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WO1996035451A1 - Novel toxin complex - Google Patents

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WO1996035451A1
WO1996035451A1 PCT/JP1996/001241 JP9601241W WO9635451A1 WO 1996035451 A1 WO1996035451 A1 WO 1996035451A1 JP 9601241 W JP9601241 W JP 9601241W WO 9635451 A1 WO9635451 A1 WO 9635451A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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compound
added
residue
solvent
peg
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1996/001241
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiyuki Suzawa
Motoo Yamasaki
Satoru Nagamura
Hiromitsu Saito
So Ohta
Nobuo Hanai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to DE69637383T priority Critical patent/DE69637383T2/de
Priority to US08/981,416 priority patent/US6103236A/en
Priority to CA002220339A priority patent/CA2220339C/en
Priority to EP96913722A priority patent/EP0867190B1/en
Priority to JP53395196A priority patent/JP3871713B2/ja
Publication of WO1996035451A1 publication Critical patent/WO1996035451A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to a toxin complex in which a toxin residue and a residue derived from a compound having an affinity for a target cell, for example, a residue derived from a cancer-specific antibody or antibody fragment are bound via a spacer.
  • the toxin complex obtained by the present invention has a cell growth inhibitory action selectively and efficiently on target cells, and is useful as an active ingredient of an antitumor agent.
  • daunomycin As anthracycline anticancer compounds, daunomycin (US Patent No.
  • adriamycin US Pat. No. 3,590,028, and the like are known anticancer agents widely used clinically.
  • adriamycin for example, produces side effects such as cardiotoxicity and myelosuppression [Cancer Chemotherapy and Pharmacolgy, 5-10 (1980)], and reducing these side effects is one of the major challenges. is there.
  • Research to solve this problem has been performed extensively in the past, and in recent years, in particular, research has been conducted on drug delivery systems that seek to reduce toxicity, maintain blood levels, and have affinity for cancer cells.
  • a modification with a divinyl ether-maleic anhydride copolymer Japanese Patent Laid-Open No. 60-67090
  • a dextran modification [Cancer Treatment Reports, 66, 107 (1982)] are known.
  • Antibody conjugates (toxin conjugates) having cancer cell specificity have also been studied, for example, the following example [Bioconjugate Chem., 1.13 (1990)]. Construction
  • Antibody monocarbohydrate -c -N— N C—toxin anthracycline
  • the present inventors have intensively studied to search for an excellent toxin conjugate that selectively exerts a killing effect on tumor cells.
  • the toxin molecule by chemically binding the toxin molecule to a molecule having a specific affinity for cancer cells via a novel spacer composed of polyethylene glycol and a dipeptide, the spacer is formed in a specific cell.
  • the inventors have found that a complex in which the protein is specifically cleaved can be obtained, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a toxin conjugate in which a residue derived from a compound having an affinity for a target cell and a toxin residue are bound via a spacer containing alkylene glycol and a peptide.
  • Z represents a residue derived from a compound having affinity for a target cell
  • Y 1 represents a toxin residue
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acid residues
  • Alk represents an alkylene.
  • N represents an integer of 1 to 1,000
  • m represents an integer of 1 to 100).
  • Chi beta, not a and W 1 is not particularly limited, for example, ⁇ ° - COA 1 k 1 - , -SA 1 k 1 one, -COOA 1 k 1 -, one CONHA lk 1 -, -COA 1 k 1 CO,
  • Alk 1 and Alk 2 are the same or different and are linear or branched such as methylene, ethylene, propylene, isopropylene, butylene, isobutylene, pentylene, hexylene, heptylene, octylene, etc. Represents alkylene having 1 to 8 carbon atoms.
  • W is a single bond
  • the alkylene portion of the alkylene and polyalkylene glycol includes a straight-chain or branched C1-C8 carbon atom such as methylene, Examples include ethylene, propylene, isopropylene, butylene, isobutylene, pentylene, hexylene, heptylene, octylene and the like.
  • Target cells COOH, NH, SH
  • compounds having a bondable structure X 1 such as OH, epidermal growth factor having an affinity for example a target cell (EGF), trans Hue phosphorus Receptor, a ligand such as an arginine-glycine-aspartate sequence, a protein such as an antibody or an antibody fragment, a peptide, etc., preferably an antibody, an antibody fragment and the like.
  • Antibodies include both polyclonal and monoclonal antibodies produced by known methods, including those of the immunoglobulin (Ig) G, IgA, IgM, and IgE classes, and those of the subclass.
  • the antibody against ganglioside GD 3 to a high expression observed in cancer cells KM- 64 1 antibody (JP-A-5-1 7679 No. 1), the antibody against Shiariruruisu a KM- 23 1 (AMC- 4 62 ) Antibody (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-0102562), NL-1 antibody which is an antibody against common human acute lymphocytic leukemia cell antigen (CALLA) [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4386-4390 (1982) ].
  • CALLA common human acute lymphocytic leukemia cell antigen
  • Examples of the antibody fragment include F (ab ') 2 obtained by treating the above antibody with a protease such as pepsin, Fab' obtained by reducing F (ab ') 2 with mercaptan, antibody Fab obtained by decomposing the protein with a proteolytic enzyme such as papain, trypsin, chymotrypsin, and plasmin.
  • F (ab ') 2 , Fab', Fab and its production method are known (Yuichi Yamamura et al., Immunochemistry, 461 pages, Asakura Shoten, 1973).
  • Toxins NH, SH, toxins that have a possible structure adds to the double bond of the terminal amino acid R 2 of a carboxyl group and condensation available-structure or Mareinimi de such as OH, for example adriamycin (U.S. Patent No. 3, 590 , 028), anthracycline compounds such as daunorubicin (U.S. Pat. No. 3,616,242), DC-88A derivatives (JP-A-2-288879), and duocarmycin derivatives such as the compounds described in Reference Examples.
  • mitomycin A and mitomycin include a protein toxin such as ricin A, diphtheria toxin, pseudomonas exotoxin, etc.
  • amino acid residues are alanine residue and leucine residue. Glycine residue Group, proline residue and valine residue.
  • a 1 a L-alanine
  • a DM Adriamycin
  • EDC 1— (3-dimethylaminopropyl) -1-3-ethylcarbodiimide
  • DMAP 4- (N, N-dimethylamino) pyridine
  • Y 2 is hydroxy
  • R 1 , R 2 and n have the same meanings as described above).
  • Process 1 Compound preparation of compounds wherein Z N in the group, group and X 1 have the S or 0 is CO and W is a single bond in (I) (I a)
  • Compound (la) can be produced according to the following reaction steps. HOCOCH 2 (OCH 2 CH 2 ) n OCH 2 COOH (III)
  • a 1 and A 2 are the same or different and represent a protecting group for a carboxylic acid
  • a 3 and A 4 are the same or different and represent a group that activates a carboxylic acid
  • Ha represents a halogen
  • Z 1 represents a group having N, S or 0 in the group in the definition of Z
  • Y 1 , R 1 , R 2 and n have the same meanings as described above
  • carboxylic acid protecting group examples include carboxylic acid protecting groups used in general peptide synthesis ("Basic and Experimental Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya et al., Maruzen), for example, tBu, Bzl, Pic, etc.
  • group that activates a carboxylic acid examples include ONS u. Halogen means chlorine, bromine and iodine atoms. (Process 1)
  • Compound (V) is prepared by combining polyethylene glycol dicarboxylic acid (III) with 0.1 to 1 equivalent, preferably 0.5 equivalent, of compound (IV) in a solvent such as DMF in the presence of a base such as potassium carbonate. It can be obtained by reacting at 50-30 ° C for 1-24 hours. At this time, diester and unreacted dicarboxylic acid contained in the product are removed by partitioning, adsorption resin, reverse phase silica gel, alumina, diatomaceous earth, ion exchange resin, preferably by silica gel column chromatography or thin layer chromatography. be able to.
  • Compound (VII) is obtained by combining 1 to 2 equivalents of compound (VI) with compound (VI) obtained by a general liquid phase peptide synthesis method ("Basic and Experimental Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya et al., Maruzen). It can be obtained by condensation in a solvent using 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents of a condensing agent in the presence of a base.
  • the base include triethylamine, NMM and the like
  • examples of the condensing agent include condensing reagents of ordinary amino acids such as DCC and EDC
  • examples of the solvent include methylene chloride, chloroform and DMF.
  • the reaction is carried out by stirring at 0-30 for 1-24 hours.
  • a 2 used as a carboxylic acid protecting group of compound (VI) is preferably a group that can be selectively removed separately from A 1 of compound (V).
  • Compound (VII) is prepared by subjecting compound (V) to 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents of HONS u. HOBt or the like, in the presence of an equivalent of a base, 1 to 5 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents.
  • the active ester can be obtained by condensing in a solvent using an equivalent amount of a condensing agent, and then reacting this with compound (VI) at 0 to 30 ° C for 1 to 24 hours.
  • Examples of the base, the condensing agent and the solvent include the same as described above.
  • Compound (VIII) can selectively select ⁇ ⁇ 2 from compound (VII) according to the method for removing protecting groups used in general peptide synthesis (“Basic and Experimental Peptide Synthesis”, Nobuo Izumiya et al., Maruzen) By deprotection. (Process 4)
  • Compound (X) is obtained by condensing compound (VI) with an equivalent amount of a toxin in a solvent using 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents of a condensing agent in the presence of 1 to 2 equivalents of a base.
  • a base include triethylamine, NMM and the like
  • examples of the condensing agent include condensing reagents of ordinary amino acids such as DCC and EDC
  • examples of the solvent include methylene chloride, chloroform and DMF.
  • the reaction is carried out by stirring at a temperature of 30 to 30 ° C for 1 to 24 hours.
  • Compound (X) is prepared by combining compound (VIII) with 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents of HONS u. HOBt or the like in the presence of an equivalent of base, 1 to 5 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents.
  • the active ester (IX) can be obtained by condensing in a solvent using an equivalent amount of a condensing agent, and then reacting it with a toxin at 130 to 30 ° C for 1 to 24 hours.
  • Examples of the base, the condensing agent and the solvent include the same as described above.
  • Compound (XI) is obtained by deprotecting A 1 from compound (X) according to the method for removing protecting groups used in general peptide synthesis ("Basic and Experimental Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya et al., Maruzen). Obtainable.
  • the steps 3 and as for example A 1 combination of protecting groups which have contact in step 5 is deprotected Bz l, when using the t Bu in A 2, A 1 is and hydrogenated under palladium carbon catalyst, A 2 is deprotected according selective removal methods usual Amino acid protecting group such as triflic O b acetic acid treatment, the a 1 and a 2 can be selectively removed in each step.
  • the order of to deprotection combination of A 1 and A 2 in the reverse also may be reversed accordingly.
  • the compound (XI) can after deprotection to A 1 according than compound in Step 4 () to the method of Step 5, also be obtained by reacting a toxin according to the method of Step 2.
  • Compound (la) can be obtained from compound (XI) and a compound having affinity for target cells and having NH, SH, or 0H in the molecule according to the method in Step 2.
  • Compounds that have an affinity for the target cells are stored in organic solvents such as proteins and peptides. Many of the compounds have a risk of denaturing and deactivating in the reaction, and the above reaction is preferably carried out in a mild aqueous solution.
  • the reaction is performed by dissolving a compound having an affinity for the target cell in a buffer solution such as phosphoric acid or boric acid having a pH of 6 to 8, and adding 1 to 500 equivalents, preferably 1 to 50 equivalents of the compound (XI ) And a condensing agent such as EDC, and the mixture is stirred at 0 to 30 ° C for 1 to 48 hours, or an active ester (XII) is obtained according to the method of Step 2, which is In the presence of 0 to 10%, preferably 0 to 5% of DMS 0 or DMF, 1 to 500 equivalents, preferably 1 to 500 equivalents, of a solution in which a compound having an affinity for a target cell is dissolved in a buffer having a pH of 6 to 8 Is carried out by mixing at a ratio of 1 to 50 equivalents and stirring at 0 to 30 ° C for 1 to 48 hours.
  • a buffer solution such as phosphoric acid or boric acid having a pH of 6 to 8
  • a condensing agent
  • Production method 2 In compound (I), Z is a group having N, S or 0 in the group and X 1 is CO and W is
  • Compound (Ib) can be produced according to the following reaction steps ⁇
  • Step 7 (Wherein A 1 , Y 1 , Z 1 , R 1 , R 2 and n have the same meanings as described above) (Step 7)
  • Compound (XIII) can be obtained from compound (VIII) and aminoethylmaleide according to the method of Step 2.
  • Compound aiV) can be obtained by reacting compound (XIII) with a toxin. For the reaction, dissolve the toxin in a buffer solution such as phosphoric acid or boric acid with ⁇ 6 to 8, add 1 to 50 equivalents of compound (XIII), and stir at 0 to 30 ° C for 1 to 48 hours. It is performed by
  • Compound (lb) can be obtained from compound (XI V) according to the methods of Step 5 and Step 6.
  • Production method 3 Production method of compound (Ic) in which Z is a group having CO in the group and X 1 is S and W is a single bond in compound (I)
  • Compound (Ic) can be produced according to the following reaction steps.
  • a 4 represents a thiol protecting group
  • Z 2 represents a group having CO in the definition of Z
  • a 1 , Y 1 , R 1 , R 2 and n are the same as those described above.
  • thiol protecting groups include benzyl, picolyl, and nitrobenzyl.
  • the starting compound (XV) can be obtained according to the method for synthesizing a polyethylene glycol derivative described in Poly (Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, (J. M. Harris, Ed., Plenum, NY. 1992).
  • Compound (XVI) can be obtained by protecting the thiol group of compound (XV) according to the general method for introducing a protecting group used for peptide synthesis ("Basic and Experimental Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya et al., Maruzen). Can be.
  • Compound (XVI I) can be obtained from compound (XVI) according to the method of Step 3. (Process 1 2)
  • Compound (XVIII) can be obtained from compound (XVII) according to the methods of Step 2 and Step 3.
  • Compound (XIX) can be obtained from compound ⁇ ) according to the method of Step 4.
  • Compound (XX) can be obtained by deprotecting compound (XIX) according to the general method for removing protecting groups used in peptide synthesis ("Basic and Experimental Peptide Synthesis", Nobuo Izumiya et al., Maruzen). it can.
  • Compound (Ic) is obtained by combining compound (XX) with a compound having affinity for a target cell and having C00H in the molecule by the thiol group described in J. Applied Biochem., _6, 56-63 (1984). It can be obtained by binding using a method such as an activation method.
  • Compound (XXI I) can be obtained from compound (XXI) according to the method of Step 3. Wear.
  • Compound (Ud) can be obtained from compound (XXII) according to the methods of Step 2 and Step 3.
  • Compound (XXIII) can be obtained from compound (IId) according to the method of Step 4.
  • Compound (Id) can be obtained from compound (II) and a compound having affinity for target cells and having NH, SH or OH in the molecule according to the method of Step 8.
  • Production method 5 Production method of compound (IIa) wherein X 2 is carboxy and Y 2 is hydroxy in compound (II)
  • Compound (IIa) can be obtained from compound (VIII) according to the method of Step 3.
  • Compound (lib) can be obtained from compound (II) according to the method of Step 3.
  • Production method 7 Production method of compound (lie) wherein X 2 is mercapto and Y 2 is hydroxy in compound ( ⁇ ) (Step 22)
  • Compound (lie) can be obtained from compound (XVIII) according to the method of Step 14.
  • the compound (I) or compound (II) having a desired group at a desired position can be obtained by appropriately combining and carrying out the methods described above.
  • Intermediates and target compounds in each of the above-mentioned production methods are classified into various types such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, silica gel chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, etc. It can be isolated and purified by column chromatography or dialysis using a normal semipermeable membrane. In addition, the intermediate can be subjected to the next reaction without purification.
  • Table 1 shows specific examples of the toxin complex (I) obtained by the above production method.
  • the target cell lines used were cervical cancer HeLaS 3 (CALLA-), which does not express the CALLA antigen, and Daudi (CALLA + ), a basic lymphoma expressing the CALLA antigen.
  • Target cell line 50 to a 96-well flat bottom plate 1 (1 1 0 3 _ hole) of its Rezorema-out and incubated for 2 hours C0 2 incubator at 37 °. After culturing, diluted toxin conjugate or monochrome one monoclonal antibody to 5 Q 1 added to a concentration of species people were further cultured at 3 7 ° 6 8 hours C0 2 incubator within one.
  • the compound (Ia-6) was used to examine the cell growth inhibitory effect.
  • the target cell line, s L e cervical H does not express ⁇ antigen e L a S 3 (s L e a -) and s L e colon cancer expressing a antigen S W1116 (s L e '+).
  • s L e a S 3 s L e a -
  • s L e colon cancer expressing a antigen S W1116
  • the target cell line is sLe. Cervical cancer HeLa S3 (sLe and sLe ⁇ antigen expressing SW11 16 ( sLe ⁇ + ), which does not express the antigen, was used. well flat bottom plate were plated target cell line 5 0 1 (1 X10 3 cells holes) respectively, 3 7 times after cultured. culture at 2 hours C0 2 incubator, the drug one monoclonal antibody complexes were diluted into various concentrations the body or monochrome one monoclonal antibody 5 0 1 was added, an additional 3 7 times in 2 hours C0 2 and cultured in an incubator. after incubation, plates were centrifuged to remove the culture supernatant.
  • the human myeloma cells SK—Ly—18 prepared to 2 ⁇ 10 8 1 in RPM1-1640 medium containing 10% fetal bovine serum were purified from Matrigel [Matrige 1 (registered trademark; Becton Dickins). on Labwa re, USA)] and 1: 1 (v / v) were mixed in a subcutaneous its 0. 1ml (1 x 1 0 7 or Z mouse) B AL B Zc, nu / nu mice (CLEA Japan) Transplanted.
  • the control group received physiological saline in the same manner.
  • the major axis and minor axis of the tumor were measured daily, and the tumor volume was calculated by the following formula as an approximate value of an ellipsoid.
  • Tumor volume (mm 3 ) (a xb 2 ) / 2
  • a major axis (mm)
  • b minor axis (mm)
  • the therapeutic effect on the transplanted tumor is the ratio of the tumor volume (V) on the measurement evaluation day to the tumor volume (V.) on the drug administration day, VZV. Was evaluated.
  • FIG. 1 shows the cell growth inhibitory effect of the toxin complex or the monoclonal antibody.
  • Fig. 2 shows the therapeutic effect of a toxin complex or drug on transplanted tumors It is.
  • the desired eluted fraction is concentrated with a small amount ultrafiltration membrane (Millipore, molecular weight cut-off: 500,000), and NL-1-(PEG-Ala—Val — ADM) m ⁇ G (protein concentration 0.67 mgZm 1) was obtained (yield 49%).
  • Example 2 In this complex, the number of adriamycin bonds calculated from the absorbance at 280 nm and 495 nm in the same manner as in Example 1 was 1.8 per antibody molecule. It was confirmed by the fluorescent antibody method described in Example 1 that the complex had almost the same binding titer as the unbound antibody.
  • Example 2 the number of adriamicin bonds calculated from the absorbance at 280 nm and 495 nm in the same manner as in Example 1 was 1.5 per antibody molecule. It was confirmed by the fluorescent antibody method described in Example 1 that the antibody had almost the same binding titer as an unbound antibody.
  • Example 4 the number of daunorubicin bonds calculated from the absorbance at 280 nm and 495 nm in the same manner as in Example 4 was 1.9 per antibody molecule. It was confirmed by the fluorescent antibody method described in Example 1 that the antibody had almost the same binding titer as the unbound antibody. At this time, SW111 16 was used for the evaluation cells.
  • aqueous solution (1.0 mg / m 1) 825 81 was added, and the mixture was gently stirred overnight at 4 ° C. Insolubles were removed with a 0.45 in filter, and then the same as in Example 1.
  • the antibody fraction is purified and concentrated by gel filtration HP LC, and KM-231- (PEG-GlyPro-DNR) ra is obtained in an amount of 66 g (protein concentration of 1.1 mgZm1). Was obtained (80% yield).
  • the number of daunorubicin bonds calculated from the absorbance at 280 nm and 495 nm in the same manner as in Example 4 was 1.5 per antibody molecule. It was confirmed by the fluorescent antibody method described in Example 5 that the binding antibody had almost the same binding titer as the binding antibody.
  • the number of compound (20) bound per antibody molecule was determined by HPLC using the H-Va1 compound (20) liberated after enzymatic treatment (samomoricin) according to the method described in Reference Example 27. It was calculated by quantification. As a result, it was confirmed that 0.38 compounds (20) were bound per antibody molecule in this complex.
  • the number of bound compounds (20) per antibody molecule was calculated by enzymatic treatment (proline endopeptidase) according to the method described in Reference Example 27 and quantifying the released compound (20) by HPLC. . This confirmed that 0.45 compounds (20) were bound per antibody molecule in this complex.
  • the number of compound (20) bound per antibody molecule can be determined by enzymatic treatment (proline endopeptidase) according to the method described in Reference Example 27 and quantifying the released compound (20) by HPLC. Calculated. This confirmed that 0.49 compounds (20) were bound per antibody molecule in this complex.
  • Example 11 1 Toxin complex (la-11): KM-641- (PEG-A1a-Va1-compound (12)) m
  • Polyethylene glycol dicarboxylic acid [HO-PEG-OH, average molecular weight
  • Methanol 100: 0, 50: 1, 30: 1, 20: 1, 10: 1 and 5: 1 each using 200 ml and fractionated by 10 ml) .
  • the solvent of the target fraction was removed under reduced pressure while confirming the target fraction by silica gel thin layer chromatography.
  • the residue was dissolved in a small amount of chloroform, filtered, and the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure to obtain 0.9 g (1.3 mmol) of the target compound BzlO-PEG- ⁇ H (yield 7.8). %).
  • the residue was removed under reduced pressure to obtain 1.47 g of the oily target substance, Z—A1a—Pro—OtBu, which was dissolved in 1.47 g of the compound by adding 30 ml of THF and 30 ml of methanol.
  • the aqueous layer was extracted, adjusted to pH 6.5 with 1N HCl, and extracted 6 to 7 times with chloroform 100 ml. At this time, ⁇ of the aqueous layer gradually increased, so ⁇ was kept at 6.5 at 1 NHC1. After drying the form layer with anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed under reduced pressure to obtain 1.0 g (1.5 ol) of the desired product, Pic 0-PEG- ⁇ (yield 8.9%). .
  • Reference Example 5 Compound (VIII-5): PicO-PEG-Ala-Val-OH Pic59-PEG-OH obtained in Reference Example 4 (a), 459 mg (0.67 mmol), was treated with methylene chloride. After dissolving in 7 ml, 138 mg (0.80 mmol) of DCC was added under ice cooling, and the mixture was stirred for 20 minutes. 7 ml of a methylene chloride solution of 134 mg (0.55 sleep) of H—Ala—Val—OtBu obtained in Reference Example 1 (b) was added, and the mixture was stirred for 3 hours under ice cooling.
  • UV-visible absorption spectrum (in methanol, imex ): 233, 252, 290 , 470 , 495 , 5 34, 5 78
  • UV-visible absorption spectrum (in methanol, l m, x): 233 , 25 0, 2 9 0, 4 70, 4 9 5, 5 30, 5 76 nm
  • UV-visible absorption spectrum (in methanol, ex ): 232, 274, 495, 534, 575 nm
  • Infrared absorption spectrum (in the mouth of the mouth): 358, 340, 300, 290, 290, 187, 176, 177, 6, 660 , 1 6 0 5, 1 5 2 0, 1 4 5 0, 1 2 95, 1 1 05 cm- 1
  • the catalyst was filtered off, and the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure.
  • 0.95 mg of daunorubicin hydrochloride was dissolved in a dry DMF solution of triethylamine in 5001 (0.48 gZm1). added. After leaving the reaction solution to stand under ice cooling for 30 minutes and then at room temperature for 1 hour, the solvent was removed under reduced pressure, and the residue was purified with 5.0 ml of silica gel (Cocogel C1200).
  • UV-visible absorption spectrum (in methanol, l max ): 2 32, 251, 29, 90
  • Infrared absorption spectrum (in the form of black mouth): 3690, 358,0, 340,031, 29,36, 28,78, 1.782, 1714 , 1 6 5 0, 1 6 0 0,
  • Reference Example 1 Compound (XI-7): HO-PEG-A1a-Va1- compound (20) 11.5 mg (13.4 mol) of the compound (VIII-1) obtained in Reference Example 1 was chlorided. After dissolving in 5 ml of methylene, HONS u, 3.6 mg (31.3 mol) and DCC, 6. mg (31.0 mol) were added under ice cooling, and the mixture was stirred at 0 ° C for 2 hours. The insoluble matter (DCU) was filtered off, and the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure.
  • DCU insoluble matter
  • the residue was dissolved in 300 ml of methanol in a nitrogen stream, 2-3 mg of a 10% palladium on carbon catalyst was added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 3 hours in a hydrogen stream.
  • the catalyst was filtered off, and the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure.
  • the residue was dissolved in a small amount of chloroform and purified with silica gel (3.0 ml) ( ⁇ co-gel C-200).
  • methanol 20: 1, 10: 1 as eluent (10 ml each), eluted and removed benzyl ester Bz10-PEG-Ala-Pro-ONSu, then reference
  • Infrared absorption spectrum (in the form of black mouth): 3690, 36592, 340, 0300, 290, 0, 1712, 1650, 1 6 0 0, 1 4 5 0, 1 3 0 0, 1 1 1 0 cm— 1
  • Reference Example 14 Compound (XI-9): HO—PEG—G 1 y-Pr 0—Compound (20) Compound (VIII—3) obtained in Reference Example 3 11.2 mg (13.0 // ml) ) was dissolved in 0.5 ml of methylene chloride, HONS u (3.6 mg, 31.3 mol) and DC 6.4 mg (31.0 zmol) were added under ice cooling, and the mixture was stirred at 0 ° C for 2 hours. The insoluble matter (DCU) was filtered off, and the solvent was removed from the filtrate under reduced pressure.
  • DCU insoluble matter
  • Infrared absorption spectrum (in the form of black mouth): 3690, 36592, 340, 0300, 290, 0, 1712, 165, 0 6 0 0, 1 4 5 0, 1 3 0 0, 1 1 1 0 cm— 1
  • Infrared absorption spectrum (in the form of black mouth): 3595, 3450, 030, 029, 0 0, 1 75 0, 1 6 65, 1 6 0 8, 15 1 5, 1 4 6 0, 1 3 1 0, lll O cnr 1
  • 3'-Hydroxy-4'-Methoxycinnamic acid (compound (13)) 1.5 1 g (7.78 ol) was dissolved in a mixed solvent of methanol 3 Om 1 and benzene 105 ml, and trimethylsilyldiamine was dissolved. 1 lml (9.6raraol) of a 10% hexane solution of azomethane was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. A 10% hexane solution of trimethylsilyldiazomethane was further added in an amount of 2.Oml, followed by stirring for 1 hour.
  • Infrared absorption spectrum (in the form of black mouth): 359, 345, 0 310, 290, 175, 0, 166, 166, 168 1 5, 1 4 6 0, 1 3 1 0, 1 1 1 0 cm 1
  • the compound (24) was removed under reduced pressure to obtain 891113 (0.08 country 01) (yield: 68%).
  • the structures of the compounds (21) to (23) were determined by 'HNMR and mass spectrometry.
  • the structure of 24) was confirmed by 'HNMR.
  • Reference Example 20 KM—64 1— (PEG—Ala-Val—segment B) ra
  • the compound (25) obtained in Reference Example 19 (7.8 mg, 7.5 zmol) was added to 0.8 ml of methylene chloride.
  • 1.0 ml (1 mgm 1) of a methylene chloride solution of HONSu and 0.9 ml (2 mgZml) of a methylene chloride solution of DCC were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • the solvent was removed under reduced pressure, and 1 ml of DMSO was added to the residue.
  • the number of segments B bound per antibody molecule was calculated by enzymatic treatment (thermolysin) according to the method described in Reference Example 22, and quantifying the released H—Va 1—Segment B by HP. This confirmed that 1.9 segments B were bound per antibody molecule in this complex.
  • This reference example demonstrates that the peptide bond of the antibody-spacer-anticancer drug conjugate is cleaved intracellularly by a specific enzyme but is stably present in serum. This is described using a spacer-one-segment B conjugate.
  • specific cleavage of spacer was confirmed as follows using thermolysin as an intracellular cleavage enzyme and plasmin as a major proteolytic enzyme in blood.
  • thermolysin showed the same H-Va1-segment B peak as in Reference Example 21 at an elution time of 42.0 minutes. No peak was observed with the conjugate treated with kaplasmin. . Since plasmin is a major proteolytic enzyme in blood, these results indicate that the conjugate is stably present in blood, but specific anti-cancer drugs by specific enzymes when taken up into cells. This indicates that the part was cleaved to express anticancer activity.
  • the compound (XI-3) obtained in Reference Example 8 (14.3 g) was dissolved in DMSO, 201, and a phosphate buffer solution was added to the solution, and proline endopeptidase was added. 1. Omg / ml) 80/1 (enzyme amount: 2.8 U) was added and left at 37 ° C for 24 hours. The supernatant was analyzed by reverse phase HPLC, and the release of ADM from compound (XI-3) (elution time: 23.3 minutes) was confirmed (cleavage efficiency: 50%).
  • the compound (Ia-3) (0.19 mgZm1) 351 obtained in Example 3 was combined with the open-chain endopeptidase (1.0 OmgZmD TO zl (2.4 U enzyme amount) and a phosphate buffer 95). u 1 was added, and the mixture was allowed to stand for 24 hours at 37 ° C. Was analyzed to confirm the release of ADM from the compound (Ia-3) (cleavage efficiency 10%).
  • the analysis conditions for HP LC were the same as in Reference Example 25.
  • Example 8 Compound (Ia-8) (1.8 mg / m 1) obtained in Example 8 was added to proline endopeptidase (OmgZml) 0 ul (enzyme amount 2.8 U) and phosphate buffer 59 in 1 ⁇ 1. 1 was added and left overnight at 37 ° C. The supernatant was analyzed by reversed-phase HPLC to confirm the release of compound (20) from compound (la-8). The analysis conditions for HP LC were the same as in (1).
  • a toxin conjugate useful as an active ingredient of an antitumor agent comprising a toxin and a group having an affinity for a target cell, for example, a cancer-specific antibody or antibody fragment bound thereto via a spacer. And an in vitro diagnostic method using the complex.

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Description

技
野 明 細 書
斩 規 毒 素 複 合 体
本発明は、 毒素残基と標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基、 例えば癌 特異的な抗体あるいは抗体フラグメント由来の残基とをスぺーサーを介して結合 させた毒素複合体に関する。 本発明により得られる毒素複合体は、 標的細胞に対 して選択的かつ効率的に細胞増殖抑制作用を有し、 抗腫瘍剤の有効成分として有 用である。
背 景 技 術
アントラサイクリン系制癌剤化合物としては、 ダウノマイシン （米国特許第
3 , 5 9 0 , 0 2 8号） 、 アドリアマイシン （米国特許第 3， 5 9 0， 0 2 8号） などが知られており、 これらは臨床的にも広く使用されている制癌剤である。 し かしながら、 例えばアドリアマイシンは、 心臓毒性、 骨髄抑制などの副作用を発 現し [Cancer Chemotherapy and Pharmacol ogy, 5-10(1980) など] 、 これら の副作用の軽減が一"" ^の大きな課題である。 この課題の解決のための研究は従来 から広範に行われており、 近年、 特に毒性の軽減、 血中濃度の維持、 癌細胞親和 性を求めたドラッグデリバリ一システムの研究も行われている。 例えば、 ジビニ ルエーテル—無水マレイン酸共重合体による修飾 （特開昭 6 0 - 6 7 4 9 0 ) . デキス トラン修飾 [Cancer Treatment Reports, 66, 107( 1982) ]などが知られて いる。
また、 癌細胞特異性をもたせた抗体コンジユゲー卜 （毒素複合体） も検討され ており、 例えば、 下記の例 [Bi ocon jugate Chem. , 1. 13(1990) ] があげられる。 構造
ビンブラスチン リシン A、
ジフテリァ毒素 A、
アブリン A o = ビンブラスチンヒ ドラ
ジド、 メソ トレキセ一
Figure imgf000004_0001
ヒドラジド
抗体 -Lys-Ν· -C一アコニット酸一 C- -N— アントラサイクリン
I! I III <H
0
抗体 -Lys-N' -C N—毒素 ィンジゥムゃィッ トリ
H I < H ゥムのキレート体 抗体 ト体
Figure imgf000004_0002
抗体一炭水化物 -c -N— N=C—毒素 アントラサイクリン
II H I 金
キ
レ
この他にも、 抗体コンジユゲー卜に関して報告がなされている [特開昭 60一 67433号； 特開昭 63— 35575号； 特開昭 63— 1 50282号； 特開 昭 6 3— 24 6 336号； Biochem. J., 173, 723(1978); Cancer Res., 50， 6600(1990); Sience, 261^_ 212(1993); Bioconjugate Chem. , 275(1993); Bioconjugate Chem. , 4, 251(1993); Bioconjugate Chem., ^_ 88(1994)； Bioconjugate Chera. , _5, 31(1994); Bioconjugate Chem. , ^ 246(1994)]。
また、 低分子ポリエチレングリコールをスぺーサ一として用いた例 [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9287(1991); 特表平 5 - 5 0 8 8 5 6号； Bioconjugate Chem. , 4^ 455(1993)] あるいは抗体自身のボリエチレングリコ一 ル修飾（W093/08838； W086/04145など） が知られている。 また、 スぺーサ一に ペプチドを含むものが知られている [米国特許第 4, 671, 958号； 特表平 5— 502886号； Bioconjugate Chem. , 4, 10(1993) など] 。 発 明 の 開 示
本発明者らは、 腫瘍細胞に対し選択的に殺傷効果を発揮する優れた毒素複合体 の探索に鋭意検討を重ねた。 その結果、 ポリエチレングリコールとジペプチドと から構成される新規スぺーサーを介して毒素分子と癌細胞に特異的に親和性を有 する分子とを化学的に結合することにより、 特定細胞内でスぺーサ一が特異的に 切断される複合体が得られることを見い出し、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基と毒素残基とをポリア ルキレングリコールおよびジぺプチドを含有するスぺーサーを介して結合させた 毒素複合体に関する。
具体的には、 例えば一般式 （A)
:-{x°— (OAIk)nO-W°-R1-R2-w1-Y1)
m m (A)
(式中、 Zは標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基を表し、 Y1 は毒素残 基を表し、 R1 および R2 は同一または異なってアミノ酸残基を表し、 A l kは アルキレンを表し、 nは 1〜1 000の整数を表し、 mは 1〜1 00の整数を表 す） で表される毒素複合体があげられる。 Χβ 、 ず および W1 は特に限定され ないが、 例えば Χ° は— COA 1 k1 ―、 -S A 1 k 1 一、 -COOA 1 k 1 ―、 一 CONHA l k1 -、 -COA 1 k1 CO、
Figure imgf000005_0001
等を表し、 ず は C〇、 -Al k1 CO—、 -Al k1 S—等を表し、 W は単 結合、 S、 -OA 1 k1 CO—、 — NHA 1 k1 CO—、 -NHA 1 k1 NH―、 — NHAIk1— •NHAIk NHCOAIk2-N
0 ヽ O
等を表し、 式中、 A l k1 および A l k2 は同一または異なってメチレン、 ェチ レン、 プロピレン、 イソプロピレン、 ブチレン、 イソプチレン、 ペンチレン、 へ キシレン、 ヘプチレン、 ォクチレンなどの直鎖または分技状の炭素数 1〜8のァ ルキレンを表す。
中でも、 一般式 （I)
Z« x1— CH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1 - R2 - W - Y1) m (I)
(式中、 X1 は C0、 Sまたは
Figure imgf000006_0001
を表し、 Wは単結合または
Figure imgf000006_0002
を表し、 Z、 Y1 、 R1 、 R2 、 nおよび mは前記と同意義を表す） で表される 毒素複合体 [以下、 一般式 （I) で表される化合物を化合物 （ I) という。 他の 式番号の化合物についても同様である] が好ましい。
上記の各基の定義において、 アルキレンおよびポリアルキレングリコールのァ ルキレン部分としては、 直鎖または分技状の炭素数 1〜8の、 例えばメチレン、 エチレン、 プロピレン、 イソプロピレン、 ブチレン、 イソブチレン、 ペンチレン、 へキシレン、 ヘプチレン、 ォクチレンなどがあげられる。 標的細胞に親和性を有 する化合物としては、 COOH、 NH、 SH、 OHなどの X1 に結合可能な構造 を有する化合物、 例えば標的細胞に親和性を有する上皮細胞増殖因子 （EGF )、 トランスフエリンなどのレセプ夕ーリガンド、 アルギニンーグリシンーァスパラ ギン酸配列に代表される接着分子、 抗体、 抗体フラグメン トなどの蛋白質、 ぺプ チドなど、 好ましくは抗体、 抗体フラグメントなどがあげられる。 抗体は、 公知 の方法で作製される多クローン抗体、 単クローン抗体の双方を含み、 免疫グロブ リン （ I g) G、 I gA、 I gM、 I gEなどのクラスのもの、 およびサブクラ スのもの、 例えば I gGでは I gG, 、 I gG2 、 I gG3 、 I gG4 などを包 含する。 好ましくは、 癌細胞に高発現がみられるガングリオシド GD3 に対する 抗体である KM— 64 1抗体 （特開平 5— 1 7679 1号） 、 シァリルルイス aに対する抗体である KM— 23 1 (AMC— 4 62) 抗体 （特開昭 6 3一 021 562号） 、 共通人急性リンパ性白血病細胞抗原 （CALLA) に対する 抗体である NL— 1抗体 [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4386-4390(1982)] などがあげられる。 抗体フラグメントとしては、 上記抗体をペプシンなどの蛋白 質分解酵素で処理することにより得られる F (ab')2 、 さらに F (ab')2 をメル カブタンで還元することにより得られる Fab' 、 抗体をパパイン、 トリプシン、 キモトリプシン、 プラスミ ンなどの蛋白質分解酵素で分解することにより得られ る Fabなどがあげられる。 F (ab')2 、 Fab' 、 Fabおよびその製法については 公知である （山村雄一ら、 免疫化学、 46 1頁、 朝倉書店、 昭和 48年） 。 毒素 としては、 NH、 SH、 OHなどの末端アミノ酸 R2 のカルボキシル基と縮合可 能な構造あるいはマレインィミ ドの二重結合部に付加可能な構造を有する毒素、 例えばアドリアマイシン （米国特許第 3， 590, 028号） 、 ダウノルビシン (米国特許第 3， 6 1 6, 242号） などのアントラサイクリン系化合物、 DC — 88 A誘導体 （特開平 2— 288879 ) 、 参考例記載の化合物などのデュオ カルマイシン誘導体、 マイ トマイシン A、 マイ トマイシン（：、 あるレ、はリ シン A、 ジフテリアトキシン、 シユードモナスェクソトキシンなどの蛋白性の毒素などが あげられる。 アミノ酸残基としては、 ァラニン残基、 ロイシン残基、 グリシン残 基、 プロリン残基、 バリン残基があげられる。
なお、 以下の記載において使用される略号は、 特に断わらない限りそれぞれ以 下の意味を有する。
アミノ酸およびその保護基に関する略号は、 生化学命名に関する I UP AC— I UB委員会 （IUPAC- IUB Commit ion on Biochemical Nomenclature ) の勧告 [Biochemistry, 11, 1726(1972)]に従った。
A 1 a ： L-ァラニン
V a 1 : L-バリン
Pr o : L-プロリン
G 1 y ： グリシン
DMF： N, N—ジメチルホルムアミ ド
DMS〇 ： ジメチルスルホキシド
THF ：テトラヒドロフラン
TFA： トリフルォロ酢酸
NMM： N—メチルモルホリン
B z 1 ：ベンジル
t B u ： t e r t -ブチル
Z：ベンジルォキシカルボニル
P i c ： ピコリル
HONS u ： N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド
ONS u ： スクシンイミ ドォキシ
D C C： N, N' —ジシクロへキシルカルポジイミ ド
DCU： N, Ν' ージシクロへキシルゥレア
A DM： ァドリアマイシン
DNR： ダウノルビシン
HOB t ： N—ヒドロキンベンブトリアゾール
P y B〇 P：ベンブトリアゾ一ルー 1ーィルォキシトリピロリジノフォスフ才ニ ゥ厶へキサフルオロフォスフエ一ト
EDC ： 1— (3—ジメチルァミノプロピル） 一 3—ェチルカルボジィミ ド DMAP : 4— (N， N—ジメチルァミノ） ピリジン
PEG： COCH2 (OCH2 CH2 ) „ OCH2 CO
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
NMR：核磁気共鳴
次に、 化合物 （ I ) および一般式 （II)
X2— CH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1 - R2-Y2 (II)
(式中、 X2 はカルボキシ、 メルカプトまたは
Figure imgf000009_0001
を表し、 Y2 はヒドロキシまたは
Figure imgf000009_0002
を表し、 R1 、 R2 および nは前記と同意義を表す） で表されるポリエチレング リコール誘導体の製造法について説明する。
製造法 1 ：化合物 （ I) において Zが該基内に N、 Sまたは 0を有する基かつ X1 が COかつ Wが単結合である化合物 （ I a) の製造法
化合物 （ l a) は、 次の反応工程に従い製造することができる。 HOCOCH2(OCH2CH2)nOCH2COOH (III)
A1— Hal (IV) I工程 1
A1OCOCH2(OCH2CH2)nOCH2COOH (V)
Figure imgf000010_0001
A1OCOCH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1 - R2—OH (VIII)
I工程 4
A1OCOCH2(OCH2CH2)NOCH2CO— R1-R2-OA3 (IX)
Figure imgf000010_0002
A1OCOCH2(OCH2CH2) InOCH2CO— R1 - R2 - Y1 (X)
Figure imgf000010_0003
Z-(COCH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2-Y1)m (la)
(式中、 A1 および A2 は同一または異なってカルボン酸の保護基を表し、 A3 および A4 は同一または異なってカルボン酸を活性化する基を表し、 Ha l はハ ロゲンを表し、 Z1 は Zの定義のうち該基内に N、 Sまたは 0を有する基を表し、 Y1 、 R1 、 R2 および nは前記と同意義を表す）
カルボン酸の保護基としては、 一般的なぺプチド合成に用いられるカルボン酸 の保護基 （ "ペプチド合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） 、 例えば t B u、 B z l、 P i cなどがあげられ、 カルボン酸を活性化する基としては、 ONS u などがあげられる。 ハロゲンは、 塩素、 臭素、 ヨウ素の各原子を意味する。 (工程 1)
化合物 （V) は、 ポリエチレングリコールジカルボン酸 （III ) と 0. 1〜1 当量、 好ましくは 0. 5当量の化合物 （IV) とを、 炭酸カリウムなどの塩基の存 在下、 DMFなどの溶媒中、 一 50〜30°Cで 1〜24時間反応させることによ り得ることができる。 この際、 生成物に含まれるジエステルおよび未反応のジカ ルボン酸は、 分配、 吸着樹脂、 逆相シリカゲル、 アルミナ、 珪藻土、 イオン交換 樹脂、 好ましくはシリカゲルカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグ ラフィ一により除去することができる。
(工程 2)
化合物 （VII ) は、 化合物 （V) と一般的な液相ペプチド合成法 （ "ペプチド 合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） により得られる化合物 （VI) とを、 1 〜 2当量の塩基の存在下、 1〜 1 0当量、 好ましくは 1〜 2当量の縮合剤を用い て、 溶媒中縮合させることにより得ることができる。 塩基としては、 トリェチル ァミン、 NMMなどがあげられ、 縮合剤としては、 DCC、 EDCなどの通常の アミノ酸の縮合試薬があげられ、 溶媒としては、 塩化メチレン、 クロ口ホルム、 DMFなどがあげられる。 反応は、 0〜30でで 1〜24時間攪拌することによ り行われる。
なお、 化合物 （VI) のカルボン酸の保護基として用いられる A2 は、 化合物 (V) の A1 とは別に選択的に除去できる基が好ましい。
化合物 （VII ) は、 化合物 （V) と 1〜 1 0当量、 好ましくは 1〜 2当量の HONS u. HOB tなどとを、 当量の塩基の存在下、 1〜5当量、 好ましくは 1〜2当量の縮合剤を用いて、 溶媒中縮合させることにより活性エステルを得、 次いでこれと化合物 （V I) とを 0〜30°Cで 1〜24時間反応させることによ り得ることもできる。 塩基、 縮合剤および溶媒としては、 上記と同じものがあげ られる。
(工程 3)
化合物 （VIII) は、 化合物 （VII ) より、 一般的なペプチド合成に用いられる 保護基の除去方法 （ "ペプチド合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） に従つ て Α2 を選択的に脱保護することにより得ることができる。 (工程 4)
化合物 （X) は、 化合物 （V I) と当量の毒素とを、 1〜2当量の塩基の存在 下、 1〜1 0当量、 好ましくは 1〜2当量の縮合剤を用いて、 溶媒中縮合させる ことにより得ることができる。 塩基としては、 トリェチルァミン、 NMMなどが あげられ、 縮合剤としては、 DCC、 EDCなどの通常のアミノ酸の縮合試薬が あげられ、 溶媒としては、 塩化メチレン、 クロ口ホルム、 DMFなどがあげられ る。 反応は、 一 30~30°Cで 1〜24時間攪拌することにより行われる。
化合物 （X) は、 化合物 （VIII) と 1〜 1 0当量、 好ましくは 1〜2当量の HONS u. HOB tなどとを、 当量の塩基の存在下、 1〜5当量、 好ましくは 1〜2当量の縮合剤を用いて、 溶媒中縮合させることにより活性エステル （IX) を得、 次いでこれと毒素とを一 30〜30°Cで 1〜24時間反応させることによ り得ることもできる。 塩基、 縮合剤および溶媒としては、 上記と同じものがあげ られる。
(工程 5)
化合物 （XI) は、 化合物 （X) より、 一般的なペプチド合成に用いられる保護 基の除去方法 （ "ペプチド合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） に従って A1 を脱保護することにより得ることができる。 なお、 工程 3および工程 5にお いて脱保護される保護基の組み合わせとして例えば A1 に Bz l、 A2 に t Bu を用いた場合、 A1 はパラジウム炭素触媒下での水素添加など、 A2 はトリフル ォロ酢酸処理などの通常のァミノ酸保護基の選択的除去方法に従い脱保護され、 A1 および A2 を各工程で選択的に除去することができる。 A1 および A2 の組 み合わせを逆にして脱保護の順序もそれにあわせて逆にすることも可能である。 また、 化合物 （XI) は、 工程 4における化合物 （ ） より工程 5の方法に準じ て A1 を脱保護した後、 工程 2の方法に準じて毒素と反応させることにより得る こともできる。
(工程 6)
化合物 （ l a) は、 化合物 （XI) と標的細胞に親和性を有し、 分子内に NH、 S Hまたは 0 Hを有する化合物とから、 工程 2の方法に準じて得ることかできる。 標的細胞に親和性を有する化合物は、 蛋白質、 ペプチドなどのように有機溶媒中 で変性失活するおそれのある化合物が多く、 上記反応は好ましくは緩和な水溶液 中で行われる。 この場合、 反応は、 pH 6〜8の燐酸あるいはほう酸などの緩衝 液中に標的細胞に親和性を有する化合物を溶解し、 これに 1〜500当量、 好ま しくは 1 ~50当量の化合物 （XI) および E DCなどの縮合剤を加え、 0〜30 °Cで 1〜48時間攪拌することにより行われるか、 あるいは、 工程 2の方法に準 じて活性エステル （XII ) を得、 これを、 0〜1 0%、 好ましくは 0〜5%の DMS 0あるいは DMFの存在下、 p H 6〜 8の緩衝液中に標的細胞に親和性を 有する化合物を溶解した溶液に 1 ~ 500当量、 好ましくは 1〜50当量の割合 で混合し、 0〜30°Cで 1〜48時間攪拌することにより行われる。
製造法 2 ：化合物 （ I) において Zが該基内に N、 Sまたは 0を有する基かつ X1 が COかつ Wが
Figure imgf000013_0001
である化合物 （ l b) の製造法
化合物 （ I b) は、 次の反応工程に従い製造することができる <
A1OCOCH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1— R2— OH (VIII)
Figure imgf000014_0001
(式中、 A1 、 Y1 、 Z1 、 R1 、 R2 および nは前記と同意義を表す） (工程 7)
化合物 （XIII) は、 化合物 （VIII) とアミノエチルマレイミ ドとから、 工程 2 の方法に準じて得ることができる。
(工程 8)
化合物 aiV ) は、 化合物 （XIII) と毒素とを反応させることにより得ること ができる。 反応は、 ρΗ 6〜8の燐酸あるいはほう酸などの緩衝液中に毒素を溶 解し、 これに 1〜50当量の化合物 （XIII) を加え、 0〜30°Cで 1〜48時間 攪拌することにより行われる。
(工程 9)
化合物 （l b) は、 化合物 （XI V ) から、 工程 5および工程 6の方法に準じて 得ることができる。
製造法 3 ：化合物 （I) において Zが該基内に COを有する基かつ X1 が Sかつ Wが単結合である化合物 （ I c) の製造法
化合物 （ I c) は、 次の反応工程に従い製造することができる。 HSCH2(OCH2CH2)nOCH2COOA1 (XV)
工程 1 0
A4SCH2(OCH2CH2)nOCH2COOA1 (XVI)
I 工程 1 1
A4SCH2(OCH2CH2)nOCH2COOH (XVII) 工程 1 2
A4SCH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1 - R2 - OH (XVIII)
工程 1 3
A4SCH2(OCH2CH2)n CH2CO— R1 - R2— Y1 (XIX)
工程 1 4
Figure imgf000015_0001
HSCH2(OCH2CH2)nOCH2CO— R1 - R2 - Y1 (XX)
I 工程 1 5
Z SCH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2-Y1)m (Ic)
(式中、 A 4 はチオールの保護基を表し、 Z 2 は Zの定義のうち該基内に C Oを 有する基を表し、 A 1 、 Y 1 、 R 1 、 R 2 および nは前記と同意義を表す） チオールの保護基としては、 ベンジル、 ピコリル、 ニトロべンジルなどがあげ られる。
原料化合物 (XV) は、 Poly (Ethylene Glycol ) Chemi stry ： Biotechnical and Biomedical Appl ications, (J. M. Harris, Ed.， Plenum, NY. 1992) 記載の ポリエチレングリコール誘導体の合成手法に従い得ることができる。
(工程 1 0 )
化合物 （XVI ) は、 一般的なペプチド合成に用いられる保護基の導入方法 ( "ペプチド合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） に従って化合物 （XV) の チオール基を保護することにより得ることができる。
(工程 1 1 )
化合物 （XVI I) は、 化合物 （XVI ) から、 工程 3の方法に準じて得ることがで きる。 (工程 1 2)
化合物 （XVIII ) は、 化合物 （XVII) から、 工程 2および工程 3の方法に準じ て得ることができる。
(工程 1 3 )
化合物 （XIX ) は、 化合物 ανιπ ) から、 工程 4の方法に準じて得ることが できる。
(工程 1 4 )
化合物 （XX) は、 化合物 （XIX ) を、 一般的なペプチド合成に用いられる保護 基の除去方法 （ "ペプチド合成の基礎と実験" 、 泉屋信夫ら、 丸善） に従って脱 保護することにより得ることができる。
(工程 1 5)
化合物 （ I c) は、 化合物 （XX) と標的細胞に親和性を有し、 分子内に C00H を有する化合物とを、 J. Applied Biochem.,_6, 56-63(1984) 記載のチオール基 の活性化法などの方法を用い結合させることにより得ることができる。
製造法 4 ：化合物 （ I) において Zが該基内に N、 Sまたは〇を有する基かつ X1 が
Figure imgf000016_0001
かつ Wが単結合である化合物 （ I d) および化合物 （II) において X2 が
Figure imgf000016_0002
かつ Y2 がヒドロキシである化合物 （II d) の製造法 化合物 （I d) および化合物 （lid) は、 次の反応工程に従い製造することが できる。
Figure imgf000017_0001
(式中、 A1 、 Y1 、 Z1 、 R1 、 R2 および nは前記と同意義を表す） 原料化合物 (XXI ) は Po (Ethylene Glycol) Chemistry ： Biotechnical and Biomedical Applications, (J. . Harris, Ed. , Plenum, NY.1992) 記載の ポリエチレングリコール誘導体の合成手法に従い得ることができる。
(工程 1 6 )
化合物 （XXI I) は、 化合物 （XXI ) から、 工程 3の方法に準じて得ることがで きる。
(工程 1 7)
化合物 （Ud) は、 化合物 （XXII) から、 工程 2および工程 3の方法に準じて 得ることができる。
(工程 1 8 )
化合物 （XXIII ) は、 化合物 （II d) から、 工程 4の方法に準じて得ることが できる。
(工程 1 9)
化合物 （ I d) は、 化合物 （ΧΧΠΙ ) と標的細胞に親和性を有し、 分子内に NH、 SHまたは OHを有する化合物とから、 工程 8の方法に準じて得ることが できる。
製造法 5 ：化合物 （II) において X2 がカルボキシかつ Y2 がヒ ドロキシである 化合物 （II a) の製造法
(工程 20)
化合物 （II a) は、 化合物 （VIII) から、 工程 3の方法に準じて得ることがで さる。
製造法 6 ：化合物 （II) において X2 がカルボキシかつ Y2 が
Figure imgf000018_0001
である化合物 （lib) の製造法
(工程 21)
化合物 （lib) は、 化合物 （ΧΠΙ) から、 工程 3の方法に準じて得ることがで きる。
製造法 7 ：化合物 （Π) において X2 がメルカプトかつ Y2 がヒ ドロキシである 化合物 （lie) の製造法 (工程 22)
化合物 （lie) は、 化合物 （XVIII ) から、 工程 1 4の方法に準じて得ること ができる。
以上に記載した方法等を適宜組み合わせて実施することにより、 所望の位置に 所望の基を有する化合物 （I) あるいは化合物 （II) を得ることができる。 上記各製造法における中間体および目的化合物は、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 再結晶、 シリカゲルクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラ フィ一、 逆相クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種カラ ムクロマトグラフィ一あるいは通常の半透膜を用いた透析により単離精製するこ とができる。 また、 中間体においては、 特に精製することなく次の反応に供する ことも可能である。
上記製造法によって得られる毒素複合体 （ I) の具体例を第 1表に示す。
第 1表
化合物番号 構造
Ia-1 NL-l-(PEG-Ala-Val-ADM)
Ia-2 NL-l-(PEG-Ala-Pro-ADM)m
Ia-3 NL-l-(PEG-Gly-Pro-ADM)m
Ia-4 KM-231-(PEG— Ala-Val— DNR)
Ia-5 KM-231-(PEG-Ala-Pro-DNR)m
Ia-6 KM-231-(PEG-Gly-Pro-DNR)m
Ia-7 NL-1-(PEG-Ala-Val -化合物（20)*)m
Ia-8 NL-1-(PEG— Ala-Pro-化合物（20)*)m
la - 9 NL-1-(PEG— Gly-Pro-化合物（20)*)m
la- 10 KM-231 -（PEG- Ala-Val-化合物（12)**)m
Ia-11 KM-641-(PEG-Ala-Val-化合物（12)**)
*:参考例 17で合成， **:参考例 15で合成 次に、 毒素複合体の薬理活性について試験例で説明する。
試験例 1
毒素複合体を用い、 細胞増殖抑制効果の検討を行った。 標的細胞株としては、 CALLA抗原を 現していない子宮頸癌 HeLaS 3 (CALLA— ) および CALLA抗原を発現しているバ一キッ トリンパ腫 Da u d i (C ALLA+ ) を用いた。 96穴平底プレートに標的細胞株 50 1 (1 1 03 個_ 穴） をそ れぞれまき、 3 7度で 2時間 C02 インキュベーター内で培養した。 培養後、 種 々の濃度に希釈した毒素複合体あるいはモノクロ一ナル抗体を 5 Q 1添加し、 さらに 3 7度で 6 8時間 C02 インキュベータ一内で培養した。 3H—チミジン 2 0 ϊ ( 4 6 3 KB q/m l ) を各穴に添加して 4時間後、 ハーべストし、 細 胞内に取り込まれた 3H—チミジンの放射活性をマトリックス 9 6 (パッカード ジャパン社製） で測定した。 細胞増殖抑制活性は以下の式により算出した。
Figure imgf000020_0001
その結果、 化合物 （ I a— 3) あるいは化合物 （ I a— 1 ) を添加した場合、 高濃度では若干 He L a S 3にも細胞増殖抑制効果が認められたが、 Da u d i に対してはごく低濃度より強い細胞増殖抑制効果が認められた。 また、 化合物 ( I a— 9) あるいは化合物 （ I a— 7) を添加した場合には、 He L a S 3細 胞にはほとんど効果が認められず、 Da u d iに対してより特異性の高い増殖抑 制効果が認められた。 一方、 モノクローナル抗体 （NL— 1 ) のみを添加した場 合は、 ほとんど増殖に影響を及ぼさなかった （第 1図） 。
試験例 2
試験例 1 と同様にして、 化合物 （ I a— 6 ) を用い細胞増殖抑制効果の検討 を行なった。 標的細胞株としては、 s L e β 抗原を発現していない子宮頸癌 H e L a S 3 (s L e a— ) および s L e a 抗原を発現している大腸癌 S W1116 ( s L e '+) を用いた。 その結果、 化合物 （ I a— 6) を添加した場合、 SW 1 1 1 6に対しては細胞増殖抑制効果が認められたが、 He L a S 3に対しては 効果が認められなかった。 一方、 モノクローナル抗体 （KM— 2 3 1 ) のみを添 加した場合は、 いずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制効果が認められず、 複合 体の抗原特異的細胞増殖抑制効果が確認された （第 2表） 。
第 2表
化合物 増殖抑制効果 (%)
(12.5 g/nil) HeLaS3 SW1116
化合物（la - 6) 1.6 26.8
KM-231 0.0 0.0 以上より、 種々の複合体の抗原特異的細胞増殖抑制効果、 スぺーサ一の有用性 が確認された。
試験例 3
化合物 （ I a— 1 0) を用い、 細胞増殖抑制効果の検討を行った。 標的細胞株 としては、 s L e。 抗原を発現していない子宮頸癌 He L a S 3 ( s L e お よび s L e β 抗原を発現している大腸癌 SW 1 1 1 6 ( s L e β+) を用いた。 9 6穴平底プレートに標的細胞株 5 0 1 ( 1 X103 個 穴） をそれぞれまき、 3 7度で 2時間 C02 インキュベーター内で培養した。 培養後、 種々の濃度に希 釈した薬物一モノクローナル抗体複合体あるいはモノクロ一ナル抗体を 5 0 1 添加し、 さらに 3 7度で 2時間 C02 インキュベーター内で培養した。 培養後、 プレートを遠心し、 培養上清を除去した。 すぐに培地 1 0 0 1を加え、 さらに 64時間培養を行なった。 3H-チミジン 20〃 1 (4 63 KB qZm 1 ) を各 穴に添加して 4時間後、 ハーべストし、 細胞内に取り込まれた 3H—チミジンの 放射活性をマトリックス 9 6 (パッカード ジャパン社製） で測定した。 細胞増 殖抑制活性は以下の式により算出した。
， 処理細胞の放射活性 、
1 X 100
コン トロール細胞の放射活性 ) その結果、 化合物 （ I a— 1 0 ) を添加した場合、 SW 1 1 1 6に対しては細 胞増殖抑制効果が認められたが、 H e L a S 3に対しては効果が認められなかつ た。 一方、 モノクローナル抗体 （KM— 23 1 ) のみを添加した場合は、 ごくわ ずかに SWl 1 1 6に対して細胞増殖抑制効果が認められただけであり、 この系 においても複合体の抗原特異的細胞増殖抑制効果、 スぺーサ一の有用性が確認さ れた （第 3表） 。
第 3表
化合物 増殖抑制効果（％)
(75 g/ml) HeLaS3 SW1116
化合物（la- 10) 0.0 20.8
KM-231 0.0 5.3 試験例 4
1 0 %牛胎児血清を含む RPM 1 - 1 640培地で 2 x 1 08 個 1に調製 したヒトミエローマ細胞 SK— L y— 1 8をマトリゲル [Ma t r i g e 1 (登 録商標； B e c t o n D i c k i n s on Labwa r e、 USA) ] と 1 ： 1 (v/v) で混合し、 その 0. 1ml ( 1 x 1 07 個 Zマウス） を B AL B Zc， nu/nuマウス （日本クレア） の皮下に移植した。 腫瘍移植後 7日目に、 1群 5匹で、 薬物—モノクローナル抗体複合体 （ADM, 7. 5mg/kg相当 量） または ADM (7. 5mg/k g) を静脈内投与した。 対照群には、 生理食 塩水を同様にして投与した。 経日的に腫瘍の長径と短径を測定し、 腫瘍体積は、 楕円体の近似値として以下の式により算出した。
腫瘍体積 （mm3 ) = (a xb2 ) /2
a ：長径 （mm) b ：短径 （mm)
移植腫瘍に対する治療効果は、 測定評価日の腫瘍体積 （V) と薬物投与日の腫 瘍体積 （V。 ） の比 VZV。 で評価した。
その結果、 対照群においては著しい腫瘍の増殖が認められたが、 化合物 （ I a 一 1 ) および化合物 （ I a— 3) 投与群では著しい腫瘍の増殖抑制効果が認めら れた。 一方、 同量の ADM単独投与群では、 対照群に比較し増殖抑制効果が認め られず、 薬物一モノ クローナル抗体複合体の有用性が示された （第 2図） 。
図面の簡単な説明
第 1図は、 毒素複合体またはモノ クロ一ナル抗体による細胞増殖抑制効果を示 すものである。
(a) 化合物 （ I a— 3) を用いた場合の結果
(b) 化合物 （ I a— 1 ) を用いた場合の結果
(c) 化合物 （ I a— 9) を用いた場合の結果
(d) 化合物 （ I a— 7) を用いた場合の結果
(e) NL- 1を用いた場合の結果
〇 D a u d iを用いた場合の結果
• H e L a S 3を用いた場合の結果
第 2図は、 毒素複合体または薬物による移植腫瘍に対する治療効果を示すもの である。
• 対照群
□ 化合物 （ I a— 1 ) を用いた場合の結果
△ 化合物 （ I a— 3) を用いた場合の結果
〇 ADMを用いた場合の結果
発明を実施するための最良の形態
以下に、 実施例および参考例によつて本発明の態様を説明する。
実施例 1 毒素複合体 （ l a— 1 ) : NL- 1 - (P EG-A l a -V a l - ADM) ra
参考例 6で得られる化合物 （XI— 1 ) 2 7 5 g(0.21 zmol)を塩化メチレン 5 0 0 // 1に溶解し、 氷冷下 HONS u(l.l〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 ( 1 3. OmgZm 1 ) および D C C (1.1〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0〃 1 (22. Omg/m 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1. 5時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMSO, 7 0 / 1に溶解し、 燐酸緩衝液 1 4 0 0〃 1を加えた後、 NL - 1 抗体水溶液 （ 3. 3mg/m 1 ) 4 8 0 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5〃mのフィルタ一で不溶物を除去し、 ゲル濾過 HPLCで抗体の画 分を精製した [カラム ： S u p e r o s e l 2 (フアルマシア社製） 、 展開液： 燐酸緩衝液、 流速： 0. 5m l Z分、 2 8 0 nmの吸光度で検出] 。 目的とする 溶出画分を少量限外濾過膜 （ミ リポア社製、 分画分子量 5 0 0 0 ) で濃縮し、 NL - 1 - (P E G - A l a— V a l — ADM) m を 7 7 1 〃 g (蛋白濃度 0. 6 7mgZm 1 ) 得た （収率 4 9 %) 。
本複合体において、 2 8 0 nm (蛋白質の吸収 = 2 8 0 nmにおける全吸収一 2 8 0 nmにおけるァドリアマイシンの吸収） および 4 9 5 nm (ァドリァマイ シンの吸収、 ε = 1. 2 1 X 1 04 M—1 cm— ε 280 = ε 495 ) における吸光 度から算出したアドリアマイシンの結合数は抗体 1分子当り 2. 2個であり、 抗 体の結合力価が未結合の抗体の結合力価とほぼ等しいことは以下に記載の蛍光抗 体法により確認した。
く蛍光抗体法による抗体の結合力価測定〉 D a u d i細胞 1 x 1 06 個に上記複合体 （ 1 0 g/τη 1 ) を加え、 氷冷下 3 0分間反応させた。 細胞を燐酸緩衝液で 3回遠心洗浄し、 未反応の複合体を除 去した後、 F I TC (フルォレツセインイソチオシァネー ト） 標識抗マウス I g G抗体 （和光純薬 （株） 社製、 3 0倍希釈） 2 0m lを加え、 氷冷下 3 0分 間反応させた。 再び燐酸緩衝液で 3回遠心洗浄した後、 フローサイ トメーター (EP I CS E l i t e. コールター社製） を用いて測定を行った。 コント口 ールには、 細胞に F I TC標識抗マウス I gG抗体のみを反応させたものを用い た。
実施例 2 毒素複合体 （ l a - 2) ： NL— 1 — (PEG - A l a— P r o - ADM) m
参考例 7で得られる化合物 （XI— 2 ) 2 8 9 ^ g (0.22 〃mol)を塩化メチレン 5 0 0 ^ 1 に溶解し、 氷冷下 H〇NS u(l.l^mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 ( 1 3. Omg/m 1 ) および D C C (1.1〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 (2 3. 1 mgZm 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1. 5時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMSO, 9 5〃 1に溶解し、 燐酸緩衝液 1 9 0 0〃 1を加えた後、 NL— 1 抗体水溶液 （3. 3mg/m 1 ) 5 1 0 // 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5〃mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にして ゲル濾過 HPLCによる抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 NL— 1一 （PEG— A 1 a— P r o-ADM) ra を 1 0 6 0〃 g (蛋白濃度 0. 8 8mgZm 1 ) 得 た （収率 6 3 %) 。
本複合体において、 実施例 1 と同様にして 2 8 0 nmおよび 4 9 5 nmにおけ る吸光度から算出したァドリアマイシンの結合数は抗体 1分子当り 1. 8個であ り、 また、 本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実 施例 1に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例 3 毒素複合体 （ l a - 3) ： NL— 1 - （PEG - G l y - P r o— ADM) m
参考例 8で得られる化合物 （XI— 3 ) 2 5 9 g (0.20 czmol)を塩化メチレン 5 0 0〃 1 に溶解し、 氷冷下 HONS u(1.0〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0〃 1 ( 1 1. 7m /m 1 ) および D C C (1.0〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 (2 1. Omg/m 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1. 5時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMS〇， 76 1に溶解し、 燐酸緩衝液 1 4 6 0〃 1を加えた後、 NL— 1 抗体水溶液 （3. 3mg/m 1 ) 4 6 0 / 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5〃mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にして ゲル濾過 HP LCによる抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 NL— 1一 （PEG— G 1 y-P r o— ADM) m を 9 1 2〃 g (蛋白濃度 0. 76mg/m 1 ) 得た (収率 6 0 %) 。
本複合体において、 実施例 1 と同様にして 28 0 nmおよび 4 9 5 nmにおけ る吸光度から算出したァドリァマイシンの結合数は抗体 1分子当り 1. 5個であ り、 また、 本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実 施例 1に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例 4 毒素複合体 （ l a - 4) ： KM- 23 1 - (PEG-A l a -Va l -DNR) m
参考例 9で得られる化合物 （XI— 4 ) 9 Q u g (0.08 mol)を塩化メチレン 5 0 0〃 1に溶解し、 氷冷下 HONS u (0.38 mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 (4. 3mgZm 1 ) および DC C(0.37 zmol)の塩化メチレン溶液 1 0 II 1 (7. lmg/m 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1時間攪 拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を DMS 0, 2 7 / 1に溶解し、 燐酸緩衝液 1 1 4〃 1を加えた後、 KM— 23 1 抗体水溶液 （ 1. OmgZm l ) 5 6 3 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5 mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にして ゲル濾過 H PLCで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 KM— 23 1— (PEG— A l a— Va l — DNR) ra を 5 1 0〃 g (蛋白濃度 0. 8 5mg/m 1 ) 得た (収率 9 1 %) 。
本複合体において、 実施例 1 と同様にして 28 0 nmおよび 4 9 5 n m (ε = 1. 1 5 x 1 04 M-1 cm"1) における吸光度から算出したダウノルビシンの結 合数は抗体 1分子当り 3. 1個であり、 また、 本複合体が未結合の抗体とほぼ等 しい結合力価を有していることを実施例 1に記載の蛍光抗体法により確認した。 実施例 5 毒素複合体 （ l a - 5) ： KM— 2 3 1 - （PEG— A 1 a— P r 0 一 DNR) m
参考例 1 0で得られる化合物 （XI— 5 ) 3 4 8 g (0.27 〃mol)を塩化メチレ ン 5 0 0〃 1 に溶解し、 氷冷下 HONS u(1.4^mol)の塩化メチレン溶液 1 0 μ. 1 ( 1 5. 7mgZm 1 ) および DC C(1.4 zmol)の塩化メチレン溶液 1 0 II 1 (2 8. 2mgZm l ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMS〇， 1 0 0 ^ 1に溶解し、 燐酸緩衝液 4 1 0 z 1を加えた後、 KM— 2 3 1抗体水溶液 （ 1. Omg/m 1 ) 2. 0 5 m 1を加え、 4 °Cで一昼夜静か に攪拌した。 0. 4 5 mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同 様にしてゲル濾過 HP L Cで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 KM— 2 3 1 — (PEG— A l a— P r 0— DNR) m を 2. Omg (蛋白濃度 1. 3 6mg/ m 1 ) 得た （収率 1 0 0 %) 。
本複合体において、 実施例 4と同様にして 2 8 0 nmおよび 4 9 5 nmにおけ る吸光度から算出したダウノルビシンの結合数は抗体 1分子当り 1. 9個であり、 また、 本複合体が未結合の抗体とほぼ等しレ、結合力価を有していることを実施例 1に記載の蛍光抗体法により確認した。 この際、 評価細胞には SW1 1 1 6を用 いた。
実施例 6 毒素複合体 （ l a— 6) ： KM- 2 3 1 - (PEG-G l y-P r o -DNR) m
参考例 1 1で得られる化合物 （XI— 6) 1 5 4 / g(0.12 mol)を塩化メチレ ン 5 0 0〃 1に溶解し、 氷冷下 HONS u(0.61 raol)の塩化メチレン溶液 1 0 U 1 ( 7. OmgZm 1 ) および DC C 0.61 〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 (1 1 ( 1 2. 6mgZm 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMS 0, 0 ^ 1 に溶解し、 燐酸緩衝液 1 8 5 1 を加えた後、 KM— 2 3 1抗体水溶液 （ 1. 0 m g/m 1 ) 8 2 5 ζ 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに 攪拌した。 0. 4 5 inのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様 にしてゲル濾過 HP L Cで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 KM— 2 3 1 - (PEG-G l y-P r o -DNR) ra を 6 6 0 g (蛋白濃度 1. 1 mgZ m 1 ) 得た （収率 8 0 %) 。
本複合体において、 実施例 4と同様にして 28 0 nmおよび 4 9 5 nmにおけ る吸光度から算出したダウノルビシンの結合数は抗体 1分子当り 1. 5個であり、 また、 本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 5に記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例 7 毒素複合体 （ l a - 7) ： NL - 1— (PEG— A 1 a—Va 1—化 合物 （ 20 ) ) „
参考例 1 2で得られる化合物 （XI— 7) 1 0 0 g (0.08 〃mol)を塩化メチレ ン 5 0 0〃 1に溶解し、 氷冷下 HONS u (0.41 mol)の塩化メチレン溶液 1 0 fi 1 (4. 7mgZm 1 ) および DCCC0.41 〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 〃 1 (8. 4mgZm l ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1. 5時 間攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残 渣を DMSO, 30〃 1に溶解し、 燐酸緩衝液 527〃 1を加えた後、 NL— 1 抗体水溶液 （3. Omg/m 1 ) 20 3 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5 のフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にして ゲル濾過 HP L Cで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 NL - 1 - (P E G - A 1 a -V a 1 一化合物 （ 2 0 ) ) ra を 6 4 8〃 g (蛋白濃度 1. l mgZ m 1 ) 得た （収率 1 0 0 %) 。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 1に 記載の蛍光抗体法により確認した。
抗体 1分子当りの化合物 （2 0) の結合数は、 参考例 27に記載の方法に従つ て酵素処理 （サ一モリシン） し、 遊離した H— Va 1一化合物 （2 0) を HPLCで 定量することにより算出した。 これにより、 本複合体において、 抗体 1分子当り 0. 3 8個の化合物 （2 0) が結合していることを確認した。
実施例 8 毒素複合体 （ l a— 8) ： NL - 1一 （PEG— A 1 a— P r o -化 合物 （20) ) ra
参考例 1 3で得られる化合物 （XI— 8) 2 1 1 g(0.17 〃mol)を塩化メチレ ン 5 0 0〃 1に溶解し、 氷冷下 HONS u (0.85 mol)の塩化メチレン溶液 1 0 PL 1 ( 9. 8mgZm 1 ) および DCC(0.85 〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 PL 1 ( 1 7. 5mgZm l ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMSO, 6 0〃 1に溶解し、 燐酸緩衝液 1 1 1 5〃 1を加えた後、 NL— 1 抗体水溶液 （3. Om /m 1 ) 4 25 >w 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌し た。 0. 4 5 zmのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にして ゲル濾過 HP L Cで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 NL - 1 — (PEG— A l a— P r 0 —化合物 （2 0) ) ra を 1. 2mg (蛋白濃度 1. 7 6mg/ m 1 ) 得た （収率 9 7 %)。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 1に 記载の蛍光抗体法により確認した。
抗体 1分子当りの化合物 （20) の結合数は、 参考例 27に記載の方法に従つ て酵素処理 （プロリンエンドべプチダーゼ） し、 遊離した化合物 （20) を HPLC で定量することにより算出した。 これにより、 本複合体において、 抗体 1分子当 り 0. 4 5個の化合物 （20) が結合していることを確認した。
実施例 9 毒素複合体 （ l a— 9) ： NL— 1 - （PEG - G 1 y - P r 0—化 合物 （ 20) ) m
参考例 1 4で得られる化合物 （XI— 9) 1 3 5 (0.11 〃mol)を塩化メチレ ン 5 0 0 1に溶解し、 氷冷下 HONS u(0.55 mol)の塩化メチレン溶液 1 0 μ. 1 ( 6. 3mg/m 1 ) および DCC(0.55 〃mol)の塩化メチレン溶液 1 0 1 ( 1 1. S m g/m 1 ) を順に加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 1時間 攪拌した後、 不溶物 （DCU) を濾別し、 瀘液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を DMSO, 4 0 1に溶解し、 燐酸緩衝液 73 5 1を加えた後、 NL— 1抗 体水溶液 （3. 0mg/m 1 ) 275 1を加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌した。 0. 4 5〃mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実施例 1 と同様にしてゲル 濾過 HPLCで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 NL - 1一 （PEG - G l y - P r 0—化合物 （2 0) ) π を 7 7 4〃 g (蛋白濃度 1. 2mgZm 1 ) 得た (収率 94 %) 。 本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 1に 記載の蛍光抗体法により確認した。
抗体 1分子当りの化合物 （20) の結合数は、 参考例 27に記載の方法に従つ て酵素処理 （プロリ ンエン ドべプチダーゼ） し、 遊離した化合物 （2 0) を HPLC で定量することにより算出した。 これにより、 本複合体において、 抗体 1分子当 り 0. 4 9個の化合物 （20) が結合していることを確認した。
実施例 1 0 毒素複合体 （ l a— 1 0) ： KM- 2 3 1 - (PEG-A 1 a - Va 1一化合物 （ 1 2) ) m
参考例 1 6で得られる化合物 （X— 1 ) 0. 4 5mg(0.33 〃mol)をメタノ一 ル 0. 4m lに溶解し、 窒素雰囲気下 1 0 %パラジウム炭素触媒 l mgを加え、 水素気流中、 _ 1 5°Cで 5時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を 0 °C以下で減圧下除去し、 HO— P E G— A l a - Va 1一化合物 （ 1 2) 0. 1 4mg(0.11 〃mol)を得た。 この化合物 0. 1 4 m gを氷冷下 H〇N S u の塩化メチレン溶液 25 0〃 1 ( 0. 0 7 6 mg/m 1 ) に溶解し、 DCCの塩 化メチレン溶液 25 0〃 1 (0. 1 4 mgZm 1 ) を加え、 氷冷下 2. 5時間攪 拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 0°C以下に冷却したまま溶媒を減圧下除去 した。 残渣を DMSO, 3 6 1に溶解し、 氷冷した燐酸緩衝液 204 1を加 えた後、 氷冷下 KM - 23 1抗体水溶液 （ 0. 9 9mgZm l ) 0. 5 6m lを 加え、 4でで静かに一昼夜撹拌した。 0. 22 / mのフィルタ一で不溶物を除去 し、 次いで実施例 1 と同様にしてゲル濾過 HPLCで抗体の画分の精製、 濃縮を 行い、 KM— 23 1— (PEG-A 1 a -Va 1一化合物 （ 1 2 ) ) ra を 25 0 g (蛋白濃度 0. SmgZm 1 ) 得た （収率 5. 1 %) 。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 4に 記載の蛍光抗体法により確認した。
実施例 1 1 毒素複合体 （ l a— 1 1 ) ： KM- 6 4 1 - (PEG-A 1 a - Va 1—化合物 （ 1 2) ) m
参考例 1 6で得,られる化合物 （X— 1 ) 2. 5mg(l,8 mol)をメタノール 0. 3m 1に溶解し、 窒素雰囲気下 1 0 %パラジウム炭素触媒 l mgを加え、 水 素気流中、 一 1 8 °Cで 4時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を 0 °C以下で減圧下除去し、 HO— PEG - A l a -Va 1 一化合物 （ 1 2 ) 0. 0 5 m g (0.04 rool)を得た。 この化合物 0. 0 5 m gを氷冷下 HONS uの塩化メ チレン溶液 2 5 0 / 1 ( 0. 0 2 8 mg/m 1 ) に溶解し、 DCCの塩化メチレ ン溶液 2 5 0〃 1 (0. 0 5mgZm 1 ) を加え、 氷冷下 4. 5時間攪拌した。 不溶物 (DCU) を濾別し、 0°C以下に冷却したまま溶媒を減圧下除去した。 残 渣を DMS〇， 1 5 / 1に溶解し、 冷却した燐酸緩衝液 8 0 1を加えた後、 氷 冷下 KM— 6 4 1抗体水溶液 （ 1. 4 Tmg/ui 1 ) 2 0 5 1を加え、 4 で 静かに一昼夜攪拌した。 0. 2 2；/mのフィルターで不溶物を除去し、 次いで実 施例 1 と同様にしてゲル濾過 HPL Cで抗体の画分の精製、 濃縮を行い、 KM - 6 4 1 — (PEG— A l a— Va l —化合物 （ 1 2) ) m を 2 0 0〃 g (蛋白濃 度 70 g/ml) 得た （収率 66 %) 。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを実施例 4に 記載の蛍光抗体法により確認した。
参考例 1 化合物 （VIII— 1 ) ： B z l O-PEG-A l a -Va l -OH
(a) 化合物 （V— 1 ) ： B z l O— PEG—〇H
ポリエチレングリコールジカルボン酸 [HO— P E G— OH、 平均分子量
6 0 0 (フル力 ファイン ケミカルズ社製） ] 1 0 g(16.7隱 ol)を DMF，
1 0 0m lに溶解し、 無水炭酸力リウム 2. 7 5 gを加え、 室温で攪拌した。 こ の溶液に臭化べンジル 2 m 1 (8.4mmol) を DMF， 1 0 0m lに溶解した溶液を
3 0分間かけて滴下し、 さらに一昼夜攪拌した。 水 1 0 0 m 1 を加え、 1 N HC 1で pH 1〜2に調整した。 酢酸ェチル 1 0 0m lで 6回抽出を行い、 酢酸 ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲ ル 2 0 0 m 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0を用レ、、 展開液はクロ口ホルム
： メタノール = 1 0 0 : 0、 5 0 : 1、 3 0 : 1、 2 0 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1 を各々 2 0 0 m 1使用し、 1 0m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄 層クロマトグラフィ一で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去した。 残渣を 少量のクロ口ホルムに溶解し、 濾過後、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 目的物 B z l O— PEG—〇Hを 0. 9 g(1.3mmol) 得た （収率 7. 8 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ： キーゼルゲル 6 0 (メノレク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 3 ： 1、 R f 値 0. 5
iHNMRスぺク トノレ （ 1 0 OMH z、 CDC 13 中） S (p pm) ： 7. 3 6 ( 5 H, m, C6 H5 ) 、 5. 1 9 ( 2 H, s, CH2 ) 、 4. 1 2 ( 4 H, s,
OCH2 ) 、 3. 64 (4 nH, b r s， OCH2 CH2 )
( b ) 化合物 （VI— 1 ) ： H-A 1 a -Va 1— O t Bu
H— Va 1 - O t Bu塩酸塩 1. 6 g (7· 6画 ol) を TH F, 1 6 0 m 1に溶解 し、 NMM, 1. 0 m 1 (9.2mmol) を加え、 室温で攪拌した。 この溶液に Z— A 1 a -ONS u, 2. 5 g (7.6闘 ol) を加え、 さらに室温で一昼夜攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 クロ口ホルム、 燐酸緩衝液 （pH7. 0) を順次 5 0m l ずつ加えた後、 クロ口ホルム層を抽出し、 硫酸ナトリウムで乾燥した。 溶媒を減 圧下除去し、 オイル状の残渣を得、 これをシリカゲル 20 0 m 1で精製した （ヮ コーゲル C一 200を用い、 展開液はクロ口ホルム： メ夕ノール = 1 0 0 : 0、
1 0 0 : 1、 50 : 1を各々 20 0 m l順に使用し、 1 0m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー [キーゼルゲル 6 0 (メノレク
(株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 ： 1、 R f 値 0. 9 ] で確認し ながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 オイル状の目的物 Z— A 1 a -Va 1一 〇 t Buを 3. 0 g得た。 この化合物 3. 0 gに THF， 6 0m lおよびメタノ ール 6 0m 1を加えて溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 32 Omgを加え、 水 素雰囲気下、 室温で 7時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧 下除去し、 目的物 H— A l a— Va l — O t Buを 1. 7 g(7.1隱 ol) 得た （収 率 9 3 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ： キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f 値 0. 4
質量分析 （S I MS) : 24 5 (M + H)
(c) 化合物 （VI II— 1 ) ： B z 1 O-PEG-A 1 a -Va 1 -OH
上記 （a) で得られた B z 1 O-PEG-OH, 4 0 0 m g (0.58mmol)を塩化 メチレン 6. 0m 1に溶解し、 氷冷下 DC C, 1 1 9mg(0.58國 ol)を加え、 20 分間攪拌した。 この溶液に上記 （b) で得られた H— A l a— Va l — O t Bu, 1 1 8mg(0.48mmol)の塩化メチレン溶液 6. 0m lを加え、 さらに氷冷下 2時 間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5. Omlを加え、 氷冷下 1時間 攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 残渣をシ リカゲル 5 Om 1で精製した （展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1を各々 1 0 Om 1使用し、 5mlずつ分画した） 。 目的物 画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー [キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社 製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f値 0. 7 ] で確認しながら目 的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 B z 10 - PEG - A l a - Va 1 - 0 81 を0. 1 9 g得た。 この化合物 0. 1 9 gを塩化メチレン 4. 6m lに 溶解し、 TFA, 4. 6mlを加え、 室温で一昼夜攪拌した。 溶媒を減圧下除去 し、 残渣をシリカゲル 2 Om 1で精製した （展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1、 30 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1を各々 50 ml使用し、 5m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマ卜グラ フィ一で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 Bz 10— PEG 一 Al a— Va l—〇Hを 0. 1 4 g(0.16讓 ol)得た （収率 28 %)。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f値 0. 2
'HNMRスぺク トル （ 1 00MHz、 CDC 13 中） <5 (p pm) ： 7. 36 ( 5 H, m, C6 H5 ) 、 5. 1 9 ( 2 H, s， CH2 ) 、 4. 1 2 (4 H, s， 〇CH2 ) 、 3. 64 (4 nH, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 23 ( 1 H, s， CH (A l a) ) 、 2. 23 ( 1 H， b r q, J= 6. 0 Hz,
CH (V a 1 ) ) 、 1. 26 ( 1 H, s， CH (Va 1 ) )、 1. 1 7 ( 3 H， d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) , 0. 8 9 ( 6 H, b r d， J =
2. 5Hz, CH3 (Va 1 ) )
参考例 2 化合物 （VIII— 2) ： Bz l O-PEG-A l a-P r o-OH
(a) 化合物 （VI— 2) ： H - A l a - Pr o - O t Bu
H— Pr o_〇 t Bu， 657 mg(3.8譲 ol) を THF， 65. 7m lに溶解 し、 Z— A l a— ONSu, 1. 23 g (3.8薩 ol) を加え、 室温で一昼夜攪拌し た。 溶媒を減圧下除去し、 クロ口ホルム、 燐酸緩衝液 （pH7. 0) を順次 50 m lずつ加えた後、 クロ口ホルム層を抽出し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 溶媒を減圧下除去し、 オイル状の残渣を得、 これをシリカゲル 20 Omlで精製 した （ヮコ一ゲル C— 20 0を用い、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1を各々 1 00ml順に使用した） 。 目的物画 分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー [キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 1¾ {値0. 8] で確認しながら目的画分 の溶媒を減圧下除去し、 オイル状の目的物 Z— A 1 a— P r o— O t B uを 1. 47 g得た。 この化合物 1. 4 7 gに THF, 30m lおよびメタノール 30mlを加えて溶解し、 1 0%パラジウム炭素触媒 25 Omgを加え、 水素雰 囲気下、 室温で 8時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除 去した後、 残渣をシリカゲル 200 mlで精製した （ヮコ一ゲル C一 200を用 い、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1、 30 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1を各々 1 00m 1使用し、 1 0m】ずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィ一で確認しながら目的画分の溶媒 を減圧下除去し、 目的物 H— A 1 a— P r 0 -0 t Buを 0. 67g(2.8闘 ol) 得た （収率 74 %)。
シリ力ゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノールニ 1 0 ： 1、 R f値 0. 2
質量分析 （S I MS) : 243 (M + H)
(b) 化合物 （VIII— 2) ： Bz 10-PEG-A 1 a-Pr o-OH 参考例 1 (a) で得られた B z 1〇— PEG— OH, 400 m g (0.58画 ol)を 塩化メチレン 6. 0m lに溶解し、 氷冷下 DCC， 1 1 9 m g (0.58mmol)を加え、
2 0分間攪拌した。 この溶液に上記 （a) で得られた H— A 1 a - P r 0 - O t Bu, 1 1 6mg(0.48隱 ol)の塩化メチレン溶液 6. 0mlを加え、 さらに 氷冷下 2時間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5. 0mlを加え、 氷 冷下 i時間攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 目的物 Bz 10-PEG-A 1 a— Pr o— O t Buを含む残渣 0. 2 1 gを得 た。 これを塩化メチレン 5. 1m lに溶解し、 TFA, 5. 1 m 1を加え、 室温 で一昼夜攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 20m 1で精製した
(ヮコ一ゲル C一 200を用い、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1、 30 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1、 3 : 1を各々 50 ml使用し、 5mlずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラ フィ一で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 Bz 10— PEG — Al a— Pr o— OHを 1 64 m g (0.19mmol)得た （収率 33 %)。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 5 ： 1、 R f値 0. 2
!HNMRスぺク トル （ 1 00MHz、 CDC 13 中） <5 (p pm) ： 7. 36 ( 5 H, m， C6 H5 ) 、 5. 1 9 (2H, s, CH2 ) 、 4. 40 ( 2 H, b r, CH2 (Pr o) ) . 4. 1 2 (4H, s, 〇CH2 ) 、 3. 80 ( 1 H, q, J= 6. 0 Hz, CH (A l a) ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, 0CH2CH2)、 3. 59 (2H, b r, CH2 (Pr o) ) . 2. 36 ( 1 H, b r， CH(Pro))、
2. 02 ( 2 H, b r, CH2 (P r o) ) . 1. 29 ( 3 H, b r d， J =
3. 5Hz, CH3 (A l a) )
参考例 3 化合物 （VIII— 3) ： Bz 10— PEG - G 1 y - Pr o - OH
(a) 化合物 （VI— 3) ： H-G l y-Pr o-O t Bu
H— Pr o— O t Bu, 1. 0 g (5.8画 ol) を TH F, 1 00m lに溶解し、 Z-G 1 y-ONSu, 1. 8 g (5.8mmol) を加え、 室温で一昼夜攪拌した。 溶 媒を減圧下除去し、 クロ口ホルム、 燐酸緩衝液 （pH 7. 0) を順次 50m lず つ加えた後、 クロ口ホルム層を抽出し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 溶媒を 減圧下除去し、 オイル状の残澄を得、 これをシリカゲル 200 m 1で精製した
(ヮコ一ゲル C一 200を用レ、、 展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 00 ： 0、 1 00 : 1、 50 : 1を各々 1 50m 1使用し、 1 0mlずつ分画した） 。 シリカゲル薄層クロマトグラフィー [キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 ： 1、 R f値 0. 9] で目的物画分を確認しな がら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 オイル状の目的物 Z— G 1 y - P r 0 - O t Buを 1. 93 g得た。 この化合物 1. 93 gに THF, 20m lおよびメ 夕ノール 40m lを加えて溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 44 Omgを加え、 水素雰囲気下、 室温で 1 5時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を 減圧下除去し、 目的物 H— G l y-Pr o— O t Buを 1. 1 38(4.9國01) 得 た （収率 8 6 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 ： 1、 R f 値 0. 2
質量分析 （S I MS) : 2 1 1 (M + H)
(b) 化合物 （VIII— 3) ： B z l O-PEG-G l y-P r o-OH 参考例 1 (a) で得られた B z 1 0— PEG— OH， 4 0 0 m g (0.58mmol)を 塩化メチレン 6. Om 1に溶解し、 氷冷下 DC 1 1 9mgを加え、 2 0分間 攪拌した。 この溶液に上記 （a) で得られた H— G 1 y - P r 0 -0 t B u,
1 1 0mg(0.48議 ol)の塩化メチレン溶液 6. Om lを加え、 さらに氷冷下 2時 間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5. Om lを加え、 氷冷下 1時間 攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 残渣をシ リカゲル 5 Om 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0を用レ、、 展開液はクロロホ ル厶 ： メ夕ノ一ル= 1 0 0 : 0、 1 0 0 : 1、 5 0 : 1を各々 1 0 0 m 1使用し、
1 0m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー [キ ーゼルゲル 6 0 (メノレク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 : 1、 R f 値 0. 7] で確認しながら目的画分の溶媒を減圧除去し、 目的物 B z 1 0— PEG— G l y— P r o— O t Buを 0. 2 1 g得た。 この化合物 0. 2 1 gを 塩化メチレン 5. 1 m lに溶解し、 TFA, 5. 1 m 1を加え、 室温で一昼夜攪 拌した。 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 2 Om 1で精製した （ヮコーゲ ル C— 2 0 0を用レ、、 展開液はクロ口ホルム： メタノ一ル = 1 0 0 : 0、 1 0 0
: 1、 5 0 : 1、 3 0 : 1、 2 0 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1、 3 : 1を各々 5 0 m l使用し、 5m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラ フィ一で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 B z 1 0— PEG 一 G l y— P r o— OHを 1 6 4mg(0.2隱 ol) 得た （収率 3 3 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メ夕ノール = 1 0 ： し R f 値 0. 2
'HNMRスぺク トル （ 1 0 0 MHz、 CDC 13 中） 5 (p pm) ： 7. 3 6 ( 5 H, m, C6 H5 ) 、 5. 1 9 ( 2 H, s , CH2 ) 、 . 4 0 ( 2 H, b r, CH2 (P r o) ) 、 4. 1 2 ( 4 H, s. 〇CH2 ) 、 3. 8 2 ( 2 H. s， CH2 (G l y) ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 59 (2H， b r， CH2 (Pr o) ) . 2. 21 ( 1 H, s, CH(Pro))、 2. 02 (2H, b r, CH2 (Pr o) )
参考例 4 化合物 （VIII—4) ： P i cO— PEG— G l y - Pr o— OH (a) 化合物 （V— 2) : P i cO— PEG—〇H
HO— PEG— OH, 1 0 g(16.7mmol)を DMF, 50mlに溶解し、 塩化ピ コリル塩酸塩 1. 37 g(8.4画 ol) 、 次いでトリェチルァミン 3. 4m 1 (25.1 瞧 ol) を加え、 90〜1 00°Cで 2時間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 ボリエ チレングリコールジカルボン酸 （未反応物） 、 モノピコリルエステルおよびジピ コリルエステルの混合物を得た。 この反応混合物 1. 9 7 gをクロ口ホルム 1 00mlに溶解し、 水 1 00 m 1を加え、 1 N水酸化ナトリゥムで水層の p H を 9. 5に調整した。 水層を抽出し、 l NHC lでpH6. 5に調整した後、 ク ロロホルム 1 00m 1で 6〜7回抽出した。 この際、 水層の ρΗが徐々に上昇す るので 1 NHC 1で ρΗを 6. 5に保った。 クロ口ホルム層を無水硫酸ナトリウ 厶で乾燥した後、 溶媒を減圧下除去し、 目的物 P i c 0— PEG— ΟΗを 1. 0 g (1.5隱 ol) 得た （収率 8. 9%)。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 3 ： 1、 R f値 0. 5
'HNMRスぺク トル （1 001^112、 〇0( 13 中） （5 ( 111) : 5. 2 1 (2H， s， CH2 ) 、 4. 1 2 (4H, s， OCH2 ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 7. 28 ( 2 H, d, J= 3. 5 Hz, H- 3, H- 5 (P i c) ) , 8. 65 ( 2 H, d， J= 3. 5Hz, H - 2， H- 6 (P i c) )
(b) 化合物 （νΐΠ— 4) ： P i cO— PEG— G l y— Pr o—〇H 上記 （a) で得られた P i cO— PEG - OH， 500 m g (0.73minol)を塩化 メチレン 8m 1に溶解し、 氷冷下 DC C, 1 5 1 mg(0.73mmol)を加え、 20分 間攪拌した。 参考例 3 (a) で得られた H— G 1 y-P r O-0 t Bu, 1 39 mg (0.61隱 ol)の塩化メチレン溶液 8 m 1を加え、 氷冷下 3時間攪拌した。 溶媒 を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5m lを加え、 氷冷下 1時間攪拌した。 不溶物 (DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 5 Om l で精製した （ヮコ一ゲル C— 200を用い、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1、 30 : 1、 20 : 1、 1 0 : 1を各々 50 ml使用し、 5mlずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラ フィー [キーゼルゲル 60 (メノレク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール =
1 0 ： 1、 R f値 0. 5] で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的 物 P i c〇— PEG— G l y— Pr o— O t Buを 374mg得た。 この化合物 374 mgを塩化メチレン 9. 01111に溶解し、 丁？八， 9. 0 m 1を加え、 室 温で一昼夜攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲルカラム 20m 1で 精製した （ヮコ一ゲル C— 200を用レ、、 展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : し 30 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1を各々 50m 1 使用し、 5m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィ 一で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 P i cO— PEG— G l y— Pr o—〇Hを 1 3 1 m g (0.16mmol)得た （収率 26 %)。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール =5 ： 1、 R f値 0. 1
!HNMRスぺク トル （ 1 00MHz、 CDC 13 中） S (p pm) ： 5. 21 (2H, s， CH2 )、 4. 40 (2H, b r， CH2 (Pr o) ) , 4. 1 2 ( 4 H, s， OCH2 ) 、 3. 82 ( 2 H, s， CH2 (G l y) ) . 3. 64 (4 nH， b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 3. 5 9 (2H， b r， CH2(Pro)) 、 2. 21 ( 1 H, s, CH (Pr o) ) 、 2. 02 ( 2 H, b r， CH2(Pro)) 、 7. 28 (2H， d， J=3. 5 Hz, H— 3， H- 5 (P i c) ) . 8. 65 (2H, d, J= 3. 5 Hz, H - 2, H - 6 (P i c) )
参考例 5 化合物 （VIII— 5) ： P i cO— PEG— A l a— Va l—OH 参考例 4 (a) で得られた P i c〇-PEG— OH， 459 m g (0.67mmol)を 塩化メチレン 7 m 1に溶解し、 氷冷下 DC C, 1 38 m g (0.80mmol)を加え、 20 分間攪拌した。 参考例 1 (b) で得られた H— A l a— Va l— O t Bu, 1 34mg(0.55睡 ol)の塩化メチレン溶液 7m 1を加え、 氷冷下 3時間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5m lを加え、 氷冷下 1時間攪拌した。 不溶物 (DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 5 Om l で精製した （ヮコ一ゲル C— 20 0を用い、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 0 0 : 0、 1 00 : 1、 5 0 : 1、 3 0 : 1、 20 : 1を各々 5 0m l使用 し、 5m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー [キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 尺 値0. 4 ] で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 P i c O-PEG-A l a - Va 1一 O t Buを 32 8 mg得た。 この化合物 328 mgを塩化メチレン 8. 01111に溶解し、 丁？八， 8. 0 m 1を加え、 室 温で一昼夜攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 20m lで精製し た （ヮコ一ゲル C一 20 0を用レ、、 展開液はクロ口ホルム ： メタノール = 1 0 0 : 0、 1 0 0 : 1、 5 0 : 1、 30 : 1、 1 0 : 1、 5 : 1を各々 5 0m l使用 し、 5m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで 確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 目的物 P i c O— PEG— G l y -P r o-OHを 1 3 1 m g (0.15mniol)得た （収率 2796) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール = 5 ： 1、 R f 値 0. 1
'HNMRスぺク トル （ 1 0 0MHz、 CDC l 3 中） （5 (p pm) ： 5. 2 1 (2H, s, CH2 ) 、 4. 1 2 (4 H, s, 〇CH2 ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 23 ( 1 H, s, CH (A l a) ) 、 2. 23 ( 1 H， b r q， J= 6. 0 Hz, CH (Va 1 ) ) , 7. 28 ( 2 H, d, J = 3. 5 Hz, H— 3， H- 5 (P i c) ) . 1. 26 ( 1 H, s, CH(Val))、 1. 1 7 (3H, d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) . 8. 6 5 ( 2 H, d, J = 3. 5 Hz, H- 2, H- 6 (P i c) ) , 0. 8 9 ( 6 H, q， J = 2. 5 Hz, CH3 (Va 1 ) )
参考例 6 化合物 （Χί— 1 ) ： HO-PEG-A l a -Va l -ADM
参考例 1で得られた化合物 （VIII— 1 ) 1 1. 4mg(13.3 〃mol)を塩化メチ レン 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 4 m g (29.5 〃mol)および DCC, 6. 2 m g (30.1 〃mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 30 0 〃 1に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 に、 ァドリアマイシン塩酸塩 0. 2 5 m g (0.46 mol)をトリエチルァミンの乾 燥 DMF溶液 3 8 3 / 1 (8. 5 gZm 1 ) に溶解した溶液を氷冷下加えた。 反応液を氷冷下 3 0分間静置した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 3. 0m lで精製した （ヮコ一ゲル C— 20 0 ) 。 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 : 1、 7 : 1、 5 : 1、 3 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0 m 1 ) として副 生成物 B z 1 O-PEG-A 1 a -Va 1 一 A DMを溶出除去した後、 クロロホ ルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1， 20m lで目的の HO— PEG— A 1 a 一 Va 1— AD1V [を溶出した。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 HO— PEG— A 1 a— Va 1—ADMを 1 7 9 g (0.20 〃mol)得た （ァドリアマイシンから の収率 4 4 %)。
シリ力ゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1、 R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： PEG— A 1 a - V a 1部分 4. 1 9 (4 H, s, OCH2 ) 、 3. 4 8 ( 4 n H, b r s, O CH2 CH2 ) 、 3. 2 2 ( 1 H, b r s, CH (A 1 a) ) .
2. 23 ( 1 H, b r q， J= 6. 0Hz, CH (Va l ) ) 、 1. 25 ( 1 H, s, CH (Va l ) ) 、 1. 1 7 ( 3 H, d, J= 2. 8 Hz， CH3(Ala)) 、 0. 8 9 ( 6 H, b rm， CH3 (Va l ) ) 、 ァドリァマイシン部分 7.99 ( 2 H, d, J = 6. 0 H z, H - 1， H— 2) 、 7. 73 ( 1 H, b r m,
H— 3) 、 5. 4 3 ( 1 H, b r m, H- Γ ) , 5. 4 2 ( 1 H, d, J =
3. 7 Hz, H - 1 4 b) 、 5. 3 5 ( 1 H, d， J= 3. 7 H z, H - Γ ) 、 5. 1 4 ( 1 H， b r s, H - 7) 、 4. 34 ( 1 H, q, J = 6. 5 H z, H- 5' ) 、 4. 1 0 ( 3 H, s, 4 -〇CH3 ) 、 3. 22 ( 1 H， d, J =
1 8Hz, H - 1 0 b) 、 3. 1 0 ( 1 H, d, J= 1 8 Hz, H— 1 0 a) 、 2. 5 0 ( 1 H, b r d, J= 1 H z, H- 8 b) 、 2. 23 ( 1 H， d, J = 1 4 Hz， H - 8 a) 、 2. 0 6 ( 1 H, b r m, H - 2' b) 、 1. 8 9 ( 1 H, b r m, H- 2' a) 、 1. 28 ( 3 H, d, J = 6. 5 Hz, 5 " 一 CH3 )
紫外可視吸収スペク トル （メタノール中、 ； ax ) : 2 3 2, 2 74, 4 9 5, 5 3 4, 5 7 5 nm
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 8 0, 3 4 0 0, 3 0 0 0, 2 9 2 4, 2 8 7 0, 1 7 8 6, 1 7 1 7， 1 6 6 0, 1 6 0 5, 1 5 2 0, 1 4 5 0, 1 2 9 5, 1 1 0 5 cm"1
参考例 7 化合物 （XI— 2) ： HO-PEG-A l a -P r o -ADM
参考例 2で得られた化合物 （VIII— 2) 9. 5mg (ll.l zmol)を塩化メチレ ン 0. 5m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 4mg(29.5 〃moI)および DC 6. 2 m g (30.1 〃mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾 別し、 瀘液から溶媒を減圧下除去した。 残澄を窒素気流中メタノール 3 0 0 fi l に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温で 2 時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣に、 ァ ドリァマイシン塩酸塩 0. 2 5m (0.46 imol)をト リェチルァミ ンの乾燥 DMF溶液 3 8 3 z l (8. 5 gZm 1 ) に溶解した溶液を氷冷下加えた。 反 応液を氷冷下 3 0分間静置した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 3. 0m lで精製した （ヮコ一ゲル C— 2 0 0 ) 。 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 : 1 , 7 : 1、 5 : 1、 3 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0 m 1 ) として副 生成物 B z 1 O-PEG-A 1 a -P r o— A DMを溶出除去した後、 クロロホ ルム ： メタノール ：水 = 1 3 ： 6 ： 1 , 2 0m lで目的の HO— P EG— A 1 a 一 P r o— ADMを溶出した。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 HO— PEG— A 1 a— P r o— ADMを 1 8 2〃 g (0.21 〃mol)得た （ァドリァマイシンから の収率 4 6 %)。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール ：水 = 1 3 ： 6 ： し R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： PEG— A 1 a - P r o部分 . 5 2 ( 2 H, b rm， CH2 (P r o) ) , 4. 1 2
( 4 H, s, 〇CH2 ) 、 3. 7 5 ( 1 H, q, J= 6. 0 H z, CH(Ala))、 3. 6 4 (4 nH, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 5 5 (2H, br, CH2(Pro)) 、 2. 34 ( 1 H, b r, CH (P r o) ) 、 2. 04 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 1. 1 5 (3H, b r， CH3 (A l a) ) . ァドリアマイシン部分 8. 0 6 (2H， d, J= 6. 0 Hz, H- 1 , H - 2) 、 7. 8 0 ( 1 H， b rm, H 一 3) 、 5. 5 4 ( 1 H, b rm, H- 1 ' ) . 5. 5 1 ( 1 H, d, J =
3. 5 H z, H - 1 4 b) 、 5. 2 9 ( 1 H, d， J= 3. 5 Hz, H— 14a)、 5. 1 9 ( 1 H, b r s, H— 7) 、 4. 3 1 ( 1 H， t , J= 6. 5 Hz, H 一 5， ） 、 4. 1 3 ( 3 H, s, 4 -〇CH3 ) 、 3. 4 1 ( 1 H, d， J = 1 8 Hz, H— 1 0 b) 、 3. 0 7 ( 1 H, d, J= 1 8Hz, H- 1 0 a) . 2. 5 9 ( 1 H, b r d, J= 1 4 Hz, H— 8 b) 、 2. 27 ( 1 H, d， J = 1 4 H z, H - 8 a) 、 2. 1 4 ( 1 H, b r， H - 2' b) 、 1. 8 2
( 1 H， b r, H- 2' a) 、 1. 2 6 ( 3 H， d， J = 6. 5 Hz, 5 ' 一 CH3 )
紫外可視吸収スペク トル （メタノール中、 imex ) : 233, 252, 2 9 0, 4 70, 4 9 5, 5 34, 5 78請
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 8 0， 3 4 0 0, 3 0 0 5, 2 9 3 0， 2 8 7 0, 1 7 8 0, 1 7 1 8， 1 6 5 8, 1 5 8 0， 1 4 5 0, 1 28 2, 1 1 1 0 cm"1
参考例 8 化合物 （XI— 3) ： HO-PEG-G l y-P r o-ADM
参考例 3で得られた化合物 （VIII— 3) 1 0. 8mg(12.5 〃mol)を塩化メチ レン 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 4 m g (29.5 〃mol)および DCC, 6. 2 m g (30.1 ; mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 〃 1に溶解し、 1 0%パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 に、 ァドリアマイシン塩酸塩 0. 1 75mg(0.3 zmol)をトリエチルァミ ンの乾 燥 DMF溶液 25 0 1 (8. 5 ^ gZm 1 ) に溶解した溶液を氷冷下加えた。 反応液を氷冷下 3 0分間静置した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 5. 0m lで精製した （ヮコ一ゲル C— 20 0 ) 。 クロ口ホルム ： メタノール = 5 : 1、 3 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0 m 1 ) として副生成物 B z 1 〇— PEG— G l y-P r o— A DMを溶出除去した後、 クロ口ホルム ： メタノール ：水 = 1 3 ： 6 :.1, 20m lで目的の HO— PEG— G l y— P r o— ADM を溶出した。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 HO— PEG— G 1 y— P r 0 — ADMを 24 0〃g(0.19 〃mol)得た （ァドリアマイシンからの収率 62%) 。 シリ力ゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メ夕ノール：水 = 1 3 : 6 : 1、 尺 ^値0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, C D C 13 中） 5 ( p p m) ： PEG - G 1 y— P r o部分 4. 22 ( 2 H, b r m, CH2 (P r o) ) . 4. 1 7 (4H, m, OCH2 ) 、 4. 0 8 ( 2 H, s， CH2 (G 1 y) ) 、 3. 64 ( 4 nH, b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 3. 5 2 ( 2 H, b r， CH2(Pro)) 、
2. 22 ( 1 H, b r, CH (P r o) ) 、 1. 9 5 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 ァ ドリアマイシン部分 8. 0 5 ( 2 H, m, H- 1， H— 2) 、 7. 7 7
( 1 H, m, H - 3) 、 5. 5 0 ( 1 H, d, J= 3. 7Hz, H- 1 ' ) , 5. 34 ( 1 H, d, J = 3. 5 Hz, H— 1 4 b) 、 5. 3 0 ( 1 H, d， J = 3. 8 H z, H- Γ ) . 5. 1 9 ( 1 H， b r s, H - 7) 、 4. 3 1
( 1 H, q, J= 6. 8Hz， H- 5' ) . 4. 1 0 (3H， s, 4— 0CH3) 、
3. 30 ( 1 H， d, J= 1 8Hz, H - 1 0 b) 、 3. 0 3 ( 1 H, d, J = 1 8Hz， H- 1 0 a) 、 2. 4 8 ( 1 H， b r d, J= 1 Hz, H- 8 b) 、 2. 20 ( 1 H， d, J= 1 4 Hz, H— 8 a) 、 2. 04 ( 1 H, b rm, H — 2' b) 、 1. 8 3 ( 1 H, m, H- 2' a) 、 1. 1 4 ( 3 H, b r d, J = 7Hz, 5' -CH3 )
紫外可視吸収スペク トル （メタノール中、 lm,x ) : 233, 25 0, 2 9 0, 4 70, 4 9 5, 5 30, 5 76 nm
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 9 0， 3 4 0 0, 3 0 0 0， 294 0, 28 60, 1 720, 1 6 5 0, 1 4 5 0, 1 1 1 5 cm-1 参考例 9 化合物 （XI— 4) ： HO-PEG-A 1 a-Va 1 - DNR
参考例 1で得られた化合物 （VIII— 1 ) 1 1. 4mg(13.3 〃mol)を塩化メチ レン 0. 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 6 m g (31.3 〃mol)および DCC, 6. 4m (31.0 〃mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 30 0 〃 1に溶解し、 1 0%パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 に、 ダウノルビシン塩酸塩 0. 9 0mg(1.7〃mol)をトリエチルァミ ンの乾燥 DMF溶液 5 00 (0. 4 8〃 gZm 1 ) に溶解した溶液を氷冷下加えた。 反応液を氷冷下 3 0分間、 次いで室温で 1時間静置した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 3. 0m 1で精製した （ヮコ一ゲル C— 20 0 ) 。 クロ口ホル ム： メタノール = 1 0 : し 7 : 1、 5 : 1、 3 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 10 m l ) として副生成物 B z 1 O-PEG-A 1 a-Va 1一 DNRを溶出除去し た後、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1， 20 m lで目的の H〇一 PEG— A 1 a-Va 1—DNRを溶出した。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 HO-PEG-A 1 a -Va 1— DNRを 3 8〃 g (0.03 〃mol)得た （ダウノル ビシンからの収率 1. 8 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1、 R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： PEG - A 1 a—V a 1部分 4. 1 9 ( 4 H, s, 〇CH2 ) 、 3. 4 9 ( 4 n H, b r s， 〇CH2 CH2 ) 、 3. 2 0 ( 1 H, b r s， CH (A l a) ) 、 2. 2 9 ( 1 H, b r q， J= 5. 7 Hz, CH (Va l ) ) 、 1. 29 ( 1 H， s, CH (Va l ) ) 、 1. 24 ( 3 H, d, J= 2. 8 Hz, CH3(Ala)) 、 0. 9 5 ( 6 H, b rm, CH3 (Va l ) ) 、 ダウノルビシン部分 7.82
( 2 H, m, H - 1 , H— 2) 、 7. 7 2 ( 1 H， m, H— 3 ) 、 5. 3 4
( 1 H, d， J= 3. 7 Hz, H- 1 ' ) , 5. 27 ( 1 H, b r s, H - 7) 、 4. 3 1 ( 1 H, q, J= 6. 5 Hz, H- 5' ) 、 4. 1 9 ( 3 H, s, 4 - OCH3 ) 、 3. 2 9 ( 1 H, d, J = 1 8 H z, H - 1 0 b) 、 3. 1 2
( 1 H， d, J= 1 8 Hz, H - 1 0 a) 、 2. 8 0 ( 3 H, s, H - 1 4) 、 2. 34 ( 1 H， b r d, J= 1 4 Hz, H - 8 b) 、 2. 22 ( 1 H, d， J = 1 H z, H - 8 a) 、 1. 9 1 ( 1 H, b rm, H— 2' b) 、 1. 8 3
( 1 H, b rm, H— 2' a) 、 1. 2 9 ( 3 H, d, J= 6. 5 Hz, 5' 一 CH3 )
紫外可視吸収スペク トル （メタノール中、 ex ) : 232, 274, 4 9 5, 5 34, 5 75 nm
赤外吸収スペク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 8 0， 3 4 0 0, 3 0 0 0， 2 9 24, 2 8 7 0, 1 7 8 6， 1 7 1 7, 1 6 6 0, 1 6 0 5, 1 5 2 0， 1 4 5 0, 1 2 95, 1 1 05 cm-1
参考例 1 0 化合物 （XI— 5) ： HO-PEG-A 1 a-P r o-DNR
参考例 2で得られた化合物 （VIII— 2) 9. 7mg(11.3 〃mol)を塩化メチレ ン 0. 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u， 3. 1 m g (26.9 /zmol)および DCC, 5. 5mg(26.7 zmol)を加え、 0 °Cで 2時間攪拌した。 不溶物 （D C U) を濾 別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 ^ 1 に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温で 2 時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣に、 ダウノルビシン塩酸塩 0. 9mgをトリエチルアミ ンの乾燥 DMF溶液 5 0 0 1 ( 0. 4 8 gZm 1 ) に溶解した溶液の中の 1 6 5〃 1 (0.5;tzmol)を氷冷 下加えた。 反応液を氷冷下 30分間、 次いで室温で 1時間静置した後、 溶媒を減 圧下除去し、 残渣をシリカゲル 5. 0 m 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 20 0 ) 。 クロ口ホルム ： メタノール: = 1 0 : 1、 7 : 1、 5 : 1、 3 : 1、 2 : 1を展開 溶媒 （各 1 0m 1 ) として副生成物 B z 1 O-PEG-A 1 a -P r o— DNR を溶出除去した後、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1 , 20m 1で 目的の H〇一 PEG— A l a -P r o— DNRを溶出した。 この画分の溶媒を減 圧下除去し、 HO— PEG— A l a— P r o— DNRを 1 5 0 g (0.1〃mol)得 た （ダウノルビシンからの収率 20 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ： キーゼルゲル 6 0 (メノレク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1、 R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz， CDC 13 中） <5 (p pm) ： PEG— A 1 a - P r 0部分 . 5 2 (2H， b r, CH2 (P r o) ) 、 4. 1 2
( 4 H, s, OCH2 ) 、 3. 7 5 ( 1 H, q, J= 6. 0 H z, CH(Ala))、 3. 6 4 (4 nH, b r s， OCH2 CH2 ) 、 3. 4 2 (2H， br, CH2(Pro)) 、 2. 3 7 ( 1 H, b r, CH (P r o) ) 、 2. 0 8 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 1. 2 9 (3 H, b r， CH3 (A l a) ) . ダウノルビシン部分 8. 0 3 ( 2 H, m, H— 1 , H— 2) 、 7. 7 2 ( 1 H, m， H— 3) 、 5. 5 2 ( 1 H, b r d, J= 3. 7 Hz, H- 1 ' ) 、 5. 3 6 ( 1 H， b rm, H— 1 ' ) 、 5. 2 9 ( 1 H, b r s, H— 7) 、 4. 3 4 ( 1 H, q, J= 6. 5 Hz, H- 5' ) . 4. 0 9 (3H, s， 4一〇CH3 ) 、 3. 2 3 ( 1 H, d， J= 1 8 Hz, H - 1 0 b) 、 3. 0 1 ( 1 H, d, J= 1 8 Hz, H-lOa). 2. 8 0 ( 3 H, s, H— 1 4) 、 2. 4 2 ( 1 H, b r d, J= 1 4 Hz, H - 8 b) . 2. 2 3 ( 1 H, d， J= 1 4 H z, H - 8 a) 、 2. 0 6 ( 1 H， b r m, H- 2' b) 、 1. 8 7 ( 1 H, b r m, H- 2' a) 、 1. 2 9 (3 H, d， J = 6. 5 Hz, 5' — CH3 )
紫外可視吸収スぺク トル （メタノール中、 lmax ) : 2 3 2, 2 5 1 , 2 9 0，
4 6 9, 4 9 5， 5 3 2, 5 8 0 nm
赤外吸収スペク トル （クロ口ホルム中） ： 3 6 9 0， 3 5 8 0, 3 4 0 0, 3 0 1 5, 2 9 3 6, 2 8 7 8, 1.7 8 2， 1 7 1 4, 1 6 5 0, 1 6 0 0,
1 5 2 5, 1 4 5 7, 1 4 3 2, 1 3 5 0, 1 2 8 5, 1 24 0, 1 1 0 8 cm"1 参考例 1 1 化合物 （XI - 6) ： HO-PEG-G l y-P r o -DNR
参考例 3で得られた化合物 （VIII— 3) 1 1. 0mg(12.8 〃mol)を塩化メチ レン 0. 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 5 m g (30.4 〃mol)および DC C, 6. 3mg(30.5 〃mol)を加え、 0 °Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 1に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 に、 ダウノルビシン塩酸塩 0. 9 m gをトリエチルァミ ンの乾燥 DMF溶液
5 0 0 ^ 1 (0. 4 8 g/m 1 ) に溶解した溶液中の 1 5 6〃 1 (0.5〃mol)を 氷冷下加えた。 反応液を氷冷下 3 0分間、 次いで室温で 1時間静置した後、 腿 を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 5. 0 m lで精製した （ヮコ一ゲル C—
2 0 0) 。 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 : 1、 7 : 1、 5 : 1、 3 : 1、
2 ： 1を展開溶媒 （各 1 0 m 1 ) として副生成物 B z 1 O- PEG- G 1 y - P r o— DNRを溶出除去した後、 クロ口ホルム ： メタノール：水 =13 : 6 ： し 20m lで目的の H〇一 PEG— G 1 y-P r o— DNRを溶出した。 この画分 の溶媒を減圧下除去し、 HO— PEG— G l y— P r o— DNRを 1 8 0〃 g (0. l〃mol)得た （ダウノルビシンからの収率 26 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メ夕ノール：水 = 1 3 : 6 : 1、 R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： PEG - G 1 y-P r o部分 4. 5 1 ( 2 H, b rm, CH2 (P r o) ) , 4. 1 7
(4 H, m， OCH2 0) 、 3. 6 4 ( 4 n H, b r s， OCH2 CH2 ) 、 3. 5 6 (2H, s， CH2 (G 1 y) ) 、 3. 5 0 ( 2 H, m, CH2(Pro)) 、 2. 2 1 ( 1 H， s, CH (P r o) ) 、 2. 0 2 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 ダウノルビシン部分 8. 04 (2H, m, H - 1， H - 2) 、 7. 79 ( 1 H， m， H - 3) 、 5. 3 4 ( 1 H, d, J = 3. 7Hz, H- 1 ' ) . 5. 2 7
( 1 H, b r s, H - 7) 、 4. 5 2 ( 1 H, q, J= 6. 7Hz, H - 5' ) 、 4. 1 2 (3H, s， 4—OCH3 ) 、 3. 22 ( 1 H, d， J= 1 8 Hz, H - 1 0 b) . 2. 9 9 ( 1 H, d, J = 1 8 H z, H - 1 0 a) 、 2. 9 0
(3H, s, H - 1 4) 、 2. 3 5 ( 1 H, b r d, J= 1 4 Hz, H- 8 b) 、 2. 22 ( 1 H, d, J= 1 4 Hz, H - 8 a) 、 2. 02 ( 1 H, b rm, H 一 2' b) 、 1. 1 8 ( 3 H, d， J= 6. 6 Hz, 5' -CH3 )
紫外可視吸収スぺク トル （メタノール中、 iraex ) : 235, 252, 28 9， 4 70, 4 9 5, 5 34, 5 78 nm
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 8 0, 3 0 0 0, 2 9 3 0, 2 8 8 0, 1 7 9 0, 1 7 1 9, 1 6 5 8， 1 6 1 0, 1 4 5 0, 1 0 4, 1 3 5 0, 1 29 0, 1 1 1 0 cm— 1
参考例 1 2 化合物 （XI— 7) ： HO - PEG - A 1 a - Va 1 -化合物 （20) 参考例 1で得られた化合物 （VIII— 1 ) 1 1. 5mg(13.4 〃mol)を塩化メチ レン 5m lに溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 6 m g (31.3 mol)および DCC, 6. mg(31.0 mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 1に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 2時間 3 0分激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を少量のクロ口ホルムに溶解し、 シリカゲル 3. Om lで精製した （ヮコ一 ゲル C一 2 0 0 ) 。 クロ口ホルム ： メタノール = 2 0 ： 1 0 : 1を展開溶媒
(各 1 0m l ) としてべンジルエステル体 B z 1 0-PEG-A l a -Va l - ONS uを溶出除去した後、 参考例 1 7で得られる化合物 （2 0 ) 0. 0 5 mg (0.10 〃mol)を乾燥 DMF, 2 0 0〃 1に溶解した溶液をカラムにチャージした。 さらに乾燥 DMF, 1 5 0〃 1をカラム上に加えた後、 室温で 3 0分間反応させ た。 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 : 1、 5 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0 m 1 ) としてカラムを洗浄した後、 クロ口ホルム： メタノール：水 = 13 : 6 : 1 , 1 0m lで目的物 HO— P EG— A 1 a -Va 1 一化合物 （2 0) を溶出した。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 H〇— PEG— A 1 a— Va 1 —化合物 （2 0) を 1 1 2〃 g(0.09 ζπιοΐ)得た （化合物 （2 0) からの収率 8 8 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ： キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1、 R f 値 0. 6
!HNMRスぺク トル （ 5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： P E G - A 1 a -Va 1部分 4. 1 2 ( 4 H, s, OCH2 ) 、 3. 6 4 ( 4 n H, b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 3. 2 3 ( 1 H, s, CH (A 1 a) ) , 2. 2 3
( 1 H, b r q， J= 6. 0 H z, CH (Va l ) ) 、 1. 2 6 ( 1 H， s, CH (Va l ) ) 、 1. 1 7 ( 3 H, d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) . 0. 8 9 ( 6 H, q, J= 2. 5 Hz, CH3 (Va l ) ) 、 化合物 （2 0) 部分 1 0. 5 7 ( 1 H, b r s ) . 7. 6 8 ( 1 H, d, J= 1 5. 5 Hz) 、 7. 1 2 ( 1 H, d d， J= 8. 3， 2. 0 Hz) 、 6. 9 9 ( 1 H, d， J = 2. 0 Hz) 、 6. 8 0 ( 1 H, d， J= 8. l Hz) 、 4. 4 0 ( l H， m) 、 4. 2 7 (2H, m) 、 4. 1 6 ( 1 H, b r d, J= 1 1. 2 H z ) . 3. 9 0 ( 3 H, s ) 、 3. 8 2 ( 3 H, s ) 、 3. 6 7 ( 1 H, m) 、 3. 1 2 ( 2 H, t , J= 7. l Hz) 、 2. 6 3 ( 3 H, s ) 、 2. 3 8 ( 1 H, d d, J = 7. 5 , 3. 4 H z ) , 1. 5 2 ( 2 H. m) 、 1. 3 7 ( 1 H, t , J = 4. 2Hz) 赤外吸収スぺク トゾレ （クロ口ホルム中） ： 3 6 9 0 , 3 5 9 2, 3 4 0 0 , 3 0 0 0， 2 9 0 0, 1 7 1 2, 1 6 5 0, 1 6 0 0， 1 4 5 0， 1 3 0 0， l l l O cnr1
参考例 1 3 化合物 （XI— 8) ： HO - PEG— A 1 a— P r 0—化合物 （2 0) 参考例 2で得られた化合物 （VIII— 2) 9. 8mg(11.4 /zmol)を塩化メチレ ン 0. 5 m 1 に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 2 m g (27.8 〃 mol)および DCC, 5. 6 m g (27.1 /mol)を加え、 0°Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 こ溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 3時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を少量のクロ口ホルムに溶解し、 シリカゲル 3. 0m 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0 ) 。 クロ口ホルム： メタノール = 2 0 : 1、 1 0 : 1を展開溶媒 （各 1 0 m l ) としてべンジルエステル体 B z 1 0— P E G— A l a— P r o— ONS uを溶出除去した後、 参考例 1 7で得られる化合物 （2 0 ) 0. 0 5 mg (0.10 mol)を乾燥 DMF， 2 0 0〃 1に溶解した溶液をカラムにチャージした。 さらに乾燥 DMF， 1 0 0〃 1をカラム上に加えた後、 室温で 3 0分間反応させ た。 クロ口ホルム： メタノール = 1 0 ： 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0m 1 ) と してカラムを洗浄した後、 クロ口ホルム： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1， 1 0 m 1で目的物 H〇一 PEG— A l a -P r o一化合物 （2 0) を溶出した。 この 画分の溶媒を減圧下除去し、 HO - PEG - A l a -P r o -化合物 （2 0) を 2 3 3 z g(0.10 /mol)得た （化合物 （2 0) からの収率 1 0 0%) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール：水 = 1 3 : 6 : 1、 尺 値0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz， CDC 13 中） 5 (p pm) ： PEG - A 1 a— P r 0部分 4. 5 2 ( 2 H, b rm, CH2 (P r o) ) , 4. 1 2 ( 4 H, s , O CH2 ) 、 3. 6 4 ( 4 n H, b r s , O CH2 CH2 ) 、 3. 4 2 ( 2 H, b r, CH2 (P r o) ) , 3. 2 3 ( 1 H, s， CH(Ala))、 2. 3 7 ( 1 H, b r， CH (P r o) ) 、 2. 0 8 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 1. 1 7 ( 3 H, d, J= 2. 8 Hz. CH3 (A l a) ) . 化合物 （ 2 0) 部分 1 0. 23 ( 1 H， b r s) 、 7. 6 8 ( 1 H, d, J= 1 5. 5Hz) 、 7. 1 0 ( 1 H, d d, J= 8. 3, 2. 0 H z) . 6. 8 9 ( 1 H, d, J = 2. 0Hz) 、 6. 8 0 ( 1 H， d, J= 8. l Hz) 、 4. 4 0 ( 1 H, m) 、 4. 2 9 (2H， m) 、 4. 20 ( 1 H, b r d, J= 1 1. 2 H z ) . 3. 8 9 (3H, s) 、 3. 82 (3H, s) 、 3. 6 7 ( 1 H, m) 、 3. 1 2 ( 2 H, t， J = 7. l Hz) 、 2. 6 3 ( 3 H, s) 、 2. 3 3 ( 1 H, d d, J = 7. 5， 3. 4 H z ) 、 1. 5 2 ( 2 H， m) 、 1. 3 5 ( 1 H, t , J = 4. 2Hz)
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 6 9 0, 3 5 9 2， 3 4 0 0, 3 0 0 0, 2 9 0 0, 1 7 1 2, 1 6 5 0, 1 6 0 0, 1 4 5 0, 1 3 0 0, 1 1 1 0 cm— 1
参考例 1 4 化合物 （XI - 9) ： HO— PEG— G 1 y - P r 0—化合物 （2 0) 参考例 3で得られた化合物 （VIII— 3) 1 1. 2mg(13.0 //ml) を塩化メチ レン 0. 5 m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u, 3. 6 m g (31.3 〃mol)および DC 6. 4mg(31.0 zmol)を加え、 0 °Cで 2時間攪拌した。 不溶物（DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣を窒素気流中メタノール 3 0 0 〃 1に溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2〜3mgを加え、 水素気流中、 室温 で 3時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣 を少量のクロ口ホルムに溶解し、 シリカゲル 3. 0m 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0 ) 。 クロ口ホルム ： メタノール = 20 ： K 1 0 : 1を展開溶媒 （各 1 0m l ) としてべンジルエステル体 B z l O- P EG-G l y - P r o - ONS uを溶出除去した後、 参考例 1 7で得られる化合物 （20) 0. 0 5mg (0.10 〃mol)を乾燥 DMF， 20 0〃 1に溶解した溶液をカラムにチャージした。 さらに乾燥 DMF, 1 5 0 / 1をカラム上に加えた後、 室温で 30分間反応させ た。 クロ口ホルム ： メタノ ール = 1 0 : 1、 2 : 1を展開溶媒 （各 1 0m 1 ) と してカラムを洗浄した後、 クロ口ホルム： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1 , 1 0 m 1で目的物 H〇— PEG— G 1 y-P r o一化合物 （20) を溶出した。 この 画分の溶媒を減 E下除去し、 HO— PEG— G 1 y-P r o—化合物 （20) を 1 35 / g(0.10 mol)得た （化合物 （20) からの収率 1 0 0%) 。 シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム： メタノール：水 = 1 3 ： 6 ： 1、 R f 値 0. 6
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） （5 (p pm) ： P E G - G 1 y— P r 0部分 4. 2 2 ( 2 H， b r m, CH2 (P r o) ) . 4. 1 7
(4 H, m, OCH2 ) 、 4. 0 8 ( 2 H, s， CH2 (G 1 y) ) 、 3. 6 4
( 4 nH, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 5 2 ( 2 H, b r， CH2(Pro)) 、 2. 22 ( 1 H， b r, CH (P r o) ) 、 1. 9 5 (2H, brm, CH2(Pro))、 化合物 （ 2 0 ) 部分 9. 9 7 ( 1 H, b r s ) . 7. 5 4 ( 1 H, d, J = 1 5. 5 Hz) 、 7. 22 ( 1 H, d d, J= 8. 3, 2. 0 Hz) 、 6. 9 9
( 1 H, d, J = 2. 0 H z ) . 6. 8 8 ( 1 H， d， J= 8. l H z) 、 4. 4 0 ( 1 H, m) 、 4. 2 7 ( 2 H, m) 、 4. 1 6 ( 1 H, b r d, J = 1 1. 2 H z ) 、 3. 9 0 ( 3 H, s ) . 3. 8 2 ( 3 H, s ) 、 3. 7 0
( 1 H, m) 、 3. 1 2 ( 2 H, t, J= 7. l Hz) 、 2. 6 3 ( 3 H, s) 、 2. 5 4 ( 1 H, d d, J= 7. 5, 3. 4 Hz) 、 1. 6 2 ( 2 H, m) 、 1. 3 5 ( 1 H, t, J= 4. 2 Hz)
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 6 9 0， 3 5 9 2, 3 4 0 0, 3 0 0 0， 2 9 0 0, 1 7 1 2, 1 6 5 0， 1 6 0 0, 1 4 5 0, 1 3 0 0， 1 1 1 0 cm— 1
参考例 1 5 化合物 （ 1 2)
化合物 （ 1 2) は、 次の反応工程に従い合成した。
6 l-
Figure imgf000051_0001
Ifn0/96df/X3d XSfS£/96 OAV
Figure imgf000052_0001
(11)
H2， Pd-C
Figure imgf000052_0002
(12)
4 ーヒ ドロキシ一 3 , 5—ジメ トキシベンズアルデヒ ド （化合物 （ 1 ) ) 3. 0 g(16圆 ol)を DMF， 3 0 m 1に溶解し、 無水炭酸カリウム 3. 4 gを加 え、 さらに臭化べンジル 3. Om 1 (25imnol)を滴下し、 室温で一昼夜攪拌した。
0. 1 NHC 1 , 3 0 Om 1を加え、 酢酸ェチル 2 0 Om 1で 2回抽出した。 酢 酸ェチル層を飽和塩化ナトリゥム水溶液で洗浄し、 無水硫酸ナトリゥムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 シリカゲル 3 0 Om 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0 を用い、 展開液はへキサン ：酢酸ェチル = 3 ： 1を使用した） 。 目的画分の溶媒 を減圧下除去し、 化合物 （ 2 ) を 4. 7 g (17隱 ol)得た （収率 1 0 0 %) 。
アジド酢酸メチル 1 1. 8 g(103mmol) をアルゴン気流中メタノール 7 Om 1 に溶解し、 — 5 0°Cで 2 8 %ナトリウムメ トキサイ ド 2 0. 9m 1 (103mmol) を 1時間 1 5分かけて滴下し、 3 0分間攪拌した。 化合物 （2) 4. 7 gのメタノ ール： トルエン = 1 ： 1混合溶液 4 Om 1を 2 5分間かけて加え、 一 5 0°Cから 一 1 0°C程度まで自然昇温させて一昼夜攪拌した。 水およびジェチルエーテルを 適量加え、 エーテル層を抽出した。 エーテル層を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 化合物 （ 3) を 2. 8 g (7.6nunol) 得た （収率 4 5 。
化合物 （ 3) 2. 8 gをキシレン 7 5 0m lに溶解し、 1 4 0〜 1 5 0 °Cで 2 時間加熱した。 室温に冷却後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 1 5 0 m 1で精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0を用い、 展開液はへキサン ：酢酸ェチル = 4 ： 1を使用した） 。 目的画分の溶媒を減圧下除去し、 化合物 （4) を 2. 4 g(7. Ommol) 得た （収率 9 396) 。
化合物 （4) 2. 4 gをテトラヒドロフラン ： メタノール = 1 ： 1の混合溶媒 1 1 6m l に溶解し、 二酸化白金 4 7 1 m gを加え、 水素気流中一昼夜激しく攪 拌した。 二酸化白金 2 0 Omgを追加し、 水素気流中さらに 7時間攪拌した。 セ ライ 卜で触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 1 2 0 m 1カラムで精製した （展開液；へキサン ：酢酸ェチル == 3 : 1 ) 。 目的画分の 溶媒を減圧下除去し、 化合物 （ 5) を 1. 6 g(6.4圃 ol) 得た （収率 9 1 6) 。 化合物 （5) 1 0 0mg(0.4讓 ol) を DMF, 5 m 1に溶解し、 無水炭酸カリ ゥム 2 7 5 mg(2mmol) を加え、 さらに 1 , 2—ジブロモェタン 1 7 3 / 1 (2mmol) を滴下し、 窒素気流中室温で 1 9時間攪拌した。 反応液に燐酸緩衝液 (pH7) を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 2 Oml で精製した （ヮコ一ゲル C— 200を用い、 展開液はへキサン：酢酸ェチル = 2 ： 1を使用した） 。 目的画分の溶媒を減圧下除去し、 化合物 （6) を 94mg (0.26國01)得た （収率 65 。
化合物 （6) 94mg(0.26圃 ol)を DMF， 9. 5 m 1に溶解し、 アジ化ナト リウム 85mg(1.3mmol) を加え、 室温で 25時間攪拌した。 反応液に酢酸ェチ ルおよび燐酸緩衝液 （pH7. 0) を適量加え、 酢酸ェチル層を抽出した。 酢酸 ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 化合物 （7) を 79mg得た （収率 95 %) 。
化合物 （7) 79mgを THF， 8 m 1および水 1 0 m 1の混合溶媒に溶解し、 1 N水酸化ナトリウム水溶液 2. 5mlを加え、 室温で 3. 5時間攪拌した。 反 応液に 1 NHC 1を加えて酸性にした後、 クロ口ホルムで抽出した。 クロ口ホル ム層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 化合物 （8) を 75mg得た （収率 98%)。
化合物 （8) 75 mgを氷冷下塩化メチレン 7m 1に溶解し、 DCC, 1 03 m (0.5mmol) を加え、 氷冷下 1時間攪拌した。 パラニトロフヱノール 70 m g (0.5mmol) およびジメチルァミノピリジン 6 lmg(0.5譲 ol) を加え、 0°C〜室 温で 1時間 20分攪拌した。 不溶物を濾別し、 0. 5NHC 1を加え、 クロロホ ルムで抽出した。 クロ口ホルム層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液および飽和食 塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去した。 残渣をェ 夕ノールから再結晶し、 化合物 （9) を 72mg得た （収率 62%)。
アルゴン気流中、 5 0 %水素化ナトリウム 37 m g (0.9mmol) を DMF, 1. 5mlに溶解し、 ― 20°Cで特開平 5 - 1 78858号に記載の方法に従つ て得られる化合物 （ 1 0) 1 85mg(0.7國 ol) を DMF, 2. 9m lに溶解し た溶液を加え、 3時間攪拌した。 化合物 （ 9 ) 368 mg(0.9画 ol) を DMF, 6m 1に溶解した溶液を加え、 一 20°Cから室温まで自然昇温させて一昼夜攪拌 した。 反応液に酢酸ェチルおよび燐酸緩衝液 （pH7. 0) を適量加え、 酢酸ェ チル層を抽出した。 酢酸ェチル層を飽和塩化ナトリゥム水溶液で洗浄し、 無水硫 酸ナト リウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲル 8 Om lで精製 した （展開液； クロ口ホルム： メタノール = 1 0 0 : 1 ) 。 目的画分の溶媒を減 圧下除去し、 化合物 （ 1 1 ) を 2 7 8 mg(0.5mmol) 得た （収率 7 1 %)。
なお、 化合物 （2) 〜化合物 （ 9) および化合物 （ 1 1 ) の構造は、 iH— NMRおよび質量分析で確認した。
窒素気流中、 化合物 （ 1 1 ) 2 0mg(36.6 ； Cimol)を酢酸 0. 2m lおよびテ トラヒ ドロフラン 9. 8m lの混合溶媒 1. 1 m l に溶解し、 1 0〜1 5 °Cで 1 0 %パラジウム炭素触媒 7. 3 mg加え、 水素気流中、 1 0〜1 5°Cで 3時間 2 0分激しく攪拌した。 一 2 0°C以下に冷却して触媒を濾別した後、 冷却状態の まま溶媒を減圧下除去し、 化合物 （ 1 2) を 9mg(17.3 //mol)得た （収率 4 7 %) 。
'HNMRスぺク トル （ 5 0 0 MHz, C D C 13 中） <5 ( p p m) ： 11. 5 8 ( 1 H, b r s, 1 - NH) 、 9. 4 0 ( 1 H, b r s, 1 ' -NH) 、 7. 1 2 ( 1 H, s, H - 7) 、 6. 9 5 ( 1 H, d, J= 2. 3 H z, H- 3 ' ) .
6. 8 1 ( 1 H, s， H - 4' ) 、 4. 4 5 ( 2 H, m, H - 5) 、 4. 0 8 ( 3 H, s, Ί' 一 OCH3 ) 、 3. 9 2 ( 2 H, t, J= 5. 2 Hz, 0CH2)、 3. 9 0 ( 3 H, s， 5' —OCH3 ) 、 3. 8 2 ( 3 H, s， 3— C00CH3) 、 3. 6 7 ( 1 H, m, H - 4 a) 、 3. 2 0 ( 2 H, q, J= 6. 4 H z, CH2)、 2. 6 3 ( 3 H, s , 2— CH3 ) 、 2. 3 8 ( 1 H, d d, J = 7. 5, 3. 4 Hz, H— 4) 、 1. 3 7 ( 1 H, t， J= 4. 2Hz, H— 4) 質量分析 （S I MS) : 5 2 1 (M + H)
参考例 1 6 化合物 （X— 1 ) ： B z 1 〇一 PEG— A 1 a— Va 1 —化合物 ( 1 2)
参考例 1で得られる化合物 （VIII— 1 ) 1 3mg(15.2 〃mol)を塩化メチレン 2. 4 m 1 に溶解し、 氷冷下 HONS u， 2. Omgおよび DCC， 4. 3mg を順に加え、 2時間攪拌した。 不溶物を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣をピリジン 2m 1に溶解し、 氷冷下実施例 2 4で得られた化合物 （ 1 2)
7. 8mg(15.0 〃mol)をピリジン 1. 5 m 1に溶解した溶液を加えた。 氷冷下 1時間、 次いで室温で 2時間攪拌した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲ ル 5m 1で精製した （ヮコ一ゲル C— 20 0を用い、 展開液はクロ口ホルム ： メ 夕ノール = 1 0 0 : 1、 8 0 : 1、 6 0 : 1、 4 0 : 1、 20 : 1、 1 0 : 1、 5 ： 1を各々 5 m 1使用し、 0. 5m lずつ分画した） 。 目的画分の溶媒を減圧 下除去し、 B z l 〇— PEG— A l a—Va l —化合物 （ 1 2) を 2. 8mg (0.2 mol)得た （収率 1. 4 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f 値 0. 5
!HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz, CDC 13 中） 5 (p pm) ： B z 10 — PEG— A l a -Va 1部分 7. 3 6 (5 H， m, C6 H5 ) 、 5. 1 9
(2H, s, CH2 ) 、 4. 1 2 (4 H， s， OCH2 ) 、 3. 64 ( n H, b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 3. 23 ( 1 H， s， CH (A l a) ) 、 2. 23
( 1 H, b r q, J= 6. 0 Hz, CH (Va l ) ) 、 1. 2 6 ( 1 H, s, CH (Va l ) ) 、 1. 1 7 ( 3 H, d， J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) . 0. 8 9 ( 6 H, q, J = 2. 5 Hz, CH3 (Va l ) ) 、 化合物 （ 1 2) 部分 1 1. 5 8 ( 1 H, b r s, 1— NH) 、 9. 4 0 ( 1 H, b r s, 1 ' — NH) 、 7. 1 2 ( 1 H, s, H - 7) 、 6. 9 5 ( 1 H, d, J = 2. 3 Hz, H - 3' ) 、 6. 8 1 ( 1 H, s, H— 4' ) 、 4. 4 5 ( 2 H, m, H — 5) 、 4. 0 8 (3H， s， 7' — OCH3 ) 、 3. 9 0 ( 3 H, s, 5， 一 〇 CH3 ) 、 3. 8 8 ( 2 H, t , J = 5. 2 H z, 〇 CH2 ) 、 3. 8 2
( 3 H, s， 3 - C〇OCH3 ) 、 3. 6 7 ( 1 H, m， H - 4 a) 、 3. 20
(2H， q， J= 6. 4 Hz, CH2 ) 、 2. 6 3 ( 3 H, s， 2 - CH3 ) 、 2. 3 8 ( 1 H, d d, J= 7. 5, 3. 4 Hz, H— 4) 、 1. 3 7 ( 1 H, t, J = 4. 2Hz, H - 4)
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 9 5, 3 4 5 0, 3 0 1 0, 2 9 0 0, 1 75 0, 1 6 6 5, 1 6 0 8, 1 5 1 5, 1 4 6 0, 1 3 1 0, l l l O cnr1
参考例 1 7 化合物 （20)
化合物 (20) は、 次の反応工程に従い合成した。
Figure imgf000057_0001
(81)
Figure imgf000057_0002
Figure imgf000057_0003
3 ' —ヒ ドロキシー 4' —メ トキシ桂皮酸 （化合物 （ 1 3 ) ) 1. 5 1 g (7.78画 ol)をメタノール 3 Om 1とベンゼン 1 05mlの混合溶媒に溶解し、 ト リメチルシリルジァゾメタンの 1 0%へキサン溶液 1 lml (9.6raraol) を加え、 室温で 3時間撹拌した。 トリメチルシリルジァゾメタンの 1 0%へキサン溶液を さらに 2. Oml加え、 1時間撹拌した。 反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 3' —ヒドロキシ— 4' ーメ トキ シ桂皮酸のメチルエステル （化合物 （1 4) ) を 1. 55 g得た （収率 95. 6 %) 。
化合物 （1 4) 1. 55 g(7.44譲 ol)を DMF， 60 m 1に溶解し、 炭酸カリ ゥム 5. 1 4 g(37.2國 ol)および 1 , 3—ジブロモプロパン 3. 78ml (37.2 mmol) を加え、 室温で 1 4時間撹拌した。 水および酢酸ェチルを加え、 酢酸ェチ ル層を抽出した。 酢酸ェチル層を水および飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー
(展開液；へキサン ：酢酸ェチル = 4 ： 1 ) で精製し、 3' — (3—ブロモプロ ピルォキシ） 一 4' —メ トキシ桂皮酸のメチルエステル （化合物 （ 1 5) ) を 1. 90 g得た （収率 77. 6 %)。
化合物 （1 5) 1. 90 g(5.77mmol)を DMF, 1 20 m 1に溶解し、 アジ化 ナトリウム 88 g (28.9画 ol)を加え、 室温で 1 7時間撹拌した。 反応液に飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 酢酸ェチル層を水 および飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 3' 一 （ 3—アジドプロピルォキシ） -4' —メ トキシ桂皮酸のメチルエステル
(化合物 （1 6) ) の粗成物を 1. 8 1 g得た。
'H-NMR ( 1 00MHz. CDC 13 中） 5 (p pm) ： 7. 62 ( 1 H， d, J= 1 5. 8Hz) 、 7. 1 2 ( 1 H, d, J= 7. 9Hz) 、 7. 08
( 1 H, s) 、 6. 86 ( 1 H, d, J = 7. 9Hz) 、 6. 29 ( 1 H, d, J= 1 5. 8Hz) 、 4. 1 2 ( 2 H, t, J= 6. 2Hz) 、 3, 89 ( 3 H, s) 、 3. 79 (3H, s) 、 3. 55 ( 2 H, t, J=6. 6Hz) 、 2. 1 0
(2H, m) 化合物 （ 1 6 ) の粗成物 1. 8 1 gを THF, 6 Om lおよび水， 2 m 1の混 合溶媒に溶解し、 1 N水酸化ナトリウム水溶液 1 1. 5m lを加え、 室温で 1 9 時間撹拌した。 反応液に 2NHC 1を加え、 pH 4にあわせた。 水および酢酸ェ チルを加え、 酢酸ェチル層を抽出した。 酢酸ェチル層を水および飽和食塩水で洗 浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 3' - (3—アジド プロピルォキシ） — 4' —メ トキシ桂皮酸 （化合物 （ 1 7) ) の粗成物を 1. 6 4 g得た。
化合物 （ 1 7) (5.77mmol)を塩化メチレン， 1 5 0m lに溶解し、 4—ニトロ フエノール 1. 3 6 g(9.8隱 ol) 、 トリェチルァミン 2. 7 3m 1 (19.6隱 ol)お よびヨウ化 2—クロ口— 1 —メチルピリジニゥム 2. 5 1 g(9.8mmol) を加え、 室温で 5時間撹拌した。 4一二トロフエノール 722mg(5.2ranol) 、 トリェチ ルァミ ン 1. 4 5m l (10.4mmol)およびヨウ化 2—クロロー 1 一メチルピリジニ ゥム 1. 3 3 g(5.2mmol) をさらに加え、 1 7時間撹拌した。 反応液に飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液を加え、 クロ口ホルムで抽出した。 クロ口ホルム層を飽和 炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧 下除去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （展開液；へキサン ：酢酸ェ チル = 4 ： 1〜2 ： 1 ) で精製し、 3' — （3—アジドプロピルォキシ） 一 4' —メ トキシ桂皮酸の 4一二トロフヱニルエステル （化合物 （ 1 8) ) を 2. 1 5 g得た。 これをさらにエタノールから再結晶して、 化合物 （ 1 8) 2. 0 1 gを 得た （収率 8 1 %) 。
Ή-NMR ( 1 0 0MHz、 CDC 13 中） 5 (p pm) ： 8. 3 0 ( 1 H, d, J = 9. 2 H z ) 、 8. 1 7 ( 2 H, d， J = 9. 2 H z ) 、 7. 8 4
( 1 H, d， J= 1 5. 8 Hz) 、 7. 3 7 ( 1 H, d, J = 9. 0 Hz) 、 7. 1 6 ( 1 H, s ) 、 6. 9 0 (2H， d, J= 9. 2Hz) 、 6. 4 7 ( 1 H, d, J= 1 5. 8 Hz) 、 4. 1 5 ( 1 H, t， J= 6. 2Hz) 、 3. 9 2
( 3 H, s ) 、 3. 5 7 (2H， t, J= 6. 5 Hz) 、 2. 1 2 ( 2 H， m) 6 0 %水素化ナトリウム 1 2mg(0.3國 ol) に DMF, 0. 6 m 1を加え、 さ らに化合物 （ 1 0) 6 0 mg(0.23mmol)の DMF溶液 1. 5m lを加え、 了ルゴ ン雰囲気下、 0でで 2時間攪拌した。 反応液を- 2 0°Cに冷却後、 化合物 （18) 1 24 mg(0.31mmol)の DMF溶液 1. 5 m 1を加え、 一 20~0°Cで 2時間攪 拌した。 反応混合物に 0. 2 M燐酸緩衝液 （pH7) を加え、 酢酸ェチルで抽出 した。 酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒 を減圧下除去した。 残渣をシリカゲル 3 Omlで精製し （展開液； クロ口ホルム ： メタノール =50 : 1) 、 化合物 （1 9) を 77mg得た （収率 65 %)。 'HNMRスぺクトル （270 MHz、 CDC 13 中） 3 (ppm) ： 9. 8 1 ( 1 H, b r) 、 7. 68 ( 1 H, d, J= 1 5. 5Hz) 、 7. 1 1 (1 H, d d， J= 8. 3, 2. 0Hz) 、 7. 0 1 ( 1 H, d, J = 2. 0Hz) 、
6. 8 1 ( 1 H, d, J= 8. 2Hz) 、 6. 66 ( 1 H, d， J= 1 5. 5 Hz) 、 6. 56 (1 H， b r) 、 4. 1 5 (1 H， d, J= 1 1. 2Hz) 、
4. 07 (2H, t , J= 3. 6 Hz) . 4. 06 ( 1 H, m)、 3. 84 (3 H, s) 、 3. 76 (3H, s) 、 3. 50 ( 2 H, t, J= 6. 6Hz) 、 3. 4 6 ( 1 H, m) 、 2. 52 (3 H， s) 、 2. 3 1 ( 1 H, d d, J =
7. 3, 3. 3Hz) 、 2. 05 ( 2 H, m) . 1. 25 ( 1 H, d d, J =
5. 3， 3. 4 Hz)
赤外吸収スペク トル （K B r ) : 209 8, 1 697, 1 622, 1 608, 1 5 1 6, 1 392, 1 263, 1 21 7 cm"1
質量分析 （S IMS) : 5 1 8 (M + H)
化合物 （ 1 9) 1 5mg(0.029誦 ol) を THF, 1. 5m lに溶解し、 トリフ ェニルホスフィン 23mg(0.088隨 ol) を加え、 室温で 0. 5時間攪拌した。 反 応液に水 1. 5mlを加え、 室温で 24時間攪拌した。 反応混合物に飽和炭酸水 素ナトリウム水溶液を加え、 クロ口ホルムで抽出した。 クロ口ホルム層を飽和食 塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去した。 残渣をシ リカゲル 30m 1で精製し （展開液； クロ口ホルム： メタノール： トリエチルァ ミン = 200 ： 1 0 ： 1 ) 、 化合物 （20) を 4mg得た （収率 28 %)。
'HNMRスペク トル （27 0MHz、 DMS 0 - d 6 中） 5 (p pm) ： 7. 75 ( 1 H, d， J= 1 5. 2Hz) 、 7. 54 ( 1 H, b r s) 、 7.4 9 ( 1 H, b r, J = 8. 6Hz) 、 7. 1 8 ( 1 H, d, J= 8. 6Hz) 、 7. 09 ( 1 H, d, J= 1 5. 2Hz) 、 7. 03 ( 1 H, b r) 、 4. 1 5 ( 1 H, b r d, J= 1 1. 2Hz) 、 4. 3 9 ( 1 H， m) 、 4, 27 ( 2 H, t, J= 3. 6 Hz) 、 3. 9 6 ( 3 H, s) 、 3. 8 7 ( 3 H, s) 、 3. 6 1 ( 1 H, m) 、 3. 1 2 ( 2 H， t, J= 7. 2 H z ) 、 2. 6 1 ( 3 H, s ) 、
2. 23 ( 1 H, m) 、 2. 1 6 ( 2 H， m) 、 1. 4 6 ( 1 H, m)
赤外吸収スぺク トル （KB r) : 1 6 4 7, 1 6 1 0, 1 5 1 2, 1 4 5 8, 1 3 94， 1 3 8 5, 1 294, 1 2 1 9 cm一1
質量分析 （S I MS) : 4 92 (M + H)
参考例 1 8 化合物 （X— 2) ： B z 1 0— P E G— A 1 a— P r 0 -化合物 ( 1 2)
参考例 2で得られる化合物 （VIII— 2) 2 1 m g (24.5 mol)を塩化メチレン
3. 5m 1に溶解し、 氷冷下 HONS u， 3. 4mgおよび DCC, 6. 3 m g を順に加え、 2時間攪拌した。 不溶物を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去した。 残渣をピリジン 3. 4m lに溶解し、 氷冷下参考例 1 5で得られた化合物 （12) 9. 9mg(19 mol)をピリジン 2. 0 m 1に溶解した溶液を加えた。 氷冷下
1時間、 次いで室温で 2時間攪拌した後、 溶媒を減圧下除去し、 残渣をシリカゲ ル 1 Om lで精製した （ヮコ一ゲル C一 20 0を用レ、、 展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 0 0 : 1、 8 0 : 1、 6 0 : 1、 4 0 : 1、 20 : 1、 1 0 : 1、 5 ： 1を各々 1 0m 1使用し、 1. 0m 1ずつ分画した） 。 目的画分の溶媒を減 圧下除去し、 B z 1 0— PEG— A l a— P r o—化合物 （ 1 2 ) を 1 0. 0 mg(7.3 mol)得た （収率 3 9 %) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 6 0 (メノレク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f 値 0. 5
'HNMRスぺク トル （5 0 0 MHz， CDC 13 中） （5 (p pm) ： B z 1 0 一 PEG— A l a - P r o部分 7. 3 6 ( 5 H， m， C6 H5 ) 、 5. 1 9
(2H, s， CH2 ) 、 4. 5 0 (2H, b rm, CH2 (P r o) ) 、 4. 1 2 ( 4 H, s , OCH2 ) 3. 6 4 ( 4 n H, b r s, 〇CH2 CH2 ) 、 3. 4 2 (2H, b r， CH2 (P r o) ) , 3. 23 ( 1 H, s, CH(Ala))、 2. 3 7 ( 1 H, b r， CH (P r o) ) 、 2. 0 8 ( 2 H, brm, CH2(Pro))、 1. 1 7 ( 3 H, d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) . 化合物 （ 1 2) 部分 1 1. 5 8 ( 1 H, b r s, 1— NH) 、 9. 4 0 ( 1 H, b r s， 1 ' 一 NH) 、 7. 1 2 ( 1 H, s， H - 7) 、 6. 9 5 ( 1 H， d， J= 2. 3 Hz、 H- 3' ) 、 6. 8 1 ( 1 H, s, H - 4' ) , 4. 4 5 ( 2 H, m， H _ 5) 、 4. 0 8 ( 3 H, s, 7' - OCH3 ) 、 3. 9 2 ( 2 H, t , J = 5. 2Hz， OCH2 ) 、 3. 9 0 ( 3 H, s， 5 ' —〇CH3 ) 、 3. 8 2 (3H， s, 3 - COOCH3 ) 、 3. 6 7 ( 1 H, m, H— 4 a) 、 3. 20 (2H, q, J= 6. 4Hz， CH2 ) 、 2. 63 ( 3 H, s， 2 - CH3 ) 、 2. 3 8 ( 1 H, d d， J= 7. 5, 3. 4 Hz, H - 4) 、 1. 3 7 ( 1 H, t， J= 4. 2 Hz, H- 4 )
赤外吸収スぺク トル （クロ口ホルム中） ： 3 5 9 5， 3 4 5 0， 3 0 1 0, 2 9 0 0, 1 75 0, 1 6 6 5, 1 6 0 8, 1 5 1 5, 1 4 6 0, 1 3 1 0, 1 1 1 0 c m一1
参考例 1 9 化合物 （25) ：
化合物 （25) は、 次の反応工程に従い合成した。
Figure imgf000063_0001
D-Pd 'ΖΗ
OOQ 'nSNOH
HO-|BA-B|V-03d-OzHOsH90 D-pd tZ
Figure imgf000063_0002
0 (IS)
ZHN 〜 εοο2
ΟΟΟΟεΗ
(S) ZHN
cHOO I00002HOSH90 HN
2—プロモェチルァミ ン臭化水素酸塩 3. 1 g (15隱 ol)を塩化メチレン 7 5 m 1に溶解し、 一 4 0^ ^— 5 0°Cに冷却した後、 ベンジルォキシカルボニルクロ ライ ド 2. 6m 1 (18國 ol)を滴下した。 一昼夜にわたり室温まで自然昇温させた 後、 溶媒を減圧下除去し、 酢酸ェチル 5 Om 1および 1 NHC 1 , 5 0 m 1を加 え、 室温で 6時間攪拌した。 酢酸ェチル層を飽和塩化ナトリウム水溶液 5 Om l で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 溶媒を減圧下除去し、 化合物 （2 1 ) を 2. 0 g得た （収率 5 3%) 。
化合物 （ 5 ) 4 9 5 mg(2.0讓 ol) を DMF, 1 0 m 1に溶解し、 無水炭酸力 リウム 5 4 5 mgおよび化合物 （ 2 1 ) 1 0 2 0 mg(4.(kmol) を順に加え、 氷 冷下一昼夜攪拌した。 燐酸緩衝液 （2 0mmo l、 pH7. 0) 1 0 0m l、 次 いで酢酸ェチル 1 0 Om lを加え、 酢酸ェチル層を抽出した。 酢酸ェチル層を飽 和塩化ナトリゥム水溶液で洗浄し、 無水硫酸ナトリゥムで乾燥後、 溶媒を減圧下 除去し、 残渣をシリカゲル 1 0 Om lで精製した （ヮコ一ゲル C一 2 0 0を用い、 展開液はへキサン ：酢酸ェチル = 5 : 1、 4 : 1、 3 : 1を各々 2 0 Om 1ずつ 使用し、 1 0m lずつ分画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフ ィー （キーゼルゲル 6 0 (メルク （株） 社製） 、 へキサン ：酢酸ェチル = 2 ： 1、 尺 値0. 2) で確認しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 化合物 （2 2) を 7 1 3mg(1.7mmol) 得た （収率 8 3%) 。
化合物 （ 2 2 ) 6 6 mg(0.15mmol)に THF， 1. 5m lおよびメタノール 1. 5m 1を加え、 さらに 1 0 %パラジウム炭素触媒 6. 6 mgを加え、 水素気 流中 1 8時間激しく攪拌した。 触媒を 6. 6mg追加し、 さらに 5時間攪拌した。 触媒を濾過し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 化合物 （2 3) (セグメント B) を 3 6mg(0.12瞧 ol)得た （収率 8 2 %) 。
シリ力ゲル薄層クロマトグラフィ一 ：キーゼルゲル 6 0、 クロロホルム ： メタノ 一ル= 5 ： 1、 R f 値 0. 3
参考例 1で得られた化合物 （VIII— 1 ) 1 0 9 mg(0.13國 ol)を塩化メチレン 1. 5m 1に溶解し、 氷冷下 HONS 2 1 mgおよび DCC， 3 8mgを順 に加え、 氷冷下 3時間攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減 圧下除去した。 残渣に塩化メチレン 1 m 1 を加え、 さらに化合物 （ 2 3) 3 4 mg(0.12圆 ol)の塩化メチレン溶液 1 m 1を氷冷下加えた後、 室温まで自然昇温 させて一昼夜攪拌した。 不溶物 （DCU) を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去 し、 残渣 1 92mgを得、 これをシリカゲル 2 Om 1で精製した （ヮコ一ゲル C -200を用い、 展開液はクロ口ホルム： メタノール = 1 00 : 0、 1 00 : 1、 50 : 1、 30 : 1、 20 : 1を各々 20m lずつ使用し、 5 m 1ずつ分画し た） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィー （キーゼルゲル 60 (メ ルク （株） 社製、 クロ口ホルム ： メタノール = 1 0 ： 1、 R f値 0. 4 ) で確認 しながら目的画分の溶媒を減圧下除去し、 化合物 （24) を 891113(0.08國01) 得た （収率 68%) 。 なお、 化合物 （2 1) 〜化合物 （23) の構造は 'HNMRお よび質量分析で、 化合物 （24) の構造は 'HNMRで確認した。
化合物 （ 24 ) 89 m g (79 zmol)に THF， 2mlおよびメタノール 2m l を加えて溶解し、 1 0%パラジウム炭素触媒 1 8mgを加え、 水素気流中 1 5時 間激しく攪拌した。 触媒 9 m gを加え 9時間、 さらに触媒 9 m gを追加し 1 5時 間、 水素気流中で攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除去し、 シリ 力ゲル 1 0m lで精製した （ヮコ一ゲル C— 200を用い、 展開液はクロ口ホル 厶： メタノール = 1 00 : 0、 50 : 1、 30 : 1を各々使用し、 5 m 1ずつ分 画した） 。 目的物画分をシリカゲル薄層クロマトグラフィーで確認しながら目的 画分の溶媒を減圧下除去し、 化合物 （25) を 52mg得た （収率 63%) 。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー ：キーゼルゲル 60 (メルク （株） 社製） 、 クロ口ホルム ： メタノール = 5 ： 1、 R f値 0. 4
'HNMRスぺク トル （500 MHz, CDC 13 中） 5 (ppm) ： PEG— A 1 a—V a 1部分 4. 1 3 ( 4 H, s， 〇CH2 ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s， OCH2 CH2 ) . 3. 23 ( 1 H, s， CH (Al a) ) 、 2. 22
( 1 H， b r q, J= 6. 0Hz, CH (Va l ) ) 、 1. 26 ( 1 H, s， CH (Va l) ) 、 1. 1 7 ( 3 H, d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) . 0. 89 ( 6 H, q, J= 2. 5 H z, CH3 (Va l) ) 、 セグメ ン ト B部
9. 4 0 ( 1 H， b r s, 1 - NH) 、 6. 95 ( 1 H, d, J = 2. 2 Hz, H - 3) 、 6. 82 ( 1 H, s, H - 4) 、 4. 08 ( 3 H, s, 7 - OCH3 ) 、 3. 92 ( 2 H, d, J= 5. 2 H z, OCH2 ) 、 3. 90 (3 H， s, 5 -〇CH3 ) 、 3. 8 5 ( 3 H, s, 2— COOCH3 ) 、 3. 20
(2H, q， J= 6. 4 Hz, CH2 )
参考例 20 KM— 64 1— (PEG— A l a-Va l—セグメント B) ra 参考例 1 9で得られた化合物 （ 2 5) 7. 8mg(7.5 zmol)を塩化メチレン 0. 8m lに溶解し、 氷冷下 HONS uの塩化メチレン溶液 1. 0m l ( 1 m g m 1 ) および DCCの塩化メチレン溶液 0. 9m l (2mgZm l ) を順に加 え、 室温で 3時間攪拌した。 溶媒を減圧下除去し、 残渣に DMSO, 1 m lを加 えた。 これを、 KM— 64 1抗体水溶液 （ 1. 4 7mg/m 1 ) 8m 1に燐酸緩 衝液 1 1. 5m 1を加えた溶液に氷冷下加え、 4 °Cで一昼夜静かに攪拌した。 0. 22〃mのフィルターで不溶物を除去し、 ゲル濾過クロマトグラフィーで抗 体の画分を精製した [カラム：セフアクリル S 2 0 0 (フアルマシア （株） 社 製） 20 0 m 1、 展開液：燐酸緩衝液、 流速： 0. 5m l /分、 1 1. 5 m 1ず つ分画] 。 第 8および第 9画分を回収し、 KM— 6 4 1— (PEG— A l a— Va l—セグメント B) m (0. 34mgZm 1 ) を含有する溶液を得た。
抗体 1分子当りのセグメント Bの結合数は、 参考例 22に記載の方法に従って 酵素処理 （サーモリシン） し、 遊離した H— Va 1—セグメント Bを HP じで 定量することにより算出した。 これにより、 本複合体において、 抗体 1分子当り 1. 9個のセグメント Bが結合していることを確認した。
本複合体が未結合の抗体とほぼ等しい結合力価を有していることを以下に記載 の酵素免疫測定法により確認した。
<酵素免疫測定法 [E L I S A (Enzyme-linked I mm u n o s o r b e n t A s s a y) ] による抗体の結合力価の測定 >
カングリオシド GD 3 ( 2 nm 0 1 ) をフォスファチジルコリ ン （S i gma 社製） 5 n gノコレステロール 2. 5 n gを含有するエタノール 2m 1に溶解し、 20〃 1ずつ 9 6穴の EL I S A用プレート （L i n b r o社） に分注し、 乾燥 させてコー卜し、 1 %牛血清アルブミンを含有する燐酸緩衝液でプロッキングし た。 これに、 上記複合体 （ 1 0〃 g/m 1 , 5 0〃 1 ) を加え、 室温で 2時間 (もしくは 4 で一昼夜） 反応させた後、 第二抗体としてペルォキシダ一ゼ標識 ゥサギ抗マウス I g抗体 （ダコ社） を加え、 室温で 1〜2時間反応させた。 洗浄 後、 ABTS (S i gma社） 溶液を加え、 発色後、 NJ— 200 1 (日本イン 夕ーメッ ド社） で 4 1 4 nmの吸光度を比色測定した。
参考例 21 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
スぺ一サ一一セグメン ト B (モデル側鎖） 結合体を用いた実験 本参考例は、 スぺーサ一一抗癌剤結合体のスぺーサ一部のぺプチド結合が細胞 内で特異酵素によって切断されること、 および血清中でスぺ一サ一部の切断が起 こらないことを、 参考例 1 9で得られた化合物 （25) を用いて説明するもので ある。 本参考例では、 切断酵素としてサーモリシンを用いたセグメント Bの遊離 を以下のように確認した。
燐酸緩衝液で調製した化合物 （25) (0. 2mg/m 1 ) 0. 1 m 1に酵素 溶液 （0. lmg/m l ) 0. 1m l (酵素量 94 p U) を加え、 37°Cで一昼 夜放置した。 逆相 H PLCで上清を分折することにより、 化合物 （25) から遊 離する H— Va 1—セグメント B量を確認した （切断効率 1 00%) 。
逆相 HPLC分析条件；装置： UV I DEC - 1 00 I V分光検出器、 TRIROTAR SR (日本分光 （株） 社製） 、 カラム ： UN I S I L PACK 5 C 1 8 - 1 5 OA (ジーエルサイエンス社） 、 溶離液： 5 OmM酢酸緩衝液 （pH4.5) (1 0-70%のァセトニトリルグラジェント （35分） ) 、 流速： 0. 7ml /分、 検出波長： 300 nm
溶出時間： 39. 0分
質量分析 （S IMS) : 393. 2 (M + H)
ァミノ酸分析： Va i l. 0 (1. 0)
—方、 本参考例のスぺーサ一部分が血清中では切断されないことは、 以下のよ うにして確認した。
燐酸緩衝液で調製した化合物 （25) (0. 2mg/m 1) 0. 1m lにヒ ト 血清 0. 1mlを加え、 37 °Cで 2日間放置した。 上清を逆相 HPLCで上記実 験と同様の分析条件 （ただし、 溶離液は 5 OmM燐酸緩衝液 （pH5. 9) ) で 分析したところ、 セグメント B由来のピークは確認されなかった。
参考例 22 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
抗体ースぺーサ一一セグメン ト B (モデル側鎖） 結合体を用いた実 験
本参考例は、 抗体 -スぺーサ一-抗癌剤結合体のぺプチド結合が細胞内で特異 酵素によって切断されるが血清中では安定に存在することを、 参考例 20で得ら れた抗体—スぺ一サ一一セグメント B結合体を用いて説明するものである。 本参 考例では、 細胞内切断酵素としてサーモリシン、 血中主要蛋白分解酵素としてプ ラスミンを用い、 以下のようにしてスぺーサ一の特異的切断を確認した。
KM— 64 1— (PEG— A 1 a—Va 1—セグメント B) ra (0. 3 3mg / 1 ) 2 5 0〃 1にサーモリシン （ 0. 1 mg/m 1 ) 2. 5 fi 1 (酵素量 2. 4 pU) (または 1 2 0 0に希釈したプラスミン 2. 5 1 (酵素量 25 0〃U) ) および燐酸緩衝液 5. 7 z lを加え、 37°Cで一昼夜放置し、 逆 相 H PLCで上清を分析した。 HP LCの分析条件は参考例 2 1 と同様にして行 つた。
サーモリシンで処理した結合体では、 溶出時間 4 2. 0分に参考例 2 1 と同様 の H— Va 1—セグメント Bのピークを確認したカ^ プラスミンで処理した結合 体ではピークは確認されなかった。 プラスミンは血中の主要な蛋白質分解酵素で あることから、 これらの結果は、 結合体が血中では安定に存在するが細胞内に取 り込まれた際に特定酵素によつて特異的に抗癌剤部分が切断され抗癌活性を発現 することを示すものである。
参考例 23 スぺ—サー部位の酵素特異的切断
スぺーサ一—化合物 （〖 2 ) 結合体を用いた実験
( 1 ) 化合物 （X - 1 ) [B z 1 O-PEG-A 1 a-Va 1一化合物 （12) ] のサーモリシンによる切断
参考例 1 6で得られた化合物 （X— 1 ) 2 0 g ( nmol)を DMS 0, 1 0 1に溶解し、 燐酸緩衝液 9 0 1を加え、 さらにサーモリシン溶液 （2mgZ m l ) 1 0 0 / 1 (酵素量 1. 9 //U) を加え、 37°Cで 5時間放置した。 逆相 HPLCで上清の分析を行い、 化合物 （X— 1 ) (溶出時間： 35. 1分） から の H— Va 1一化合物 （ 1 2) の遊離を確認した （切断効率 78 %)。
逆相 H PLC分析条件；装置は参考例 2 1 と同様。 溶離液： 0. 2 M燐酸水素二 ナトリウム水溶液および 0. 1 Mクェン酸水溶液で調製した pH 4. 8の緩衝液 を 25 %含有する溶液 （ 1 0〜70 %ァセトニトリルグラジェント （ 35分） ） . 流速： 0. 7 m 1 /分、 検出波長： 3 30 n m
溶出時間： 3 1. 6分
質量分析 （S I MS) : 620 (M + H)
ァミノ酸分析： V a 1 1. 0 ( 1. 0)
(2) 化合物 （X— 2) [B z 1 O-PEG-A 1 a -P r o—化合物 （12) ] のプロリンェンドぺプチダーゼによる切断
参考例 1 8で得られた化合物 （X— 2 ) 5 4 g(40nmol)に DMS 0, 2 0 H 1および燐酸緩衝液 3 7 0 \を加え、 さらにプロリンェンドぺプチダ一ゼ溶 液 （ 0. lmgZm l ) 1 0〃 1を加え、 3 7°Cで 2. 5時間放置した。 逆相 HPL Cで分析し、 化合物 （X— 2) からの化合物 （ 1 2) の遊離を確認した
(切断効率 1 0 0%) 。
逆相 HPLC分析条件；装置は参考例 2 1 と同様。 溶離液： 5 OmM燐酸緩衝液
(pH 5. 9) ( 1 0〜70 %ァセトニトリルグラジェント） 、 流速： 0. 7m 1 Z分、 検出波長： 330 nm
溶出時間：'3 0. 6分 （化合物 （ 1 2) と一致）
質量分析 （S I MS) : 52 1 (M + H)
参考例 24 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
抗体ースぺーサ一一化合物 （ 1 2) 結合体を用いた実験 実施例 1 1で得られた化合物 （ l a— 1 1 ) [KM— 6 4 1 — (P E G— A 1 a— Va 1—化合物 （ 1 2) ) ra ] (0. 0 7mg/m 1 ) 74 0 1にサ 一モリシン溶液 （ 0. lmg/m l ) 5. 1 u 1 (酵素量 2 6 U) を加え、 37 °Cで 8時間放置した。 逆相 HPLCで上清を分析し、 化合物 （ I a— 1 1 ) からの H— Va 1—化合物 （ 1 2) の遊離を確認した。 なお、 HPLCの分析条 件は参考例 23 ( 1 ) と同様にして行った。
溶出時間： 3 1. 6分
質量分析 （S I MS) : 620 (M+H)
参考例 2 5 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
スぺーサ一—ァドリアマイシン結合体を用いた実験 ( 1 ) 化合物 XI— 3) (HO— PEG— G l y— Pr o— ADM) のプロリ ン エンドべプチダーゼによる切断
参考例 8で得られた化合物 （XI— 3) 1 4. 3〃g(ll議 ol)を DMSO, 20 1に溶解し、 燐酸緩衝液 21 0〃 1を加え、 さらにプロリンェンドぺプチダ一 ゼ （1. Omgノ ml) 80 / 1 (酵素量 2. 8 U) を加え、 37 °Cで一昼夜放 置した。 逆相 HPLCで上清を分析し、 化合物 （XI— 3) (溶出時間： 23. 3 分） からの ADMの遊離を確認した （切断効率 50 %) 。
逆相 HPLC分析条件；溶離液： 5 OmM燐酸緩衝液 （PH5. 9) ( 1 0〜 70%ァセトニトリルグラジェン ト （35分） ） 、 流速 0. 7 m 1 Z分、 測定波 長 233 nm
溶出時間： 24. 0分 （ADMと一致）
質量分析 （S IMS) : 544. 2 (M + H) (ADMと一致）
(2) 化合物 （XI— 1) (HO-PEG-A1 a-Va 1 - ADM) のサーモリ シンによる切断
実施例 6で得られた化合物 （XI— 1 ) 0. 09mg(10.2nmol)を DMSO, 1 0^ 1に溶解し、 燐酸緩衝液 21 0^ 1を加え、 さらにサ一モリシン （ 1. 0 mg/m 1 ) 8 0 l (酵素量 750 pU) を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 HPLCで上清を分析し、 化合物 （XI— 1 ) (溶出時間： 23. 8分） から の H— Va 1— ADMの遊離を確認した （切断効率 1 00%) 。 なお、 HPLC の分析条件は （1) と同様にして行った。
溶出時間： 25. 2分
質量分析 （S I MS) : 643 (M + H)
参考例 26 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
抗体一スぺ一サ一一ァドリアマイシン結合体を用いた実験
( 1 ) 化合物 （ l a— 3) [NL- 1 - (PEG-G 1 y-P r o - ADM) m ] のプロリンェンドぺプチダーゼによる切断
実施例 3で得られた化合物 （ I a— 3) ( 0. 1 9mgZm 1 ) 35 1にプ 口リ ンエンドべプチダーゼ （ 1. OmgZmD T O z l (酵素量 2. 4 U) お よび燐酸緩衝液 95 u 1を加え、 37てで一昼夜放置した。 逆相 HPLCで上清 を分析し、 化合物 （ I a— 3) からの ADMの遊離を確認した （切断効率 10%)。 なお、 HP LCの分析条件は参考例 25と同様にして行った。
溶出時間： 23. 7分 （ADMと一致）
(2) 化合物 （l a— 1) [NL- 1 - (PEG-A 1 a-Va 1 -ADM) m ] のサーモリシンによる切断
実施例 1で得られた化合物 （ I a— 1 ) (0. 42mg/m 1 ) 50 ^ 1にサ 一モリシン （2. OmgZm 1 ) 50 / 1 (酵素量 0. 9 U) および燐酸緩衝 液 1 0 1を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 H PLCで上清を分析し、 化合物 （ I a— 1 ) からの H— Va 1 一 ADMの遊離を確認した （切断効率 1 00%) 。 なお、 HP LCの分析条件は参考例 25と同様にして行った。
溶出時間： 28. 1分
(3) 化合物 （ l a— 2) [NL— 1 - （PEG - A l a - Pr o-ADM) m ] のプロリンエンドべプチダーゼによる切断
実施例 2で得られた化合物 （ I a— 2) (0. 27mgZm 1 ) 40〃 1にブ 口リ ンエン ドべプチダーゼ （ 1. Omg/ml) 1 1 0〃 1 (酵素量 3. 9 U) および燐酸緩衝液 50 fi 1を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 H PLCで上 清を分析し、 化合物 （I a— 2) からの ADMの遊離を確認した （切断効率 1 0 %) 。 なお、 HP LCの分析条件は参考例 25と同様にして行った。
溶出時間： 23. 9分 （ADMと一致）
参考例 27 スぺーサ一部位の酵素特異的切断
抗体—スぺーサー—化合物 （20)結合体を用いた実験
( 1 ) 化合物 （ l a— 9) [NL - 1— (PEG - G l y— P r o—化合物
(20) ) m ] のプロリンェンドぺプチダーゼによる切断
実施例 9で得られた化合物 （ I a— 9) (1. 2mg/ml) 1 7〃 1にプロ リ ンエン ドべプチダ一ゼ （ 1. 0mg/ml) 80〃 l (酵素量 2. 8U) およ び燐酸緩衝液 53 U 1を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 H PLCで上清を 分析し、 化合物 （ I a— 9) からの化合物 （20) の遊離を確認した。
逆相 HPLC分折条件；装置、 カラムなどは参考例 2 1と同様。 溶離液； 50 mM燐酸緩衝液 （pH7. 0) ( 1 0〜 70 %了セトニト リルグラジェン ト ( 35分） ） 、 流速； 0. 7ml Z分、 測定波長； 330 n m 溶出時間： 26. 0分 （化合物 （20) と一致)
(2) 化合物 （ l a— 7) [NL— 1— (PEG— A l a—Va l—化合物 ( 20 ) ) m ] のサーモリシンによる切断
実施例 7で得られた化合物 （ I a— 7) (1. 1 mgZm 1 ) 1 8〃 1にサー モリシン （3. Omg/m 1 ) 60 / 1 (酵素量 1 · 7 ^U) および燐酸緩衝液
72^ 1を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 H PLCで上清を分析し、 化合 物 （ I a— 7) からの H— Va 1一化合物 （20) の遊離を確認した。 なお、 HP LCの分析条件は （1) と同様にして行った。
溶出時間： 1 7. 7分
( 3 ) 化合物 （ l a - 8) [NL— 1 - （PEG - A l a— P r o -化合物
(20) ) m ] のプロリンェンドぺプチダーゼによる切断
実施例 8で得られた化合物 （I a— 8) (1. 8mg/m 1 ) 1 1 ^ 1にプロ リンエンドべプチダーゼ （ OmgZml) 0 u l (酵素量 2. 8U) およ び燐酸緩衝液 59 1を加え、 37 °Cで一昼夜放置した。 逆相 H PLCで上清を 分析し、 化合物 （ l a— 8) からの化合物 （20) の遊離を確認した。 なお、 HP LCの分析条件は （1) と同様にして行った。
溶出時間： 25. 9分 （化合物 （20) と一致）
参考例 28 化合物 （Ha— 1) ： HO-PEG-A 1 a-Va 1 -OH 参考例 1で得られた化合物 （VIII— 1) 1 00mg(117 mol)を窒素気流中メ 夕ノール 5. 0m lに溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2 Omgを加え、 水素 気流中、 室温で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減 E下除 去し、 HO— PEG— A l a—Va l— OHを 76mg(99 mol)得た （収率
85%) 。
'HNMRスぺク トル （1 00 MHz、 CDC 13 中） 5 (p pm) : 4. 1 2 ( 4 H, s， OCH2 ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s， OCH2 CH2 ) 、 3. 23 ( 1 H, s， CH (Al a) ) 、 2. 23 ( 1 H, b r q, J= 6. 0 Hz, CH (Va l ) ) 、 1. 26 ( 1 H， s, CH (Va l ) ) 、 1. 1 7 (3H, d, J = 2. 8 Hz, CH3 (A l a) ) , 0. 89 ( 6 H, b r d, J= 2. 5 Hz, CH3 (Va 1 ) )
参考例 29 化合物 （Ila - 2) ： HO - PEG - A l a— Pr o - OH
参考例 2で得られた化合物 （VIII— 2) 1 00mg(117 mol)を窒素気流中メ 夕ノール 5. Omlに溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2 Omgを加え、 水素 気流中、 室温で 3時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を減圧下除 去し、 ^10—？£0—八 1 3— ? 1* 0— 0^1を701¾ (91 〃mol)得た （収率
78%) 。
1HNMRスぺク トル （1 00^^ 2、 〇0(： 13 中） 5 ( 11(1) : 4. 40 (2H, b r, CH2 (Pr o) ) , 4. 1 2 ( 4 H, s， 〇CH2 ) 、 3.80 ( 1 H, q, J= 6. 0Hz， CH (A l a) ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, OCH2 CH2 ) 、 3. 5 9 (2H, b r , C H2 (P r o) ) , 2. 3 6 ( 1 H, b r， CH (Pr o) ) 、 2. 02 (2H, b r, CH2 (Pr o) ) . 1. 29 ( 3 H, b r d, J= 3. 5 Hz, CH3 (A l a) )
参考例 30 化合物 （Ila— 3) : HO - PEG— G 1 y— Pr o - OH
参考例 3で得られた化合物 （VIII— 3) 1 00mg(116^mol)を窒素気流中メ 夕ノール 5. 0mlに溶解し、 1 0 %パラジウム炭素触媒 2 Omgを加え、 水素 気流中、 室温で 2時間激しく攪拌した。 触媒を濾別し、 濾液から溶媒を滅圧下除 去し、 HO— PEG— G l y— P r o— OHを 76mg(98 ^mol)得た （収率
85%) 。
1HNMRスぺク トル （1 001^112、 じ0(： 13 中） （5 ( 111) : 4. 40 (2H, b r， CH2 (Pr o) ) . 4. 1 2 ( 4 H, s， OCH2 ) 、 3.82 ( 2 H, s, CH2 (G l y) ) 、 3. 64 ( 4 n H, b r s, 0CH2CH2 ) 、
3. 59 (2H, b r, CH2 (Pr o) ) , 2. 21 ( 1 H, s， CH(Pro))、
2. 02 (2H, b r, CH2 (Pr o) )
産業上の利用可能性
本発明によれば、 毒素と標的細胞に親和性を有する基、 例えば癌特異的な抗体 あるいは抗体フラグメントとをスぺーサーを介して結合させた、 抗腫瘍剤の有効 成分として有用な毒素複合体、 および該複合体を用いる生体外診断法を提供する ことができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基と毒素残基とをポリアルキレ ングリコールおよびジぺプチドを含有するスぺ一サーを介して結合させた毒素複 合体。
2. —般式 （I) Z-fx1-CH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2-W-Y1)_ (I)
(式中、 Zは標的細胞に親和性を有する化合物由来の残基を表し、 X1 は co、 Sまたは
Figure imgf000074_0001
を表し、 Wは単結合または
Figure imgf000074_0002
を表し、 Y1 は毒素残基を表し、 R1 および R2 は同一または異なってアミノ酸 残基を表し、 nは 1〜1 000の整数を表し、 mは 1〜1 00の整数を表す） で 表される毒素複合体。
3. Zが該基内に CO、 N、 Sまたは 0を有する残基であり、 Y1 が該基内に N、 Sまたは◦を有する残基である請求の範囲 2記載の毒素複合体。 ただし、 X1 が Sのとき Zは該基内の COを介して X1 と結合し、 X1 が S以外の基のと き Zは該基内の N、 Sまたは 0を介して X1 と結合する。 また、 Y1 は該基内の N、 Sまたは 0を介して Wまたは R2 と結合する。
4. Zが蛋白質またはべプチド由来の残基である請求の範囲 2または 3記載の 毒素複合体。
5. 蛋白質が抗体または抗体フラグメントである請求の範囲 4記載の毒素複合 体。
6. R1 がァラニン残基、 ロイシン残基またはグリシン残基を表し、 R2 がプ 口リン残基、 バリン残基またはロイシン残基である請求の範囲 2〜5記載の毒素 複合体。
7. Y1 がアドリアマイシン、 ダウノルビシン、 デュオカルマイシン誘導体、 マイ トマイシン A、 マイ トマイシン ( 、 リシン A、 ジフテリアトキシン、 シユー ドモナスェクソトキシン由来の残基である請求の範囲 2〜 6記載の毒素複合体。
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