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WO1997031110A1 - Molecule de la famille des genes de transfert f, polynucleotide codant pour cette molecule et anticorps actif contre cette molecule - Google Patents

Molecule de la famille des genes de transfert f, polynucleotide codant pour cette molecule et anticorps actif contre cette molecule Download PDF

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Publication number
WO1997031110A1
WO1997031110A1 PCT/JP1997/000512 JP9700512W WO9731110A1 WO 1997031110 A1 WO1997031110 A1 WO 1997031110A1 JP 9700512 W JP9700512 W JP 9700512W WO 9731110 A1 WO9731110 A1 WO 9731110A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
molecule
traf
family
leu
traf family
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/000512
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Motomi Nakata
Hiroyasu Nakano
Hideo Yagita
Ko Okumura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Electric Industries Ltd
Original Assignee
Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Electric Industries Ltd filed Critical Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority to EP97903599A priority Critical patent/EP0882790A4/en
Publication of WO1997031110A1 publication Critical patent/WO1997031110A1/ja
Priority to US09/138,277 priority patent/US6426403B1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • TRAF family molecules polynucleotides encoding the molecules, and antibodies against the molecules
  • the present invention relates to TRAF family molecules, polynucleotides encoding the molecules, antibodies against the molecules, and antisense polynucleotides of the polynucleotides encoding the molecules.
  • TNF-R TNF receptor
  • TNF-R2 TNF-R2
  • Fas CD40
  • CD27 CD27
  • lymphotoxin-1 / 3 receptor lymphotoxin-1 / 3 receptor
  • TRAF 1 abbreviation of TNF-R associated factor (TNF-R associated molecule)
  • TRAF 2 which are molecules that associate with TNF-R, are cloned (Go eddel et al., Cellvol. 78 No. 4). 681-692, 1994), which are known to associate with the cytoplasmic domain of TNF-R2.
  • TRAF 1 must associate with TNF-R2 and CD40 (J. Biol. Chem. Vol. 269 No. 48, p. 30069 to 30072),
  • TRAF 2 is NF- / c B (immunoglobulin ⁇ It plays an important role in activating the DNA binding of a nucleoprotein that binds to a base sequence consisting of 10 base pairs called the / cB motif in the enhancer region of the L chain gene,
  • TRAF 3 (also called CRAF 1, CD40bp or CAP1) is known to associate with TNF-R2, CD40 and LT- / 3R (
  • TRAF4 also called CART 1
  • CART 1 For TRAF4 (also called CART 1), no associated molecule has yet been identified (J. Biol. Chem. Vol. 270 No. 43, p. 25715-25721, 1 995).
  • the molecules of the TRAF family are structurally characterized by having a TRAF domain, and depending on the family member, the RING finger motif, Zn finger motif, leucine zipper motif, etc. Or it has a coiled coil structure in the center. From these structural and usual characteristics, it is speculated that these TRAF family molecules form homo- or hetero-complexes and function as transcription factors. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a new molecule of the TRAF family. Also, The present invention is applied to elucidation of the function of one molecule of the TRAF family, such as an antibody or a polynucleotide probe, that is, to elucidation of the interaction between one molecule of the TRAF family and the signal transduction system of the TNF-R family. The challenge is to provide substances that can be used. Furthermore, an object of the present invention is to provide an antisense polynucleotide applicable to drug development.
  • an object of the present invention is to search, isolate, and structurally identify a TRAF 5 molecule, which is a novel TRAF family molecule according to the present invention, and to provide various functions of the molecule.
  • the present invention provides a computer analysis of the homology of TRAF 1 and TRAF 2, synthesis of various oligo DNA primers capable of amplifying the most conserved region, and generation of various DNA-derived primers.
  • New DNA showing high homology with TRAF1 and TRAF2 genes, obtained by preparing cDNA based on RNA and performing PCR using oligoDNA primers with cDNA as type II It is an object of the present invention to provide a gene (TRAF 5 gene) and an amino acid sequence of 5 molecules of TRAF encoded by the gene.
  • TRAF 5 molecule the protein is hereinafter referred to as TRAF 5 molecule or TRAF 5
  • TRAF 5 gene itself is referred to as TRAF 5 gene.
  • Another object is to provide a finding that TRAF 5 molecules are associated with LT- / 3R and CD30, and that TRAF 5 molecules have the inducibility of DNA binding activity of NF- / cB, a DNA-binding protein.
  • an antibody against the TRAF 5 molecule is prepared, and the antibody provides a means for elucidating the function of the TRAF 5 molecule and a means for elucidating the signal transduction system of the TNF-R family involved in the TRAF family molecule. That is the task.
  • TRAF family molecules having the following properties (1) to (4):
  • lymphotoxin-1) 3 receptor (LT-) 3R) and CD30 It has an association with lymphotoxin-1) 3 receptor (LT-) 3R) and CD30.
  • TRAF family molecule described above, wherein the DNA-binding protein is NF- ⁇ B.
  • TRAF family which is a protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • TRAF family molecule having at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing.
  • TRAF molecules comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • TRAF 5 molecule comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • TRAF 5 molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 in the BB column list, wherein the TRAF family molecule has one or more of the above-mentioned amino acid sequences without substantially changing the function of the TRAF family molecule.
  • TRAF family molecules whose parts have been modified by amino acid substitutions, deletions or additions.
  • a TRAF 5 molecule comprising an amino acid sequence from position 233 to position 558 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a TRAF 5 molecule comprising an amino acid sequence from position 342 to position 558 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a TRAF 5 molecule comprising the amino acid sequence from position 233 to position 557 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • TRAF family molecule described above.
  • TRAF 5 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • TRAF5 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • a polynucleotide which is a part of continuous 12 or more bases of the polynucleotide according to any of 12 to 14 above.
  • a polynucleotide which is a part of 16 or more consecutive bases of the polynucleotide according to any of 12 to 14 above.
  • An expression vector comprising a polynucleotide encoding one TRAF family molecule of the above item 12.
  • a transformant characterized by being transformed with the expression vector.
  • a method for producing a TRAF family molecule comprising using the transformant.
  • FIG. 1 shows the results of homology analysis of the amino acid sequences of 5 molecules of mouse TRAF and one molecule of another TRAF family.
  • the black part is TR A
  • the F domain (TRAF domain) indicates the leucine zipper motif (Leucine Zipper)
  • the hatched region indicates the Zn finger motif (Zinc finger)
  • the horizontal line indicates the region. It represents the RING finger motif (Zinc ring finger).
  • TRAF 1 to TRAF 4 the full length (overall) with TRAF 5 and the homology of amino acids in the TRAF domain (TRAF domain) are shown on the right side.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of Northern blot hybridization analysis of each tissue of the mouse TRAF5 gene.
  • the arrow indicates the position of the mouse TRAF5 gene band.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of searching for one molecule of TNF-R family associated with five molecules of mouse TRAF.
  • the arrow indicates the position of the band of the mouse TRAF 5 molecule.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of immunoprecipitation western blotting of the aggregated substance of mouse TRAF 5 molecules and LT- ⁇ R using HA epitope.
  • the arrow indicates the position of the mouse TRAF 5 molecule to which the peptide was bound.
  • Figure 5 is a photograph showing the results of EMS Alpha indicating the DN Alpha binding activity inducing NF-? Kappa B by murine TRAF 5 molecules or LT one j3 R molecule.
  • B ⁇ the position of the indicated bands NF-? Kappa B, the density of the bands indicates the amount of DNA bound to NF-? Kappa beta.
  • FIG. 6D shows primers used for identification of the mouse TRAF5 gene.
  • FIG. 6B is a diagram showing primers used for identification of mouse TRAF5 gene.
  • Figure 8 shows Cys Tyr Ser Gly Lys Leu lie Trp Lvs Val Thr Asp Tyr Arg (CYSGKL I WKVTDYR) from position 401 to position 4 of mouse TRAF 5 molecule.
  • 14 is a graph showing the result of ELISA of a polyclonal antibody against the 14mer peptide (peptide of sequence 2).
  • FIG. 9 is a photograph of a western blot showing the expression of five human TRAF molecules in each cell line. The arrow indicates the position of the band of the human TRAF 5 molecule.
  • FIG. 10 is a photograph showing the association of CD30 or LT-3R with 5 mouse TRAF molecules, 2 mouse TRAF molecules or 3 mouse TRAF molecules. Arrows indicate the positions of the bands of mouse TRAF 2 molecules, mouse TRAF 3 molecules or mouse TRAF 5 molecules.
  • FIG. 11 shows a comparison of the amino acid sequences of five human TRAF molecules and five mouse TRAF molecules.
  • the upper row shows the amino acid sequence of human TRAF5, and the lower row shows the amino acid sequence of mouse TRAF5.
  • One in the mouse TRAF5 sequence indicates that the amino acid at that position is the same as the corresponding amino acid in human TRAF5 (ie, the amino acid described at the top).
  • the one at position 494 in the sequence of human TRAF5 indicates that the amino acid at that position is missing.
  • the method for identifying a TRAF family molecule according to the present invention and a polynucleotide encoding one molecule of the TRAF family of the present invention will be specifically described below.
  • a homology search is performed on the known base E sequence of TRAF1 and TRAF2, and a region with the highest homology between the two is identified and selected.
  • a primer is designed for PCR amplification (polymerase chain reaction) of the specified region.
  • the nucleotide sequence of the target primer is not particularly limited. In the present invention, for example, as shown in FIGS. A mixture of primers to which an I site has been added can be preferably used. Further, such primers can be synthesized using a conventional DNA synthesizer.
  • A is adenine
  • T is thymine
  • G is guanine
  • C is cytosine
  • Y is cytosine or thymine
  • N is adenine, thymine, guanine or cytosine
  • R is adenine or guanine
  • D is adenine, thymine or guanine. Therefore, (1) in FIG. 6A represents 256 primers, and (2) in FIG. 6B represents 768 primers.
  • mRNA is prepared from mouse B cell lymphoma, mouse monocyte cell line and mouse liver, and oligo d is prepared.
  • cDNA is prepared using T or random hexamers as primers.
  • cells for the purpose of adjusting the mRNA are not limited to the above cells.
  • RNA fraction for example, after obtaining a total RNA fraction by the guanidine thiocyanate method (“Biochemistryvol. 13” p. 2633, 1974), an oligo (dT) cellulose column or the like is used. It is possible to carry out the preparation appropriately.
  • the obtained cDNA template was used as a type II, PCR was performed using the above primers, the amplified fragment was recovered, and a closing vector having a multiple cloning site (for example, pBluescript SK (+) Is preferably used).
  • the subcloned product is subjected to a DNA sequence using the DNA sequencer by a didoxy method, and is found to be a novel gene. With this method, a new TRAF family gene fragment is obtained. This new TRAF family gene is labeled with 32 P to give a 32 P—TRAF fragment.
  • RNA is newly prepared from a monocyte cell line or a tissue such as liver tissue, and a cDNA library is prepared therefrom.
  • a cDNA library is prepared therefrom.
  • phage vectors such as AgtlO, ⁇ gt11 and ⁇ ZAP11, as well as plasmid vectors such as pBR and pUC can be used.
  • the thus prepared cDNA library is subjected to screening using the aforementioned 32 P-TRAF fragment as a probe to obtain a clone containing cDNA covering the entire translation region of TRAF5.
  • the nucleotide sequence is determined using a DNA sequencer.
  • the TRAF5 gene of other animals including humans can be obtained from cells of the target animal species.
  • search and acquisition can be performed in the same manner as described above.
  • TRAF5 The structure of the TRAF5 gene, for example, in the case of a mouse, is as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • Mouse TRAF5 consists of an open reading frame of 1674 nucleotides (positions 323 to 1999 of the sequence number in the sequence listing) and is composed of 558 amino acids. Its mRNA size is assumed to be 2.2 kb.
  • the amino acid sequence of 5 mouse TRAF molecules encoded by the above nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Referring to FIG. 1, the amino acid sequence is compared to known TRAF family molecules. Structurally, the TRAF 5 molecule is similar to the TRAF 3 molecule. TRAF5 molecules differ from TRAF1, TRAF2 and TRAF4 molecules in having a leucine zipper motif or coiled coil structure.
  • the amino acid sequences of the mouse TRAF 5 molecule and the human TRAF 5 molecule are very homologous, and their functions are well conserved between different types. Therefore, the TRAF5 gene shows high homology in mice and humans, and the plaque hybridization was carried out using the method of Example 7 described later, ie, using all or a part of the already obtained TRAF5 gene as a probe. Isolating the TRAF5 gene of the target animal from a cDNA library derived from the target animal by a commonly used cDNA library method such as the cDNA method. You can get a message.
  • a molecule of the TNF-R family of the present invention, in which five TRAF molecules have association properties, can be searched, for example, by the following method.
  • a fusion protein is prepared using a fusion protein expression system.
  • a method in which a fusion protein is prepared by inserting a portion of the cytoplasmic domain of a TNF-R family molecule into the downstream of daltathione-1 S-transferase (GST) can be preferably used.
  • GST daltathione-1 S-transferase
  • any protein that can synthesize a fusion protein with a TNF-R family molecule besides GST can be used.
  • a thioredoxin fusion protein of ThioFusion registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • a fusion protein expression system with a leader peptide derived from gene 10 of T7 can be used.
  • the TRAF 5 gene is translated in vitro, and 5 molecules of TRAF labeled with 35 S-methionine or the like are prepared. It is possible to do it.
  • the fusion protein and 5 TRAF molecules are mixed to select a fusion protein associated with the 5 TRAF molecules.
  • a selection method for example, a method in which an associated substance is adsorbed on a GSH-agarose column can be used.
  • chromatography such as affinity chromatography can be preferably used.
  • the above-mentioned associated substance is separated, heat is applied to dissociate the TRAF 5 molecules, SDS-PAGE is performed, and the gel is subjected to autoradiography.
  • SDS-PAGE is performed, and the gel is subjected to autoradiography.
  • the TRAF 5 molecule band it is possible to confirm that the TRAF 5 molecule has an association with LT- ⁇ R and CD30.
  • the association between the TRAF 5-molecule and LT-1) 3R was determined by immunoprecipitation Western blotting. It is also possible to confirm the nature.
  • the TRAF 5 molecule used binds the influenza virus hemagglutinin epitope (HA epitope) as a tag.
  • the aforementioned method of binding a leader peptide derived from the T7 gene 10 can be preferably used.
  • various known methods can be used for the tag binding method.
  • a genetic engineering method is preferable. In particular, treatment with a restriction enzyme such as EcoRI is carried out, and the HA peptide is used. It is preferred to incorporate into the expression vector a DNA encoding the gene and TRAF 5 molecules amplified by PCR.
  • the TRAF 5 molecule when the TRAF 5 molecule is produced by a gene engineering method, it is preferable to introduce a TRAF 5 molecule expression vector and an LT1 / 3R-introduced vector into a cell.
  • a method for introducing the vector into a cell a liposomal method, an electoral portation method, or the like can be used.
  • a DEAE-dextran method Pharmacia
  • the TRAF 5 molecule and the substance associated with the TRAF 5 molecule can be accurately determined. It is possible to separate and collect.
  • the TRAF 5 molecule of the present invention has an associating property with LT-3R and CD30, which are one molecule of the TNF-R family, and this property is a function of the molecule of the TNF-R family. It can be used to elucidate.
  • the TNF-R family molecule and one member of the TNF family are important molecules that trigger intracellular differentiation, proliferation, and death. Using antibodies and the like, it will be possible to elucidate such functions and elucidate the mechanisms of cancer and apoptosis.
  • LT-1 / 3R like LT-1 ⁇ , is estimated to have an important role in immune system differentiation.
  • peripheral lymph node differentiation is immature in mice lacking the gene for LT-1 ⁇ , and it is considered that LT-) 3R is similar.
  • CD30 the function of CD30 is that T cells cannot be normally differentiated in the thymus in deficient mice, and that signals mediated by T cell receptors are not transmitted well. Therefore, the association of the TRAF 5 molecule with the LT-j3R or CD30 suggests that the TRAF 5 molecule should be a key substance in LT / 1/3 R signaling, It is presumed that mice lacking cause immaturity of the immune system, for example, immature differentiation of peripheral lymph nodes.
  • the expression of the TRAF 5 molecule induces the DNA binding protein NF- ⁇ B DNA binding activation. Can be confirmed. That is, it is confirmed that the TRAF5 molecule can be used for inducing DNA binding activation of a DNA binding protein.
  • the expression of NF- ⁇ B is caused only by the expression of LT-3R, but the 233rd position to the 233rd position of the mouse TRAF 5 molecule, which is a deleted protein. It can be confirmed that the activation is suppressed by adding only the 558th position in excess.
  • the use of positions 233 to 558 of the TRAF 5 molecule makes it possible to study the effect of antagonizing LT-1) 3R.
  • the present invention makes it possible to study a system for controlling signal transduction involving NF- ⁇ or to develop a drug by adjusting the TRAF 5 molecule or the TRAF 5 gene according to the present invention.
  • NF- ⁇ binding to the probe was generated using a TRAF 5 molecule.
  • a method of detecting from the expressed cells can be used.
  • the TRAF 5 molecules used may be all or part.
  • NF-? Kappa in gene itself polynucleotide probe is NF-? / C beta comprising a binding site of the B, may even partially, be of natural, or may be one synthesized.
  • an electrogel shift method ⁇ 1 ectrophoretic mobility shift as say (EMS A)
  • a gel shift method can be used.
  • one molecule of the TRAF family of the present invention has a property capable of associating with LT-R and CD30 and inducing the DNA binding activity of a DNA-binding protein.
  • NF- ⁇ B is preferable as the DNA binding protein for confirming the induction of DNA binding activity.
  • lymphotoxin-1) 3 receptor (LT-3R) and CD30 has an association with lymphotoxin-1) 3 receptor (LT-3R) and CD30.
  • the TRAF family molecules of the present invention include those having at least a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as long as they have the above properties. Part of the above amino acid sequence is not particularly limited. It is preferably at positions 233 to 558 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In particular, it preferably has a TRAF domain (positions 342 to 558 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).
  • the TRAF family molecule of the present invention has the above-mentioned properties, as shown in Example 7, the molecule is hybridized to a DNA that hybridizes to a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. And proteins to be loaded.
  • a TRAF family molecule of the present invention may be structurally modified by substituting, deleting or adding an amino acid to a part of the above TRAF family molecule.
  • Known methods can be used for the method of substituting, deleting or adding amino acids. For example, "Molecu lar Cloning"
  • the polynucleotide encoding one molecule of the TRAF family of the present invention is, for example, a DNA consisting of the nucleotide sequence from position 323 to position 1999 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and an RNA corresponding to the DNA.
  • These are polynucleotides encoding the mouse TRAF 5 molecule consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and expressing all or a part of the coding region of the protein in an appropriate transformant. It can be used to produce recombinant TRAF family members.
  • a part of the polynucleotide can be used immediately as a research polynucleotide probe for examining the presence or expression of a gene encoding a single TRAF family molecule in a tissue or a cell.
  • the part used as a probe is preferably one having 12 bases or more and having a GC content of 30 to 70%. It is particularly preferable if the number is 16 bases or more.
  • the polynucleotide used as a probe may be a derivative. For use as a probe, it may be a nucleotide sequence of a non-coding region of a gene encoding one TRAF family molecule or a nucleotide sequence complementary thereto. (TRAF family antibody of the present invention)
  • the TRAF family molecular antibody of the present invention includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies as long as it recognizes one TRAF family molecule molecule of the present invention. Also included are active fragments thereof and chimeric antibodies containing the active fragments. Antibodies, ie, immunoglobulins, have heavy and light chains and are divided into five classes (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) based on their physicochemical and immunological properties. Of these, IgA and IgG are further divided into subclasses depending on the type of H chain. The novel antibodies of the present invention include those belonging to all these classes and subclasses.
  • the antibody of the present invention does not necessarily need to use the entire antibody molecule, and can use a part of the molecule (active fraction) as long as it has activity.
  • specific examples of the active fragment include F (ab ′) 2, Fab, Fv and recombinant Fv.
  • digestion with pepsin yields F (ab ') 2
  • digestion with papain yields Fab.
  • active fragments can be used alone or, if necessary, combined with a substance such as albumin or polyethylene glycol to be used as a new complex. In general, such a complex is most likely to exhibit its effect in vivo without being decomposed for a long time.
  • a method for adding a substance such as albumin or polyethylene glycol to the active fragment is described in, for example, “Antibodle s A Labora tatoroy Manu a l” (Col d s p rin g
  • a bivalent reactive reagent such as SPDP (Pharmacia), SM PB (Pierce), or EMCS (Dotait) allows the active fragment to be easily bound to albumin or the like. it can.
  • the primary structure other than the region (eg, hypervariable region) necessary to react with the TRAF family molecule in the H chain and L chain using the active fragment eg, F Chimeric antibodies can also be obtained by methods such as replacing c with the corresponding primary structure of antibodies from other animal species.
  • the novel antibody of the present invention whether a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, can be obtained by a known method.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be obtained by a known method.
  • the method of obtaining the TRAF family molecule is not limited as long as the TRAF family molecule of the present invention used as an immunogen has a degree of purification that can be used for the production of an antibody.
  • the TRAF family molecule used as an immunizing antigen is a small molecule of the TRAF family or a part thereof, that is, a TRAF family molecule consisting of about 10 to 20 amino acid residues or a part thereof, It can be used as an antigen by binding it to a carrier such as Mosyanin (KLH) to the keyhole linker.
  • KLH Mosyanin
  • the animal immunized with the TRAF family molecule or a part thereof may be any animal other than human, and it is preferable to select and use an animal species that can produce the desired antibody from animals usually used by those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained anti-blood plasma.
  • methods such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be combined.
  • a monoclonal antibody can be obtained by a method for producing a hybridoma.
  • techniques using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse and the like can be used.
  • the antibody can be obtained by using a genetic engineering method.
  • mRNA is collected from a hybridoma that produces a spleen cell, a lymphocyte, or a monoclonal antibody against one molecule of the TRAF family or a part thereof of an animal immunized with the TRAF family molecule of the present invention or a part thereof.
  • a cDNA library is prepared based on this.
  • An antibody is expressed by the cDNA library.
  • a clone producing a reactive antibody is obtained from the cDNA library by screening and the obtained clone is cultured.
  • the desired antibody is extracted from the culture mixture by salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. It can be purified by a combination of these methods.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the TRAF family molecule of the present invention or a part thereof present in a body fluid or a tissue. Further, the antibody is used for preparing an antibody column used for purifying one molecule of the TRAF family of the present invention or a part thereof, and detecting the one molecule of the TRAF family or a part thereof in each fraction. Can be used.
  • the recombinant vector and the transformant of the present invention are characterized by containing all or a part of the gene encoding one TRAF family molecule. These can be produced by various methods as shown in Examples 1, 4, 5 and 7. As a host for the transformant, any of bacteria such as E. coli, yeast, and animal cells can be used.
  • these uses may be, for example, the production of all or part of the TRAF 5 molecules as shown in Examples 4 and 5, that is, the method for producing the TRAF family molecules of the present invention.
  • the TRAF5 gene may be used to obtain all or part of it in large amounts.
  • the transformant of the present invention is cultured to perform gene amplification and expression.
  • the culture is recovered, and if necessary, operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various types of chromatography are performed to purify the TRAF family molecule of the present invention.
  • Purification methods include salting out, ultrafiltration, isoelectric focusing, gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, and other various affinity methods. There are monochromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, reverse phase chromatography, and the like, which may be appropriately selected. As detailed in the examples, purification by affinity chromatography using LT-1] 3R and CD30 or affinity chromatography using the antibodies of the invention is preferred.
  • one molecule of the TRAF family to be produced may be produced in a transformant as a fusion peptide with another polypeptide.
  • an operation of cutting out the TRAF family molecules by treatment with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as a protease is added.
  • the antisense polynucleotide of the present invention includes all nucleotides consisting of a plurality of nucleotides consisting of bases, phosphates, and sugars, including those not naturally occurring. Typical examples are DNA and mRNA.
  • One use of the antisense polynucleotide of the present invention is as a research polynucleotide probe for examining the presence of a gene encoding a TRAF family molecule and its expression status.
  • Another use of the antisense polynucleotide of the present invention is to regulate the expression of one TRAF family molecule. Since antisense polynucleotides are expected to hybridize to DNA encoding one molecule of the TRAF family or mRNA encoding one molecule of the TRAF family to promote or suppress the expression of TRAF family molecules, TRAF family molecules It can be used as a therapeutic agent for signal transduction-related diseases in which is involved or LT-1) 3R-mediated signal. That is, an antisense drug is prepared from the polynucleotide or a derivative thereof. It is possible to develop.
  • a method of regulating the expression of a protein using a polynucleotide containing a complementary nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding the protein is called an antisense method, and many researchers are currently conducting research. Technology.
  • a polynucleotide having a sequence complementary to the sequence of the translation initiation codon, the ribosome binding site, the cabling site, and the splice site can be expected to have a high expression suppression effect (see “Cancer and Chemotherapy, Vol. 20, No. 13”). 1899-1907 p.).
  • the antisense polynucleotide of the present invention which is a gene encoding a TRAF family molecule or the vicinity of a translation initiation codon of mRNA for the gene, a ribosome binding site, a cabling site, and a splice site are complementary. Those containing a unique sequence are expected to have a high expression regulating effect.
  • the antisense polynucleotide preferably has a length of about 16 to 30 bases for use in regulating expression.
  • the polynucleotide and the antisense polynucleotide of the present invention comprise a sense polynucleotide.
  • the oligonucleotide can express the TRAF family molecule of the present invention, the three-dimensional structure of the antisense polynucleotide is limited so long as it can hybridize to its complementary polynucleotide (sense polynucleotide).
  • sense polynucleotide complementary polynucleotide
  • polynucleotides whose functions are similar to those of naturally occurring polynucleotides are similar to those of naturally occurring polynucleotides.
  • the derivative is preferably a derivative having at least one of increased nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and binding strength, and a particularly preferred polynucleotide derivative has a phosphorothioate bond. It is known that the derivative has a skeletal structure.
  • the polynucleotide of the present invention and derivatives thereof also include derivatives having these functions or structures.
  • some derivatives such as a methylphosphonate type and a phosphorothioate type, can be synthesized using a chemical synthesizer (eg, Perkin Elmer Japan 3394).
  • the target polynucleotide can also be obtained by performing the operation according to the instructions attached to the chemical synthesizer, and purifying the obtained synthetic product by an HPLC method using reverse phase chromatography or the like. Derivatives can be obtained.
  • (I ZM) described in the above sequence means either I or M.
  • the amino acid-encoding nucleotide sequence cannot be determined in one way due to degeneracy (for example, Ala has four possible cases: GCA, GCG, GCC, and GCT).
  • the synthesis mode at the time of was selected as GCX (X is A, G, (including any of:, T)), and a mixture of oligo DNA primers corresponding to the selected amino acid sequence was prepared.
  • Fig. 6 Here, Figure 6 (1) shows the 256 primers on the sense side, and Figure 6 (2) shows 768 primers on the antisense side. Further, as shown in Fig. 6, each primer contained an EcoRI site.
  • a 20.25 (ATC CTIB 208), a mouse B cell lymphoma, was cultured in 25 cm 2 flasks.
  • RNAZ01B registered trademark, manufactured by Cosmo Bio
  • the reaction was repeated 40 times in a cycle of "45: for 2 minutes, followed by 72 for 1 minute, and then 94 for 1 minute".
  • the point to be noted in this reaction is that the annealing temperature was set as low as 45 to make it possible to pick up even those with the lowest possible homology.
  • the reaction was carried out overnight at 14 to obtain a ligation mixture.
  • ⁇ ⁇ Transformation was performed using a 1 uescript cloning kit. 1) To 5 ⁇ l of the cell suspension on ice, 2 ⁇ l of 0.5 ⁇ / 3 mercaptoethanol and the ligation mixture prepared in 4) were added and left for 30 minutes. After that, they were left in a water bath at 42 for 30 seconds and then on ice for 20 minutes. 450 1 of SOC medium was added and incubated at 225 rpm for 1 hour at 37.
  • DNA sequencing was performed using the DNA sequencer model 373 manufactured by Company I, using the dye terminator method.
  • the cDNA library is available from Uni-ZAP (registered trademark, manufactured by Stratagene) c DNA library kit (manufactured by Stratagene) and Po1y (A) quick mRNA isolation kit (Stratagene) Was constructed according to the respective instruction manual.
  • RNA and cDNA libraries can be prepared by referring to the protocols described in the following books. "Molec u l ar C lon Ing 2 nd E d io t io n", Chapter 8, "Biomanual Series 2 Preparation of Gene Library", pp. 33-40 and 95-106 (Yodosha).
  • Hybridization conditions were the conditions described in “Cell Engineering Experiment Protocol”, pp. 57-65 (Shujunsha, 1991). 1) using the random primer labeling kit (Takara Shuzo) and [ ⁇ one 32 P] ATP (Amersham) and the resulting P CR product 7. performs label 32 P, which DN A A probe was used.
  • the solid portion is the TRAF domain (positions 342 to 558 of the amino acid sequence of TRAF 5), and the vertical line is the leucine zipper motif (amino acid of the TRAF 5 molecule).
  • the hatched portion indicates the Zn finger motif (positions 11 to 250 of the amino acid sequence of TRAF 5 molecule), and the hatched portion indicates the RI NG finger motif (TRAF 5 From position 45 to position 85 of the amino acid sequence).
  • TRAF 5 The tissue in which TRAF 5 was expressed was examined as follows.
  • RNAZ01B The tissues of mouse brain, thymus, lung, liver, spleen, heart, stomach and adrenal gland were extracted, and each total RNA was extracted using RNAZ01B.
  • RNA was prepared using a Pol y (A) quick mRNA isolation kit (Stratagene) according to the same protocol as 9 in Example 1.
  • Example 4 The DNA probe prepared in 10.1) of Example 1 was used as the 32 P-probe.
  • the hybridization operation was performed under the conditions of high stringency according to “Molecuar Cloning AL aboratory iVI anua 1 2nd Edition” p. 7. 39—7.52. The result is shown in figure 2.
  • 28 S indicates a position of 4.9 kb, and 183 indicates a position of 1.9 kb.
  • an mRNA band was observed at 2.2 kb (indicated by an arrow), confirming the expression of the TRAF5 gene.
  • TNF-R1 TNF-R2, CD40, LT-1] 3R
  • GST glutathione-S-transferase
  • TRAF5 was translated in vitro using Invitrotranscriptionan dtranslationsystem (TNT, manufactured by Alomega) according to the attached instructions. It was confirmed by electrophoresis that the generated TRAF 5 in Vitro translation was labeled with 35 S-methionine.
  • TNT Invitrotranscriptionan dtranslationsystem
  • the gel was dried and exposed to X-ray film.
  • the results are shown in Figure 3.
  • the lane of Invitropro is the lane of the invitrotranslation product.
  • the names of the various fusion proteins used are entered in each lane.
  • a band corresponding to about 50 kD of TRAF 5 molecules was detected when reacted with the LT-R GST fusion protein. That is, it was found that 5 molecules of TRAF were associated with LTR.
  • Immunoprecipitation western blot confirmed the association of the TRAF 5 molecule with LT- / 9R.
  • HA epitopes influenza virus hemagglutinin epitopes
  • Oligonucleotides corresponding to 9 amino acids of HA epitope were synthesized. That is, the following formula (1) was synthesized as a sense polynucleotide, and the following formula (2) was synthesized as an antisense polynucleotide using a DNA synthesizer.
  • pHAK I Tneo was treated with EcoRI and subcloned with the TRAF5 gene amplified by PCR.
  • EcoRI By the treatment of EcoRI, introduction of TRAF5 into pHAK I Tneo is better than in the case of introducing TRAF5 ⁇ gene directly into pMKITNeo.
  • COS 7 cells ATCC CR L- 1 6 5 1
  • 2 X 1 0 and 6 pairs
  • 5 ⁇ g pHAK I Tneo - TRAF 5 gene and pc DNA 1- LT-) 3R LT- / 3R-introduced vectors were transiently introduced using the DE AE-dextran method (Pharmacia).
  • Cell lysates include 0.1% NP-40, 5 OmM HEPES (pH 7.4), 25 OmM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 / ig gm1 aprotinin , 2 ⁇ g Zm 1 ⁇ pstatin A and 2 ⁇ g A solution containing / m 1 leptin was used.
  • TRAF 5-LT- ⁇ R complex was immunoprecipitated with the solution in which the cells were lysed using an anti-LT-) 3R antibody.
  • Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to the membrane, and blocking was performed for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was washed with PBS (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20 for 10 minutes, and then 10 g of goat anti-HA antibody (manufactured by Behringer) was added. After adding in step 1 and reacting at room temperature for 1 hour, washing with Tween PBS for 10 minutes was repeated three times.
  • FIG. 4 shows the results.
  • NGS is a lane of goat serum
  • Anti-LT-] 3R is a lane of a sample obtained by treating the immunoprecipitate with a sample buffer for reducing SDS-PAGE.
  • a band of the HA—TRAF 5 molecule is observed at about 60 kD in the immunoprecipitated antibody with the anti-LT-1; 3R antibody.
  • TRAF 5 molecule transmits to the nucleus of cells by examining the activation of NF- ⁇ B DNA binding.
  • NF- K was DNA binding ability temper Baie B.
  • Fig. 5 shows the results.
  • lanes 1 to 5 correspond to the above expression patterns 5 to 5.
  • the band indicated by “B ⁇ ” indicates NF- ⁇ B bound to the DNA probe for detection.
  • FIG. 5 when the TRAF 5 molecule is expressed, NF- ⁇ B is detected by binding to the DNA probe. From this, it can be seen that induces activation of DN A binding TRAF 5 expression of molecules NF-? Kappa B.
  • NF-KB can be induced only by expression of LT-R, but when this is added by about 10 times the amount of amino acids 233 to 558 of the TRAF 5 molecule, a deleted protein, is added. Activation was found to be suppressed. That is, the DNA binding activity of NF- / cB can be suppressed by excessive administration of the 233 to 558 portion of the amino acid SB sequence of 5 TRAF molecules. This indicates that it is possible to control signal transduction by adjusting five TRAF molecules.
  • the following two peptides which are partial sequences of five TRAF molecules, were synthesized using a peptide synthesizer.
  • Sequence 2 14-mer peptide of Cys Tyr Ser Gly Lys Leulie Trp Lys Val Thr Asp Tyr Arg (CYSGKL I WKVTDYR) from position 401 to position 414 of 5 TRAF molecules.
  • Antibodies were prepared independently for each of the peptides prepared in 1. by the following procedure.
  • the serum was further subjected to salting out with 40% saturated ammonium sulfate, and an IgG fraction (polyclonal antibody) was obtained by affinity chromatography using Protein A Sepharose (manufactured by Pharmacia). 270 mg of polyclonal antibody was obtained from 5 Oml of serum.
  • the titer of the polyclonal antibody was measured by ELISA in the following manner.
  • Antigen solution (peptide of sequence 1 and peptide of sequence 2) 25 g Zm each 1 was dispensed into wells of a 96-well ELISA plate (Xenobind, manufactured by Xenopore) in 50 ⁇ l wells, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 4 hours.
  • Block Ace manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • distilled water was dispensed into each well at 200 ⁇ l / well, blocking was performed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of ELISA of the polyclonal antibody against the peptide in column 1
  • FIG. 8 is a graph showing the results of ELISA of the polyclonal antibody against the peptide of sequence 2.
  • the horizontal axis indicates the concentration of the added polyclonal antibody
  • the vertical axis indicates the A490 value.
  • the peptide of sequence 1 represents the result of ELISA of a polyclonal antibody obtained by immunizing two egrets. The addition of the antibody increases the A490 value, indicating that the polyclonal antibody has reacted with the antigen.
  • cDNA library was carried out in the same manner as in Example 1, 9. However, instead of the mouse monocyte cell line J774A.1 cell and Uni-ZAP (registered trademark) cDNA library kit (Stratagene), human HLTV-1 was The transfected HAT109 cells (obtained from Hiroshi Yoshida of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo) and a human gt11 cDNA library kit (Stratagene) were used.
  • the cDNA library prepared in 1 was screened using the plaque hybridization method (see “Cell Engineering Experiment Protocol”, pp. 57-65). As a result, 19 positive clones were obtained. All of these clones were subjected to DNA sequencing, and the nucleotide sequence of each clone was determined. As a result, it was found that the 19 clones were fragments of one full-length gene.
  • nucleotide sequence of the human TRAF5 gene was determined.
  • the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of human TRAF5 is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the transformant Escherichia coli containing the longest clone was transferred to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology ( ⁇ 305 It was deposited on February 14, 1997 at Tsukuba Guro 1-chome, Ibaraki Pref., Japan (Deposit No. ⁇ ERM BP-5821).
  • information obtained from other clones was obtained for parts shorter than the full length.
  • cells of BJ AB (Bakit's lymphoma), HEK293 (human fetal cell line), ME180 (cervicalcarcinoma) and FDC-11 (folliculardendritic cells) were obtained as follows. Was recovered and dissolved. 1 ⁇ 10 6 cells were used for each. Cell lysates, 50 mM T ris- HC 1, 1 50 mM Na C l, 1% NP- 40, 5 OmM ® one Doasetoami de, 2mM Mg C 1 2, 2 mM C a C 1 2, 0. 1 % N a N 3, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM N a 3 V0 4, a 1 mM N a F. 100 ⁇ l of the cell lysate was added to the pellet of each cell, and the cells were lysed by vigorous stirring.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), left for 1 hour, and blocked. Thereafter, the plate was washed twice with 0.05% Tween 20 PBS for 5 minutes.
  • Anti-mouse TRAF5 antibody was diluted with PBS to 1 ⁇ gZm 1, added to the membrane, and allowed to react at room temperature for 2 hours. Thereafter, the plate was washed three times for 5 minutes with 0.05% Tween 2 OZPBS.
  • TRAF 5 was found to associate with CD30, and both TRAF 2 and TRAF 3 were associated with both CD30 and LT-13R.
  • mock indicates cells into which vector-plasmid into which nothing has been inserted has been introduced.
  • TRAF 1 TRAF 2, TRAF 3, TRAF 4, and TRAF 5
  • Table 1 summarizes the functions and the structural features of the known knowledge and the results obtained in Example 3 and Example 5 in combination.
  • + indicates that the feature is provided
  • 1 indicates that the feature is not provided
  • ND indicates that any is unknown.
  • TRAF family molecules of the present invention are useful for elucidating the functions of the molecules of the TNF-R family. Since TNF-R family molecules and TNF are important groups of molecules that trigger intracellular differentiation, proliferation, and death, the use of TRAF family molecules and their elucidation to improve the immune system It is thought that this will lead to elucidation of the mechanisms of differentiation, cancer and apoptosis.
  • TRAF family molecules of the present invention are useful as elucidation of signal transduction from LT1 / 3R and as an immune response regulator of LT1 / 3 signal.
  • the antibodies of the present invention enable detection of TRAF family molecules of the present invention present in body fluids and tissues.
  • the antibody makes it possible to prepare an antibody column used for purifying the TRAF family molecule of the present invention, and to detect a single molecule of the TRAF family in each fraction.
  • the active fragment of the antibody of the present invention enables the production of a chimeric antibody.
  • a gene encoding the TRAF family molecule of the present invention and a polynucleotide comprising the base sequence of the antisense strand of the gene, a part thereof, and a derivative thereof are used to form a TRAF family molecule in a tissue or a cell. Research and diagnostic polynucleotide probes for examining the presence of the coding gene and its expression status are provided.
  • a polynucleotide comprising the antisense strand base sequence of a gene encoding a TRAF family molecule of the present invention, a part thereof and a derivative thereof regulates the expression of one molecule of the TRAF family. It is possible. That is, the TRAF family molecule and its derivative provide a therapeutic agent for a signal transduction disease involving one TRAF family molecule or a disease involving a signal mediated by LT-i3R or CD30. . That is, an antisense drug can be developed from the polynucleotide or a derivative thereof.
  • Gin Asn Ser Gly Asn Ser lie Ser Leu Asp Phe Glu Pro Asp Thr Glu
  • Gin Lys Glu Ser Lys lie Gin Gin Leu Ala Glu Thr Val Lys Lys Phe
  • Lys Gin Arg lie Thr Gin Leu Glu Ala Ser Asp Gin Arg Leu Val Leu
  • Sequence type nucleic acid
  • AGC TTC AAA AGG CCA GAT GGC GAG ATG AAC ATT GCC TCT GGC TGT CCC 1891
  • Gin Lys Glu Ser Lys lie Gin Gin Leu Ala Glu Thr lie Lys Lys Leu
  • Lys Gin Lys lie Thr Leu Leu Glu Asn Asn Asp Gin Arg Leu Ala Val
  • Sequence type nucleic acid
  • GCCGTGGACT TAACTGACCT GGAGGATCTC TAGTCACTGT TATGGGGTGA TAAGAGGACT 1800
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
TRAFファミリー分子、 その分子をコ一ドするポリヌクレオチドおよびその分 子に対する抗体 技術分野
本発明は、 TRAFファミリー分子、 その分子をコードするポリヌクレオチド、 その分子に対する抗体およびその分子をコードするポリヌクレオチドのアンチセ ンスポリヌクレオチドに関する。 背景技術
TNFレセプター （以下、 「TNF— R」 とする。 ） ファミリ一に属する分子 としては、 TNF— R 1や TNF— R 2、 または F a s、 CD40、 CD27お よびリンホトキシン一 /3レセプタ一 （以下 「LT— 3 Rまたは TNF— R r p J とする。 ） が知られている。 これらの分子は、 そのリガンドと結合することによ り最終的に細胞増殖、 分化や細胞死という現象を引き起こす作用や、 または他の 分子の第 2シグナル分子としての作用を有するものである。
また、 TNF— Rに会合する分子である TRAF 1 (TNF— R a s s o c i a t e d f a c t o r (TNF— R会合分子） の略） および TRAF 2がク ローニングされ （Go e d d e l等、 『C e l l v o l . 78 No. 4』 p. 681〜692、 1994) 、 これらは T N F— R 2の細胞質内ドメインに会合 することが知られている。
さらに、 新たな 2種類の TRAF分子が同定されており、 これらについては、
① TRAF 1は TNF— R 2および CD40と会合すること （ 『J. B i o l . Ch em. v o l . 269 No. 48』 p. 30069〜 30072 ) 、
② TRAF 2は、 TNF— R 2や CD40による NF— /c B (免疫グロブリン κ L鎖遺伝子のェンハンサー領域内の/ c Bモチーフと呼ばれる 10塩基対からなる 塩基配列に結合する核蛋白質） の D N A結合活性化に重要な役割を演じているこ と、
③ TRAF 3 (CRAF 1、 C D 40 b pまたは C A P 1とも呼ばれている） は TNF— R2、 CD40および LT— /3 Rと会合することが知られているが (
『S c i e n c e v o l . 267 No. 5203』 p. 1494〜 1498、 『FEBS L e t t. v o l . 358 No. 2』 p. 1 1 3〜1 18、 『J . B i o l . Ch em. v o l . 269』 p. 30069〜30072、 『Ce I l v o l . 80 No. 3』 p. 389〜 399) 、
④ TRAF4 (C ART 1とも呼ばれている） については、 会合する分子はいま だ同定されていない （ 『 J . B i o l . Ch em. v o l . 270 No. 4 3』 p. 25715〜 25721、 1 995) 。
さらに、 TR AF 1および TRAF 3については、 NF— K Bの DNA結合活 性化を誘導しないことが報告されている （ 『C e 1 1 v o l . 81』 p. 49 5〜504、 『S c i e n c e v o l . 269』 p. 1424〜： 1427、 『P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA v o l . 93』 p. 969 9〜9703) 。
TRAFファミリ一の分子は、 構造的には、 TRAFドメインを有することを 特徴とするものであり、 また、 そのファミリ一分子によっては、 N末端に R I N Gフィンガーモチーフ、 Z nフィンガーモチーフ、 ロイシンジッパーモチーフま たは中央にコイルドコイル構造を持っている。 これらの構造常の特徴から、 これ ら TRAFファミリー分子は、 ホモあるいはヘテロに複合体を形成し、 転写因子 として機能すると推測されている。 発明の開示
本発明は、 新規 TRAFファミリ一分子を提供することを課題とする。 また、 本発明は、 抗体やポリヌクレオチドプロ一ブ等、 該 TRAFファミリ一分子の機 能の解明、 すなわち TRAFフアミリ一分子間の相互作用および TNF— Rファ ミリ一のシグナル伝達系の解明に応用することが可能な物質を提供することを課 題とする。 さらに、 本発明は、 医薬品開発に応用可能なアンチセンスポリヌクレ ォチドを提供することを課題とする。
すなわち、 本発明に係る新規 TRAFフアミリー分子である TRAF 5分子の 検索、 単離、 及び構造上の同定、 さらにはその分子の有する種々の機能を提供す ることを課題とする。
すなわち、 本発明は、 TRAF 1および TRAF 2についてホモロジ一をコン ピュータ解析し、 最もよく保存されている領域を増幅することができるオリゴ D NAプライマーを種々合成し、 種々の細胞株や組織由来の RNAをもとに c DN Aを作製し、 c DNAを铸型としてオリゴ DNAプライマ一を用いた P CRを行 うことにより取得した、 TRAF 1遺伝子および TRAF 2遺伝子と高いホモ口 ジーを示す新規な遣伝子 （TRAF 5遣伝子） 、 及びその遺伝子がコードする T RAF 5分子のアミノ酸配列を提供することを課題とする。
なお、 本明細書においては、 以下、 蛋白質を TRAF 5分子または TRAF 5 と記載し、 TRAF 5遣伝子自体を TRAF 5遺伝子と記載する。
また、 TRAF 5分子が LT—/3Rおよび CD30と会合性であり、 さらに、 TRAF 5分子が DNA結合蛋白質である NF— / c Bの DNA結合活性の誘導性 を有する知見を提供することを課題とする。
また、 該 TRAF 5分子に対する抗体を作製し、 該抗体により、 TRAF 5分 子の機能の解明手段、 および、 TRAFファミリー分子が関与する TNF— Rフ ァミリ一のシグナル伝達系の解明手段を提供することを課題とする。
さらに、 TRAF 5遣伝子を用いて、 実験用プローブ、 該遗伝子またはアンチ センス遺伝子の診断用プローブ、 治療薬へ応用可能とする手段を提供することを 課題とする。 より詳しくは、 本発明により以下に記載の新規な TRAFファミリー分子 （T RAF 5分子を含む） が提供される。
1. 下記 （1) ないし （4) の性質を有する TRAFファミリー分子。
(1) リンホトキシン一）3レセプター （LT— )3R) および CD30との会合性 を有する。
(2) DNA結合性蛋白質の DNA結合活性を誘導性を有する。
(3) CD 40または TNF— R 2に対して非会合性を有する。
(4) ロイシンジッパーモチーフ、 またはコイルドコイル構造を分子内に有する。
2. 前記 DNA結合性蛋白質が NF— κ Bである前記の TRAFフアミリ一分子。
3. 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列とス トリンジユントな条件でハイブリ ダイズする DN Aによりコードされる蛋白質である前記 TRAFファミ リ一分子。
4. 配列表の配列番号 1または 3に記載のァミノ酸配列の一部を少なくとも有す る前記 TRAFフアミリー分子。
5 , 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなる TRAF 5分子。
6. 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなる TRAF 5分子。
7. BB列表の配列番号 1または 3に記載のアミノ酸配列からなる TRAF 5分子 であって、 該 TRAFファミリー分子の機能を実質的に変化させずに、 該 TRA Fファミリー分子の前記アミノ酸配列の一部を、 アミノ酸置換、 欠失または付加 することにより改変した TRAFフアミリー分子。
8. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 233位から 558位までのァ ミノ酸配列からなる TRAF 5分子。
9. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 342位から 558位までのァ ミノ酸配列からなる TRAF 5分子。
10. 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 233位から 557位までの アミノ酸配列からなる TRAF 5分子。
11. 配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列の 342位から 557位までの アミノ酸配列からなる TR A F 5分子。
12. 前記記載の T RAFフアミリー分子をコードするポリヌクレオチド。 13. 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる TRAF 5遣伝子。
14. 配列表の配列番号 4に記載の塩基配列からなる TRAF 5遺伝子。
15. 上記 12ないし 14のいずれかに記載のポリヌクレオチドの連続する 1 2 塩基以上の一部であるポリヌクレオチド。
16. 上記 12ないし 14のいずれかに記載のポリヌクレオチドの連続する 16 塩基以上の一部であるポリヌクレオチド。
17. 上記 1ないし 1 1のいずれかの TRAFフアミ リー分子に対する抗体。
18. 上記 12の TRAFフアミリ一分子をコ一ドするポリヌクレオチドを含む ことを特徴とする発現ベクター。
19. 前記発現ベクターで形質転換されたことを特徴する形質転換体。
20. 前記形質転換体を用いることを特徴とする TRAFファミ リー分子の製造 方法。
21. 上記 12の TRAFフアミリ一分子をコードするポリヌクレオチドのアン チセンスポリヌクレオチド。
22. 前記アンチセンスポリヌクレオチドの連続する 1 2塩基以上の塩基からな る一部であるポリヌクレオチド。
23. 前記アンチセンスポリヌクレオチドの連続する 1 6塩基以上 30塩基以下 の塩基からなる一部であるポリヌクレオチド。
24. 前記 12ないし 16、 または 21ないし 23のいずれかに記載のポリヌク レオチドの誘導体。 図面の簡単な説明
図 1は、 マウス TRAF 5分子と他の TRAFファミ リ一分子のァミノ酸配列 のホモロジ一解析の結果を示す図である。 図中、 黒く塗りつぶした部分が TR A Fドメイン（TRAF domain)であり、 縦線を付した部分がロイシンジッパーモチー フ（Leucine Zipper)であり、 斜線を付した部分が Z nフィンガーモチーフ（Zinc finger)であり、 横線を付した部分が R I N Gフィンガーモチーフ（Zinc ring fi nger)を表すものである。 T R A F 1ないし T R A F 4については、 TRAF 5 との全長（Overall)および TRAFドメイン（TRAF domain)におけるアミノ酸のホ モロジ一（Homology)を、 右横に示す。
図 2は、 マウス TRAF 5遺伝子の各組織におけるノーザンブロットハイプリ ダイゼ一ション解析の結果を表す写真である。 矢印はマウス TRAF 5遺伝子の バンドの位置を示す。
図 3は、 マウス TRAF 5分子と会合する TNF— Rファミ リ一分子の探索の SDS— PAGEの結果を表す写真である。 矢印はマウス TRAF 5分子のバン ドの位置を示す。
図 4は、 HAェピトープを用いたマウス TRAF 5分子と LT— β Rの会合物 質の免疫沈降ウェスタンプロッ 卜の結果を表す写真である。 矢印は ΗΑェピトー プを結合させたマウス TRAF 5分子の位置を示す。
図 5は、 マウス TRAF 5分子または L T一 j3 R分子による NF— κ Bの DN Α結合活性誘導を示す EMS Αの結果を表す写真である。 B→で示されたバンド が NF— κ Bの位置を、 バンドの濃さは NF— κ Βに結合した DNA量を示す。 図 6 Αは、 マウス TRAF 5遺伝子の同定に用いたプライマーを表す図である。 図 6 Bは、 マウス TRAF 5遣伝子の同定に用いたプライマーを表す図である。 図 7は、 マウス TRAF 5分子の 351位から 363位までの Ser Val Lsy Gl n Arg lie Thr Gin Leu Glu Ala Ser Asp (S VKQR I TQLEASD) の N 末端に Cys (C) を付けた 14 m e rのべプチド （配列 1のぺプチド） に対する ポリク口一ナル抗体の E L I S Aの結果を表すグラフである。
図 8は、 マウス TRAF 5分子の 401位から 4 1 4位までの Cys Tyr Ser Gl y Lys Leu lie Trp Lvs Val Thr Asp Tyr Arg (CYSGKL I WKVTDYR) の 1 4me rのペプチド （配列 2のペプチド） に対するポリクローナル抗体の E L I S Aの結果を表すグラフである。
図 9は、 各細胞株におけるヒ ト TRAF 5分子の発現を表すウェスタンブロッ トの写真である。 矢印はヒ ト TRAF 5分子のバンドの位置を示す。
図 1 0は、 CD 30または LT— /3 Rとマウス TRAF 5分子、 マウス TRA F 2分子またはマウス TRAF 3分子とが会合することを表す写真である。 矢印 はマウス TRAF 2分子、 マウス TRAF 3分子またはマウス T R A F 5分子の バンドの位置を示す。
図 1 1は、 ヒ ト TRAF 5分子とマウス TRAF 5分子のァミノ酸配列の比較 を示す図である。 上段がヒ ト TRAF 5のアミノ酸配列を、 下段がマウス TRA F 5のアミノ酸配列を示す。 マウス TRAF 5配列中の一は当該位置のアミノ酸 がヒ ト TRAF 5の対応するアミノ酸 （すなわち上段に記載のアミノ酸） と同じ であることを示す。 ヒ ト TRAF 5の配列の 4 94番目の一は当該位置のアミノ 酸が欠けていることを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
(新規 TRAFフアミ リ一分子の同定）
本発明に係る TRAFフアミリー分子および本発明の TRAFファミリ一分子 をコードするポリヌクレオチドの同定する方法について以下に具体的に説明する。 まず、 TRAFファミリ一分子の中でホモロジ一の高い領域を見出すため、 T RAF 1および TRAF 2の既知塩基 E列についてホモロジ一検索し、 両者間で ホモロジ一の高い領域を特定し選択する。
次いで、 特定された領域を PC R増幅 （ポリメラーゼ鎖反応） するためのブラ イマ一を設計する。 係る目的のプライマ一の塩基配列には特に制限はないが、 本 発明においては、 例えば図 6 A及び Bに示すように 1 7me rの塩基に E c o R Iサイ トを付加したプライマーの混合物か好ましく使用可能である。 さらに係る プライマ一は通常の DN A合成機を使用してで合成可能である。
図 6 Aにおいて、 Aはアデニン、 Tはチミン、 Gはグァニン、 Cはシトシン、 Yはシトシンまたはチミン、 Nはアデニン、 チミン、 グァニンまたはシトシン、 Rはアデニンまたはグァニン、 Dはアデニン、 チミンまたはグァニンのいずれか の塩基を表し、 したがって、 図 6Aの （1) は 256種のプライマ一を表し、 図 6Bの （2) は 768種のプライマ一を表すものである。
さらに、 铸型とする DNAの選択についても、 本発明においては特に制限はな いが、 具体的には、 マウス B細胞リンホーマ、 マウス単球系細胞株およびマウス 肝臓から mRNAを調製し、 オリゴ d Tまたはランダムへキサマ一をプライマ一 として用いて c DNAを調製することが好ましい。
なお、 本発明においては、 前記 mRNAを調整する目的の細胞は上記細胞に制 限されない。
mRNAの調整は、 例えば、 チォシアン酸グァニジン法 （ 『B i o c h em i s t r y v o l . 13』 p. 2633， 1974年） 等により ト一タル RN A 画分を得た後、 オリゴ （dT) セルロースカラムなどを用いて好適用意に行うこ とが可能である。
上記得られた c DNAプ一ルを铸型とし、 上記プライマーを用いて P CRを行 い、 増幅したフラグメントを回収し、 マルチクローニングサイ トを有するクロー ユングベクター （例えば p B l u e s c r i p t SK ( + )が好ましく使用可 能である） にサブクローニングする。 このサブクローユングしたものについてダ イデォキシ法により、 DN Aシーケンサ一を用いて、 DN Aシーケンスを行い、 新規な遣伝子であることが見出される。 係る方法にて、 新規な TRAFファミ リ —の遺伝子断片を取得する。 この新規 TRAFフアミリ一の遺伝子を32 Pでラベ ルして32 P— TRAFフラグメントとする。 なお、 ダイデォキシ法を行うにおい ては、 蛍光色素を付けたプライマ一を用いるプライマ一法、 蛍光色素を付けた d d NT Pを用いるダイターミネータ一法のいずれも好ましく使用可能である。 一方、 単球系細胞株あるいは肝臓組織等の組織から、 新たに P o 1 y (A) R NAを調整し、 これより c DNAライブラリーを調整する。 この cDNAライブ ラリーには、 A g t l O、 λ g t 1 1 , λ ZAP 1 1などのファージベクターの 他、 p BR、 pUCなどのプラスミ ドベクターがいずれも使用可能である。
こうして作製した c DNAライブラリ一に対し、 前記の32 P— TRAFフラグ メントをプローブとしてスクリーニングを行い、 TRAF 5の全翻訳領域をカバ —する c DNAを含むクローンを得ることが可能である。 次いで、 DNAシーケ ンサ一を用いてその塩基配列を決定する。
なお、 如何説明する本明細書の実施例においては、 マウス TRAF 5遺伝子の 取得方法の具体例を示すが、 ヒ トを含む他の動物の TRAF 5遺伝子についても、 目的とする動物種の細胞から調製した c DNAライブラリ一を用いて上記と同様 の方法で探索取得可能である。
TRAF 5遣伝子の構造は、 例えばマウスの場合、 配列表の配列番号 2に示す 通りである。 マウス TRAF 5は 1674残基のヌクレオチド （配列表の配列番 号の 323位から 1999位までの部分） のオープンリーディングフレームから なり、 558残基のアミノ酸から構成されている。 その mRNAのサイズは 2. 2 k bとされる。
上記塩基配列がコードするマウス TRAF 5分子のアミノ酸配列を配列表の配 列番号 1に示す。 図 1を参照して、 該アミノ酸配列を既知の TRAFファミリー 分子と対比させる。 構造的には、 TRAF 5分子は、 TRAF 3分子と類似して いる。 TRAF 5分子は、 ロイシンジッパーモチーフまたはコイルドコイル構造 を有する点で TRAF 1、 TRAF 2および T R A F 4分子と相違する。
また、 図 1 1に示したように、 マウス TRAF 5分子とヒ ト TRAF 5分子と のアミノ酸配列は非常にホモロジ一が高く、 異種間でその機能がよく保存されて いる。 従って、 TRAF 5遺伝子はマウスとヒ 卜で高いホモロジ一を示し、 後述の実 施例 7の方法、 すなわち既に得られている TR A F 5遺伝子の全部または一部を プローブとして用い、 プラークハイプリダイゼーション法等の通常用いられる c DN Aクロ一ユング法により目的とする動物由来の c DN Aライブラリ一から該 動物の TR A F 5遺伝子を単離する方法、 によっても目的とする動物種の TR A F 5遣伝子を取得することができる。
(本発明の TRAFフアミリ一分子の機能解析）
本発明に係る TRAF 5分子が会合性を有する TNF— Rファミリ一の分子は、 例えば以下の方法で探索可能である。
まず、 融合蛋白質の発現系を用いて融合蛋白質を作製する。 具体的には、 ダル タチオン一 S—トランスフェラーゼ （GST) の下流に TNF—Rファミリ一分 子の細胞質内ドメインの部分をそれぞれ挿入することで融合蛋白質を作製する方 法が好ましく使用可能である。 本発明においては、 G S T以外にも TNF— Rフ アミリー分子との融合蛋白質を合成することができるものであれば、 使用可能で ある。 具体的には、 Th i o Fu s i o n (登録商標、 インヴィ トロゲン社製） のチォレドキシン融合蛋白質や T 7の遺伝子 10に由来するリーダペプチドとの 融合蛋白質の発現系も使用可能である。
なお、 TRAF 5分子の検出が容易に行うべく、 例えば、 TRAF 5遺伝子を i n V i t r oで翻訳し、 35S—メチォニン等でラベルされた TRAF 5分子 を作製し、 TRAF 5分子の検出が容易に行えようにすることが可能である。 次に、 融合蛋白質と TRAF 5分子とを混合して、 該 TRAF 5分子と会合し た融合蛋白質を選択する。 選択の方法としては、 例えば、 GSH—ァガロース力 ラムに会合物質を吸着させる方法が使用可能であり、 他にァフィ二ティ一クロマ トグラフィ一等のクロマトグラフィーも好ましく使用可能である。
会合性を確認するには、 例えば、 前記会合物質を分離し、 熱を加えて TRAF 5分子を解離させた後、 SDS— PAGEを行い、 ゲルをオートラジオグラフィ —し、 TRAF 5分子のバンドの有無を検出することにより、 TRAF 5分子が LT- β Rおよび CD 30との会合性を有することを確認可能となる。
また、 TRAF 5分子と LT一 J3 Rを同一の動物細胞内で強制発現させた後、 細胞内の会合物質を免疫沈降ウェスタンプロットする方法により、 TRAF 5分 子と LT一) 3 Rとの会合性を確認することも可能である。 この目的で、 具体的に は、 用いる TRAF 5分子は、 インフルエンザウイルスのへマグルチニンェピト —プ （HAェピト一プ） をタグとして結合させることが好ましい。 他に、 既述の T7の遺伝子 1 0に由来するリーダべプチドを結合させる方法も好ましく使用可 能である。 さらに、 前記タグの結合方法には種々の公知の方法が使用可能である 本発明においては遺伝子工学的な方法が好ましく、 特に、 E c o R I等の制 限酵素で処理を行い、 HAェプト一プをコードする DNAと P CRで增幅させた TRAF 5分子を発現べクタ一に組み込むことが好ましい。
また、 遣伝子工学的な方法により TRAF 5分子を作製する場合には、 TRA F 5分子の発現ベクターと LT一 /3 Rを導入したベクタ一を細胞に導入すること が好ましい。 細胞にベクタ一を導入する方法は、 リポソ一ム法、 エレク ト口ポー レーシヨン法等を用いることが可能であるが、 特に、 DEAE—デキス トラン法 (フアルマシア社製） を用いることが好ましい。
さらに、 細胞の生成物にタグとして結合させたェピトープに対する抗体 （HA ェピトープを結合させた場合、 抗 HA抗体） を加えて反応させることで TRAF 5分子と該 TRAF 5分子への会合物質を精度よく分離採取することが可能であ る。
既述のように、 本発明の TRAF 5分子は、 TNF— Rファミリ一分子である LT— 3 Rおよび CD 30と会合性を有するものであり、 係る性質は TNF— R フアミ リーの分子の機能の解明に使用可能である。 TNF— Rフアミリーの分子 および TNFファミリ一分子は細胞内の分化、 増殖、 死を引き起こす引き金とな る重要な分子群であることから、 TRAF 5分子およびその遺伝子それに対する 抗体等を使用し、 係る機能を解明し、 癌やアポト一シスのメカニズムを解明する ことが可能となる。
また、 LT一 /3Rは LT一 αと同様に、 免疫システムの分化に重要な働きを持 つていることが推定されている。 これまでに、 LT一 αの遺伝子を欠くマウスで は抹消のリンパ節の分化が未成熟であることが知られており、 LT— )3 Rでも同 様であると考えられる。 CD 30の機能としては、 欠損マウスでは T細胞が胸腺 内で正常に分化できないことや、 T細胞レセプターを介したシグナルがうまく伝 わらない場合があることが知られている。 したがって、 TRAF 5分子と LT— j3 Rまたは CD 30との会合は、 TRAF 5分子が L T一 /3 Rのシグナル伝達の キーとなるべき物質であることが示唆するものであり、 TRAF 5分子を欠くマ ウスでは免疫系の未成熟、 例えば抹消リンパ節の分化の未熟が引き起こされるも のと推定される。
次に、 本発明に係る TRAF 5分子を用いて、 細胞のシグナル伝達作用を検 討することで、 TRAF 5分子の発現により、 DNA結合蛋白質である NF— κ Bの DNAの結合活性化が誘導されることを確認可能となる。 すなわち、 TRA F 5分子は、 DN A結合蛋白質の DN A結合活性化の誘導に使用可能であること が確認される。
また、 本発明においては、 本発明に係る TRAF 5分子を用いて、 LT— 3 R の発現のみでも NF— κ Bの発現は引き起こされるが、 欠失蛋白質であるマウス TRAF 5分子の 233位〜 558位のみを過剰に加えるとこの活性化は抑えら れることが確認可能となる。 すなわち、 TRAF 5分子の 233位〜 558位を 利用することで、 LT一 )3 Rと拮抗する作用を研究可能とする。 また、 本発明に 係る TRAF 5分子または TRAF 5遺伝子の調整により NF— κ Βが関与する シグナル伝達をコントロールする系の研究又は薬剤の開発を可能とする。
この確認のためには、 例えば、 NF— κ Βの結合サイ トを含むポリヌクレオチ ドプロ一ブを用いて、 同プローブに結合する NF— κ Βを、 TRAF 5分子を発 現させた細胞から検出する方法が使用可能である。 用いる TRAF 5分子は、 全 部でも一部でもよい。 また、 NF— κ Bの結合サイ トを含むポリヌクレオチドプ ローブは NF— /C Βの遺伝子そのものでも、 その一部でもよく、 天然のものでも、 合成したものでもよい。 検出方法には、 例えば、 電気ゲルシフト法 （Ε 1 e c t r o p h o r e t i c Mo b i l i t y S h i f t As s a y (EMS A) ) が用いられる。 この他にも、 ゲルシフト法であれば使用可能である。
上述したように、 本発明の TRAFファミリ一分子は、 LT一 Rおよび CD 30と会合し且つ DNA結合性蛋白質の DNA結合活性を誘導することができる 性質を有するものである。 DNA結合活性の誘導を確認するための DN A結合性 蛋白質としては NF— κ Bが好ましい。
なお、 既知の TR AFファミリ一分子について、 L T— /3 Rおよび CD 30と の会合や NF— κ Βの活性化についての本発明において得られる知見により、 Τ RAF 5分子と構造的には類似している TRAF 3分子は、 TNF— R2と会合 しないこと、 CD40と会合しないこと、 また NF— κ Βを活性化できることを 確認し、 本発明に係る TRAF 5分子とは相違する。
(本発明の TRAFフアミリ一分子）
本発明の TRAFファミリ一分子の特徴である性質をまとめると、 以下の 4点 となる。
(1) リンホトキシン一 )3レセプター （LT— 3R) および CD30との会合性 を有する。
(2) DNA結合性蛋白質の DNA結合活性の誘導性を有する。
(3) CD40または TNF— R 2との非会合性を有する。
(4) ロイシンジッパーモチーフまたはコイルドコィル構造を分子内に有する。 本発明の TRAFファミリー分子は上記の性質を有している限り、 配列表の配 列番号 1または配列番号 3に記載のアミノ酸配列の一部を少なく とも有している ものも含まれる。 上記のアミノ酸配列の一部とは、 特に制限がないが、 配列表の 配列番号 1のアミノ酸配列の 233位から 558位であることが好ましい。 特に、 TRAFドメイン （配列表の配列番号 1のアミノ酸配列の 342位から 558位） を有していることが好ましい。
また、 本発明の TRAFファミリー分子は上記の性質を有している限り、 実施 例 7に示すように、 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列の一部にハイブリダィ ズする DN Aによってコ一ドされる蛋白質も含まれる。
また、 本発明の TRAFファミリー分子は上記の性質を有している限り、 上記 の TRAFファミリ一分子の一部を、 アミノ酸を置換、 欠失または付加させて構 造的に改変したものも含まれる。 アミノ酸を置換、 欠失または付加させる方法は、 公知の方法が使用可能であり、 例えば、 『Mo l e c u l a r C l o n i n g
2 n d e d i t i o n』 p. 15. 1— 1 5. 1 1 3に記載の方法がある。 (本発明の TRAFファミ リ一分子をコ一ドするポリヌクレオチド）
本発明の TRAFファミリ一分子をコ一ドするポリヌクレオチドは、 例えば、 配列表の配列番号 2の塩基配列の 323位から 1 999位までの塩基配列より成 る DNAおよび該 DNAに对応する RNAがあり、 これらは配列表の配列番号 1 のアミノ酸配列より成るマウス TRAF 5分子をコードするポリヌクレオチドで あり、 その蛋白質のコ一ド領域の全部または一部を適当な形質転換体に発現させ て、 組み換え TRAFファミリ一分子を製造するのに用いることができる。
その他に、 該ポリヌクレオチドはその一部を、 組織や細胞における TRAFフ ァミリ一分子をコードする遣伝子の存在やその発現状況を調べるための研究用ポ リヌクレオチドプローブとして、 直ちに使用可能である。 プローブとして使用す る部分は 12塩基以上であり且つ GC含有率が 30ないし 70%のものが好まし い。 1 6塩基以上であれば特に好ましい。 プローブとして用いるポリヌクレオチ ドは誘導体であってもよい。 また、 プローブとして使用するには、 TRAFファ ミリ一分子をコードする遺伝子の非コ一ド領域の塩基配列またはそれに相補的な 塩基配列であってもよい。 (本発明の TRAFフアミリー分子抗体）
本発明の TRAFフアミ リー分子抗体は、 本発明の TRAFフアミ リ一分子を 認識する限り、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体いずれも含まれる。 ま た、 その活性フラグメントおよび活性フラグメントを含むキメラ抗体も含まれる。 抗体、 すなわち免疫グロブリンは、 H鎖と L鎖を持ち、 物理化学的性質や免疫 学的性質から 5つのクラス （ I gA、 I gD、 I gE、 I gG、 I gM、 ) に分 けられる。 このうち、 I gA、 I g Gは H鎖のタイプによってさらにサブクラス に分けられる。 本発明の新規抗体は、 これらの全てのクラス、 サブクラスに属す るものを含む。
さらに、 本発明の抗体は、 必ずしも抗体分子全体を用いる必要はなく、 活性を 有する限り、 分子の一部 （活性フラクメント） を用いることができる。 活性フラ グメントとしては、 具体的には F (a b ' ) 2 、 F a b、 F vおよび組換え F v 体などを挙げることができる。 例えば、 ペプシンで分解すると F (a b ' ) 2 が 得られ、 パパインで分解すると F a bが得られる。
これらの活性フラグメントは、 単独でも用いられるが、 必要に応じて、 アルブ ミン、 ポリエチレングリコール等の物質と結合させ、 新たな複合物として用いる ことができる。 このような複合物は、 一般に、 生体内では、 長時間分解されずに その効果を最大限まで発揮することが多い。 活性フラグメントに、 アルブミン、 ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、 例えば、 『An t i b o d l e s A La b o r a t o r y Ma n u a l』 (C o l d s p r i n g
Ha r b o r L a b o r a t o r y, 1988) p. 77— 81、 p 1 29 — 137に記載されている。 一般的には、 SPDP (フアルマシア社製） 、 SM PB (ピアス社製） 、 EMCS (ドータイ ト社製） 等の 2価反応性試薬を用いれ ば、 活性フラグメントをアルブミン等と容易に結合させることができる。
また、 活性フラグメントを用いて、 H鎖と L鎖における TRAFファミリ一分 子と反応するのに必要な領域 （例えば、 超可変領域） 以外の一次構造、 例えば F cを他の動物種由来の抗体の対応する一次構造に置き換えるなどの方法により、 キメラ抗体を得ることもできる。
本発明の新規抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であ つても、 公知の方法によって得ることが可能である。 例えば、 『免疫実験操作法』
(日本免疫学会編、 日本免疫学会発行） を参考にして得ることができる。 免疫抗 原として用いる本発明の TRAFフアミリ一分子は、 それが抗体の作製に使用し うる精製度のものであれば、 該 TRAFフアミリー分子が得られた方法は問わな い。
免疫抗原として使用する TRAFファミ リ一分子が、 低分子の TRAFファミ リ一分子またはその一部、 すなわち約 10ないし 20アミノ酸残基からなる TR AFファミリ一分子またはその一部である場合には、 それをキーホールリンぺッ トへモシァニン （KLH) 等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。 該 TRAFファミリー分子またはその一部で免疫する動物はヒ ト以外のいずれ でもよく、 通常当業者で使用される動物から目的の抗体を産生し得る動物種を選 択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、 得られた抗血淸を精製することによって得られる。 精 製は、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ —等の方法を組み合わせることができる。
モノクローナル抗体は、 ハイブリ ド一マを作製する方法によって得られる。 細 胞融合には、 ポリエチレングリコール、 、 センダイウィルス、 電気パルス等を用 いる手法が使用可能である。
また、 上記以外に、 遺伝子工学的な方法を用いても該抗体が得られる。 例えば、 本発明の TRAFフアミリー分子またはその一部で免疫した動物の脾細胞、 リン パ球または該 TRAFファミリ一分子またはその一部に対するモノク口一ナル抗 体を産生するハイプリ ドーマから mRNAを採取し、 これをもとに cDNAライ ブラリーを作製する。 該 c DNAライブラリ一により抗体を発現させる。 抗原と 反応する抗体を産生するクローンをスクリ一ユングにより c DNAライブラリ一 から得、 得られたクローンを培養し、 培養混合物から目的をする抗体を、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の方法を 組み合わせて精製することができる。
本発明の抗体は、 体液中や組織中に存在する本発明の TRAFフアミリー分子 またはその一部の検出に用いることができる。 また、 該抗体は、 本発明の TRA Fファミリ一分子またはその一部を精製するために使用する抗体カラムの作製、 各分画中の該 TR AFファミリ一分子またはその一部の検出のために用いること ができる。
(組み換えベクターおよび形質転換体）
本発明の組み換えベクターおよび形質転換体は、 TRAFフアミリ一分子をコ 一ドする遺伝子の全部または一部を含むことを特徴とするものである。 これらは、 実施例 1、 4、 5または 7に示されるように種々の方法により作製可能である。 形質転換体の宿主としては、 大腸菌等の細菌、 酵母、 動物細胞のいずれも使用可 能である。
また、 これらの用途は、 例えば、 実施例 4、 5に示すように TRAF 5分子の 全部または一部を産生させること、 すなわち本発明の TRAFフアミリー分子の 製造方法であってもよく、 実施例 1、 7に示すように TRAF 5遺伝子の全部ま たは一部を大量に得るために用いられるものであってもよい。
(本発明の TRAFフアミリ一分子の製造方法）
本発明の TRAFファミリー分子の製造方法では、 まず、 本発明の形質転換体 を培養し、 遺伝子の增幅、 発現を行う。 次に培養物を回収し、 必要に応じて濃縮、 可溶化、 透析、 各種クロマトグラフィー等の操作を行い、 本発明の TRAFファ ミリー分子を精製する。
形質転換体の培養については、 各種の成書があり、 例えば、 『微生物実験法』 (社団法人日本生化学会編、 東京化学同人、 1 992年） に記載の方法で行うこ とが可能である。
精製方法には、 塩析法、 限外濂過法、 等電点沈錄法、 ゲル濂過法、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィ一や抗体クロマトグラ フィ一等の各種ァフィ二ティ一クロマトグラフィ—、 クロマトフォ—カシング法、 吸着クロマトグラフィ一法および逆相クロマトグラフィー等があり、 適宜選択し て行えばよい。 実施例に詳しく示すように、 LT一 ]3 Rおよび CD 30を使用し たァフイエティーク口マトグラフィーまたは本発明の抗体を用いたァフィ二ティ —クロマトグラフィ一による精製は好適である。
また、 該製造方法において、 製造する TRAFファミリ一分子は、 他のポリべ プチドとの融合ペプチドとして形質転換体に生産させてもよい。 この場合は、 必 要であれば精製工程において、 ブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵 素で処理して、 該 TRAFフアミリー分子を切り出す操作を加える。
(本発明のアンチセンスポリヌクレオチド）
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドには、 塩基、 リン酸、 糖からなるヌク レオチドが複数結合したものが、 天然には存在しないものを含めて全て含まれる。 その代表的なものは、 DNAと mRNAである。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの用途の一つは、 TRAFファミリー 分子をコードする遺伝子の存在やその発現状況を調べるための研究用ポリヌクレ ォチドプロ一ブである。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの他の用途は、 TRAFフアミ リ一分子の発現を調節することである。 アンチセンスポリヌクレオチドは TR A Fファミリ一分子をコードする DNAまたは TRAFファミリ一分子をコードす る mRNAにハイブリダィズして TRAFファミリー分子の発現を促進ないし抑 制することが期待されるので、 TRAFフアミ リー分子が関与するシグナル伝達 系の疾患や LT一 )3 Rを介したシグナルが関与する疾患の治療薬として使用可能 である。 すなわち、 該ポリヌクレオチドやその誘導体よりアンチセンス医薬品を 開発することが可能である。
蛋白質をコードする DNAや mRNAの相補的な塩基配列を含むポリヌクレオ チドを使用して、 該蛋白質の発現を調節する方法は、 アンチセンス法と呼ばれて おり、 現在多くの研究者によって研究が進められている技術である。 相補的な配 列を有するポリヌクレオチドは、
①遺伝子から p r e— mRNAへの転写段階、
©p r e—mRNAから成熟 mRNAへのプロセッシング段階、
③核膜通過段階、
④蛋白への翻訳段階
のいずれかで、 遺伝情報を担う DNAまたは mRNAに結合し、 遣伝情報の伝達 の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節すると考えられている。
ハイブリダィズのし易さの点では、 一般的には、 ステムループを形成している 領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチドまたはポリヌクレオ チド誘導体を設計するとよいとされている （『臨床免疫 25卷』 1200〜1 206頁、 1 993年） 。
また、 翻訳開始コドン付近、 リボソーム結合部位、 キヤッビング部位、 スプラ イス部位の配列に相補的な配列を有するようなポリヌクレオチドは、 一般に高い 発現抑制効果が期待できる （ 『癌と化学療法 20卷 13号』 1899〜1 90 7頁） 。 したがって、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドであって、 TRA Fフアミリー分子をコードする遣伝子または該遣伝子に対する mRNAの翻訳開 始コドン付近、 リボソーム結合部位、 キヤッビング部位、 スプライス部位の相捕 的な配列を含むものは、 高い発現調節効果が期待される。
また、 アンチセンスポリヌクレオチドは、 発現調節の用途には、 16ないし 3 0塩基程度の長さのものが好ましい。
(本発明のポリヌクレオチド誘導体）
本発明のポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドは、 センスポ リヌクレオチドについては、 本発明の T R A Fフアミリー分子を発現することが できるもの、 アンチセンスポリヌクレオチドについてはその相補ポリヌクレオチ ド （センスポリヌクレオチド） にハイブリダィズすることができるものである限 り、 その立体構造や機能が天然に存在するポリヌクレオチドと類似するものが全 て含まれる。 例えば、 ポリヌクレオチドの 3 ' 末端もしくは 5， 末端に他の物質 が結合したものやポリヌクレオチドの塩基、 糖、 リン酸の少なくともいずれか一 部において、 置換や欠失や付加の修飾が生じた物質、 天然に存在しないような塩 基、 糖、 リン酸を有するものや、 糖一リン酸骨格以外の骨格を有するものである。 また、 誘導体には、 ヌクレア一ゼ耐性、 組織選択性、 細胞透過性、 結合力の少 なくとも 1つが高められた誘導体であることが好ましく、 特に好ましいポリヌク レオチド誘導体は、 フォスフォロチォエート結合を骨格構造として有する誘導体 であることが知られている。 本発明のポリヌクレオチドおよびその誘導体につい ても、 これらの機能または構造を有する誘導体が含まれる。
例えば、 メチルフォスフォネート型やフォスフォロチォエート型等、 誘導体の 中には、 化学合成機 （例えば、 パーキンエルマ一ジャパン社製 3 9 4型） を使用 して合成できるものもある。 この場合には、 化学合成機に添付されている説明書 にしたがって操作を行い、 得られた合成産物を逆相クロマトグラフィ一等を用い た H P L C法により精製することによつても、 目的のポリヌクレオチド誘導体を 得ることができる。
(実施例）
以下に実施例を示し、 本発明をさらに詳述するが、 本発明はこの例に限定され るものではなレ、。
<実施例 1〉T R A F 5分子の同定
1 . プライマ一の設計
T R A F 1および T R A F 2の塩基配列でホモロジ一の高い領域を検索し、 T R A F 1のアミノ酸配列のうちの T V rから G 1 yまでの部分、 すなわち Tyr Le u Asn Gly Asp Gly (YLNGDG) をセンス側とし、 アミノ酸配列、 Asp Asp (Thr / Ala) (lie / Met) Phe (lie / Leu) (DD (T/A) ( I /M) F ( I /L) ) をアンチセンス側として、 センス側についてはそのアミノ酸配列をコ— ドする遺伝子のセンス鎖を、 アンチセンス側についてはそのァミノ酸配列をコー ドする遺伝子のアンチセンス鎖をそれぞれプライマーとして合成した。 ここで上 記配列で記載される （ I ZM) とは Iまたは Mのいずれか一方を意味する。 アミ ノ酸をコードする塩基配列は、 縮重により 1通りには決まらない （例えば Ala だ と GCA、 GCG、 GCC、 GCTの 4つの場合が考えられる。 ） 力 このような場合は、 D N A自動合成のときの合成モードを、 GCX (X は A 、 G 、 （： 、 T いずれも含む） と選択し、 選択されたアミノ酸配列に相当するオリゴ DN Aプライマ一混合物を 調整した。 このプライマ一を図 6に示す。 ここで図 6 ( 1 ) はセンス側のプライ マー 2 56種を表し、 図 6 (2) はアンチセンス側 7 6 8種のプライマーを表す。 上記のオリゴ DNAプライマー混合物は、 これらを全て含むものである。 さらに、 図 6に示すように、 各プライマーには E c oR Iサイ トを含ませた。
2. c DNA混合物の調整
1 ) マウスの B細胞リンホ一マである A 20. 2 5 (ATC C T I B 20 8) を 25 cm2 フラスコ中で培養した。
2) 培養細胞を回収して、 PB Sで洗浄した後、 11111 の？ 83に懸濁し、 細 胞数を数えた。
3) 細胞 1 X 1 06 個を無菌のエツペンドルフチューブに入れ、 5， 000 r pmで 3分間遠心分離して上清を除去し、 ペレツトをタッピングした。
4) RNAZ 0 1 B (登録商標、 コスモバイオ社製） を 200 μ 1加え、 ピ ぺットマンのチップでよく撹拌して細胞を溶かした。
5) クロ口ホルムを 20 μ 1添カ卩し、 振盪後、 氷中に 5分間放置した後、 4で で 1 5, 000 r pm、 1 5分間遠心分離し、 上層の無色透明の部分を回収し、 新しいチューブに移した。 6) 次いで、 4でで 1 5， 0 0 0 r p m、 1 5分間遠心分離した後、 上淸を捨 てて、 ペレツトに 7 5%エタノールを 8 0 0 μ \加え、 一 2 で 3 0分間放置 した。
7) 次いで、 4でで 1 5， 0 0 0 r p m、 1 5分間遠心分離した後、 ペレッ ト に蒸留水 1 1. 5 μ 1を添加した。
8) 次いで、 オリゴ d Τ (0. 5 m g/m 1 ) を 0. 5 1添加して、 7 0で で 1 0分間、 氷上で 5分間放置した。
9) 次いで、 下記組成の液を加え、 4 2でで 5 0分間、 9 0でで 5分間、 氷上 で 5分間放置した。
5 X RT b u f f e r 4 μ 1
1 0 mM d NT Pm i x 1 μ 1
S u p e r s c r i p t R T a s e 1 μ 1
(登録商標、 ギブコ B R L社製）
1 0) RN a s e H (登録商標、 ギブコ BR L社製） を 1 μ 1添加し、 3 7 で 2 0分間放置し、 c DNA混合物を得た。
3. P C R
1 ) 2. で得られた c DNA混合物と 1. で得られたオリゴ DNAプライマ一 を用い、 下記の条件で P C Rを行った。
c DNA 2 μ 1
d NTPm i 1 β 1
プライマ一 （センス側） （Ι Ο Ο ρ ιη ο ΐ Ζμ Ι ) 1 μ 1
プライマー （アンチセンス側） （Ι Ο Ο ρπι ο ΐ Ζμ Ι ) 1 1
1 0 X P CR b u f f e r 4 μ 1
DDW 3 0. 5 μ 1
Am ρ 1 Τ a q 0. 5 μ 1
合計 4 0 μ 1 上記組成の液にミネラルオイル 4 0 ;/ 1を重層し、 9 4 で 5分間放置した後、
「4 5 :で 2分間、 続いて 7 2 で 1分間、 続いて 9 4 で 1分間」 のサイクル で 4 0回繰り返し反応させた。 この反応での注意点は、 アニーリングの温度を 4 5 と低く設定し、 できるだけホモ口ジ一が低いものでもピックアップできるよ うに工夫したことである。
2) 反応後、 P CR生成物についてミニゲル電気泳動 （1. 5 %ァガロースゲ ル） を行った。
3) 約 0. 5 k bの TRAFドメイン （配列表の配列番号 1で示されるァミノ 酸配列のうちの 34 2位から 5 5 8位までの部分） をコ一ドする遺伝子と考えら れるバンドをゲルから切り出した。 これについて、 G e n e C l e a n I I
(登録商標、 B I O 1 0 1社製） で P C R生成物を回収した。
4) さらに該回収物の一部について上記のミニゲル電気泳動を再度行い、 約 0. 6 5 k bにバンドが現れることを確認した。
4. DNA連結反応
B 1 u e s c r i p tのベクター （ストラタジーン社製） を用い、 下記組成の 反応液で DNAの連結反応 （ライゲーシヨン） を行った。
ADDW 5 μ 1
l O X L i g a t i o n b u f f e r 1 μ 1
P CRベクター 2 μ 1
P CR生成物 1 μ 1
Τ 4 DNA L i g a s e 1 μ 1
合計 1 0 1
1 4 で一晩反応を行い、 ライゲーシヨン混合物を得た。
5. 形質転換
Β 1 u e s c r i p tのクローニング用キットを用いて形質転換 （トランスフ ォ一メ一シヨン） を行った。 1 ) 氷上で細胞懸濁液 5 μ 1に、 0. 5Μの /3メルカプトエタノール 2 μ 1お よび、 4) で調整したライゲーシヨン混合物を添加し、 30分間放置した。 その 後、 4 2での湯浴中に 30秒間、 次いで、 氷上に 20分間放置した。 450 1 の SO C培地を加え、 37でで 1時間、 225 r pmでインキュベートした。
2) 次いで、 LB a g a rプレート （+アンピシリン、 X— G a 1、 I PT G) 各プレートに 50 μ 1、 1 00 ^ 1 , 200 z lで拡散した。
3) 37でで 1 8時間インキュベートした後、 4でで 2時間放置したところ、 白と青のコロニーが発現した。
6. ミニ培養
1) 5. の各プレートから白いコロニーを 96個拾った。
2) 3m 1の LB培地 （ + Amp) に前記のうちの 1個のコロニーを加え、 3 7 :で一晚振盪した。
I . 二調整
『M o l e c u l a r C l o n i n 2 n d E d i t i o n』 （C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, 1 989) p. 1. 25 - 1. 28に記載の方法にしたがって下記の操作を行った。
1) 培養液 1 , 5m 1をエツペンドルフチューブに取り （残りの液は LBブレ ートに拡散して 37°Cで培養し、 保存した。 ） 、 4でで 6, 000 r pm、 2分 間遠心分離した。
2) ペレツトに 1 00 μ 1溶液 1 (リゾチーム 5mgZni 1 ) を加え、 室温で 5分間放置した後、 氷上で穏やかに 5分間混合した溶液 2を 200 μ 1添カ卩し、 氷上で 15分間混合した溶液 3を 1 50 μ 1添加し、 次いで、 4Τ:で 1 2， 00 0 r pm、 5分間遠心分離した。 各溶液の組成は、 上記『Mo 1 e c u 1 a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n』 にしたがった。
3) 新しいエツペンドルフチューブに上清を取った。 これに、 等容量のフエノ —ルを添加し、 次いで、 室温で 1 2, 000 r pm、 1分間遠心分離した。 4) 新しいエツペンドルフチューブに上清を取った。 これに、 等容量の CHC 1 a ： i AA (99 ： 1 ) 混合物を加え、 室温で 12， 000 r p m、 1分間遠 心分離した。
5) 新しいエツペンドルフチューブに上清を取った。 これに、 1 μ 1の Mu s s e 1ダリコーゲンと 900 μ 1のエタノールを添加し、 一 80でで 30分間放 置した後、 4°Cで 15， 000 r pm、 5分間遠心分離した。
6) 沈殿物を乾燥した。 20/ lの TEおよび 1 /iの RNa s e A ( 5 m g Zm l ) を加え、 65°Cで 20分間放置し、 プラスミ ド DNAを得た。
7) 下記の条件でミニゲル電気泳動を行い、 バンドをチェックした。
H Bu f f e r 1 μ 】
E c o R I 1 1
DNA 1 u 1
ADDW 7 μ 1
合計 10 μ 1
上記溶液中でプラスミ ド DNAを 37°Cで 1時間インキュベートした後、 0. 75%ァガロースゲルに加えて電気泳動を行った。
8. DNAシーケンス
1 ) プラスミ ド DN Aを 1 1取り、 99 μ 1の ΤΕにて希釈した。
2) 260 nmでの吸光度 （A260) を吸光度計で測定し、 DNA値を測定 した （ 260が1. 0となるとき希釈液の DNA濃度 （DNA値） が 50 g /m 1である。 ） 。
3) A260値より、 DNAが 1 μ 1 となるように Τ Εにて希釈した。
4) ダイターミネータ一法により、 ΑΒ I社製 DNAシーケンサモデル 373 Αを用いて、 DNAシーケンスを行った。
5) 上記の方法により、 6. でスクリーニングした 96個のクローンについて ホモロジ一を調べた結果、 TRAFファミリーに属する新規遺伝子が 10クロー ン （全て同じシーケンス） 得られた。
上記のように、 PCR時のアニーリング温度を 45でと低下させることにより TRAFフアミリーに属する新規遺伝子の一部が得られた。
9. cDNAライブラリーの構築
cDNAライブラリーは、 Un i— ZAP (登録商標、 ス トラタジーン社製） c DNAライブラリーキッ ト （ス トラタジーン社製） および P o 1 y (A) クイ ック mRN Aアイソレーションキット （ス トラタジーン社製） を用いて、 それぞ れの取り扱い説明書にしたがって構築した。
1 ) マウスの単球系細胞株 J 774 A. 1細胞 （ATCC T I B— 67) 1 X I 08 個から Un i— ZAPキットでトータル RN Aにした。
2) これを P o l y (A) クイック mRNAアイソレーションキット （ストラ タジーン社製） を用いて最終的に 10 μ gの P o 1 y (A) RNAを得た。
3) この P o l y (A) RNAについて先述の Un i—ZAPキットを用い、 c DNAライブラリーを構築した。
なお、 本実施例の他、 P o l y (A) RNAおよび c DNAライブラリーの作 製は以下に挙げる成書に記載されているプロトコールを参考にして作製可能であ る。 『Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n』 第 8章、 『バイオマニュアルシリーズ 2 遺伝子ライブラリーの作製法』 33〜40頁お よび 95〜106頁 （羊土社） 。
10. c DNAのスクリーニング
1. 〜8. の過程で得た TRAFファミ リーに属すると考えられる PCR生成 物 （クローン） に相当する c DNAを得るために、 該 PCR生成物と 9. で構築 した c DNAライブラリーとのハイブリダイゼ一ションを行い、 新規の TRAF フアミリーの新 c DN Aを以下のようにしてスクリ一エングした。 ハイブリダィ ゼーシヨンの条件は 『細胞工学実験プロ トコ一ル』 57〜65頁 （秀潤社、 1 9 91年） に記載の条件とした。 1 ) 7. で得られた P CR生成物をランダムプライマー標識キッ ト （宝酒造社 製） および [ァ一32 P] ATP (アマシャム社製） を用い、 32Pでラベルを行い、 これを DN Aプローブとした。
2) 次いで、 9. で得た c DNAライブラリーについてプラークハイブリダィ ゼ一シヨン法 ( 『細胞工学実験プロ 卜コール』 57〜65頁 （秀潤社、 199 1 年） を参照） を用いてスクリーニングし、 16種の cDNAクローンを得た。
3) この 16種のクローンについて、 DNAシーケンスを行い、 部分長のもの や重複するものを除き、 最終的に 1個のクローンを選択した。 このクローンの塩 基配列を配列表の配列番号 2に示す。 また、 この cDNAを導入した形質転換体 大腸菌を工業技術院生命工学工業技術研究所 （〒305 日本国茨城県つくば巿 東一丁目 1番 3号） に平成 8年 2月 9日に寄託した （受託番号： ： FERM BP - 5384) 。
4) このクローンの全長 2224 b pの塩基配列を基にしてコンビュ一夕解析 を行った。 その結果、 該 cDNAは、 1674 bpのオーブンリーディングフレ ームを含むことが分かった。 すなわち、 該 c DNAによってコードされる蛋白質 は 558個のアミノ酸配列から構成されていることが分かった。 該アミノ酸配列 を配列表の配列番号 1に示す。
5) また、 該蛋白質について他の TRAFファミ リーの分子とホモロジ一を比 較した結果、 図 1に示すように全長では 29 %〜42 %のホモロジ一を持つこと が判明した。 特に TRAFドメイン （配列表の配列悉号 1で示されるアミノ酸配 列のうちの 342位から 558位までの部分） は 40-55 %のホモロジ一があ つた。 これらの結 とを図 1に示す蛋白質構造から、 該 ¾白^が、 叫らかに新し い TRAFファミリ一に屈する分子であることが判 Π刀した。 よって、 該¾ ! 5を 新しい TRAFファミリーの分子と同定し、 TRAF 5分子と名付けた。 なお、 図 1で、 ^く塗りつぶされている部分が TRAFドメイン （TRAF 5のァミノ 酸配列の 342位から 558位の部分） 、 縦線の付されている部分がロイシンジ ッパーモチーフ （ T R A F 5分子のアミノ酸配列の 26 1位から 303位の部分） 、 斜線の付されている部分が Z nフィンガーモチーフ （TRAF 5分子のァミノ 酸配列の 1 1 1位から 250位の部分） 、 横線の付されている部分が R I NGフ インガ一モチーフ （TRAF 5のアミノ酸配列の 45位から 85位の部分） であ る。
<実施例 2> TR A F 5分子の組織での発現の調査
TRAF 5がどのような組織で発現しているのかを下記のようにして調べた。
1) マウスの脳、 胸腺、 肺、 肝臓、 脾臓、 心臓、 胃および副腎の組織を摘出後、 それぞれのトータル RNAを RNAZ 01 Bを用いて抽出した。
2) その後、 P o l y (A) クイック mRNAァイソレーションキッ ト （ス ト ラタジーン社製） を用い、 実施例 1の 9. と同じプロ トコールで P o 1 y (A) RNAを調整した。
3) これらについて、 50%ホルムアミ ド中で 65°Cで 5分間加熱し RNAを 変性させ、 6. 6%のホルムアルデヒ ドを含む 1. 5%ァガロースゲルで電気泳 動を行い、 ニトロセルロース膜 （またはナイロン膜も使用可能） に転写させた。
4) 32 P—プローブとして実施例 1の 10. 1) で作製した DNAプローブを 用いた。 ハイプリダイゼーシヨン操作はハイス トリンジエンシーの条件下で 『M o l e c u a r C l o n i n g A L a b o r a t o r y iVI a n u a 1 2 n d E d i t i o n』 p. 7. 39— 7. 52にしたがい行った。 結果を図 2に示す。 28 Sは 4. 9 k bの位置を、 183は1. 9 k bの位置を示す。 全 ての組織で、 2. 2 k bの位置 （矢印で示している） に mRNAのバンドが認め られ、 TRAF 5遺伝子の発現が確認された。
<実施例 3〉 TRAF 5会合物質の探索 1
TRAF 5と TNF— Rフアミリ一の分子との会合物質について探索を行った。 1) TNF— Rファミ リ一の分子中で TNF— R 1、 TNF— R2、 CD40、 LT一 ]3Rについて、 グルタチオン一 S— トランスフェラ一ゼ （GST) の下流 に上記各 TNF— Rフアミリー分子の細胞質内ドメインの部分をそれぞれ挿入す ることで G S Tとの融合蛋白質を作製した。
2) TRAF5を、 i n v i t r oで、 I n v i t r o t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n s y s t em (TNT、 ァロ メガ社製） を用いて、 添付の説明書にしたがって翻訳した。 生成された TRAF 5 i n V i t r o翻訳物について、 35 S—メチォニンがラベルされているこ とを電気泳動で確認した。
3) 次に、 TRAF 5 i n v i t r o翻訳物を G S Tおよび 1 ) で作製し た各種融合蛋白質と混合した。
4) その後、 混合液を G SH—ァガロースカラムに加え、 GST、 GST— T NF— Rファミリ一分子 （TRAF 5分子との会合物質を含む） を該カラムに吸 着させた。
5) その後、 GSH—ァガロースカラム中のビーズを SDSのサンプルバッフ ァーに加え、 95¾で 5分間沸騰させて、 GS T— TNF— Rファミ リー分子と 会合している TRAF 5分子を解離させた。 。
6) その後、 遠心分離してビーズを沈殿させた後、 上清液について SDS— P AGEを行った。 ゲルは 10%ゲルを使い、 電気泳動後、 ゲルを Amp 1 i f y
(登録商標、 アマシャム社製） で 30分間インキュベートした。
7) その後、 ゲルを乾燥し、 X線フィルムで露光させた。 結果を図 3に示す。 図 3で I n v i t r o p r oのレーンは i n v i t r o翻訳物のレーン である。 他は、 用いた各種融合蛋白質名を各レーンに記入している。 図 3から明 らかなように、 約 50 kDの TRAF 5分子に相当するバンドが LT— Rの G ST融合蛋白質と反応させた場合に検出できた。 すなわち、 TRAF 5分子は L T— Rと会合することが分かった。
<実施例 4〉免疫沈降ウェスタンプロッ ト
免疫沈降ウェスタンブロットにより、 TRAF 5分子と LT— /9 Rとの会合を 確認した。 1) まず、 以下のようにして TRAF 5分子にインフルエンザウイルスのへマ グルチニンェピトープ （H Aェピトープ） をタグとして結合させた。
① HAェピトープの 9アミノ酸に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。 す なわち、 センスポリヌクレオチドとして下記式 （1) を、 アンチセンスポリヌク レオチドとして下記式 （2) を、 DN A合成機を用いて合成した。
式 （ 1 ) 5' -AAT TGA TGT ACC CAT AGG ATG TTC CAG ATT ACG CTG AAT TCC_3' 式 （ 2 ) 5* - TCG AGG AAT TCA GCG TAA TCT GGA ACA TCG TAT GGG TAC ATC-3'
②これらのポリヌクレオチド混合し、 50°Cで 10分間ァ二一リングさせた。
③次いで、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （プロメガ社製） を用いてリン酸化 させた。
④これを E c o R I と X h o Iで制限酵素処理したべクタ一プラスミ ド pMK I Tneo にサブクロ一エングし、 生成したクロ一ンを pHAK I Tneo と名付け た。
⑤ pHAK I Tneo に対し、 E c o R Iで処理を行い、 PCRで增幅させた T RAF 5遣伝子をサブクローニングした。 E c o R Iの処理により、 pMK I T neo に直接 TRAF 5遗伝子を導入するのに比し、 pHAK I Tneo に TRAF 5を導入するとうまくィンフレームで読み取られる。
2) 次いで、 COS 7細胞 （ATCC CR L- 1 6 5 1 ) 2 X 1 06 個に対 し、 2. 5 μ gの pHAK I Tneo — TRAF 5遺伝子と p c DNA 1— LT— )3R (LT— /3 Rを導入したベクタ一） を DE AE—デキストラン法 （フアルマ シァ社製） を用いてそれぞれ一過的に導入した。
3) 該 COS 7細胞の形質転換体を 48時間培養し、 導入した遣伝子がコード する蛋白質を生産させた後、 細胞を回収し、 細胞溶解液を用いて細胞を溶解させ た。 細胞溶解液には、 0. 1 %NP— 40、 5 OmM HEPES (pH7. 4) 、 25 OmM Na C l、 1 0%グリセロール、 2 mM EDTA、 1 mM P MS F、 2 /i gZm 1ァプロチニン、 2 μ gZm 1ぺプスタチン Aおよび 2 μ g /m 1 ロイぺプチンを含む液を用いた。
4) この細胞を溶解させた液に抗 LT— )3 R抗体を用いて、 TRAF 5— L T 一 β R複合体を免疫沈降させた。
①該細胞が溶解した液の上清液 1 m 1 に対して、 ャギの I g Gを結合させたセ ファロ一スビーズでプレクリアを行った。 すなわち、 ャギ I g Gセファロ一スビ —ズ 1 00 / l (ビーズ 5 0 z l分） を上清液 l m lに加え、 4 tで 1 6時間反 応させた後、 6 , 0 0 0 r p mで 2分間遠心分離してビーズを除去することでャ ギ I g Gに非特異的に結合する物質を除去した。
②次いで、 上清液に抗 L T— )3 R抗体を結合させたセファロ一スビーズ 1 0 0 μ g (ビーズ 5 0 μ 1分） を加え、 4 °Cで 1 6時間反応させた。 その後、 遠心分 離によりビーズに非吸着の部分を除去し、 さらにこのビーズを 3) で用いた細胞 溶解液で 2回遠心分離した。
5) このビーズを、 2 0 μ 1の S D S— PAG E用の還元用サンプルバッファ 一に入れ、 5分間煮沸した。
6) その後、 S D S _ P AGE用の濃度勾配ゲル （アク リルアミ ドのゲル濃度 ： 1 0%から 20%) を用いて電気泳動を行った。
7) 電気泳動後、 ゲルをニトロセルロースのメンブランに 1 0 V、 4 でー晚 トランスファ一した。
8) このメンブランに、 ブロックエース （大日本製薬社製） を加え、 室温で 1 時間プロッキングを行った。
9) 次いで、 0. 0 5%Tw e e n 2 0が入った P B S (p H 7. 4) で 1 0 分間メンブランを洗浄した後、 ャギ抗 H A抗体 （ベ一リンガー社製） を 1 0 g ΤΆ 1で加え、 室温で 1時間反応させた後、 Tw e e n P B Sで 1 0分間洗浄 することを 3回繰り返した。
1 0) 次いで、 ペルォキシダ一ゼ標識ャギ I g G (カルタグ社製） を 1 0 0 0 倍希釈した液を加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tw e e n P B Sで 3回メンブランを洗浄し、 ECLキット （アマシャム社製） の発色液を 5m lメ ンブランに加え、 1分間反応させた。
1 1) このメンブランを X線フィルムに 20秒間露光し、 現像した。 結果を図 4に示す。 図 4で N. G. Sはャギの血清のレーン、 An t i— LT— ]3 Rは免 疫沈降物を S D S— P A G E還元用サンプルバッファ一で処理したサンプルのレ ーンである。 図 4より明らかなように、 抗 LT一 ;3 R抗体で免疫沈降したものに ついて約 60 k Dの位置に HA— TRAF 5分子のバンド （矢印で示されている） が認められる。
<実施例 5〉TRAF 5分子の特性化 （NF— κ Bの D N A結合の活性化の検 討）
TRAF 5分子がどのようなシグナルを細胞の核内に伝えるのか、 NF— κ B の DN A結合の活性化を調べることにより検討した。
1) 293細胞 2 X 106 個に対し、 下記の 3つのべクタ一をそれぞれ下記の 5つの発現パターンになるように 7. 5 μ gずつ導入した。 導入は、 C a PO4 を用い、 一過的に該細胞に TRAF 5分子発現させた。
用いたべクター：
① pMK I Tneoベクターに TRAF 5遺伝子の全長の c DNAを揷入したベ クタ一
② pMK I Tneoベクターに TRAF 5遺伝子の 233位〜 558位のフラグ メントの c DNAを挿入したベクター
③ pMK I Tneoベクタ一に LT— ;3 Rを挿入したベクター
発現パターン ：
① pMK I Tneoベクタ一のみ
② p MK I Tneoベクタ一一 TRAF 5遺伝子全長
③ pMK I Tneoベクタ TRAF 5遺伝子の 233位〜 558位
④ pMK I Tneoベクタ—— LT一 β Ι ⑤ pMK I Tneo ベクタ一一 TRAF 5遺伝子の 233位〜 558位と pMK I Tneo ベクタ一— LT一 /3 R (前者 1 0に対して後者 1の割合）
2) 導入 48時間後、 核內抽出液をそれぞれ 4 μ gずつ抽出した （ 『バイオマ ニュアルシリーズ 5 転写因子研究法』 1 7〜26頁 （羊土社、 1 993年） 参 照） 。
3) NF- /c Bの結合サイ トである下記式 （3) および式 （4) のポリヌクレ ォチドをそれぞれ合成し、 これらを二本鎖にし、 5 ' 末端を Me g a r a b e 1
(登録商標、 宝酒造社製） を用いて32 Pでラベルすることで NF— κ B検出 DN Aプローブを作製した。
式 （3) 5' ATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTT 3'
式 （4) 5' CGGAAAGTCCCCAGCGGAAAAGTCCC 3'
4) 2) の抽出液と 3) で作製したプローブとを 3 7でで 30分間反応させた。
5 ) 反 J心後、 E l e c t r o p h o r e t i c mo b i l i t y s h i f t a s s a y (EM S A) で電気泳動を行い、 N F— K Bの D N A結合能を調 ベた。 結果を図 5に示す。 図 5で、 レーン 1ないし 5は、 上記の発現パターン① ないし⑤に対応している。 「B→」 で示されるバンドが検出用 DNAプローブが 結合した NF— κ Bを示す。 図 5に明らかなように、 TRAF 5分子を発現させ ると、 NF— κ Bが DNAプローブと結合して検出される。 これより、 TRAF 5分子の発現が NF— κ Bの DN A結合の活性化を誘導することが分かる。 また、 LT一 Rの発現のみでも NF— K Bの発現は引き起こされるが、 これに欠失蛋 白質である TRAF 5分子のアミノ酸配列の 233位〜 5 58位を約 1 0倍量加 えるとこの活性化は抑えられることが判明した。 すなわち、 NF— / c Bの DNA 結合活性は TRAF 5分子のアミノ酸 SB列の 233位〜 558位の部分の過剰な 投与により抑えられる。 このことは、 TRAF 5分子の調整によりシグナル伝達 をコント口一ルすることが可能であることを示す。
ぐ実施例 6 >抗体の作製 1. 抗原の作製
TRAF 5分子の一部の配列である下記の二つのぺプチドをぺプチド合成機を 用いて合成した。
配列 1 T R A F 5分子の 351位から 363位までの Ser Val Lsy Gin Arg II e Thr Gin Leu Glu Ala Ser Asp (S VKQR I TQLEASD) の N末端に Cys
(C) を付けた 14 m e rのぺプチド。
配列 2 TRAF 5分子の 401位から 414位までの Cys Tyr Ser Gly Lys Le u lie Trp Lys Val Thr Asp Tyr Arg (CYSGKL I WKVTDYR) の 14 m e rのぺプチド。
2. ポリクローナル抗体の作製
1. で作製したペプチドについて、 それぞれ独立に以下の手順で抗体を作製し た。
1) 合成したペプチド 5 m gを m—マレイミ ドベンゾィルー N—ヒ ドロキシス クシユミ ドエステル （ピアス社製） により 10mgの KLH (和光純薬社製） に 結合させ、 フロインド完全アジュバンド （ディフコ社製） と 1 ： 1の割合で混合 してェマルジョンとした。
2) 上記のェマルジヨンを、 ゥサギに 1羽当たりその 6分の 1量を筋肉注射す ることにより免疫した。
3) 同じ操作を 2週間おきに 2回行い、 ゥサギのポリクローナル抗体を調整す る場合には最終免疫より 7日後、 採血して血淸を分離した。
4) 更に血清を 40%飽和硫安により塩析を行い、 プロテイン Aセファロ一ス (フアルマシア社製） を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィにより I gG画 分 （ポリクロ一ナル抗体） を得た。 血清 5 Om lより、 270mgのポリクロー ナル抗体が得られた。
5) ポリク口一ナル抗体の力価の測定を E L I S Aにより以下の方法で行った。 ①抗原液 （配列 1のぺプチドおよび配列 2のぺプチド） それぞれ 25 g Zm 1を 96ウエノレ E L I S Aプレート （Xe n o b i n d、 キセノポア社製） の各 ゥエルに、 50 μ 1 ウエルずつ分注し、 4 でー晚放置した。
②抗原液を捨て、 蒸留水で 4倍に希釈したブロックエース （大日本製薬社製） を各ゥヱルに 200 μ 1ノウエルずつ分注し、 ブロッキングを行い、 室温で 2時 間放置した。
③ブロッキング液を捨て、 160、 320、 640、 1 280、 2560、 5 120、 10240倍希釈ポリクローナル抗体および免疫していない正常ゥサギ 血清それぞれを 8ゥエルへ 100 1 /ゥエルずつ分注し、 室温で 1時間放置し た。
④培養上淸を捨て、 0. 05%ツイ一ン 2 OZPB Sで、 プレートを 4回洗い、 ピオチン化抗ゥサギ I g G抗体 （ベクター社製） を各ゥエルに 50 μ Ι Ζゥヱル ずつ分注し、 室温で 1時間放置した。
⑤ 0. 05%ツイーン 2 OZPB Sでプレートを 4回洗い、 ABC溶液 （アビ ジン—ピオチン化ペルォキシダ一ゼ混合液、 ベクタ一社製） を各ゥエルに 50 μ 1/ゥュルずつ分注し、 30分間反応させた。
©0. 05%ツイ一ン 2 OZP B Sでプレートを 4回洗い、 Η2 02 — OPD ZP CBを各ゥエルに 100 μ 1 ウュルずつ分注して発色させ、 Α490値を 測定した。
この結果を図 7および図 8に示す。 図 7が Κ列 1のぺプチドに対するポリク口 ーナル抗体の EL I S Αの結果を表すグラフであり、 図 8が配列 2のペプチドに 対するポリクローナル抗体の EL I S Aの結果を表すグラフである。 図中、 横軸 は加えたポリクローナル抗体の濃度を、 縦軸は A490値を示す。 配列 1のぺプ チドは二匹のゥサギに免疫して得られたポリクロ一ナル抗体の E L I SAの結果 を表す。 抗体を加えることにより、 A490値が上昇していることより、 該ポリ クロ一ナル抗体が、 抗原と反応していることが分かる。
<実施例 7〉ヒ ト TRAF 5遺伝子のクローニング 1. cDN Aライブラリ一の作製
cDNAライブラリ一の作製は実施例 1の 9. と同様の方法で行った。 ただし、 マウスの単球系細胞株 J 774 A. 1細胞、 Uni— ZAP (登録商標） cDN Aライブラリーキッ ト （ストラタジーン社製） の代わりに、 それぞれ、 ヒ トの H LTV- 1を遺伝子導入した HAT 109細胞 （東京大学医科学研究所の吉田博 士から入手） 、 人 gt 1 1の cDNAライブラリ一キッ ト （ストラタジーン社製） を用いた。
2. cDNAのスクリーニング
配列表の配列番号 2で示される塩基配列のうちの 1646位から 1996位ま での部分の cDNAを、 [ひ32 P]の d CTPを Re d i p r ime ki t アマシャム社製） でラベルした。 この cDNAをプローブとして、 1で作製し た cDN Aライブラリーに、 プラークハイブリダィゼ一シヨン法 （ 『細胞工学実 験プロ 卜コール』 57— 65頁を参照。 ） を用いてスクリ一ニングしこの結果 1 9個の陽性クローンが得られた。 このクローンは全てについて DN Aシーケンス を行い、 各クローンの塩基配列を決定した。 この結果、 該 19種のクローンは 1 つの全長遺伝子の断片であることがわかった。 これらの断片よりヒ ト TRAF5 遺伝子の塩基配列を決定した。 該塩基配列を配列表の配列番号 4に示す。 また、 ヒ卜 TRAF5のアミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示す。
また、 19種のクローンのうち、 最長のもの （配列表の配列番号 4の 421位 から 1860位までを含む） を導入した形質転換体大腸菌を工業技術院生命工学 工業技術研究所 （〒305 曰本国茨城県つくば巿朿一丁目 1*3号） に平成 9 年 2月 14曰に寄託した （受託^号 F ERM BP- 582 1 ) 。 なお、 完全長 に満たない部分は他のクローンより情報を得た。
また、 マウス TRAF 5分子の構造 （図 1) と比較して、 各ドメインの位^は、 TRAFドメインが 342〜 557位ロイシンジッパーモチーフ力； 261位〜 3 03位、 Z nフィンガーモチーフが 1 1 1位〜 250位、 RINGフィ ンガーモ チーフが 45位〜 85位であることが分かる。 <実施例 8〉抗体のクロスリアクション
実施例 6で作製した抗マウス T R A F 5抗体の反応性を調べた。
1. 細胞の溶解
まず、 B J AB (バ一キット · リンフォ一マ） 、 HEK 293 (ヒ ト胎児由来 の細胞株） 、 ME 1 80 (c e r v i c a l c a r c i n oma) および F D C一 1 (f o l l i c u l a r d e n d r i t i c細胞） について、 以下のよ うにして細胞を回収後溶解させた。 細胞は各々 1 X 106 個用いた。 細胞溶解液 は、 50 mM T r i s— HC 1、 1 50 mM Na C l、 1 % NP— 40、 5 OmMョ一ドアセトアミ ド、 2mM Mg C 12 、 2 mM C a C 12 、 0. 1 % N a N3 、 1 mM EGTA、 1 mM EDTA、 1 mM N a 3 V04 、 1 mM N a F である。 この細胞溶解液 1 00 μ 1 をそれぞれの細胞のペレツ トに加え、 よく撹拌して該細胞を溶解した。
氷上に 60分間放置した後、 1 5， 000 r pm、 1 0分間の遠心分離を行い、 上清液を回収した。
2. 非特異的結合蛋白質の除去
回収した上淸液に免疫していないゥサギの I gG l mgを CNB r活性化セ ファロース . ビーズ （フアルマシア社製） に結合したビーズ 50 μ 1 を添加した。 4¾で一晚反応後、 1， 500 r pmで 5分間遠心分離を行い非特異的結合蛋白 質を除去した。
3. 電気泳動
2. で得られた液 10 /z 1を、 等量の SDS— PAGEサンプルバッファーお よび 1 μ 1の 2—メルカプトエタノールと混和し、 95^の熱処理を 5分間行つ た後、 5— 20%のグラディエント 'ゲルで電気泳動した。
4. 膜転写
電気泳動後、 トランスブロットシステム （マリソル社製） を用い、 ニトロセル ロース膜に転写した。 5. ブロッキング
ニトロセルロース膜をブロックエース （大日本製薬社製） に浸し、 1時間放置 し、 ブロッキングした。 その後、 0. 05% Twe e n 20ノ PB Sで 5分間、 2回洗浄した。
6. 抗原抗体反応
抗マウス TRAF 5抗体を 1 μ gZm 1 に P B Sで希釈後、 メンブレンに加え、 室温で 2時間反応させた。 その後、 0. 0 5% Twe e n 2 OZPB Sで 5分 間、 3回洗浄した。
7. 発色反応
次いで、 ペルォキシダ一ゼ標識抗ゥサギ I g G (カルタグ社製） を PB Sで 1 000倍希釈した液を、 ニトロセルロース膜に加え、 さらに 1時間反応させた。 その後、 0. 05% Tw e e n 20/P B Sで 5分間、 3回洗浄した。
次いで、 ECLキット （アマシャム社製） の発色液を 5m 1 メンブレンに加え、 さらに 1分間反応させた。 その後、 このニ トロセルロース膜を X線フィルムに 2 0秒間露光し、 現像した後、 写真撮影した。 その結果を図 9に示す。 図 9では、 FDC- 1細胞に約 65 k dの位置にヒ ト TRAF 5分子のパンドが見られる。 このことより、 実施例 4で得られた抗マウス T R A F 5抗体はヒ ト TRAF 5分 子にもクロスリアク トすることが明らかとなった。
<実施例 9 > TRAF会合物質の探索 2
実施例 3の方法と同様にして、 TRAF 5と CD 30との会合を調べた。 また、 TRAF 2 , TRAF 3についても、 同様にして CD 30、 LT—j3Rとの会合 を調べた。 結果を図 10に示す。 図より明らかなように、 TRAF 5は CD 30 と会合すること、 TRAF 2、 TRAF 3とも CD30、 LT一 3Rいずれとも 会合することが分かった。 なお、 図 1 0中 mo c kは何も挿入していないべクタ —プラスミ ドを導入した細胞を示す。
TRAF 1 , TRAF 2、 TRAF 3、 T R A F 4および T R A F 5について、 既知の知見と実施例 3および実施例 5の結果とを合わせて得られるそれらの機能 および構造の特徴を表 1にまとめる。 表中 +は当該特徴を有することを示し、 一 は当該特徴を有さないことを示し、 N. D.はいずれか不明であることを示す。
表 1
Figure imgf000042_0001
産業上の利用の可能性
本発明の TRAFファミ リ一分子は、 TNF— Rフアミ リーの分子の機能の解 明に有用である。 TNF— Rファミリーの分子および TNFは細胞内の分化、 增 羝、 死を引き起こす引き金となる重要な分子群であることから、 TRAFフアミ リー分子を使用し、 その解明を行うことにより、 免疫システムの分化、 癌やアポ トーシスのメカ-ズムの解明に結びつくことと考えられる。
また、 本発明の TRAFファミリー分子は、 LT一 /3 Rからのシグナル伝達の 解明および LT一 /3のシグナルの免疫反応調節剤として有用である。
本発明の抗体により、 体液中や組織中に存在する本発明の TRAFファミリー 分子の検出が可能である。 また、 該抗体により、 本発明の TRAFファミリ一分 子を精製するために使用する抗体カラムの作製、 各分画中の胲 TRAFフアミリ 一分子の検出が可能である。 本発明の抗体の活性フラグメントにより、 キメラ抗体の作製が可能である。 本発明の TRAFフアミリー分子をコ一ドする遺伝子および該遺伝子のアンチ センス鎖の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド、 その一部および それらの誘導体により、 組織や細胞における TRAFフアミリ一分子をコ一ドす る遣伝子の存在やその発現状況を調べるための研究用および診断用ポリヌクレオ チドプローブが提供される。
また、 本発明の TRAFフアミリ一分子をコ一ドする遺伝子のアンチセンス鎖 の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド、 その一部およびそれらの 誘導体により、 TRAFファミリ一分子の発現を調節することが可能である。 す なわち、 該 TRAFフアミリ一分子およびその誘導体により、 TRAFファミリ 一分子が関与するシグナル伝達系の疾患や LT— i3 Rや CD 30を介したシグナ ルが関与する疾患の治療薬が提供される。 すなわち、 該ポリヌクレオチドやその 誘導体よりァンチセンス医薬品を開発することが可能である。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 558
配列の型： アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Met Ala His Ser Glu Glu Gin Ala Ala Val Pro Cys Ala Phe lie Arg
5 10 15
Gin Asn Ser Gly Asn Ser lie Ser Leu Asp Phe Glu Pro Asp Thr Glu
20 25 30 Tyr Gin Phe Val Glu Gin Leu Glu Glu Arg Tyr Lys Cys Ala Phe Cys
35 40 45
His Ser Val Leu His Asn Pro His Gin Thr Gly Cys Gly His Arg Phe
50 55 60
Cys Gin Gin Cys lie Arg Ser Leu Arg Glu Leu Asn Ser Val Pro lie 65 70 75 80
Cys Pro Val Asp Lys Glu Val lie Lys Pro Gin Glu Val Phe Lys Asp
85 90 95
Asn Cys Cys Lys Arg Glu Val Leu Asn Leu His Val Tyr Cys Lys Asn
100 105 110
Ala Pro Gly Cys Asn Ala Arg lie lie Leu Gly Arg Phe Gin Asp His
115 120 125
Leu Gin His Cys Ser Phe Gin Ala Val Pro Cys Pro Asn Glu Ser Cys
130 135 140
Arg Glu Ala Met Leu Arg Lys Asp Val Lys Glu His Leu Ser Ala Tyr 145 150 155 160
Cys Arg Phe Arg Glu Glu Lys Cys Leu Tyr Cys Lys Arg Asp lie Val
165 170 175
Val Thr Asn Leu Gin Asp His Glu Glu Asn Ser Cys Pro Ala Tyr Pro
180 185 190
Val Ser Cys Pro Asn Arg Cys Val Gin Thr lie Pro Arg Ala Arg Val
195 200 205
Asn Glu His Leu Thr Val Cys Pro Glu Ala Glu Gin Asp Cys Pro Phe
210 215 220
Lys His Tyr Gly Cys Thr Val Lys Gly Lys Arg Gly Asn Leu Leu Glu 225 230 235 240 His Glu Arg Ala Ala Leu Gin Asp His Met Leu Leu Val Leu Glu Lys
245 250 255
Asn Tyr Gin Leu Glu Gin Arg lie Ser Asp Leu Tyr Gin Ser Leu Glu
260 265 270
Gin Lys Glu Ser Lys lie Gin Gin Leu Ala Glu Thr Val Lys Lys Phe
275 280 285
Glu Lys Glu Leu Lys Gin Phe Thr Gin Met Phe Gly Arg Asn Gly Thr
290 295 300
Phe Leu Ser Asn Val Gin Ala Leu Thr Ser His Thr Asp Lys Ser Ala 305 310 315 320
Trp Leu Glu Ala Gin Val Arg His Leu Leu Gin lie Val Asn Gin Gin
325 330 335
Pro Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ser Leu Val Asp Ala Val Asp Ser Val
340 345 350
Lys Gin Arg lie Thr Gin Leu Glu Ala Ser Asp Gin Arg Leu Val Leu
355 360 365
Leu Glu Gly Glu Thr Ser Lys His Asp Ala His lie Asn lie Hi s Lys
370 375 380
Ala Gin Leu Asn Lys Asn Glu Glu Arg Phe Lys Gin Leu Glu Gly Ala 385 390 395 400
Cys Tyr Ser Gly Lys Leu lie Trp Lys Val Thr Asp Tyr Arg Val Lys
405 410 415
Lys Arg Glu Ala Val Glu Gly His Thr Val Ser Val Phe Ser Gin Pro
420 425 430
Phe Tyr Thr Ser Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Cys Ala Arg Ala Tyr Leu
435 440 445 Asn Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gly Thr Hi s Leu Ser Leu Tyr Phe Val
450 455 460
Val Met Arg Gly Glu Phe Asp Ser Leu Leu Gin Trp Pro Phe Arg Gin
465 470 475 480
Arg Val Thr Leu Met Leu Leu Asp Gin Ser Gly Lys Lys Asn Hi s lie
485 490 495
Val Glu Thr Phe Lys Ala Asp Pro Asn Ser Ser Ser Phe Lys Arg Pro
500 505 510
Asp Gly Glu Met Asn lie Ala Ser Gly Cys Pro Arg Phe Val Ser His
515 520 525
Ser Thr Leu Glu Asn Ser Lys Asn Thr Tyr l ie Lys Asp Asp Thr Leu
530 535 540
Phe Leu Lys Val Ala Val Asp Leu Thr Asp Leu Glu Asp Leu
545 550 555 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 2 5 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c D N A t o m R NA
配列
GGAACGAGTG TCGAGGCGAA GCAGCCTAGT GCCCGCCGCC GTAGGGCGCC AGCGGAGCTC 60 CGCGAGCCCC GCAAGTGGCG AAGTCCGGGT GAGCTAACCG TCCCGGCTCC TCAGAAACCG 120 AAAGCAACTC AGGGTGGTGA GCCGGAGGCG TGTGTGGTAG CGGGCGAACT GAGGCGACGC 180 GGGACACCCG CGCCCGGCCG AGGGCACTTT TGCAAGACTT GTGAGCACAG CCCGTTAACG 240 TGAGCTTAAT GCCAGGGTCT CGAGCCTGCG CCGGTGCTAT AGCGCGTGCT CGATTGGAAA 300 CAGAACCCGA CTCTGCAGAA GA ATG GCT CAT TCG GAG GAG CAA GCG GCT GTC CCC 355
TGC GCC TTC ATC CGC CAG AAC TCT GGC AAC TCA ATT TCC TTG GAC TTT 403 GAG CCC GAC ACC GAG TAC CAG TTT GTG GAG CAG CTG GAA GAA CGC TAC 451 AAA TGT GCC TTC TGC CAC TCC GTG CTT CAC AAC CCC CAC CAG ACC GGC 499 TGC GGG CAC CGC TTC TGC CAG CAG TGC ATC CGG TCT CTG AGA GAA TTG 547 AAC TCG GTG CCG ATC TGC CCG GTA GAC AAG GAG GTC ATC AAG CCT CAG 595 GAG GTG TTC AAA GAC AAC TGC TGC AAA AGA GAA GTT CTC AAT TTA CAC 643 GTC TAC TGC AAA AAC GCC CCC GGG TGC AAT GCC AGG ATT ATT CTG GGA 691 CGA TTC CAG GAC CAC CTT CAG CAC TGT TCC TTC CAA GCC GTG CCC TGC 739 CCT AAC GAG AGC TGC CGG GAA GCC ATG CTC CGG AAA GAC GTG AAA GAG 787 CAC CTG AGC GCA TAC TGC CGG TTC CGA GAG GAG AAG TGC CTT TAC TGC 835 AAA AGG GAC ATA GTG GTG ACC AAC CTG CAG GAT CAT GAG GAA AAC TCG 883 TGT CCT GCG TAC CCA GTG TCT TGT CCC AAC AGG TGT GTG CAG ACT ATT 931 CCA AGA GCT AGG GTG AAT GAA CAC CTT ACT GTA TGT CCT GAG GCT GAG 979 CAA GAC TGT CCC TTT AAG CAC TAT GGC TGC ACT GTC AAG GGT AAG CGG 1027 GGG AAC TTG CTG GAG CAT GAG CGG GCA GCC CTG CAG GAC CAC ATG CTT 1075 CTG GTT TTA GAG AAG AAC TAC CAA CTA GAA CAG CGG ATC TCT GAT TTA 1123 TAT CAG AGT CTC GAA CAG AAG GAA AGC AAG ATC CAG CAG CTG GCA GAA 1171 ACC GTG AAG AAG TTC GAA AAG GAG CTT AAG CAG TTC ACA CAG ATG TTT 1219 GGC AGA AAT GGA ACT TTC CTC TCA AAT GTC CAG GCT CTC ACC AGT CAC 1267 ACG GAC AAG TCA GCT TGG CTG GAA GCG CAG GTG CGG CAT CTG CTA CAA 1315 ATA GTT AAC CAG CAG CCA AGT CGA CTT GAT CTG AGG TCT TTG GTG GAT 1363 GCG GTT GAC AGC GTG AAA CAG AGG ATC ACC CAG CTG GAA GCC AGT GAC 1411 CAG AGA TTA GTT CTT TTA GAG GGG GAG ACC AGC AAG CAC GAC GCA CAC 1459 ATT AAT ATC CAC AAA GCA CAG CTG AAT AAG AAC GAA GAG CGG TTT AAG 1507 CAG CTG GAG GGC GCC TGC TAC AGT GGC AAG CTC ATC TGG AAG GTG ACA 1555
GAT TAC AGG GTG AAG AAG AGG GAG GCC GTG GAG GGG CAC ACA GTG TCC 1603
GTC TTC AGC CAG CCT TTC TAC ACC AGC CGC TGC GGC TAC CGG CTC TGT 1651
GCC AGG GCG TAC CTG AAC GGG GAC GGG TCG GGG AAG GGA ACG CAC CTG 1699
TCC CTG TAC TTT GTG GTG ATG CGC GGT GAG TTT GAC TCG CTG CTG CAG 1747
TGG CCG TTC AGG CAG AGG GTG ACC CTG ATG CTT TTG GAC CAG AGC GGC 1795
AAG AAG AAC CAT ATT GTG GAG ACC TTC AAA GCT GAC CCC AAC AGC AGC 1843
AGC TTC AAA AGG CCA GAT GGC GAG ATG AAC ATT GCC TCT GGC TGT CCC 1891
CGC TTT GTG TCG CAC TCT ACT CTG GAG AAC TCC AAG AAC ACC TAC ATT 1939
AAA GAC GAC ACA CTG TTC TTG AAA GTG GCC GTG GAT TTA ACT GAC TTG 1987
GAG GAT CTG TAG TGTTACCTGA TAAGGAAACT TCTCAGCACA GGAAAAGGTG 2039
TGGCTGTCCC TTGGGCGCAG CCCTCTGGAC TGAGCAGGCT CTTGTTCTTG TCTTCCTGCC 2099
TCCGATGTCT GATGTGTCAT CTTTTTATCT TGGATCCTTC CCTGGTTTGA AACTTTAAAC 2159
TCTTGAAATA TTGCTGTTAT TTATATTTTT GTATCTTCCA AAAAATTATA ATAATTTGAC 2219
AACCCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2254 配列番号： 3
E列の長さ ： 5 5 7
配列の型： アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
列
Met Ala Tyr Ser Glu Glu His Lys Gly Met Pro Cys Gly Phe lie Arg
5 10 15
Gin Asn Ser Gly Asn Ser lie Ser Leu Asp Phe Glu Pro Ser lie Glu 20 25 30
Tyr Gin Phe Val Glu Arg Leu Glu Glu Arg Tyr Lys Cys Ala Phe Cys
35 40 45
His Ser Val Leu His Asn Pro His Gin Thr Gly Cys Gly His Arg Phe
50 55 60
Cys Gin His Cys lie Leu Ser Leu Arg Glu Leu Asn Thr Val Pro lie 65 70 75 80
Cys Pro Val Asp Lys Glu Val lie Lys Ser Gin Glu Val Phe Lys Asp
85 90 95
Asn Cys Cys Lys Arg Glu Val Leu Asn Leu Tyr Val Tyr Cys Ser Asn
100 105 110
Ala Pro Gly Cys Asn Ala Lys Val lie Leu Gly Arg Tyr Gin Asp His
115 120 125
Leu Gin Gin Cys Leu Phe Gin Pro Val Gin Cys Ser Asn Glu Lys Cys
130 135 140
Arg Glu Pro Val Leu Arg Lys Asp Leu Lys Glu His Leu Ser Ala Ser 145 150 155 160
Cys Gin Phe Arg Lys Glu Lys Cys Leu Tyr Cys Lys Lys Asp Val Val
165 170 175
Val lie Asn Leu Gin Asn His Glu Glu Asn Leu Cys Pro Glu Tyr Pro
180 185 190
Val Phe Cys Pro Asn Asn Cys Ala Lys lie lie Leu Lys Thr Glu Val
195 200 205
Asp Glu His Leu Ala Val Cys Pro Glu Ala Glu Gin Asp Cys Pro Phe
210 215 220
Lys Hi s Tyr Gly Cys Ala Val Thr Asp Lys Arg Arg Asn Leu Gin Gin 225 230 235 240
His Glu His Ser Ala Leu Arg Glu His Met Arg Leu Val Leu Glu Lys
245 250 255
Asn Val Gin Leu Glu Glu Gin lie Ser Asp Leu His Lys Ser Leu Glu
260 265 270
Gin Lys Glu Ser Lys l ie Gin Gin Leu Ala Glu Thr l ie Lys Lys Leu
275 280 285
Glu Lys Glu Phe Lys Gin Phe Ala Gin Leu Phe Gly Lys Asn Gly Ser
290 295 300
Phe Leu Pro Asn lie Gin Val Phe Ala Ser Hi s lie Asp Lys Ser Ala 305 310 315 320
Trp Leu Glu Ala Gin Val Hi s Gin Leu Leu Gin Met Val Asn Gin Gin
325 330 335
Gin Asn Lys Phe Asp Leu Arg Pro Leu Met Glu Ala Val Asp Thr Val
340 345 350
Lys Gin Lys lie Thr Leu Leu Glu Asn Asn Asp Gin Arg Leu Ala Val
355 360 365
Leu Glu Glu Glu Thr Asn Lys His Asp Thr His lie Asn lie Hi s Lys
370 375 380
Ala Gin Leu Ser Lys Asn Glu Glu Arg Phe Lys Leu Leu Glu Gly Thr 385 390 395 400
Cys Tyr Asn Gly Lys Leu li e Trp Lys Val Thr Asp Tyr Lys Met Lys
405 410 415
Lys Arg Glu Ala Val Asp Gly His Thr Val Ser lie Phe Ser Gin Ser
420 425 430
Phe Tyr Thr Ser Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Cys Ala Arg Ala Tyr Leu 435 440 445
Asn Gly Asp Gly Ser Gly Arg Gly Ser His Leu Ser Leu Tyr Phe Val
450 455 460
Val Met Arg Gly Glu Phe Asp Ser Leu Leu Gin Trp Pro Phe Arg Gin
465 470 475 480
Arg Val Thr Leu Met Leu Leu Asp Gin Ser Gly Lys Lys Asn lie Met
485 490 495
Glu Thr Phe Lys Pro Asp Pro Asn Ser Ser Ser Phe Lys Arg Pro Asp
500 505 510
Gly Glu Met Asn li e Ala Ser Gly Cys Pro Arg Phe Val Ala Hi s Ser
515 520 525
Val Leu Glu Asn Ala Lys Asn Ala Tyr lie Lys Asp Asp Thr Leu Phe
530 535 540
Leu Lys Val Ala Val Asp Leu Thr Asp Leu Glu Asp Leu
545 550 555 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 8 9 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： c D NA t o m R N A
配列
CTTGTTGTGC CTGACGGAAG AGCAAGACGG CCACAATTCA GACGCACGTG AGGGAAATCA 60 GATGACTGGA CTTGTAGATA CTAACGGTTC TGAAGCGGA 99 ATG GCT TAT TCA GAA GAG CAT AAA GGT ATG CCC TGT GGT TTC ATC CGC 147 09
S6ET 001 0V3 3DV Dli OIV 331 Did VOV OVO 300 IVO 019 930 OVO VDV OW
Ln\ 3VV OIV OW DVI IVO V3V 010 OW 091 iiV 313 OW V90 IVV IVl 301 662T 13V 100 9VD 010 013 VW 111 VOO OVO VV9 IVV VW 10V 013 OVD V30
\SZ\ WV IVO IIV IVV IIV 3V3 33V IVO IVO VW OW 13V WO OVO VVO VLL Zl 110 333 ViX VOV W3 IVO IW DVV WO VIO 013 33V iiV VW 0V3 VW 9ST 1 910 VOV IVO 110 VOO WO OIV Oil 133 VOV 010 OVO 111 WV XW W3
LOU WD OVD OW 110 01V WD VII VII W3 IVD 010 VVO 130 VVO VIO 001
6S0T 100 VOX OW 3V0 XXV 3V3 XOV 333 ill 丄丄 3 0V3 OIV OW V33 3X3 311
ΠΟΐ 30V VOO IW WV 300 1X1 Oli 0V3 VDO 111 DVD OW Oil DVO 9W WO
E96 113 VW OW ViV 13V VV9 VOO VXD OVD 9VD DIV VW 10V VVO VW OVD
SI 6 W9 ViO 30V DVV 3V3 Vll 3V0 131 IiV OVO W9 VVO VII VVD 310 丄
L9S OW VVO Vll 110 Oil IDD OIV DVD 9V0 0ΰ3 VII 300 VOL IVD 9V0 IVD
618 WO OVD 0X3 DVV OOV 9D3 VW 1V9 03V VI9 130 131 300 IVI 3VD OW
IZZ 111 133 101 DVO VVO DVO 1D9 WO 133 101 VIO X09 913 DVD VVO XVO
VIO OVO IDV WV VI3 丄丄 V IXV OW 030 101 IVV DW 333 XOl 1X1 VXO
SZ,9 V33 DVI W9 133 101 Oil DVV WO 0V9 XV3 IVV OVD VI3 IVV DIV 310
LZ9 VIO 910 XVO DVV VW 301 IVI HO 30X VW OW VOO lil OVD 丄； XL
6 9 DDI 039 IOV 911 IVD OVO VW 013 OVO VW D93 VXD 3X9 VD3 9V9 D03
1£9 301 DW OVO 丄 VV 101 101 0V3 DID IDO VV3 111 VII DOX OVO OVD 丄丄 0 £8 DVO IV9 OVO DVI 003 300 013 IXV 119 9W 300 IW 101 VDO I3D 130
S IVV 3DV 301 IVI VXO IVl VXl DVV 313 319 W9 VOV VW 301 101 IW
Z8£ 3V0 VW ill 110 9V0 OVO XDI WV OXV 310 OVO VW IVO VIO 133 3丄
6£E DIV VOD OXO VOV OW Vll VVO VOV 9XD DDL 010 OIV DOI OVD 9V3 301
Ϊ6Ζ Oil 3D3 3V3 090 IOX VOO VOV 0V3 DVO 333 3VV DVD 113 910 031 3V3
301 311 030 101 VW OVX DOO OVO WO Oil OOD 3V3 019 XII 9 3 OVX
961 OVO VIV I9V ODD OVO 111 3V0 Oil DDI IIV 331 DW 093 DDI IW OVO
7IS00/Z.6dT/X3«[ 0lTie/£6 OAV TTC TAC ACC AGC CGC TGT GGC TAC CGG CTC TGT GCT AGA GCA TAC CTG 1443
AAT GGG GAT GGG TCA GGG AGG GGG TCA CAC CTG TCC CTA TAC TTT GTG 1491
GTC ATG CGA 1500
GGAGAGTTTG ACTCACTGTT GCAGTGGCCA TTCAGGCAGA GGGTGACCCT GATGCTTCTG 1560
GACCAGAGTG GCAAAAAGAA CATTATGGAG ACCTTCAAAC CTGACCCCAA TAGCAGCAGC 1620
TTTAAAAGAC CTGATGGGGA GATGAACATT GCATCTGGCT GTCCCCGCTT TGTGGCTCAT 1680
TCTGTTTTGG AGAATGCCAA GAACGCCTAC ATTAAAGATG ACACTCTGTT CTTGAAAGTG 1740
GCCGTGGACT TAACTGACCT GGAGGATCTC TAGTCACTGT TATGGGGTGA TAAGAGGACT 1800
TCTTGGGGCC AGAACTGGAG GAGAGCACAT TTGATTATCA TATTGACCTG GATTTAGACT 1860
CAAAGCACAT TTGTATTTGC CTTTTTCCTT AACGTTTGAA GTCAGTTTAA AACTTCTGAA 1920
GTGCTGTCTT TTTACATTTT ACTCTGTCCC AGTTTGAAAC TTAAAACTCT TAGAATATTC 1980
TCTTATTATT TATATTTTTA TATTTCTTGA AAGATGGTAA GTTTCTTGAA GTTTTTGGGG 2040
CGTTTCTCTT TTACTGGTGC TTAGCGCAGT GTCTCGGGCA CTCTAAATAT TGAGTGTTAT 2100
GGAGGACACA GAGGTAGCAG AATCCCAGTT GAAAATGTTT TGATATTTTA TTGTTTGGCC 2160
TATTGATTCT AGACCTGGCC TTAAGTCTGC AAAAGCCATC TTTATAAGGT AGGCTGTTCC 2220
AGTTAAGTAG TGGGTGATGT AGTTACAAAG ATAATATGCT CAGTTTGGAC CTTTTTTTCA 2280
GHAAATGCT AAATATATGA AAATTACTAT ACCTCTAAGT ATTTTCATGA AATTCACCAG 2340
CAGTTTGCAA GCACAGTTTT GCAAGGCTGC ATAAGAACTG GTGAATGGGG TAAGCATTTT 2400
CATTCTTCCT GCTGAAGTAA AGCAGAAAGT ACTGCATAGT ATATGAGATA TAGCCAGCTA 2460
GCTAAAGTTC AGATTTTGTT AGGTTCAACC CTATGAAAAA AACTATTTTC ATAGGTCAAA 2520
AATGGTAAAA AATTAGCAGT TTCATAAGAT TCAACCAAAT AAATATATAT ATACACACAC 2580
ACATACATAT ACACCTATAT ATGTGTGTAT ACAAACAGTT CGAATGTATT TTGGTGACAG 2640
TAATAAATCA ATGTGAGGAT GGATAGAATT TAGTATATGA TAGAGAAAAT GTCATAAATG 2700
GATAAAAGGA ATTTACAACT TGAGGAGAAA ACCTTTACAA TTTCCTATGG GTGTCAGAAG 2760
TACTCTCAGC GAAAACTGAT GGCTAAAACA GTATCTACTA TTCTCTGATA ACTTTTTTTC 2820
TGAGACAGAG TTTCATTGTC ACCCAGGCTG GAGTACAGTG GCATGATCTC AGCTCACTGC 2880 AAACTCTGCC TCCC 2894
配列番号： 5
配列の長さ ： 42
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA t o mRNA
配列
AATTGATGTA CCCATAGGAT GTTCCAGATT ACGCTGAATT CC 42 配列番号： 6
配列の長さ ： 42
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA t o mRNA
配列
TCGAGGAATT CAGCGTAATC TGGAACATCG TATGGGTACA TC 42

Claims

請求の範囲
1. リンホトキシン一 ;3レセプタ一 （LT— /3R) および CD 30との会合性と、 DN A結合性蛋白質の DN A結合活性誘導性と、 CD 40または TNF— R 2と の非会合性とを有し、 さらにロイシンジッパーモチーフまたはコイルドコイル構 造を有することを特徴とする TRAFファミリ一分子。
2. 請求項 1に記載の TR A Fファミリー分子であって、 さらに、 配列表の配列 番号 2に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイプリダイズする DNA によってコードされる蛋白質であることを特徴とする TRAFフアミリ一分子。
3. 請求項 1又は 2のいずれか 1項に記載の TRAFファミリ一分子であって、 さらに、 配列表の配列番号 1または 3のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部を 有することを特徴とする TRAFフアミリ一分子。
4. 配列表の配列番号 1または 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる TR AFファミリー分子であって、 前記アミノ酸配列の一部のアミノ酸を置換、 欠失 または付加することにより改変され、 かつ、 リンホトキシン一 レセプター （L T- /3 R) および CD 30との会合性と、 CD40または TNF— R 2との非会 合性と、 D N A結合性蛋白質の D N A結合活性誘導性とを有することを特徴とす る TRAFフアミリ一分子。
5. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の TRAFフアミリ一分子をコードする ポリヌクレオチド。
6. 請求項 5に記載のポリヌクレオチドの連続する 12塩基以上の一部であるポ リヌクレオチド。
7. 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の TRAFフアミ リー分子に対する抗体。
8. 請求項 5に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
9. 請求項 8に記載の発現べクタ一で形質転換されたことを特徴する形質転換体。
10. 請求項 5または 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドのアンチセン スポリヌク レオチド。
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