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WO1996012180A1 - Process and device for liquid-chromatographic analyses and substance separations - Google Patents

Process and device for liquid-chromatographic analyses and substance separations Download PDF

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WO1996012180A1
WO1996012180A1 PCT/EP1995/003994 EP9503994W WO9612180A1 WO 1996012180 A1 WO1996012180 A1 WO 1996012180A1 EP 9503994 W EP9503994 W EP 9503994W WO 9612180 A1 WO9612180 A1 WO 9612180A1
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WO
WIPO (PCT)
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liquid
module
eluted
substances
mass
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Ceased
Application number
PCT/EP1995/003994
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German (de)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Demmer
Thomas Ehlert
Khuong To Vinh
Jürgen Kaiser
Dietmar Nussbaumer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sartorius AG
Original Assignee
Sartorius AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Sartorius AG filed Critical Sartorius AG
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for carrying out liquid chromatographic analyzes and material separations. those with high reproducibility. Accuracy and speed are executable.
  • the invention can be used in the laboratory, on a technical and in production scale for the implementation of chromatography tasks in the fields of biotechnology. Medicine. Chemistry and for the extraction of valuable materials.
  • a sample of a substance mixture is placed on a chromatographic carrier and separated by means of elution liquids (eluents) which are pressed through the carrier under pressure.
  • elution liquids eluents
  • the individual constituents are held to different degrees by the carrier and emerge in fractions. They are indicated by a detection device and collected in a fraction collector.
  • the extinctions displayed on the detection device are usually plotted as a function of time (retention time). Using the graph, the separated substances can be determined qualitatively and quantitatively.
  • the sample can be placed on the support in such a way that it takes up only part or all of its capacity.
  • the so-called frontal chromatography the carrier is loaded with the mixture of substances to be separated to such an extent that the desired substance appears at the outlet of the module which contains the carrier. It can be eluted with suitable elution liquids and separated from the other substances attached to the support.
  • the frontal chromatography is also used to determine breakthrough curves, the knowledge of which is required to describe the effectiveness of the support and the entire module for the desired material separation process.
  • the carrier is completely loaded with the mixture of substances to be separated and the time Course of the extinction measured in the course of the wearer From the course of the extinction curve for this substance, conclusions can be drawn about the quality and usability of the separation system. A steep increase in the extinction is desirable
  • liquid chromatography is understood to mean chromatography processes such as HPLC, column chromatography and separation chromatography.
  • Modules are the modules which contain the chromatographic support between the liquid inlet and outlet.
  • the modules in HPLC are capillaries, in column chromatography as columns, and in separation chromatography as Dead-end modules. as they are used in separation technology (filtration technology), designed All suitable media are suitable as chromatographic supports, in particular resins.
  • porous nonparticulate polymeric adsorbers such as fleeces or membranes (membrane adsorbers) in the form of tubes, hollow fibers and flat materials
  • porous membrane adsorbers are membranes that adhere to their surface functional groups. Wear ligands or reactants that are capable of interacting with at least one component of a liquid phase in contact with it. The liquid phase is transported through the membrane in a convex manner.
  • membrane adsorber is a generic term for various types of membrane adsorbers such as membrane ion exchangers.
  • Ligand membranes and activated membranes Nonwovens and membranes are preferably used as a stack to increase the module capacity
  • ERS ⁇ TZBl- ⁇ T (RULE 26) flattened so that the modules appear to be unsuitable for the particular separation task.
  • the flow rate of elution liquid through the module decreases with increasing duration of the chromatography, that is to say with increasing elution time and number of batches
  • the time difference in absorbance and the associated disadvantages are primarily due to a decrease in the flow rate of elution liquid by the module.
  • the decrease in the flow rate can be caused by leaks on the pressure side of the device, poor quality in the pressurization, for example due to defective pumps and by Reduction of the permeability of the module, for example due to blocking of the pores of the carrier, such as the formation of a covering layer on the surface (membrane structure).
  • Inadmissible swelling behavior or compaction of the wearer To remedy this deficiency, measures have been proposed such as.
  • Use of high performance precision pumps regular checking of the device for leaks and their elimination, additional regeneration steps of the wearer. Calibrations with internal standard substances and recalculation of the data by computer programs
  • the invention is therefore based on the object of providing an improved method for carrying out liquid-chromatographic analyzes and material separations, which is characterized in particular by a high reproducibility of the results, an improved separation performance and, if appropriate, a higher speed, and to provide a device for carrying out the method
  • the object is achieved in that the extinction of the eluted substances is determined as a function of the amount of eluted liquid and / or the flow rate of eluted liquid is kept constant and that a device for carrying out liquid-chromatographic analyzes and material separations with a device for determining the amount of eluted liquid and / or combined with a device for controlling the flow rate of eluted liquid
  • separation tasks with a constant sharpness between the substances and high reproducibility can be carried out if the flow rate is kept constant.
  • the delivery rate of dosing pumps is regulated depending on the eluted amount measured in the fraction collector so that the flow rate after passage of the module.
  • the separation tasks can be carried out in routine operation with the same amount of time for each batch Carrying out the process with a constant flow rate is a dramatic shift in the elution peaks which occurs according to the prior art. which is caused by blocking the adsorber unit is prevented, a reliable identification of the individual substances is guaranteed even in routine operation
  • the determination of the amount of eluted liquid is preferably carried out g ⁇ av ⁇ met ⁇ sch or volumet ⁇ sch.
  • feedback is applied to the pressurization of the module with elution liquid in such a way that a constant flow rate within a chromatography batch and across all batches is guaranteed
  • the amount of eluted liquid is determined gravimetrically by means of a balance and the flow rate is kept constant by means of a device for pulsation-free continuous gravimetric metering, as is known, for example, from German Patent 39 38 898
  • FIG. 1 shows the schematic representation of an exemplary embodiment of a device according to the invention with a gravimetric device
  • FIG. 2 is a schematic representation of an exemplary embodiment of a device according to the invention with a device for keeping the
  • FIG. 4 A is a chromatogram with regulation of the flow rate according to the invention, in which the absorbance is shown as a function of time, and FIG. 4 B is a chromatogram. in which the extinctions are shown as a function of time, but the flow rate was not regulated
  • the exemplary embodiment according to FIG. 1 consists of a combination of an HPLC
  • Data acquisition -.- control and evaluation unit 6 is shown. with an electronic
  • Scale 7 for measuring the mass of eluted liquid
  • the detector 4 and the electronic scale 7 are with the PC-controlled data acquisition.
  • Control and identification unit 6 connected in terms of data processing technology The PC-controlled
  • Data acquisition, control and identification unit 6 provides extinction curves as a function of mass
  • Example 1 With an HPLC device (Millennium 2010 with refractometer detector from Waters
  • Table 1 shows those measured in a first and a 5 batch
  • the device consists of a combination of a device for separation chromatography with a module 8, vessels for receiving the sample solution 9, 9 'to be separated.
  • Eluent reservoirs 1. 1 '. a fraction collector 5 for eluted liquid, a detector 4 and a device for gravimetric metering of a liquid mass flow in the form of an electronic balance 7, an interface 10, a PC-controlled data acquisition.
  • the module 8 contains a chromatograph 1 see carrier 11 in the form of a membrane adsorber.
  • a membrane adsorber stack of at least two membrane systems which is arranged in a fluid-tight manner between a liquid inlet 12 and a liquid outlet 13 for permeate (eluted liquid) arranged before the liquid outlet 13 flows into a fraction collector 5 located on an electronic balance 7.
  • the solution of the substance mixture to be treated is in the sample vessels 9 or 9 '. It is made from 9', for example by hand using a piston tip, or from 9 automatically via the metering pump 2 or one optionally available (auxiliary) dosing pump 2 '. which are connected on the pressure side to the liquid inlet 12 of the module 8, placed on the carrier 11.
  • the device for gravimetric metering of the liquid mass flow requests the liquid with a preset value from the sample vessel 9 and
  • Table 2 shows the measured flow rates according to Example 2 at the beginning and end of the charee
  • a mixture of the three commercially available proteins is chymotrypsinogen.
  • Cytochrome C and lysozyme 0.5 mg / ml each. Total protein content 1.5 mg / ml
  • the proteins were adsorbed completely, as the absence of proteins in the course of the unit showed.
  • the proteins become chymotrypsinogen.
  • SPARE BLADES (RULE 26) The chromatogram obtained with the regulation of the flow rate according to the invention. in which the absorbance is shown as a function of mass. 4 A shows a comparison with a chromatogram. where the absorbance is shown as a function of time. and which was obtained under the same conditions as in Example 3, but with no regulation of the flow rate (FIG. 4B) shows that by blocking the adsorber unit, the elution peaks are shifted dramatically, so that reliable identification of the individual substances is not more is guaranteed

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Abstract

The invention relates to a process and device for liquid-chromatographic analyses and substance separations on a laboratory, technical and production scale and is applicable to the fields of bio-technology, medicine, chemistry and the obtaining of valuable substances. It is the aim of the invention to provide an improved process for performing liquid-chromatographic analyses and substance separations distinguished in particular by great reproducibility in the results, improved separation power and possibly higher working rates, and a device for implementing the process. This aim is achieved in that the extinction of the eluted substances is determined as a function of the quantity of eluted liquid and/or the flow rate of eluted liquid is kept constant and a device for performing liquid-chromatographic analyses and substance separations is combined with one for determining the quantity of eluted liquid and/or with one for controlling the flow rate of eluted liquid. The quantity is preferably determined as a mass by means of electronic scales.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung flüssigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen.Method and device for carrying out liquid chromatographic analyzes and separations.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung flüssigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen. die mit hoher Reproduzierbarkeit. Genauigkeit und Geschwindigkeit ausführbar sind. Die Erfindung ist anwendbar im Labor, im technischen und im Produktionsmaßstab für die Realisierung von Chromatographieaufgaben in den Bereichen der Biotechnologie. Medizin. Chemie und zur Wertstoffgewinnung.The invention relates to a method and a device for carrying out liquid chromatographic analyzes and material separations. those with high reproducibility. Accuracy and speed are executable. The invention can be used in the laboratory, on a technical and in production scale for the implementation of chromatography tasks in the fields of biotechnology. Medicine. Chemistry and for the extraction of valuable materials.

Bekanntlich wird zur qualitativen und quantitativen Analyse und zur präparativen Stofftrennung mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie eine Probe eines Stoff emisches auf einen chro atographischen Träger gegeben und mittels Elutionsflüssigkeiten (Eluenlen), die unter Druck durch den Träger gepreßt werden, aufgetrennt. In Abhängigkeit vom Ausmaß der Wechselwirkung der Bestandteile der Probe mit dem Träger und den Elutionsflüssigkeiten werden die einzelne Bestandteile vom Träger unterschiedlich stark festgehalten und treten fraktioniert aus. Sie werden durch eine Detektionseinnchtung angezeigt und in einem Fraktionssammler gesammelt Die an der Detektionseinnchtung angezeigten Extinktionen werden üblicherweise als Funktion der Zeit (Retentionszeit) aufgetragen. Anhand des Kurvenbildes können die aufgetrennten Stoffe qualitativ und quantitativ bestimmt werden.As is known, for qualitative and quantitative analysis and for preparative substance separation using liquid chromatography, a sample of a substance mixture is placed on a chromatographic carrier and separated by means of elution liquids (eluents) which are pressed through the carrier under pressure. Depending on the extent of the interaction of the constituents of the sample with the carrier and the elution liquids, the individual constituents are held to different degrees by the carrier and emerge in fractions. They are indicated by a detection device and collected in a fraction collector. The extinctions displayed on the detection device are usually plotted as a function of time (retention time). Using the graph, the separated substances can be determined qualitatively and quantitatively.

Die Probe kann derart auf den Träger aufgegeben werden, daß sie entweder nur einen Teil oder seine gesamte Kapazität einnimmt. Im letzteren Fall, der sogenannten frontalen Chromatographie, wird der Träger mit dem zu trennenden Stoffgemisch in einem Umfang beaufschlagt, bis der gewünschte Stoff am Auslaß des Moduls, der den Träger beinhaltet, erscheint. Mit geeigneten Elutionsflüssigkeiten kann er eluiert und von den anderen am Träger festgehaltenen Stoffen abgetrennt werden. Die frontale Chromatographie wird auch zur Ermittlung von Durchbruchskurven benutzt, deren Kenntnis für die Beschreibung der Wirksamkeit des Trägers und des gesamten Moduls für den gewünschten Stoff trenn prozeß erforderlich ist. Hierbei wird der Träger vollständig mit dem zu trennenden Stoffgemisch beladen und der zeitliche Verlauf der Extinktion im Ablauf des Tragers gemessen Aus dem Verlauf der Extinktionskurve für diesen Stoff können Rückschlüsse auf die Qualität und Brauchbarkeit des Trennsystems gezogen werden Wünschenswert ist ein möglichst steiler Anstieg der ExtinktionThe sample can be placed on the support in such a way that it takes up only part or all of its capacity. In the latter case, the so-called frontal chromatography, the carrier is loaded with the mixture of substances to be separated to such an extent that the desired substance appears at the outlet of the module which contains the carrier. It can be eluted with suitable elution liquids and separated from the other substances attached to the support. The frontal chromatography is also used to determine breakthrough curves, the knowledge of which is required to describe the effectiveness of the support and the entire module for the desired material separation process. Here, the carrier is completely loaded with the mixture of substances to be separated and the time Course of the extinction measured in the course of the wearer From the course of the extinction curve for this substance, conclusions can be drawn about the quality and usability of the separation system. A steep increase in the extinction is desirable

Unter Flussigkeitschromatographie werden in der Erfindungsbeschreibung Chromatographieverfahren verstanden wie HPLC, Saulenchromatographie und Separationschromatographie Als Module werden die Baueinheiten bezeichnet, die zwischen Flussigkeitsemlaß und -auslaß den chromatographischen Trager enthalten Die Module sind bei der HPLC als Kapillare, bei der Saulenchromatographie als Säule und bei der Separationschromatographie als Dead-End-Module. wie sie in der Separationstechnik (Filtrationstechnik) gebrauchlich sind, ausgestaltet Als chromatographische Trager kommen alle bekannten Medien in Betracht, insbesondere Harze. Gele, poröse partikulare und poröse nichtpartikuiare Adsorber und Ionenaustauscher, für die Separationschromatographie vorzugsweise poröse nichtpartikulare polymere Adsorber wie Vliese oder Membranen (Membranadsorber) in Form von Rohren, Hohlfasern und flachigen Materialien Nach der WO-Al 92/00805 sind poröse Membranadsorber Membranen, die an ihrer Oberflache funktionelle Gruppen. Liganden oder Reaktanden tragen, die zur Wechselwirkung mit mindestens einer Komponente einer mit ihr in Kontakt stehenden flussigen Phase befähigt sind Der Transport der flussigen Phase durch die Membran hindurch erfolgt dabei konvekm Die Bezeichnung Membranadsorber ist Oberbegriff für verschiedene Membranadsorbertypen wie Membranionenaustauscher. Ligandenmembranen und aktivierte Membranen Vliese und Membranen werden zur Erhöhung der Modulkapazitat vorzugsweise als Stapel eingesetztIn the description of the invention, liquid chromatography is understood to mean chromatography processes such as HPLC, column chromatography and separation chromatography. Modules are the modules which contain the chromatographic support between the liquid inlet and outlet. The modules in HPLC are capillaries, in column chromatography as columns, and in separation chromatography as Dead-end modules. as they are used in separation technology (filtration technology), designed All suitable media are suitable as chromatographic supports, in particular resins. Gels, porous particulate and porous nonparticulate adsorbers and ion exchangers, for separation chromatography preferably porous nonparticulate polymeric adsorbers such as fleeces or membranes (membrane adsorbers) in the form of tubes, hollow fibers and flat materials According to WO-Al 92/00805, porous membrane adsorbers are membranes that adhere to their surface functional groups. Wear ligands or reactants that are capable of interacting with at least one component of a liquid phase in contact with it. The liquid phase is transported through the membrane in a convex manner. The term membrane adsorber is a generic term for various types of membrane adsorbers such as membrane ion exchangers. Ligand membranes and activated membranes Nonwovens and membranes are preferably used as a stack to increase the module capacity

Im Routmebetπeb, insbesondere bei automatisch ablaufenden Chromatographiereihen (Chargen), müssen die durchzuführenden Analysen und Stofftrennungen mit dem gleichen Modul wiederholbar sein und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aufweisen In der Praxis wird eine Reproduzierbarkeit nur unzureichend erreicht Mit zunehmender Chargenanzahl der zu analysierenden Reihe fallen die Extintionen. die die einzelnen Stoffe charakterisieren, zeitlich nicht mehr zusammen oder sie überlappen stark Die Zeitverschiebung und Überlappung erschwert die Zuordnung der einzelnen Extinktionen zu den dazugehörigen Stoffen und behindert somit ihre qualitative und quantitative Auswertung Die Überlappung fuhrt zu einer deutlichen Verschlechterung in der Auftrennung des Stoffgemisches in die gewünschten Komponenten Die Durchbruchskurven \ erlaufen in der frontalen Chromatographie ctgrIn routine operations, especially in the case of automatically running chromatography series (batches), the analyzes and material separations to be carried out must be repeatable with the same module and have a high degree of reproducibility of the results. In practice, reproducibility is only insufficiently achieved With increasing number of batches of the series to be analyzed the extinctions. which characterize the individual substances, no longer coincide in time or they strongly overlap.The time difference and overlap complicates the assignment of the individual extinctions to the associated substances and thus hinders their qualitative and quantitative evaluation.The overlap leads to a significant deterioration in the separation of the substance mixture into the desired components The breakthrough curves \ run in frontal chromatography ctgr

ERSÄTZBl-ÄΪT (REGEL 26) abgeflacht, sodaß die Module für die jeweilige Trennaufgabe ungeeignet zu sein scheinen Die Flußrate an Elutionsflussigkeit durch den Modul nimmt mit zunehmender Dauer der Chromatographie, das heißt mit zunehmender Elutionszeit und Chargenanzahl abERSÄTZBl-ÄΪT (RULE 26) flattened so that the modules appear to be unsuitable for the particular separation task. The flow rate of elution liquid through the module decreases with increasing duration of the chromatography, that is to say with increasing elution time and number of batches

Die Zeitverschiebung der Extinktion und die damit verbundenen Nachteile sind in erster Linie zurückzuführen auf eine Abnahme der Flußrate an Elutionsflussigkeit durch den Modul Die Abnahme der Flußrate kann verursacht werden durch Leckagen auf der Druckseite der Vorrichtung, Qualitätsmangel in der Druckbeaufschlagung, z.B durch mangelhafte Pumpen und durch Verringerung der Durchlaßfähigkeit des Moduls, z B wegen Verblockung der Poren des Tragers, wie Deckschichtbildung auf der Oberflache (Membranfouhng). unzulässiges Quellverhalten oder Verdichtungen des Tragers Zur Beseitigung dieser Mangel wurden Maßnahmen vorgeschlagen wie. Verwendung von Hochleistungsprazisionspumpen. regelmäßige Überprüfung der Vorrichtung auf Undichtigkeiten und ihre Beseitigung, zusätzliche Regenerierungsschritte des Tragers. Eichungen mit internen Standardsubstanzen und Rekalkulation der Daten durch ComputerprogrammeThe time difference in absorbance and the associated disadvantages are primarily due to a decrease in the flow rate of elution liquid by the module. The decrease in the flow rate can be caused by leaks on the pressure side of the device, poor quality in the pressurization, for example due to defective pumps and by Reduction of the permeability of the module, for example due to blocking of the pores of the carrier, such as the formation of a covering layer on the surface (membrane structure). Inadmissible swelling behavior or compaction of the wearer To remedy this deficiency, measures have been proposed such as. Use of high performance precision pumps. regular checking of the device for leaks and their elimination, additional regeneration steps of the wearer. Calibrations with internal standard substances and recalculation of the data by computer programs

Alle diese Maßnahmen erhohen den Aufwand zur Durchfuhrung der Chromatographie oder sind im Routinebetrieb, insbesondere bei automatischen Chromatographiereihen nicht oder nur unzureichend realisierbarAll of these measures increase the effort required to carry out the chromatography or cannot be carried out, or only inadequately, in routine operation, particularly in the case of automatic chromatography series

Der Erfindung egt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen zu schaffen, das sich insbesondere durch eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine verbesserte Trennleistung und gegebenenfalls durch eine höhere Geschwindigkeit auszeichnet, sowie eine Vorrichtung zur Durchfuhrung des Verfahrens bereitzustellenThe invention is therefore based on the object of providing an improved method for carrying out liquid-chromatographic analyzes and material separations, which is characterized in particular by a high reproducibility of the results, an improved separation performance and, if appropriate, a higher speed, and to provide a device for carrying out the method

Die Aufgabe wird dadurch gelost, daß die Extinktion der eluierten Stoffe als Funktion der Menge an eluierter Flüssigkeit bestimmt wird und/oder die Flußrate an eluierter Flüssigkeit konstant gehalten wird und daß eine Vorrichtung zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen mit einer Einrichtung zur Mengenbestimmung an eluierter Flüssigkeit und/oder mit einer Einrichtung zur Steuerung der Flußrate an eluierter Flüssigkeit kombiniert wirdThe object is achieved in that the extinction of the eluted substances is determined as a function of the amount of eluted liquid and / or the flow rate of eluted liquid is kept constant and that a device for carrying out liquid-chromatographic analyzes and material separations with a device for determining the amount of eluted liquid and / or combined with a device for controlling the flow rate of eluted liquid

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Extinktionen, die als Funktion der Menge an eluierter Flüssigkeit gemessen wurden, zwischen den Chargen in hohem Maße übereinstimmen, wahrend sie. wenn sie wie nach dem Stand der Technik über die Zeit gemessen werden, deutlich voneinander abwichen und damit zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen oder Fehlinterpretationen in der Verwendbarkeit des chromatographischen Systems führtenIt has surprisingly been found that the extinctions, which are measured as a function of the amount of eluted liquid, agree to a large extent between the batches as they are. if, as in the prior art, they are measured over time, they differ significantly from one another and therefore not too reproducible results or misinterpretations in the usability of the chromatographic system

Weiter wurde gefunden, daß Trennaufgaben mit gleichbleibender Trennscharfe zwischen den Stoffen und hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden können, wenn man die Flußrate konstant halt Dazu wird die Förderleistung von Dosierpumpen in Abhängigkeit von der im Fraktionssammler gemessenen eluierten Menge so geregelt, daß die Flußleistung nach Passage des Moduls konstant ist Das hat den Vorteil, daß die Vorrichtung kostengünstig aufgebaut werden kann, indem man auf die Verwendung von Prazisionspumpen und einen hohen Aufwand bei der Abdichtung des Systems verzichtet Die Trennaufgaben sind im Routinebetrieb mit dem gleichen Zeitaufwand für jede Charge durchfuhrbar Dadurch, daß bei erfϊndungsgemaßer Durchfuhrung des Verfahrens mit konstanter Flußrate eine nach dem Stand der Technik auftretende dramatische Verschiebung der Elutionspeaks. die durch Verblocken der Adsorber- Einheit hervorgerufen wurde, verhindert wird, wird eine sichere Identifikation der einzelnen Substanzen auch im Routinebetrieb gewährleistetIt was also found that separation tasks with a constant sharpness between the substances and high reproducibility can be carried out if the flow rate is kept constant.For this purpose, the delivery rate of dosing pumps is regulated depending on the eluted amount measured in the fraction collector so that the flow rate after passage of the module This has the advantage that the device can be set up inexpensively by dispensing with the use of precision pumps and a high outlay in sealing the system. The separation tasks can be carried out in routine operation with the same amount of time for each batch Carrying out the process with a constant flow rate is a dramatic shift in the elution peaks which occurs according to the prior art. which is caused by blocking the adsorber unit is prevented, a reliable identification of the individual substances is guaranteed even in routine operation

Die Bestimmung der Menge an eluierter Flüssigkeit wird vorzugsweise gτavιmetπsch oder volumetπsch vorgenommen Alternativ oder zusätzlich erfolgt ausgehend von der gemessenen Menge an eluierter Flüssigkeit eine Ruckkopplung auf die Druckbeaufschlagung des Moduls mit Elutionsflussigkeit in der Weise, daß eine konstante Flußrate innerhalb einer Chromatographiecharge und über alle Chargen hinweg gewahrleistet wirdThe determination of the amount of eluted liquid is preferably carried out gτavιmetπsch or volumetπsch. Alternatively or additionally, based on the measured amount of eluted liquid, feedback is applied to the pressurization of the module with elution liquid in such a way that a constant flow rate within a chromatography batch and across all batches is guaranteed

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Menge an eluierter Flüssigkeit gravimetπsch mittels einer Waage und die Konstanthaltung der Flußrate mittels einer Vorrichtung zum pulsationsfreien kontinierhchen gravimetπschen Dosieren, wie sie beispielsweise aus der Deutschen Patentschrift 39 38 898 bekannt istIn a preferred embodiment of the invention, the amount of eluted liquid is determined gravimetrically by means of a balance and the flow rate is kept constant by means of a device for pulsation-free continuous gravimetric metering, as is known, for example, from German Patent 39 38 898

Die Erfindung ward anhand der beiliegenden Zeichnungen und Beispiele naher beschrieben Dabei zeigtThe invention was described in more detail with reference to the accompanying drawings and examples

Fig 1 die schematische Darstellung eines Ausfuhrungsbeispiels einer erfindungsgemaßen Vorrichtung mit einer Einnchtung zur gravimetnschen1 shows the schematic representation of an exemplary embodiment of a device according to the invention with a gravimetric device

Bestimmung der eluierten Flüssigkeit. Fig 2 die schematische Darstellung eines Ausfuhrungsbeispiels einer erfindungsgemaßen Vorrichtung mit einer Einrichtung zur Konstanthaltung derDetermination of the eluted liquid. Fig. 2 is a schematic representation of an exemplary embodiment of a device according to the invention with a device for keeping the

Flußrate.Flow rate.

ERSATZBLATT (REGE E) Fig 3 Durchbruchskurven für ein Protein mit erfindungsgemaßer und ohne Regelung der Flußrate.REPLACEMENT LEAF (REGE E) 3 breakthrough curves for a protein with and without regulation of the flow rate.

Fig 4 A ein Chromatogramm mit erfindungsgemaßer Regelung der Flußrate, in dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt ist und Fig 4 B ein Chromatogramm. bei dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt sind, wobei aber keine Regelung der Flußrate erfolgte4 A is a chromatogram with regulation of the flow rate according to the invention, in which the absorbance is shown as a function of time, and FIG. 4 B is a chromatogram. in which the extinctions are shown as a function of time, but the flow rate was not regulated

Das Ausfuhrungsbeispiel gemäß Fig 1 besteht aus einer Kombination einer HPLC-The exemplary embodiment according to FIG. 1 consists of a combination of an HPLC

Vorπchtung. von der ein Eluentenreservoir 1. eine Dosierpumpe 2, eine Trennsaule 3. ein Detektor 4, ein Fraktionssammler 5 für eluierte Flüssigkeit und eine PC-gesteuerteCaution. of which an eluent reservoir 1. a metering pump 2, a separation column 3. a detector 4, a fraction collector 5 for eluted liquid and a PC-controlled one

Datenerfassungs-.-Steuer- und Auswerteeinheit 6 dargestellt ist. mit einer elektronischenData acquisition -.- control and evaluation unit 6 is shown. with an electronic

Waage 7 zur Messung der Masse an eluierter Flüssigkeit Der Detektor 4 und die elektronische Waage 7 sind mit der PC -gesteuerten Datenerfassungs-. Steuer- und Ausweπeeinheit 6 datenverarbeitungstechnisch verbunden Die PC-gesteuerteScale 7 for measuring the mass of eluted liquid The detector 4 and the electronic scale 7 are with the PC-controlled data acquisition. Control and identification unit 6 connected in terms of data processing technology The PC-controlled

Datenerfassungs-, Steuer- und Ausweπeeinheit 6 liefert Extinktionskurven als Funktion der MasseData acquisition, control and identification unit 6 provides extinction curves as a function of mass

Beispiel 1 Mit einer HPLC- Vorrichtung (Millenium 2010 mit Refraktometer Detektor der WatersExample 1 With an HPLC device (Millennium 2010 with refractometer detector from Waters

GmbH i wird ein Losungsgemisch von Dextranen mit einer Molekularmasse zwischenGmbH i is a solution mixture of dextrans with a molecular mass between

4 000 und 550 000 Chromatographien4,000 and 550,000 chromatographies

In der Tabelle 1 sind die in einer ersten und einer 5 Charge gemessenenTable 1 shows those measured in a first and a 5 batch

Extinktionswerte in bekannter Weise als Funktion der Zeit und erfϊndungsgemaß als Funktion der Masse an eluierter Flüssigkeit dargestellt Es ist sichtbar, daß dieAbsorbance values are shown in a known manner as a function of time and according to the invention as a function of the mass of eluted liquid. It can be seen that the

Extinktionen, die als Funktion der Zeit gemessen wurden zwischen den Chargen deutlich voneinander abweichen, wahrend sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem hohen Maß übereinstimmenAbsorbances, which were measured as a function of time, differ significantly between the batches, while they agree to a high degree using the method according to the invention

Tabelle 1Table 1

Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001

Wie das Ausfuhrungsbeispiel gemäß Fig 2 zeigt, besteht die Vorrichtung aus einer Kombination einer Vorrichtung zur Separationschromatographie mit einem Modul 8, Gefäßen zur Aufnahme der zu separierenden Probenlosung 9. 9'. Eluentenreservoirs 1. 1 '. einem Fraktionssammler 5 für eluierte Flüssigkeit, einem Detektor 4 und aus einer Vorrichtung zur gravimetπschen Dosierung eines Flussigkeits-Massenstromes in Form einer elektronischen Waage 7 , einer Schnittstelle 10. einer PC gesteuerten Datenerfassungs-. Steuer- und Auswerteeinheit 6 und Dosierpumpen 2, 2' Der Modul 8 enthalt einen Chromatograph l sehen Trager 11 in Form eines Membranadsorbers. vorzugsweise eines Membranadsorberstapels aus mindestens zwei Membranlagen, der fluiddicht zwischen einem Flussigkeitseinlaß 12 und einem Flussigkeitsauslaß 13 für Permeat (eluierte Flüssigkeit) angeordnet ist Am Flussigkeitsauslaß 13 für Permeat (eluierte Flüssigkeit) ist der Detektor 4 zur Messung der Extinktion der durch den Trager 11 durchbrechenden Stoffe angeordnet bevor der Flussigkeitsauslaß 13 einem auf einer elektronischen Waage 7 befindlichen Fraktionssammler 5 mundet Die Losung des zu behandelnden Stoffgemisches befindet sich in den Probengefaßen 9 oder 9' Sie wird aus 9' beispielsweise per Hand mittels Kolbenspπtze oder aus 9 automatisch über die Dosierpumpe 2 oder einer wahlweise vorhandenen (Hilfs-) Dosieφumpe 2'. die druckseitig mit dem Flussigkeitseinlaß 12 des Moduls 8 verbunden sind, auf den Trager 11 aufgegeben Die Dosieφumpe 2 und die wahlweise vorhandene (Hilfs-) Dosieφumpe 2' sind ansaugseitig mit den Eluentenreservoirs 1, 1* verbunden Die Vorrichtung zur gravimetnschen Dosierung des Flussigkeits-Massenstromes fordert die Flüssigkeit mit einem voreinstellbaren Wert aus dem Probengefäß 9 und denAs the exemplary embodiment according to FIG. 2 shows, the device consists of a combination of a device for separation chromatography with a module 8, vessels for receiving the sample solution 9, 9 'to be separated. Eluent reservoirs 1. 1 '. a fraction collector 5 for eluted liquid, a detector 4 and a device for gravimetric metering of a liquid mass flow in the form of an electronic balance 7, an interface 10, a PC-controlled data acquisition. Control and evaluation unit 6 and metering pumps 2, 2 'The module 8 contains a chromatograph 1 see carrier 11 in the form of a membrane adsorber. preferably a membrane adsorber stack of at least two membrane systems, which is arranged in a fluid-tight manner between a liquid inlet 12 and a liquid outlet 13 for permeate (eluted liquid) arranged before the liquid outlet 13 flows into a fraction collector 5 located on an electronic balance 7. The solution of the substance mixture to be treated is in the sample vessels 9 or 9 '. It is made from 9', for example by hand using a piston tip, or from 9 automatically via the metering pump 2 or one optionally available (auxiliary) dosing pump 2 '. which are connected on the pressure side to the liquid inlet 12 of the module 8, placed on the carrier 11. The metering pump 2 and the optionally available (auxiliary) metering pump 2 'are connected on the suction side to the eluent reservoirs 1, 1 * . The device for gravimetric metering of the liquid mass flow requests the liquid with a preset value from the sample vessel 9 and

Eluentenreservoirs 1. 1 ' mit der Dosieφumpe 2 oder den Dosieφumpen 2. 2' über den Flussigkeitseinlaß 12. den Trager 11 und den Flussigkeitsauslaß 13 des Moduls 8 in den Fraktionssammler 5. der sich auf der elektronischen W aage 7 befindet Mit Hilfe eines Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteprogramms der PC-gesteuerte Datenerfassungs- , Steuer- und Auswerteeinheit 6 wird aufgrund der Ausgangssignale der Waage 7 die Forderleistung der Dosieφumpe 2 beziehungsweise der Dosieφumpen 2. 2' so geregelt, daß der voreingestellte Wert des Massenstromes an Flüssigkeit, der den Trager 11 passiert, konstant gehalten wird Über die Schnittstelle 10 ist die PC gesteuerte Datenerfassungs-. Steuer- und Ausweπeeinheit 6 mit der Waage 7. den Dosieφumpen 2 . 2' und dem Detektor 4 datenverarbeitungstechnisch verbunden Beispiel 2Eluent reservoirs 1. 1 'with the dosing pump 2 or the dosing pumps 2. 2' via the liquid inlet 12, the carrier 11 and the liquid outlet 13 of the module 8 into the fraction collector 5. which is located on the electronic balance 7 With the aid of a data acquisition , Control and evaluation program of the PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit 6, the output of the dosing pump 2 or the dosing pumps 2, 2 'is regulated on the basis of the output signals of the scale 7 such that the preset value of the mass flow of liquid which corresponds to the Carrier 11 happens, is kept constant Via the interface 10 is the PC controlled data acquisition. Control and identification unit 6 with the scale 7. the dosing pumps 2. 2 'and the detector 4 are connected in terms of data processing technology Example 2

Mit einer erfindungsgemaßen Vorrichtung gemäß Fig 2 wurde die Durchbruchskurve eines Testproteins bei konstanter Flußrate bestimmt und mit einer Durchbruchskurve, die in herkömmlicher Weise ohne Regelung der Flußrate erhalten wurde, verglichen Dazu wurden in beiden Fallen die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt Zur Durchfuhrung des Verfahrens wird ein Modul mit einem stark basischen Membranionenaustauscher von 3.4 cm- Flache mit Rinderserumalbumin (0.5 mg/ml 0,01 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 7) beaufschlagt und die Extinktion im Ablauf des Moduls aufgezeichnet Das Ergebnis wird durch die in der Fig 3 dargestellten Kurven widergegeben, wobei die Kurve 2 ohne Regelung der Flußrate und die Kurve 1 erfindungsgemaß mit Regelung der Flußrate erhalten wurde Aus dem verzogenen Beginn des Durchbruchs an Rinderserumalbumin (Kurve 2j wird eine höhere Kapazität des Membranadsorbers vorgetauscht, als tatsächlich vorhanden ist Außerdem konnte der flache Anstieg der Kurve 2 zu dem Schluß fuhren, daß das System für bestimmte Trennaufgaben unter den gewählten Bedingungen ungeeignet ist2, the breakthrough curve of a test protein was determined at a constant flow rate and compared with a breakthrough curve, which was obtained in a conventional manner without regulating the flow rate. In both cases, the extinctions were represented as a function of time a module with a strongly basic membrane ion exchanger with a surface area of 3.4 cm is exposed to bovine serum albumin (0.5 mg / ml 0.01 M potassium phosphate buffer, pH 7) and the absorbance is recorded in the course of the module. The result is shown in FIG. 3 shown curves, curve 2 being obtained without regulation of the flow rate and curve 1 according to the invention obtained with regulation of the flow rate. From the delayed beginning of the breakthrough of bovine serum albumin (curve 2j, a higher capacity of the membrane adsorber is exchanged than is actually present) Curve 2 increases concluded that the system is unsuitable for certain separation tasks under the chosen conditions

Die Tabelle 2 gibt die gemessenen Flußraten gemäß Beispiel 2 am Beginn und Ende der Charee widerTable 2 shows the measured flow rates according to Example 2 at the beginning and end of the charee

Tabelle 2Table 2

Chargenzustand Flußrate [g min*^ ] Flußrate [ min'l ] mit Reεelune ohne ReεelunεBatch state flow rate [g min * ^] flow rate [min'l] with Reεelune without Reεelunε

Beεinn 16.5 16.5Start 16.5 16.5

Ende 16.2 4 2End 16.2 4 2

Beispiel 3Example 3

Zur Trennung eines Proteingemisches mit der erfindungsgemaßen Vornchtung gemäß Fig 2 wird ein Gemisch der drei kommerziell erhältlichen Proteine Chymotrypsinogen. Cytochrom C und Lysozym (je 0.5 mg/ml. Gesamtproteingehalt 1.5 mg/ml) in 0.01 M Natπum-Acetat-Puffer pH 5.0 gelost und von dieser Losung 1 ml durch einen stark sauren Membran-Ionenaustauscher-Modul gepumpt Dabei war die Adsoφtion der Proteine vollständig, wie das Fehlen von Proteinen im Ablauf der Einheit zeigte Durch Anlegen eines linearen Gradienten von 0-1 M Kalium-Chlorid in 0.01 M Natπum- Acetat pH 5.0 werden die Proteine in der Reihenfolge Chymotrypsinogen. Cytochrom C und Lvsozvm eluieπTo separate a protein mixture with the device according to the invention shown in FIG. 2, a mixture of the three commercially available proteins is chymotrypsinogen. Cytochrome C and lysozyme (0.5 mg / ml each. Total protein content 1.5 mg / ml) dissolved in 0.01 M sodium acetate buffer pH 5.0 and 1 ml of this solution pumped through a strongly acidic membrane ion exchanger module. The proteins were adsorbed completely, as the absence of proteins in the course of the unit showed. By applying a linear gradient of 0-1 M potassium chloride in 0.01 M sodium acetate pH 5.0, the proteins become chymotrypsinogen. Cytochrome C and Lvsozvm eluieπ

ERSATZBLÄΓΓ (REGEL 26) Das mit der erfindungsgemaßen Regelung der Flußrate erhaltene Chromatogramm. in dem die Extinktionen als Funktion der Masse dargestellt ist. zeigt Fig 4 A Ein Vergleich mit einem Chromatogramm. bei dem die Extinktionen als Funktion der Zeit dargestellt ist. und das unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 beschneben erhalten wurde, wobei aber keine Regelung der Flußrate erfolgte (Fig 4 B) zeigt, daß durch Verblocken der Adsorber-Einheit die Elutionspeaks dramatisch verschoben werden, so daß eine sichere Identifikation der einzelnen Substanzen nicht mehr εewahrleistet istSPARE BLADES (RULE 26) The chromatogram obtained with the regulation of the flow rate according to the invention. in which the absorbance is shown as a function of mass. 4 A shows a comparison with a chromatogram. where the absorbance is shown as a function of time. and which was obtained under the same conditions as in Example 3, but with no regulation of the flow rate (FIG. 4B) shows that by blocking the adsorber unit, the elution peaks are shifted dramatically, so that reliable identification of the individual substances is not more is guaranteed

ERSAΓZBLATT (REGEL 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Claims

Patentansprüche Claims 1 Verfahren zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen durch Aufbringen eines Stoff gemisches auf einen in einem Modul befindlichen chromatographischen Trager, Hindurchpumpen von Elutionsflüssigkeiten durch den Modul. Detektieren der nach Passage des Moduls in der eluierten Flüssigkeit vorhandenen Stoffe und Sammeln der eluierten Flüssigkeit in einem Fraktionssammler, dadurch gekennzeichnet, daß die Masse an eluierter Flüssigkeit mit einer Waage gemessen wird und die detektierten1 Procedure for carrying out liquid chromatographic analyzes and separations by applying a mixture of substances to a chromatographic support located in a module, pumping elution liquids through the module. Detecting the substances present in the eluted liquid after passage of the module and collecting the eluted liquid in a fraction collector, characterized in that the mass of eluted liquid is measured with a balance and the detected ones Extinktionswene der Stoffe als Funktion der Masse an eluierter Flüssigkeit zur Anaiv se und Stofftrennung ausgewertet werdenExtinction range of the substances as a function of the mass of eluted liquid for the Anaiv se and material separation are evaluated 2 Verfahren zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen durch Aufbringen eines Stoffgemisches auf einen in einem Modul befindlichen chromatographischen Trager, Hindurchpumpen von Elutionsflüssigkeiten durch den Modul mittels Dosieφumpen. Detektieren der nach Passage des Moduls in der eluierten Flüssigkeit vorhandenen Stoffe, Sammeln der eluierten Flüssigkeit einem Fraktionssammler und Darstellen der detektierten Extinktionswerte als Funktion der Zeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Flußrate an eluierter Flüssigkeit nach Passage des Moduls gemessen wird, die Meßwerte einer PC-gesteuerten Datenerfassungs. Steuer- und Auswerteeineheit zugeführt und derart verarbeitet werden, daß durch Steuerung der Dosieφumpen die Flußrate an eluierter Flüssigkeit konstant auf einen voreinstellbaren Wert gehalten wird2 Process for carrying out liquid chromatographic analyzes and substance separations by applying a mixture of substances to a chromatographic carrier in a module, pumping elution liquids through the module by means of dosing pumps. Detection of the substances present in the eluted liquid after passage of the module, collection of the eluted liquid to a fraction collector and presentation of the detected extinction values as a function of time, characterized in that the flow rate of eluted liquid is measured after passage of the module, the measured values of a PC controlled data acquisition. Control and evaluation unit are fed and processed in such a way that the flow rate of eluted liquid is kept constant at a presettable value by controlling the dosing pumps 3 Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß die Flußrate an eluierter Flüssigkeit gravimetπsch oder volumetπsch gemessen wird3 The method according to claim 2, characterized in that the flow rate of eluted liquid is measured gravimetπsch or volumetπsch 4 Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffgemisch auf Membranadsorber als in einem Modul befindlichen chromatographischen Trager aufgebracht wird4 Process according to claims 1 to 3, characterized in that the mixture of substances is applied to membrane adsorber as a chromatographic support located in a module 5 Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffgemisch auf einen aus mindestens zwei flachigen Zuschnitten bestehenden Membranadsorberstapel aufgebracht ward 6 Vorrichtung zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen gemäß Anspruch 1 bestehend aus einem Modul mit einem Flussigkeitsein- und auslaß. zwischen denen sich ein chromatographischer Trager befindet. Dosieφumpen. die druckseitig mit dem Flussigkeitseinlaß des Moduls und ansaugseitig mit Probegefaßen und Eluentenreservoirs verbunden sind, einem5 The method according to claim 4, characterized in that the mixture of substances was applied to a membrane adsorber stack consisting of at least two flat blanks 6 device for performing liquid chromatographic analyzes and material separations according to claim 1 consisting of a module with a liquid inlet and outlet. between which there is a chromatographic support. Dosing pumps. which are connected on the pressure side to the liquid inlet of the module and on the suction side to sample vessels and eluent reservoirs, one Fraktionssammler, der nach dem Flussigkeitsauslaß des Moduls angeordnet ist und einem Detektor am Flussigkeitsauslaß, dadurch gekennzeichent, daß der Fraktionssammler mit einer Waage zum Messen der Masse an eluierter Flüssigkeit verbunden ist und wahlweise eine PC-gesteuerte Datenerfassungs-, Steuer- und Auswerteeinheit an die Waage und den Detektor datenverarbeitungstechnisch angeschlossen ist. um die detektierten Extinktionen als Funktion der Masse an eluierter Flüssigkeit darzustellenFraction collector, which is arranged after the liquid outlet of the module and a detector at the liquid outlet, characterized in that the fraction collector is connected to a balance for measuring the mass of eluted liquid and optionally a PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit on the balance and the detector is connected for data processing. to represent the detected extinctions as a function of the mass of eluted liquid 7 Vorrichtung zur Durchfuhrung flussigkeitschromatographischer Analysen und Stofftrennungen gemäß der Ansprüche 2 bis 5 bestehend aus einem Modul mit einem7 device for performing liquid chromatographic analyzes and separations according to claims 2 to 5 consisting of a module with a Flussigkeitsein- und auslaß. zwischen denen sich ein chromatographischer Trager befindet, Dosieφumpen. die druckseitig mit dem Flussigkeitseinlaß des Moduls und ansaugseitig mit Probegefaßen und Eluentenreservoirs verbunden sind, einem Fraktionssammler. der nach dem Flussigkeitsauslaß des Moduls angeordnet ist und einem Detektor am Flussigkeitsauslaß. dadurch gekennzeichent. daß über eine Schnittstelle eine PC-gesteuerte Datenerfassungs-, Steuerungs- und Auswerteeinheit mit einer Einrichtung zur Messung der Masse oder des Volumens an im Fraktionssammler vorhandener eluierter Flüssigkeit, den Dosieφumpen und dem Detektor datenverarbeitungstechnisch verbunden ist. derart, daß mit Hilfe der PC- gesteuerten Datenerfassungs-. Steuer-, und Auswerteeinheit die Forderleistung der Dosieφumpen so geregelt wird, daß ein voreingestellter Wert eines Massen- oder Volumenstroms an eluierter Flüssigkeit, der den Modul passiert hat. eingehalten wirdLiquid inlet and outlet. between which there is a chromatographic support, dosing pumps. which are connected on the pressure side to the liquid inlet of the module and on the suction side to sample vessels and eluent reservoirs, a fraction collector. which is located after the liquid outlet of the module and a detector at the liquid outlet. characterized by it. that a PC-controlled data acquisition, control and evaluation unit is connected via data processing technology to a device for measuring the mass or volume of eluted liquid present in the fraction collector, the dosing pumps and the detector. such that with the help of PC-controlled data acquisition. Control and evaluation unit regulates the output of the dosing pumps so that a preset value of a mass or volume flow of eluted liquid that has passed the module. is observed 8 Vorrichtung nach Anspruch 7. dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Messung der Masse eine Waage ist8 Apparatus according to claim 7, characterized in that the device for measuring the mass is a balance 9 Vorrichtung nach den Ansprüchen 6 bis 8. dadurch gekennzeichnet, daß der chromatographische Trager aus Membranadsorbern besteht9 Device according to claims 6 to 8, characterized in that the chromatographic support consists of membrane adsorbers 10 Vorrichtung nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, daß die Membranadsorber als Membranadsorberstapei vorliegen, dieaus mindestens zwei flächieen Zuschnitten bestehenden 10 Device according to claim 9, characterized in that the membrane adsorbers are present as membrane adsorber tapes which consist of at least two flat blanks
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DATABASE WPI Week 8426, Derwent World Patents Index; AN 163992, Y.U. ALAKHOV ET AL.: "Chemical liquids fractions-by-weight collector - has scales to pass continual weight signal to recording device and differentiator to calculate rate of change of flow" *

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