WO1997011096A1

WO1997011096A1 - Anti-inflammatory agent

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Publication number: WO1997011096A1
Application number: PCT/JP1996/002706
Authority: WO
Inventors: Mamoru Kyogashima; Akira Asari
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 1998-03-19
Also published as: CA2232527A1; US6537977B1; CN1196734A; AU7001496A; AU717673B2; JP4027973B2; EP0852236A4; RU2176509C2; EP0852236A1; CA2232527C

Description

明細書

抗炎症剤

技術分野

本発明は抗炎症剤、特に遷延性炎症（慢性進行性炎症）あるいは免疫機序が関与する炎症に対する抗炎症剤に関する。

さらに、本発明は、免疫抑制剤との併用により、その抗炎症効果を増強する免疫抑制剤の効果増強剤あるいは抗炎症効果の増強された薬剤に関する。

本発明によると、糸球体腎炎、膠原病あるいはその近縁疾患、難治性血管炎、炎症を伴なう免疫異常、自己免疫疾患等の疾患の発症、伸展を予防し、あるいは治療することができる。背景技術

免疫機序が関与する炎症、例えば、糸球体腎炎、膠原病あるいはその近縁疾患、難治性血管炎ならびに炎症を伴う免疫異常、自己免疫疾患等は、時に急性增悪を繰り返しながら慢性進行性に経過し、放置すると臓器の荒廃を招き腎不全や他の臓器不全を発症し、死亡に至る。こうした慢性進行性炎症の多くは難治性であり、その発症には、免疫異常、それに伴う種々の炎症性メデイエ一ターの持続的な活性化等が原因と考えられ、これらの原因に注目して様々の治療が模索されてきた。例えば、免疫異常があることから、副肾皮質ステロイドゃシクロホスフアミド、あるいはミゾリビン、メトトレキサート、ァザチォプリンといった免疫抑制剤の通常の方法による使用やこれらのものの大量静注療法（パルス療法）が行われている。しか.し、副腎皮質ステロイドには副腎皮質機能の抑制作用、易感染性、あるいは消化性潰瘍、高血圧、骨粗しょう症の発症等様々な極めて重篤な副作用がある。またその他の免疫抑制剤にも骨髄抑制、胃腸障害、肝障害、間質性肺炎、腎障害、出血性膀胱炎の発症等極めて重篤な副作用が存在する。加えてこの種の薬剤療法は原因療法ではなく、年余にわたる薬剤の使用を余儀なくされるため、重篤な副作用があることは極めて深刻な問題となる。さらに疾患の中にはこういった薬剤に抵抗性を示すものもある。腎炎や血管炎を主病変とする疾患に対しては抗血小板剤や抗凝固剤も用いられることがある。し力、し、例えばへパリンやヮーフアリン（商品名；一般名、ヮルフアリンカリウム）等の抗凝固剤を用いると出血という副作用の懸念が常につきまとう。また、抗血小板剤にしてもやはり出血の危険は残る。膠原病の中には全身性エリテマ卜一デス（S L E ) のように血小板の低下する例が多いことや、糸球体腎炎をおこすグッドバスチヤ一（Good pasture)症候群のように肺出血を併発する疾患も多く、こういつたケースに対しては抗血小板剤の使用は難しい。また最近、へパリンゃ低分子へパリンが S L Eに伴う腎炎の予防に効果があるという報告もされているが（特開平 2-40327号公報、 Arth ritis Rheum. 33, 1554, 1990)、後述するように本発明者らの実験からはその効果は不確かなものであった。発明の開示

免疫機序が関与する炎症、例えば、糸球体腎炎、膠原病あるいはその近縁疾患、難治性血管炎、ならびに炎症を伴う免疫異常、自己免疫疾患のすべての要素を含む疾患が前述の S L Eであるが、本発明者らは上記のような事情に鑑みて S L Eの動物モデルの一つである M R L (lpr/lpr) マウス（【zui S. , et al. , Mechanism of genetic control of murine systemic lupus erythematosus. , In Systemic Lupus Erythematosus, pp.3-12, Ed. Peter A. Miescher, Spr i nger-Ver 1 ag Berlin, 1995)を用い、デルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩のこうした炎症疾患に対する作用を調べたところ、このものが炎症反応を抑制し、病気の進行を遅らせることに加え、安全性に優れており、長期使用に耐え得ることを見いだした。さらに、免疫機序が関与する炎症のもう一つの例として、ヒ卜の多発性硬化症の動物モデル、ラット実験的アレルギー性脳脊髄炎を用い、デルマタン硫酸の効果を確認したところ、この疾病に対し、有効であることが判明した。また、デルマタン硫酸のうちでも、特定の物性あるいは由来のデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩が用いられた場合は、これらのデルマタン硫酸が血中により長く保持され、より好ましいことを見いだした。すなわち、本発明の目的に特に適したデルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩は、 Δ Di-0S(A HexAl →3GaINAc)の含有率が 2 ~ 9 %、より好ましくは 3〜 8 %であるもの；極限粘度（ 100mL/g)が 0.8〜2.0 であるもの；分子量既知のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマトグラフィ一によるゲル濂過法（Biochim. Biop ys. Acta, 1117， 60- 70, 1992に記載の方法；参考例 1，（1) 平均分子量の測定参照）によって測定した平均分子量が 25, 000〜100, 000 、より好ましくは 30， 000 〜60， 000であるもの；あるいは鶏冠由来のデルマタン硫酸であることを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明は、デルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩の前記の作用を利用して、炎症に対して優れた抗炎症効果を示す抗炎症剤、特に免疫機序が関与する炎症あるいは遷延性炎症である糸球体腎炎、膠原病またはその近縁疾患、難治性血管炎、あるいは免疫異常または自己免疫疾患等に伴なう炎症等の難治性炎症の予防または治療に有効な抗炎症剤を提供することを課題とする。

また、硫酸基を有するグリコサミノグリカンと免疫抑制剤を併用した免疫抑制剤の抗炎症効果増強剤または両者を併用した抗炎症効果を増強するための薬剤を提供することを課題とする。

本発明は、上記したようにデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤に関する。特に、デルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、遷延性炎症あるいは免疫機序が関与する炎症例えば自己免疫疾患に伴う炎症に対して抗炎症作用を示す抗炎症剤に関する。なかでも、多発性硬化症に伴う炎症、膠原病またはその近縁疾患に伴う炎症、糸球体腎炎、難治性血管炎等に対して有用な抗炎症剤に関する。また、特定の物性または由来のデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする上記の抗炎症剤に関する。

さらに、本発明は硫酸基を有するグリコサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、免疫抑制剤による免疫抑制の結果として起こる抗炎症効果を増強する抗炎症効果増強剤に関する。

さらにまた、本発明は硫酸基を有するグリコサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩と免疫抑制化合物（免疫抑制剤）とよりなり、免疫抑制剤の抗炎症作用の増強された薬剤に関する。

免疫抑制剤と併用される硫酸基をもつグリコサミノグリカンとしては、デルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸があげられる力 <、なかでもデルマタン硫酸が好ましく、特に上記特定の物性または由来のデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩が好ましい。図面の簡単な説明

第 1 図は、由来の異なるデルマタン硫酸をラッ卜に投与し、経時的にその血中濃度（残存率）を測定した結果を示す。

図中、〇は鶏冠由来のデルマタン硫酸を、 ·は牛腸由来のデルマタン硫酸をそれぞれ示す。 Xは、〇及び鲁が重なっていることを示す。

第 2図は、実施例 1 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの血液凝固系に対する影響を示す。

図中、〇は低分子へパリンの投与を、また拿はデルマタン硫酸の投与をそれぞれ示す。

第 3図は、実施例 2 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの腎機能を反映する血清成分に対する影響を示す。 aは BUN の測定結果、 b はクレアチニンの測定結果を示す。また、 b において *は Bonferroni の検定により、危険率 P < 0.05で有意差があることを示す。

第 4図は、実施例 2 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの腎臓の剖検結果を示す顕微鏡写真である（写真倍率 X 500，一（Bar)は 10 m である）。

aは正常な腎臓、 bは MC (微小変化）の腎臟、 c は DP(WH0のびまん性糸球体腎炎の增殖性糸球体腎炎に相当し、機能不全に陥っているもの）の腎臓の組織像を示す。

第 5図は、実施例 2 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの異常な糸球体の割合を示す。

aは全糸球体数に対する MC (微小変化）糸球体数の割合を、 bは全糸球体数に対する DP糸球体数の割合を示す。

第 6図は、実施例 2 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの腎動脈の組織像を示す顕微鏡写真である（写真倍率 X 204, - (Bar) は 50 m である）。 a は正常対照の組織像、 b は軽度の、 c は中等度の、 dは重度の血管炎の組織像をそれぞれ示す。

第 7 図は、実施例 2 においてデルマタン硫酸をマウスに投与したときの血中のフィブリノ一ゲンの測定結果を示す。

第 8 図は、実施例 3 においてデルマタン硫酸（25mg/kg) と各投与量のエンドキサン（シクロホスフアミドの商標名）を単独または併用してマウスに投与したときの血清クレアチニンに対する影響を示す。

D Sはデルマ夕ン硫酸の投与を、 Endはェンドキサンの投与を示す。

*は Bonferroni の検定により、危険率 P く 0.05で有意差があることを示す。

第 9 図は、実施例 3 においてデルマタン硫酸（25mg/kg) と各投与量のェンドキサンを単独または併用してマウスに投与したときの脾臓重量に対する影響を示す。

第 1 0 図は、実施例 3 においてデルマタン硫酸（25mg/kg) と各投与量のェンドキサンを単独または併用してマウスに投与した時の腸間膜リンパ節重量に対する影響を示す。

* *は Bonferroni の検定により危険率 P く 0.01で有意差があることを示す。発明を実施するための最良の形態

デルマタン硫酸は、 N-ァセチル- D- ガラクトサミン - 4- 硫酸とレイズロン酸とからなる二糖の繰返し構造（ Ido- GalNAc) が主である力少量の D-グルクロン酸も含まれ、動物種および臓器もしくは器官などによって硫酸含量、硫酸基の結合位置、 D- グルクロン酸含量が異つている。

通常デルマタン硫酸は、牛、豚、馬、羊、山羊、兎等の哺乳類または鶏、家鴨、がちょう等の鳥類の腸粘膜、皮廣、肺、腎臓、肝臓、薩、大動脈、脾臓、脳、胸腺、軟骨またはとさか等の原料から製造される。

本発明に使用されるデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩（以下、特にことわらない限り、「デルマタン硫酸」というときに、その薬理学的に許容される塩も含めた意味で使用することもある）としては、従来知られているこれらの化合物であればどのような化合物でも使用することができる。すなわち、その物性および由来は限定されない。

このような化合物としては、例えば動物（哺乳動物、鳥類等）の臓器等（腸、皮庸、腎臓、血管）、具体的には鶏冠、牛腸、豚腸、豚皮膚、牛腎臓、豚腎臓、牛大動脈等に由来するものであって、例えば、第 1 表に示すような物性（平均分子量、極限粘度、構成二糖組成）を示すものが例示される。また、分子量

1， 600〜10， 000程度の比較的低分子量のデルマタン硫酸（Do I， F. et al. J. Lab. Clin. Med. , 1990, vol.115, 43- 51あるいは、 B i anch i n i , P. et al. T rombos i s and Haemos tas i s, 1991， vol .65, 1315あるしゝ（ま、 Barbant i, M. et al. Thrombos i s and Haemostasis, 1993， vol.69, 147-151参照）が知られている力、このような低分子デルマタン硫酸も本発明に使用することができる。なお、本発明において構成二糖組成とは、デルマタン硫酸をコンドロイチナーゼ A B Cで不飽和二糖に分解し、酵素分解物をイオン交換担体を用いる高速液体クロマトグラフィ一で分画し、各不飽和二糖異性体の含有量を分析する公知の方法

〔新生化学実験講座 3，糖質 I I， 49〜62頁（1991 年，（株）東京化学同人発行）の「 2 · 8 グリコサミノグリカン分解酵素と H P L Cを組合わせた構造解析」参照〕で得られる不飽和二糖の組成（％) である（具体的には参考例 1 参照）。また、不飽和二

ΔΔΔ厶厶厶厶

糖は通常 D D D D D D D第 1 表に示す記号で表され、各記号によって表される異性体の構造は下記式〔 I 〕と第 2 表で表される。

第 1 表各種デルタマン硫酸の由来および物性由来牛腸豚腸豚皮 I H 7tl 平均分子量（ダルトン） 16, 000 18， 500 14， 000 38, 000 極限粘度（100mL/g) 0.68 0.58 0.44 1.21

H, OH [ I 〕

(式中 R ¹ 、 R ² 、 R ³ は水素原子または S〇 ₃_を示し A c はァセチル基を示す。）

第 2 表略号 R R R

第 1 表および第 2 表の略号の示す構造は以下のとおり表記されることもある。

Δ Di-OS ： AHexAl →3GalNAc 、 Δ Di-6S ： Δ HexAl →3GalNAc (6S)、 Δ Di-4S ： AHexAl → 3Ga 1 NAc (4S)、 Δ Di-diS_D ： Δ HexA (2S)1 →3GalNAc(6S) 、 Δ Di-diS_E ： Δ HexAl →3GalNAc (4, 6 -diS) 、 Δ Di-diS_B ： AHexA(2S)l -→3GalNAc(4S) 、 Δ Di-triS ： Δ HexA(2S)l →3GalNAc(4, 6-diS)

上記式中、 AHexAは不飽和へキスロン酸、 GalNAcは N—ァセチル— D _ガラクトサミン、括弧内は硫酸基の結合位置と結合数を示す。

上記のようなデルマタン硫酸であればいずれも本発明の目的に使用しうる力なかでも生体に投与した際の血中の持続時間が長いこと、および出血等の副作用がほとんどないこと、などの長所を有する以下の物性または由来のデルマタン硫酸を好適に使用することができる。すなわち、 ① Δ Di-OS (Δ HexAl →3G alNAc)の含有率が 2 〜 9 %、より好ましくは 3 〜 8 %であるもの； ②極限粘度（100mL/g) が 0.8~2.0 であるもの； ③分子量既知のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマ卜グラフィ一によるゲル濾過法（Biochim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992に記載の方法）によって測定した平均分子量が 25, 000 〜 100, 000 、より好ましくは 30， 000〜60， 000であるもの；あるいは④鶏冠由来のデルマタン硫酸が好ましい。特に上記の①〜 ④要件をすベて具備したデルマタン硫酸またはそれと均等なデルマタン硫酸が、より好ましい。このようなデルマタン硫酸としては、具体的には本発明者らによる先の発明の特許出願明細書（ P C T国際公開、 W095/09188号公報参照）に参考例として記載された方法によって、鶏冠を原料として得られたデルマ夕ン硫酸のナ卜リゥム塩（第 1 表参照）が挙げられる。上記の鶏冠由来のデルマタン硫酸と牛腸由来のデルマタン硫酸（W095 /09 1 88号公報の参考例 2 参照）を、 S D系雄性ラットの尾静脈に投与し、血中のデルマタン硫酸の残存量の経時的変化を測定し、投与時のデルマタン硫酸に対する残存率を算出した（上記国際公開公報の実施例 1 参照）。両化合物のラッ卜の投与後の血中残存率の経時変化を第 1 図に示した。図中、〇は鶏冠由来のデルマタン硫酸を ·は牛腸由来のデルマタン硫酸をそれぞれ示す。その結果、第 1 図に示すように、投与 5分後において鶏冠由来のデルマタン硫酸の残存率は牛腸由来のデルマタン硫酸の約 2 倍であり、投与 1 20分後においても鶏冠由来のデルマタン硫酸は約 1 0 %残存していたが、牛腸由来のデルマ夕ン硫酸はほとんど検出されなかった。すなわち、鶏冠由来のデルマタン硫酸あるいはそれと同等の物性を有するデルマタン硫酸は血中持続時間が長く、抗炎症効果が長時間持続するので、大量に投与しなくても治療効果が期待され、この点からみて最も好ましい。

本発明の抗炎症剤においては、デルマタン硫酸を、その薬理学的に許容される塩として使用することができる。このような塩の種類は限定されるものではないが、ナトリウム塩、力リウム塩、リチウム塩、カルシウム塩などが好ましく、通常はナトリゥム塩の形で投与される。

デルマタン硫酸は通常静脈内に投与されるが必要に応じて動脈内に投与されてもよいし、また筋肉内あるいは皮下に投与されてもよい。また、点眼剤として許容される適当な補助剤とともに製剤化し点眼してもよいし、あるいは適当な基剤に混ぜ、軟膏、あるいはクリームの形で皮廣ゃ粘膜に塗布してもよい。さらに、剤型等を工夫することによって経口剤とすることもできる。また、本発明の抗炎症剤、抗炎症効果増強剤または薬剤を調製する際は、有効量のデルマタン硫酸もしくは硫酸基を有するグリコサミノグリ力ンおよび Zまたは免疫抑制化合物（免疫抑制剤）を含有させ、医薬として許容される通常の安定剤、乳化剤、あるいは浸透圧調整剤、 pH調整剤等の補助剤を適宜用いることができる。

投与量は、デルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩を、成人に対し、一日総量 50〜 3000mgで、一日に単回あるいは適当な間隔をあけて 2 回乃至数回に分けて投与することができるし、数日にわたり持続点滴静注も可能である。

さらに、硫酸基を有するグリコサミノグリカンは免疫抑制剤と併用すると、免疫抑制剤のもつ抗炎症効果を著しく増強し、免疫抑制剤の用量を低減することができる。この結果、免疫抑制剤の投与による重篤な副作用を低減することができる。従つて、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを有効成分とする医薬品は、それ単独で免疫抑制剤の抗炎症効果を増強し、免疫抑制剤の用量を低減するための抗炎症効果増強剤もしくは免疫抑制剤の副作用を低減するための副作用低減剤として、または免疫抑制化合物（免疫抑制剤）と混合して免疫抑制化合物の抗炎症効果が増強され、副作用が低減された薬剤として使用することができる。また、免疫抑制剤と併用される硫酸基を有するグリコサミノグリカンとしては、デルマタン硫酸、特に上記特定の物性または由来のデルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩が好ましい。

硫酸基を有するダリコサミノダリカンと免疫抑制剤を同一の個体（患者）に投与する限り、両者の併用の形態（投与時期、投与ルート等）は限定されず、それぞれ単独を有効成分とする製剤を用意し、免疫抑制剤の投与の前後に硫酸基を有するグリコサミノグリカンの製剤を投与してもよく、あるいは、両成分を含むひとつの製剤組成物を調製し、これを投与してもよい。具体的には、硫酸基を有するグリコサミノダリカンまたはその薬理学的に許容される塩が注射剤として投与される形態であり、免疫抑制化合物が経口剤または注射剤として投与される形態であってもよい。

硫酸基を有するグリコサミノグリカンと併用する場合の免疫抑制剤の投与量は、免疫抑制剤の種類、投与対象の状態（年齢、性別、疾患の種類、重篤度等）、投与方法（投与ルート、剤形等）によって異なり、一概には特定できないが、各免疫抑制剤の単独での投与量の 30〜 70 %程度が目安である。

なお、本発明の抗炎症効果増強剤との併用、または硫酸基を有するグリコサミノグリカンとの製剤組成物に含ませる免疫抑制剤または免疫抑制化合物は、抗炎症効果を有するものであれば特に限定されず、市販または公知の免疫抑制剤（「今日の治療薬（1 994年版）」、 1 994年、（株）南江堂発行；第 1 57〜 1 6 1 頁「免疫抑制薬」および第 1 62〜 183 頁「副腎皮質ステロイド」参照）を使用することができる。本発明における免疫抑制剤または免疫抑制化合物としては、副腎皮質ステロイド、シクロホスフアミド、ァザチォプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、メトトレキサ一ト、タク口リ厶ス水和物等、通常使用される薬剤が例示される。代表的な副腎皮質ステロイドとしては、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ノ、。ラメ夕ゾン、トリアムシノロン、ヒドロコノレチゾン、酢酸コルチゾンが挙げられる。

本発明の抗炎症剤は、次のような疾患に伴なう炎症に対して抗炎症作用を示し、ヒトを含む哺乳動物（ヒト等の霊長類；犬、猫等の愛玩動物；牛、豚、馬等の家畜等）、鳥類（鶏等）の、これらの疾患を予防、治療あるいは軽減することができる。

(1) 糸球体腎炎

糸球体腎炎は、 WHO の分類（Churg. J. and Sokin, L H: Renal disease classif ication and atlas of glomerular disease. Tokyo and New York, Igaku-shoin, 1982)によると、 1)原発性糸球体疾患、 2)系統的疾患における糸球体腎炎、 3)血管性病患における糸球体病変、 4)代謝性疾患における糸球体病変、 5)遗伝性腎病変、 6)その他の糸球体疾患、 7)終末期腎、および 8)移植腎糸球体病変に分類される。本発明の抗炎症剤は、その作用機序からみて、前記項目 1)の原発性糸球体疾患（A.軽度糸球体異常群、 B.巣状/分節状病変、び漫性糸球体腎炎、および！). 未分類糸球体腎炎）、および項目 2)の系統的疾患における糸球体腎炎のなかの特定の疾患（ループス腎炎、紫斑性腎炎、 IgA 腎症（Berger' s Disease) 、グッドパスチヤ一症候群）に有効である。また、項目 3)の血管性疾患における糸球体病変（結節性動脈周囲炎、ゥュグナー（Wegner) 肉芽腫症、血栓性微小循環異常症、糸球体血栓症、良性腎硬化症、悪性腎硬化症、および強皮症）や、項目 8)の移植腎糸球体病変にも有効である。

(2) 膠原病およびその近縁疾患

膠原病およびその近縁疾患には、ァメリ力リゥマチ協会によつて分類されている広汎性結合組織病（Decker, J. L. et al. Arthritis Rheum. 26, 1029， 1983) が相当する。これに含まれる疾患には、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、エリテマトーデス、強皮症、広汎性筋膜炎、多発性筋炎、壊死性血管炎およびその他の血管障害（結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、過敏性血管炎、肉芽腫性動脈炎症、川崎病、ベーチヱッ卜病等）、シヱーグレン症候群、オーバーラップ症候群、その他（リウマチ性多発筋痛症、再発性脂肪織炎、再発性多発软骨炎、リンパ腫性肉芽腫症、結節性紅斑等）がある。また、これらの疾患によって生ずる糸球体腎炎や血管炎等も含まれる。本発明の抗炎症剤は、これらの疾患に有効である。また、ヒト自己免疫性リンパ球増殖性症候群（human autoimmune lymphop rol i ferat ive syndrome； Cell 81， 935〜 946 ( 1995), Science 268， 1347〜 1349 ( 1995) )にも有効である。

(3) 難治性血管炎

難治性血管炎は、 Fauci, AS (The vascul i tis syndrome. Harrison' s Principles of Internal Medicine, 11th ed. , McGraw-Hill Book Company, 1986) によると、全身性壊死性血管炎（古典的多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎 (Churg-Strauss症候群）、多発性血管炎重複症候群）、過敏性血管炎（外因性刺激による疾患； Schoenlein- Henoch 紫斑病、血清病とその類似反応、それ以外の薬剤誘発性血管炎、感染症に伴う血管炎、内因性抗原の関与が推定される疾患；腫瘍に伴う血管炎、結合織疾患に伴う血管炎、他の基礎疾患に伴う血管炎、補体系の先天性欠損に伴う血管炎）、 Wegener 肉芽腫症、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎、高安動脈炎）、他の血管炎症候群（川崎病、中枢神経に限局した血管炎、 Buerger 病（閉塞性血栓性動脈炎）、その他の血管炎）に分類され、本発明の抗炎症剤は、これらの疾患に有効である。

(4) 免疫異常あるいは自己免疫疾患

免疫異常あるいは自己免疫疾患による疾病としては、各種の臓器移植後におこる拒絶反応に伴う炎症；神経系疾患では、多発性硬化症、 Guil n- Barre症候群、 HTLV 関連脊髄症等；消化器系疾患では炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、原発性胆汁性肝硬変等；内分泌系疾患では橋本病、 Basedow 氏病等の自己免疫性甲状腺疾患、インスリン依存性糖尿病（自己免疫性驿ラ氏島炎）等：循環器系疾患では、特発性心筋炎、

Chagas性心筋症、拡張型心筋症、心内膜性心筋線維症、特発性良性心膜炎、好酸球性心内膜炎、心手術後症候群、心筋梗塞後症候群、抗リン脂質抗体症候群等；呼吸器系疾患では、特発性間質性肺炎、肺線維症等：腎臓系疾患では、間質性腎炎等；皮膚枓領域では、天疱瘡、類天疱瘡、後天性表皮水泡症等の自己免疫性水泡症等；眼科領域では、水晶体起因性ぶどう膜炎、 Vogい小柳-原田症候群等の疾病が挙げられ（自己免疫疾患と免疫不全、最新内科学大系 22, 井村裕夫他、編集中山書店、 1993， pp91〜 206)、本発明の抗炎症剤は、これらの疾患に伴う炎症に対して有効である。

次に参考例、実施例および比較例を示して本発明を具体的に説明する。参考例 1

デルマタン硫酸の調製

鶏冠（メンドリ） i kgをミンチした後煮沸し、その残渣にプロナーゼ（科研製薬（株），商品名） 5 gを加え、 50°Cで 12時間消化した。消化液を珪藻土濾過し、濾液の pHを pH5.8〜6.3 に調整し、ストレプトミセス属由来のヒアルロニダーゼ（生化学工業（株））を 1000TRU 加え、 50°Cで 3 時間消化した。その液に食塩を添加し、 0.65Mに調整し、 0.5 M食塩溶液で平衡化した Diaion HPA-10 (三菱化学（株），商品名）ァニオン交換樹脂カラム（3X 20cm)にかけた。 0.65M食塩溶液 0.5 Lおよび 1. 1 M食塩溶液 0.3 L の順でカラムを洗浄後、 1.8 M食塩溶液にて溶出した画分を集め、减圧濃縮した。濃縮液は、蒸留水にて一晚透析し、 lOmLに濃縮後、 5M水酸化ナトリウム溶液を加えて終濃度を 0.5Mに調整した。このアルカリ溶液を 37°Cで 90分間保温した後、冷却後酢酸を加えて中和した。中和液に 2倍量のエタノールを加え、生じた沈澱を 70%エタノール、純ェタノ一ルおよびエーテルの順で洗浄後、五酸化リン存在下で減圧乾燥した。乾燥物 5gを水 125mL中で一晩放置後、少量の不溶物を遠心（10°C、 10000rpml5分）にて除いた。これに 10%酢酸ナトリゥム水溶液を 125mL を加え、氷浴中にて終濃度 45%になるようにエタノールを加えた。 4 °Cで 20時間放置後遠心し、沈殿を 90%エタノール、純エタノールおよびエーテルの順で洗浄し、五酸化リン存在下で減圧乾燥してデルマタン硫酸塩（以下、 D S と略記することがある）の精製品を得た。

平均分子量、極限粘度、二糖組成は第 1 表に示されるとおりであったり

なお、 D Sの分離精製は上記方法に限定されることなく特公昭 60— 9042号公報あるいは特公昭 61-21241号公報記載の方法に従って行うこともできる。

( 1 ) 平均分子量の測定

D Sの平均分子量は荒井らの方法（Biocim. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992)に準拠して求めた。すなわち、光散乱法で決定した分子量が既知のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマトグラフィ一（HPLC)を用いたゲル濾過を行い、その溶出位置によって決定した。カラムは TSKgel G4000PWXし、同 G3000PWX_L および同 G2500PWX_l (いずれも 300 x 7.8mm 内径、東ソー（株）製）を三連結したものを用い、溶媒は 0.2M塩化ナ卜リゥム溶液を流速 0.6mL/分で用い、検出は示差屈折によった。 ( 2 ) 構成二糖分析

D Sの硫酸基位置の分析は、公知の方法〔新生化学実験講座 3 , 糖質 II， 49〜62頁（1991年，（株）東京化学同人発行）に記載の「 2 * 8 グリコサミノグリカン分解酵素と HPLCを組合せた構造解析」参照〕に準拠し、次のようにして行った。すなわち、

D Sをコンドロイチナーゼ A B Cで消化し、生成した不飽和糖を含む二糖（不飽和二糖）群を、そのまま高速液体クロマ卜グラフィー（HPLC) で分析した結果と、前述の不飽和二糖群をさらにコンドロ— 6 —スルファターゼで処理し、 HPLCで分析した結果を比較して求めた。コンドロイチナ一ゼ A B Cによる消化、コンドロ— 6 — スルファターゼによる脱硫酸化、および HPLCの分析の具体的条件は以下の通りである。

a ) コンドロイチナーゼ A B C による消化

吉田らの方法〔Anal. Biochem..77, 372-333(1989) 〕により D S の水溶液（ 10mg/mL)20〃 Lに、 0.4M トリス—塩酸（pH8.0) 20 ί 、 0.4Μ酢酸ナトリウム 20 L 、 0. 1%ゥシ血清アルブミン 20 L および水 120 L を加え、コンドロイチナーゼ A B C (5U/mL) を 20 L 加えて、 37°Cで 2 時間反応させた。

b ) コンドロ一 6 —スルファタ一ゼによる消ィ匕

20mMトリス酢酸緩衝液（pH7.0) に溶解したコンドロー 6 —スルファターゼ（5U/mL) 20 u l を、上記のコンドロイチナ一ゼ A B C消化物 lOOraL に加え 37°Cで 2 時間反応させた。

c ) HPLCによる分析

コンドロイチナーゼ A B Cで消化を行った後の溶液あるいはそれをコンドロー 6 —スルファターゼで消化した溶液 50〃 L を、 HPLC ((株）日立製作所製）を用いて分析した。イオン交換カラム（YMC-Pack PA-120-S5カラム， 250 x 2.6mm 内径）を使用し、 232nm での吸光度を測定した。流速 1.5mL/分で、 800mM リン酸水素ナトリウムを 60分間に 0 %から 100%まで上昇させて溶出した。溶出した種々の位置に硫酸基を有する不飽和二糖のピークを同定した。

( 3 ) 極限粘度の測定 D Sの極限粘度の測定は第 1 2 改正日本薬局方に準拠して行つた。測定装置：ウベローデ型粘度管を用いる自動粘度測定装置、形式 VMC-052(離合社製）

溶媒： 0.2M塩化ナトリウム溶液（粘度管の流下時間の測定にも同じ溶液を使用）測定温度： 30 ± 0. 1 °C

測定法：還元粘度（ red)を縦軸に、試料濃度（C)を横軸にプロッ卜して求めた直線を'濃度 0 に補外したときの縦軸の切片から、極限粘度を求める。

77 red = (t s I、。 - 1)/C

上記式において、 t_s ： D Sを含む 0.2M塩化ナトリウム溶液の流下速度、 t。：溶媒（ D Sを含まない 0.2M塩化ナトリウム溶液）の流下速度、 C:試料濃度（重量％)

このようにして鶏冠由来の上記 D Sおよびその他公知の D S (牛腸、豚腸、豚皮）について物性を求めた結果を第 1 表にまとめた。

なお、牛腸、豚腸、豚皮廣由来の D Sは、 W095/09188号公報記載の方法によって得たものである。実施例 1

参考例 1 の方法によって得られた D Sおよび低分子へパリン (LMWHep ; 商品名、 Fragmin 、フアルマシア社製、キツセィ薬品工業（株）販売）の血液凝固系に対する影響を調べた。

(1) 実験材料

動物は 1 0週令の C57BL/6 の雄マウス（一群 n= 3 ) を用いた。

D Sおよび LMWHepは滅菌生理食塩水に溶解した。

(2) 実験方法

D S (25mg/kg投与）および LMWHep ( lmg/kg投与）'をそれぞれマウス尾静脈より投与後、経時的に採血し、その部分活性トロンボプラスチン時間（APTT) を測定した。

(3) 結果

各薬剤投与後の APTTの値の経時変化を第 2図に示す。第 2図において、〇は LMWHep投与時の値を、 ·は D S投与時の値（平均値土標準誤差（秒））をそれぞれ示す。第 2図に示したように、 LMWHep (〇）では投与後 30分を経過しても APTTは 300秒を越え、 LMWHepが血中凝固因子の働きを著しく阻害し、この間はきわめて出血の危険性が高まっていることを示している。反対に、投与 60分を越えると、 APTT延長活性はほとんど認められなくなり、このことは LMWHepが短期間に血中から除かれ、その薬効の長時間にわたる作用が期待できないことを示している。一方、 D S (·) では、投与 5分でもマイルドな APT 延長活性がみられるのみで、出血への危険性はなく、またその効果は投与 240分の時点でも認められており、このものが LMWHep よりも安全で効力が長いことを示唆している。なお前述のごとく、 lmg/kgを越えて投与すると LMWHepでは、出血の副作用が懸念されるため、以下の実験では LMWHe pの最大用量は 1 mg/kgに定めて実験を行つた。またその抗凝固活性をマイルドになるよう工夫した LMWHep でさえ、先のように出血の危険性が強いことから、へパリン (Hep) での治療は実用的でないと予想されるため、行わないこととした。実施例 2

マウス S L Eモデルを用いての検討一 I

デルマタン硫酸、単独効果の確認

(1) 実験材料

動物は S L Eモデルとして Π週令の雄の MRLUpr/lpr)マウスを用い、正常対照として同週令、同性の C57BL/6 マウスを用い

I 9 た。薬物としては参考例 1 の手法で作製した D Sあるいは低分子へパリン（LMWHep. Fragmin) を適宜滅菌生理食塩水に溶解し用いた。

(2) 実験方法

17週令の時点で採血し、血中 BUN (尿素窒素）が高値で腎炎を同程度の強さで発症している MRLマウスのみを選択し 5匹を

1 グループとして 4群に分けた。そのうちの 1 群は腎炎進行の無治療対照群として滅菌生理食塩水のみを、残り 3 群の内、 1 群には D S 5mg/kg を、別の 1 群には D S 25mg/kgを、最後の

1 群には LMWHepを lmg/kgを各々 1 日 1 回、週 5 回尾静脈より投与した。 4週間後にネンブタール麻酔下で採血した後放血屠殺し、腎臓を摘出した。採取した血清および血漿は、 BUN, クレアチニン，フイブリノ一ゲンの測定に、腎臓は病理組織学的検査に供した。

(3) 結果（第 3〜 6 図参照）

1) 腎機能に対する影響

第 3 図 aに BUN 、第 3 図 bにクレアチニンの測定結果（各物質の血清中の濃度（mg/dL) を示すグラフ）を示す。第 3 図 a において PRE (点線）は薬剤投与開始時（17週令）の BUN 平均値を表す。図に示されているごとく、この値は正常対照群（C57BL/6) の値より明らかに高く、本実験に使用した MRLマウスは確実に腎炎を発症していることを示すものである。第 3 図 bにおいて *は無治療対照群に対し、 Bonferroniの検定により、危険率 P く 0.05で有意差があることを示す。無治療対照群は正常対照群 (C57BL/6) と比し、両値（BUN, クレアチニン）とも高値を示し、腎機能の障害は明らかであった。 BUN では治療群の D S 5mg/kg, 25mg/k 投与群と LMWHep lmg/k 投与群で軽度の改善が認められた。クレアチニンでは治療群の D S 5mg/kg 投与群と LMWHep lmg/kg 投与群で軽度の改善が認められた。これに対し、 D S 25mg/kg投与群では顕著な改善効果が認められた。

2) 腎臓の病理組織学的変化に対する影響

第 4図 a〜 c に M R Lマウスまたは正常対照マウスの剖検による腎臓の組織像で、腎臓の病理組織学的変化の各段階の例を示すものである。なお、第 4図 aは正常対照の組織像であり、他は MR Lマウスの組織像（写真倍率： X 500)である。各写真の右下の横棒（Bar) はを示す。

また、第 5図 aは MC糸球体数 Z全糸球体数（％) を、第 5図 bは DP糸球体数 Z全糸球体数（％) を示すグラフである。

剖検されたマウスの肾臓を鏡検した結果、無治療対照群では強い糸球体腎炎の像がみられた。すなわち正常の糸球体（第 4 図 a ) は認められず、 ①ごく軽度の係蹄の肥厚や細胞増殖がみられるのみで、 WHO の分類で微小変化（MC)というタイプに分類されると判断されるもの（第 4図 b ) と②ボウマン囊腔ゃ血管腔がほぼ完全に消失し、糸球体が細胞成分や沈着物に埋めつくされ、その機能が廃絶されていると推定されるもの（WHO の分類、び慢性糸球体腎炎（Diffuse Glomerulonephri tis)の増殖性糸球体腎炎（Prol iferative Glomerulonephri tis：以下 DPと略す）に相当するもの、第 4図 c ) および③、 ①と②との中間にあるものとに分けられた。このことから、 MRL(lpr/lpr)マウスの腎糸球体の病変は、 MCから徐々にボウマン囊腔ゃ血管腔が単球やメサンギゥ厶細胞の増殖、フイブリンおよび免疫複合体の沈着等により消失した状態、すなわち DPに移行していくものと考えれる。

組織標本中の MC糸球体数 Z全糸球体数（％) および DP糸球体数ノ全糸球体数（％) を測定したところ、 MC糸球体の割合は、 D S 25mg/kg投与群で顕著に、 D S 5mg/kg 投与群あるいは /1

LMW ep lmg/kg 投与群では軽度に増加した（第 5図 a ) 。一方、 DP糸球体の割合は D S 5mg/k 投与群および 25mg/kg 投与群では明らかに用量依存性で減少しているのに対し、 LMWHep投与群ではこうした効果は認められなかった（第 5図 b ) 。

以上のように病理組織学的検査においても D Sには肾炎の進行を抑制する効果が認められた。 LMWHepには微小変化群（MC)を維持する作用は軽度あるものの、一旦進行した腎炎に対する効果は無いことが判明した。

3) 腎動脈の病理組織学的変化に対する影響

第 6図 aは正常対照マウスの腎動脈の組織像、第 6図 b〜 d は， M R Lマウスの腎動脈の組織像で、腎動脈の病理組織学的変化の各段階の例を示すものである（写真倍率： X 204)。各写真の右下の横棒（Bar) は 50 m を示す。鏡検の結果、 MR L マウスの腎動脈においては、以下のような 3つの段階の血管炎の病理組織像が認められた。

軽度：血管周囲における炎症性細胞浸潤（第 6図 b )

中等度：血管周囲における炎症性細胞浸潤および外膜〜中膜の破綻（空胞変性およびフイブリン沈着）（第 6図 c )

重度：血管周囲における炎症性細胞浸潤、外膜〜中膜の破綻 (空胞変性、フイブリン沈着および平滑筋細胞の增生）および内膜〜中膜における炎症性細胞浸潤（第 6図 d )

これらの組織像を指標として、各群の血管炎を病理組織学的に評価した。その結果、 D S 25mg/kg投与群では、重度例の減少ならびに中等度および軽度の例の増加が認められた（第 3表）。

LMWHep lmg/k 投与群および D S 5mg/kg 投与群では無治療群との間に大きな違いは認められなかった（第 3表）。以上のようなことから、病理組織学的検査において D Sが血'管炎抑制効果を有することが判明した。第 3表軽度中等度重度

無治療群 0 2 3

LMWHep lmg/kg 群 0 1 4

D S 5mg/kg 0 2 3

D S 25mg/kg 1 3 1

数字：例数

4) 血中フイブリノ一ゲンに対する影響

フイブリノ一ゲンは急性反応性物質の一つで糸球体腎炎や血管炎に限らず様々な炎症時に上昇が見られ、炎症の活動度の指標ともなる Un Procoagu 1 an t Activit in Health and Disease, Eds. Levy, G. A. and Cole, E. H. , CRC Press Boca Raton 1994), 第 7 図に示す如く、 MRL(lpr/lpr)マウス無治療群では、正常対照に比し、この値は顕著に上昇しており、強い炎症が起きていることが分かる。 D S 5mg/kg, 25mg/kg投与群ではこの上昇は用量依存性に抑制されたが、し MWHepにはこの作用はほとんどみりな力、つた。実施例 3

マウス S L Εモデルを用いての検討— 2

デルマタン硫酸とシクロホスファミドの併用効果の確認

(1) 実験材料

動物は 10週令の雄の M R L (lpr/lpr) マウスを用い、薬物としては参考例 1 の手法で作製した D Sを適宜滅菌生理食塩水に溶解し用いた。注射用エンドキサン（シクロホスフアミド、塩野義製薬（株）製）は、各バイアル（100mg/vial)に注射用蒸留水 5mLを添加し溶解後、滅菌生理食塩水で 4， 6, 8 mg/mL となるよう調製し用いた。陰性対照群（無治療群）には、滅菌生理食塩水を投与した。 (2) 実験方法

10週令の時点で体重測定と採血をし、体重、血清 BUN (尿素窒素）、血清クレアチニンを測定し、これらが各群の平均値及び標準偏差でなるべく等しくなるように、層別連続無作為化により、 6匹を 1 グループとして 5群に割りつけた。 D Sは、マウスの尾静脈内に l mLデイスポーザブル注射筒、静注針を用いて一週間に連続 5 回、連日、一匹あたり、 25mg/kg/day 投与した（土、日曜は休薬）。シクロホスフアミドは、同剤の M R L マウスに対する効果について記載した文献（Shiraki, M. et al. Cl in. Exp. Immunol. 55, 333-339 (1984)) を参考とし、 20mg /kg 、 15 mgノ kg および 10 mg/kg のいずれかを、週 1 回腹腔内投与した。投与中は、連日動物を注意深く観察した。 8週間後にネンブタール麻酔下で採血した後放血屠殺した。その際、血清クレアチニンを測定し、脾臓重量、腸間膜リンパ節重量を測定した。

(3) 結果（第 8〜10図参照）

1) 腎機能に対する影響

第 8 図にクレアチニンの測定結果（血清中の濃度（mg/dL) を示すグラフ）を示す。クレアチニンは、陰性対照群（control) に比し、エンドキサン 20mg/kg 単独投与では全く効果が見られていないのに対し、 D S 25mg/kg とエンドキサンを併用した群では、エンドキサン 10mg /kg 併用群とエンドキサン 20mg/kg 併用群で改善傾向を、エンドキサン 15mg/kg併用群では有意な改善を示した（Pく 0.05) 。特に注目すべきは、エンドキサン 20mg/kg 単独投与群と、エンドキサン 20mg/kgと D S 25mg/kg 併用群、及びェンドキサン 15mg/kgと D S 25mg/kg 併用群を比較した場合、いずれも併用群の方が良い結果を示している点である。また、エンドキサン 20mg/kg 単独投与群よりも、エンドキサン 15mg/kgと D S 25mg /kg 併用群の方が、遥かによい結果を示していることから、 D Sはェンドキサンの毒性を抑えかつ有効な結果を引き出していることを示している。

2) 脾臓重量に対する影響

MR Lマウスでは、正常のラッ卜に比し脾臓重量が異常に増大するのでこれに対する治療効果をみた。第 9図に、脾藏重量に対する測定結果を示す。陰性対照群（control) に対し、ェンドキサン 10mg/kg 単独投与群は無効であつたが、他の群はいずれも脾腫に有効であった。 D Sはいずれの場合も 25mg/kg 投与した。特に注目すべき点は、エンドキサンの投与量が同じである場合は、エンドキサン単独投与群よりも、 D S とエンドキサン併用群の方が良い成績を示している点である。

3) 腸間膜リンパ節重量に対する影響

MR Lマウスでは、正常のラッ卜に比し腸間膜リンパ節重量が異常に増大するのでこれに対する治療効果をみた。第 10図に、腸間膜リンパ節重量に対する測定結果を示す。陰性対照群（con trol) に対し、全ての群で、リンパ節重量の縮小効果が見られた。ここでも重要なことは、エンドキサン単独投与 lOmg/kg群よりも、 D S とェンドキサン lOmg/kg併用群の方が良い傾向を示している点である。 D Sは、いずれの場合も 25mg/kg 投与した。

以上、実施例 3 の結果から、 D S と免疫抑制剤を併用することにより、免疫抑制剤の抗炎症効果が高まること、またこのため、 D S と免疫抑制剤を併用することで、ある投与量（以下、投与量 Aと記す）の免疫抑制剤単独で治療した場合に得られる効果と同じかそれを上回る効果が、投与量 A以下の免疫抑制剤と、 D Sの併用（この D Sの投与量には制限がなし、）で得られることが明白となった。また D Sは、硫酸基を有するグリコサ " ミノグリカンの一種であることから、このような効果は他の硫酸基を有するダリコサミノグリカンと免疫抑制剤を併用した場合でも見られる。実施例 4

ラッ卜多発性硬化症（M S ) モデルを用いての検討

中枢神経系の免疫異常疾患で、自己免疫の関与も示唆されている代表例である、多発性硬化症の動物モデル、ラッ卜実験的了レルギ一性脳脊髄炎（EAE)を用い（臨床免疫学イラストレイテツド、 pp. 112-117. Brostof f, Scadding, Male, Roi tt編、廣瀬俊一、狩野庄吾、多田富雄監訳、南江堂 1994) 、 D Sの効果をみた。

(1) 実験材料

動物は 4週令の雌の Lewisラットを用い、一群 10から 11匹の構成で 2群に分けた。感作用物質としてモルモットミエリン塩基性蛋白質（以下、 GPMBP)を結核菌（MTB)を含むフロイント完全アジュバントとともに用いた。薬物としては参考例 1 の手法で作製した D Sを適宜滅菌生理食塩水に溶解し用いた。以下、 D Sを投与された群を D S群とし、また、陰性対照群には、滅菌生理食塩水を投与した。

(2) 実験方法

各々のラッ卜の足踵に 12.5 gの GPMBPと 200〃 gの MTBを注射し、感作させた。感作後 3 日目から D S群には、 D S 5mgを、陰性対照群には、滅菌生理食塩水を一日一回腹腔内に投与した。

E A E としての臨床症状は次のように数値化した（以下、臨床スコアと呼称する）。無症状は 0 、尾の緊張低下を 1 、下肢の緊張低下を 2 、下肢の麻痺を 3 、上肢の麻痺を 4 、死亡を 5 とした。各々のラッ卜の症状を日毎に数値化し、発症病日と、症状のスコアの累積について群別に検討した。有意差の検定は

Student 卜 testを用いた。

(3) 結果

累積臨床スコアは、 D S群 12.4± 1.7 、対照群 16.3±5.9 で、 D S群と対照群の間で有意差（pく 0.05) が認められ、 D Sが症状の強さを抑えていることが判明した。また、平均発症病日は D S群で 9.5±0.5 、対照群で 9.1±0.3 で、 D S投与群で症状の発現までの期間が長引く傾向がみられ、 D Sが症状の発現を抑えていることが示唆された。以上より、 E A Eは M Sの動物モデルであることから、 D Sが M Sに対して有効な治療薬であることが示された。実施例 5

デルマタン硫酸のマウスにおける単回静脈内投与毒性試験（1) 実験方法

動物は雌雄の 5 週令の Crj;CD-lマウス（日本チヤ一ルス · リバー社）の各 5匹を用いた。参考例 I と同様の方法によって得られた D Sの溶液を、無菌蒸留水および無菌生理食塩水を用いて等張液となるように調製し、 2000mg/kg をマウス尾静脈から単回投与し、その後 1 4 日間観察した。

(2) 結果

1 4 日間の観察の結果、雌雄とも各 5 匹中死亡例はみられなかった。したがって、 D Sの致死量は上記条件下において 2000 mg/k 以上と推定された。実施例 6

製剤

(1) デルマタン硫酸を有効成分とする注射剤 D S 5000mgを生理食塩水 i O OmL に溶解し、滅菌を行い、 5mL ずつアンプルに注入した。血管内注射、皮下注射あるいは筋肉注射に用いられる。

( 2 ) 免疫抑制剤との併用

以下の様な用量の各種免疫抑制剤を各々生理食塩水 1 00m l に溶解し滅菌を行い、アンプルに注入した。すなわち、各免疫抑制剤の種類に応じて、その用量はシクロホスフアミド、 30mg；ァザチォプリン、 30mg ；ミゾリビン、 1 50mg；メト卜レキサート、 3 mg ；タク口リムス水和物、 3 mg；シクロスポリン 1 5mgとした。この免疫抑制剤のアンプルと上記（1 ) で得られた D S注射剤とを組み合わせた。

上記免疫抑制剤の投与の前または後に D S製剤を投与する。なおプレドニゾロン製剤の場合は、たとえば 25 mg 日、シクロホスフアミドゃァザチォプリン製剤の場合は、たとえば各々 30 mg/日、ミゾリビンの場合は、たとえば 1 50 mg /日、メトトレキサートゃタク口リムス水和物の場合は、たとえば 3 mg/日、シクロスポリンの場合は、たとえば 1 5mg /日を各々用いることができる。

これら免疫抑制剤により得られる各種疾病に対しての効果は、その前後に投与された D S製剤により増強される。また、これらの投与量は、患者の重症度等により適宜増減させることが可能である。これらの薬剤の内、プレドニゾロン、シクロホスフアミド、メトトレキサート、シクロスポリンは、血管内あるいは経口にて投与する。他の薬剤の主たる投与経路は経口投与である。産業上の利用可能性

デルマタン硫酸あるいはその薬理学的に許容される塩は、難治性、遷延性あるいは免疫機序が関与する炎症を抑制し、副作用のない有用な抗炎症剤として利用される。また、硫酸基を有するグリコサミノグリカンあるいはその薬理学的に許容される塩を、種々の副腎皮質ステロイド、シクロホスフアミド、ァザチォプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、メトトレキサート、タク口リムス水和物等の免疫抑制剤と併用した場合、これら免疫抑制剤を単独で投与する場合よりも少量の免疫抑制剤の投与量で同等の効果を得ることができるので、免疫抑制剤によって引き起こされる副作用発現の確率を低下させることができる。

Claims

請求の範囲

I . デルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤。

2. 遷延性炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 1 記載の抗炎症剤。

3 . 免疫機序が関与する炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 1 記載の抗炎症剤。

4 . 自己免疫疾患に伴なう炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 3 記載の抗炎症剤。

5 . 多発性硬化症に伴なう炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 3 に記載の抗炎症剤。

6. 膠原病あるいはその近縁疾患に伴なう炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 3 記載の抗炎症剤。

7. 糸球体腎炎に対して抗炎症作用を示す請求項 1 〜 3 のいずれかに記載の抗炎症剤。

8. 難治性血管炎に対して抗炎症作用を示す請求項 1 〜 3 のいずれかに記載の抗炎症剤。

9. デルマタン硫酸が、グリコサミノグリカン分解酵素および高速液体クロマトグラフィ一を用いる構成二糖組成の測定法によって測定した Δ Di- 0S(AHexAl → 3Ga INAc)の含有率が 2

〜 9 %のものである請求項 1 〜 8 のいずれかに記載の抗炎症剤。

10. デルマタン硫酸が、ウベローデ型粘度管を使用し、溶媒として 0.2M塩化ナトリウム溶液を使用して 30 ± 0.1 てで測定した極限粘度（ 100mL/g)が 0.8〜2.0 である請求項 1 〜 8 のいずれかに記載の抗炎症剤。

II. 分子量既知のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマ卜グラフィ一によるゲル濾過法によって測定した平均分子量が 25, 000〜 100, 000 である請求項 1 8 のいずれかに記載の抗炎症剤。

12. デルマタン硫酸が、グリコサミノグリカン分解酵素および高速液体クロマトグラフィ一を用いる構成二糖組成の測定法によつて測定した Δ Di- 0S(AHexAl →3GalNAc)の含有率が 1 〜9%であり；ウベローデ型粘度管を使用し、溶媒として 0.2 M塩化ナトリウム溶液を使用して 30± 0.1 てで測定した極限粘度（100mL/g)が 0.8〜2.0 であり；かつ分子量既知のグリコサミノグリカンを標準品として高速液体クロマトグラフィ一によるゲル濾過法によって測定した平均分子量が 25, 000- 100, 000である請求項 1〜 8 のいずれかに記載の抗炎症剤。

13. デルマタン硫酸が鶏冠由来のデルマタン硫酸である請求項

1〜12のいずれかに記載の抗炎症剤。

14. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫抑制剤の抗炎症効果増強剤。

15. 硫酸基を有するグリコサミノグリ力ンがデルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される少なくとも 1 種のグリコサミノグリカンである請求項 14記載の抗炎症効果増強剤。

16. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンがデルマタン硫酸である請求項 15記載の抗炎症効果増強剤。

17. 免疫抑制剤が、副腎皮質ステロイド、シクロホスフアミド、ァザチォプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、メ卜トレキサートおよびタク口リムス水和物よりなる群から選択される少なくとも 1 種の免疫抑制化合物を含有するものである請求項 14記載の抗炎症効果増強剤。

1 8. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩と免疫抑制化合物とを含有する薬剤。

1 9. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩を含有する薬剤と免疫抑制剤が、投与時期または投与経路を変えて投与されるために組み合わされ、前者は後者の抗炎症効果を増強するために使用される組み合わされた薬剤。

20. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許容される塩が注射剤として投与される形態であり、免疫抑制化合物が経口剤または注射剤として投与される形態である請求項 1 9記載の薬剤。

2 1 . 硫酸基を有するグリコサミノグリ力ンがデルマタン硫酸、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される少なくとも 1 種のグリコサミノグリ力ンである請求項 1 8〜 20のいずれかに記載の薬剤。

22. 硫酸基を有するグリコサミノグリカンがデルマタン硫酸である請求項 1 8〜 2 1のいずれかに記載の薬剤。

23. 免疫抑制化合物が、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アサチォプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、メ卜トレキサ一トおよびタク口リムス水和物よりなる群から選択される少なくとも 1 種の免疫抑制化合物である請求項 1 8〜 22 のいずれかに記載の薬剤。

24. 抗炎症作用を示す請求項 1 8〜 23のいずれかに記載の薬剤。

25. デルマタン硫酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤の抗炎症作用を示す有効量を、炎症性疾患に罹患した哺乳動物に投与することからなる炎症の治療方法。

26. 炎症性疾患が、遷延性の炎症性疾患である請求項 25記載の治療方法。

27. 炎症性疾患が、免疫機序が関与する炎症性疾患である請求項 25記載の治療方法。

28. 抗炎症剤を製造するための、デルマタン硫酸もしくは薬理学的に許容される塩、またはそれらと免疫抑制化合物を含有する薬剤の使用。

29. 抗炎症剤が、遷延性炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 28記載の使用。

30. 抗炎症剤が、免疫機序が関与する炎症に対して抗炎症作用を示す請求項 28記載の使用。