WO1997032982A1

WO1997032982A1 - Human adhesion molecule occludin

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Publication number: WO1997032982A1
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Inventors: Shoichiro Tsukita
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Description

弓月糸田ヒ卜接着分子ォクルディン

技術分野ヒト、ィヌおよびマウスのタイトジャンクション（tight junction, 以下「TJ」と記す）の膜タンパク質ォクルディンのァミノ酸配列およびそれをコードする DN Aに関する。背景技術：

多細胞動物において、隣接する細胞との接着の情報は、細胞の増殖、分化、炎症、癌転移などの生命現象の調節、維持に深く関係している。接着に関与している細胞問接着分子は細胞表面で集合して、接着のための特殊に分化した膜領域をつくることが多い。とくに、上皮細胞において、カドヘリンなどの細胞問接着分子は、その細胞質ドメィンで細胞骨格と強く結合していることが知られている。このような膜領域は、細胞間接着装置と呼ばれ、主として次の 4つに分類されてレヽ < 。 gap junction (GJ) 、 adherens junction (AJ) 、 desmosome およひ tight junction (TJ) である。

これら接着装置は、最初電子顕微鏡下で同定されたものであるが、構成タンパク質の解明研究により、その生理学的病理学的意義の重要性が大きな注目の的となっている。いわゆる接着分子と呼ばれるタンパク質がこれら接着装置中に特異的に存在し、 AJの接着分子は力ドヘリンであり現在まで N—力ドヘリン、 P—力ドヘリンなどいく種類ものカドヘリンが同定されている（Takeichi, M. et al. , Science, 251, 1451-1455, 1991) 。 desmosome の接着分子としてはデスモグレン、デスモコリンであり、最近の研究により、その構造がカドヘリンに類似していることが判明した (Buxton, R. S. et al. , J. Cell Biol. , 121, 481-484, 1993)。 GJの接着分子はコネキシンと呼ばれ、 4個所の細胞膜貫通部位を保有し、 N末端 C末端とも膜の細胞質側に出ていることがわかっている。 TJは、上皮細胞と内皮細胞に特有の細胞間接着装置で、そこでは隣り合う細胞の細胞膜が完全に密着してみえる。 TJは個々の細胞の周囲を取り卷いていて、細胞層をはさんだ管腔側と基底膜側との間の水溶性分子の透過を遮る、あるいは調節するバリアとして機能している。また、細胞膜を apical側と basolateral 側に仕切るフェンスとして働き、イオンチャンネル、ポンプなどの膜タンパク質や、脂質の細胞膜上での極性をもった分布を維持しているともいわれている（ Schneeberger, E. E. et al. , Am. J. Physiol. , 262,し 647 -し 661, 1992) 。これらの機能により、細胞層をはさんだ両側で異なる溶液組成からなる環境がつくられ、その細胞層の極性が保たれるのであり、 TJは多細胞生物においてきわめて基本的な重要な構造の 1つといえる。

しかしながら、 TJの分子構築の解析は他の接着装置に比べて遅れており、これまで TJの接着分子そのものが同定されていなかったために、 TJに関する分子生物学的研究を進めるうえで大きな障害となっていた。

本発明者はラット肝臓からの AJ分離法を確立し、この分離した AJからラディキシン、 Z0—1など多くのタンパク質を同定してきた（Tsukita, Sh. et al. , Curr. Opin. Cel l Biol.， 4， 834-839, 1992) 。 ZO— 1に関する研究および AJと TJの組織学的知見から、 AJ中のタンパク質は TJのタンパク質も含んでいることが予想された。そこで、ニヮトリ（chic) 肝臓より AJを分離し、この AJを抗原とするモノクロ一ナル抗体を作製し TJと特異的に反応する抗体を用いて、 TJ構成タンパク質の構造解析を行った。その結果、公知のタンパク質と類似しない新規構成タンパク質の構造解析に成功し、ォクルディンと命名した

(Furuse, M. et al. , J. Cell Biol. , 123, 1777-1788, 1993) 。

このニヮトリォクルディンは 504個のァミノ酸からなる 56KDaのタンパク質で、最大の特徴は N末端部半分に 4ケ所の膜貫通領域を有し、 N末端と C末端を細胞質に向け、細胞外に 2つのル一ブを持つタンパク質である。

その後の研究によりォクルディンが、細胞レベルおよび生体全体レベルにおいて TJ生理機能の解析に重要な因子であることが推察され、非常に大きな注目を集めた。

しかしながらニヮトリというヒ卜とかなりかけ離れた種の起源であることから、それ以上全く研究は進展せず、 TJの生理機構の解明および医学的解析のためにはヒト由来オタルディンの構造解析が待望された。この目的のためにこの分野において世界的な競争が行われていたにも拘わらず、未だヒトォクルディンの解明は成功していない。発明の開示上記現状に鑑み、本発明の目的は、ヒト、ィヌおよびマウスのォクルディンのァミノ酸配列およびそれをコ一ドする DNAを提供することにある。

Roy らはヒト neuronal apoptosis inhibi tory protein ( AIP^ の遣 1 子 ¾r報告したが、その中で NAIP遺伝子の欠失体において、ニヮトリオクルディンの C末端部と類似の塩基配列を保有する DNA断片が存在することを報告した（Roy, N. et al. , Cel l, 80, 167-178, 1995) 。そこで本発明者は、この配列が実際にォクルディンのヒト相同体の一部をコードしているか否かを決定するために、ニヮトリオクルディンとの類似塩基配列からプライマーを選択し、ヒト腸管上皮 T84細胞株の c DNAライブラリ一を PCRの铸型として鋭意スクリーニングした結果、ヒトォクルディンの全構造解析に成功した。さらにマウスおよびィヌのォクルディン解析も完成させ、抗ォクルディンモノクロナール抗体を作成し、組織染色により、 TJの膜貫通型タンパク質であることを確認した。発明を実施するための最良の形態：

本発明は、ヒト、ィヌおよびマウスのォクルディンアミノ酸配列、それをコ一ドする DNA、抗ォクルディン抗体およびそれらを利用する遺伝子解析法に関するものであって、

1)配列番号 1に記載のァミノ酸配列を有するヒトォクルディンをコードする DNA、

2)配列番号 4に記載のヒトォクルディンをコードする DNA、

3)配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するィヌォクルディンをコードする、配列番号 5に記載の DNA、

4)配列番号 3に記载のァミノ酸配列を有するマウスォクルディンをコードする、配列番号 6に記載の DNA、

5)配列番号し 2及び 3に記載のアミノ酸配列を有する、それぞれ順にヒト、ィヌ、マウスォクノレディン、

6)それぞれのォクルディンのァミノ酸配列のうち 1若しくは複数のァミノ酸が、付カロ、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有するォクルディン改変体、及びこれら改変体をコードする DNA、

7)ヒト、ィヌ、マウスォクルディンおよびそれらの改変体をコードする DNAいずれかを含有するべクタ一、

8)前記べクタ一を保持する形質転換体、

9)前記の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含む、それぞれのォクルディン蛋白質の製造方法、

10)配列番号 4、 5または 6に記載の塩基配列の全部または一部を含むものからなる DNAプローブ、

11)配列番号 4、 5または 6に記載の塩基配列の一部を含むものからなる DNAプライマ

12)ヒト、ィヌ又はマウスォクルディンタンパク質と特異的に結合するポリクロナ —ル抗体またはモノクロナール抗体、

13)抗ォクルディン抗体を用いることを特徴とする生体資料中のォクルディンの測定法方および測定試薬、

14)上記 DNAプライマ一又は DNAプローブを用いることを特徴とする生体試料中のォクルディン遣伝子の解析方法、

15)オタルディンを発現している細胞と被検物質を共存させた後、該細胞のォクルディン遗伝子の発現量を DNAプライマー又は DMAプロ一ブを用いて解析することを特徴とする、ォクルディンの発現に影響を与える薬物のスクリーニング方法、

16)ヒトォクルディン DNAから導かれるアンチセンス DNA、

17)ォクルディン DNAをノックァゥ卜した実験動物、に関する。発明の詳細な説明

本発明者が哺乳動物ォクルディン相同体の同定に成功したことにより、 TJの構成や機能を構造的に且つ機能的に分子レベルで試験することができる。種々のタイブの培養したヒト，ネズミおよびィヌ（MDCK) 細胞を使用して、ォクルディン遺伝子発現を調節するかまたはァンチセンスプローブ若しくは抗体でォクルディンの機能を阻害することによって、丁 Jのバリヤ一およびフェンス機能並びにこれに関与する調節メカニズムを実験的に分析することができる。例えば、ォクルデイン cDNAの過剰発現によって、フリーズフラクチャ一レプリカに見られる TJス卜ランド数が増加し、バリャ一機能が付随的に向上するかどうかを今や決定することができる。さらに本発明により、 TJの機能に影響を及ぼす薬物の簡便なスクリ —ユング TJの機能に影響を及ぼす薬物の'簡便なスクリーニング法の樹立を可能にした。例えば、ォクルディンを発現している種種の細胞を用い、検体と反応させた後、細胞のォクルディン遺伝子又はォクルディン蛋白質の発現量を測定することにより、 TJの機能に影響を及ぼす薬物をスクリーニングすることができる。遺伝子の解析は、 DNAプロ一ブ又はプライマーなどを用いて行うことができる。例えば、検体試料から常法により RNAまたは DNAを抽出し、必要に応じて前処理後、メンブレンまたはゲル上で電気泳動を行つた後、ラベルした纖プローブとハイプリダイズさせるのノザンブロット法又はサザンブロット法、ゲノム DNAや cDN'Aを铸型として、適切な位置に相当する約 20塩基程度のプライマーを用いて目的 DNAを増幅させる PCR法など公知の方法で行うことができる。ォクルディン蛋白質は、例えば抗体を用いて定量することができる。

また、種々のタイプの突然変異およびォクルディン遗伝子ノックァゥトマウスを作成することによって、 TJ形成が種々の器官の形態形成にどのように関与しているのか、そして TJの機能不全が炎症や腫瘍転移のような種々の病理学的状態に関係があるのかどうかを知ることが可能となる。 TJ機能、特にそのバリヤ一機能の調節の可能性も医薬品の透過性に関連して興味がある。かくして、脳上皮細胞中でのォクルディン合成の上方または下方調節によって血液—脳関門を調節することが可能であろう。腸からの医薬品吸収を調節するためには腸上皮細胞内での丁 J機能の調節が必要である。このように、 TJの機能を調節する薬物をすクリ一二ングして効果を有する物質を投与することにより、医薬品の吸収調節、特に脳内への移行を調節することが可能となる。このように本発明は、血液一脳関門を中心とする生理的機構の解明、病態の解析、診断、治療に大きく期待される。

本発明の D N Aは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、ォクルディンタンパク質の遣伝子解析や遣伝子の発現の解析に利用することができる。一部とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレォチドが本発明の DNA配列をもとに少なくとも 10個の対応する塩基配列を含むものからなり、好ましくは少なくとも 15個の塩基配列、さらに好ましくは約 20〜30個の塩基配列を含むものからなる対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブとしては、さらに高分子のもの、全 DNAも使用することができる。

オタルディンの機能を調節する手段の一つとして、アンチセンス DNA又はアンチセンス RNAを用いる方法がある。 DMA複製、転写、翻訳などの遺伝子発現の各段階において、遺伝子の情報が読みとられなくして発現の流れを遮断する方法であつて、この遮断に核酸あるいはそのアナログを用いる方法がアンチセンス法である (Wickstrome, E. , ea. , Prospects for Antisense Nucleic Aci d Theraphyof C ancer and AIDs. Wiley-Liss, New York, 1991) 。本発明のォクノレディン DNAを解明したことにより、アンチセンス法によりォクルディンの機能を抑制させる手段を可能とした。 DNAオリゴマーの長さは二重鎖形成能、膜透過性、塩基配列特異性が関係し、少なくとも 6個、好ましくは少なくとも 10 mer,通常 15から 30 merを用いることができる。配列は本発明 DNA配列に基づいて適宜選択し、実験確認することができる。通常、オリゴマーの安定性を増すために、リン酸基、糖部分、 3' , 5'末端に化学修飾を施させる (Cook, P. D. , Anticancer Drig Des. , 5， 585, 1991) 。代表的アナログはヌクレオシド問のホスホジエステル基の酸素原子の —つを硫黄原子に置換したオリゴホスホロサイォエー卜、メチル基に置換したォリゴメチルホスホネートであって、いずれもヌクレアーゼにた対してきわめて安定となる。その他ハイプリッドニ重鎮の安定性を増すためにァクリジンやボリリジンを結合させたオリゴマー、 Ν-メチルチミジレートを含むオリゴマーなどが用いられる。これらオリゴマ一は公知の化学合成法により合成することができる。また、本発明 DNAから導かれるアンチセンス RNAも利用できる。

本発明のォクルディンタンパク質の全部または一部（部分）をェピトープとして用い、抗体の作成、およびその抗体を用いる研究用、診断用試薬として利用することができる。ェピトープとは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも 6個のアミノ酸で構成され、 6個のアミノ酸で構成されるポリぺプチドが抗体と結合することは公知である（公表特許公報 60- 500684 号）。本タンパク質の抗原ペプチドは、本発明のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少なくとも 6個のアミノ酸、好ましくは連続してなる少なくとも 8個のアミノ酸、より好ましくは連続してなる少なくとも約 15個のァミノ酸、さらに好ましくは連続してなる少なくとも約 20個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。本発明のォクルディンはそのアミノ酸配列から、ニヮトリオクルディンと同様に N末端部半分に 4力所の膜貫通領域を有し、 N末端と C末端を細胞質に向け、細胞外に 2つのループを持つ蛋白質である。ヒトォクルディンの場合、アミノ酸 89~135位および 196〜243位部分が細胞外に位置すると予想されることから、抗原部位を目的に応じて選択することにより、各種の抗体を作成することができ、それらを使い分けることにより TJの機能解明手段、抗体による TJ機能抑制手段として利用することができる。また、部分ペプチドは、部分ペプチドと結合性を有する化合物のスクリーニング手段として利用することも可能である。

本発明のオタルディンのァミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ酸力；、付加、欠失若しくは置換されたァミノ酸配列を有するタンパク質も本発明に含まれる。

(1) cDNAライブラリーの作製およびォクルディンの構造解析

RNAの調製は、ヒトまたは動物の細胞（株）を原料として、例えばグァニジンチオシァネート、界面活性剤、キレート剤および還元剤の混合溶液にて抽出を行つた後、フエノール抽出、有機溶媒分画（Chamezynski et al. , Anal, Biochem. ,

162, 156, 1987) 、次いで密度勾配超遠心操作により行うことができる。得られた RNAを铸型として用い、ランダムプライマー、逆転写酵素、 DNA ポリメラ一ゼ等を用いる cDNA合成法（Gubler, U. et al. , Gene, 25, 263, 1983) などの常法により、 2本鎖 DNAを調製し、得られた 2本鎖 DNAを、常法に従い、パクテリオファージ、例えば； L zap 、 A gtl lなどに組み込み cDNAライブラリーを作製することができる。また市販の cDNAライブラリーを使用することも可能である。

次いで、 Roy らの報告の中で、ニヮトリオクルディン C末端部と類似した塩基配列をもとに適切にブライマー部位を選択し、常法の PCR法により DN'Aを増幅させ、サブクロ一ユングすることにより、ォクルディン DMA 由来と予想される DNA 断片を得ることができる。次いで、この断片をプローブとして cDNAライブラリーをスクリーニングし、単離したクローンの塩基配列を解析をすることによりォクルディン全長 cDNAを得ることができる。塩基配列の構造は、マキサム .ギルバー卜法 (Maxam, A. . and Gilbert, W. , Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 74, 560, 1977) あるいはジデォキシ法（Sanger, F. , Proc Natl. Acad.

Sci. USA, 74, 5463, 1977) によって決められる。その塩基配列をもとにァミノ酸配列が演繹される。これら遣伝子の操作は通常行われる公知の方法により実施すること力でき、 · ^えは 'Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , T. Manitis ら編集（1989) , Cold Spring Harbor Laboratoryに記載の方法に準じて行うことができる。

(2)抗体の調製

本発明のモノクローナル抗体の調製はヒト、ィヌまたはマウスのォクルディンを抗原とし、必要に応じてキャリア一蛋白との複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、ォクルディンに強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。

免疫抗原としては天然精製品、遺伝子組換手法あるいは化学合成手法による生産品などいずれも使用できる。遣伝子組換手法によるォクルディンの調製は、ォクルディンをコ一ドする c D N Aをォクルディンの発現に適したべクタ一のプロモター下流に制限酵素と D N Aリガ一ゼを用いる公知の方法により再結合して組換え発現べクタ一を作製することでできる。ベクターは宿主内で複製、増幅可能であれば特に限定されない。プロモータ一およびターミネータ一に関してもォクルディンをコ一ドする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特 ίこ限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可能である。このようにして得られた組換え発現べクタ一はコンビテント細胞法（J. ol. Biol. , 53, 154, 1970) 、リン酸カルシウム法（Sc ience, 221， 551, 1983 ) 、などにより宿主に導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌および動物細胞などが用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培養は通常 20°C〜45°C、 pH 5〜8の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。培養物からのオタルディンの分離、精製は公知の分離、精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、ァフィ二テイク口マトグラフィ一、逆相高速液体クロマトグラフィなどが挙げられる。

免疫抗原ォクルディンは全構造を保有していることが好ましいが、部分構造を有するフラグメントあるいはぺプチドであってもよく、オタルディンの全ァミノ酸配列から適宜選択することができる。フラグメントあるいはぺプチドの調製は化学合成法、上記遺伝子組換法あるいは天然物の分解の方法などが用いられる。抗原とキヤリァ蛋白の複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルポジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロブリン、へモシァニン等の常用されているものでよく、通常 1〜5倍量の割合でカツプリングさせる方法が用いられる。

免疫される動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全フロイントアジュバンドゃ不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイプリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。

細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケ一ラーとミルスタインの方法（ Nature, 256, 495, 1975) に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウィルスなどが挙げられるが、通常 20〜50^ο/ο程度の濃度のポリエチレングリコ一ル（平均分子量 1000〜4000) を用いて 20~40^:C、好ましくは 30〜37°Cの温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1 : 1〜10 : 1程度、約 1 ~ 10分問程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。

抗ォクルディン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たとえば、ォクルディンをコートしたマイクロプレートを用レヽる £ L I S A (Enzyme-l inked immunosorbent assay ) 法、饥 '免疫クロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いる E I A (Enzyme immunoassay) 法、ォクルディンを含むサンブルを電気泳動後二トロセルロース転写膜を用いるゥェスタンプ口ット法などがあげられる。

このようなゥエルから更に例えば限界希釈法によってクロ一ニングを行いク口ーンを得る。ハイプリドーマの選別、育'種は通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、 10〜20°/。牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、 RPMI 1640) で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめブリスタンを投与した BALB/Cマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモノクロ一ナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該ク口一ンを培赛し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクロ一ナル抗体の回収は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにァフィニテイク口マトグラフィなどの手段により容易に達成することができる。

本発明によって得られた抗ォクルディンモノクローナル抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中のォクルディンの定性、定量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行ないえる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいずれも使用できる。

本発明のモノクローナル抗体は Fc'あるいは Fc領域を除去した Fab'あるいは Fab 画分、あるいはその重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。実施例

以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1. ヒトォクルディンの構造解析

ヒト NAIP欠損遺伝子の一部に見られる、ニヮトリオクルディン C末端部と類似している塩基配列をもとに、配列番号 7および 8に記載のオリゴヌクレオチドをブライマ一として用い、 PCRを実施した。 A gtl l cD A ライブラリ一はヒト腸管上皮細胞下部 T84を原料として poly (A) +RNA を精製し、 TimeSaver cDNA synthesis kit

(商品名、フアルマシア LKBバイオテクノロジー社製）および GIGAPACK II Pack aging Extract (ストラテジーン社）を用いて作製した。このライブラリーを PC Rの踌型として上記二つのプライマーを用いて PCRを実施した結果、 363bp cDNA断片が得られた。

この DNA断片を DIG label ing kit (商品名、ベーリンガーマンハイム社製）を用いて DIGラベルした後、これをプローブとして同ライブラリーをスクリ一二ングした。その結果、 3個の cDNAクローンを単離し、これらのインサート部位を切り出し、 pBluescript SK (-) にサブクローニングした。このうち、 phO c6と ph O c l6 のクローンが全 ORFを含むと予想されたので、この二つのクローン両鎖の塩基配列を解析した結果、ヒトォクルディン全構造をコードする塩基配列であること確 ¾Sした。 ia¾配歹 IJは 7 - deaza Sequenase Version Deoxy Terminator Cycle Sequencing Ki t (商品名、アプライドバイオシステム社製）を用いて決定した。配列番号 4に塩基配列を、それから演繹されるァミノ酸配列を配列番号 1に示した。なお、ィヌおよびマウスのォクルデインの構造についても上記と同じ手法により、ィヌ腎細胞（MDCK)およびマウス肺細胞から作製した、それぞれ; L gtl lおよび A gt lO cDNA ライブラリ—を用いて決定した。ィヌォクルディンの塩基配列およびァミノ酸配列は配列番号 5および 2に、マウスォクルディンの塩基配列およびァミノ酸配列は配列番号 6および 3に示した。なお、ヒトォクルディン cDNAを含有する Esherichia Col i J¾I 109は 1996年 3月日、受託番号 FERM BP-5477として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ) に寄託された。

実施例 2. 抗ヒトォクルディンモノクローナル抗体の作製

実施例 1に記載の、配列番号 4を含む pBluescript SK (-) ベクターを、制限酵素 Ssp I と EcoR I (いずれも宝酒造）によって切断して、ヒ卜ォクルディンの C末端側細胞質領域をコードする cDNA断片を得た。これを pGEX-3Xベクターに導入し、このベクターで形質転換した大腸菌を培養し、 GST 融合タンパク質として調製した。この融合タンパク質を抗原としてラットに免疫し、モノクロナ一ル抗体を作製した。

免疫はラットの後足肉趾に 300 回を一度目は完全フロインドアジュバンドと混和して行い、さらに 2回（1度目の免疫から 3日後と 7日後）抗原のみを投与した。最終免疫の翌日、免疫動物から鼠蹊部リンパ節を取り出し細胞融合に用いた。

ラットのリンパ球とマウスミエ口一マ P3とを 2. 5： 1の割合で混和し、ケーラーらの方法を一部改変して、 lg のボリエチレングリコール（平均分子量 4000) を 1 mlの RPMI培地に溶解したものを用いて 2分間反応させることにより細胞融合を行つた。融合細胞を 24ゥエルプレートに植え込み、 10%の HCF (ポクスィ 'ブラウン社製）を含む ΗΛΤ培地で 9日間培養後 HT培地に移行し、更にフラスコで培養できるようになってから RPMIで培養した。増殖の見られたゥエルの培養上淸中の抗体価をヒト腸管上皮細胞株 T84に対するィムノブロットと蛍光抗体染色で検定し、適正なゥエルから限界希釈法により求めるハイプリドーマのクローニングを行った。マイクロタイタ一プレー卜に計算上 7個/ゥエルとなるようにハイブリドーマを植え込み、ィムノブロット法にてスクリーニングしクロ一ン株を確認し単離した ₃ 該ハイブリドーマの培養液より常法により抗体を精製した。

実施例 3. 細胞染色

ヒト腸管上皮細胞を 3%ホルマリン PBSで室温で 15分固定し、更に室温で 0. 2 % Triton X-100PBS中で 15分処理した。試料を 1 <½BSAでブロックした後に検体を加え、室温で 30分反応させた。洗浄後 FITC標識の抗ラッ卜免疫グロブリン抗体を加え室温で 30分反応させ、未反応の抗体を冼浄後蛍光顕微鏡で検鏡を行った。

TJ関連タンパク質 Z0—1に対するモノクロナ一ル抗体と本発明の抗ヒトォクルデインモノクロナ一ル抗体による二重免疫蛍光染色の結果を図に示した。 Z0— 1 (文献）と全く同一染色パターンが見られたことから、本発明のヒトタンパク質は、

TJの接着分子オタルディンのヒトにおけるホモログであることが証明された。実施例 4. 脳血管細胞におけるォクルディンの発現

脳血管内皮細胞は、末梢血管内皮細胞と異なり、高電気抵抗 T Jを有しており、高電気抵抗 TJは脳一血液関門を形成していると考えられていることから、高電気抵抗 TJを有する培養豚脳血管内皮細胞（PBEC) と低電気抵抗 TJを有する培養豚大動脈内皮細胞（PAEC) のォクルディンの分布、発現を検討した。

豚オタルディン cDNA断片は、ヒトォクルディン DMA配列（配列番号 4) の 1359- 1391位センス鎖（配列番号 7) および 1692- 1721位アンチセンス鎖（配列番号 8) を- プライマーとして PCR法により増幅し 363塩基断片を調製した。該断片の塩基配列を解析に基づく、そのコードするアミノ酸配列はヒト、マウス、ィヌォクルディンのァミノ酸配列と高い相同性を示し、豚ォクルディンの cDNAであることを確認した。 ^{3 2}Pラベルした該断片をプローブとして使用した。

培養細胞からの raRNAの調製は RNA分離キット（ストラタジーン社（Stratagene) 製）を使用し、ァガロースゲル電気泳動後ニトロセルロース膜に転写し、高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリダィズさせた。その結果、オタルディン niRNAは PBECにおいて訳 2. 4kbに強いバンドが認められたが、 PAECにおいては、同位置に非常に弱いバンドしか認められなかつた。

ついで哺乳類ォクルディンを特異的に認識するモノクローナル抗体として抗マウスォクルディン抗体を、及び TJ関連蛋白質 Z0— 1にたいする抗体を用いォクルデインの発現を比較した。

ラット抗マウスォクルディン抗体は、マウスォクルディンとグルタチオン一 S— トランスフユラーゼ融合蛋白質を抗原として作製し、該抗体の検出は FITC標識羊抗ラット IgG抗体を用いた。培赛細胞の破砕抽出物の同一蛋白質量を一次元ゲル電気泳動後、ィムノプロット法で検出したところ、 PBECにおいては約 58KDの位置に強く検出されたが、 PAECにおいては、それに比較してかなり弱く検出された ₃

—方、 Z0-1の発現は 2つの細胞で明らかな差は認めなかった。免疫染色ではィムノブロットと同様に PBECではォクルディンは高度に発現し、細胞間に連続性に ZO— 1と同一の局在を示した。一方、 PAECではまたォクルディンの検出は困難であり、 Z0—1は細胞問に不連続に局在した。これらの結果は PBECにおけるォクルディンの相対的に高度な発現は高電気抵抗 TJの形成に必要であることが示唆され、ォクルディンが TJ構成蛋白質であることを立証したものである。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 5 2 2

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

起源

生物名：ヒト（腸管上皮細胞株 T 8 4 )

配列の記述

Met Ser Ser Arg Pro Leu Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu

1 5 10 15

Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp l ie Tyr Gly Gly Glu

20 25 30

Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gin Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro

35 40 45

Glu Asp Glu l ie Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val

50 55 60

l ie Arg l ie Leu Ser Met Leu l ie l ie Val Met Cys l ie Ala l ie Phe 65 70 75 80

Ala Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Ser

85 90 95

Leu Leu Gly Gly Ser Val Gly Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Gl y Phe Gly

100 105 110

Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr

115 120 125

Gly Gly Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Met Leu Ala Met

130 135 140

Ala Ala Phe Cys Phe l ie Ala Ala Leu Val He Phe Val Thr Ser Val 145 150 155 160 lie Arg Ser Glu Met Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Ser Val l ie

165 170 175 l ie Val Ser Ala lie Leu Gly l ie Met Val Phe lie Ala Thr lie Val

180 185 190

Tyr lie Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gin Ser Ser Gly Ser Leu Tyr

195 200 205

Gly Ser Gin lie Tyr Ala Leu Cys Asn Gin Phe Tyr Thr Pro Ala Ala

210 215 220

Thr Gly Leu Tyr Val Asp Gin Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp 225 230 23b 240

Pro Gin Glu Ala l ie Ala l ie Val Leu Gly Phe Met l ie l i e Val Ala

245 250 255

Phe Ala Leu lie lie Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp

260 265 270

Arg Tyr Asp Lys Ser Asn lie Leu Trp Asp Lys Glu His l ie" Tyr Asp

275 280 285

Glu Gin Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly

290 295 300

Thr Gin Asp Val Pro Ser Pro Pro Ser Asp Tyr Val Glu Arg Val Asp 305 310 315 320

Ser Pro Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Asp Lys Arg Phe

325 330 335

Tyr Pro Glu Ser Ser Tyr Lys Ser Thr Pro Val Pro Glu Val Val Gin

340 345 350

Glu Leu Pro Leu Thr Ser Pro Val Asp Asp Phe Arg Gin Pro Arg Tyr

355 360 365

Ser Ser Gly Gl y Asn Phe Gl u Thr Pro Ser lys Arg Ala Pro Ala Lys 370 375 380 Gly Arg Ala Gly Arg Ser Lys Arg Thr Glu Gin Asp His Tyr Glu Thr 385 390 395 400

Asp Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Asp Glu Leu Glu Glu Asp Trp

405 410 415 lie Arg Glu Tyr Pro Pro l ie Thr Ser Asp Gin Gin Arg Gin Leu Tyr

420 425 430

Lys Arg Asn Phe Asp Thr Gly Leu Gin Glu Tyr Lys Ser Leu Gin Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Glu lie Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu

450 455 460

Asp Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu 465 470 475 480

Tyr Asn Arg Leu Lys Gin Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser Lys

485 490 495

Lys Asn His Cys Lys Gin Leu Lys Ser Lys Leu Ser His lie Lys Lys

500 505 510

Met Val Gly Asp Tyr Asp Arg Gin Lys Thr

515 520 配列番号： 2

配列の長さ： 5 2 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

起源

生物名：ィヌ（腎細胞 M D C K)

配列の記述

Met Ser Ser Arg Pro Phe Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu 1 5 10 15 Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp Val Tyr Gly Gly Asp

20 25 30

Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gin Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro

35 40 45

Glu Asp Glu l ie Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val

50 55 60

lie Arg l ie Leu Ser Met Leu Val l ie Val Met Cys l ie Ala lie Phe 65 70 75 80

Gly Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Gly

85 90 95

Leu Met Gly Gly Ser l ie Gly Tyr Pro Tyr Gly Ser Gly Phe Gly Ser

100 105 110

Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Tyr Gly Phe Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly

115 120 125

Gly Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Leu Leu Ala Met Val

130 135 140

Ala Phe Cys Phe He Ala Ala Leu Val l ie Phe Val Thr Ser Val l ie 145 150 155 160

Arg Ser Asp lie Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Thr Val He l ie

165 170 175

180 185 190 lie Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gin Ala Ser Gl y Ser Leu Tyr Ser

195 200 205

Ser Gin l ie Tyr Ala Met Cys Asn Gin Phe Tyr Ala Ser Thr Ala Thr

210 215 220

Gly Leu Tyr Met Asp Gin Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp Pro 225 230 235 240

Gin Glu Ala lie Ala l ie Val Leu Gly Phe Met Val l ie Val Ala Phe

245 250 255 Ala Leu l ie lie Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp Arg

260 265 270

Tyr Asp Lys Ser Asn lie Leu Trp Asp Lys Glu His l ie Tyr Asp Glu

275 280 285

Gin Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly Thr

290 295 300

Gin Asp Met Pro Pro Pro Pro Ser Asp Tyr Val Glu Arg Val Asp Ser 305 310 315 325

Pro Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Asp Lys Arg Leu Tyr

325 330 335

Pro Glu Ser Ser Tyr Lys Ser Thr Pro Val Pro Glu Val Val Gin Glu

340 345 350 leu Pro Ala Thr Ser Pro Ala Asp Asp Phe Arg Gin Pro Arg Tyr Ser

355 360 365

Ser Ser Gly His Leu Glu Pro Pro Ser Lys Arg Ala Pro Ser Lys Gly

370 375 380

Arg Thr Gly Arg Pro Lys Arg Leu Glu Gin Asp Hi s Tyr Glu Thr Asp 385 390 395 400

Tyr Thr Thr Gl y Gly Glu Ser Cys Asp Glu Leu Glu Glu Asp Trp l ie

405 410 415

Arg Glu Tyr Pro Pro l ie Thr Ser Asp Gin Gin Arg Gin Leu Tyr Lys

420 425 430

Arg Asn Phe Asp Thr Gly Leu Gin Glu Tyr Lys Ser leu Gin Ala Glu

435 440 445

Leu Asp Glu lie Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu Asp

450 455 460

Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Gl u Tyr 465 470 475 480

Asn Arg eu Lys Gin Val Lys Gly Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Lys Arg 485 490 495

Asn Tyr Cys Lys Gin Leu Lys Ser Lys Leu Ser His l ie Lys Lys Met

500 505 510

Val Gly Asp Tyr Asp Arg Gin Lys Thr

515 520 配列番号： 3

配列の長さ： 5 2 1

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

起源

生物名：マウス（肺細胞）

配列の記述

Met Ser Val Arg Pro Phe Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu

1 5 10 15

Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp Met Tyr Gly Gly Glu

20 25 30

Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gin Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro

35 40 45

Glu Asp Glu l ie Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val

50 55 60

l ie Arg l ie Leu Ser Met Leu He l ie Val Met Cys l ie Ala He Phe 65 70 75 80

Ala Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Gly

85 90 95

Leu Phe Gly Gly Ser Leu Asn Tyr Pro Tyr Ser Gly Phe Gly Tyr Gly

100 105 110

Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gl y Gly 1 15 120 125

Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Leu Leu Ala Met Ala Ala

130 135 140

Phe Cys Phe He Ala Ser Leu Val lie Phe Val Thr Ser Val He Arg 145 150 155 160

Ser Gly Met Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu lie Val lie lie Val

165 170 175

Ser Ala l ie Leu Gly lie Met Val Phe lie Ala Thr l ie Val Tyr lie

180 185 190

Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gin Ala Ser Gly Ser Met Tyr Gly Ser

195 200 205

Gin l ie Tyr Met lie Cys Asn Gin Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Thr Gly

210 215 220

Leu Tyr Val Asp Gin Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp Pro Gin 225 230 235 240

Glu Ala He Ala lie Val Leu Gly Phe Met l ie l ie Val Ala Phe Ala

245 250 255

Leu l ie l ie Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp Arg Tyr

260 265 270

Asp Lys Ser Asn lie Leu Trp Asp Lys Glu His lie Tyr Asp Glu Gin

275 280 285

Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly Thr Gin

290 295 300

Asp Met Pro Pro Pro Pro Ser Asp Tyr Ala Glu Arg Val Asp Ser Pro 305 310 315 320

Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Gly Lys Arg Ser Tyr Pro

325 330 335

Glu Ser Phe Tyr Lys Ser Thr Pro Leu Val Pro Glu Val Ala Gin Glu

340 345 350 l ie Pro Leu Thr Leu Ser Val Asp Asp Phe Arg Gin Pro Arg Tyr Ser

355 360 365

Ser Asn Gly Asn Leu Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ala Pro Thr Lys Gly

370 375 380

Lys Ala Gly Lys Gly Lys Arg Thr Asp Pro Asp His Tyr Glu Thr Asp 385 390 395 400

Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Glu Glu Leu Glu Glu Asp Trp Val

405 410 415

Arg Glu Tyr Pro Pro l ie Thr Ser Asp Gin Gin Arg Gin Leu Tyr Lys

420 425 430

Arg Asn Phe Asp Ala Gly Leu Gin Glu Tyr Lys Ser Leu Gin Ala Glu

435 440 445

Leu Asp Asp Val Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu Asp

450 455 460

Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu Tyr 465 470 475 480

Asn Arg leu Lys Gin Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser し ys Arg

485 490 495

Asn Tyr Cys Lys Gin Leu Lys Ser Lys Leu Ser Hi s l ie Lys Arg Met

500 505 510

Val Gly Asp Tyr Asp Arg Arg Lys Pro

515 520 配列番号： 4

配列の長さ： 2 3 7 9

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A 08C I OiDVVOVOVl 3V9V3V0V0X VIOVOIVOVV O0V0V3VV0V DVWOIOOW 90VDDV0VV0 0Z£\ 00WV001OD VDOVOVWW 31133V0V0V 0I113VV100 109D0V30V3 V11031D0DV 0921 309V311DV0 1VDD101330 3丄丄 OVV丄丄 V D1130V00V3 UD91DVV0J, ODliOOOOOO 0021 V331WV1VX D011D10VOV )丄 VLL丄丄 93 30WDV01VV 010WV3001 VV03丄丄 3丄 V 0U 1V3091VDOD 10V3V0110V OVWOOIOIV 1DV0101VOD 333V3110DD IOOVOOVDVO 0801 V300VD0131 0101VVWV1 100010V0DV 00101VV330 33D9V30V01 V01V111VDV 020Ϊ 3VV00WOVO 3丄 OLLLLV丄 VV3310VV3V 01V100V3VD OIVOVWOW 3 丄:) W OL 096 OlDOlllDil 丄丄 VV丄 VV丄丄丄 3D1I11D091 01XV1IV91V D1100001DV 1011V03011 006 V0300VOOV3 3331V00101 lOXOiOVlDV 01V10111VI OV31V0010D V1310V001O 0^8 V130V301D0 V V丄 V丄丄丄丄 V VDDVV00131 0030IV1V1V W3V0110D1 VIV1D1D1VD 081 01311D10VD 1D013W3DD VVOlOVOODi WiVlVlDlO 1IW0V3D01 IV丄丄丄 3丄 3丄 02 VD1V390913 31V13010VD IDV1W1V01 010VVI13VX DVIVOWOW 0W0V33101 099 WVOiOiVOV V丄 V丄丄。丄 OV V丄丄 3丄丄丄：)丄 V3丄 39丄丄 3 。 D3011VOI11 0L11UD01D 009 001V000011 9丄 V 丄丄: )333 VW30VD0V0 VVD3DV0V0V IViOOOVOOD V130D1V130 0 01V11001VI 3001V10001 V130019VV9 03VIOOV100 IiiOOOlOW 00V001V113 08 03V1300V10 lOVXOOVOOV 1111030113 VV001V13D9 V0V3V0001D 3011090V3D 1330910101 OODlUDi O DOXiVOOlOi V01911V11V 0ID01V13X0 ICO丄 V3£0丄丄 09S Vi)丄 X301313DV0 01WV3V13X 10V31I3IXV WOIVOVVOV D03V111113 00ε 13V1030VD3 OV010X3I30 丄 OOVi D丄丄 01V001V9V9 VOOIOOIVIV XVDV01W09 O VVCOVO。丄 V丄 JLV3丄 VViO V VV311VV01V 013300VDV1 iODlDOVODl 0WV911313 08 ΐ 300V3D1V31 OIVDDOVDIV V0VD11VD3V 0130V0XV0V V01031V01D 011V0900W 021 V100W0911 01V11X00XX V0V30V39OV 00VX010000 0VOOV9D30O 0V0VD3100V 9 D00V9V0D0V V90VD0D300 V00D001313 31100X33D1 3001D133VD D1030D3D13

¾ai ss ε ε z ΐ - ■ 8 9 τ ·■

3 Ρ ϊ 1 d 3 d 1 B UI：峯^^ ¾ ( 8丄¾¾(晦丁袅都） 4 ： ¾？^^ 難 Ζ86Ζ€/ 6 ΟΛΥ GCGGCGAGTC CTGTGATGAG CTGGAGGAGG ACTGGATCAG GGAATATCCA CCTATCACTT 1440 CAGATCAACA AAGACAACTG TACAAGAGGA ATTTTGACAC TGGCCTACAG GAATACAAGA 1500 GCTTACAATC AGAACTTGAT GAGATCAATA AAGAACTCTC CCGTTTGGAT AAAGAATTGG 1560 ATGACTATAG AGAAGAAAGT GAAGAGTACA TGGCTGCTGC TGATGAATAC AATAGACTGA 1620 AGCAAGTGAA GGGATCTGCA GATTACAAAA GTAAGAAGAA TCATTGCAAG CAGTTAAAGA 1680 GCAAATTGTC ACACATCAAG AAGATGGTTG GAGACTATGA TAGACAGAAA ACATAGAAGG 1740 CTGATGCCAA GTTGTTTGAG AAATTAAGTA TCTGACATCT CTGCAATCTT CTCAGAAGGC 1800 AAATGACTTT GGACCATAAC CCCGGAAGCC AAACCTCTGT GAGCATCACA AAGTTTTGGT 1860 TGCTTTAACA TCATCAGTAT TGAAGCATTT TATAAATCGC TTTTGATAAT CAACTGGGCT 1920 GAACACTCCA ATTAAGGATT TTATGCTTTA AACATTGGTT CTTGTATTAA GAATGAAATA 1980 CTGTTTGAGG TTTTTAAGCC TTAAAGGAAG GTTCTGGTGT GAACTAAACT TTCACACCCC 2040 AGACGATGTC TTCATACCTA CATGTATTTG TTTGCATAGG TGATCTCATT TAATCCTCTC 2100 AACCACCTTT CAGATAACTG TTATTTATAA TCACTTTTTT CCACATAAGG AAACTGGGTT 2160 CCTGCAATGA AGTCTCTGAA GTGAAACTGC TTGTTTCCTA GCACACACTT TTGGTTAAGT 2220 CTGTTTTATG ACTTCATTAA TAATAAATTC CCTGGCCTTT CATATTTTAC CTACTATATA 2280 TGTGATGATC TACCAGCCTC CCTATTTTTT TTCTGTTATA TAAATGGTTA AAAGAGGTTT 2340 TTCTTAAATA ATAAAGATCA TGTAAAAGTA AAAAAAAAA 2379 配列番号： 5

配列の長さ： 1 9 6 1

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：ィヌ（腎細胞株 MD C K)

配列の特徴

特徴を表す記号： m a t p e p t i d e

存在位置： 7 2 . . 1 6 2 4 0891 3V0111V19V VOIOIIVOVO V0111DV3V3 V3301VOV30 OVVOVIVDW VV0V3V0V1V 0Ζ9Ϊ OiVXOVOVOO 11001V9VV0 VVOIVOVODO 19UWV30V 0VVD110V39 VV0011V11V 099Ϊ VOOVOWIVV WV3V11V0V DD131V000V V119WD0VV OLOVOV丄 W V10V01V013

0091 0ID01OO01V DVlOVOVVOi OVVVOVVOVO VIVIDVOIVO OiiVVOVWi

0^1 IDIDWOVVV 1VV31VDV01 V9110VV0V3 9VV3V1100V 0VV3V1VV0O V301339013 08ε ΐ V3V01111VV V V0VV0V13 IDVVOVOVW OVV:)丄 V3V0丄丄: 3V 丄 V丄 OOV 33XV1VV000 02εΐ V31V9010V0 0V00V9010D V0DV010103 10V9000300 03V00V0V13 VOVOVOVOIV

092 Ϊ IOVODVOOVO 0V90I3D0VO VV3D300VV0 003VVOWOO WV0310033 D00DV0W03 0021 1I33V3D0VO 011DVOOOOD 0V30VD0V0V X00310DDVD OOVD110VD1 V3 Oi)丄

OH I 130V00D303 91O0V00VO0 IDD10VV0D3 30I9033V0V V01WV1V13 DilDlDVOVD 0801 01V101I003 0VV3V01VV0 IOWVIOOIV V3D1I013V1 D3001V03D1 0V3V001OVO 0201 VOVDD101V1 0V01D110D3 3313313301 V3V0W3V3V 3D0V001311 i V VV丄丄 096 09DI0VOW9 X10XVV0030 D3VV0VV01V OXVillVlVD WOOVVOVOO OlOiiVlViV 006 VOD10W3VD 1V19003V00 IVOVWOVVO 310VWVD10 丄:) 3丄丄丄 3丄丄丄 1W1W1X10 0 8 0丄丄丄丄3£) 丄 ί) llVOlOOiVO iiVOOOlOOI OllVODOliV V300V0VV33 3 丄 VOOL£>i)丄 81 OiOIOVlOVD 1V10111V10 V31V991V3V 1O10V00D3V 1D9V0V1D1V 001V13110V 02 i 03W39101V D001V1V1V9 V0V3110V3V IVlliaiODD I011000VD3 0010VV301V 99 V310V0001V VIVIVIOIDI 1W3V130I1 V31101V01V 110301DV01 09 DViVVlVViO 10V0110V13 V10DW9V0D W0VD31VIV 3V013X09W IVilDDOVOO ^9 VllOXliVIV 010011V39X 0031V11119 llilOOOOlO 01V00001D3 103110090V 8 WOOVOOVOV 0DD1V000V3 V1399399DV 13000V1009 3V10001I10 D00V130D3V 13D910V909 OVIDOVDDOD X100019VV0 COVUXOV丄 300V1V30V1 0010001VV1 9ε 1D9D13VV90 1V13D0V0V1 VOOOiOOODi 00DVDD103O 010I0100D1 11V1VD0001 OS VDOXOiVOlD 11V31011D0 1VDD101D11 V90D11W10 V09VD01331 3130V001W^2 VDViDlXOVD IiOiiVWOi V0W0VD30V 1311131IVJ, 0000D3DV31 丄：)丄:) 3丄 V81 3V03D103V3 01V3V09001 900V19I91V 01W00V900 VOOlVllVOi VVCO VW 丄2 ΐ 1VV01V01D3 V3V丄 V丄 £0っ丄 03V0010VOV OillXODOOV 031VD101VD つ 3V 丄 V3VaL9 1V31V010D9 01V0VV01D3 ΙΟΟί ΟίΟΟί VD091D1D0V DD001111V1 1D09110DVD

¾3 00/i,6df/X3t[ Z86 /" OAV ATATCTGCAA CGTTGTCAGA AGGCAGAATG ACTTTGGATT TCGAACCCAG GAGGCCAGAT 1740 CTTTGTGATC ATTACAAAGT TTTGGTAGCT TTAATATCAT CAGTATTGAA GCATTTTACA 1800 CATAGCTTTT GATAATCAAC TGGGCTGAAC ACTCCCGATT AAGGATTCTG TGCTTTAGAC 1860 TTTGGCTGTT GTGCTAAAGG ACTGAGTATA GGTGGAGGTT TTCAGACCTT GGAAGAAGGT 1920 CCCACGGTGA ACTTGTGCTG TGAACTTGCA CACTTGGGGC A 1961 配列番号： 6

配列の長さ： 2 8 3 9

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：マウス（肺細胞）

配列の特徴

特徴を表す： m a t p e p t i d e

存在位置： 2 2 3 . . 1 7 8 5

配列の記述

GGAGTTTCAG GTGAATGGGT CACCGAGGGA GGAGGCTGGC CACGCCACAC CTCGTCGCTA 60 GTGCCCACCT CCCGGCCCCT CTTTCCTTAG GCGACAGCGG TGGAGTTGCG GGAGAGCGGT 120 CCAGCGCACG GAGCAACCGG CTAGGGGCTC GGCAGGTTCG CTTATCTTGG GAGCCTGGAC 180 ATTTTGCTCA TCATAAAGAT TAGGTGACCA GTGACATCAG CCATGTCCGT GAGGCCTTTT 240 GAAAGTCCAC CTCCTTACAG ACCTGATGAA TTCAAACCCA ATCATTATGC ACCAAGCAAT 300 GACATGTATG GCGGAGAGAT GCATGTCCGG CCGATGCTCT CTCAGCCAGC GTACTCTTTT 360 TATCCGGAAG ATGAAATTCT TCACTTCTAC AAATGGACGT CGCCCCCAGG GGTGATCCGG 420 ATCCTGTCTA TGCTCATTAT TGTGATGTGC ATCGCCATAT TTGCCTGTGT GGCTTCCACA 480 CTTGCTTGGG ACAGAGGCTA TGGGACAGGG CTCTTTGGAG GAAGCCTAAA CTACCCTTAT 540 AGTGGCTTTG GCTACGGAGG TGGCTATGGA GGCGGCTATG GAGGCTATGG CTATGGCTAT 600 GGCGGATATA CAGACCCAAG AGCAGCCAAA GGCTTCCTGT TGGCCATGGC AGCCTTCTGC 660 LZ mz iiovooovvi ooiovwoio VWOOXOUD νοιοοοοιοα imovoivo IVIOODOVOO

Om 10D103VV1I 9V0DVD0100 IDOIOVOIOX D31D0V3VDV DlOWOliOO 00X300V3DV 08 OVlOiODOVl 1DVV0VX30V 013001D330 V10IO1D13X 110D0V3V0V 0 丄丄丄丄 03丄丄 OZZZ IliOilOOVD 丄 W9V丄丄丄 V丄 1013V0100V 313300VOOV 0011131VV3 1W101033V 09 I Z 0V100VD313 311010D0V3 00V0D03V3V OIIODVVOIO 1V01D100V0 1010IDIV01 0012 0130V91010 D1D3100VVV 0W3101VVV IIIIOOVOII 3丄丄 3丄 VVW 丄丄 VV VVUV 0 OZ 丄 3丄丄っ丄丄 V3丄丄 V VVつ丄丄丄 3 V3V1111V0D VV11VV0D13 VDWOIDODO 13V011W1V 0861 011113001V W1V1111VD OW011V10V 031D1V1331 110V3IV33I 丄丄丄 33丄 0261 VDDliiOWV V丄丄 V 丄 VOL 01110VWV1 丄 O DOOLO丄 W10丄:) J.13V013VW 0981 OOOVOVDDID iOllVVOOlD 13101V93VD OlODDLO 0I00V0V009 VVOVaOOOOl 008 ΐ 10V3301V0V 0V0V1ID0W V003V0VDV0 1VI3V0V0DD IOOIVOOVOV V 丄 V VO 丄 O^Ll V1IVW00V0 WOIIOVOOV VD013VI1W OOVOVVIOVV WIVIXVOVO OIOIVOOOW 0891 丄丄 0VV 3WV 丄:) VOV丄 W丄 V 1WD1V01D9 13010001V3 ViOVOWOlO VOVOOVOVOV 029 ΐ 0V1DV01VD9 130V0WV1V 0VXD103X01 31D0V0WV1 WD103V0DV 0V1DW0V30 09SI 0V0V1139V0 WiVlOVOOV 301OX00V30 1V01111WV DVOWOVIOI 0W3V0WV3 009Ϊ WOiVOVDll 0VD1V130V3 DIVXWOOOV 3100D1DV00 VOOVOOIOOV 09V0301DDI Οΐ ΐ 0V090D100V DVD0V3V10V OVOVWOXVI 3V33V01030 V003VOOV0V VOOOOVVVOO 08E1 V30VW9900 W03V30310 OOOVWVIOI 133V0VDV0V IOOWiOOiV 丄 OZ£l 0031309V30 i)VO丄丄 VOiV 001910V011 O0V0131301 1VDV00V3D0 0910W9I03 0921 OlOOiOiODV OWDiOWlV 101I1D10V0 V303V1V01V 030WOOD1V VOIOWVOOO 0021 1WD313D13 ViOOOOlVVD OiOVOVOliO VOWVOODOI V13V01D1V0 3D33V331D3 OH I 01V3V90V3V 0V300VD01D iOlOlVWW X1090X0V0V VOllOXVVOD DD330V3VVD 0801 1V 1V111V3 V0VV09W1V 009101111V 1VVD310W1 V91V19001V 901V0VW0V 0201 VODODWWO 10X3011111 131VD1W11 13011X130C 1001V11V01 V311000D13 096 DI9I1V3D0V IVlOOOVOOV D3D31V0X10 0101013V1D VOiViOliiV 1WD1V0910 006 3V13131001 DVX09V0913 丄 V丄 V丄丄 LL 0V03W0013 IVOIVIVIVI VOVOVOIOOO 1-8 D lO OL DOIOIIDDOV DDD003V033 OVVOXOVOOD IVV1V3V101 001V03V0D9 SL 丄丄 V丄丄丄 i)丄 99 XVD1V0000I DD1V1D930V 010V1V3IVO lOOlVOilDV XIVIVOWOV 2A V3VODVD010 1W0D1D1V0 VVIVIIOIDV 丄 9丄丄丄 V 1VV10V11D3 11D0D1VD11 900/L6df/XDd OAV TTGGCTAAGT CTGTTTTATG ACTGCAAATG ACAGCATTCC TGCCTTTGTA TTTCAGGGGA 2460 AATACGATAC ATTATATCGG CCATGTTCCC CACCACTGTT TTTCTTATAT TGACTTTTAA 2520 CAAATGAATA GGATTATTTT TGGCTTTACA TTTTTTCCTA ACACTTAAGA TCATATAAAA 2580 TTAACAAATA TGTGAAATTT AAGAATTGTA AATATATATT TACGTTTGAA AGATGATTTT 2640 AAATCCAGGG TTAAAGTGCT TTTTATCTTG TATAGTTTAC ATGCTTTTTT TTTTTTTTGA 2700 TAACCCACTA GACCTTTCCA TTGTATCAGA GTATCCAATT ACATTTACAA TTATGACTTG 2760 AATTGTATTT CACAGGAATG CTCAAGTTTT GTACATATTT TATAAGGTAT TAAACCTGAT 2820 GTTCTCTTTC TAAAAAAAA 2839 配列番号： 7

配列の長さ： 3 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 D N A

配列の記述

TATGAGACAG ACTACACAAC TGGCGGCGAG TCC 配列番号： 8

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：合成 D N A

配列の記述

ATCATAGTCT CCAACCATCT TCTTGATGTG 画面の簡単な説明

図 1は生物の形態を示す図面の代用写真である。写真 Aはヒトォクルディンに対するラットモノクロナ一ル抗体による培養ヒト腸上皮細胞株 T 8 4の免疫蛍光染色写真。写真 Bは T J裏打ちタンパク質 Z O— 1に対するマウスモノクロナール抗体による培養ヒト腸上皮細胞株 T 8 4の免疫蛍光染色写真。 T 8 4細胞の同 —部位を撮影した。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するヒトォクルディンタンパク質をコードする DNA。

2. 配列番号 4に記載の DNAである、請求項 1に記載のヒトォクルディンタンパク質をコードする DNA。

3. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち 1若しくは複数のアミノ酸が、付力欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコ一ドする DN A。

4. 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するィヌォクルディンタンパク質をコードする、配列番号 5に記載の DNA。

5. 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有するマウスォクルディンタンパク質をコードする、配列番号 6に記載の DNA。

6. 請求項 1ないし 5に記載の DN Aを含有するべクター。

7. 請求項 6に記載のベタターを保持する形質転換体。

8. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するヒトォクルディンタンパク質。

9. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1若しくは複数のアミノ酸が、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。

1 0. 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するヒトォクルディンタンパク質の部分べプチド。

1 1. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するィヌォクルディンタンパク質。

1 2. 配列番号 3に記截のアミノ酸配列を有するマウスォクルディンタンパク質。

1 3. 請求項 7に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含む、請求項 8ないし 1 1に記载のタンパク質の製造方法。

1 4. 配列番号 4, 5または 6に記載の塩基配列の全部または一部を含むものからなる DNAプローブ。

1 5. 配列番号 4， 5または 6に記載の塩基配列の一部を含むものからなる D N Aァライマー。

1 6. 請求項 8, 1 1または 12に記載のタンパク質と特異的に結合するポリク口ナ一ル抗体またはモノクロナ一ル抗体。

17. 請求項 1 5に記載の DNAブライマーを用いることを特徴とする生体試料中の請求項 2 , 4または 5に記載の D N A遣伝子の解析方法。

1 8. 請求項 14に記截の DNAプローブを用いることを特徴とする生体試料中の請求項 2, 4または 5に記載の DN A遺伝子の解析方法 ₃

1 9. ォクルディンを発現している細胞と被検物質を共存させた後、該細胞のォクルディン遺伝子の発現量を、請求項 1 7又は 1 8の方法により解析することを特徴とする、オタルディンの発現に影響を与える薬物のスクリーニング方法

20. 請求項 4に記截のヒトォクルディン DNAに選択的にハイブリダィズする少なくとも 6ヌクレオチドを含む医療用ポリヌクレオチド。

21. 請求項 1 6に記載の抗体を含むことを特徴とする、生体試料中のォクルディン測定試薬。