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WO1997017374A1 - Recombinant ligands for the human cell membrane antigen cd30 - Google Patents

Recombinant ligands for the human cell membrane antigen cd30 Download PDF

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Publication number
WO1997017374A1
WO1997017374A1 PCT/EP1996/004765 EP9604765W WO9717374A1 WO 1997017374 A1 WO1997017374 A1 WO 1997017374A1 EP 9604765 W EP9604765 W EP 9604765W WO 9717374 A1 WO9717374 A1 WO 9717374A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ligands
seq
recombinant
sequences
fragments
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP1996/004765
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Andreas Ziegler
Harald Stein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Original Assignee
Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH filed Critical Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority to AU74971/96A priority Critical patent/AU7497196A/en
Publication of WO1997017374A1 publication Critical patent/WO1997017374A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel recombinant DNA molecules which code for variable immunoglobulin chains or fragments thereof which have specificity for the human cell membrane antigen CD30.
  • the invention further relates to expression vectors which contain these DNA molecules, and to host cells transformed therewith which are capable of producing the novel ligands.
  • a method for the production of ligands of the specified specificity using the transformed host cells, the resulting ligands and diagnostic and pharmaceutical preparations containing them are provided.
  • the CD30 antigen is a glycoprotein with a molecular mass of 120 kD when determined by SDS electrophoresis.
  • the special thing about the CD30 antigen is that it is normally only present in the organism on very few activated T-cell and B-cell blasts and only in low density on these (Stein et al., "Identification of Hodgkin and Sternberg-Reed cells as a unigue cell type derived from a newly detected small cell population ", Int. J. Cancer, 30, pp.
  • Ber-H2 a new monoclonal antibody of the Ki-1 family for the detection of Hodgkin's disease in formaldehyde-fixed tissue sections (A2.13) ", in: Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens, AJ McMichael, ed., Oxford University Press, Oxford - New York - Tokyo, pp. 574-575, 1987), but it is expressed in a much higher concentration in a number of lymphoproliferative processes and in embryonic carcinomas.
  • the strong CD30-positive malignant lymphomas primarily include Hodgkin's lymphomas, anaplastic large cell lymphoma and the acute form of adult T-cell leukemia.
  • CD30 molecule Because of the extremely rare occurrence of the CD30 molecule in the normal organism and the high expression of this molecule on the tumor cells of the above-mentioned lymphomas and the embryonic carcinoma, as well as on activated T H 2 blasts, one is due to the expression of the CD30 molecule Establishing diagnostics and therapy an important strategy for the detection and treatment of the named diseases.
  • CD30-positive forms of cancer The primary diagnosis of CD30-positive forms of cancer is currently carried out immunohistologically, with only antibodies from the mouse such as Ber-H2 currently being used as antibodies.
  • This reagent is a monoclonal antibody directed against the CD30 molecule, which was briefly described in 1987 and in 1989 in detail by the inventors' working group (Schwarting et al., "Ber-H2: a new anti-Ki -1 (CD30) monoclonal antibody directed at a formol-resistant epitope ", Blood, 74, pp. 1678-1689, 1989).
  • the spread diagnosis of the tumor diseases mentioned is generally carried out by means of computer tomography, sonography and / or lymphography.
  • the non-invasive spreading diagnosis mentioned has the disadvantage that only relatively large tumor masses can be identified, but smaller tumors or metastases cannot be detected.
  • the surgical spreading diagnosis, which is therefore often used additionally, is very stressful for the patient and limited to certain body cavities (eg, abdominal cavity).
  • the currently only medically accepted and therefore used standard therapy for CD30-positive tumors is carried out with non-specific radio and / or chemotherapy.
  • the first follow rate is approximately 60-70%, there has been no curative concept for therapy failures so far.
  • the monoclonal antibody Ber-H2 was conjugated with plant poisons and experimentally used to treat patients with Hodgkin's disease in the terminal phase of the disease (Falini et al., "Response of refractory Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339, p 1195-1196, 1992).
  • the four treated patients showed a tumor mass reduction of 50% to almost 100% within 10 days. In all cases, however, tumor masses reappeared at the old and / or new locations after different times. Repetition of the immunotoxin application was not possible because the patients treated in this way had formed antibodies against the mouse antibody Ber-H2 without exception.
  • variable regions of the heavy (V H ) and light (V L ) chain of a mouse antibody to the corresponding constant regions C H and C L of a human antibody molecule.
  • This manipulation largely eliminates the areas of the antibody molecule that are immunogenic for humans, while the specificity of the original mouse antibody in the chimeric molecule is usually retained.
  • the object of the present invention is therefore to provide new CD30-specific substances with reduced immunogenicity. Furthermore, the instability of the cell line Ber-H2 can be improved in terms of monoclonal antibody production.
  • recombinant DNA molecules which code for variable immunoglobulin chains or fragments thereof, which have specificity for the human cell membrane antigen CD30, the recombinant DNA molecules being sequences in accordance with one or more of the SEQ ID NOS : 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof, which are preferably operatively linked in whole or in part. It is further preferred that these sequences or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof are operatively linked to DNA sequences which code for constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule.
  • sequences, fragments and variants which are derived from the same or homologous gene and for the immunoglobulin chains or fragments thereof according to the invention encode.
  • the recombinant DNA molecules each comprise one or more of the hypervariable regions (which are also referred to as CDR for "complementarity determining residences") which are contained in SEQ ID NOS: 1 or 3 or in SEQ ID NOS: 4 or 6 specified sequences or syngeneic or allelic variants thereof.
  • the sequences given in SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof can be operatively linked to DNA sequences which code for toxic proteins or enzymes.
  • expression vectors which contain one or more of the recombinant DNA molecules mentioned in operative linkage with expression control sequences and are preferably suitable for expression in procaryte and / or eukaryote host cells.
  • the invention furthermore provides host cells which are transfected with the expression vectors mentioned, prokaryote or eukaryote cells being suitable, the ones obtained from the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) on August 8, 1995 under the Access number DSM ACC2224 according to the provisions of the Budapest Treaty, eukaryotic cell CH-BerH2 is preferred.
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
  • a method for the production of ligands for the human cell membrane antigen CD30 in which one of the host cells mentioned is cultivated in a suitable nutrient medium, then the cells are separated from the medium and the ligands as expression products from or from the medium isolated from the cytoplasm of the host cells.
  • the ligands are then preferably purified and formulated with conventional auxiliaries and carriers to give pharmaceutical or diagnostic preparations.
  • recombinant ligands for the human cell membrane antigen CD30 comprise at least the amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: 2 and / or 5.
  • These ligands preferably each comprise one or more of the hypervariable CDR regions of the amino acid sequences or syngeneic or allelic variants indicated in SEQ ID NOS: 2 and / or 5 the same.
  • 2 and / or 5 amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: are linked to one another.
  • these sequences or fragments or all variants thereof can preferably be linked to constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule.
  • the recombinant ligands mentioned above are linked peptically or via linker molecules to toxic proteins or to enzymes or proenzymes, the toxins preferably being in the form of ribosome-inactivating proteins and the enzymes preferably being selected from the group of the phosphodiesterases are.
  • the above-mentioned recombinant ligands are linked covalently or conjugated directly or via linker molecules to photoactivatable compounds or to radioactive isotopes, the latter preferably from the group consisting of indium, iodine, yttrium, technetium, Rhenium, copper and lutetium are selected.
  • the linkage can take place, for example, using chelating agents or via photochemical activation processes (cf. WO 94/04189).
  • diagnostic or pharmaceutical preparations which preferably contain one or more of the above-mentioned ligands or those produced by the process according to the invention, optionally in combination with conventional carriers and diluents.
  • common carriers are water, physiological saline, alcohols, polyethylene glycols, glycerol esters, gelatin, carbohydrates such as lactose and starch, calcium carbonate, magnesium stearate, talc.
  • Usual additives are, for example, preservatives, lubricants, wetting agents and emulsifiers, colorants, taste correctives and flavorings.
  • the choice of carriers and additives depends on whether the preparations according to the invention are to be administered enterally, parenterally or locally. Examples of the invention Future dosage forms are solutions, dragees, capsules, tablets, injection and infusion solutions as well as transdermal patches.
  • preparations are preferably used for the diagnosis and / or treatment of forms of cancer such as, in particular, Hodgkin's disease, in which the human cell membrane antigen CD30 is expressed on cells which are important for the disease.
  • V L J variable region of the light
  • V H DJ heavy chains
  • the cytoplasmic RNA was first isolated from cultured cells of the mouse myeloma hybrid line which produce the antibody Ber-H2. Then, with the help of the reverse transcriptase, a cDNA synthesis of V L J and V H DJ was carried out, the oligonucleotides used below being complementary to the 5 'end of the constant regions of the L and H chains :
  • oligonucleotides konLl or konHl already used for cDNA synthesis were used as 3 'primers.
  • the cDNAs were amplified with the 3'-oligonucleotides konL2 or konH2 given below and with the anchor primer indicated at the 5 'end, each of which carried overhanging restriction sites:
  • the fragments obtained were cloned into commercially available sequencing vectors (e.g. using the vector pGEM -HZf (+) from Promega, Heidelberg).
  • the sequence analyzes showed that the V gene segment of the light chain of the mAb Ber-H2 was recombined with the J 2 gene segment and that of the heavy chain with the J 3 gene segment.
  • 5 'primer sequences could be determined and synthesized in a further step, which are in the untranslated region of the respective gene. Since the intron sequences of all J-minigens are known and accessible via gene banks, 3 'primer sequences which lie in the non-coding region of the DNA of the mouse myeloma hybrid line could also be derived therefrom. In this way it was possible to clone this genomic DNA in a directed manner after PCR amplification without changing the original gene structure (5'-UTR - exon 1 - intron-exon 2 - J-intron).
  • V L J or V H DJ PCR products were then first cloned into suitable sequencing vectors and the "insert" regions of three clones were completely sequenced. In parallel, the PCR products were called Reference sequenced directly. After checking the correct reading frame and the absence of stop codons within the cloned DNA, a clone which was homologous to the PCR products was recloned into the corresponding expression vectors (pUHW ⁇ l or pUHW k ). These vectors contained the sequences coding for the constant parts of a human antibody, a murine / human intron hybrid, a selection marker, and the mouse promoter and enhancer elements required for efficient expression.
  • the advantage of the DNA sequences according to the invention or their products set out here compared to the prior art is, on the one hand, in the far lower immunogenicity in the human body and, on the other hand, in their diverse manipulation possibilities, which are based on the knowledge of the DNA sequences result. For example, it is possible to produce a protein with CD30 specificity in bacteria or insect cells at a much lower cost. than in conventional cell culture. Knowledge of the sequences also enables coupling to other DNA sequences which code for activating or toxic proteins, enzymes or ligands from defense cells. Furthermore, fragments of the total sequences, such as isolated hypervariable regions, can be used for the synthesis of corresponding protein fragments.
  • the pelleted cytoplasmic RNA was obtained, dissolved in distilled water, by PIC extraction (50% by volume phenol, 48% by volume CHC1 3 , 2% by volume .-% isoamyl alcohol) purified and precipitated with ethanol. The precipitates were stored at -80 ° C until further processing.
  • RNA corresponding volume of the precipitate obtained in Example 1 was used for cDNA synthesis.
  • the Precipitate was centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes, washed with 300 ⁇ l of 70% ethanol, and the RNA was dissolved in 15 ⁇ l of H 2 O.
  • the mixture was subsequently denatured for 20 minutes at 45 ° C. with 375 ⁇ l DMSO, precipitated with ethanol and, after 15 minutes of centrifugation at 4 ° C. and 14,000 rpm and after washing with 70% ethanol, dissolved in 5 ⁇ RT buffer.
  • the reaction mixture for the reverse transcriptase contained 1 mM each of the four dNTP's, 1 ⁇ g c ⁇ or c ⁇ primer, 1000 units MMLV reverse transcriptase (BRL), 20 ⁇ Ci [ 32 P] dCTP, 2 units RNAse Block 2 ( Stratagene) and H 2 0 up to a final volume of 100 ⁇ l.
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes and then the RNA was treated with 50 ⁇ g RNAse at 42 ° C. for 30 minutes.
  • the approach for the subsequent "tailing" reaction of the cDNA contained 1 mM dGTP, 100 mM Na cacodylate, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1 mM CoCl 2 , 2 ⁇ g BSA, 33 units terminal deoxynucleotide transferase (BRL), 5 ⁇ l cDNA and water up to a final volume of 20 ⁇ l.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes. After PIC extraction, ethanol precipitation and washing of the nucleic acid according to Example 1, the DNA obtained, after dissolving in 20 ⁇ l of water and producing a series of dilutions, was fed to the subsequent PCR method.
  • the DNA from Example 2 was amplified in a first PCR reaction with the aid of a poly-C anchor primer (AN-Poly-C) and the corresponding 3'c primer (konLl or konHl) Letter c refers to the constant range.
  • the reaction mixture contained 10 ng of the primer AN-poly-C-oligo, 100 ng anchor primer, 100 ng konLl- or konHl-oligo, 2 ⁇ l lOx PCR buffer (2 mM dNTP's, 10 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-HCl , 500 mM KC1, pH 8.4), 2 units of Taq polymerase, 5 ⁇ l cDNA and water to a final volume of 20 ⁇ l.
  • the reaction was carried out according to the following PCR program: 5 minutes 94 ° C, 5 cycles of 1 minute 94 ° C, 2 minutes 42 ° C, 1 minute 72 ° C, 30 cycles of 1 minute 94 ° C, 1 minute 42 ° C, 1 minute 72 ° C and 10 minutes 72 ° C.
  • the DNA molecules obtained in this way were applied to an agarose gel and separated electrophoretically.
  • the bands corresponding to V ⁇ and V ⁇ were cut out and eluted in 100 ⁇ l of H 2 012 hours at 4 ° C.
  • both the vector pGEM®-HZf (+) (Promega, Heidel ⁇ berg) and the cDNA obtained were incubated with the restriction enzymes EcoRI and Sall for 1 hour at 37 ° C.
  • the vector and cDNA were up an agarose or polyacrylamide gel, then transferred to an NA-45 membrane (Schleicher & Schull, Dassel) and eluted for 30 minutes at 65 ° C. with IM NaCI in 1 ⁇ TE.
  • the eluates were precipitated according to Example 1 with ethanol, centrifuged, washed and dissolved in H 2 0. The subsequent ligation reaction took place at 16 ° C. for 12 hours, the mixture containing 2 units of T4 DNA ligase (New England Biolabs, Boston, USA), 1 mM ATP and 5 ⁇ ligase buffer and the molar ratio of Plasmid to cDNA was 1: 2. The ligation mixture was then mixed with 200 ⁇ l bacterial suspension for the transformation of competent E.
  • coli bacteria (XL 1 blue) and first for 30 minutes at 0 ° C., then for 2 minutes at 42 ° C., then for 5 minutes at 0 ° C and finally after the addition of 1 ml LB medium for 1 hour at 37 ° C in a shaker.
  • 200 ⁇ l of the mixture were plated on agar plates containing antibiotics and incubated at 37 ° C. overnight.
  • the resulting individual colonies were then inoculated in LB ampicillin medium and incubated overnight at 37 ° C. in a shaker.
  • a plasmid preparation was then carried out with the bacterial culture obtained in this way and the cloning success was checked after restriction digestion and subsequent application of the mixture to an agarose gel.
  • the positive clones were then alkaline denatured for 30 minutes at 37 ° C. with 0.2N NaOH. After ethanol precipitation, centrifugation and washing of the precipitate according to Example 1, the DNA was dissolved and an aliquot was loaded onto an agarose gel for quantity estimation.
  • the cloned cDNA and the genomic DNA were sequenced using the method of Sanger (F. Sanger, S. Nicklen and
  • primer sequences were determined and synthesized in a second step in order to amplify the genomic DNA.
  • 5 'oligonucleotides given below
  • the primers also contained the restriction sites necessary for cloning in expression vectors.
  • the genomic DNA was amplified using these primers.
  • the PCR reaction (5 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer (1.5 mM MgCl 2 , 200 mM dNTP's, 500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3), 2.5 units Taq polymerase (Perkin Bucket, Kochlingen), 5 ⁇ M primer each, 5 ⁇ l genomic DNA from a dilution series, ad 50 ⁇ l H 2 0) was carried out with the following program: 5 minutes 95 ° C, 26 cycles of 1 minute 94 ° C, 2 minutes 55 ° C, 2 minutes 72 ° C, 7 minutes 72 ° C.
  • VJ or VDJ PCR products were first cloned into sequencing vectors (pGEM ®
  • Example 5 as well as the expression vectors pUHW ⁇ and pUHW ⁇ l
  • the prepared plasmids for light and heavy chains were used for the stable transfection with the restriction enzymes EcoRI or
  • the antibiotic G418 was initially added to the medium 48 hours after sowing in a concentration of 800 ⁇ g / ml, although the concentration was increased to 1200 ⁇ g / ml after 12 days. After 15 days, primary cultures whose culture supernatants reacted with L428KS cells in indirect immunofluorescence could be identified. These transfectants were cloned, recloned and supernatants were again analyzed for L428KS cells using a flow cytometer. Individual supernatants were also examined against CD30-negative cells, for example the cell line KG-1, and as expected no reaction could be detected.
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • microorganism referred to under I was received by this internal depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this first deposit into a deposit according to the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion)

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Abstract

The invention relates to novel recombinant DNA molecules or parts thereof which code for variable immunoglobulin chains, or fragments thereof, having specificity for the human cell membrane molecule CD30. Also produced are expression vectors containing the novel DNA molecule and host cells transformed with those expression vectors and capable of producing the novel ligands. Also described is a process for producing ligands of the designated specificity with the aid of the transformed host cells, the resulting ligands themselves, and diagnostic and pharmaceutical preparations containing them.

Description

Rekombinante Ligaπden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 Recombinant ligands for the human cell membrane antigen CD30

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige rekombinante DNA- Moleküle, welche für variable Immunglobulinketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmem¬ bran-Antigen CD30 aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner Ex- pressionsvektoren, die diese DNA-Moleküle enthalten, sowie damit transformierte Wirtszellen, die in der Lage sind, die neuartigen Liganden zu produzieren. Darüber hinaus werden ein Verfahren zur Herstellung von Liganden der bezeichneten Spezifität unter Ver¬ wendung der transformierten Wirtszellen, die daraus resultieren¬ den Liganden sowie diese enthaltende diagnostische und pharma¬ zeutische Präparate bereitgestellt.The present invention relates to novel recombinant DNA molecules which code for variable immunoglobulin chains or fragments thereof which have specificity for the human cell membrane antigen CD30. The invention further relates to expression vectors which contain these DNA molecules, and to host cells transformed therewith which are capable of producing the novel ligands. In addition, a method for the production of ligands of the specified specificity using the transformed host cells, the resulting ligands and diagnostic and pharmaceutical preparations containing them are provided.

Das CD30-Antigen ist ein Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 120 kD, wenn diese durch eine SDS-Elektrophorese bestimmt wird. Das besondere an dem CD30-Antigen ist, daß es normalerweise im Organismus nur auf sehr wenigen aktivierten T-Zell- und B-Zell- Blasten und an diesen auch nur in geringer Dichte vorhanden ist (Stein et al. , "Identification of Hodgkin and Sternberg-Reed cells as a unigue cell type derived from a newly detected small cell population", Int. J. Cancer, 30, S. 445-459, 1982; Stein et al.,"The expression of the Hodgkin's disease associated antigen Ki-1 in reactive and neoplastic lymphoid tissue: evidence that Reed-Sternberg and histiocytic malignancies are derived from activated lymphoid cells", Blood, 66, S. 848-858, 1985; Schwar- ting et al., "Ber-H2: a new monoclonal antibody of the Ki-1 family for the detection of Hodgkin's disease in formaldehyde- fixed tissue sections (A2.13)", in: Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens, A.J. McMichael, Hrsg., Oxford University Press, Oxford - New York - Tokyo, S. 574-575, 1987), während es aber bei einer Reihe von lymphoproliferativen Prozes¬ sen und bei embryonalen Karzinomen in sehr viel höherer Konzen¬ tration exprimiert wird. Zu den stark CD30-positiven malignen Lymphomen gehören in erster Linie die Hodgkin-Lymphome, das anaplastische großzellige Lymphom wie auch die akute Form der adulten T-Zeil-Leukämie.The CD30 antigen is a glycoprotein with a molecular mass of 120 kD when determined by SDS electrophoresis. The special thing about the CD30 antigen is that it is normally only present in the organism on very few activated T-cell and B-cell blasts and only in low density on these (Stein et al., "Identification of Hodgkin and Sternberg-Reed cells as a unigue cell type derived from a newly detected small cell population ", Int. J. Cancer, 30, pp. 445-459, 1982; Stein et al.," The expression of the Hodgkin's disease associated antigen Ki -1 in reactive and neoplastic lymphoid tissue: evidence that Reed-Sternberg and histiocytic malignancies are derived from activated lymphoid cells ", Blood, 66, pp. 848-858, 1985; Scharting et al.," Ber-H2: a new monoclonal antibody of the Ki-1 family for the detection of Hodgkin's disease in formaldehyde-fixed tissue sections (A2.13) ", in: Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens, AJ McMichael, ed., Oxford University Press, Oxford - New York - Tokyo, pp. 574-575, 1987), but it is expressed in a much higher concentration in a number of lymphoproliferative processes and in embryonic carcinomas. The strong CD30-positive malignant lymphomas primarily include Hodgkin's lymphomas, anaplastic large cell lymphoma and the acute form of adult T-cell leukemia.

Kürzlich konnte gezeigt werden, daß das CD30-Molekül selektiv von aktivierten TH2-Blasten (S. Romagnani, "Induction of TH1 and TH2 responses: a key role for the 'natural' immune response?", Immunol. Today, 13, S. 379-381, 1992) in vitro und in vivo ex¬ primiert wird (Del Prete et al., "CD30, Th2 cytokines and HIV infection: a complex and fascinating link", Immunol. To¬ day, 16 (2): 76-80, 1995). Bei Patienten mit allergischen Erkran- kungen war die Zahl der CD30+ TH2-Blasten im Vergleich zu Normal¬ personen um ein Vielfaches erhöht. Es ist daher denkbar, daß die Mehrzahl der Autoaggressionserkrankungen auf eine Fehlsteuerung der TH-Antwort mit Vermehrung von TH2-Zellen zurückzuführen ist.It has recently been shown that the CD30 molecule is selectively activated T H 2 blasts (S. Romagnani, "Induction of T H 1 and T H 2 responses: a key role for the 'natural' immune response?", Immunol. Today, 13, pp. 379-381, 1992) is expressed in vitro and in vivo (Del Prete et al., "CD30, Th2 cytokines and HIV infection: a complex and fascinating link", Immunol. To day, 16 (2): 76-80, 1995). In patients with allergic diseases, the number of CD30 + T H 2 blasts was many times higher than that of normal people. It is therefore conceivable that the majority of autoaggressive diseases can be attributed to incorrect control of the T H response with an increase in T H 2 cells.

Wegen des äußerst seltenen Vorkommens des CD30-Moleküls im nor¬ malen Organismus und der hohen Expression dieses Moleküls auf den Tumorzellen der oben genannten Lymphome und des embryonalen Karzinoms sowie auf aktivierten TH2-Blasten sind eine auf die Ex¬ pression des CD30-Moleküls aufbauende Diagnostik und Therapie eine wichtige Strategie zur Erkennung und Behandlung der genann¬ ten Erkrankungen.Because of the extremely rare occurrence of the CD30 molecule in the normal organism and the high expression of this molecule on the tumor cells of the above-mentioned lymphomas and the embryonic carcinoma, as well as on activated T H 2 blasts, one is due to the expression of the CD30 molecule Establishing diagnostics and therapy an important strategy for the detection and treatment of the named diseases.

Es sind bereits Immunotoxine versuchsweise in vivo beim Menschen angewendet worden, mit denen Hodgkin-Lymphomzellen erkannt bzw. eliminiert werden können (B. Falini et al . , "Response of refrac- tory Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin" , Lancet, 339, S. 1195-1196, 1992; Falini et al., "In vivo targe- ting of Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease with monoclonal antibody Ber-H2 (CD30): Immunohistological evi- dence", Brit. J. Haematol. , 82, S. 38-45, 1992). Die primäre Diagnostik der CD30-positiven Krebsformen wird gegenwärtig immunhistologisch durchgeführt, wobei als Antikörper z.Z. ausschließlich Reagenzien der Maus wie z.B. Ber-H2 einge¬ setzt werden. Bei diesem Reagenz handelt es sich um einen gegen das CD30-Molekül gerichteten monoklonalen Antikörper, der 1987 in einem Kurzbeitrag und 1989 in ausführlicher Weise von der Arbeitsgruppe der Erfinder beschrieben wurde (Schwarting et al.,"Ber-H2: a new anti-Ki-1 (CD30) monoclonal antibody directed at a formol-resistent epitope", Blood, 74, S. 1678-1689, 1989). Dieser Antikörper wird von der gleichnamigen Maus-Myelom-Hybrid- zellinie sezerniert, die am 28.01.1992 bei der European Collec¬ tion of Animal Cell Cultures (ECACC), Public Health Laboratories Service Board, 61 Collindale Avenue, London, NW9 5DF, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter der Hinterlegungs- nummer Ber-H2 92012823 hinterlegt worden ist. Allerdings ist es bei der Massenproduktion dieses Antikörpers in Langzeitkultur (etwa in Fermentern) von erheblichem Nachteil, daß die Antikör- per-produzierenden Zellen bereits nach einigen Generationen von solchen Zellen überwachsen werden, die die Fähigkeit zur Anti- körperproduktion verloren haben, offenbar weil letztere nicht mehr in der Lage sind, schwere Immunglobulinketten oder auch schwere und leichte Immunglobulinketten zu synthetisieren.Experimental immunotoxins have already been used in humans in vivo with which Hodgkin's lymphoma cells can be recognized or eliminated (B. Falini et al., "Response of refractive Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339 , Pp. 1195-1196, 1992; Falini et al., "In vivo targeting of Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease with monoclonal antibody Ber-H2 (CD30): Immunohistological evidence", Brit. J. Haematol., 82, pp. 38-45, 1992). The primary diagnosis of CD30-positive forms of cancer is currently carried out immunohistologically, with only antibodies from the mouse such as Ber-H2 currently being used as antibodies. This reagent is a monoclonal antibody directed against the CD30 molecule, which was briefly described in 1987 and in 1989 in detail by the inventors' working group (Schwarting et al., "Ber-H2: a new anti-Ki -1 (CD30) monoclonal antibody directed at a formol-resistant epitope ", Blood, 74, pp. 1678-1689, 1989). This antibody is secreted by the mouse-myeloma hybrid cell line of the same name, which was released on January 28, 1992 at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Public Health Laboratories Service Board, 61 Collindale Avenue, London, NW9 5DF the provisions of the Budapest Treaty has been deposited under the deposit number Ber-H2 92012823. However, in the mass production of this antibody in long-term culture (for example in fermenters) it is a considerable disadvantage that the antibody-producing cells are overgrown after a few generations by cells which have lost the ability to produce antibodies, apparently because the latter are no longer able to synthesize heavy immunoglobulin chains or heavy and light immunoglobulin chains.

Die Ausbreitungsdiagnostik der genannten Tumorerkankungen er- folgt in der Regel durch Computertomographie, Sonographie und/ oder Lymphographie. Die genannte nicht-invasive Ausbreitungs¬ diagnostik ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, daß lediglich relativ große Tumormassen identifiziert werden können, kleinere Tumore oder Metastasen jedoch nicht nachweisbar sind. Die des- halb oft zusätzlich angewendete chirurgische Ausbreitungsdiagno¬ stik ist für den Patienten sehr belastend und auf bestimmte Körperhöhlen (z.B. Bauchhöhle) beschränkt. Die gegenwärtig medi¬ zinisch ausschließlich akzeptierte und deswegen angewendete Standardtherapie der CD30-positiven Tumore erfolgt mit einer unspezifischen Radio- und/oder Chemotherapie. Obgleich die Er- folgsrate ca. 60 - 70 % beträgt, gibt es für die Therapiever¬ sager bisher kein kuratives Konzept.The spread diagnosis of the tumor diseases mentioned is generally carried out by means of computer tomography, sonography and / or lymphography. However, the non-invasive spreading diagnosis mentioned has the disadvantage that only relatively large tumor masses can be identified, but smaller tumors or metastases cannot be detected. The surgical spreading diagnosis, which is therefore often used additionally, is very stressful for the patient and limited to certain body cavities (eg, abdominal cavity). The currently only medically accepted and therefore used standard therapy for CD30-positive tumors is carried out with non-specific radio and / or chemotherapy. Although the first follow rate is approximately 60-70%, there has been no curative concept for therapy failures so far.

Deshalb wurde der monoklonale Antikörper Ber-H2 mit pflanzlichen Giften konjugiert und versuchsweise zur Therapie von Patienten mit Morbus Hodgkins in terminaler Krankheitsphase eingesetzt (Falini et al., "Response of refractory Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339, S. 1195-1196, 1992). Dabei zeigten die vier behandelten Patienten innerhalb von 10 Tagen eine Tumormassenreduktion um 50% bis nahezu 100%. Allerdings kam es in allen Fällen nach unterschiedlicher Zeit zum Neuauftreten von Tumormassen an den alten und/oder neuen Lokalisationen. Eine Wiederholung der Immunotoxinapplikation war nicht möglich, weil die so behandelten Patienten ausnahmslos Antikörper gegen den Maus-Antikörper Ber-H2 gebildet hatten.For this reason, the monoclonal antibody Ber-H2 was conjugated with plant poisons and experimentally used to treat patients with Hodgkin's disease in the terminal phase of the disease (Falini et al., "Response of refractory Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339, p 1195-1196, 1992). The four treated patients showed a tumor mass reduction of 50% to almost 100% within 10 days. In all cases, however, tumor masses reappeared at the old and / or new locations after different times. Repetition of the immunotoxin application was not possible because the patients treated in this way had formed antibodies against the mouse antibody Ber-H2 without exception.

Die immunologisch begründete Problematik der in-vivo Applikation von Maus-Antikörpern gegen das CD30-Molekül für diagnostische und therapeutische Zwecke läßt sich drastisch reduzieren, wenn anstelle des Maus-Antikörpers ein nicht oder nur geringfügig immunogenes Protein mit Spezifität für das CD30-Antigen einge¬ setzt wird.The immunologically justified problem of the in vivo application of mouse antibodies against the CD30 molecule for diagnostic and therapeutic purposes can be drastically reduced if, instead of the mouse antibody, a non-or only slightly immunogenic protein with specificity for the CD30 antigen is used is set.

Es besteht heute die Möglichkeit, die variablen Regionen von schwerer (VH) und leichter (VL) Kette eines Maus-Antikörpers an die entsprechenden konstanten Regionen CH und CL eines mensch¬ lichen Antikörpermoleküls anzufügen. Durch diese Manipulation werden die für den Menschen immunogenen Bereiche des Antikörper- Moleküls weitgehend beseitigt, während die Spezifität des ur- sprünglichen Maus-Antikörpers in dem Chimären Molekül zumeist erhalten bleibt.It is now possible to add the variable regions of the heavy (V H ) and light (V L ) chain of a mouse antibody to the corresponding constant regions C H and C L of a human antibody molecule. This manipulation largely eliminates the areas of the antibody molecule that are immunogenic for humans, while the specificity of the original mouse antibody in the chimeric molecule is usually retained.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Be¬ reitstellung von neuen CD30-spezifischen Substanzen mit vermin- derter Immunogenität. Ferner soll die Instabilität der Zellinie Ber-H2 in Bezug auf die Produktion des monoklonalen Antikörpers verbessert werden.The object of the present invention is therefore to provide new CD30-specific substances with reduced immunogenicity. Furthermore, the instability of the cell line Ber-H2 can be improved in terms of monoclonal antibody production.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe werden erfindungsgemäß die Gegenstände der Ansprüche 1, 6, 9, 13, 15, 25 und 26 vorgeschla¬ gen, wobei bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfin¬ dung in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben sind.To achieve the object, the subject matter of claims 1, 6, 9, 13, 15, 25 and 26 are proposed according to the invention, preferred embodiments of the present invention being specified in the respective subclaims.

Erfindungsgemäß werden somit rekombinante DNA-Moleküle bereitge- stellt, welche für variable Immunglobulinketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmem- bran-Antigen CD30 aufweisen, wobei die rekombinanten DNA-Molekü¬ le Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Va- rianten derselben umfassen, die vorzugsweise vollständig oder teilweise operativ miteinander verknüpft sind. Ferner ist es bevorzugt, daß diese Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für konstante Teile eines humanen oder tie- rischen Immunglobulinmoleküls kodieren.According to the invention, recombinant DNA molecules are thus provided which code for variable immunoglobulin chains or fragments thereof, which have specificity for the human cell membrane antigen CD30, the recombinant DNA molecules being sequences in accordance with one or more of the SEQ ID NOS : 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof, which are preferably operatively linked in whole or in part. It is further preferred that these sequences or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof are operatively linked to DNA sequences which code for constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule.

Der vorliegend verwendete Begriff "syngen" bezeichnet erfin¬ dungsgemäß isogene, homologe oder genetisch nahe verwandte DNA- Sequenzen, und umfaßt alle Sequenzen, Fragmente und Varianten, die sich von dem gleichen oder homologen Gen ableiten und für die erfindungsgemäßen Immunglobulinketten oder Fragmente dersel¬ ben kodieren.The term "syngene" used in the present invention refers to isogenic, homologous or genetically closely related DNA sequences and includes all sequences, fragments and variants which are derived from the same or homologous gene and for the immunoglobulin chains or fragments thereof according to the invention encode.

Nach einer weiteren Ausführungsform umfassen die rekombinanten DNA-Moleküle jeweils einen oder mehrere der hypervariablen Be¬ reiche (die auch als CDR für "complementarity determining resi- dues" bezeichnet werden) der in den SEQ ID NOS: 1 oder 3 bzw. in den SEQ ID NOS: 4 oder 6 angegebenen Sequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben. Schließlich können die in den SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 angegebenen Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen ver¬ knüpft sein, die für toxische Proteine oder Enzyme kodieren.According to a further embodiment, the recombinant DNA molecules each comprise one or more of the hypervariable regions (which are also referred to as CDR for "complementarity determining residences") which are contained in SEQ ID NOS: 1 or 3 or in SEQ ID NOS: 4 or 6 specified sequences or syngeneic or allelic variants thereof. Finally, the sequences given in SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof can be operatively linked to DNA sequences which code for toxic proteins or enzymes.

Ferner werden erfindungsgemäß Expressionsvektoren bereitge¬ stellt, die ein oder mehrere der genannten rekombinanten DNA- Moleküle in operativer Verknüpfung mit Expressionskontroll-Se¬ quenzen enthalten und vorzugsweise für die Expression in Proka- ryonten- und/oder Eukaryonten-Wirtszellen geeignet sind.Furthermore, according to the invention, expression vectors are provided which contain one or more of the recombinant DNA molecules mentioned in operative linkage with expression control sequences and are preferably suitable for expression in procaryte and / or eukaryote host cells.

Weiterhin stellt die Erfindung Wirtszellen zur Verfügung, die mit den genannten Expressionsvektoren transfiziert sind, wobei Prokaryonten- oder Eukaryonten-Zellen in Betracht kommen, wobei die bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell¬ kulturen GmbH) am 8. August 1995 unter der Zugriffsnummer DSM ACC2224 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinter¬ legte Eukaryonten-Zelle CH-BerH2 bevorzugt ist.The invention furthermore provides host cells which are transfected with the expression vectors mentioned, prokaryote or eukaryote cells being suitable, the ones obtained from the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) on August 8, 1995 under the Access number DSM ACC2224 according to the provisions of the Budapest Treaty, eukaryotic cell CH-BerH2 is preferred.

Im übrigen wird ein Verfahren zur Herstellung von Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 bereitgestellt, bei dem man eine der genannten Wirtszellen in einem geeigneten Nährmedi¬ um kultiviert, anschließend die Zellen von dem Medium abtrennt und die Liganden als Expressionsprodukte aus dem Medium oder aus dem Cytoplasma der Wirtszellen isoliert. Vorzugsweise werden die Liganden anschließend gereinigt und mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu pharmazeutischen oder diagnostischen Präparaten formuliert.Furthermore, a method for the production of ligands for the human cell membrane antigen CD30 is provided, in which one of the host cells mentioned is cultivated in a suitable nutrient medium, then the cells are separated from the medium and the ligands as expression products from or from the medium isolated from the cytoplasm of the host cells. The ligands are then preferably purified and formulated with conventional auxiliaries and carriers to give pharmaceutical or diagnostic preparations.

Ferner werden rekombinante Liganden für das menschliche Zellmem¬ bran-Antigen CD30 bereitgestellt, die mindestens die in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder Frag¬ mente oder allelische Varianten derselben umfassen. Vorzugsweise umfassen diese Liganden jeweils einen oder mehrere der hyperva- riablen CDR-Bereiche der in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angege¬ benen Aminosäuresequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben. Nach einer besonderen Ausführungsform sind in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebene Aminosäuresequenzen oder Frag¬ mente oder allelische Varianten derselben untereinander ver¬ knüpft. Ferner können diese Sequenzen oder Fragmente oder alle- lische Varianten derselben vorzugsweise mit konstanten Teilen eines humanen oder tierischen Immunglobulinmoleküls verknüpft sein. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die vorstehend genannten rekombinanten Liganden peptidisch oder über Linker-Moleküle mit toxischen Proteinen oder mit Enzymen bzw. Proenzymen verknüpft, wobei die Toxine vorzugsweise in Form von Ribosomen-inaktivierenden Proteinen vorliegen und die Enzyme vorzugsweise aus der Gruppe der Phosphodiesterasen ausgewählt sind. Nach einer alternativen Ausführungsform sind die vorste¬ hend genannten rekombinanten Liganden direkt oder über Linker- Moleküle kovalent oder konjugiert mit photoaktivierbaren Ver¬ bindungen oder mit radioaktiven Isotopen verknüpft, wobei letz¬ tere vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Indium, Jod, Yttrium, Technetium, Rhenium, Kupfer und Lutetium ausgewählt sind. Die Verknüpfung kann beispielsweise unter Verwendung von Chelatbildnern oder über photochemische Aktivierungsprozesse erfolgen (vgl. WO 94/04189).Furthermore, recombinant ligands for the human cell membrane antigen CD30 are provided which comprise at least the amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: 2 and / or 5. These ligands preferably each comprise one or more of the hypervariable CDR regions of the amino acid sequences or syngeneic or allelic variants indicated in SEQ ID NOS: 2 and / or 5 the same. According to a particular embodiment, 2 and / or 5 amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: are linked to one another. Furthermore, these sequences or fragments or all variants thereof can preferably be linked to constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule. According to a further preferred embodiment, the recombinant ligands mentioned above are linked peptically or via linker molecules to toxic proteins or to enzymes or proenzymes, the toxins preferably being in the form of ribosome-inactivating proteins and the enzymes preferably being selected from the group of the phosphodiesterases are. According to an alternative embodiment, the above-mentioned recombinant ligands are linked covalently or conjugated directly or via linker molecules to photoactivatable compounds or to radioactive isotopes, the latter preferably from the group consisting of indium, iodine, yttrium, technetium, Rhenium, copper and lutetium are selected. The linkage can take place, for example, using chelating agents or via photochemical activation processes (cf. WO 94/04189).

Schließlich werden diagnostische oder pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die vorzugsweise einen oder mehrere der vorste- hend genannten oder durch das erfindungsgemäße Verfahren herge¬ stellte Liganden gegebenenfalls in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln enthalten. Beispiele für übliche Trägerstoffe sind z.B. Wasser, physiologische Kochsalz¬ lösung, Alkohole, Polyethylenglykole, Glycerinester, Gelatine, Kohlenhydrate, wie Laktose und Stärke, Calciumcarbonat, Magne¬ siumstearat, Talkum. Übliche Zusatzstoffe sind z.B. Konservie¬ rungsstoffe, Gleitmittel, Netzraittel und Emulgatoren, Farb¬ stoffe, Geschmackskorrigentien und Aromastoffe. Die Auswahl der Träger- und Zusatzstoffe hängt davon ab, ob die erfindungs- gemäßen Zubereitungen enteral, parenteral oder lokal appliziert werden sollen. Beispiele für erfindungsgemäß in Betracht kommende Darreichungsformen sind Lösungen, Dragees, Kapseln, Tabletten, Injektions- und Infusionslösungen sowie transdermale Pflaster.Finally, diagnostic or pharmaceutical preparations are provided, which preferably contain one or more of the above-mentioned ligands or those produced by the process according to the invention, optionally in combination with conventional carriers and diluents. Examples of common carriers are water, physiological saline, alcohols, polyethylene glycols, glycerol esters, gelatin, carbohydrates such as lactose and starch, calcium carbonate, magnesium stearate, talc. Usual additives are, for example, preservatives, lubricants, wetting agents and emulsifiers, colorants, taste correctives and flavorings. The choice of carriers and additives depends on whether the preparations according to the invention are to be administered enterally, parenterally or locally. Examples of the invention Future dosage forms are solutions, dragees, capsules, tablets, injection and infusion solutions as well as transdermal patches.

Diese Präparate dienen vorzugsweise der Diagnostik und/oder Behandlung von Krebsformen wie insbesondere der Hodgkinschen Er¬ krankung, bei denen das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 auf Zellen exprimiert wird, die für die Erkrankung von Bedeutung sind.These preparations are preferably used for the diagnosis and / or treatment of forms of cancer such as, in particular, Hodgkin's disease, in which the human cell membrane antigen CD30 is expressed on cells which are important for the disease.

Zur Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden Problems wurden ausgehend von dem Maus-Antikörper Ber-H2 die Sequenzen der va¬ riablen Region der leichten (VLJ) und schweren Ketten (VHDJ) dieses CD30-reaktiven monoklonalen Antikörpers bestimmt. Die zugehörigen genomischen Sequenzen wurden dann mit den Sequenzen für die konstanten Regionen eines menschlichen Immunglobulinmo- leküls verbunden. Das resultierende Konstrukt wurde in einer ge¬ eigneten Zelle, vorzugsweise einer keine eigenen Immunglobulin¬ ketten produzierenden Myelomzellinie, zur Expression gebracht.To solve the problem on which the invention is based, the sequences of the variable region of the light (V L J) and heavy chains (V H DJ) of this CD30-reactive monoclonal antibody were determined on the basis of the mouse antibody Ber-H2. The associated genomic sequences were then linked to the sequences for the constant regions of a human immunoglobulin molecule. The resulting construct was expressed in a suitable cell, preferably in a myeloma cell line which does not produce its own immunoglobulin chains.

Erfindungsgemäß wurde zunächst die zytoplasmatische RNA aus kultivierten, den Antikörper Ber-H2 produzierenden Zellen der Mausmyelomhybridlinie isoliert. Anschließend wurde mit Hilfe der Reversen Transkriptase eine cDNA-Synthese von VLJ und VHDJ durch- geführt, wobei die verwendeten, nachfolgend angegebenen Oligonu- kleotide dem 5'-Ende der konstanten Regionen der L- bzw. H-Kette komplementär waren:According to the invention, the cytoplasmic RNA was first isolated from cultured cells of the mouse myeloma hybrid line which produce the antibody Ber-H2. Then, with the help of the reverse transcriptase, a cDNA synthesis of V L J and V H DJ was carried out, the oligonucleotides used below being complementary to the 5 'end of the constant regions of the L and H chains :

5' AGATGGATACAGTTGGT 3' (konLl) 5' GGGGCCAGTGGATAGAC 3' (konHl)5 'AGATGGATACAGTTGGT 3' (konLl) 5 'GGGGCCAGTGGATAGAC 3' (konHl)

Um die cDNAs durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren zu können, wurden sie mit Guanosin-Trinukleotiden so verlängert, daß ein Poly-C-Anker-oligo mit der nachfolgend angegebenen Se- quenz als 5'-Primer dienen konnte: 5' GCGCGGCCGCGGAGGCCCCCCCCCCCCCC 3' (AN-Poly-C).In order to be able to amplify the cDNAs by polymerase chain reaction (PCR), they were extended with guanosine trinucleotides in such a way that a poly-C anchor oligo with the sequence given below could serve as a 5 'primer: 5 'GCGCGGCCGCGGAGGCCCCCCCCCCCCCC 3' (AN-Poly-C).

Als 3'-Primer wurden die bereits zur cDNA-Synthese verwendeten Oligonukleotide konLl bzw. konHl eingesetzt. In weiteren PCR- Reaktionen wurden die cDNAs mit den nachfolgend angegebenen 3'- Oligonukleotiden konL2 bzw. konH2 sowie mit dem angegebenen Ankerprimer am 5'-Ende, die jeweils überhängende Restriktions¬ schnittstellen trugen, amplifiziert:The oligonucleotides konLl or konHl already used for cDNA synthesis were used as 3 'primers. In further PCR reactions, the cDNAs were amplified with the 3'-oligonucleotides konL2 or konH2 given below and with the anchor primer indicated at the 5 'end, each of which carried overhanging restriction sites:

5' GGAATTCGGATACAGTTGGTGCAGC 3' (konL2)5 'GGAATTCGGATACAGTTGGTGCAGC 3' (konL2)

5' GGAATTCGTGGATAGACAGATGGG 3' (konH2) 5' GCGCGGCCGCGGAGG 3' (Ankerprimer)5 'GGAATTCGTGGATAGACAGATGGG 3' (konH2) 5 'GCGCGGCCGCGGAGG 3' (anchor primer)

Zur Bestimmung der cDNA-Sequenzen wurden die erhaltenen Fragmen- te in handelsübliche Sequenzierungsvektoren kloniert (z.B. unter Verwendung des Vektors pGEM -HZf(+) von Promega, Heidelberg).To determine the cDNA sequences, the fragments obtained were cloned into commercially available sequencing vectors (e.g. using the vector pGEM -HZf (+) from Promega, Heidelberg).

Die Sequenzanalysen ergaben, daß das V-Gensegment der leichten Kette des mAk Ber-H2 mit dem J2-Gensegment, das der schweren Kette mit dem J3-Gensegment rekombiniert war.The sequence analyzes showed that the V gene segment of the light chain of the mAb Ber-H2 was recombined with the J 2 gene segment and that of the heavy chain with the J 3 gene segment.

Mit Hilfe dieser cDNA-Sequenzen konnten in einem weiteren Schritt 5'-Primersequenzen festgelegt und synthetisiert werden, die im untranslatierten Bereich des jeweiligen Gens liegen. Da die Intronsequenzen sämtlicher J-Minigene bekannt und über Gen¬ banken zugänglich sind, konnten hieraus ferner 3'-Primersequen¬ zen abgeleitet werden, die im nicht-kodierenden Bereich der DNA der Mausmyelomhybridlinie liegen. Auf diese Weise war es mög¬ lich, diese genomische DNA nach PCR-Amplifikation gerichtet zu klonieren, ohne die originale Genstruktur (5'-UTR - Exon 1 - Intron -Exon 2 - J-Intron) zu verändern.With the help of these cDNA sequences, 5 'primer sequences could be determined and synthesized in a further step, which are in the untranslated region of the respective gene. Since the intron sequences of all J-minigens are known and accessible via gene banks, 3 'primer sequences which lie in the non-coding region of the DNA of the mouse myeloma hybrid line could also be derived therefrom. In this way it was possible to clone this genomic DNA in a directed manner after PCR amplification without changing the original gene structure (5'-UTR - exon 1 - intron-exon 2 - J-intron).

Um vollständige Sequenzen zu erhalten, wurden die VLJ- bzw. VHDJ- PCR-Produkte dann zunächst in geeignete Sequenzierungsvektoren kloniert und die "Insert"-Bereiche von jeweils drei Klonen voll¬ ständig sequenziert. Parallel hierzu wurden die PCR-Produkte als Referenz direkt sequenziert. Nach Überprüfung des korrekten Leserahmens und des NichtVorhandenseins von Stop-Codons inner¬ halb der klonierten DNA wurde jeweils ein zu den PCR-Produkten sequenzhomologer Klon in die entsprechenden Expressionsvektoren (pUHWγl bzw. pUHWk) umkloniert. Diese Vektoren enthielten die für die konstanten Teile eines humanen Antikörpers kodierenden Se¬ quenzen, ein murin/humanes Intronhybrid, einen Selektionsmarker, sowie die zur effizienten Expression notwendigen Maus-Promotor- und Enhancerelemente.In order to obtain complete sequences, the V L J or V H DJ PCR products were then first cloned into suitable sequencing vectors and the "insert" regions of three clones were completely sequenced. In parallel, the PCR products were called Reference sequenced directly. After checking the correct reading frame and the absence of stop codons within the cloned DNA, a clone which was homologous to the PCR products was recloned into the corresponding expression vectors (pUHW γl or pUHW k ). These vectors contained the sequences coding for the constant parts of a human antibody, a murine / human intron hybrid, a selection marker, and the mouse promoter and enhancer elements required for efficient expression.

Nach Linearisierung der Plasmide wurde eine Kotransfektion bei¬ der Konstrukte in Sp2/0-Agl4-Zellen (M. Shulman et al. , Nature, 276, S. 269-270, 1978) durchgeführt. Diese Zellen haben die Fähigkeit verloren, eigene Immunglobulinketten zu synthetisie- ren. Stabile Transfektanten wurden darauf durch Geneticin-Selek- tion isoliert. Die Austestung der Kulturüberstände erfolgte mit der Immunfluoreszenztechnik auf L428KS-Zellen, einer Hodgkin- lymphomlinie (V. Diehl et al . , "Characteristics of Hodgkin's disease-derived cell lines", Cancer Treatment Reports, 66, S. 615-632, 1982). Mehrere positive Primärkulturen wurden gefunden und jeweils kloniert und rekloniert. Zur Spezifitätsabklärung des sezernierten Antikörpers wurde untersucht, ob das Reaktions¬ spektrum des Chimären Proteins dem des murinen mAk Ber-H2 ent¬ sprach. Sowohl ein Panel von CD30+- bzw. CD30"-Zellinien in der Immunfluoreszenz als auch die immunhistologische Austestung an humanem Morbus Hodgkin-Gewebe ergaben, daß das chimärisierte Reagenz eine mit dem ursprünglichen Maus-Antikörper Ber-H2 ver¬ gleichbare Spezifität aufweist.After linearization of the plasmids, cotransfection of the constructs was carried out in Sp2 / 0-Agl4 cells (M. Shulman et al., Nature, 276, pp. 269-270, 1978). These cells have lost the ability to synthesize their own immunoglobulin chains. Stable transfectants were then isolated by geneticin selection. The culture supernatants were tested using the immunofluorescence technique on L428KS cells, a Hodgkin's lymphoma line (V. Diehl et al., "Characteristics of Hodgkin's disease-derived cell lines", Cancer Treatment Reports, 66, pp. 615-632, 1982) . Several positive primary cultures were found and each was cloned and recloned. To clarify the specificity of the secreted antibody, it was examined whether the reaction spectrum of the chimeric protein corresponded to that of the murine mAb Ber-H2. Both a panel of CD30 + or CD30 " cell lines in immunofluorescence and the immunohistological testing on human Hodgkin's tissue showed that the chimerized reagent has a specificity comparable to that of the original mouse antibody Ber-H2.

Der Vorteil der hier dargelegten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. ihrer Produkte gegenüber dem Stand der Technik besteht zum einen in der weit geringeren Immunogenität im menschlichen Kör¬ per und zum anderen in deren vielfältigen Manipulationsmöglich¬ keiten, die sich aufgrund der Kenntnis der DNA-Sequenzen erge- ben. So ist es z.B. möglich, ein Protein mit CD30-Spezifität in Bakterien oder Insektenzellen mit viel niedrigeren Kosten herzu- stellen, als in der konventionellen Zellkultur. Die Kenntnis der Sequenzen ermöglicht auch die Kopplung mit anderen DNA-Sequen¬ zen, die für aktivierende oder toxische Proteine, Enzyme oder Liganden von Abwehrzellen kodieren. Ferner können Fragmente der Gesamtsequenzen wie z.B. isolierte hypervariable Regionen für die Synthese entsprechender Proteinfragmente eingesetzt werden.The advantage of the DNA sequences according to the invention or their products set out here compared to the prior art is, on the one hand, in the far lower immunogenicity in the human body and, on the other hand, in their diverse manipulation possibilities, which are based on the knowledge of the DNA sequences result. For example, it is possible to produce a protein with CD30 specificity in bacteria or insect cells at a much lower cost. than in conventional cell culture. Knowledge of the sequences also enables coupling to other DNA sequences which code for activating or toxic proteins, enzymes or ligands from defense cells. Furthermore, fragments of the total sequences, such as isolated hypervariable regions, can be used for the synthesis of corresponding protein fragments.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen veranschaulicht.The present invention is illustrated below by means of examples.

Beispiel 1example 1

Isolierung von Nukleinsäuren aus MyelomhybridzellenIsolation of nucleic acids from myeloma hybrid cells

Etwa 2 x 10 Zellen der Mausmyelomhybridlinie Ber-H2 wurden mittels Zentrifugation pelletiert, in 100 μl PBS resuspendiert und in 4 ml GT-Puffer (enthaltend 4 M Guanidiniumisothiocyanat, 25 mM Natriumeitrat, 0,5 % Natriumlaurylsarcosin, 100 mM ß-Mer- captoethanol, pH-Wert 7,0) lysiert. Die erhaltene Suspension wurde auf einen Cäsiumchlorid-Gradienten geladen, welcher 2 ml 5,7 M Cäsiumchlorid, 1,5 ml 40 % (Gew./Vol.) CsCl, 1,5 ml 30 % (Gew./Vol.) CsCl und 1 ml 20 % (Gew./Vol.) CsCl enthielt. Nach einer 20 Stunden langen Zentrifugation mit 35 000 UpM bei 15°C wurde die pelletierte cytoplasmatische RNA gewonnen, in destil¬ liertem Wasser gelöst, durch PIC-Extraktion (50 Vol.-% Phenol, 48 Vol.-% CHC13, 2 Vol.-% Isoamylalkohol) aufgereinigt und mit Ethanol gefällt. Die Präzipitate wurden bis zur weiteren Ver¬ arbeitung bei -80°C aufbewahrt.About 2 x 10 cells of the mouse myeloma hybrid line Ber-H2 were pelleted by centrifugation, resuspended in 100 μl PBS and in 4 ml GT buffer (containing 4 M guanidinium isothiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.5% sodium lauryl sarcosine, 100 mM β-mercaptoethanol , pH 7.0) lysed. The suspension obtained was loaded onto a cesium chloride gradient which contained 2 ml 5.7 M cesium chloride, 1.5 ml 40% (w / v) CsCl, 1.5 ml 30% (w / v) CsCl and 1 ml of 20% (w / v) CsCl contained. After a centrifugation for 20 hours at 35,000 rpm at 15 ° C., the pelleted cytoplasmic RNA was obtained, dissolved in distilled water, by PIC extraction (50% by volume phenol, 48% by volume CHC1 3 , 2% by volume .-% isoamyl alcohol) purified and precipitated with ethanol. The precipitates were stored at -80 ° C until further processing.

Beispiel 2Example 2

cDNA-SynthesecDNA synthesis

Ein etwa 100 μg RNA entsprechendes Volumen des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Präzipitats wurde zur cDNA-Synthese eingesetzt. Das Präzipitat wurde 15 Minuten lang bei 4°C mit 14 000 UpM zentri¬ fugiert, mit 300 μl 70%igem Ethanol gewaschen, und die RNA wurde in 15 μl H20 gelöst. Nachfolgend wurde der Ansatz 20 Minuten lang bei 45°C mit 375 μl DMSO denaturiert, mit Ethanol gefällt und nach 15 Minuten langer Zentrifugation bei 4°C und 14 000 UpM und nach Waschung mit 70 % Ethanol in 5x RT-Puffer gelöst.An approximately 100 μg RNA corresponding volume of the precipitate obtained in Example 1 was used for cDNA synthesis. The Precipitate was centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes, washed with 300 μl of 70% ethanol, and the RNA was dissolved in 15 μl of H 2 O. The mixture was subsequently denatured for 20 minutes at 45 ° C. with 375 μl DMSO, precipitated with ethanol and, after 15 minutes of centrifugation at 4 ° C. and 14,000 rpm and after washing with 70% ethanol, dissolved in 5 × RT buffer.

Der Reaktionsansatz für die Reverse Transkriptase enthielt je 1 mM der vier dNTP's, 1 μg cκ- bzw. cγ-Primer, 1000 Einheiten MMLV-Reverse Transkriptase (BRL), 20 μCi [32P]dCTP, 2 Einheiten RNAse Block 2 (Stratagene) und H20 bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Der Ansatz wurde 90 Minuten lang bei 37°C inkubiert und anschließend wurde die RNA 30 Minuten lang bei 42°C mit 50 μg RNAse behandelt. Nach PIC-Extraktion, Fällung, Zentrifugation und Waschen der cDNA gemäß Beispiel 1 wurde der Niederschlag in 8 μl H20 gelöst, mit 8 μl denaturierendem Laufpuffer vermischt und auf ein Polyacrylamid-Harnstoff-Gel aufgetragen und 2 Stun¬ den lang bei 54°C und 2500 V aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel 12 Stunden lang bei -80°C auf einem Röntgenfilm exponiert. Die im Autoradiogramm den VLJ- bzw. VHDJ-Fragmenten entsprechen¬ den Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit 500 ml NHAOAc bei 37°C eluiert. Die Eluate wurden anschließend mit Ethanol gefällt und nach Zentrifugation und Waschen der DNA gemäß Beispiel 1 in 10 μl H20 gelöst.The reaction mixture for the reverse transcriptase contained 1 mM each of the four dNTP's, 1 μg c κ or c γ primer, 1000 units MMLV reverse transcriptase (BRL), 20 μCi [ 32 P] dCTP, 2 units RNAse Block 2 ( Stratagene) and H 2 0 up to a final volume of 100 μl. The mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes and then the RNA was treated with 50 μg RNAse at 42 ° C. for 30 minutes. After PIC extraction, precipitation, centrifugation and washing of the cDNA according to Example 1, the precipitate was dissolved in 8 μl of H 2 O, mixed with 8 μl of denaturing running buffer and applied to a polyacrylamide-urea gel and applied at 54 ° for 2 hours C and 2500 V separated. The gel was then exposed on an X-ray film at -80 ° C for 12 hours. The bands corresponding to the V L J or V H DJ fragments in the autoradiogram were cut out of the gel and eluted with 500 ml of NH A OAc at 37 ° C. The eluates were then precipitated with ethanol and, after centrifugation and washing of the DNA according to Example 1, dissolved in 10 μl of H 2 O.

Der Ansatz für die anschließende "Tailing"-Reaktion der cDNA enthielt 1 mM dGTP, 100 mM Na-Cacodylat, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 1 mM CoCl2, 2 μg BSA, 33 Einheiten terminale Desoxynukleotidyl- transferase (BRL), 5 μl cDNA und Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl . Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C durch¬ geführt. Nach PIC-Extraktion, Ethanolfällung und Waschen der Nukleinsäure gemäß Beispiel 1 wurde die erhaltene DNA nach Lösen in 20 μl Wasser und Herstellung einer Verdünnungsreihe dem an¬ schließenden PCR-Verfahren zugeführt. Beispiel 3The approach for the subsequent "tailing" reaction of the cDNA contained 1 mM dGTP, 100 mM Na cacodylate, 1 mM β-mercaptoethanol, 1 mM CoCl 2 , 2 μg BSA, 33 units terminal deoxynucleotide transferase (BRL), 5 μl cDNA and water up to a final volume of 20 μl. The reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes. After PIC extraction, ethanol precipitation and washing of the nucleic acid according to Example 1, the DNA obtained, after dissolving in 20 μl of water and producing a series of dilutions, was fed to the subsequent PCR method. Example 3

PCR-VerfahrenPCR method

Die DNA aus Beispiel 2 wurde mit Hilfe eines Poly-C-Anker-Pri- mers (AN-Poly-C) sowie des entsprechenden 3'c-Primers (konLl bzw. konHl) in einer ersten PCR-Reaktion amplifiziert, wobei sich der Buchstabe c auf den konstanten Bereich bezieht. Der Reaktionsansatz enthielt 10 ng des Primers AN-Poly-C-Oligo, 100 ng Ankerprimer, 100 ng konLl- bzw. konHl-Oligo, 2 μl lOx PCR-Puffer (2 mM dNTP's, 10 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl, 500 mM KC1, pH-Wert 8,4), 2 Einheiten Taq-Polymerase, 5 μl cDNA und Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl. Die Reaktion erfolgte nach dem folgenden PCR-Programm: 5 Minuten 94°C, 5 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 2 Minuten 42°C, 1 Minute 72°C, 30 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 1 Minute 42°C, 1 Minute 72°C und 10 Minuten 72°C.The DNA from Example 2 was amplified in a first PCR reaction with the aid of a poly-C anchor primer (AN-Poly-C) and the corresponding 3'c primer (konLl or konHl) Letter c refers to the constant range. The reaction mixture contained 10 ng of the primer AN-poly-C-oligo, 100 ng anchor primer, 100 ng konLl- or konHl-oligo, 2 μl lOx PCR buffer (2 mM dNTP's, 10 mM MgCl 2 , 100 mM Tris-HCl , 500 mM KC1, pH 8.4), 2 units of Taq polymerase, 5 μl cDNA and water to a final volume of 20 μl. The reaction was carried out according to the following PCR program: 5 minutes 94 ° C, 5 cycles of 1 minute 94 ° C, 2 minutes 42 ° C, 1 minute 72 ° C, 30 cycles of 1 minute 94 ° C, 1 minute 42 ° C, 1 minute 72 ° C and 10 minutes 72 ° C.

Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Moleküle wurden auf ein Aga- rosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die mit Vκ bzw. Vγ korrespondierenden Banden wurden ausgeschnitten und in 100 μl H2012 Stunden lang bei 4°C eluiert. Anschließend erfolgte eine zweite PCR-Reaktion mit einer Verdünnungsreihe der aus dem Gel eluierten DNA wie oben beschrieben, jedoch mit der Abwei- chung, daß 3'c-Primer (konL2 bzw. konH2) eingesetzt wurden, die Restriktionsschnittstellen-Überhänge an den 5'-Enden aufwiesen.The DNA molecules obtained in this way were applied to an agarose gel and separated electrophoretically. The bands corresponding to V κ and V γ were cut out and eluted in 100 μl of H 2 012 hours at 4 ° C. This was followed by a second PCR reaction with a series of dilutions of the DNA eluted from the gel as described above, but with the difference that 3'c primers (konL2 or konH2) were used, the restriction site overhangs at the 5 ' - had ends.

Beispiel 4Example 4

Klonierung der cDNACloning of the cDNA

Zunächst wurde sowohl der Vektor pGEM ®-HZf(+) (Promega, Heidel¬ berg) als auch die erhaltene cDNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sall 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach Dephospho- rylierung des Plasmids mit 2 x 4 Einheiten Kälberdarm-Phosphata- se (20 Minuten 37°C, 10 Minuten 70°C) wurden Vektor und cDNA auf einem Agarose- bzw. Polyacrylamidgel aufgetrennt, anschließend auf eine NA-45-Membran (Schleicher & Schüll, Dassel) transfe¬ riert und 30 Minuten lang bei 65°C mit IM NaCI in lx TE eluiert. Die Eluate wurden gemäß Beispiel 1 mit Ethanol gefällt, zentri- fugiert, gewaschen und in H20 gelöst. Die anschließende Liga- tionsreaktion erfolgte 12 Stunden lang bei 16°C, wobei der An¬ satz 2 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Boston, USA), 1 mM ATP und 5x Ligasepuffer enthielt und das molare Ver¬ hältnis von Plasmid zu cDNA 1 : 2 betrug. Der Ligationsansatz wurde anschließend zur Transformation kompetenter E. coli-Bakte- rien (XL 1 blue) mit 200 μl Bakteriensuspension vermischt und zunächst 30 Minuten lang bei 0°C, dann 2 Minuten lang bei 42°C, dann 5 Minuten lang bei 0°C und schließlich nach Zugabe von 1 ml LB-Medium 1 Stunde lang bei 37°C im Schüttler inkubiert. Jeweils 200 μl des Ansatzes wurden auf antibiotikahaltige Agarplatten ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die entstandenen Einzelkolonien wurden nun in LB-Ampicillin-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert.First, both the vector pGEM®-HZf (+) (Promega, Heidel¬berg) and the cDNA obtained were incubated with the restriction enzymes EcoRI and Sall for 1 hour at 37 ° C. After dephosphorylation of the plasmid with 2 x 4 units of calf intestinal phosphatase (20 minutes at 37 ° C., 10 minutes at 70 ° C.), the vector and cDNA were up an agarose or polyacrylamide gel, then transferred to an NA-45 membrane (Schleicher & Schull, Dassel) and eluted for 30 minutes at 65 ° C. with IM NaCI in 1 × TE. The eluates were precipitated according to Example 1 with ethanol, centrifuged, washed and dissolved in H 2 0. The subsequent ligation reaction took place at 16 ° C. for 12 hours, the mixture containing 2 units of T4 DNA ligase (New England Biolabs, Boston, USA), 1 mM ATP and 5 × ligase buffer and the molar ratio of Plasmid to cDNA was 1: 2. The ligation mixture was then mixed with 200 μl bacterial suspension for the transformation of competent E. coli bacteria (XL 1 blue) and first for 30 minutes at 0 ° C., then for 2 minutes at 42 ° C., then for 5 minutes at 0 ° C and finally after the addition of 1 ml LB medium for 1 hour at 37 ° C in a shaker. In each case 200 μl of the mixture were plated on agar plates containing antibiotics and incubated at 37 ° C. overnight. The resulting individual colonies were then inoculated in LB ampicillin medium and incubated overnight at 37 ° C. in a shaker.

Mit der auf diese Weise erhaltenen Bakterienkultur wurde sodann eine Plasmidpräparation durchgeführt und der Klonierungserfolg wurde nach Restriktionsverdau und anschließendem Auftragen des Ansatzes auf ein Agarosegel überprüft. Die positiven Klone wur¬ den anschließend zur Sequenzierung 30 Minuten lang bei 37°C mit 0,2N NaOH alkalisch denaturiert. Nach Ethanolfällung, Zentrifu¬ gation und Waschen des Niederschlags gemäß Beispiel 1 wurde die DNA gelöst und ein Aliquot zur Mengenabschätzung auf ein Aga¬ rosegel geladen.A plasmid preparation was then carried out with the bacterial culture obtained in this way and the cloning success was checked after restriction digestion and subsequent application of the mixture to an agarose gel. The positive clones were then alkaline denatured for 30 minutes at 37 ° C. with 0.2N NaOH. After ethanol precipitation, centrifugation and washing of the precipitate according to Example 1, the DNA was dissolved and an aliquot was loaded onto an agarose gel for quantity estimation.

Beispiel 5Example 5

Sequenzierung der DNA-FragmenteSequencing of the DNA fragments

Die Sequenzierung der klonierten cDNA sowie der genomischen DNA erfolgte nach der Methode von Sanger (F. Sanger, S. Nicklen undThe cloned cDNA and the genomic DNA were sequenced using the method of Sanger (F. Sanger, S. Nicklen and

A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74:546 (1977)) mit dem Sequenase-Kit-Version 2.0 (United States Biochemical, USA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Gelelektropho¬ resen erfolgten bei 54°C und einer Spannung von 1500 V.AR Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 546 (1977)) with the Sequenase Kit Version 2.0 (United States Biochemical, USA) according to the manufacturer's instructions. The gel electrophoresis took place at 54 ° C. and a voltage of 1500 V.

Mit Hilfe der cDNA-Sequenzen wurden in einem zweiten Schritt Primersequenzen festgelegt und synthetisiert, um die genomische DNA zu amplifizieren. Hierbei wurden die nachfolgend angegebenen 5' -OligonukleotideWith the aid of the cDNA sequences, primer sequences were determined and synthesized in a second step in order to amplify the genomic DNA. Here, the 5 'oligonucleotides given below

5' GATCGTCGACGGAAATGCATCAGACCAGCATGGGC 3' (LCHTUKup) bzw. 5' CATAGTCGACAATACGATCAGCATCCTCTCCACAG 3' (HACHBERup)5 'GATCGTCGACGGAAATGCATCAGACCAGCATGGGC 3' (LCHTUKup) or 5 'CATAGTCGACAATACGATCAGCATCCTCTCCACAG 3' (HACHBERup)

so gewählt, daß sie im Bereich der 5'-untranslatierten Regionen binden. Die 3' -Primerchosen so that they bind in the region of the 5 'untranslated regions. The 3 'primer

5' ATCAGCGGCCGCACTTAACAAGGTTAGACTTAGTGAAC 3' (LCHTUKdo) bzw. 5' GATAGCGGCCGCATGCATTTAGAATGGGAGAAGTTAGG 3' (HACHBERdo)5 'ATCAGCGGCCGCACTTAACAAGGTTAGACTTAGTGAAC 3' (LCHTUKdo) or 5 'GATAGCGGCCGCATGCATTTAGAATGGGAGAAGTTAGG 3' (HACHBERdo)

wurden anhand der Information über das jeweils rekombinierte J- Minigen im entsprechend zugehörigen invarianten J-Intron ausge¬ wählt. Die Primer enthielten außerdem die zur Klonierung in Ex¬ pressionsvektoren notwendigen Restriktionsschnittstellen. Die genomische DNA wurde mit Hilfe dieser Primer amplifiziert. Die PCR-Reaktion (5 μl lOx PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2, 200 mM dNTP's, 500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3), 2,5 Einheiten Taq- Polymerase (Perkin Eimer, Überlingen), je 5 μM Primer, 5 μl genomische DNA einer Verdünnungsreihe, ad 50 μl H20) wurde mit folgendem Programm durchgeführt: 5 Minuten 95°C, 26 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 2 Minuten 55°C, 2 Minuten 72°C, 7 Minuten 72°C.were selected on the basis of the information about the recombined J-minigen in the corresponding invariant J-intron. The primers also contained the restriction sites necessary for cloning in expression vectors. The genomic DNA was amplified using these primers. The PCR reaction (5 μl 10 × PCR buffer (1.5 mM MgCl 2 , 200 mM dNTP's, 500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3), 2.5 units Taq polymerase (Perkin Bucket, Überlingen), 5 μM primer each, 5 μl genomic DNA from a dilution series, ad 50 μl H 2 0) was carried out with the following program: 5 minutes 95 ° C, 26 cycles of 1 minute 94 ° C, 2 minutes 55 ° C, 2 minutes 72 ° C, 7 minutes 72 ° C.

Um vollständige Sequenzen zu erhalten, wurden die VJ- bzw. VDJ- PCR-Produkte zunächst in Sequenzierungsvektoren kloniert (pGEM ®-In order to obtain complete sequences, the VJ or VDJ PCR products were first cloned into sequencing vectors (pGEM ®

5Zf(+), Promega, Heidelberg) und jeweils 3 Klone vollständig (nach Beispiel 5) sequenziert. Parallel hierzu wurde das PCR- Produkt als Referenz direkt sequenziert (Cycle-Sequencing-Kit, Perkin Eimer, Überlingen) . Nach Überprüfung des korrekten Le¬ serahmens und des NichtVorhandenseins von Stop-Codons innerhalb der klonierten DNA wurde jeweils ein zum PCR-Produkt sequenzho¬ mologer Klon in den entsprechenden Expressionsvektor umkloniert. Diese Vektoren enthielten die für die konstanten Teile eines humanen Antikörpers kodierenden Sequenzen, ein murin-humanes Intronhybrid, einen Selektionsmarker sowie die zur Expression notwendigen Maus-Promotor- und Enhancerelemente.5Zf (+), Promega, Heidelberg) and 3 clones complete (according to Example 5) sequenced. In parallel, the PCR product was directly sequenced as a reference (cycle sequencing kit, Perkin Elmer, Überlingen). After checking the correct reading frame and the absence of stop codons within the cloned DNA, a clone sequence-homologous to the PCR product was recloned into the corresponding expression vector. These vectors contained the sequences coding for the constant parts of a human antibody, a murine-human intron hybrid, a selection marker and the mouse promoter and enhancer elements necessary for expression.

Beispiel 6Example 6

Umklonierung in Expressionsvektor und Expression des Chimären ProteinsReccloning into expression vector and expression of the chimeric protein

Zur Umklonierung wurden sowohl von den pGEM ®-5-Konstrukten gemäßFor cloning, both from the pGEM ®-5 constructs according to

Beispiel 5 als auch von den Expressionsvektoren pUHWκ bzw. pUHWγl Example 5 as well as the expression vectors pUHW κ and pUHW γl

(W. Weissenhorn et al., Gene, 106, S. 273-277, 1991) je ca. 1 μg DNA mit den Restriktionsenzymen Sall und Notl geschnitten. Nach der Restriktion wurde der Ansatz auf ein Polyacrylamidgel ge¬ laden und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden, die dem VJ- bzw. VDJ-Gen entsprachen, wurden gemäß Beispiel 4 aus dem Gel isoliert. Der Restriktionsverdau, die Aufreinigung und Dephos- phorylierung der Vektoren, die Ligation und Transformation sowie die Anzucht der Bakterienkultur erfolgte ebenfalls gemäß Bei¬ spiel 4. Nach Plasmidaufarbeitung und Restriktionsverdau wurde von je einem positiven Klon eine 100 ml umfassende Bakterienkul¬ tur bei 37°C angezogen. Die zur Transfektion benötigte Plasmid- DNA wurde mit dem QuiagenPlasmid-Midi-Kit (Quiagen GmbH, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers aus den Bakterien isoliert und aufgereinigt.(W. Weissenhorn et al., Gene, 106, pp. 273-277, 1991) each cut approximately 1 μg of DNA with the restriction enzymes Sall and Notl. After the restriction, the mixture was loaded onto a polyacrylamide gel and separated electrophoretically. The bands which corresponded to the VJ or VDJ gene were isolated from the gel according to Example 4. The restriction digestion, the purification and dephosphorylation of the vectors, the ligation and transformation as well as the cultivation of the bacterial culture also took place according to Example 4. After plasmid processing and restriction digestion, a positive culture clone became a 100 ml bacterial culture at 37 ° C. dressed. The plasmid DNA required for transfection was isolated and purified from the bacteria using the QuiagenPlasmid Midi Kit (Quiagen GmbH, Hilden) according to the manufacturer's instructions.

Die vorbereiteten Plasmide für leichte und schwere Ketten wurden zur stabilen Transfektion mit den Restriktionsenzymen EcoRI bzw.The prepared plasmids for light and heavy chains were used for the stable transfection with the restriction enzymes EcoRI or

Pvul linearisiert, gereinigt, und zur Mengenabschätzung wurde ein Aliquot auf ein Agarosegel aufgetragen. Die Transfektion erfolgte unter Anwendung des Gene-Pulser-Geräts (Biorad, Mün¬ chen): jeweils ca. 4 μg Plasmid und lx 10 Sp2/0-Maus-Myelomhy- brid-Zellen wurden in lx HeBs (20 mM HEPES, 137 mM NaCI, 5 mM KC1, 700 mM Na2HP04, pH-Wert 7,5) mit 940 μF und 270 V. gepulst, bevor die Zellen in einer Dichte von lx 10 Zellen/ml in Dulbec¬ co's Modified Eagle's Medium unter Zusatz von 10 % fötalem Käl¬ berserum ausgesät wurden. Für die Selektion positiver Klone wurde dem Medium 48 Stunden nach der Aussaat das Antibiotikum G418 in einer Konzentration von zunächst 800 μg/ml zugegeben, wobei die Konzentration allerdings nach 12 Tagen auf 1200 μg/ml erhöht wurde. Nach 15 Tagen konnten Primärkulturen, deren Kul¬ turüberstände mit L428KS-Zellen in der indirekten Immunfluores- zenz reagierten, identifiziert werden. Diese Transfektanten wurden kloniert, rekloniert und Überstände mit Hilfe eines Durchflußcytometers wiederum auf L428KS-Zellen analysiert. Ein¬ zelne Überstände wurden auch gegenüber CD30-negativen Zellen, z.B. der Zellinie KG-1, untersucht, eine Reaktion konnte erwar¬ tungsgemäß nicht nachgewiesen werden. Pvul linearized, cleaned, and an aliquot was applied to an agarose gel to estimate the amount. The transfection was carried out using the Gene Pulser device (Biorad, Munich): approx. 4 μg plasmid and 1 × 10 Sp2 / 0 mouse myeloma hybrid cells were each in 1 × HeBs (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 700 mM Na 2 HP0 4 , pH 7.5) pulsed with 940 μF and 270 V. before the cells at a density of lx 10 cells / ml in Dulbecco's Modified Eagle's Medium with the addition of 10 % fetal calf serum were sown. For the selection of positive clones, the antibiotic G418 was initially added to the medium 48 hours after sowing in a concentration of 800 μg / ml, although the concentration was increased to 1200 μg / ml after 12 days. After 15 days, primary cultures whose culture supernatants reacted with L428KS cells in indirect immunofluorescence could be identified. These transfectants were cloned, recloned and supernatants were again analyzed for L428KS cells using a flow cytometer. Individual supernatants were also examined against CD30-negative cells, for example the cell line KG-1, and as expected no reaction could be detected.

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:(1) GENERAL INFORMATION:

(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:

(A) NAME: medac Gesellschaft fuer klinische(A) NAME: medac Clinical Society

Spezialpraeparate mbHSpezialpraeparate mbH

(B) STRASSE: Fehlandtstrasse 3(B) ROAD: Fehlandtstrasse 3

(C) ORT: Hamburg(C) LOCATION: Hamburg

(E) LAND: Deutschland(E) COUNTRY: Germany

(F) POSTLEITZAHL: 20312(F) POSTAL NUMBER: 20312

(ii) ANMELDETITEL: Rekombinante Liganden fuer das menschliche Zellmembran-Antigen CD30(ii) APPLICATION TITLE: Recombinant Ligands for Human Cell Membrane Antigen CD30

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 6

(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:(iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk(A) DISK: Floppy disk

(B) COMPUTER : IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 470 Basenpaare(A) LENGTH: 470 base pairs

(B) ART: Nukleinsäure(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANGFORM: Doppel(C) STRAND FORM: Double

(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR(A) NAME / KEY: 5'UTR

(B) LAGE: 1..47(B) LOCATION: 1..47

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS(A) NAME / KEY: CDS

(B) LAGE: 48..>470(B) LOCATION: 48 ..> 470

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Primaerprodukt der schweren gammal-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Primary product of the heavy gammal chain from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peρtide(A) NAME / KEY: sig_peρtide

(B) LAGE: 48..101(B) LOCATION: 48..101

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide(A) NAME / KEY: mat_peptide

(B) LAGE: 102..>470(B) LOCATION: 102 ..> 470

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Schwere gammal-Kette von BerH2" (ix) MERKMALE:(D) OTHER INFORMATION: / product = "Heavy gammal chain from BerH2" (ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 102..470(B) LOCATION: 102..470

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region der schweren gammal-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region of the heavy gammal chain of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 192..206(B) LOCATION: 192.206

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR1 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR1 of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 249..299(B) LOCATION: 249..299

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR2 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR2 from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 396..437(B) LOCATION: 396..437

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR3 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR3 from BerH2"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

AATACGATCA GCATCCTCTC CACAGACACT GAAAACTCTG ACTCACA ATG GAA GGC 56AATACGATCA GCATCCTCTC CACAGACACT GAAAACTCTG ACTCACA ATG GAA GGC 56

Met Glu Gly -18Met Glu Gly -18

ACT GGA TCT TCT CTT CCT GTT TTC AGT ACT GCA GGT GTC CAC TCC CAG 104 Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly Val His Ser Gin -15 -10 -5 1ACT GGA TCT TCT CTT CCT GTT TTC AGT ACT GCA GGT GTC CAC TCC CAG 104 Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly Val His Ser Gin -15 -10 -5 1

GTC CAG CTT CAC GAG TCT GGG GCT GAA GTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA 152 Val Gin Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser 5 10 15GTC CAG CTT CAC GAG TCT GGG GCT GAA GTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA 152 Val Gin Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser 5 10 15

GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT ACC TAC TGG 200 Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp 20 25 30GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT ACC TAC TGG 200 Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp 20 25 30

ATG CAC TGG ATA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA 248 Met His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45ATG CAC TGG ATA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA 248 Met His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45

TAC ATT AAT CCT AGC ACT GGT TAT ACT GAC TAC AAT CAG AAC TTC AAG 296 Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin Asn Phe Lys 50 55 60 65TAC ATT AAT CCT AGC ACT GGT TAT ACT GAC TAC AAT CAG AAC TTC AAG 296 Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin Asn Phe Lys 50 55 60 65

GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGA ACA GCC TAC ATG 344 Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met 70 75 80 CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT ACA GTC TAT TAC TGT ACA 392GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGA ACA GCC TAC ATG 344 Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met 70 75 80 CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT ACA GTC TAT TAC TGT ACA 392

Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95

AGA AGG GGA CCC TCG TAT GGT AAC CAC GGG GCC TGG TTT CCT TAC TGG 440AGA AGG GGA CCC TCG TAT GGT AAC CAC GGG GCC TGG TTT CCT TAC TGG 440

Arg Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Asn His Gly Ala Trp Phe Pro Tyr TrpArg Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Asn His Gly Ala Trp Phe Pro Tyr Trp

100 105 110100 105 110

GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 470GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 470

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser AlaGly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120115 120

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 141 Aminosäuren(A) LENGTH: 141 amino acids

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Glu Gly Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly Val -18 -15 -10 -5Met Glu Gly Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly Val -18 -15 -10 -5

His Ser Gin Val Gin Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro 1 5 10His Ser Gin Val Gin Leu His Glu Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro 1 5 10

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 15 20 25 30Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 15 20 25 30

Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin 50 55 60Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin 50 55 60

Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr 65 70 75Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr 65 70 75

Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr 80 85 90Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr 80 85 90

Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Asn His Gly Ala Trp Phe 95 100 105 110Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Asn His Gly Ala Trp Phe 95 100 105 110

Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 598 Basenpaare(A) LENGTH: 598 base pairs

(B) ART: Nukleinsäure(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANGFORM: Doppel(C) STRAND FORM: Double

(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 1..6(B) LOCATION: 1..6

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Restriktionsschnittstelle Sall, synthetisch"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Sall restriction interface, synthetic"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR(A) NAME / KEY: 5'UTR

(B) LAGE: 7..53(B) LOCATION: 7..53

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon(A) NAME / KEY: exon

(B) LAGE: 54..98(B) LOCATION: 54..98

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= Exonl(D) OTHER INFORMATION: / label = exonl

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: intron(A) NAME / KEY: intron

(B) LAGE: 99..179(B) LOCATION: 99..179

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon(A) NAME / KEY: exon

(B) LAGE: 180..557(B) LOCATION: 180..557

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= Exon2(D) OTHER INFORMATION: / label = Exon2

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: intron(A) NAME / KEY: intron

(B) LAGE: 558..>590(B) LOCATION: 558 ..> 590

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= J3-Intron(D) OTHER INFORMATION: / label = J3 intron

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS(A) NAME / KEY: CDS

(B) LAGE: join(54..98, 180..557)(B) LOCATION: join (54..98, 180..557)

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Prim.prod. d. var. Region d. schweren gammal-Kette v. BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Prim.prod. D. Var. Region of the heavy gammal chain by BerH2"

( ix ) MERKMALE :(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL : mi scjeature(A) NAME / KEY: mi scjeature

(B) LAGE : 498. .>590(B) LOCATION: 498 ... 590

(D) SONSTIGE ANGABEN: /function= "J3-Minigen" (ix) MERKMALE:(D) OTHER INFORMATION: / function = "J3-Minigen" (ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 591..598(B) LOCATION: 591..598

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Restriktionsschnittstelle Notl, synthetisch"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Restriction interface Notl, synthetic"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peptide(A) NAME / KEY: sig_peptide

(B) LAGE: join(54..98, 180..188)(B) LOCATION: join (54..98, 180..188)

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide(A) NAME / KEY: mat_peptide

(B) LAGE: 189..557(B) LOCATION: 189..557

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region der schweren gammal-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region of the heavy gammal chain of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: miscjfeature(A) NAME / KEY: miscjfeature

(B) LAGE: 279..293(B) LOCATION: 279..293

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR1 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR1 of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 336..386(B) LOCATION: 336..386

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR2 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR2 from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 483..524(B) LOCATION: 483..524

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR3 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR3 from BerH2"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

GTCGACAATA CGATCAGCAT CCTCTCCACA GACACTGAAA ACTCTGACTC ACA ATG 56GTCGACAATA CGATCAGCAT CCTCTCCACA GACACTGAAA ACTCTGACTC ACA ATG 56

Met -18Met -18

GAA GGC ACT GGA TCT TCT CTT CCT GTT TTC AGT ACT GCA GGT 98GAA GGC ACT GGA TCT TCT CTT CCT GTT TTC AGT ACT GCA GGT 98

Glu Gly Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly -15 -10 -5Glu Gly Thr Gly Ser Ser Leu Pro Val Phe Ser Thr Ala Gly -15 -10 -5

TAGGGGCTCA CCAGTTCAAA ATCTGAAGAG GAAACAGAAT CTGAGGTGAC AGTGATACCT 158TAGGGGCTCA CCAGTTCAAA ATCTGAAGAG GAAACAGAAT CTGAGGTGAC AGTGATACCT 158

ACTATCCTTC TGTCCACAGG T GTC CAC TCC CAG GTC CAG CTT CAC GAG TCT 209ACTATCCTTC TGTCCACAGG T GTC CAC TCC CAG GTC CAG CTT CAC GAG TCT 209

Val His Ser Gin Val Gin Leu His Glu Ser -3 1 5Val His Ser Gin Val Gin Leu His Glu Ser -3 1 5

GGG GCT GAA GTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG 257 Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 10 15 20 GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT ACC TAC TGG ATG CAC TGG ATA AAA CAG 305 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gin 25 30 35GGG GCT GAA GTG GCA AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG 257 Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 10 15 20 GCT TCT GGC TAC ACC TTT ACT ACC TAC TGG ATG CAC TGG ATA AAA CAG 305 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gin 25 30 35

AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT AGC ACT 353 Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr 40 45 50 55AGG CCT GGA CAG GGT CTG GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT AGC ACT 353 Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr 40 45 50 55

GGT TAT ACT GAC TAC AAT CAG AAC TTC AAG GAC AAG GCC ACA TTG ACT 401 Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 60 65 70GGT TAT ACT GAC TAC AAT CAG AAC TTC AAG GAC AAG GCC ACA TTG ACT 401 Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Gin Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 60 65 70

GCA GAC AAA TCC TCC AGA ACA GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA 449 Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr 75 80 85GCA GAC AAA TCC TCC AGA ACA GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA 449 Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr 75 80 85

TCT GAG GAC TCT ACA GTC TAT TAC TGT ACA AGA AGG GGA CCC TCG TAT 497 Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Pro Ser Tyr 90 95 100TCT GAG GAC TCT ACA GTC TAT TAC TGT ACA AGA AGG GGA CCC TCG TAT 497 Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Pro Ser Tyr 90 95 100

GGT AAC CAC GGG GCC TGG TTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC 545 Gly Asn His Gly Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 105 110 115GGT AAC CAC GGG GCC TGG TTT CCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC 545 Gly Asn His Gly Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 105 110 115

ACT GTC TCT GCA GGTGAGTCCT AACTTCTCCC ATTCTAAATG CATGCGGCCG 597ACT GTC TCT GCA GGTGAGTCCT AACTTCTCCC ATTCTAAATG CATGCGGCCG 597

Thr Val Ser AlaThr Val Ser Ala

120120

C 598C 598

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 412 Basenpaare(A) LENGTH: 412 base pairs

(B) ART: Nukleinsäure(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANGFORM: Doppel(C) STRAND FORM: Double

(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR(A) NAME / KEY: 5'UTR

(B) LAGE: 1..4(B) LOCATION: 1..4

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS(A) NAME / KEY: CDS

(B) LAGE: 5..412(B) LOCATION: 5..412

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Primaerprodukt der leichten kappa-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Primary product of the light kappa chain from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peptide(A) NAME / KEY: sig_peptide

(B) LAGE: 5..91 (ix) MERKMALE:(B) LOCATION: 5..91 (ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide(A) NAME / KEY: mat_peptide

(B) LAGE: 92..>412(B) LOCATION: 92 ..> 412

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Leichte kappa-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Light kappa chain from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 92..412(B) LOCATION: 92..412

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region der leichten kappa-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region of the light kappa chain of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 161..193(B) LOCATION: 161..193

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Variable Region CDR1 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Variable region CDR1 from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 239..259(B) LOCATION: 239..259

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Variable Region CDR2 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Variable region CDR2 from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 356..382(B) LOCATION: 356..382

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Variable Region CDR3 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Variable region CDR3 from BerH2"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

GGAA ATG CAT CAG ACC AGC ATG GGC ATC AAG ATG GAA TCA CAG ACT CTG 49 Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin Thr Leu -29 -25 -20 -15GGAA ATG CAT CAG ACC AGC ATG GGC ATC AAG ATG GAA TCA CAG ACT CTG 49 Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin Thr Leu -29 -25 -20 -15

GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT GGT GCT GAT GGG AAC ATT 97 Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile -10 -5 1GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT GGT GCT GAT GGG AAC ATT 97 Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile -10 -5 1

GTA ATG ACC CAA TCT CCC AGA TCC ATG TCC ATG TCT GTA GGA GAG AGG 145 Val Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg 5 10 15GTA ATG ACC CAA TCT CCC AGA TCC ATG TCC ATG TCT GTA GGA GAG AGG 145 Val Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg 5 10 15

GTC ACC TTG AGC TGC AAG GCC AGT GAG AAT GTG GAT ACT TAT GTA TCC 193 Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val Ser 20 25 30GTC ACC TTG AGC TGC AAG GCC AGT GAG AAT GTG GAT ACT TAT GTA TCC 193 Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val Ser 20 25 30

TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT AAA CTC CTG ATA TAC GGG 241 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 35 40 45 50TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT AAA CTC CTG ATA TAC GGG 241 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 35 40 45 50

GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA 289 Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 55 60 65 TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC 337 Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp 70 75 80GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA 289 Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 55 60 65 TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC 337 Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp 70 75 80

CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG AGT TAC AGA TAT CCT CCC ACG TTC 385 Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr Phe 85 90 95CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG AGT TAC AGA TAT CCT CCC ACG TTC 385 Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr Phe 85 90 95

GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 412 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 412 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 136 Aminosäuren(A) LENGTH: 136 amino acids

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin Thr Leu Val -29 -25 -20 -15Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin Thr Leu Val -29 -25 -20 -15

Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val -10 -5 1Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val -10 -5 1

Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val 5 10 15Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val 5 10 15

Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val Ser Trp 20 25 30 35Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val Ser Trp 20 25 30 35

Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala 40 45 50Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala 40 45 50

Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 55 60 65Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 55 60 65

Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu 70 75 80Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu 70 75 80

Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly 85 90 95Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly 85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LÄNGE: 777 Basenpaare(A) LENGTH: 777 base pairs

(B) ART: Nukleinsäure(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANGFORM: Doppel(C) STRAND FORM: Double

(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 1..6(B) LOCATION: 1..6

(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Restriktionsschnittstelle Sall, synthetisch"(D) OTHER INFORMATION: / note = "Sall restriction interface, synthetic"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'UTR(A) NAME / KEY: 5'UTR

(B) LAGE: 7..10(B) LOCATION: October 7th

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon(A) NAME / KEY: exon

(B) LAGE: 11..85(B) LOCATION: 11..85

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= Exonl(D) OTHER INFORMATION: / label = exonl

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: intron(A) NAME / KEY: intron

(B) LAGE: 86..374(B) LOCATION: 86..374

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon(A) NAME / KEY: exon

(B) LAGE: 375..707(B) LOCATION: 375..707

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= Exon2(D) OTHER INFORMATION: / label = Exon2

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: intron(A) NAME / KEY: intron

(B) LAGE: 708..777(B) LOCATION: 708..777

(D) SONSTIGE ANGABEN: /label= J2-Intron(D) OTHER INFORMATION: / label = J2 intron

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS(A) NAME / KEY: CDS

(B) LAGE: joinfll..85, 375..707)(B) LOCATION: joinfll..85, 375..707)

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Prim.prod. d. var. Region d. leichten kappa-Kette v. BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Prim.prod. D. Var. Region of the light kappa chain by BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 674..>777(B) LOCATION: 674 ..> 777

(D) SONSTIGE ANGABEN: /function= "J2-Minigen"(D) OTHER INFORMATION: / function = "J2-Minigen"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: sig_peptide(A) NAME / KEY: sig_peptide

(B) LAGE: join(11..85, 375..386) (ix) MERKMALE:(B) LOCATION: join (11..85, 375..386) (ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide(A) NAME / KEY: mat_peptide

(B) LAGE: 387..>707(B) LOCATION: 387 ..> 707

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region der leichten kappa-Kette von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region of the light kappa chain of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 456..488(B) LOCATION: 456..488

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR1 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR1 of BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 534..554(B) LOCATION: 534..554

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR2 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR2 from BerH2"

(ix) MERKMALE:(ix) FEATURES:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature(A) NAME / KEY: misc_feature

(B) LAGE: 651..677(B) LOCATION: 651..677

(D) SONSTIGE ANGABEN: /product= "Variable Region CDR3 von BerH2"(D) OTHER INFORMATION: / product = "Variable region CDR3 from BerH2"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

GTCGACGGAA ATG CAT CAG ACC AGC ATG GGC ATC AAG ATG GAA TCA CAG 49 Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin -29 -25 -20GTCGACGGAA ATG CAT CAG ACC AGC ATG GGC ATC AAG ATG GAA TCA CAG 49 Met His Gin Thr Ser Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gin -29 -25 -20

ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT GGTAAAACAT 95ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT GGTAAAACAT 95

Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr -15 -10 -5Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr -15 -10 -5

TTAAAAGTAC TATAATATCT TAAAATAATT AATTTGTAGA GAAATAGCTA TTTCCTATAG 155TTAAAAGTAC TATAATATCT TAAAATAATT AATTTGTAGA GAAATAGCTA TTTCCTATAG 155

GATGCCAATA GCATGCAGAC AATGCAATTA GAAAAGTTAT TTTAAAATCT AAAATCTTGC 215GATGCCAATA GCATGCAGAC AATGCAATTA GAAAAGTTAT TTTAAAATCT AAAATCTTGC 215

TGGCATATCG ATGGTGACTG CGTTTGGAGG CTGATTTTTG GATGGATCCC CCCCCCAAAA 275TGGCATATCG ATGGTGACTG CGTTTGGAGG CTGATTTTTG GATGGATCCC CCCCCCAAAA 275

AAAGAAAAGA AAAGTTATTT TAGATTCCAA CGATTATGTA ATGAAGTCTT TTGTGTGTGT 335AAAGAAAAGA AAAGTTATTT TAGATTCCAA CGATTATGTA ATGAAGTCTT TTGTGTGTGT 335

GTGTGTGTAT ATATATATAT ACTCATTGTT CTGATTTCA GGT GCT GAT GGG AAC 389GTGTGTGTAT ATATATATAT ACTCATTGTT CTGATTTCA GGT GCT GAT GGG AAC 389

Gly Ala Asp Gly Asn -4 1Gly Ala Asp Gly Asn -4 1

ATT GTA ATG ACC CAA TCT CCC AGA TCC ATG TCC ATG TCT GTA GGA GAG 437 Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu 5 10 15ATT GTA ATG ACC CAA TCT CCC AGA TCC ATG TCC ATG TCT GTA GGA GAG 437 Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Arg Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu 5 10 15

AGG GTC ACC TTG AGC TGC AAG GCC AGT GAG AAT GTG GAT ACT TAT GTA 485 Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val 20 25 30 TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT AAA CTC CTG ATA TAC 533AGG GTC ACC TTG AGC TGC AAG GCC AGT GAG AAT GTG GAT ACT TAT GTA 485 Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr Val 20 25 30 TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT AAA CTC CTG ATA TAC 533

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

GGG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT CGC TTC ACA GGC AGT 581GGG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT CGC TTC ACA GGC AGT 581

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 50 55 60 65Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 50 55 60 65

GGA TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA 629GGA TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA 629

Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu 70 75 80Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu 70 75 80

GAC CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG AGT TAC AGA TAT CCT CCC ACG 677GAC CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG AGT TAC AGA TAT CCT CCC ACG 677

Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr 85 90 95Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Arg Tyr Pro Pro Thr 85 90 95

TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGTAAGTAGT CTTCTCAATT 727TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGTAAGTAGT CTTCTCAATT 727

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile LysPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105100 105

TTGTTCACTA AGTCTAACCT TGTTAAGTGC GGCCGCACTA GTGATATCCC 777 TTGTTCACTA AGTCTAACCT TGTTAAGTGC GGCCGCACTA GTGATATCCC 777

>*JDΛP'i*-TER VERTPΛG ÜBER DIE INTERNATIONALE ΛNi ι<KEWNUNG DER HII.T- ERLEGJNG VO.J MK;R00RGΛNISML. PUR DIE ZWECKE VON PATTNTV^PJ- \HREN> * JDΛP'i * -TER VERTPΛG ON THE INTERNATIONAL ΛNi ι <KNOWING THE HII.T- ERLEGJNG VO.J MK; R00RGΛNISML. PURE THE PURPOSES OF PATTNTV ^ PJ- \ HREN

INTERNATIONALES FORMBLATTINTERNATIONAL FORM

Institute of PathologyInstitute of Pathology

UK Benjamin FranklinUK Benjamin Franklin

Hindenburgdamm 30Hindenburgdamm 30

12200 Berlin medac EMPFANGSBESTAnGUNG BB ERSTHINTERLEGUNG,12200 Berlin medac RECEIPT CONDITION BB First filing,

Fehlandtstr. 3 ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenenFehlandtstrasse 3 issued in accordance with rule 7.1 of the below

20354 Hamburg INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE20354 Hamburg INTERNATIONAL DEPOSIT

I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUSI LABELING THE MICROORGANISM

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezuεszeichen. Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER.Reference sign assigned by the DEPOSITOR. INPUT NUMBER assigned by the INTERNATIONAL DEPOSIT.

CH-BerH2CH-BerH2

DSM ACC2224DSM ACC2224

II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNGII. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND / OR PROPOSED TAXONOMIC NAME

Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurdeWith the microorganism designated under I.

(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung(X) a scientific description

( ) eine vorgeschlagene laxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen)() submitted a proposed laxonomic name. (Tick the appropriate)

III. EINGANG UND ANNAHMEIII. ENTRANCE AND ACCEPTANCE

Diese internationale Hmteriegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an. der bei ihr am 1 9 9 5 - 08 - 0 8 (Datum der Ersthimeriegung)1 eingegangen istThis international regulatory body adopts the microorganism designated under I. which it received on 1 9 9 5 - 08 - 0 8 (date of first homing) 1

IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNGIV. RECEIPT FOR CONVERSION

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internauonaien Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst¬ hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)The microorganism referred to under I was received by this internal depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this first deposit into a deposit according to the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion)

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLEV INTERNATIONAL DEPOSIT

Name DSM-DCUTSCI1L" SAMMLUNG VON Uιucrsclιrιfl(cιι) der zur Vertretung der inlcrnaliυnalen I linlcrlcgungsslcllc MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten BedienstetenName DSM-DCUTSCI1L " COLLECTION OF Uιucrsclιrιfl (cιι) the person (s) authorized by the person authorized by them to represent the international I linlcrlcgungsslcllc MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH

Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig es. us^-C,Address Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig es. us ^ -C,

Datum. 1995 - 08 - 18Date. 1995-08-18

Talls Regel 6 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer inicmalionalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblau DSM-BP/4 (einzige Seite) 07/94 1 IDΛPI-5TER VERTR ΛG UURR DIE INTFIlNA llONALL ANLΛKEWN JNG DER HlrTERLES'JNG VOM MM'.ROORGANISML. I-'UR DlE /WECK ύ VON (,Λ'ιTNT-/1*l<l Λl .ki-i-JTalls Rule 6 4 letter d applies, this is the point in time at which the status of an inicmalional depository was acquired. Form blue DSM-BP / 4 (single side) 07/94 1 IDΛPI-5TER CONTRACT UURR THE INTFIlNA llONALL ANLΛKEWN JNG THE HlrTERLES'JNG FROM MM'.ROORGANISML. I- ' UR DlE / WECK ύ VON (, Λ ' ιTNT- / 1 * l <l Λl .ki-iJ

INTERNAnONALES FORMBLATTINTERNAnONAL FORM

Institute of PathologyInstitute of Pathology

UK Benjamin FranklinUK Benjamin Franklin

Hindenburgdamm 30Hindenburgdamm 30

12200 Berlin medac LEBENSFÄHIGKEΓΓSBESCHEΓNIGUNG12200 Berlin medac VIABILITY ACCELERATION

Fehlandtstr. 3 ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenenFehlandtstrasse 3 issued in accordance with Rule 10.2 of the below

20354 Hamburg INTERNAnONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE20354 Hamburg INTERNAnONAL DEPOSIT

I HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUSI DEPOSIT II. LABELING OF THE MICROORGANISM

Name Institute of Pathology Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLEName Institute of Pathology From the INTERNATIONAL DEPOSIT

UK Benj amin Franklin zugeteilte EINGANGSNUMMER Anschrift. Hindenburgdamm 30 DSM ACC2224UK Benj amin Franklin assigned INPUT NUMBER address. Hindenburgdamm 30 DSM ACC2224

12200 Berlin medac Datum der Hinterlegung oder Weitcricitung'12200 Berlin medac date of filing or further disclosure '

Fehlandtstr. 3 1995 - 08 - 08 20354 HamburgFehlandtstrasse 3 1995-08-08 20354 Hamburg

III. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNGIII. VITALITY CERTIFICATE

Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1 9 95 - 0 8 - 0 8 * geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der MikroorganismusThe viability of the microorganism mentioned under II was checked on 1 9 95 - 0 8 - 0 8 * at that time the microorganism was

(X)' lebensfähig(X) 'viable

( )' nicht mehr lebensfähig() 'no longer viable

IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN ISTIV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VITALITY EXAMINATION HAS BEEN CARRIED OUT

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLEV INTERNATIONAL DEPOSIT

Name DSM-DEUTSCHC SAMMLUNG VON Untcrschrift(cn) der zur Vertretung der inicmalionalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Pcrson(cn) oder des (der) von ihr ermächtigten BedienstetenName DSM-DEUTSCHC COLLECTION OF signature (cn) of the person authorized to represent the inicmalional depositary MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH or the official (s) authorized by her

Anschrift Mascheroder Weg I b D-38124 Braunschweic -Λ. USj2.'άθ iλiiiiin 1 9 95 - 0 8 - 1 8Address Mascheroder Weg I b D- 3 8124 Braunschweic -Λ. US j 2.'άθ iλiiiiin 1 9 95 - 0 8 - 1 8

Angabe des Datums der Ersüiinlcrlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weitcricitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder WeitcricitungIndication of the date of the renewal of the filing, if a new filing or further disclosure has been made, the date of the last new filing or further filing

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten LebensfϊhigkeitsprtlfungIn the cases provided for in Rule 10.2 (a) (ii) and (iii), indicate the last viability test

ZuirefTcndcs ankreuzenCheck ZuirefTcndcs

Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung πcgauv warenComplete if the information has been requested and if the results of the test were πcgauv

Formblati DSM-BP/9 (einzige Seite) 07/94 Form DSM-BP / 9 (single page) 07/94

Claims

Patentansprüche claims 1. Rekombinante DNA-Moleküle, welche für variable Immunglobu¬ linketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 aufweisen, wobei die rekombinanten DNA-Moleküle Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen.1. Recombinant DNA molecules which code for variable immunoglobulin chains or fragments thereof, which have specificity for the human cell membrane antigen CD30, the recombinant DNA molecules having sequences according to one or more of SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof. 2. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1 , dadurch gekenn¬ zeichnet, daß sie jeweils einen oder mehrere der hypervaria¬ blen Bereiche der in den SEQ ID NOS: 1 oder 3 bzw. in den SEQ ID NOS: 4 oder 6 angegebenen Sequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen.2. Recombinant DNA molecules according to claim 1, characterized in that they each have one or more of the hypervariable regions of the sequences specified in SEQ ID NOS: 1 or 3 or in SEQ ID NOS: 4 or 6 or include syngeneic or allelic variants of the same. 3. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Frag¬ mente oder syngene oder allelische Varianten derselben ope¬ rativ miteinander verknüpft sind.3. Recombinant DNA molecules according to claims 1 or 2, characterized in that the sequences according to one or more of SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof ope¬ are relatively linked. 4. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 3, da¬ durch gekennzeichnet, daß die Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Frag¬ mente oder syngene oder allelische Varianten derselben ope¬ rativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für konstante Teile eines humanen oder tierischen Immunglobulinmoleküls kodieren.4. Recombinant DNA molecules according to claims 1 to 3, characterized in that the sequences according to one or more of SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof are operatively linked to DNA sequences which code for constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule. 5. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 4, da¬ durch gekennzeichnet, daß die in den SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 angegebenen Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für toxische Proteine oder Enzyme kodieren. 5. Recombinant DNA molecules according to claims 1 to 4, characterized in that the sequences given in SEQ ID NOS: 1, 3, 4 and / or 6 or their fragments or syngeneic or allelic variants thereof surgically with DNA Sequences are linked that code for toxic proteins or enzymes. 6. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein oder mehrere der rekombinanten DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 5, operativ verknüpft mit Expressionskontroll-Sequenzen, enthält.6. Expression vector, characterized in that it contains one or more of the recombinant DNA molecules according to claims 1 to 5, operatively linked to expression control sequences. 7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Expression in einer Prokaryonten-Wirtszelle geeignet ist.7. Expression vector according to claim 6, characterized in that it is suitable for expression in a prokaryotic host cell. 8. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Expression in einer Eukaryonten-Wirtszelle geeignet ist.8. Expression vector according to claim 6, characterized in that it is suitable for expression in a eukaryotic host cell. 9. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem der Vektoren nach den Ansprüchen 6 bis 8 transformiert ist.9. host cell, characterized in that it is transformed with one of the vectors according to claims 6 to 8. 10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Prokaryonten-Zelle ist.10. Host cell according to claim 9, characterized in that it is a prokaryotic cell. 11. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Eukaryonten-Zelle ist.11. Host cell according to claim 9, characterized in that it is a eukaryotic cell. 12. Wirtszelle nach Anspruch 11 mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2224.12. Host cell according to claim 11 with the deposit number DSM ACC2224. 13. Verfahren zur Herstellung von Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der Wirtszellen nach den Ansprüchen 9 bis 12 in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, anschließend die Zellen von dem Medium abtrennt und die Liganden als Expressions¬ produkte aus dem Medium oder aus dem Cytoplasma der Wirts¬ zellen isoliert.13. A process for the preparation of ligands for the human cell membrane antigen CD30, characterized in that one of the host cells according to claims 9 to 12 is cultivated in a suitable nutrient medium, then the cells are separated from the medium and the ligands are expressed as expression products isolated from the medium or from the cytoplasm of the host cells. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Liganden anschließend reinigt und mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu pharmazeutischen oder diagnostischen Präparaten formuliert.14. The method according to claim 13, characterized in that the ligands are then cleaned and with conventional auxiliary and carriers formulated into pharmaceutical or diagnostic preparations. 15. Rekombinante Liganden für das menschliche Zellmembran-Anti- gen CD30, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben umfassen.15. Recombinant ligands for the human cell membrane antigen CD30, characterized in that they comprise at least the amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: 2 and / or 5. 16. Rekombinante Liganden nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich¬ net, daß sie jeweils einen oder mehrere der hypervariablen CDR-Bereiche der in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen.16. Recombinant ligands according to claim 15, characterized in that they each comprise one or more of the hypervariable CDR regions of the amino acid sequences given in SEQ ID NOS: 2 and / or 5 or syngeneic or allelic variants thereof. 17. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 oder 16, da¬ durch gekennzeichnet, daß in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebene Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder alleli¬ sche Varianten derselben untereinander verknüpft sind.17. Recombinant ligands according to claims 15 or 16, characterized in that in the SEQ ID NOS: 2 and / or 5 amino acid sequences or fragments or allelic variants thereof are linked to one another. 18. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 oder 16, da¬ durch gekennzeichnet, daß in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebene Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder alleli¬ sche Varianten derselben mit konstanten Teilen eines humanen oder tierischen Immunglobulinmoleküls verknüpft sind.18. Recombinant ligands according to claims 15 or 16, characterized in that amino acid sequences or fragments or fragments or allelic variants thereof given in SEQ ID NOS: 2 and / or 5 are linked to constant parts of a human or animal immunoglobulin molecule. 19. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie peptidisch oder über Linker-Moleküle mit toxischen Proteinen oder mit Enzymen bzw. Proenzymen verknüpft sind.19. Recombinant ligands according to claims 15 to 18, characterized in that they are linked peptide or via linker molecules with toxic proteins or with enzymes or proenzymes. 20. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Toxinen in Form von Ribosomen- inaktivierenden Proteinen verknüpft sind. 20. Recombinant ligands according to claims 15 to 19, characterized in that they are linked to toxins in the form of ribosome-inactivating proteins. 21. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Enzymen aus der Gruppe der Phos- phodiesterasen verknüpft sind.21. Recombinant ligands according to claims 15 to 19, characterized in that they are linked to enzymes from the group of phosphodiesterases. 22. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie direkt oder über Linker-Moleküle kovalent oder konjugiert mit radioaktiven Isotopen verknüpft sind.22. Recombinant ligands according to claims 15 to 18, characterized in that they are linked directly or via linker molecules covalently or conjugated to radioactive isotopes. 23. Rekombinante Liganden nach Anspruch 22, dadurch gekennzeich¬ net, daß die radioaktiven Isotope aus der Gruppe bestehend aus Indium, Jod, Yttrium, Technetium, Rhenium, Kupfer und Lutetium ausgewählt sind.23. Recombinant ligands according to claim 22, characterized in that the radioactive isotopes are selected from the group consisting of indium, iodine, yttrium, technetium, rhenium, copper and lutetium. 24. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie direkt oder über Linker-Moleküle kovalent oder konjugiert mit photoaktivierbaren Verbindungen verknüpft sind.24. Recombinant ligands according to claims 15 to 19, characterized in that they are linked covalently or conjugated with photoactivatable compounds directly or via linker molecules. 25. Diagnostische oder pharmazeutische Präparate, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß sie einen oder mehrere der Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 24 allein oder in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln enthalten.25. Diagnostic or pharmaceutical preparations, characterized in that they contain one or more of the ligands according to Claims 15 to 24, alone or in combination with conventional carriers and diluents. 26. Diagnostische oder pharmazeutische Präparate, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Liganden herge¬ stellt nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 13 oder 14 allein oder in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln enthalten.26. Diagnostic or pharmaceutical preparations, characterized in that they contain one or more ligands produced by the process according to claims 13 or 14, alone or in combination with conventional carriers and diluents. 27. Verwendung der Präparate nach den Ansprüchen 25 oder 26 zur Diagnostik und/oder Behandlung von Krebsformen, bei denen das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 gebildet wird.27. Use of the preparations according to claims 25 or 26 for the diagnosis and / or treatment of forms of cancer in which the human cell membrane antigen CD30 is formed. 28. Verwendung der Präparate nach Anspruch 27 zur Diagnose und/ oder Behandlung der Hodgkinschen Erkrankung. 28. Use of the preparations according to claim 27 for the diagnosis and / or treatment of Hodgkin's disease.
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