WO1996015235A1

WO1996015235A1 - Stably preservable reverse transcriptase composition

Info

Publication number: WO1996015235A1
Application number: PCT/JP1995/002304
Authority: WO
Inventors: Fumitomo Odawara
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-11-11
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 1996-05-23
Anticipated expiration: 1997-05-11
Also published as: US5935834A; DE69532717D1; EP0791650B1; EP0791650A1; EP0791650A4; JPH08131171A; DE69532717T2

Description

明細書

保存安定化逆転写酵素組成物

技術分野

本発明は、新規な保存安定化逆転写酵素組成物に関する。更に詳細には、本発明は、逆転写酵素と、トレハロース及び逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽イオンを生じうる金属塩の安定化有効量を含んでなる保存安定化逆転写酵素組成物に関する。本発明はまた逆転写酵素に、安定化有効量の、トレハロース及び逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1種の有機安定剤の安定化有効量、並 άに水溶液中で 2 価陽イオンを生じうる金属塩の安定化有効量を添加することを特徴とする逆転写酵素の保存安定化方法に関する。

本発明によれば、従来、安定性を維持するために— 2 0 〜 — 8 0 °Cの低温で保存しなくてはならなかった逆転写酵素を少なくとも 4 °Cで長期間保存することができる。また、このように逆転写酵素を安定に保存できる温度が比較的高いことから、酵素組成物溶液の粘度が低下する。従って、所望の酵素活性に相当する量を正確に分注することができ、高い再現性でもって実験を行うことができる。

本発明の保存安定化逆転写酵素組成物は、遺伝子工学及びウィルス学の分野において逆転写酵素を用いる様々な技術に極めて有用でぁリ、特に、現在一般に用いられている、逆転写酵素活性を指標にしてウィルスを定量する方法において、ウィルス量のスタンダ一ドとして有利に用いることができる従来技術

逆転写酵素は、 R N Aを铸型として、これと相補的な塩基配列の D N Aを合成する活性を有する酵素であり、近年の分子生物学の発展とともに知られるようになった。例えば、ァビアンミエロブラストウイノレス（Av i an Mye lob l as t Vi rus ： A M V ) 、ラスァソシェ一テツドウイノレス 2型（Ras

Assoc i at ed Vi rus Ty e 2 ： R A V - 2 ) 、マウスモロニ一ミュリーンリューケミアウイノレス（Mouse Mo 1 ony Mur ine Leukemi a Vi rus ： M ~ M u L V ) 、ヒト免疫不全ウイノレス 1 型 (Human Immunodef f i c i ency Vi rus Type 1 ： H 1 V— 1 ) 由来の逆転写酵素は、市販されておリ、容易に入手できる。

また、研究分野では、逆転写酵素は、直接ウィルスから酵素を分離することによって容易に入手でき、例えば、ヒト免疫不全ウイノレス 2型 (Human Immunode f f i c i ency Vi rus Type 2 : H I V— 2 ) 、ヒト Tセルリューケミアウィルス 1 型 (Human Tce l l Leukemi a Vi rus Type 1 ： H T L V - 1 ) 、サルエイズウイノレス（ S I V ) 、ネコエイズウイノレス（ F I

V ) 、ラウストリ肉腫ウィルスなどのレトロウイノレス粒子をトリトン X — 1 0 0 ( T r i t o n X - 1 0 0 ) (米国シグマ社製）等の界面活性剤で処理することによって簡単に調製できる。これら逆転写酵素は、メッセンジャー R N Aょリ c D N Aを合成する際の転写用酵素として多用されている。

また、逆転写酵素は、この他にも、最近最も一般的に用いられる核酸增幅技術である P C R (polymerase chain react ion) 法においても用いられる。 P C R法とは具体的には、耐熱性 D N Aポリメラ一ゼ、 2種類の特異的ブライマーを用い、温度の上下の繰リ返しによって対象となる 1 種類以上の核酸を D N Aポリメラーゼ反応とァニーリングを繰リ返しながら対象を特異的に增幅反応を行わせる手法である。この際、 D N Aポリメラーゼの反応特異性は D N Aに特異的であるため、対象検体が R N Aの場合は、検体の前処理として逆転写酵素によって一度 D N Aに変換してから上記增幅反応を行わせる R T— P C R (reverse transcri t ion- polymerase chain react ion) 法を Ττわなければならす、逆転写酵素は研究対象が R Ν Αの時には必須であり、特に最近 H I V、 H C Vなどのウィルス量を R N A量として定量する研究やその定量用キットが増加してぉリ、産業上重要な酵素である。

また、他の核酸增幅技術として L C R ( 1 i gas e chain react ion) 法においても逆転写酵素が使用される。 L C R法とは具体的には、上記 P C R法の耐熱性 D N Aポリメラ一ゼの代わりに耐熱性 D N A リガーゼを用い、 P C R法と同様の温度の上下でァニーリングとリガーゼ反応を繰リ返して核酸増幅を行わせる手法である。この手法も、 D N A リガ一ゼ反応特異性が D N Aに対して特異的であるため、研究対象が R N Aの時は、検体の前処理として逆転写酵素によって一度 D N Aに変換してから上記增幅反応を行わせる R T— L C R法を行わなければならず、上記 P C R法と同様逆転写酵素は必須の酵素である。

また、逆転写酵素は、 N A S B A (nuc leic ac id sequence based ampl i f icat ion) 法などに代表される核酸 i曽幅技術に必要な試薬としても用レ、られている。 N A S B A法とは具体的には、逆転写酵素、 D N Aポリメラーゼ、 R N a s e H と 2種類のプライマーを用いて酵素のカスケード反応によって常温で対象の核酸を增幅させる方法である。この方法は增幅のために逆転写酵素が必須である。

一方、ウィルス学の分野では、逆転写酵素を標準物質として、ウィルス中に含まれる逆転写酵素活性によってウィルスを定量することが、一般的に行われている。測定される逆転写酵素の由来としては、例えば、ヒト免疫不全ウィルス 1 型

(Human Immunodef f i ciency Vi rus Type 1 ： H I V— 1 ) 及び 2型 (Human Immunodef f iciency Vi rus Type 2 ： H I V— 2 ) 、ヒ卜 Tセノレリュ―ケミアウイノレス 1 型（Human T cel l Leukemia Vi rus Type 1 ： H T L V— 1 ) 、サルエイズウィルス（ S I V ) 、ネコエイズウイノレス（ F I V ) 、ラウス卜リ肉腫ウイノレスなどのレ卜ロウイノレスを挙げることができる。

これら逆転写酵素は、通常、例えば N a C l や M g C l ₂ のような 1価あるいは 2価の金属塩、並びに、例えばメルカブトエタノールゃジチオスレィトールなどの S H保護剤、そして、 5 0 v / v %程度の高濃度のグリセロールを加えた緩衝液中で一 2 0 °Cから一 8 0 °Cの間で保存されている。

この逆転写酵素の反応を通常 3 7 °Cで行うにあたって、従来は、 — 2 0〜一 8 0 °Cの冷却装置内から酵素が不安定となる 4 °C以上の室温に酵素容器を取り出し、必要量を分取した後にまた、一 2 0 °Cから一 8 0 °Cの冷却装置内に戻す方法をとっていた。しかし、この方法では、取扱い時において、酵素が不安定となる温度状態におかれる時間が長いため、使用を重ねるに従って活性が失活してしまい、結果として一定の活性を長期間得ることが困難である。また、前記使用方法による酵素の失活を避けるために、一 2 0 8 0 °Cの冷却装置内で短時間のうちに酵素を分取し、直ちに反応させる方法を行われてきた。しかしこの方法では、酵素溶液が極度に冷却されているために粘度が高く、所望の酵素活性に相当する量を正確に分注することができなかった。また、安定剤としてのメルカブトエタノールなどの S H保護剤の放つ悪臭により、使用者への悪影響が少なからず存在した。

また、（ r A) _n ( d T ) , ₂-, 8 のテンプレート 'プライマ —のハイブリッド体を用いる逆転写酵素の安定化方法 [Bioc h em i c a 1 and Bio - phys ica l Research Communicat ions V o 1 1 6 7 , ( 2 ) ， p p 6 7 3 ( 1 9 9 0 ) ] が知られているが、 4 °C、 3 0 0時間での残存活性が 7 0 %と低く、十分な安定化効果を示したものではなかった。

以上のように、これまで、逆転写酵素を用いて実験を行う場合、酵素が不安定なため再現性のよい実験研究を行うことが困難であった。

近年 H I V感染症の急増によリ、ウィルス定量のために逆転写酵素活性を測定する機会が急増している。逆転写酵素はこのときのウィルスを定量するためのスタンダ一ドとして用いられているが、逆転写酵素が不安定なために多くの検体を再現性よく測定することは困難である。そして、逆転写酵素を用いた分子生物学の研究が長期にわたる場合など、 1 つの酵素容器から何度か分取を繰り返すに従い残リの酵素が失活してしまうため、そのような残余の酵素を捨て、再度購入もしくは再調製を行わなければならず、多大なる労力及びコス卜がかかリ、研究を時間、労力、及び費用の面で圧迫してきた。

一方、安定性を改善するために液状よりもさらに安定な凍結乾燥品とすることが考えられるが、従来の保存方法では、逆転写酵素の保存溶液がグリセロールを高濃度で含んでいるため凍結乾燥品とすることが困難でぁリ、結局、長期間の安定性を得ることはできなかった。逆転写酵素の安定性を向上させ、少なくとも 4 °Cにおける長期安定性が得られるならば、一 2 0 〜一 8 0 °Cの保存を行うための特別な冷却装置が不要となリ、また前述の研究コストの低減化をはかることができる。

また、安定に保存できる温度を比較的高くできれば、酵素組成物溶液の粘度を低下させ、所望の酵素活性に相当する量を正確に分注できるようになリ、逆転写酵素を用いた実験の再現性を高めることが可能となる。特に、現在一般に用いられている、逆転写酵素活性を指標にしてウィルスを定量する方法において、逆転写酵素をウィルス量のスタンダードとして用いることが可能になる。そして、再現性の良い実験結果が得られれば、近年の検体数の増加に対応できるようにもなる。

従って、逆転写酵素を用いる様々な技術において、低コストで再現性のよい結果を得るために、逆転写酵素の保存安定性を向上させることが強く望まれている。

発明の概要

本発明者らは上記問題を解決すべく、更に鋭意研究を行つた結果、意外にも、逆転写酵素に、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種の有機安定剤と、水溶液中で 2価陽イオンを生じうる金属塩とを組み合わせて添加することにより、得られる逆転写酵素組成物が、少なくとも 4 °Cで極めて安定であることを見出し、本発明を完成した。

従って、本発明の 1 つの目的は、従来に較べ比較的高い温度で、長期にわたって活性が維持されることから、経済的でぁリ且つ再現性のよい測定結果を得ることが可能な保存安定化逆転写酵素組成物を提供することにある。

本発明の他の 1 つの目的は、上記した効果を得るための、逆転写酵素の保存安定化方法を提供することにある。

本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる発明の詳細な説明

本発明の 1 つの態様によれば、逆転写酵素と、トレハロース及び逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽イオンを生じうる金属塩の安定化有効量を含んでなる保存安定化逆転写酵素組成物が提供される。更に、本発明の他の 1 つの態様によれば、逆転写酵素に、トレハロース及び逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽イオンを生じうるの金属塩の安定化有効量を添加することを特徴とする逆転写酵素の保存安定化方法が提供される。

本発明において用いられる逆転写酵素は、レト口ウィルスなどから得られる R N Aから c D N Aを合成しうる能力を有する酵素を含むものであれば何ら限定されるものではなく、例えば、アビアンミエロブラストウイノレス（Av i an

Mye lob l ast Vi rus) 、ラスァソシェ一テッドウィルス 2 型

(Ra s Assoc ia t ed Vi rus Type 2) 、マウスモロニーミユリ一ンリュ一ケミアウイノレス (Mouse Mo 1 o n y Mur ine Leukemi a

Vi rus) 、ヒト免疫不全ウイノレス 1 型（Human

Immunode f f i c i ency Vi rus Type 1) 由来の逆 ¾s写酵素力 ^s巿販されており最も入手しやすい。又、本発明において用いられる逆転写酵素は、ヒト免疫不全ウィルス 1 型（Human

Immunodef f i c i ency Vi rus Type 1) 及ひ 2型 (Human

Immunode f f i c i ency Vi rus Type 2) 、ヒト Tセノレリューケミァゥイノレス（Human Tcel l Leukemi a Vi rus) 、サノレエイズゥイノレス、ネコエイズゥイノレス、ラウス関連トリ肉腫ウイノレスなどのレトロゥイノレスの粒子をトリトン X — 1 0 0等の界面活性剤で処理することで得ることもできる。界面活性剤で処理して得られる逆転写酵素は所望によリ精製して用いることができる。

本発明において用いられる逆転写酵素は、市販品でぁリ、使用頻度が高いヒト免疫不全ウィルス（Human

Immunode f f i c i ency Vi rus) (こ由来するもの力 ^s好ましレヽ。また、安定化する酵素組成物中の逆転写酵素の濃度としては特に限定されるものではないが、例えば、 0 . 0 1 m U / μ 1 〜 1 0 U / 1 の範囲で用いることができる。ここで、 1 U の酵素活性とは、ブライマ一と铸型 R N Aのハイブリッド体として、オリゴデォキシチミンヌクレオチド（オリゴ d T ) 一ポリアデニンリボヌクレオチド（ポリ A ) を用い、逆転写酵素をモノヌクレオチドと共に 3 7。C、 p H 7 . 4 にて 3 0 分間反応させた時の、 1 0 n m o 1 のヌクレオチドを合成 D N A として取リ込む活性として定義することができる。

本発明においては、上記の少なくとも 1 種の有機安定剤がトレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸であることが好ましい。

本発明の酵素組成物溶液において、有機安定剤の 1 つとして用いるトレハロースの分子数は、逆転写酵素 1 分子に対して 3 0倍〜 3 . 1 X 1 0 ^{1 1} 倍であることが好ましく、 3 1 倍〜 3 . 0 9 X 1 0 " 倍であることが更に好ましく、 3 0 0 0倍〜 3 . 0 9 X 1 0 ^{1 1} 倍であることが最も好ましい。また、トレハロースの量は、酵素を含む組成物全体に対して 0 . 0 ；! 〜 5 0重量％であってもよい。

本発明においてもう 1 つの有機安定剤として用いる、逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸としては、プライマ一としての D N Aと铸型としての R N Aのハイブリッド体であることが好ましく、プライマ一とハイブリダイズした铸型 R N A が、プライマ一の 3 ' 側に突出しているものであれば特に限定はない。また、プライマーの 3 ' 側における R N A鎖の突出の長さは特に限定されない。プライマ——铸型の組み合わせとしては、実質的にアデニンリボヌクレオチドょリなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシチミンヌクレオチドょリなるプライマーとのハイブリッド体、実質的にゥリジンリボヌクレオチドょリなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシアデニンヌクレオチドょりなるプライマーとのハイプリッド体、実質的にグァニンリボヌクレオチドょリなる铸型 R N A と実質的にオリゴデォキシシチジンヌクレオチドょリなるプライマー、及び実質的にグァニンリボヌクレオチドよりなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシシチジンヌクレオチドよリなるプライマーとのハイプリッド体からなる群よリ選ばれる少なくとも 1種を挙げることができる。具体的には、ォリゴ d T— p o l y A、オリゴ d A— p o l y U、オリゴ d C - p o 1 y G、オリゴ d G— p o 】 y C等を用いることができ、その中ではオリゴ d T— p o 1 y Aが特に好ましい。上記の各ヌクレオチドの長さは、逆転写酵素が転写開始部位を認識できるような長さが有ればそれでよく、 R N A鎖と D N A鎖とが 2重鎖となっているブライマ一領域が 5塩基以上あることが好ましい。また、逆転写酵素使用前に、 R N A鎖と D N A鎖とが互いにハイプリダイズできるような塩基配列を持った 1 本鎖の D N Aもしくは 1 本鎖の R N Aを別々に使用してもよい。

本発明において用いる逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸の分子数は、逆転写酵素 1 分子に対して 2 . 5 X 1 0一⁴ 倍〜 6 X 1 0 ⁶ 倍であることが好ましく、 2 . 6 4 X 1 0— ⁴ 倍〜 5 . 2 8 X 1 0⁶ 倍であることが更に好ましく、 2 . 6 4 X 1 0―¹〜 2 . 6 4 X 1 0⁶ 倍であることが最も好ましい本発明において用いられる水溶液中で 2価の陽イオンを生じうる金属塩の例としては、マグネシウム（ M g ) 、マンガン（ M n ) 、カルシウム（ C a ) 、亜鉛（ Z n ) 、力ドミゥム（ C d ) 、銅（ C u ) 等の 2価の金属の塩を挙げることができ、具体的には、 M g C l ₂ 、 M n C 1 2 、 C a C 1 2 、 Z n C 1 2 、 C d C 1 2 、 C u C 1 2 、 M g S O ₄ 、 M n S O 4 、 C d S O 4 、 C u S O ₄ 等を挙げることができる。これらの中では、 M g C I ₂ 、 M n C 1 ₂ 、 C a C l ₂ 及び M g S〇 ₄が好ましい。組成物中の金属塩の分子数は、逆転写酵素 1分子に対して、 1倍〜 1 . 2 X 1 0 ^{1 1} 倍であることが好ましく、 1 . 1 7倍〜 1 . 1 7 X 1 0 ¹¹ 倍であることが更に好ましく、 1 1 . Ί〜 2 . 3 4 X 1 0 '° 倍であることが最も好ましい。また、組成物中の金属塩の量は、酵素を含む組成物全体に対して 0 . 0 1 〜 5 0 0 mM、好ましくは 0. l 〜 l 0 0 mMであってもよレ、。これら金属塩は単独又は組み合わせて用いてもよい。

また、これら成分を含む溶液中に、所望にょリメルカプトエタノール、ジチオスレィトール、ジチォエリトリトール、還元型ダルタチオンなどの S H保護剤を添加しても良い。そして、適当な緩衝液、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液酢酸緩衝液、 G o o d緩衝液などにょリ、酵素の安定化に至適な P Hに調整されていることが好ましい。本発明の酵素組成物溶液の P H範囲としては，好ましくは 5〜 1 0 、更に好ましくは 6〜 9であり、所望であれば、 N a C l もしくは K C 1 等の塩を添加したリ、また、保存容器の種類に応じて、アルブミン、 I g G等のタンパク質、リジンやポリ一 Lーリジンなどのモノ、もしくはポリアミノ酸、及び界面活性剤を吸着防止剤として添加することができる。容器の材質はポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン榭脂（ T P X ) 、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカ一ボネート、ポリウレタン、塩化ビュル榭脂等のブラスチック、ステンレス、アルミ、チタン等の金属、ガラス及びゴム等を用いることができる。

本発明の酵素組成物の溶液は、その構成成分であるトレハロース、逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸、水溶液中で 2価陽イオンを生じうる安定化有効量の金属塩、及び場合によっては上記の様々な添加剤を、別々に添加してもよいし、 2種以上をあらかじめ混合して添加してもよい。例えば、上記のような緩衝液中に塩化マグネシウム及びトレハロースを添加した溶液、又は塩化マグネシウム、トレハロース及びォリゴ d T— p o 1 y Aを添加した溶液を、逆転写酵素溶液に添加して調製することができる。

即ち、本発明によれば、上記の逆転写酵素、少なくとも 1 種の有機安定剤及び金属塩のそれぞれが水溶液の状態でぁリそれによつて、保存安定性が改善された、水性逆転写酵素組成物を得ることができる。

このようにして得られる安定化組成物に、溶液状態での安定性よりもさらに長期の保存安定性が要求される場合は、上記の保存安定性が改善された、水性逆転写酵素組成物を凍結乾燥することにより、さらに安定化させることができる。例えば、凍結乾燥品の母液として、適当な緩衝溶液中に溶解後に 0 . 0 1 〜 5 0重量⁰ /。となるようにトレハロースを、また逆転写酵素 1 分子に対して 2 . 6 4 X 1 0— ⁴ 倍〜 5 . 2 8 X 1 0⁶ 倍分子存在するように調製した铸型ープライマー、また、金属塩として溶解後に 0 . 0 1 〜 5 0 0 mMの濃度となるように調製した 2価の陽イオンを含むような金属塩を逆転写酵素に添加混合し、これを凍結乾燥品とすればよい。凍結乾燥品母液は、上記した酵素の安定化に至適な P Hに調製されていることが好ましく、所望にょリ、上記した S H保護剤、塩、吸着防止剤等の添加剤を添加してもよい。

このようにして調製される本発明の保存安定化逆転写酵素組成物、及び逆転写酵素の保存安定化方法は、逆転写酵素に少なくとも 4 °Cにおける長期安定性を賦与することから、従来の逆転写酵素を用いる様々な技術にかかる労力及びコストの低減化をはかることができる。また、このように逆転写酵素を安定に保存できる温度が比較的高いことから、酵素組成物溶液の粘度が低下する。従って、所望の酵素活性に相当する量を正確に分注することができ、高い再現性でもって実験を行うことができる。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例及び参考例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

以下の実施例及び参考例において、逆転写酵素活性の測定方法として、中野らの手法（日本国感染症学雑誌，第 6 8卷第 7号， 9 2 3— 9 3 1 ， 1 9 9 4年）に従って酵素活性を測定した。

実施例 1

ガラスバイアル中に、 H E P E S (日本国同人化学社製） ( H 7 . 8 ) 0 . 1 M, T r i t o n X— 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製）

0 . 1 5。/。、：《 1 ー 1型逆転写酵素（日本国生化学ェ業社製） l mU/ μ Ι (比活性 1 0 0 0 0 U//m g〜 2 0 0 0 0 U / m g , 分子量 1 1 7 K d ) 及びオリゴ d T ₁₂— ₁₈ - p o 1 y A (スウェーデン国フアルマシア社製；平均分子量 8 8 6 0 0 ) (小文字の 1 2 — 1 8はオリゴ d Tの平均塩基長を意味する） 2 0 g Z /x 】の溶液を調製し、その溶液中に塩化マグネシウム（日本国和光純薬工業社製）を、 0 、 0 . 5

1 、 2 、 5、 1 0 、 2 0 、 5 0、 1 0 0 、 2 0 0 mMの濃度になるように調製した溶液を 4 °C、 3 7 °Cにそれぞれ保存し 7 日後、保存液を 0 . l % T r i t o n X _ 1 0 0 にて 0 ' 4 m U/m 1 の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。対照群としてオリゴ d T , ₂ _ , ₈ — p 0 】 7

y A及び塩化マグネシウムが添加されない溶液で同様の実験を行い、その結果を表 1 に示した。

塩化マグネシウム濃度逆転写酵素活性

( m M) ( 4 0 5 n m における吸光度）

4 °C 3 7。C

0 (比較例） 2 8 0 4 5 2 0 . 5 3 2 0 0 8

3 4 6 0 8 0 6

2 2 2 2 0 7 4 5 5 2 0 2 0 8 7 1

1 0 4 4 2 0 9 7

2 0 3 3 2 2 3 5 5 0 1 5 2 0 6 0 7 1 0 0 0 6 2 0 0 2

2 0 0 2 7 3 0 0 0 8 対照群 0 . 1 0 2 0 . 0 2 0

この結果から明らかなように、オリゴ d T — p 0 1 y A及び塩化マグネシウムが添加されていない保存液では得られなかった安定性が、オリゴ d T , ₂ - , ₈— p o 1 y A及び塩化マグネシウムを添加することによって高められることが確認された。

実施例 2

ガラスバイアル中に、 H E P E S ( 日本国同人化学社製） ( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M, T r i t o n X— 1 0 0 (米国シグマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U Z 1 及び塩化マグネシウム（日本国和光純薬ェ業社製） 2 0 mMの溶液を調製し、その溶液中にトレハロース（分子式； C H O ' 2 H ₂0、分子量 3 7 8 . 3 ：米国シグマ社製）を、 0、 1 、 5 、 1 0 、 2 0 、 4 0 %の濃度になるように調製した溶液を 4 °Cでそれぞれ保存し、 7 日後、保存液を 0 . l % T r i 1 0 1 ー 1 0 0 にて 0 . 4 m U/m 1 の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、塩化マグネシウム及びトレハロースが添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 2 に示した。

9

表 2

トレハロース濃度逆転写酵素活性

(%) (40 5 nm における吸光度）

4°C

0 (比較例） 1 0

3 5 9

5 442

1 0 4 92

20 538

40 24 1 対照群 0 02

この結果から明らかなように、トレハロース及び塩化マグネシゥムが添加されていない保存液だけでは得られなかつた安定性が、トレハロース及び塩化マグネシウムを添加することによって高められることが確認された。実施例 3 ガラスバイアル中に、 H E P E S (日本国同人化学社製） ( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M、 T r i t o n X— 1 0 0 (米国シグマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） l m UZ I 、トレハロース（米国シグマ社製） 4 0 % オリゴ d T ₁₂— ₁₈ - p 0 1 y A (スウェーデン国ファルマンァ社製） 2 0 / g Zm l 及び塩化マグネシウム（日本国和光純薬工業社製） 2 O mMの溶液を調製した。その溶液を 4 °C 2 0 °C、 3 7 °Cでそれぞれ保存し、 7 日後、保存液を 0 . 1 % T r i t o n X— 1 0 0 にて 0 . 4 m U/m l の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロース、オリゴ d T ₁₂— ₁₈ — p o l y A、及び塩化マグネシウムが添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 3 に示した。

2

表 3

逆転写酵素活性

(405 nm における吸光度）

4。C 20。C 3 7 °C 実験群 . 4 7 2 . 36 2 342 対照群 0. 1 0 2 0. 054 0. 0 20

この結果力 >ら明らかなように、オリゴ d T ₁₂-₁₈ - p 0 1 y A、トレハロース、塩化マグネシウムの 3者の組合わせにょリ、逆転写酵素の、少なくとも 4 °Cでの安定性を高められることが確認できた。

実施例 4 ガラスバイアル中に、 H E P E S ( 日本国同人化学社製） ( H 7 . 8 ) 0 . 1 M , T r i t o n X— 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1 型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U / ju 1 、トレハロース（米国シグマ社製） 4 0 % オリゴ d T , - p 0 1 y A (スウェーデン国ファノレマシァ社製） 2 0 μ g m 1 、塩化マグネシウム（日本国和光純薬工業社製） 2 0 mMの溶液を調製した。その溶液を 4 °Cで保存し、調製当日、 2 ヶ月後、 4 ヶ月後、 6 ヶ月後、 8 ヶ月後、 1 0 ヶ月後、 1 2 ヶ月後の保存液を、 0 %丁 o n X— 1 0 0にて 0 . A mUZin l の濃度に調製し、被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロース、オリゴ d T！ — p o 1 y A、及び塩化マグネシゥムが添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 4 に示した。表 4

保存期間逆転写酵素活性

(40 5 nm における吸光度）実験群対照群調製当日 5 2 8 6 05

2ヶ月後 1. 70 7 0. 0 3 1

4ヶ月後 1. 6 54 0. 0 1 8

6ヶ月後 1. 55 8 0. 0 1 1

8ヶ月後 1. 6 5 9 0. 0 1 1

0ヶ月後 1. 5 1 4 0. 0 3 2

2ヶ月後 1. 5 5 6 0. 00 3 この結果から明らかなように、オリゴ d T , ₂— , ₈ — p o l y A、トレハロース、塩化マグネシウムの 3者の組合わせにょリ、逆転写酵素を 4 °Cの条件下で少なくとも 1 年間は安定に保存できることが確認できた。

実施例 5

ガラスバイアル中に、 H E P E S (日本国同人化学社製） ( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M, T r i t o n X— 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1 型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U / μ 1 、トレハロース（米国シグマ社製） 4 0 % オリゴ d T ₁₂_₁₈ - p 0 1 y A (スウェーデン国フアルマシァ社製） 2 0 /x g Z m l の溶液を調製した。その溶液に、塩化マグネシウム、塩化カノレシゥム、塩化マンガン（ Π ) 、硫酸マグネシウム（以上、日本国和光純薬工業社製）を 2価金属としてそれぞれ 2 O mMの濃度になるように添力 [Iして、 4 。じ、 2 0 °Cでそれぞれ保存し、 7 日後、保存液を 0 . 1 % T r i t o n X— 1 0 0 にて 0 . m U Z m l の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロース，オリゴ d T _{1 2}— _{l 8} — p o l y A及び 2 価金属が添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 5 に示した。表 5

逆転写酵素活性

(40 5 nm における吸光度）

4°C 20°C 塩化マグネシウム 1. 4 3 3 3 26

塩化カルシゥム 6 1 2 5 5 2

塩化マンガン 1. 54 2 5 26

硫酸マグネシウム 1. 5 24 2 6 3 対照群 0. 080 0. 0 3 9

この結果から明らかなように、オリゴ d T！ ₂一， p 0 1 y A、トレハロース及び塩化マグネシウムの 3者の組合わせだけではなく、塩化マグネシウムの代わリに塩化カルシウム塩化マンガン（ Π ) 、硫酸マグネシウムのような他の種の 2 価金属塩を添加しても、逆転写酵素を少なくとも 4 °Cにおいて安定化させられることが確認で.きた。実施例 6

ガラスバイァノレ中 H E P E S ( 日本国同人化学社製）

( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M、 T r i t o n X— 1 0 0 (米国シグマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） /15

25

0. 1 5 %、 H I V— 1型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U / μ 1 、トレハロース（米国シグマ社製） 4 0 % 及び塩化マグネシウム（日本国和光純薬工業社製） 2 0 mM の溶液を調製した。その溶液に、オリゴ d T ₁₂— ₁₈ - p o l y A、オリゴ d A , - Ρ ο 1 y U (以上、スウェーデン国フアルマシア社製）を 2 0 g /m l の濃度になるようにそれぞれ添加し、 4 °C、 2 0 °C、 3 7 °Cにおいて保存し、 7 日後、保存液を 0 % T 0 11 ー 1 0 0にて 0 4 mU/m 1 の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロース、オリゴ d T

- 1 8 一 P o 1 y A及び、 2価金属が添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 6 に示した。表 6

铸型とプライマ一逆転写酵素活性

の組み合わせ ( 40 5 n m における吸光度）

4 °C オリゴ d T ■ - i s - P o 1 y A 1. 5 5 5

オリゴ d A . - 1 a - P o 1 y U 4 1 3 対照群 0. 2 この結果から明らかなように、オリゴ d T , ₂— , ₈ - o l y A、トレハロース及び塩化マグネシウムの 3者の組合わせだけではなく、逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸としてオリゴ d T _{l 2}— ₁₈ - p o 1 y Aの代わりにオリゴ d A ₁₂-₁₈ - p o 1 y Uを添加しても、逆転写酵素を安定化させられることが確認できた。

実施例 7

ガラスバイアル中に、 H E P E S ( 日本国同人化学社製） ( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M、 T r i t o n X— 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U ju 1 、トレハロース（米国シグマ社製） 4 0 % オリゴ d T ₁₂- ₁₈ — p o l y A (スウェーデン国フアルマシァ社製） Z O g Zm l 及び塩化マグネシウム（日本国和光純薬工業社製） 2 0 mMの凍結乾燥品母液を調製し、その母液を 0 . 5 m l ずつ分注し、凍結乾燥機にて凍結乾燥品を調製した。この凍結乾燥品の調製当日、 2 ヶ月後、 4 ヶ月後、 6 ヶ月後、 8 ヶ月後、 1 0 ヶ月後、 1 2 ヶ月後に 0 . 5 m l の蒸留水に溶解し、溶解した液を 0 . l % T r i t o n X - 1 0 0 にて 0 . m U Zm 1 の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロ — ス、オリゴ d T ₁₂— ₁₈ — p o l y A及び塩化マグネシウムが添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 7 に示した。表 7

保存期間逆転写酵素活性

(40 5 nm における吸光度）実験群対照群調製当日 4 2 9 5 5 5

2ヶ月後 1. 70 7 4 3 1

4ヶ月後 1. 6 3 3 2 1 8

6ヶ月後 1. 6 5 8 1 1 1

8ヶ月後 1. 4 9 9 0. 6 2 1

1 0ヶ月後 58 6 0. 4 1 9

1 2ヶ月後 6 34 0. 200

この結果力ら明らかなように、オリゴ d T , , s - p o 1 y A、トレハロース及び塩化マグネシウムの 3者の組合わせにより、逆転写酵素を凍結乾燥品として少なくとも 1 年間は安定に保存できることが確認できた。

実施例 8 ガラスバイアル中に、 H E P E S ( 日本国同人化学社製）

( p H 7 . 8 ) 0 . 1 M、 T r i o n X - 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血淸アルブミン（米国シグマ社製） 0 . 1 5 %の溶液を調製し、その溶液中に H I V — 1 型逆転写酵素（日本国生化学工業社製）がそれぞれ 1 、 1 m U / μ 1 , 0 . O l m Uノ μ ΐ になるように溶液を調製した。それぞれの溶液についてトレハロース（米国シグマ社製） 4 0 %、オリゴ d T _{1 2}— _{1 8} - p 0 1 y A (スウェーデン国フアルマシア社製） 2 0 μ g / 1 及び塩化マグネシウム (日本国和光純薬工業社製） 2 0 m Mの溶液を調製し、 4 °C 2 0 °C 、 3 7 °C ( 0 . 0 1 m U Z 1 においては 4 °Cのみ）にそれぞれ保存し、 7 日後、保存液を 0 . l % T r i t o n X — 1 0 0 にて 0 . m U Z rri 1 の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレノヽロース、オリゴ d T _{1 2}— _{1 8} - p o 1 y A及び塩化マグネシゥムが添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 8 ( l O U / μ Ι 保存液を用いた場合）、表 9 ( 1 m U / μ 1 保存液を用いた場合）、表 1 0 ( 0 . O l m U Z 1 保存液を用いた場合： 4 °C条件のみ）に示した。表 8 l o υ / _μ 1 保存液を用いた場合

逆転写酵素活性

( 405 n m における吸光度）

4 °C 20。C 3 7°C 実験群 1. 3 3 9 1. 4 2 2 1. 2 9 9 対照群 0. 00 2 0. 0 5 9 0. 0 3 9

表 9

1 m / μ 1 保存液を用いた場合

逆転写酵素活性

( 405 n m における吸光度）

4 °C 20°C 3 7°C 実験群 1. 4 7 2 1. 3 6 2 1. 34 2 対照群 0. 1 0 2 0 - 054 0. 0 20 表 1 0

0 . O l m UZ /u l 保存液を用いた場合

逆転写酵素活性

(40 5 nm における吸光度）

4 °C 実験群 1. 2 92

対照群 0. 1 5 3

この結果から明らかなように、オリゴ d T ₂— , ₈ - p 0 1 y A、トレハロース及び塩化マグネシウムの 3者の組合わせにより、逆転写酵素 l O UZ /x 1 〜 0 . O l m U μ 1 の酵素濃度の保存液の、少なくとも 4 °Cにおける安定性を高められることが確認できた。参考例ガラスバイアル中に、 H E P E S ( 日本国同人化学社製） ( H 7 . 8 ) 0 . 1 M, T r i 't o n X - 1 0 0 (米国シダマ社製） 0 . 1 %、牛血清アルブミン（シグマ社製） 0 . 1 5 %、 H I V— 1 型逆転写酵素（日本国生化学工業社製） 1 m U / μ 1 及びトレハロース（米国シグマ社製） 4 0 %の溶液を調製し、その溶液中にオリゴ d T ₁₂— ₁₈ - p 0 1 y A (スウェーデン国フアルマシア社製）を、 0、 0. 2、 2、 2 0、 2 0 0、 2 0 0 0 / g /m l の澳度になるように調製した溶液を 4 °Cでそれぞれ保存し、 7 日後、保存液を 0. 1 % T r i t o n X— 1 0 0にて 0. 4 mUZm l の濃度に調製した溶液を被検液として逆転写酵素活性を測定した。逆転写酵素活性測定法は実施例 1 の測定法と同様に行った。対照群として、トレハロース及びオリゴ d T ₁₂— ₁₈ — p o l y A が添加されない保存液で同様の実験を行い、その結果を表 1 1 に示した。

表 1

オリゴ d T₁₂— ₁₈ - p o 1 y A 逆転写酵素活性

( μ g /m 1 ) (40 5 nm における吸光度）

4 °C

0 (比較例） 0 3 26

0. 2 0 9 32

2 3 36

20 3 29

200 20 1

2000 0 74 1 対照群 0. 1 0 2

産業上の利用可能性

本発明によれば、逆転写酵素と、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽イオンを生じうる金属塩の安定化有効量を含んでなる酵素組成物が提供される。本発明の保存安定化酵素組成物は、少なくとも 4 °Cにおいて長期間安定なことから、従来の逆転写酵素を用いる様々な技術にかかる労力及びコストの低減化をはかることができる。更に、本発明の組成物は、粘度が低いため、所望の量を正確に分注することができ、再現性よく実験することができるので、逆転写酵素活性を指標とする、ウィルス定量のスタンダードとして有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 逆転写酵素と、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽イオンを生じうる金属塩の安定化有効量を含んでなる保存安定化逆転写酵素組成物。

2 . 上記の少なくとも 1 種の有機安定剤が、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸である請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

3 . 該核酸が、実質的にアデニンリボヌクレオチドよりなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシチミンヌクレオチドょりなるプライマーとのハイプリッド体、実質的にゥリジンリボヌクレオチドょリなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシァデニンヌクレオチドょリなるプライマーとのハイブリッド体、及び実質的にグァニンリボヌクレオチドよリなる铸型 R N A と実質的にオリゴデォキシシチジンヌクレオチドょリなるプライマ一とのハイプリッド体からなる群よリ選ばれる少なくとも 1 種を含んでなる請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

4 . 該金属塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガン（ Π ) 及び硫酸マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物

5 . 該トレハロースの分子を、該逆転写酵素 1 分子に対して 3 0倍〜 3 . 1 X 1 0 ^{1 1} 倍含む請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

6 . 該核酸の分子を、該逆転写酵素 1分子に対して 2 . 5 X 1 0 "⁴ 倍〜 6 X 1 0 ⁶ 倍含む請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

7 . 該金厲塩の分子を、該逆転写酵素 1 分子に対して 1倍〜 1 . 2 X 1 0 ^{1 1} 倍含む請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

8 . 該組成物が、水溶液である請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

9 . 該組成物が、凍結乾燥品である請求項 1 に記載の逆転写酵素組成物。

1 0 . 逆転写酵素に、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸からなる群よリ選ばれる少なくとも 1種の有機安定剤の安定化有効量、並びに水溶液中で 2価陽ィォンを生じうる金属塩の安定化有効量を添加することを特徴とする逆転写酵素の保存安定化方法。

1 1 . 上記の少なくとも 1 種の有機安定剤が、トレハロース及び該逆転写酵素の転写開始部位を含む核酸である請求項 1 0に記載の方法。

1 2 . 該核酸が、実質的にアデニンリボヌクレオチドよリなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシチミンヌクレオチドよりなるプライマーとのハイプリッド体、実質的にゥリジンリボヌクレオチドよりなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシアデニンヌクレオチドょりなるプライマーとのハイブリッド体、及び実質的にグァニンリボヌクレオチドよりなる铸型 R N Aと実質的にオリゴデォキシシチジンヌクレオチドょりなるプライマーとのハイプリッド体からなる群よリ選ばれる少なくとも 1種を含んでなる請求項 1 0に記載の方法。

1 3 . 該金属塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガン（ Π ) 及び硫酸マグネシウムからなる群よリ選ばれる少なくとも 1種である請求項 1 0に記載の方法。

1 4 . 該トレハロースの分子を、該逆転写酵素 1 分子に対して 3 0倍〜 3 . 1 X 1 0 ^{1 1} 倍添加することを特徴とする請求項 1 0に記載の方法。

1 5 . 該核酸の分子を、該逆転写酵素 1 分子に対して 2 . 5 X 1 0 倍〜 6 X 1 0⁶ 倍添加することを特徴とする請求項 1 0 に記載の方法。

1 6 . 該金厲塩の分子を、該逆転写酵素 1 分子に対して 1倍〜 1 . 2 X 1 0¹¹ 倍添加することを特徴とする請求項 1 0 に記載の方法。

1 7 . 上記の逆転写酵素、少なくとも 1種の有機安定剤及び金属塩がそれぞれ水溶液の状態でぁリ、それによつて、保存安定性が改善された、水性逆転写酵素組成物を得ることを特徴とする請求項 1 0 に記載の方法。

1 8 . 更に、上記の保存安定性が改善された、水性逆転写酵素組成物を凍結乾燥することを特徴とする請.求項 1 7 に記載の方法。