WO1996024845A1

WO1996024845A1 - Reagent for detecting substances and method for diagnosing rheumatoid arthritis

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Publication number: WO1996024845A1
Application number: PCT/JP1996/000288
Authority: WO
Inventors: Atsushi Sakuraoka; Ikue Aonuma; Yoshitsugu Harada; Yuji Yamada
Original assignee: Eisai Co Ltd; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1996-08-15
Anticipated expiration: 1997-08-10

Description

明細書物質の検出試薬及び慢性関節リゥマチの検知法

本発明は、特定の被検出物質、特に慢性関節リウマチ患者にみられる抗ガラクトース欠損 I g G抗体（ガラクトースを欠損した I g Gに対する抗体）を検出するための検出試薬、慢性関節リウマチの診断薬、及び慢性関節リウマチの検知法に関する。

疾患の鐘別診断を行うための手段としての生体内物質の分析が、臨床検査において広く採用されている。臨床検査においては、その目的によって高感度で精度の高い定量法、及び操作が簡単で短時間で結果が得られる定性法が適宜使い分けられている。このような方法の Γつとして、免疫学的抗原抗体反応を利用した方法が広範に使用されている。

現在、免疫学的抗原抗体反応を利用した簡易定性法としては標識として酵素を用いた酵素免疫測定法（以下、 E I Aと略記することがある）、微粒子を用いた粒子凝集法、凝集阻止法及び有色微粒子を用いた着色法が知られている。着色法のなかではフロースルー法及びィムノクロマトグラフ法（以下ィムノクロマトグラフ法をィムノクロマト法と記載することがある）が最も一般的に知られており、これらの方法を利用した診断試薬が数多市販され、臨床検査に使用されている。以下に両方法について説明する。

フロースルー法は、被検出物質と特異的に結合する反応性物質 1 (抗体 1 ) を膜の一部に固定化した反応性物質固定化膜及び有色微粒子に被検出物質と特異的に結合する反応性物質 2 (抗体 2 ) を固定化した反応微粒子を用いる方法である。フロースルー法は、反応性物質固定化膜により被検出物質を含む検体及び反応微粒子を濾過することにより、膜上で反応性物質 1と反応性物質 2が被検出物質をサンドィツチ状に挟んだ複合体を形成し、このとき微粒子の色調が膜上に認められ、被検出物質の存在が肉眼で確認できるという原理に基づいている。フロースルー法の代表的な方法としては、特開昭 6 3 - 1 2 7 1 6 0号公報に記載された方法等が知られている。以下に市販されている尿中ヒト黄体形成ホルモン（以下、 L Hと略記することがある）検出キット（二ツボンジーン社製）を例に具体的に説明する。なお、本法は別名ィムノフィルタ一法と呼ばれることもあるが、ここではフロースルー法と呼ぶことにする。

まず、二卜ロセルロースメンブレンに抗 L Hモノクローナル抗体 1を塗布し、抗体固定化膜を調製する。一方、赤紫色の色調を有する金コロイド粒子に抗 L H モノクローナル抗体 2を固定化し、 1回使用分ずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥し、検出用金コロイド試薬を調製する。 L Hを含む尿の所定量をバイアル瓶に添加すると、尿により検出用金コロイド試薬は溶液状に復元するとともに、（L H ) 一（抗 L Hモノクローナル抗体 2 ) - (金コロイド粒子）複合体が形成される。バイアル瓶中の（L H ) — （抗 L Hモノクローナル抗体 2 ) — （金コロイド粒子）複合体溶液を抗体固定化聘に滴下すると、滴下液が膜をその厚さ方向に通過する間に、 L Hをサンドイッチ状に挟んだ（膜）一（抗 L Hモノクローナル抗体 1 ) 一（L H ) — （抗 L Hモノクローナル抗体 2 ) — （金コロイド粒子）複合体が形成され、このとき膜上には赤紫色の着色が肉眼で確認できる。尿に L Hが含まれていないときにはサンドィツチ状複合体は形成されず着色は現れない。操作は 2段階で判定までに要する時間は 2分程度であり、簡便、かつ迅速に尿中 L Hを検出することができる。

以上、説明したとおり有色微粒子を用いたフロースルー法は操作時間が短く、操作も簡便で判定も容易な方法である。

ィムノクロマト法は、フロースルー法と同様に反応性物質固定化膜及び反応微粒子を用いる方法である。しかしながら、ィムノクロマト法は、被検出物質を含む検体及び反応微粒子が反応性物質固定化膜上をペーパークロマト法と同様の現象によつて展開し、膜上の反応性物質固定化部位に展開流が到達したときに反応性物質 1 (抗体 1 ) と反応性物質 2 (抗体 2 ) とが被検出物質をサンドイッチ状に挟んだ複合体を形成し、このとき微粒子の色調が膜上に認められ、被検出物質の存在が肉眼で確認できるという原理に基づいている。以下に市販されている妊娠検査薬クリアブルーワンステップ一 S (ュニパス社製）を例に具体的に説明する。

ニトロセルロース膜を短冊状に切断し、一方の末端近くに抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（以下、 h CGと略記することがある）モノクローナル抗体 1を固定し、反応部位を形成させる。次に、乾燥状態の抗 h CGモノクローナル抗体 2固定化青色ラテックス粒子を反応部位とは逆の末端近くに展開流により移動可能な形態で保持させる。青色ラテックス粒子を保持させた側の末端に接触させた吸収パッドに h CGを含む尿検体を直接滴下し、尿検体を吸収パッドから膜に移行させ、更に、胰上を展開させ、青色ラテックス粒子保持部分まで到達させる。このとき展開流中の h CGは、青色ラテックス粒子上の抗 h CGモノクローナル抗体 2と結合し、（h CG) - (抗 h CGモノクローナル抗体 2) — （青色ラテックス粒子）複合体を形成する。この複合体がさらに展開を継続し、反応部位に到達し、複合体中の h CGが抗 h CGモノクローナル抗体 1と反応し、（膜） ― （抗 h C Gモノクローナル抗体 1 ) 一（h CG) - (抗 h CGモノクローナル抗体 2) ― (青色ラテックス粒子）複合体を形成する。このとき、膜上の反応部位に、強い青色の着色が肉眼で確認できる。尿に h C Gが含まれていないときには、反応部位に、サンドイッチ状複合体は形成されないので、強い着色は現れない。操作は、吸収パッドに尿を滴下するだけの 1段階であり、判定までに要する時間は 3 分程度と簡便、かつ迅速である。このように、有色微粒子を用いたィムノクロマト法は操作時間が短く、操作も簡便であり、判定も容易である。

以上のとおり、フロースルー法及びィムノクロマト法は、診断試薬として広範に利用されているか、これらの診断試薬は抗原—抗体の組み合わせのみを利用した診断試薬であって、それ以外の生体内活性物質を用いたものはほとんど知られておらず、特に、リシナスコミニスァグルチニン I (RC A 1 20) を用いたィムノクロマト法及びフロースルー法による診断試薬は存在しない。

ところで、最近注目されている疾患のひとつに慢性関節リウマチ（以下、 RA と略記することがある）がある。 R A患者の血清中にはリウマチ因子（以下、 R Fと略記することがある）と呼ばれる自己免疫抗体が存在し、これはヒト免疫グロブリン G (以下、 I g Gと略記することがある）の F c部位を抗原として認識することが知られている。現在行われている R Aの臨床化学的診断法としては、ゥサギ等の動物 I g G、変性させたヒト I g G又はこれらの F c部位を抗原として固定した微粒子を用いた粒子凝集法、例えば、 R Aテスト（スライド板上のラテックス粒子の凝集の有無によって R Fの定性検出を行う R Aの診断方法）、 R A P A法（R A - particle agglutinationの略：マイクロタイタ一ウエノレ内でラテックス粒子を凝集、沈降ざせ、 R Fを半定量する方法）及び T I A法（Turbid metric i匪 unoassayの略：ラテックス粒子の凝集の度合いを分光学的に測定する R Fの定量法）が採用されている。また、抗原をマイクロプレートウエルに固定化して用いる E I A法により検出されるリゥマチ因子を R Aの疾患マーカーとして用いる方法も採用されている。

現在行われている粒子凝集法及び E I A法を用いたリゥマチ因子の検出による R Aの診断では、健常人の血清を検体として検査した場合でも判定が陽性を示す場合があり、また、肝疾患患者、変形性関節症等のリウマチ様疾患患者血清においても高率で陽性を示し、臨床特異性が劣悪である。更に、真の R A患者に対するこれらの方法の陽性率（以下、臨床的感度ということがある）もそれほど高いものではない。このように従来のリウマチ因子の検出による R Aの診断は、その臨床的感度及び臨床的特異性ともに臨床の現場では有用性が低いことが広く認識されている。しかしながら、これらの他に R Aの診断に用いることのできる臨床化学的方法が存在しないので、汎用されているというのが現状である。

以上記載した問題点に加えて、粒子凝集法においては簡単な操作で、結果が得られるまでに要する時間は 3分から 2時間程度ではあるが、判定には検査実施者の主観が関与するので、正確な判定を行うには検査実施者の熟練が必須である。

E I A法においては操作が繁雑であり、かつ 2時間から 4時間程度の操作時間を要し、判定にも分光光度計、マイクロプレートリーダー等の専用の機器を必要とする。

最近、 R A患者の血清中の I g Gの F c部位に存在する糖鎖について詳細な分折が行われ、その結果、該糖鎖は健常人の血清中の I g Gの F c部位に存在する糖鎖に比較してガラクトース含有量が著しく減少していることが報告されている [ネイチヤー（Nature)、第 3 1 6卷、第 4 5 2ページ、 1 9 8 5年] 。即ち、健常人の血清中の I g Gの F c部位に存在する糖部分は互いに構造の異なる複数の糖鎮から構成されており、糖鎖の種類間の存在比率は個体間でほぼ一定であることが明らかにされた。一方、 R A患者の血清中の I g Gの F c部位における糖部分は、構造の異なる複数の種類の糖鎖から構成されており、糖鎖の種類間の存在比率は、健常人の場合と同様に個体間でほぼ一定であるか、全体にガラクトースの含有量が著しく減少していることが判明した。更に、具体的には、健常人血清中の I g Gの F c部位の糖部分にはガラクトースを各々 2分子、 1分子及び 0分子含む 3種類の糖鎖が約 2 ： 2 ： 1の比率で存在するが、 R A患者血清中の I g Gの F c部位の糖部分ではガラクトースを 2分子含む種類の糖鎖が著しく減少し、全体にガラクトースを欠損した糖鎖が大幅に増加していることが報告されている。従って、この事実に基づけば R A患者血清中の I g Gの F c部位の糖部分には、糖鎖の構造異常があり、この構造異常を把握することが可能となれば、それは R A診断に対する有力なマーカーとなることが期待されていた。

そのため、 R A患者血清中の I. g Gの F c部位の糖鎖についての構造異常を利用した診断方法が、従来法に代わる R A診断法としていくつか提案されている。それらの方法は、その検出対象から 2つに大別される。一つは、 R A患者血清中の I g Gの F c部位の糖鎖中のガラクトース含量が低下することを利用し、血清中の I g Gの F c部位の糖鎖中のガラクトース含量を測定し、健常人のそれと比較し、ガラクトース含量が健常人よりも低い場合に R Aと診断する方法（特開平 3 - 7 3 8 5 7号公報及び特開平 5— 8 7 8 1 4号公報）。他の一つは、 I g G の F c部位の糖鎖の構造異常に対する自己抗体、即ち抗ガラクトース欠損 I g G 抗体が R A患者血清中には存在するという観点から、予めガラクトース欠損 I g Gを調製し、これに対する血清中の抗ガラクトース欠損 I g G抗体を測定する方法である（特開平 3— 4 8 7 0 0号公報）。

これら 2つの方法のうち、血清中の I g Gの糖鎖中のガラクトース含量を測定する方法は、操作が非常に繁雑で反応時間も数時間と長いこと、また、特開平 5 - 8 7 8 1 4号の方法では検体毎に血清中の総 I g G量も同時に測定し、且つシンチレーションカウンタ—を用いなければならず、判定までに複雑なデータの解析を要するという欠点を有し、更に、判定の臨床的感度及び臨床的特異性も満足できるものではなかった。

一方、抗ガラクトース欠損 I g G抗体を測定する方法は、 E I A類似の方法を用い抗ガラクトース欠損 I g G抗体を定量するものであって、その判定の臨床的感度及び臨床的特異性は非常に良好であり、確実な R Aの診断を行うことができる。しかしながら、この方法は、定量法であるため操作が繁雑であり、結果を得るまで 4時間から一夜を要し、分光光度計、デンシトメ—ター等の機器を用いなければならないという欠点があつた。発明の開示本発明は、上記観点からなされたものであり、慢性関節リウマチを正確、簡便、かつ迅速に診断する診断試薬及び方法、及びその他の被検出物質を検出するための検出試薬であって、従来のィムノクロマト法及びフロースルー法を応用することもできる検出試薬を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解するために鋭意研究を行った結果、リシナスコミニスァグルチニン I ( R C A 1 2 0 ) を用いたィムノクロマ卜法及びフロースルー法等の検出方法に用いる検出試薬を完成させ、これを応用してヒト体液中の抗ガラクトース欠損 I g G抗体を簡便に検出する検出試薬及び慢性関節リゥマチの診断試薬を完成させ、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ガラクトース及び/又は yS— N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有する被検出物質を検出するための検出試薬であって、第一の反応性物質が固定化された膜と、第二の反応性物質が固定化された微粒子とを含み、反応性物質の一方がリシナスコミニスァグルチニン Iであり、反応性物質の他方が前記被検出物質に特異的に結合しガラクトース及び^ — N —ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有しない反応性物質である検出試薬である。

また本発明は、抗ガラクトース欠損 I g G抗体を検出するための検出試薬であつて、この検出試薬は膜と微粒子とを含み、膜と微粒子の一方にはリシナスコミニスァグルチニン Iが固定化され、他方にはガラクトース欠損 I g Gが固定化された、検出試薬を提供する。

さらに本願発明は、前記検出試薬からなる慢性関節リゥマチの診断薬；及びガラクトース欠損 I g G及びリシナスコミニスァグルチニン Iの一方が固定化された膜と、他方が固定化された有色微粒子と、被検者から採取した生物学的試料とを反応させるステップと、

試料中に含まれる抗ガラクトース欠損 I g G抗体とガラクトース欠損 I g Gとの結合及びリシナスコミニスァグルチニン Iと抗ガラクトース欠損 I g G抗体に含まれるガラクトースとの結合を介して前記膜上に捕捉された有色微粒子を検出するステップを含む、

慢性関節リゥマチの検知法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

< 1〉被検出物質を検出するための検出試薬

本発明の被検出物質を検出するための検出試薬は、ガラクトース及び/又は/ e 一 N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有する被検出物質を検出するための検出試薬であって、第一の反応性物質が固定化された膜と、第二の反応性物質が固定化された微粒子とを含む。これらの反応性物質の一方がリシナスコミニスァグルチニン Iであり、反応性物質の他方が前記被検出物質に特異的に結合しガラクトース及びー N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有しない反応性物質である。

上記検出試薬は、ガラクトース又は； 8— N—ァセチルガラクトサミンと、これらに特異的に結合するリシナスコミニスァグルチニン Iとの特異的結合をフロースルー法及びィムノクロマト法に利用したものであり、試料中に含まれるガラクトース又はー N—ァセチルガラクトサミンを含有する糖鎖を有する被検出物質とリシナスコミニスァグルチニン Iとの結合、及び被検出物質とこの被検出物質に特異的に結合しガラクトース及び 9— N—ァセチルガラクトサミンを含有する糖鎖を有しない反応性物質との結合、を介して前記膜上に捕捉された有色微粒子を検出することにより、被検出物質を定性的に検出するものである。

以下に、本発明の検出試薬について詳述する。 ( 1 ) 微粒子

微粒子は、被検出物質の存在を肉眼で判定するための標識であり、肉眼判定を容易にするためには有色であることが好ましい。その材質としては、例えばポリスチレンラテックス等の合成高分子もしくはゼラチン等の天然高分子からなる均質な球状粒子、又は金コロイド等の金厲コロイド粒子等の、水不溶性素材が挙げられる。尚、金属コロイド粒子は、その本質的な色があるため着色する必要はない。また、無色であるものは、色素を用いて適宜着色すればよい。微粒子の粒径は、膜の孔径よりも小さくなければならないが、おおむね 0 . 0 1から 5 mの範囲で使用でき、 0 . 0 5から 2〃m程度が特に望ましい。

( 2 ) 膜

本発明に用いられる膜は、被検出物質とリシナスコミニスァグルチニン I との結合を介して上記微粒子を間接的に捕捉するためのものであり、反応性物質を固定化することができ、さらにフロースルー法においては未反応の微粒子を通過させることができ、ィムノクロマト法においてはクロマトグラフィー担体として水溶液中で微粒子を展開することができるものであればよい。材質としては、多孔性の三次元構造膜、例えばナイロン膜、ニトロセルロース膜等が挙げられ、合成又は天然高分子膜のいずれでもよい。また、膜の孔径は反応微粒子が目詰まりをおこさず通過できるサイズであればよいが、 0 . 2から 8 / mの範囲であることが、特に望ましい。

( 3 ) 第一の反応性物質及び第二の反応性物質

第一の反応性物質及び第二の反応性物質の一方は、リシナスコミニスァグルチニン I (以下、「R C A 1 2 0」という）である。 R C A 1 2 0は、ガラクトース及びー N —ァセチルガラクトサミンに特異的に結合する活性を有するヒママメ（リシナスコミニス（Ricinus co匪 unis)) 由来のレクチンであり、例えば、ジエイ 'ユウ 'バエンジャー（J. U. Baenziger) らの方法（ザ' ジャーナル 'ォブ .バイオロジカル.ケミストリー（J. Biol. Chem. )第 254卷第 9795〜9799頁、 1 979年）によりヒママメより精製することによって入手できる。また市販されているものを使用してもよい。尚、 R C A 1 2 0以外のガラクトース又は) 3— N —ァセチルガラクトサミンに特異的に結合するレクチン、例えばリシナスコミニスァグルチニン II (RCA 60) 、カブトムシァグルチニン（A l i o A) 、マツシュルームレクチン（ABA) 、ピーナッツレクチン（PNA) 等も、本発明に用いることができる。これらのうちでは、 RC A 1 20が特に好ましい。

第一の反応性物質及び第二の反応性物質の他方は、 RCA 1 20と組み合わせることにより被検出物質の検出を行うことのできる物質である。この反応性物質は RCA 1 20と結合しないことが必要であり、したがってガラクトース又は一 N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有しないことが必要である。以下、この反応性物質を「ガラクトース欠損反応性物質」という。具体的には、ガラクトース欠損 I gG、ガラクトース及びノ又は )3— N—ァセチルガラクトサミンを含む糖鎖を含有する糖タンパク質に対するガラクトース欠損抗体等である。

(4) 各反応性物質の微粒子及び膜への固定

第一の反応性物質及び第二の反応性物質を微粒子及び膜へ固定する方法は、物理吸着法、化学結合法、その他いずれの方法でもよい。即ち、 RCA 1 20等の反応性物質が微粒子及び膜より脱離しないのであれば、どのような固定化手段を用いてもよい。

尚、以下の記載において、反応性物質を固定した膜を「反応性物質固定化膜」、反応性物質を固定化した微粒子を「反応微粒子」という。

(5) 被検出物質

本発明の検出試薬により検出される物質は、末端にガラクトース及びノ又は^ 一 N—ァセチルガラクトサミンを含有する糖鎖を有する物質であり、 RC A 1 2 0と特異的に結合する物質である。具体的には、抗ガラクトース欠損 I gG抗体、ガラクトース及びノ又は/ S— N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有する糖タンパク質である。このような糖タンパク質としては、サイログロブリン、トランスフヱリン等が挙げられる。

尚、被検出物質が抗ガラクトース欠損 I gG抗体の場合には、前記ガラクトース欠損反応性物質はガラクトース欠損 I gGであり、糖タンパク質の場合にはこの糖タンパク質に対するガラクトース欠損抗体である。

( 6 ) 検出試薬及びその使用法

以下に、上記材料を用いた検出試薬及びその使用方法について説明する。尚、以下の説明では、より具体化するためにフロースルー法を用いたものを例として説明するが、本検出試薬はィムノクロマト法によっても実施することができるものである。ィムノクロマト法を実施する場合には、膜の形状、膜への反応性物質の固定化部位をィムノクロマト法に適合させること、及び反応微粒子を乾燥状態で膜上に保持させることにより実施可能である。

検出試薬は、上記第一の反応性物質が固定化された膜、第二の反応性物質が固定化された微粒子、及び必要に応じて反応容器及び検体希釈用の溶液と洗浄液とを含む。

上記のようにして得られた反応微粒子は、コロイド化学的安定性及び反応性物質の特異結合活性を保持させるため 0 . 0 5から 3 % (w/w)程度のゥシ血清アルブミン、 0 . 0 5から 1 0 % (w/w)程度のポリエチレングリコール等の水溶性髙分子、その他の安定剤、及び防腐剤を含有した緩衝液等に懸濁し、冷所で保管する。また、長期間保管するために懸濁液を凍結乾燥し、検査時に蒸留水等で溶解して使用することもできる。

一方、反応性物質固定化膜は、検体又は反応微粒子の非特異的な吸着を防止するため、 0 . 0 5から 5 % (w/w)程度のゥシ血清アルブミン等でブロッキング処理を行い、乾燥条件下で保存する。

〔反応容器〕

本発明の検出試薬をフロースルー法で使用する場合には、反応に関与する試薬、検体の流速、流量等が安定し、かつ使用が容易であることが好ましい。そのため、反応容器が必要であるが、反応容器は、プラスチック等の素材からなり、各試薬及び検体を容器内に滴下するための窓が配設され、成型された容器、吸収材、反応性物質固定化膜、その他の必要部材から構成される。

吸収材は、試験に使用される各滴下試薬を十分に吸収でき、滴下される各反応試薬及び検体の吸収速度が変動しない性能を有する素材が望ましい。そのような素材として、綿、不織布、據紙、多孔性プラスチック等が好ましいが前記の性能を有するものであればどのような素材であってもよい。また、吸収材のサイズは試験時に滴下される各反応試薬及び検体が完全に吸収されればどのような大きさでも良い。

反応容器内においては、容器内の吸収材上に前記反応性物質固定化膜を載置し、容器内で移動するのを防止するため、これらを容器に固定する。このとき、各反応試薬及び検体を滴下するための窓に、反応性物質固定化膜及び吸収材を固定する位置を適合させる。吸収材と反応性物質固定化膜の間には、これらの接触を完全なものとするためのティッシュ、メッシュ等、また各試薬及び検体の吸収速度の調節のための滤紙等を挟んでも良い。

〔その他の試薬（検体希釈用溶液と洗浄液）〕

本発明の試薬により検出を実施する場合、検体を希釈せずに直接使用してもよいが、半定量的な検査を行う場合、並びに反応性物質固定化膜、反応微粒子の材質、製造法及び性質に応じて必要となつた場合には検体を希釈しなければならない。この場合に用いる検体希釈用溶液としては、生理食塩水、各種緩衝液又はこれらの液に 0 . 0 5から 3 % (w/w)程度のゥシ血清アルブミン又は界面活性剤を添加した液を適宜使用することができる。本発明を適用したフロースルー法において、検体及び反応微粒子懇濁液を滴下した後に用いる洗浄液についても必要な場合には、生理食塩水、各種緩衝液、又はこれらに 0 . 0 5から 3 % (w/w)程度のゥシ血清アルブミン又は界面活性剤を添加した液を適宜使用することができる。

〔検出キット〕

本発明の被検出物質の検出を、使用者が特別な機器の使用、溶液又は試薬の調製を行わずにできるように、必要な溶液、試薬類を一つの包装内に組み入れて検出キットとすることもできる。具体的には、 1包装内に、使用説明書、反応微粒子懸濁液、反応性物質固定化膜を組み込んだ反応容器、必要に応じて検体希釈液及び洗浄液を、任意の測定回数分組み合わせて、検出キットとする。〔使用方法〕

本発明の検出試薬として、上記のような、 R C A 1 2 0を固定化した反応微粒子懸濁液、ガラクトース欠損反応性物質を固定化した反応性物質固定化膜を組み込んだ反応容器、検体希釈用溶液及び洗浄液を含むフロースルー法による検出キッ卜の使用法を以下に説明する。

前記反応容器の窓を通して検体（直接又は検体希釈用溶液にて希釈したもの）を反応性物質固定化膜に滴下し、吸収材に完全に吸収させ、その後 R C A 1 2 0 を固定化した反応微粒子懸濁液を反応性物質固定化膜に滴下し、吸収材に吸収させ、肉眼で膜上の着色の有無を観察する。検体中にガラクトース及び Z又は^ 一 N—ァセチルガラクトサミンを含む糖鎖を含有しガラクトース欠損反応性物質に特異的に結合する被検出物質が存在すれば、膜に固定化されたガラクトース欠損反応性物質に被検出物質が結合し、さらに被検出物質に含まれるガラクトース又は^ 一 N —ァセチルガラクトサミンに R C A 1 2 0が結合し、その結果、微粒子が膜上に捕捉される。

したがって、膜上に R C A 1 2 0を固定化した反応微粒子の着色が認められた場合は被検出物質が検体中に存在し、陽性であると判定し、認められなかった場合は被検物質は存在しない、すなわち陰性であると判定することができる。尚、競合反応では着色が認められなかった場合を陽性と判定することもある。検体の滴下から着色の有無の判定までを 3 0秒から 1 0分程度で行うことができる。操作は 2段階である。検体滴下後及び反応微粒子懇濁液滴下後には洗浄液を滴下しても良い。この場合には操作は 3段階又は 4段階となる。尚、判定後の膜は、乾燥して長期間にわたり着色が変化すること無く保存することができる。

本発明において、フロースルー法は B Z F分離（抗原抗体反応において抗体が結合して生じた結合型： B 0 u n d , Bと、結合していない遊離型： F r e e， Fとを物理的に分離すること）が必要な検出系では特に有効な方法である。しかし、 B / F分離の必要のない検出系、すなわち R C A 1 2 0と被検出物質との特異的結合に影響を与える夾雑物質が実質的に存在しない系では、反応微粒子を乾燥状態で膜の上部に固定し、検体滴下操作により反応微粒子を溶液状態に戻し反応を進める 1段階アツセィ法として実施可能である。また、膜を短冊状に切断し、一方の端に反応性物質を固定化し、他方の端に反応微粒子を乾燥状態で保持させた試験紙を用いるィムノクロマト法でも実施できる。

< 2 >抗ガラクトース欠損 I gG抗体の検出試薬

本発明の抗ガラクトース欠損 I gG抗体の検出試薬は、膜と微粒子とを含み、膜と微粒子の一方には RC A 1 20が固定化され、他方にはガラクトース欠損 I g Gが固定化されている。

膜、微粒子、 RCA 1 20、反応微粒子、反応性物質固定化膜、反応容器、検体希釈用溶液及び洗浄液等については、前記 < 1 >と同様である。本検出試薬においては、被検出物質が抗ガラクトース欠損 I gG抗体であり、反応性物質の一方がガラクトース欠損 I gGであることが特徴である。

本発明の抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬及びこれを用いた検出方法について、フロースルー法を例として説明する。通常の検体である血液試料には、抗ガラクトース欠損 I gG抗体以外のィムノグロプリン、糖タンパク質、多糖類等が多量に存在するために B Z F分離が必要であり、本発明の検出試薬の使用にあたっては、フロースルー法を利用することが好ましい。各反応試薬それぞれの調製方法は前記 < 1 >に準ずる。

CRCA 1 20固定化微粒子懸濁液〕

反応性物質として RC A 1 20を有色微粒子に固定化し、 RCA 1 20固定化微粒子懸濁液とする。

〔ガラクトース欠損 I gG固定化膜〕

反応性物質をガラクトース欠損 I gGとし、ガラクトース欠損 I gG固定化膜を調製する。ガラクトース欠損 I gGは、ヒト I gGを公知の方法（特開平 3— 48700号公報又は特開平 5— 878 1 4号公報参照）に従って、酵素を用いて脱ガラクトシル化処理し、精製し、ガラクトース欠損 I gGを得る。ガラクトースがほぼ除去されたことをイオン交換ク口マトグラフィ一等により確認する。次いで、これをメンブレンフィルタ一等の膜に点着、噴霧又は印刷等の手法で固定し、ガラクトース欠損 I gG固定化膜を調製する。固定する量は、最終の検出試薬の感度等により適宜調整できるが、 0 . 5から 1 0 gの間が、特に望ましい。

〔反応容器〕

プラスチック製の容器に吸収材、ガラクトース欠損 I g G固定化膜を、前記と同様にして組み込み反応容器を作成する。

〔抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出キット〕

本発明の抗ガラクトース欠損 I g G抗体の検出を、使用者が特別な機器の使用、溶液、試薬の調製の必要なく実施するために、必要な溶液、試薬類を一つの包装内に組み入れて検出キッ卜としてもよい。具体的には、 1包装内に、使用説明書、前記 R C A 1 2 0固定化微粒子懸濁液、前記ガラクトース欠損 I g G固定化膜組み込み反応容器、必要に応じて検体希釈液及び洗浄液を、任意の測定回数分組み合わせ、抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出キットとする。

〔抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬の使用法〕

前記抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬を用いて抗ガラクトース欠損 I g G抗体の検出を以下のように実施する。

前記反応容器の窓を通して検体（直接又は検体希釈液にて希釈したもの）をガラクトース欠損 I g G固定化膜に滴下し、吸収材に完全に吸収させ、その後 R C A 1 2 0固定化微粒子懇濁液をガラクトース欠損 I g G固定化膜に滴下し、吸収材に吸収させ、肉眼で膜上に着色の有無を観察する。 R C A 1 2 0固定化微粒子の着色が認められた場合は抗ガラクトース欠損 1 g G抗体が検体中に存在し、陽性であると判定し、着色が認められなかった場合は抗ガラクトース欠損 I g G抗体は存在しない、すなわち陰性と判定する。尚、本抗ガラクトース欠損〗 g G抗体検出試薬で使用される検体（生物学的試料）は、血液（全血）、血清、血漿、唾液及び関節液等である。

〔反応原理〕

前記抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬の使用における反応原理を、図 1 に基づいて以下に示す。図 1では、抗ガラクトース欠損 I g G抗体は I g Gタイプとして便宜的に示されているが、該抗体は I gGタイプに限られるものではなく、他のタイプの抗体であってもよい。

第 1反応では、ガラクト一ス欠損 I gG固定化膜上に検体を滴下し、検体中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体が、膜上でガラクトース欠損 I gGと抗原抗体反応を起こし、（膜）一（ガラクトース欠損 I gG) — (抗ガラクトース欠損 I g G抗体）複合体を形成する。

第 2反応では、該膜に RC A 1 20固定化微粒子を滴下すると、（膜）一（ガラクトース欠損 I gG) — （抗ガラクトース欠損 I gG抗体）複合体中の抗ガラクトース欠損 I g G抗体分子に存在する糖鎖中のガラクトースと RCA 1 20が結合し、（膜） ― （ガラクトース欠損 I gG) — （抗ガラクト一ス欠損 I gG抗体中のガラクトース）一（RC A 120固定化微粒子）複合体が形成され、微粒子の色が見掛上膜上の着色として肉眼で確認できるのである。尚、被検出物質が、慢性関節リゥマチ患者の血清中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体、特に I gGタイブの抗体である場合には、該抗体の多くはガラクト一スを欠損しているが、すベての I gGタイプの抗体がガラクトースを完全に欠損しているわけではなく残存しているものもあるので、 R C A 1 20と結合することができる。

尚、検体中に抗ガラクトース欠損 I gG抗体が存在しないときには RC A 1 2 0はガラクトース欠損 I gGとは結合せず、第 1反応における複合体が形成されないため RCA 1 20固定化微粒子は膜を通過し、着色は確認されない。また、この方法の原理から、着色の濃さの強弱は検体中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体量に応じて変動するため、着色の強度をデンシトメ—タ-、色差計等で測定することにより検体中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体量の定量も可能である。以上のようにして、抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬が提供される。この試薬は 0. 5から 1 0分以内の短時間、かつ 2から 4段階の簡単な操作で、従来の定量法よりも簡便に検体中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体を定性的又は半定量的にも検出することができる。く 3 >慢性関節リゥマチ（R A) 診断試薬

本発明による抗ガラクトース欠損 1 gG抗体検出試薬は、前記のとおり、検体中の抗ガラクトース欠損 I g G抗体を確実に検出できる。ところで、特開平 3— 4 8 7 0 0号公報には、抗ガラク卜一ス欠損 I g G抗体の定量法が、正確に慢性関節リゥマチの診断を行うことを可能にすることが示されている。これらのことから、本発明による抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬を慢性関節リウマチを診断対象として応用すれば、特開平 3— 4 8 7 0 0号記載の発明の定量法と同様に正確な慢性関節リゥマチの診断が可能である。

したがって、本発明による抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬は、慢性関節リウマチ（R A ) の診断試薬として使用することができる。

この抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬を慢性関節リウマチ（R A ) 診断試薬として臨床検査に使用すれば、従来の凝集法はもとより特開平 3— 4 8 7 0 0号記載の発明の定量法と比較しても、正確、簡便、かつ迅速に慢性関節リウマチの診断を行うことが可能であり、慢性関節リゥマチの診断方法として有用である。

< 4〉慢性関節リゥマチの検知法

上記慢性関節リゥマチの診断薬を用いて、慢性関節リゥマチを検知することができる。すなわち、本発明の慢性関節リウマチの検知法は、

ガラクトース欠損 I g G及び R C A 1 2 0の一方が固定化された膜と、他方が固定化された有色微粒子と、被検者から採取した生物学的試料とを反応させるステップと、

試料中に含まれる抗ガラクトース欠損 I g G抗体とガラクトース欠損 I g Gとの結合及びリシナスコミニスァグルチニン Iと抗ガラクトース欠損 I g G抗体に含まれるガラクトースとの結合を介して前記膜上に捕捉された有色微粒子を検出するステップを含むものである。次に試験例を示して本発明を詳述する。

(試験例 1 )

この試験は、本発明の検出試薬を用いた検出方法（本法）と従来の特開平 3 - 4 8 7 0 0号記載の発明の実施例 1〜3に記載の定量法（従来法）との比較をするために行った。

( 1 ) 試料検体

試料検体として前記慢性関節リウマチ（RA) 患者標準血清 [Rheumatoid Fac tor Control/Calibrator：インターナショナル'ェンザィム社製（ INTERNATIONA L ENZYMES, INC. ) カタログ No. 71 1 2, 7 1 1 3, 7 1 1 4, 7 1 1 5, 7 1 1 6， 7 1 1 7] 6検体、慢性関節リゥマチ（RA) 患者臨床検体 8検体、及び健常人血清 3検体の合計 1 7検体を用いた。

( 2 ) 試験方法

1 ) 本発明の検出試薬を用いた検出方法（以下本法と記載する）

後記実施例 1に準じて抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬を調製し、これを用いて抗ガラクトース欠損 I gG抗体を定性的に検出し、反応容器の窓に認められる赤色スポッ卜の有無により、慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性と判定した。

2 ) 従来法

E I A類似の方法に準じて検体中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体を定量した。

E I A類似の方法の操作は、予めガラクトース欠損 I g Gを固定化しプロッキング処理を施してあるプラスチック製のマイクロタイターゥエルを用いた。検体を希釈し、その 1 00 1をゥエルに加え、 2時間ィンキュベー卜する。洗浄後ビォチン標識 RC A 1 20を加え、更に 1時間ィンキュベー卜する。洗浄後ァビジン標識西洋ヮサビペルォキシダーゼを加え 1時間インキュベートし、洗浄後、基質を 30分間反応させ発色を行った。マイクロタイターゥエル内の発色の濃度を市販のマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用いて測定した。吸光度に希釈倍率を乗じたものを定量測定値とした。定量法による測定値のカツトォフ値を 1 00とし、 1 00未満を慢性関節リウマチ（R A) 陰性、 1 00以上を陽性と判定した。

前記 1 7検体を用い、前記 1 ) の本法及び前記 2) の従来法により、各検体をそれぞれ試験した。詳しくは、本法により、慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性を各検体について判定した後、つづいて、従来法により、本法にて慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性となった各群毎に、その各検体について、慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性を各検体について判定した。

( 3 ) 試験結果

この試験の結果は、表 1に示すとおりであり、表 1は、ロバ一ト ·エッチ . フレツチヤ一（Robert H. Fletcher)ら著（久道茂ら訳）、「臨床のための疫学」の第 59ページ図 3— 4 (医学書院、 1 986年）を参考にしてまとめたものである。本法により慢性関節リウマチ（RA) 陽性と判定された群を第 1行に示し、この中で、従来法によっても陽性と判定された検体数を第 1欄に示すとともに、従来法によって陰性と判定された検体数を第 2欄に示した。同様に、本法により慢性関節リウマチ（RA) 陰性と判定された群を第 2行に示し、この中で、従来法によって陽性と判定された検体数を第 1欄に示すとともに、従来法によっても陰性と判定された検体数を第 2櫊に示した。さらに、本法による慢性関節リウマチ（RA) の判定結果の合計を第 3檲にまとめて示すとともに、従来法による慢性関節リウマチ（RA) の判定結果の合計を第 3行にまとめて示した。

表 1から明らかなように、前記 1 ) の本法及び前記 2) の従来法について、慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性の判定結果を比較した結果、本法により慢性関節リウマチ（RA) 陽性のものは、そのまま従来法によっても陽性であり、本法により陰性のものは、そのまま従来法によっても陰性であって、その判定結果の一致率は 1 00%であった。

前記 2) の従来法では、操作が繁雑で 4時間半も要したが、本発明の検出試薬を用いた検出方法（本法）による抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬の操作段階数は検体滴下及び R C A 1 20固定化微粒子懸濁液の滴下のみの 2段階であつて操作が簡便あり、検体の滴下から判定までに要した時間は 2分と迅速であつこの結果から、本発明の抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬を使用した慢性関節リウマチ（RA) 陽性又は陰性の判定が、従来の定量法と良く一致したことから、本発明の試薬は、ヒト血清中の抗ガラクトース欠損 1 gG抗体を正確、かつ迅速に検出することが明らかである。従って、慢性関節リウマチ（R A ) の診断、を正確、簡便、かつ迅速に実施できることが判明した。

図面の簡単な説明図 1は、本発明における反応原理を示す概念図である。

図 2は、本発明の一実施例の検出試薬を示す平面図である。

図 3は、図 2に示した検出試薬の A— A ' 面における断面図である, 発明を実施するための最良の形態次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例限定されるものではない。実施例 1 R C A 1 2 0を用いたフロースルー法用の抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬及びこれを用いた検出方法の例く 1〉ガラクトース欠損 I g Gの調製

公知の方法（特開平 3— 4 8 7 0 0号公報）により次のとおり調製した。

ヒト I g G夕ンパク 1 0 m g 1を 0 . 1 M酌酸バッファー（： p H 5 . 0 ) 中でシァリダーゼ処理（5 0 OmUZm 1 ) し、 0. 1 Mクェン酸一リン酸バッファー（p H 7. 0) を加え、 /S—ガラクトシダーゼ（ 1 0 O mUZm 1 ) で処理した。これらの酵素処理後、該酵素処理溶液量の 1 0倍量のグリシンバッファ一（ 1. 5 Mグリシン一塩酸、 3 M塩化ナトリウム、 p H 8. 9。以下、結合バッファーと略記することがある）を加え、酵素処理溶液中に含まれている B S A、シァリダーゼ、 β— ϋラウトシダーゼ等を除去する目的で、 Protein C -Sephar ose CL-4Bを用いて該酵素処理溶液中からガラクトース欠損 I g Gを精製した。即ち、予め結合バッファーで平衡化しておいた Protein C -Sepharose CL-4BC1 x 7.8CIB)に該酵素処理試料を添加し、十分にカラムを結合バッファ一で洗浄し、その後、 0. 1 Mグリシン—塩酸（p H 3. 0 ) によりガラクトース欠損 I g G を回収した。尚、回収の際には、ガラクトース欠損 I £〇を }13. 0の状態に長時間放置するのを回避するために分画容量と同量の結合バッファーを、予め、ガラクトース欠損 I g G回収用のフラクションチューブに入れた。回収後、ガラクトース欠損 I g Gはリン酸バッファー（ 1 O mMリン酸塩、 0. 1 5 M塩化ナトリウム、 p H 7. 2 ) に対し十分透析した。

< 2〉ガラクトース欠損 I g G固定化膜の調製法

前記く 1 〉で調製したガラクト一ス欠損 I g G ( 5 m g/m 1 ) を孔径 3 μτη のニトロセルロース膜（ァドバンテック社製）にマイクロピぺットを用いて 1 g点着して固定した。十分に乾燥させ、のち非特異的な吸着を避けるためにプロッキングバッファー（ 5 0 mM卜リス一塩酸、 0. 1 5 M塩化ナトリウム、 0. 1 %B S A (w/w) 、 p H 8. 0。以下単にブロッキングバッファーと記載する）でプロッキングを行い、十分に乾燥させてガラクトース欠損 I g G固定化膜を得た。

< 3 >R C A 1 2 0固定化微粒子の調製法

R CA 1 2 0 ( 2. 5 m g/m ホーネンコーポレーション社製）をトリスバッファー（ 5 0 mMトリス—塩酸、 p H 8, 0 ) で l m g/m lの濃度に希釈した。この溶液 0. 9 m lに、粒径 0. 3 /mの赤色カルボキシル化ラテックス (固形分濃度 1 0 %、日本合成ゴム社製）を 1 0 0〃 1加え、 4 5°Cで 6 0分間損拌し、遠心分離（8000 r pmで 30分間）し、沈渣に 1 m 1の前記トリスバッファーを加えて分散させ、再び遠心分離（8000 r pmで 30分間）し、沈渣を 200 m lの 0. 1 %の83八、 0. 1 5 M塩化ナトリウム及び 0. 02 %アジ化ナトリゥムを含むトリスバッファー（ 50 mMトリス一塩酸、 p H 8. 0 ) に分散させ、 R C A 1 20固定化微粒子懸濁液を得た。

< 4〉反応容器の組み立て

2. 5 cmx 2. 5 c mx 1. 0 c mの立方体形状であって、試薬滴下部分に直径 0. 5 cmの円形の窓 2のあいたプラスチック容器 1に、適当な大きさに切り出した脱脂綿 3を組み入れ、そこに 1 cm四方に切断した濂紙 No. 6 (アドバンテック社製）（4) を載置し、その上に 1 cm四方に切断した前記ガラクトース欠損 I gG固定化膜 5を、ガラクトース欠損 I gG点着部分を容器の窓に配置し、固定し、反応容器を得た（図 2、図 3) 。

< 5 >抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬の組み立て

前記 RCA 1 20固定化微粒子懸濁液、及び前記ガラクトース欠損 I gG固定化膜組み込み反応容器を組み合わせて抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬を得た。

< 6〉抗ガラクトース欠損 I g G抗体検出試薬を用いた検出方法（フロースルー法）の実施

健常人血清及び R A患者標準血清 [Rheumatoid Factor Control /Calibrator：インタ—ナショナル ·ェンザィム社製（INTERNATIONAL ENZYMES, INC. ) カタログ N o. 7 1 1 2 ] を各 1 00 1マイクロピぺッ卜で採取し、それぞれ前記抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬の反応容器の窓に滴下した。試料を完全に吸収させ、直ちに前記抗ガラクト一ス欠損 I gG抗体検出試薬の RCA 1 20固定化微粒子懸濁液 200 ^ 1をそれぞれの反応容器に滴下し、前記懸濁液を吸収させた後、肉眼で着色の有無を確認した。その結果、健常人血清を滴下した反応容器の窓では、白色のニトロセルロース膜の色が何等変わること無く、着色は認められず陰性と判定された。一方、 RA標準血清を滴下した反応容器の窓には、赤色のスポッ卜が、明瞭に認められ、 R&性と判定された。操作は、検体滴下及び RCA 1 20固定化微粒子懸濁液の滴下の 2段階であり、極めて簡便であった。また、検体の滴下から判定までに要した時間は 2分であり、迅速であった。

以上のとおり、本発明により、 RC A 1 20を用いたフロースルー法用の抗ガラクトース欠損 I gG抗体検出試薬が提供される。

実施例 2 RCA 1 20を用いたィムノクロマト法用のサイログロプリン検出試薬及びこれを用いた検出方法の例

< 1 >ガラクトース欠損抗サイログロプリンモノクローナル抗体の調製法前記実施例 1の < 1 >の方法に準じて、ヒ卜 I g Gタンパクを 1 1 0量の抗サイログロブリンモノクローナル抗体に置き換えて処理を行った。即ち、抗サイログロブリンモノクローナル抗体 [Anti Thyroglobulin(Mono)：バイオメダ製] の 1 mgをシァリダーゼ及び/ S—ガラクトシダーゼで処理し、ガラクト一ス欠損抗サイログロプリンモノクローナル抗体を調製した。

< 2 >ガラクトース欠損抗サイログロプリンモノクローナル抗体固定化金コロイドの調製法

金コロイド（Gold colloid, Era GC 10 ：バィォセル社製）をトリスバッファ一 (50mMトリスー塩酸、 pH 8. 0) で希釈し、 540 n mにおける光路長 1 cmの吸光度を 1. 0に調整した液 20m 1に、前記 < 1 >で調製したガラクトース欠損抗サイログロブリンモノクローナル抗体 0. 9 mgを混合し 45°Cで 6 0分間攬拌した。これを 50, 000 gで 20分間遠心分離し、上清を注意深く除去し、赤紫色のペレツト状の沈渣を、 20m lの前記トリスバッファーに分散させた。更に、この分散液を同じ条件で遠心分離し、沈渣を 5m 1の 0. 1 %B SA及び 1 0%ショ糖を含む前記トリスバッファーで再分散し、ガラクトース欠損抗サイログロブリンモノクローナル抗体固定化金コロイド歷濁液を得た。く 3〉試験紙片の調製法

孔径 3 / mのニトロセルロース膜（ァドバンテツク社製）を幅 0 . 5 c m、長さ 6 c mの短冊状に切断し、短冊の端から 1 c mの位置に R C A 1 2 0 ( 2 . 5 m g Zm l、ホーネンコーポレーション社製）をマイクロピぺットを用いて 1 n g点着し、風乾させた。のち非特異的な吸着の影響を避けるためにブロッキングバッファーに短冊を浸潰した。十分に乾燥させた短冊の R C A 1 2 0塗布部分とは逆の端から 1 c mの位置に 3 0 %ショ糖を含む前記トリスバッファーを 2 0 0 β し、着し、乾燥させた。ショ糖塗布部分の上から、ガラクトース欠損抗サイログロブリンモノクローナル抗体固定化金コロイド懸濁液を 5 0 1点着し、風乾させ試験紙片を得た。

< 4〉サイログロプリン検出試薬の組み立て

セルロイドの板を幅 0 . 5 c m、長さ 6 c mの短冊状に切断し、前記試験紙片を重ねあわせて接着剤あるいは両面テープを用いて接着した。さらに、前記試験片の金コロイドを塗布した側の末端に、幅 0 . 5 c m、長さ 2 c mに切断した據紙を検体保持用の吸収パッドとして接着し、サイログロブリン検出試薬を得た。

< 5〉サイログロプリン検出試薬を用いた検出方法（ィムノクロマト法）の実施サイログロブリン（Thyroglobulin, Human：ケミコン社製）を前記トリスバッファーで希釈して 1 ju g/mlに調整したサイログロプリン溶液及び前記トリスバッファーを検体として、サイログロブリン検出試薬の吸収パッドを検体に直接浸漬し、十分に検体が吸収されたことを確認し、その後サイログロブリン検出試薬を水平に保ち静置した。検体がペーパークロマト法と同様の現象により展開し始め、これとともに乾燥状態のガラクトース欠損抗サイログロプリンモノクローナル抗体固定化金コロイドも展開し、展開流が R C A 1 2 0塗布部分に到達したとき、トリスバッファーを検体としたものでは着色は見られず、金コロイドは通過してしまうが、サイログロブリン溶液を検体としてものでは、赤紫色の着色が認められた。操作は、検体に吸収パッドを浸漬する 1段階と簡便であり、判定までに要した時間は 4分程度と簡便、かつ迅速にサイログロプリンを検出することができ以上のとおり、本発明により、 RC A 1 20を用いたィムノクロマト法用のサイログロプリン検出試薬が提供される。産業上の利用可能性本発明が有する産業上利用できる効果は次のとおりである。

( 1 ) 被検出物質を正確にかつ簡便、迅速に検出することができる検出方法に用いる検出試薬が提供される。

(2) ヒト体液中の抗ガラクトース欠損 I gG抗体、又はガラクトース及び/又は — N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有する糖タンパク質を、従来の定量法と比較して迅速にかつ簡便に検出する検出試薬が提供される。

(3) 慢性関節リウマチの診断を正確にかつ簡便、迅速に行える診断試薬が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . ガラクトース及び/ ^又はー N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有する被検出物質を検出するための検出試薬であって、第一の反応性物質が固定化された膜と、第二の反応性物質が固定化された微粒子とを含み、反応性物質の一方がリシナスコミニスァグルチニン Iであり、反応性物質の他方が前記被検出物質に特異的に結合しガラクトース及び^— N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有しない反応性物質である検出試薬。

2 . 被検出物質が抗ガラクトース欠損 I g G抗体であり、ガラクト一ス及び S - N一ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鎖を有しない反応性物質がガラクトース欠損 I g Gである請求項 1記載の検出試薬。

3 . 抗ガラクトース欠損 I g G抗体を検出するための検出試薬であって、この検出試薬は膜と微粒子とを含み、膜と微粒子の一方にはリシナスコミニスァグルチニン Iが固定化され、他方にはガラクトース欠損 I g Gが固定化された、検出試薬。

4 . 膜に抗ガラクトース欠損 I g Gが固定化され、微粒子にリシナスコミニスァグルチニン Iが固定化された請求項 3記載の検出試薬。

5 . 被検出物質がサイログロプリンであり、ガラクトース及び ;3— N—ァセチルガラクトサミンを末端に含有する糖鏆を有しない反応性物質がガラクトース欠損抗サイログロプリン抗体である請求項 1記載の検出試薬。

6 . 請求項 3又は 4記載の検出試薬からなる慢性関節リゥマチの診断薬。

7 . ガラクトース欠損 I g G及びリシナスコミニスァグルチニン Iの一方が固定化された膜と、他方が固定化された有色微粒子と、被検者から採取した生物学的試料とを反応させるステップと、

慢性関節リゥマチの検知法。