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WO1997005259A1 - Utilisation du domaine intra-cytoplasmique du recepteur de la prolactine ou du recepteur de l'hormone de croissance pour obtenir la secretion de proteines - Google Patents

Utilisation du domaine intra-cytoplasmique du recepteur de la prolactine ou du recepteur de l'hormone de croissance pour obtenir la secretion de proteines Download PDF

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WO1997005259A1
WO1997005259A1 PCT/FR1996/001237 FR9601237W WO9705259A1 WO 1997005259 A1 WO1997005259 A1 WO 1997005259A1 FR 9601237 W FR9601237 W FR 9601237W WO 9705259 A1 WO9705259 A1 WO 9705259A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
receptor
amino acids
growth hormone
sequence
prolactin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1996/001237
Other languages
English (en)
Inventor
Gérard Devauchelle
Laurence Garnier
Claire Cahoreau
Martine Cerutti
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to AU67448/96A priority patent/AU713681B2/en
Priority to EP96927736A priority patent/EP0846177A1/fr
Priority to US09/000,145 priority patent/US6169172B1/en
Publication of WO1997005259A1 publication Critical patent/WO1997005259A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to polypeptides allowing the direct secretion of proteins produced in eukaryotic cells.
  • a cleavable N-terminal signal peptide is added to the protein which it is desired to secrete, by proceeding to the fusion of a sequence coding for said signal peptide with the sequence coding for the recombinant protein.
  • This signal peptide allows the translocation of the polypeptide through the membrane of the endoplasmic reticulum, through which it will be transported, in the vesicles of the Golgi apparatus, to the plasma membrane.
  • this approach does not always lead to the expected result [JARVIS et al., J. Biol. Chem. n ° 268, p. 16754-16762, (1993)].
  • receptors are made up of an extracellular N-terminal region, a transmembrane region and an intra-C-terminal region - cytoplasmic (for review, see for example [DUSANTER-FOURT et al., Médecine / Sciences Syntician, 10, p. 825-835, (1994)]).
  • the prolactin receptor exists in two forms: a short form, consisting of 291 amino acids, and a long form, consisting of 591 amino acids in rats, 592 amino acids in rabbits, and 598 amino acids in humans) .
  • the growth hormone receptor consists of 620 amino acids (in humans and rabbits) and has many regions homologous with the long form of the prolactin receptor [KELLY et al. , in Recent Progress in Hormon Research, 48, P. 123 (Académie Press Ed. (1993); KELLY and DJIANE, US Patent 4,992,398]: in particular, we find in the intra-cytoplasmic region 4 conserved regions.
  • receptors of the same family erythropoietin receptor, growth factor receptors, interleukin receptors 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 9, GM-CSF receptor, G-CSF, receptor 1 ⁇ interferon, etc ].
  • Other receptors of the same family erythropoietin receptor, growth factor receptors, interleukin receptors 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 9, GM-CSF receptor, G-CSF, receptor 1 ⁇ interferon, etc ].
  • functional chimeric receptors comprising the extra-cytoplasmic domain of a first receptor, and the domain intracytoplasmic of a second receptor, separated by a transmembrane domain belonging either to the first or to the second receptor [MOORE et al.
  • the intra-cytoplasmic region of the prolactin receptor is not only capable of being exported into the culture medium when it is expressed alone, but could also allow the export of a protein.
  • transient protein fused at its C-terminal end.
  • the Inventors have also highlighted the minimum region responsible for this property.
  • the inventors have also observed that the intra-cytoplasmic region of the growth hormone (GH) receptor, expressed in a baculovirus / insect cell system, is excreted in the culture medium in a manner analogous to the intra- prolactin receptor cytoplasmic.
  • the inventors have thus identified, in particular, a polypeptide of 372 amino acids, coded by the fragment of the sequence coding for the growth hormone receptor comprised between the Ncol site and the stop codon of said sequence, and a polypeptide of 329 amino acids, coded by the fragment of the sequence coding for the growth hormone receptor between the ClaI site and the stop codon of said sequence.
  • the demonstration by the inventors of these characteristics of prolactin and growth hormone receptors makes it possible to envisage the use of the intra-cytoplasmic domains of cytokine receptors, and more particularly of the intra-cytoplasmic domains of receptors for prolactin and growth hormone as transporters to allow the export, from a host cell, of proteins of interest whose localization is usually cytoplasmic or nuclear.
  • the subject of the present invention is the use of a protein whose polypeptide sequence is chosen from the group consisting of:
  • GH growth hormone
  • GH growth hormone receptor
  • a chimeric fusion protein comprising the protein of interest which it is desired to export, produced at its N-terminal end by the intra region, is produced by a system of expression in eukaryotic cells.
  • -cytoplasmic of the prolactin receptor or by the intra-cytoplasmic region of the growth hormone receptor, or by a fragment, as defined above, of one or other of these regions.
  • the chimeric proteins according to the invention do not include a transmembrane domain.
  • the two regions of the chimeric protein can be directly fused, or separated by an oligopeptide providing a specific site for cleavage by a protease (for example a site for cleavage for an enterokinase (EC 3.4.21.9), or for factor Xa (EC 3.4.21.6) or any other specific protease) .
  • a chimeric protein according to the invention can be obtained by constructing, by conventional techniques of molecular biology, a recombinant gene coding for this protein.
  • a recombinant gene comprises a DNA sequence coding for the protein of interest which it is desired to express, fused at its 5 ′ end with a sequence coding for the intra-cytoplasmic domain of the prolactin receptor or the l receptor.
  • growth hormone or for a fragment, as defined above, of one or other of these domains; advantageously, these two sequences are separated by a sequence coding for an oligopeptide carrying a specific site for cleavage by a protease.
  • the implementation of the present invention allows the recovery of the recombinant proteins from the culture medium, which facilitates their purification.
  • the present invention also encompasses vectors carrying at least one recombinant gene as defined above, and in particular expression vectors in which said recombinant gene is placed under the control of expression regulation sequences active in the host cell. chosen.
  • said expression vectors can be constituted by modified baculoviruses in which at at least one recombinant gene according to the invention is placed under transcriptional control of a baculovirus promoter.
  • GENERAL EXPERIMENTAL PROTOCOLS A - Cell and virus cultures Spodoptera frugiperda Sf9 cells are maintained at 28 ° C in TC100 medium supplemented with 5% fetal calf serum.
  • the baculovirus AcMNPV wild virus
  • the recombinant baculoviruses are propagated in these Sf9 cells.
  • the cells (4 ⁇ 10 6 per 25 cm 2 bottle) are inoculated using a viral suspension at a multiplicity of infections of 10 PFU per cell. After one hour of adsorption at room temperature, the viral inoculum is removed and fresh culture medium is added.
  • Recombinant viruses are obtained after co-transfection of Sf9 cells with viral DNA, and DNA of the transfer vector, by lipofection (DOTAP, Boerhinger Mannheim, Germany) [FELGNER and RINGOLD, Nature no. 337, p. 387-388, (1989)].
  • DOTAP Boerhinger Mannheim, Germany
  • FELGNER and RINGOLD Nature no. 337, p. 387-388, (1989)].
  • the screening and the purification of the recombinant viruses are carried out according to the current procedures described for example by SUMMERS and SMITH [Texas Agric. Exp. St. Bull., N ° 1555, p. 1-56,
  • the long form of the rabbit prolactin receptor consists of an N-terminal extracellular domain of 210 amino acids, a transmembrane region of 24 amino acids and an intra-cytoplasmic C-terminal region of 358 amino acids.
  • Figure 1 Several cleavage sites by restriction enzymes are present on the gene coding for the rabbit prolactin receptor [EDERY et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, No. 86, 2112-2116 (1989)].
  • the 5kb cDNA sequence which codes for the rabbit prolactin receptor was cloned from the plasmid pECE-PRL-R 2 4 described by EDERY et al. (1989, Publication cited above) in a plasmid pUC18, to give the plasmid pUC18 L2 PRL-R [CAHOREAU et al., Biochemistry, n ° 74, p. 1053-1065, (1992)].
  • the transfer plasmids for baculoviruses of the pGmAc family are prepared from the EcoRI-I fragment of the baculovirus of the Autographa californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV) which contains the gene and the polyhedrin promoter, by inserting said fragment in the bacterial plasmid pUC8.
  • AcMNPV Autographa californica nuclear polyhedrosis
  • the coding sequence located between nucleotides + 24 and + 522 (relative to the A (+ 1) of ATG) of the polyhedrin gene was deleted and replaced by a Striai linker, which allows the insertion of a heterologous sequence in phase behind the ATG of the polyhedrin.
  • the recombinant protein is thus produced in the form of a fusion protein with the first 7 amino acids of polyhedrin.
  • this plasmid has a KpnI restriction site located 109 nucleotides downstream from the SmaI site.
  • the plasmids pGmAc31I 1 , pGmAc31I 2 and the recombinant baculoviruses expressing these plasmids are obtained as described in the publication by CAHOREAU et al. [CAHOREAU et al., Biochemistry, n ° 74, p. 1053-1065,
  • BstEII-Kpnl of 1151 bp comprising the entire sequence coding for the intra-cytoplasmic part of the prolactin receptor, between the SmaI site and the site
  • Kpn1 of pGmAc31 and comprises a sequence coding for 353 C-terminal amino acids of the prolactin receptor.
  • pGmAc31l2 results from the insertion of a Smal-Kpnl fragment of 998 bp between the Smal site and the Kpnl site of pGmAc31, and comprises a sequence coding for 302 amino acids
  • This plasmid comprises the BstEII-Bsu36I subfragment of fragment I ⁇ . This subfragment codes for 114 N-terminal amino acids of I ] _. - pGmAcl68l4: The plasmid pGmAc31l2 was cleaved using
  • pGmAc31I 1 was digested with Xbal and Bsu36I; an XbaI-Bsu36I fragment has been deleted; the ends on either side of this fragment were made blunt using the KLENOW polymerase, and ligated with a BamHI linker (10 mer).
  • the plasmid obtained comprises a sub-fragment which codes for 52 N-terminal amino acids of I ⁇ ,, fused to a sub-fragment which codes for 239 C-terminal amino acids of I ⁇ .
  • the inserts I ⁇ _, I 2 , I3, I4, I5 located with respect to the sequence coding for the intracytoplasmic domain of prolactin, are represented in FIG. 1 by solid white rectangles.
  • the polyhedrin promoter is shown in solid black; the beginning of the polyhedrin coding sequence is represented by black dots on a white background.
  • ACP ⁇ 1I3, ACP ⁇ 1I4 and ACPI1I5 were obtained by homologous recombination between pGmAc3ll3, PG111ACI68I4, and pGmAc31l5, respectively, and the total DNA of wild type AcMNPV.
  • a recombinant baculovirus expressing the protein I 2 was used as a positive control.
  • Cyclin A or cyclin B have been used as transient proteins. Cyclin A and cyclin B have already been expressed in the baculovirus / insect cell system. Under these conditions, cyclin A is present in the nucleus of infected cells [ZINDY F., "Study of the functions and expression of normal human cyclin A and its modified form by integration of the DNA of the virus of hepatitis B ", Thesis, University
  • the transfer vector pGmAc31I 2 was modified by mutation of the stop codon (TGA) of the intra-cytoplasmic domain of the prolactin receptor, so that a KpnI site replaces it.
  • the Kpnl-Kpnl fragment is then deleted by digestion using the restriction enzyme Kpnl. then the vector is religated.
  • the two cDNAs coding for cyclin A and cyclin B respectively were inserted into the unique remaining Kpnl site: the cyclin B gene was cut by HindIII, repaired by the enzyme of KLENOW and Smal, then inserted into the Kpnl site repaired by the KLENOW enzyme, from the transfer vector.
  • the different stages of this construction are illustrated in FIG. 2.
  • the complete sequence of the gene coding for cyclin B was inserted at the BglII site repaired by the enzyme of KLENOW, from the transfer vector pGmAc31l 3 .
  • cyclin A the ATG of the gene has been replaced so that a Kpnl site is obtained, and a Kpnl-Kpnl fragment containing the entire cyclin A gene has been directly inserted at the Kpnl site of the transfer vector.
  • the CycB gene was thus inserted into the transfer vectors pGmAc31I 2 and pGmAc31l3, and the CycA gene was inserted into pGmAc31I 2 .
  • the recombinant viruses respectively named AcPhI 2 -CycB, AcPhl 3 -CycB, and AcPhI 2 -CycA were obtained by homologous recombination between these transfer vectors, and the total DNA of wild-type AcMNPV.
  • Baculoviruses expressing only the sequences coding for cyclin A and cyclin B not fused with the intra-cytoplasmic domain of the prolactin receptor, were also constructed as a control.
  • Spodoptera frugiperda cells were infected with each of the recombinant viruses for 48 hours, and the proteins from cell extracts and culture supernatants were characterized by immunoelectrotransfer, using a polyclonal serum anti-prolactin receptor.
  • the chimeric proteins I 2 -CycB and I 2 -CycA are present both in cell lysates and in cell culture media. Each of the proteins fused to I 2 is therefore secreted efficiently.
  • the chimeric protein I 3 -CycB accumulates in the cytoplasm, which indicates that the deletion of the C-terminal portion of the domain I 2 substantially reduces the efficiency of secretion.
  • Immunodetection using an anti-ubiquitin antiserum shows that I 2 CycB and I 2 CycA are ubiquitinylated, while CycA, CycB, and l 3 CycB are not. It is therefore possible that ubiquitin residues play a role in the secretion process.

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Abstract

L'invention est relative à l'utilisation du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance, ou d'un fragment de l'un ou l'autre de ces domaines, pour obtenir la sécrétion d'une protéine d'intérêt produite dans une cellule-hôte eucaryote.

Description

UTILISATION DU DOMAINE INTRA-CYTOPLASMIQUE DU RECEPTEUR DE LA PROLACTINE OU DU RECEPTEUR DE L'HORMONE DE CROISSANCE POUR OBTENIR LA SECRETION DE PROTEINES.
L'Invention est relative à des polypeptides permettant la sécrétion directe de protéines produites dans des cellules eucaryotes.
Au cours des dernières années, le système baculovirus/cellules d'insectes a été utilisé avec succès pour l'expression de divers gènes d'intérêt. Dans le cadre de ce système, comme de manière plus générale, dans le cadre des différents systèmes connus de production de protéines recombinantes en cellules-hôte, il est souhaitable de disposer de moyens d'exportation desdites protéines recombinantes dans le milieu de culture des cellules. Ceci facilite en effet la récolte et la purification de ces protéines.
Habituellement, pour obtenir l'exportation d'une protéine recombinante à partir d'une cellule-hôte eucaryote, on cherche à utiliser la voie classique de sécrétion qui implique le réticulum endoplasmique et 1 ' appareil de Golgi .
Dans ce but on ajoute à la protéine que l'on souhaite faire sécréter un peptide-signal N-terminal clivable, en procédant à la fusion d'une séquence codant pour ledit peptide-signal avec la séquence codant pour la protéine recombinante. La présence de ce peptide-signal permet la translocation du polypeptide à travers la membrane du réticulum endoplasmique, par le relais duquel elle sera transportée, dans les vésicules de l'appareil de Golgi, jusqu'à la membrane plasmique. Cependant, cette approche ne permet pas toujours d'aboutir au résultat espéré [JARVIS et al., J. Biol . Chem. n° 268, p. 16754- 16762, (1993)] . Le principal inconvénient de cette stratégie réside dans le fait que le passage par le réticulum endoplasmique et 1 ' appareil de Golgi peut entraîner l'addition sur le polypeptide, de résidus de sucre qui peuvent conduire à un mauvais repliement de la protéine et/ou à la formation de nouveaux épitopes. II a d'autre part été constaté, au cours de travaux précédents de 1 ' équipe des Inventeurs concernant l'expression du récepteur de la prolactine ou de différentes portions de ce récepteur, dans des baculovirus recombinants, [CAHOREAU et al., Biochimie, n° 74, p. 1053-1065, (1992)] , que lorsque la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine était exprimée seule, elle était excrétée dans le milieu de culture, bien que ne possédant pas de peptide-signal .
Des études ultérieures sur la structure de cette région intra-cytoplasmique ont montré qu'elle n'était pas N-glycosylée, (bien qu'elle possède plusieurs sites potentiels de glycosylation) , et qu'elle était ubiquitinylée [CAHOREAU et al., FEBS Letters, n° 350, p. 130-234, (1994)] . Le récepteur de la prolactine (PRL) appartient à une famille de récepteurs (récepteurs des cytokines) , qui comprend également les récepteurs de l'hormone de croissance (GH) , et ceux de plusieurs interleukines, ceux de 1 ' érythropoïétine et du GM-CSF (= Granulocyte- macrophage colony stimulating factor) et du récepteur de 1 ' interféron γ, etc... Ces récepteurs sont constitués d'une région N-terminale extracellulaire, d'une région transmembranaire et d'une région C-terminale intra- cytoplasmique (pour revue, voir par exemple [DUSANTER- FOURT et al., Médecine/Sciences Synthèse, 10, p. 825-835, (1994)]) .
Le récepteur de la prolactine existe sous deux formes : une forme courte, composée de 291 acides aminés, et une forme longue, constituée de 591 acides aminés chez le rat, 592 acides aminés chez le lapin, et 598 acides aminés chez l'homme) . Le récepteur de l'hormone de croissance est constitué de 620 acides aminés (chez l'homme et le lapin) et présente de nombreuses régions homologues avec la forme longue du récepteur de la prolactine [KELLY et al. , in Récent Progress in Hormon Research, 48, P. 123 (Académie Press Ed. (1993) ; KELLY et DJIANE, Brevet US 4 992 398] : en particulier, on retrouve dans la région intra-cytoplasmique 4 régions conservées.
Les autres récepteurs de la même famille (récepteur de l'érythropoïétine, récepteurs de facteurs de croissance, récepteurs des interleukines 2, 3, 4, 5, 6, 7, et 9, récepteur GM-CSF, G-CSF, récepteur de 1'interféron γ, etc...), présentent également des structures très proches, et les domaines de différents récepteurs peuvent être associés entre eux pour donner des récepteurs chimériques fonctionnels, comprenant le domaine extra-cytoplasmique d'un premier récepteur, et le domaine intra-cytoplasmique d'un second récepteur, séparés par un domaine transmembranaire appartenant soit au premier soit au second récepteur [MOORE et al. , FASEB J., 9 (6), A1414, (1995) ; CIOFFI et al., FASEB J., 7 (3- 4), A430, (1993) ; DUSANTER et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplément, 18B, p276, (1994)].
Les Inventeurs ont maintenant montré que la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine était non seulement capable d'être exportée dans le milieu de culture lorsqu'elle était exprimée seule, mais pouvait également permettre l'exportation d'une protéine
(dite protéine "passagère") fusionnée à son extrémité C-terminale. Les Inventeurs ont en outre mis en évidence la région minimum responsable de cette propriété.
D'autre part, les Inventeurs ont également observé que la région intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance (GH) , exprimée dans un système baculovirus/cellules d'insecte, était excrétée dans le milieu de culture de manière analogue à la région intra- cytoplasmique du récepteur de la prolactine. Les inventeurs ont ainsi identifié, en particulier, un polypeptide de 372 acides aminés, codé par le fragment de la séquence codant pour le récepteur de l'hormone de croissance compris entre le site Ncol et le codon stop de ladite séquence, et un polypeptide de 329 acides aminés, codé par le fragment de la séquence codant pour le récepteur de l'hormone de croissance compris entre le site Clal et le codon stop de ladite séquence. La mise en évidence par les Inventeurs de ces caractéristiques des récepteurs de la prolactine et de l'hormone de croissance permet d'envisager l'utilisation des domaines intra-cytoplasmiques de récepteurs de cytokines, et plus particulièrement des domaines intra- cytoplasmiques des récepteurs de la prolactine et de l'hormone de croissance comme transporteurs pour permettre l'exportation, à partir d'une cellule-hôte, de protéines d'intérêt dont la localisation est habituellement cytoplasmique ou nucléaire . La présente Invention a pour objet l'utilisation d'une protéine dont la séquence polypeptidique est choisie dans le groupe constitué par :
- la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, à savoir la région constituée par les acides aminés 235 à 591, selon la numérotation des acides aminés décrite par KELLY et al . (1993, publication précitée) , de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme, par les acides aminés 235 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin) ;
- la séquence du fragment du récepteur de la prolactine constitué par les acides aminés 240 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin, par les acides aminés 235 à 591 de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme ;
- la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance (GH) , constitué chez l'homme, par la région C-terminale de 350 acides aminés de ce récepteur ;
- la séquence d'un fragment du récepteur de l'hormone de croissance (GH) , comprenant tout ou partie du domaine intra-cytoplasmique dudit récepteur, et comprenant les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez l'homme (par exemple le fragment constitué par les acides aminés 249 à 620) , ou bien les acides aminés 272 à 620 dudit récepteur chez le rat, ou bien les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez le lapin, pour obtenir la sécrétion d'une protéine d'intérêt produite dans une cellule-hôte eucaryote, en particulier une cellule-hôte d'insecte.
Pour mettre en oeuvre la présente Invention, on fait produire par un système d'expression en cellules eucaryotes, une protéine chimérique de fusion comprenant la protéine d'intérêt que l'on souhaite exporter, prolongée à son extrémité N-terminale par la région intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou par la région intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance, ou par un fragment, tel que défini ci- dessus, de l'une ou l'autre de ces régions. Contrairement aux récepteurs chimériques, dérivés des récepteurs des cytokines, qui sont décrits dans l'art antérieur cité ci- dessus, les protéines chimériques conformes à l'invention ne comprennent pas de domaine transmembranaire.
Les deux régions de la protéine chimérique peuvent être fusionnées directement, ou séparées par un oligopeptide apportant un site spécifique de clivage par une protéase (par exemple un site de clivage pour une entérokinase (EC 3.4.21.9), ou pour le facteur Xa (EC 3.4.21.6) ou toute autre protéase spécifique) .- Une protéine chimérique conforme à l'invention peut être obtenue en construisant, par les techniques classiques de biologie moléculaire, un gène recombinant codant pour cette protéine. Un tel gène recombinant comprend une séquence d'ADN codant pour la protéine d'intérêt que l'on souhaite exprimer, fusionnée à son extrémité 5' avec une séquence codant pour le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine ou du récepteur de l'hormone de croissance, ou pour un fragment, tel que défini ci- dessus, de l'un ou l'autre de ces domaines ; avantageusement, ces deux séquences sont séparées par une séquence codant pour un oligopeptide portant un site spécifique de clivage par une protéase. La mise en oeuvre de la présente Invention permet la récupération des protéines recombinantes à partir du milieu de culture, ce qui facilite leur purification.
En outre, du fait qu'il s'agit d'une voie alternative par rapport à celle qui implique le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, elle présente 1'avantage de permettre à certaines protéines cytoplasmiques ou nucléaires, pour lesquelles les modifications post-traductionnelles effectuées spécifiquement dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi sont inutiles, d'être excrétées sous une forme soluble dans le milieu de culture.
La présente invention englobe également les vecteurs portant au moins un gène recombinant tel que défini ci-dessus, et en particulier des vecteurs d'expression dans lesquels ledit gène recombinant est placé sous contrôle de séquences de régulation de son expression actives dans la cellule-hôte choisie. Par exemple, si ladite cellule-hôte est une cellule d'insecte, lesdits vecteurs d'expression peuvent être constitués par des baculovirus modifiés dans lesquels au moins un gène recombinant conforme à l'invention est placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur de baculovirus.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du domaine intra- cytoplasmique du récepteur de la prolactine pour permettre l'excrétion de diverses protéines.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX GENERAUX: A - Cultures de cellules et de virus Des cellules de Spodoptera frugiperda Sf9 sont maintenues à 28°C dans du milieu TC100 supplémente avec 5% de sérum de veau foetal.
Le baculovirus AcMNPV (virus sauvage) , ainsi que les baculovirus recombinants sont propagés dans ces cellules Sf9. Pour l'infection, les cellules (4 x IO6 par flacon de 25 cm2) sont inoculées à l'aide d'une suspension virale à une multiplicité d'infections de 10 PFU par cellule. Après une heure d'adsorption à la température de la pièce, l'inoculum viral est enlevé et du milieu de culture frais est ajouté.
Les virus recombinants sont obtenus après co- transfection des cellules Sf9 avec l'ADN viral, et l'ADN du vecteur de transfert, par lipofection (DOTAP, Boerhinger Mannheim, Allemagne) [FELGNER et RINGOLD, Nature n° 337, p. 387-388, (1989)] . Le criblage et la purification des virus recombinants sont effectués selon les procédures courantes décrites par exemple par SUMMERS et SMITH [Texas Agric. Exp. St. Bull., n° 1555, p. 1-56,
(1987)] . B - Clonage de la séquence codant pour la région intra-cytoplasmique de la forme longue du récepteur de la prolactine de lapin
La forme longue du récepteur de la prolactine de lapin, est constituée d'un domaine N-terminal extracellulaire de 210 acides aminés, d'une région transmembranaire de 24 acides aminés et d'une région C-terminale intra-cytoplasmique de 358 acides aminés (Figure 1) . Plusieurs sites de coupure par des enzymes de restriction sont présents sur le gène codant pour le récepteur de la prolactine de lapin [EDERY et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, n° 86, 2112-2116 (1989)] .
La séquence d'ADNc de 5kb qui code pour le récepteur de la prolactine de lapin a été clonée à partir du plasmide pECE-PRL-R24 décrit par EDERY et al. (1989, Publication précitée) dans un plasmide pUC18, pour donner le plasmide pUC18 L2 PRL-R [CAHOREAU et al., Biochimie, n° 74, p. 1053-1065, (1992)] .
C - Plasmides de transfert Les plasmides de transfert pour baculovirus de la famille des pGmAc sont préparés à partir du fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d ' Autographa californica (AcMNPV)qui contient le gène et le promoteur polyédrine, en insérant ledit fragment dans le plasmide bactérien pUC8.
Pour obtenir le plasmide pGmAc31, la séquence codante située entre les nucleotides + 24 et + 522 (par rapport au A(+l) de l'ATG) du gène de la polyédrine a été délétée et remplacée par un lieur Striai, ce qui permet l'insertion d'une séquence hétérologue en phase derrière l'ATG de la polyédrine. La protéine recombinante est ainsi produite sous la forme d'une protéine de fusion avec les 7 premiers acides aminés de la polyédrine. En outre ce plasmide possède un site de restriction Kpnl situé à 109 nucleotides en aval du site Smal. Exemple 1 ; Effet de différentes délétions sur la sécrétion du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine
Afin d'identifier la séquence minimale responsable de la sécrétion, différentes régions du domaine intra-cytoplasmique ont été exprimées dans les cellules d'insectes.
Les plasmides pGmAc31I1, pGmAc31I2 et les baculovirus recombinants exprimant ces plasmides sont obtenus comme décrit dans la publication de CAHOREAU et al. [CAHOREAU et al., Biochimie, n° 74, p. 1053-1065,
1992] . pGmAc31l2. résulte de l'insertion d'un fragment
BstEII-Kpnl de 1151 pb, comprenant la totalité de la séquence codant pour la partie intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, entre le site Smal et le site
Kpnl de pGmAc31, et comprend une séquence codant pour 353 acides aminés C-terminaux du récepteur de la prolactine. pGmAc31l2 résulte de l'insertion d'un fragment Smal-Kpnl de 998 pb entre le site Smal et le site Kpnl de pGmAc31, et comprend une séquence codant pour 302 acides aminés
C-terminaux de I]_.
Trois formes tronquées obtenues par des délétions internes (15) , N-terminales (14) , ou C-terminales (13) du fragment Iχ ont été construites : - pGmAc31l2 :
Ce plasmide comprend le sous-fragment BstEII- Bsu36I du fragment I}.. Ce sous-fragment code pour 114 acides aminés N-terminaux de I]_. - pGmAcl68l4 : Le plasmide pGmAc31l2 a été clivé à l'aide de
Bsu36I, pourvu d'extrémités franches en utilisant la polymérase de KLENOW, et coupé avec Asp7l8. Le fragment d'ADN de 729 pb qui en résulte a été ligaturé dans le vecteur de transfert pGmAcl68 clivé entre BglII (extrémité réparée avec la polymérase de KLENOW) et Asp718. (Le vecteur de transfert pGmAcl68 présente une délétion du gène de la polyédrine entre les nucleotides +5 et +483 (par rapport au A de l'ATG) . Un lieur BcrlII a été inséré entre ces deux positions) . L'insertion du fragment I4 en phase avec les 5 premiers nucleotides de la polyédrine conduit à la production d'une protéine de fusion comportant 1 acide aminé supplémentaire provenant de la polyédrine. Le plasmide ainsi obtenu est dénommé pGmAcl68l4. Il comprend un sous-fragment qui code pour 239 acides aminés C-terminaux de I]__ - pGmAc31l5 :
Pour obtenir ce plasmide, pGmAc31I1 a été digéré avec Xbal et Bsu36I ; un fragment XbaI-Bsu36I a été délété ; les extrémités de part et d'autre de ce fragment ont été rendues franches en utilisant la polymérase de KLENOW, et ligaturées avec un lieur BamHI (10 mer) . Le plasmide obtenu comprend un sous-fragment qui code pour 52 acides aminés N-terminaux de I},, fusionné à un sous-fragment qui code pour 239 acides aminés C-terminaux de Iχ.. Les inserts Iτ_, I2, I3, I4, I5 localisés par rapport à la séquence codant pour le domaine intracytoplasmique de la prolactine, sont représentés sur la figure l par des rectangles blancs unis . Le promoteur de la polyédrine est représenté en noir uni ; le début de la séquence codant pour la polyédrine est représenté par des points noirs sur fond blanc.
Trois baculovirus recombinants, nommés ACPÏ1I3, ACPÏ1I4 et ACPI1I5 ont été obtenus par recombinaison homologue entre pGmAc3ll3, PG111ACI68I4, et pGmAc31l5, respectivement, et l'ADN total de AcMNPV de type sauvage. Un baculovirus recombinant exprimant la protéine I2 a été utilisé comme contrôle positif.
Des cellules de Spodoptera frugiperda ont été infectées avec chacun de ces virus. 48 h après l'infection, les lysats de cellules et les milieux de culture ont été analysés après transfert immunoélectrophétique sur membrane de nitrocellulose, et révélation à l'aide d'un sérum polyclonal anti-récepteur de la prolactine, comme décrit par CAHOREAU et al. [Biochimie, n° 74, p. 1053-1065, 1992] . Les résultats obtenus indiquent que les trois protéines I3, I4 et I5 conservent la capacité d'être sécrétées dans le milieu de culture des cellules .
Figure imgf000013_0001
cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou de ses fragments, pour permettre la sécrétion de la cvcline B et de la cvcline A.
Pour étudier la capacité des différents fragments du domaine intracellulaire du récepteur de la prolactine pour transporter une protéine passagère, des baculovirus recombinants exprimant ces fragments fusionnés par leur extrémité C-terminale à l'extrémité N- terminale d'une protéine passagère, ont été construits. La cycline A, ou la cycline B ont été utilisés comme protéines passagères . La cycline A et la cycline B ont déjà été exprimées dans le système baculovirus/cellules d'insectes. Dans ces conditions, la cycline A est présente dans le noyau des cellules infectées [ZINDY F., "Etude des fonctions et de l'expression de la cycline A humaine normale et de sa forme modifiée par 1 ' intégration de l'ADN du virus de l'hépatite B", Thèse, Université
Paris 6, 15 Juin 1993] , tandis que la cycline B forme des granulations insolubles dans le cytoplasme des cellules
[LORCA et al., Mol. Cel . Biol . 11, p. 1171-1175, (1991)] ; il s'agit donc de protéines qui, normalement ne sont pas excrétées .
Le vecteur de transfert pGmAc31I2 a été modifié par mutation du codon stop (TGA) du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, de telle sorte qu'un site Kpnl le remplace. Le fragment Kpnl-Kpnl est ensuite délété par digestion à l'aide de l'enzyme de restriction Kpnl. puis le vecteur est religué.
Les deux ADNc codant respectivement pour la cycline A et la cycline B ont été insérés dans le site Kpnl unique restant : le gène de la cycline B a été coupé par HindIII, réparé par l'enzyme de KLENOW et Smal, puis inséré au site Kpnl réparé par l'enzyme de KLENOW, du vecteur de transfert. Les différentes étapes de cette construction sont illustrées par la figure 2. La séquence complète du gène codant pour la cycline B a été inséré au site BglII réparé par l'enzyme de KLENOW, du vecteur de transfert pGmAc31l3. Dans le cas de la cycline A, l'ATG du gène a été remplacé de telle sorte que l'on obtienne un site Kpnl, et un fragment Kpnl-Kpnl renfermant la totalité du gène de la cycline A a été directement inséré au site Kpnl du vecteur de transfert.
Le gène CycB a ainsi été inséré dans les vecteurs de transfert pGmAc31I2 et pGmAc31l3, et le gène CycA a été inséré dans pGmAc31I2. Les virus recombinants dénommés respectivement AcPhI2-CycB, AcPhl3-CycB, et AcPhI2-CycA ont été obtenus par recombinaison homologue entre ces vecteurs de transfert, et l'ADN total d'AcMNPV de type sauvage. Des baculovirus exprimant uniquement les séquences codant pour la cycline A et la cycline B non- fusionnées avec le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ont également été construits à titre de témoin. Des cellules de Spodoptera frugiperda ont été infectées avec chacun des virus recombinants pendant 48 heures, et les protéines des extraits de cellules et des surnageants de cultures ont été caractérisées par immunoélectrotransfert, en utilisant un sérum polyclonal anti-récepteur de la prolactine.
Les résultats sont les suivants : - La cycline A et la cycline B seules, ont été uniquement détectées dans les lysats de cellules ; aucune sécrétion dans le milieu de culture n'est détectable
- Les protéines chimériques I2-CycB et I2-CycA sont présentes à la fois dans les lysats cellulaires et dans les milieux de culture de cellules. Chacune des protéines fusionnée à I2 est donc sécrétée de manière efficace.
- La protéine chimérique I3-CycB s'accumule dans le cytoplasme, ce qui indique que la délétion de la portion C-terminale du domaine I2 réduit substantiellement l'efficacité de la sécrétion.
L'immunodétection en utilisant un anti-sérum anti-ubiquitine montre que I2CycB et I2CycA sont ubiquitinylés, tandis que CycA, CycB, et l3CycB ne le sont pas. Il est donc possible que les résidus d'ubiquitine jouent un rôle dans le processus de sécrétion.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'une protéine dont la séquence polypeptidique est choisie dans le groupe constitué par :
- la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine ;
- la séquence du fragment du récepteur de la prolactine constitué par les acides aminés 240 à 592 de la forme longue dudit récepteur chez le lapin, par les acides aminés 235 à 591 de la forme longue dudit récepteur chez le rat, par les acides aminés 235 à 598 de la forme longue dudit récepteur chez l'homme ;
- la séquence du domaine intra-cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance ;
- la séquence d'un fragment du récepteur de l'hormone de croissance comprenant les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez l'homme, ou bien les acides aminés 272 à 620 dudit récepteur chez le rat, ou bien les acides aminés 271 à 620 dudit récepteur chez le lapin, pour obtenir la sécrétion d'une protéine d'intérêt produite dans une cellule-hôte eucaryote.
2) Protéine chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend une première région constituée par une protéine d'intérêt que l'on souhaite exporter, prolongée à son extrémité N-terminale par une seconde région constituée par le domaine intra-cytoplasmique du récepteur de la prolactine, ou par le domaine intra- cytoplasmique du récepteur de l'hormone de croissance, ou par un fragment, tel que défini dans la revendication 1, de l'un ou l'autre de ces domaines, et en ce qu'elle ne contient pas le domaine transmembranaire desdits récepteurs .
3) Protéine chimérique selon la revendication 2 caractérisée en ce que les deux régions sont séparées par un oligopeptide comprenant un site spécifique de clivage par une protéase. 4) Gène recombinant caractérisé en ce qu'il code pour une protéine chimérique selon une quelconque des revendications 2 ou 3.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4992378A (en) * 1988-12-16 1991-02-12 The Royal Institution For The Advancement Of Learning (Mcgill University) C-DNA encoding human prolactin receptor
JPH06172394A (ja) * 1992-12-10 1994-06-21 Tanpaku Kogaku Kenkyusho:Kk 成長ホルモンレセプターの細胞質外ｃ−ドメイン蛋白質

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4992378A (en) * 1988-12-16 1991-02-12 The Royal Institution For The Advancement Of Learning (Mcgill University) C-DNA encoding human prolactin receptor
JPH06172394A (ja) * 1992-12-10 1994-06-21 Tanpaku Kogaku Kenkyusho:Kk 成長ホルモンレセプターの細胞質外ｃ−ドメイン蛋白質

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CIOFFI J A ET AL: "FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A CHIMERIC PROLACTIN-GROWTH HORMONE RECEPTOR EXPRESSED IN MOUSE L CELLS", MEETING OF THE FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY ON EXPERIMENTAL BIOLOGY '93, NEW ORLEANS, LOUISIANA, USA, MARCH 28-APRIL 1, 1993. FASEB (FED AM SOC EXP BIOL) J, 7 (3-4). 1993. A430., XP002020687 *
DUSANTER I ET AL: "Functionality of prolactin and chimeric prolactin-erythropoietin receptors in lymphoid cells", JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY SUPPLEMENT, 0 (18B). 1994. 276., XP000576341 *
GARNIER L ET AL: "The intracellular domain of the rabbit prolactin receptor is able to promote the secretion of a passenger protein via an unusual secretory pathway in Lepidopteran cells", BIO-TECHNOLOGY (NEW YORK), 13 (10), 13 October 1995 (1995-10-13), pages 1101 - 1104, XP002020688 *
MOORE R C ET AL: "Ligand-induced activation of prolactin receptor and a chimeric growth hormone receptor-prolactin receptor", FASEB JOURNAL, 9 (6). 1995. A1414., XP002020686 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 018, no. 511 (C - 1253) 27 September 1994 (1994-09-27) *
VAHOREAU, C. ET AL.: "Expression of the full-length rabbit prolactin receptor and its specific domains in baculovirus insect cells.", BIOCHIMIE, vol. 74, 1992, PARIS, pages 1053 - 1065, XP000576396 *

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