 M クェン酸ナ ト リ ウムを含有、 PH 7.5) を添加混合の後、 4 °C で 24 時間、 撹拌して毒素を抽出する。 次に、 遠心 （10、 00 0 g 、 4 °C、 30分） によ リ 除菌 して、 その上清を採取し、 こ れを出発材料と し、 実施例 1 の記載と 同様に して精製毒素を 調製する。

[参考例 15 ] スコア法

免疫動物を毒素で攻撃の後、 1週間にわた リ 生死及び症状 を観察 し、 その所見をスコア法に基づき次の通 り記録する ： 第 1 日 目死亡は 「ス コア 0」 ； 第 2 日 目死亡ほ 「ス コ ア 1 」 ；

第 3 日 目死亡は 「ス コ ア 2」 ；

第 4 一 7 日 目 に死亡又は重症 （緊張性痙攣 · 歩行困難 · 呼吸困難）

は 「ス コ ア 3」 ；

軽症生残 [注射側の反対側腹筋局所麻痺 （尾をもって 吊 リ ぁげ判定） ]

は 「ス コ ア 4 ] ； 及び

無症状で生残は 「ス コ ア 8 ] とする。

得られたス コ アにつき 、 統計解析用のソ フ ト を用いてコ ン ピューター解析し、 分散の一様性並びに直線性と平行性の検 定によ る相関分析を行い、 毒素分子 ト キソイ ドに対する相对 力価を測定する。

[参考例 16 ] モルモ ッ トの皮内反応 ：

モルモ ッ 卜の大腿部の筋肉内に破傷風 トキ ソィ ド （タ ンパ ク量を 10 / g /l. O ml に予め調整する） を 1.0 ml 注射し た後、 4 週間飼育し、 モルモ ッ ト を感作する。 次いで、 4 週 間後に感作モルモ ッ 卜 の背部を脱毛し、 同 じ破傷風 ト キソィ ド （タ ンパク量 32.0、 10.0、 及び 3.2 μ g / m 1の各濃度に 調整） を 0. lmlずつ皮內注射して攻擊し、 24時間後に注射局 所の皮膚反応、 発赤、 硬結及び壊死の有無を判定する。 なお、 発赤については直径を測定する。 実施例 1 -

( 1 ) 破傷風毒素 （nicked form) の産生と精製 ：

破傷風菌 Harvard株ビケン亜株シー ド （参考例 1 ) 5.0 m 1 を、 20本の各大型試験管 （直径 6 cm 、 高さ 38 cm) 中の

Latham 変法培地 （参考例 3 ) 450 ml にそれぞれ接種した 後、 綿栓を行い、 35 でで 5日 間培養する。 培養完了後、 各 培養物を遠心分離 （ 10， 000 X g 、 4 °C、 30分） し、 培養物中 の自 己融解菌とその残渣を沈降させ、 その上淸を採取した。 得られた培養上清 8. 5 £ を出発材料と して用いた。

出発材料に 25 °Cでの飽和硫安 （PH 7. 0) を添加混合 し 氷水槽中で塩折し、 硫安 20-40 %飽和の分画を採取した。 か かる硫安分画の沈殿物は、 40 %飽和硫安になる よ う調整 した

0. 06 リ ン酸緩衝液 （参考例 9 ； PH 7. 5、 4 °C) 65 ml に浮遊の後、 遠心分離 （15，000 X g ， 4 °C、 30分） し、 その 沈渣を該緩衝液 22 mlに再浮遊する こ と によ り 1回洗浄した。 洗浄済みの塩析沈殿物は、 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （PH 7. 5、

4。C) 22mlに溶解の後、 これを超遠心 （ 100, 000 X g 、 4 °C、 2 時間） によ り 沈渣を除去し、 その上清 20 mlを採取した。 次いで、 該上清を Acrodisc 膜 [濾孔径 0. 2 μ m 、 ドイ ツ 国、 Gelman 社製] で濾過し、 更に、 その濾液をア ミ コ ン濃 縮器で 3 ml に濃縮し、 これを粗精製毒素液と して次のゲル 濾過に供した。

粗精製毒素液は、 0. 1 リ ン酸緩衝液 （PH 7. 5) によ り 平衡化 した UUroge卜 AcA 34 [ス ゥ： —デン国、 LKB- Pharma cia社製] のカラム （内径 2. 5 cm 、 長さ 100 cm) を用いる 4 °Cでのゲル濾過にかけ、 該緩衝液にょ リ 、 流量 9 m 1 /時で 溶出 し、 溶出液を 1 mlずつ分取する こ と によ リ 分画した。 次 に、 各画分につき、 吸光度 280 nm (参考例 7 ) を測定し、 吸光度の高い画分をブール して合計 5 ml の溶出液を得た。 該溶出液につき、 フ エノ ール試薬法 （参考例 6 ) によるタ ンパク定量、 並びにタンパク 1 mg当た リ の M L D (参考例 4 ) と L f (参考例 5 ) の測定をそれぞれ行った。 その結果、 タ ンノ、。ク量 60 mg/ml 、 400 L i 、 及び 3. 5 X 10⁷ M L D であった。

更に、 この溶出液 0. 2 ^を、 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （PH 6. 8) で平衡化した TSK G3000 SW カ ラム [内径 0. 75cm, 長 さ 60cm、 S本国、 東ソー（株）社製] を用い、 該緩衝液にて流 量 0. 6 ml/分で溶出する高速液体ク ロマ ト グラ フ ィーにか けて分画し、 得られた各画分の吸光度 280 nm を測定した。 その結果、 シャープなピークがただ 1つ検出 され、 高度精製 の達成が確認された。 以上の結果に基づき、 この溶出液を精 製破傷風毒素 （nicked form) ないしは精製毒素液と して爾 後の F F Aの調製に使用 した。

( 2 ) F F Aの調製 ：

精製毒素液 2 ml に DTTト リ ス緩衝液 （参考例 8 ) 18 ml を添加混合し、 25°Cで 60分間、 反応させジスルフ ィ ド架橋を 還元した後、 更に、 れに最終濃度が 4M になるよ う尿素結 晶 4. 8 g を添加混合 して溶解する こ とによ リ尿素処理を行 つた。 次に、 該反応液に 20 mlの 50 mM ト リ ス液 （0. 6 M グ リ シン、 1 mM EDTA 、 及び 1 mM DTTを含有、 pH 8. 5) を 添加混合の後、 ア ミ コ ン澳縮器で濃縮 して 3 ml と し、 これ を 50 mM ト リ ス液 （0. 6 M グ リ シン、 1 mM EDTA , 1 mM DT T及び 2M 尿素を含有、 pH 8. 5) で平衡化した Ulい oge 1 AcA

44 (内径 1. 5 cm 、 長さ 90 cm) カラムを用いるゲル濾 過にかけ、 50 m ト リ ス液にて流量 5 m 1 /時で溶出し、 1. 2 mlずつ分取 · 分画した。 各画分の吸光度 280 nm の測定に よ り 、 2つのピークが検出された。 溶出開始後、 最初に出現 する ピーク 1から 5つの画分 （合計 6. 0 ml) と 、 これに続 く ピーク 2から 5つの画分 （合計 6. 0 ml ) をそれぞれ集め た。

精製毒素液並びにピーク 1 と 2の両画分について、 SDS - PA GEによ る分子量の概測 （参考例 8 ) 及びゲル內沈降反応 （参 考例 9 ) によ る抗原性の判定を行った。 その結果、 精製毒素 液、 ピーク 1 画分、 及びピーク 2画分のタ ンパク の分子量は それぞれ、 約 15 万、 約 10 万、 及び約 5万であった。 また、 抗原性に関し、 精製毒素液と 、 ピーク 1 及び 2 の各画分と の 間で交差が見られたが、 ピーク 1 と 2 の両分画の間には交差 がな く 互いに全く 異なる抗原特異性を示した。 更に、 ピーク 1 と 2 の両画分のタ ンパク定量をフエ ノール試薬法にょ リ行 つた。 ピーク 1 のタ ンパク量は 15 mg /m 1 、 また、 ピーク 2 は 8mg/m 1 であった。 以上の結果に基づき、 ピーク 1 の画分 が F F Aである と確認された。 この確認に基づき、 ピーク 1 画分を F F A液と して爾後の工程に供した。

( 3 ) F F Aの固定化 ：

F F A液 4 ml を取リ 、 1/15 Mリ ン酸緩衝液 （pH 7. 8) を外液と して 4でで 1 夜、 透析した。 透析完了後の液に該緩 衝液を添加混合し、 透析済み F F A液の容量が 380 ml にな る よ う調整の後、 これに 500 mM リ ジンを 20 mlを添加混合 し、 タ ンノ、。ク量 600 / g /nil の F F A液を得た。 これに最終 澳度が 0. 2% (V/V) になる よ う ホルマ リ ンを添加混合 し、 3 7 °Cで 14日 間、 保温し F F Aの固定化を行った。 次いで、 0. 85 % (W/V) NaC l溶液を外液と して 4でで 1 夜、 透析を行い、 残存ホルムアルデヒ ド及び リ ジンを除去 した後、 Ac rod i s c 膜 （濾孔径 0. 22 μ m ) で除菌濾過し、 濾液 380 ml を採 取した。 この濂液は、 4 °Cで保存し、 破傷風ワ ク チンの原液 と して爾後のワ クチン調製に供した。

( 4 ) F F A破傷風ワ ク チンの試作 ：

ワ ク チン原液を 0. 85% (W/V) NaCl溶液で希釈し、 最終タ ンパク量が 50 μ g /ml になる よ う調整の後、 これに 2mg/m 1 Al (OH) a ゲル浮遊液を等容量、 添加混合し、 4でで 1 夜、 静置し、 ト キソィ ドを A1 (0H) ₃ ゲルに吸着させ、 試作ワ クチ ンを得た。 該ワ クチンは、 その有効性 （力価 · 免疫原性） 及 P TJP97/00976

3 8

び安全性 （毒性 * 副作用） に関する各試験に供した。

( 5 ) 試作 F F A破傷風ワ ク チンの免疫原性 · 力価の判定 ： 試作ワ ク チンの免疫原性と力価を見るため、 マ ウ ス実験を 行った。 なお、 比較対照と して、 参考例 1 4 で調製 した破傷 風毒素の全分子有効成分とする ワ クチンを前記 （ 3 ) 及び

( 4 ) と 同様に調製して用いた。 各被検体ワ ク チン （抗原） は、 0. 85% (W/V)NaC! 溶液で 2. 5倍の階段希釈し、 少なく と も 3用量が用量反応曲線の直線領域に入る よ う調整 し、 こ れ等の希釈 した抗原を次の要領でマ ウスに接種し免疫 した。 即ち、 無作為配分した 1 群 10 匹の ddy/sマ ウ ス （体重 - 26 g 、 雌） の左後肢大腿内側に 5 ml ずつ皮下接種した。 該接種から 4週間目 に 100 LD₅。の試験用毒素 （Lot TA-4B 、 国立予防衛生研究所から分与） を各マ ウスに皮下接種し、 攻 撃を行った。 その後 1週間にわた り 、 マ ウスの症状及び生死 を観察した。 観察結果は、 ス コ ア法 （参考例 1 5 ) によ り記 録する と共に、 得られた数値につき統計解析用のコ ン ビユ ー ターソ フ ト を用いて分散及び相関分析した。 この結果に基づ き 、 全長破傷風毒素分子 ト キソイ ドを 1. 0とする相対力価 を算定した。 上記試験を合計 4回行った結果を表 1 に示す。 試作ワクチンの力価は、 全長毒素分子を用いる ワ クチン （従 来の破傷風 ト キソィ ド） と同等であった。

( 6 ) 試作 F F A破傷風ワ ク チ ンのモルモ ッ ト皮内反応に よ る副作用試験 ： 参考例 16に記載された方法にょ リ 、 無作為配分した 1 群 3 匹のモルモ ッ ト [std. Hart ley ( 日本国、 SLC (株）から購入） 、 体重 300- 350 g、 5 週令、 雌] を用い、 皮内反応を行った。 モルモ ッ ト の感作には、 試作ワ ク チン （ F F A) 、 市販の破 傷風 ト キソィ ド （市販） 、 及び前記 （ 5 ) の全長破傷風毒素 分子 ト キソイ ド （全長分子） を抗原と して用いた。 これ等の 3種の被検体は、 0. 85% (W/V) NaCl溶液で希釈し、 最終タ ンパク 量が 10 μ g /ml , 最終 Α1 (0Η)₃ 量が 0. 2mg/mlに なる よ う それぞれ調製の後、 モルモ ッ トに接種し感作した。 感作期間の終了後、 上記 3種の抗原を 0. 85% (W/V) NaCl溶 液で希釈し、 最終タ ンパク量 （ g ZO. 1 ml) が 3. 2、 1. 0 、 及び 0. 32 の 3段階になる よ う 調整の後。 モルモ ッ ト 皮内に 0. 1 m 1ずつ接種した。 なお、 対照と して、 0. 85 % (W/V) NaCl溶液を 0. 1 ml モルモ ッ ト皮内に接種 した。 そ の結果を表 2 に示す。 試作 F F A破傷風ワ ク チンの皮內反応 は検出不能か、 市販及び全長分子両ワ ク チンに比べ、 著しく 軽微であった。 実施例 2

( 1 ) F F A破傷風ワ ク チン原液の製造

破傷風菌 Harvard株ビケン亜株シー ド 0. 5 β を、 100 β 容のステ ン レス製タ ンク （直径 60 cm, 高さ 50 cm) 中の L a t h am 変法培地 80 β に注入 ' 接種した後、 シ リ コ ンシー ト を介して密閉 し、 35· °Cで 6曰 間培養した。 培養完了後、 培 養物をセライ ト ー濾紙で除菌濾過 し、 濾液 75 β を採取した。 該濾液をペ リ コ ン ' カセ ッ ト システム [米国、 Mi l l ipore 社 製] によ り 濃縮し、 7 β 濃縮濾液を得た。 これを出発材料と して用い、 実施例 1 に記載と 同様に して、 全長毒素分子の精 製、 F F Αの調製及び固定化を行い、 タ ンパク量 600 μ g /m 1 の F F A ワ ク チンの原液を 450 mlを製造した。

( 2 ) F F A破傷風ワ ク チン単味製剤の製造 ： 上記のヮ クチン原液を 1/75 M リ ン酸緩衝液 （PH 6. 5) で希釈し、 最終タ ンパク量が 60 g /ml になるよ う調整の後、 これに 最終濃度が蔗糖 3% (W/V) 、 L-アルギニ ン 1% (W/V) 、 及び へマセル [ ドイ ツ国、 へキス ト社製] 2 % (W/V) になるよ う 各々 、 この順序で添加混合した。 これを 1 ml 容のバイアル 瓶に 0. 6 mlずつ小分 · 分注して密栓を し、 単味ワ ク チン製 剤と した。 該製剤について、 厚生省告示第 217 号 「生物学的 製剤基準」 に規定の 「破傷風 ト キソィ ド」 の条項に準拠して 各種試験検定を行った結果、 ワ クチンと して適格である こ と が確認された。 実施例 3

F F A破傷風ワ ク チン沈降製剤の製造 ：

実施例 2 で得たワ ク チン原液を 1/40 M リ ン酸緩衝液 （PH 6. 0 ) . で希釈し、 最終タ ンパク量が 60 μ g /ml になる よ う調整の後、 これに リ-ン酸アルミ ニウムゲルを最終漠度が 0. 2 ml/mlになる添加混合し、 4 でで 5時間、 撹拌し、 トキ ソ ィ ドをゲルに吸着させた。 次いで、 遠心分離 （ 2, 000 rpm、

4 °C、 20 分） によ リ 、 ゲル層を回収した。 回収ゲルを 1/7

5 M リ ン酸緩衝液 （PH 6. 5) に懸濁し、 これに最終濃度が 蔗糖 3% (W/V) 、 L-アルギニ ン 1% (W/V) 、 及びへマセル

[ ドイ ツ国、 へキス ト社製] 2 % (W/V) になる よ う各々 、 こ の順序で添加混合した。 これを 1 ml 容のバイ アル瓶に 0.

6 ml ずつ小分 · 分注して密栓を し、 沈降ワ クチン製剤と し た。 該製剤について、 厚生省告示第 2Π 号 「生物学的製剤基 準」 に規定の 「沈降破傷風 ト キソイ ド」 の条項に準拠して各 種試験検定を行った結果、 ワ クチンと して適格である こ とが 確認された。 実施例 4

F F A破傷風ワクチンを用いる沈降 D P T混合製剤の製造 ： 最終タ ンパク量以外は実施例 3 の記載と 同様に して、 タ ン パク量が 180 ju g /ml の破傷風毒素フ ラ グメ ン ト ' 沈降ヮ クチン液を調製した。 また、 ジフテ リ ア ト キソイ ド及び百日 せき ワ クチンについて各々 、 3倍濃度の沈降ワ クチン液を調 製した。 これら 3種のワクチン液を混合の後、 10 ml 容のバ ィ アル瓶に 10 mlずつ小分 · 分注して密栓を し、 沈降 D P T 混合製剤と した。 該製剤について、 厚生省告示第 2Π 号 「生 物学的製剤基準」 に規定の 「沈降精製百日せき ジフテ リ ア破 傷風混合ワ ク チン」 の条項に準拠して各種試験検定を行った 結果、 混合ワ ク チンと して適格である こ と が確認された。 実施例 5

破傷風 F F Aワ ク チンを用いる沈降 D T混合製剤の製造 ： 最終タ ンパク量以外は実施例 3 の記載と 同様に して、 タ ン パク量が 120 μ g /m l の破傷風毒素フ ラ グメ ン ト · 沈降ヮ ク チン液を調製した。 また、 ジフテ リ ア ト キ ソイ ドについて、

2倍濃度の沈降ワ ク チン液を調製する。 これら 2種のワ クチ ン液を混合の後、 1 m l容のバイ アル瓶に 0. 6 m l ずつ小分 · 分注して密栓を し、 沈降 D P T混合製剤と した。 該製剤につ いて、 厚生省告示第 217号 「生物学的製剤基準」 に規定の

「沈降ジフテ リ ア破傷風混合 トキソィ ド」 の条項に準拠して 各種試験検定を行った結果、 混合ワ ク チンと して適格である こ と が確認された。 実施例 6

F F A破傷風ワ ク チン乾燥製剤の製造 ：

実施例 2 の記載と 同様に して、 ト キ ソ ィ ド液を調製し、 こ れを 1 ml 容のバイ アル瓶に 0. 6 m l ずつ小分 · 分注し、 凍結乾燥の後、 密栓を行い、 乾燥製剤とする。 該製剤につい て、 滅菌蒸留水で 0. 6 m l になる よ う溶解の後、 厚生省告 示第 2Π号 「生物学^製剤基準」 に規定の 「破傷風 ト キソィ ド」 の条項に準拠して各種試験検定を行った結果、 ワ クチン と して適格であるこ と が確認された。 実施例 7

F F A破傷風ワク チンの試作とその力価判定 ：

実施例 1 と 同様に して、 菌体外毒素から試作ワクチンを調 製する と共に、 該ワ ク チンの力価を判定した。 但し、 次の点 で実施例 1 と相違する。

シー ドの 35 °C培養の 日数を 6 日 に した。 また、 U 1 t r 0 g e 1 Ac A 3 カラムを用いるゲル濾過にょ リ得た精製破傷風毒素 (n i cked f o rm) からの F F A の調製を以下の通 リ行った。 上記の精製毒素タンパク 2mg にっき 、 D T T ト リ ス緩衝液

(参考例 8 ) を 1 ml 添加混合し、 25 °Cで 60間、 還元の後、 該反応液に尿素結晶を 4M になる よ う添加混合 した。 次に、 得られた溶液を緩衝液 A (2 尿素液、 0.2 niM Tr i s-HCし 】 mM DTT, p H 7.0) で平衡化した P D 10カ ラム [ス ウェー デン国、 Pha rmac i a B i o t ech 社製] にアプライ した後、 緩衝 液 Aで液出するこ と によ り 、 溶媒を D T T緩衝液から緩衝液 Aに置換した。 得られた溶出液を緩衝液 Aで平衡化した Mon 0 Q カ ラムにアプライ し、 緩衝液 B (緩衝液 Aに 0.5M NaC l を添加） を用いる 0- 0.5M NaCl の直接勾配にょ リ 、 FPLC ス ウ ェーデン国、 Pha rmac i a Bi o t ech 社製] を用いて溶出し P 6

44

た。 実施例 1 と 同様の方法で、 最初に溶出 される主ピークが F F Aである と確認された。 該精製 F F Aを、 0.025Mリ ジン 共存下の 0.2% (V/V)ホルマ リ ン加 0.067 Mリ ン酸緩衝液

(Na-K, p H 7.8) 中で 37 °C、 2週間、 保温する こ と によ リ 固定化した後、 F F A破傷風ワ ク チン と した。

実施例 1 (6)の記載と 同様にしてモルモ ッ ト皮内反応によ る副作用試験を 4回繰返し行った結果を表 3 に示す。 該試作 F F A破傷風ワ ク チンの力価は、 全長毒素分子を用いる ワ ク チン （従来の破傷風 ト キソイ ド） と同等であった。

被検体トキソイ ト 相対力価 is頼限界 (p = 0.95) 全長分子 1.0

F F A 0.970

全長分子 ： 全長破傷風分子トキソイ ド

F FA ： F FA破傷風ワクチン

表 2 皮內接種した 感作に用いた抗原 几原量 ^ g ) 巿 販 全長分子 F F A 市 販 3.2 +6 +6 +3

1.0 +6 + 5 + 2 0.32 +5 + 5 +1 全分子 3.2 +6 + 6 +1

1.0 +4 +5 +1 0.32 +4 +4 *0

F F A 3.2 +5 + 5 +1

1.0 + 3 + 3

0.32 +1 + 2 *0 対 照 0 *0 *0 *0

市 販 市販の破傷風トキソィ ド

全長分子 全長破傷風毒素分子トキソィ ド

F F A F F A破傷風ワクチン 発赤の直径 （mm) X短径 （mm) の大きさ (X, Y; X<Y) に基づく皮 內反応の程度 ：

0]のランキング（X ≤ [+] く Υ)：

0 ≤ [*0] < 1 ≤ [+1] < 20 ≤ [+2] < i0 ≤ [+3] < 60

60≤ [+4] < 80 ≤ [+5] く 100 ≤ [+6] 士ロ -VI· ΛΠ

极筷体 卜キノィ 卜 目スすノフ 頼限界（Ρ = 0.95) 全長分子 1.0

F F A 1.158

全長分子 ： 全長破傷風分子トキソイ ド

F F A ： F FA破傷風ワクチン

配列番号 ： 1

配列の長さ ： 1 3 1 5

配列の型 ： アミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： ペプチ ド

配列

Met Pro lie Thr lie Asn Asn Ph e Ar g Ty r Se r Asp Pro Val Asn

1 5 10 15

Asn As p Thr lie lie Met Met Glu Pro Pro T r Cys Lys Gly Leu

20 25 30

Asp lie Ty r T r Lys Ala Phe Lys lie Thr Asp Arg lie Trp lie

35 40 45

Val Pro Glu Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn

50 55 60

Pro Pro Ser Ser Leu l ie Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro

65 70 75

Asn Tyr Leu Ar Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gin Thr

80 85 90

Met Val Lys Leu Phe Asn Arg lie Lys Asn Asn Val Ala G 1 y Glu

95 100 105

Ala Leu Leu Asp Lys l ie lie Asn Ala lie Pro Tyr Leu Gly Asn

110 115 120

Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val

125 130 135

Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gin Asp Pro Ser Gly Ala Thr Thr Lys

140 145 150

Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu lie He Phe Gly Pro Gly Pro Val

155 160 165

Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly lie Val Leu Arg Val Asp Asn

170 175 180 Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser lie Met Gin

185 190 195 n I 9 v 81 I usv J m o j j o J j Θ [ i a [ j s s s naq [ g 31 \

OCt- S

sX-] j as Λ A I D ^{j 3}S O dsy I ΒΛ V V V ^asV o oi

丄 usv I ΒΛ 8 J V 1 ^USV «10 ]0 s 】A丄 n!3 J θς sX na d sy

SOt 96C

s i as "ID ³ 1 I usv n !0 dsy usy 31 I Jqi d y

06C 588 08S

d sy na-] a-] u s y o J j 9 [ j s 八 o J J d sy s i H u sy \sy{ 13ς aq j

SZS 022 S9£

丄 8 jy ^{J [}IJL ⁸1 I ^{U S}V s ^ s k\ n o 31 i

09S 9SS 09S

"ID J qi sqd O 91 j 1 as usy ns-] i u[0 s q

OK 9ES

dsv n |9 usy i ΒΛ » I I "丄 "10 ^ ID ^USV "V "Ί dsy aqj «19

J A丄 sAi u|3 uio 丄 an "10 ^JA丄 】as d sy a I I dsy 3 [ 1 usy

5 018 508

o J j dsy usy s 13 § jq丄 八 u | g J 35 naq s usy B | V 3 I I E [ V

OOS 96 062

sXi 』i (丄 dsv usy naq jq丄 sAi n 19 丄 nai d sy usy sX 3 [ I dsy

98Z m 9ZZ

3 i I ³1 I

aqj na] nio

OLZ S9Z 09Z

niO BIV a I I O J J iii j i S ! H U J Q J I 3 [ 1 no u|Q s

SSZ 09Z

J 3 S O J J 31 I 3 j I n |9 S ! H J ^ S ^{J 3} S 1 ^EA «19 ^IO na X o

0 22 OU

S ! H I ^ΒΛ ^s！ H ³1 I 1 n \ g s 1 ] aj^ n 3 -] naq na-] e 1 γ o 1 d ds

9Π O

UI9 3 ild J l S X I J3S s 31 [ Jqi na J3S θ ] I usy n|Q

0Π SOZ 00Z

a I 1 [ ΒΛ usv dsv aqd Jqi O J J ιΧχ n i 0 sX3 aqj E 1 y l^W

6

0/L6drilDd Z19S£ OAV 440 445 450

Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Se r Leu Thr Asp Leu Gly Gl y Glu

455 460 465 Leu Cys l ie L s l ie L s Asn Glu Asp Leu Thr Ph e l ie Ala G 1 u

470 475 480

Ly s Asn Ser Phe Se r Glu Glu Pro Phe Gin Asp Glu l ie Va 1 Ser

485 490 495

Tyr Asn Thr Ly s Asn Ly s Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp

500 505 510

Ly s l ie l ie Va 1 As p Tyr Asn Leu Gin Ser Ly s l ie Thr Leu P【o

515 520 525

Asn Asp Arg Thr Thr Pro Va I Thr Lys Gly l ie Pro Tyr Ala Pro

530 535 540

Glu Tyr Lys Ser Asn Ala A 1 a Ser Thr l ie Glu l ie His Asn l ie

545 550 555

Asp Asp Asn Thr l ie Tyr G 1 n Tyr Leu Tyr Ala Gin Lys Ser Pro

560 565 570 Thr Thr Leu Gin Arg 11 e Thr Met Thr Asn Ser Va 1 Asp Asp Ala

575 580 585

Leu l ie Asn Ser Thr Lys l ie Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Va 1 l ie

590 595 600

Ser Lys Va 1 Asn Gin Gly Ala Gin Gly l ie Leu Phe Leu Gin Trp

605 610 615

Va I Arg As l ie l ie Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gin Lys

620 625 630

Thr Thr l ie Asp Lys l ie Ser Asp Va 1 Ser Thr l ie Va 1 Pro Tyr

635 640 645 l ie Gly Pro Ala Leu Asn l ie Va 1 Lys Gin Gly Tyr Glu Gly Asn

650 655 660 Phe l ie Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gl Va 1 Va 1 Leu Leu Leu Glu

665 670 675 Tyr l ie Pro Glu l ie Thr Leu Pro Va 1 l ie Ala Ala Leu Ser l ie

680 685 690 L

r

> - «

<t>

-3

·■"»

-9 to

cr> o

>- a M t— ' to < oo ^ oo — — J >» >- en ■ "~

C -< 3 o

コ :

r- s:

>— i

t O s

> - >- - O

t—i *

— ' c => c C c ^ <= =» - D S to

.. ■ ~^ o c ' ~ -n ¾ > cr> O c: n -t C> n c

-H - — Ϊ

*-<

τ> ·-«

r- r- G

era

O

e— > - -3

cr

コ

>

> - <： = > <= => c > c C >

—3 «—3

t o " 一 、

cn cn

c— -3

=r

■ ， - ^<

> > -

-a

r- r—

^

c: a

t— » ·— *

— < — => > c => r-

sin οιει

dsv usy iqi 丄 ^IO O d^sV o J d I U

SOS! 00Π 56Π

I Al d J丄 dsy S 3 [ 9 nai 3【i sAi dsy sA^] na S !H u sy atfj

06ZI 98Π 08Π

丄 d J丄 usy J as ε { y 31 I nai a i I dsy 8iy usy 0 J J dsy u sy 19

5 Π 0 I 59Π

3Π "10 19 ^USV ^S !H ^Jm ^ 10 [ U ^η3Ί A 13 ^J3S ^elV usy sX

09ΖΪ 99ΖΪ 09ZI

dsy d sy χ na sX nai u 19 Jas 丄 丄 sX dsy g iy

SHI OHt 5δΠ

n s j ΒΛ ε IV ⁿ 19 1»W s sA "丄 0 J J 911 X 13 0 e |y

0821 m\ UZ\

u s v "丄 つ 八 2 J v ^η9Ί ⁹1 I 3 J V dsy na-] u s y u s v a q J B | γ u sy

91Π O I 0Π

I9 dsy sXi O J J 1X1 X 10 [ a I I ^S!H "19 usy usy usy 丄 』

ΟΟΠ 9611 0611

I ΒΛ J nai sX a 1 \ aqj dsy A 13 1^ Hi \ ΒΛ aqj J 9S dsy 31 \

9

L6WIL6dril d Z19S£/L6 OA\ 産業上の利用可能性 - 本発明によ り 、 従来の破傷風 ト キ ソイ ドに比べ、 副作用が 著し く 低く 、 しかも、 その免疫原性が従来のそれと実質的に 同等な、 破傷風ワ ク チン用の F F A (破傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原） を提供する こ と ができ る。

また、 該 F F Aをワ ク チンの有効成分と して用いる こ と に よ り 、 従来の破傷風 ト キ ソイ ドに比べ、 副作用が著し く 低く 、 しかも、 その免疫原性が従来の ト キ ソィ ドのそれと実質的に 同等の破傷風ワ ク チ ンを提供する こ と ができ る。

更に、 上記の破傷風ワ クチンは、 百 日せき ワ クチンゃジフ テ リ ア ト キ ソィ ド等と の混合ワ クチンと して も提供する こ と ができ る。

Claims

am 求 の 範 囲

1 . 全長破傷風毒素分子の全長ア ミ ノ酸配列の N末端側に存 在する ジスルフ ィ ド架橋に関与する 2つのシス ティ ン残基間 の部分ァ ミ ノ酸配列中の各ァ ミ ノ 酸を結合するべプチ ド結合 の中の少なく と も 1 つを開裂する と共に、 該ジスルフ ィ ド架 橘を開裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するア ミ ノ酸 残基間相互の非共有結合を開裂する こ と によって得られる少 な く と も 1種のフ ラ グメ ン ト と実質的に同一のフラ グメ ン ト ょ リ な リ 、 SDS-ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法にょ リ 測 定された分子量が 9万〜 1 1 万でぁ リ 、 等電点電気泳動法に よ リ 測定された等電点が 7.25 ± 0.5であって、 その免疫原性 が全長破傷風毒素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴とする破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原。

2 . 上記の少なく と も 1種のフラ グメ ン トが、 各々独立に、 下記のア ミ ノ 酸配列（ 1 )〜（ 8 )よ り なる群から選ばれるア ミ ノ 酸配列を N末端配列 と して有する こ と を特徴とする請求項 1 に記載の破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原。

(1) KI IPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(2) I IPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK

(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK

(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK

(5) NRTASLTDLGGELCIK

(6) TASLTDLGGELCIK

(7) SLTDLGGELCIK

(8) GGELCIK

3 . 固定化剤にょ リ 固定化された、 請求項 1 または 2 に記載 の破傷風毒素の機能的フ ラ グメ ン ト抗原。

4 . 請求項 1 から 3 のいずれかに記載の破傷風毒素の機能的 フ ラ グメ ン ト抗原を、 有効成分と して免疫を奏する量含有し てなる破傷風ワ ク チン。

5 . 請求項 1 から 3 のいずれかに記載の破傷風毒素の機能的 フ ラ グメ ン ト抗原を、 混合された複数の有効成分の一つと し て免疫を奏する量含有してなる混合ワ ク チン。

6 . 破傷風菌の培養液から菌体外毒素を精製採取の後、 該菌 体外毒素分子内の N末端側に存在するジスルフ ィ ド架橋を開 裂し、 更に、 該毒素分子ペプチ ドを構成するア ミ ノ 酸残基間 相互の非共有結合を開裂するこ と によ って得られる少なく と も 1種のフ ラ グメ ン ト と実質的に同一のフ ラ グメ ン ト ょ リ な リ 、 SDS-ポ リ アク リ ノレア ミ ドゲル電気泳動法によ り 測定され た分子量が 9 万〜 1 1 万でぁ リ 、 等電点電気泳動法によ り 測 定された等電点が 7.25 ± 0.5であって、 その免疫原性が全長 破傷風毒素分子の免疫原性と実質的に同等である こ と を特徴 とする破傷風毒素の ^"能的フ ラグメ ン ト抗原を固定化剤で固 定化する こ と を特徴とする破傷風ワ ク チンの製造方法。

7 . 請求項 1 または 2 に記載の破傷風毒素の機能的フラ グメ ン ト抗原をコー ドする D N Aをベク ターに挿入連係し、 該べ ク タ一を破傷風菌と は異なる別の宿主に移入し発現させる こ と を特徴とする上記のフ ラ グメ ン ト抗原の製造方法。