WO1995025793A1

WO1995025793A1 - Lapin transgenique sensibilise aux dyslipoproteinemies

Info

Publication number: WO1995025793A1
Application number: PCT/FR1995/000318
Authority: WO
Inventors: Patrick Benoit; Patrice Denefle; Nicolas Duverger; Louis Marie Houdebine
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-03-21
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 1995-09-28
Anticipated expiration: 1996-09-21
Also published as: EP0751993A1; JPH10501683A; US5792902A; FR2718329A1; CA2184202A1; FR2718329B1

Abstract

La présente invention se rapporte à un lapin transgénique exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, son procédé de préparation ainsi que son usage à titre de modèle animal.

Description

LAPIN TRANSGENIQUE SENSIBILISE AUX DYSLIPOPROTEINEMIES La présente invention a pour objet un lapin transgénique exprimant une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dystipoprotéinémies, son procédé de préparation ainsi que son usage à titre de modèle animal. Les dyslipoprotéinémies sont des désordres du métabolisme des lipoprotéines, responsables du transport dans le sang et les fluides périphériques de lipides comme le cholestérol et les triglycérides. Elles conduisent à des pathologies importantes, liées respectivement à l_ιyperc__olestérolémie, l"hypocholestérolémie ou lliypertriglycéridémie telle que notamment l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie, sur le plan histologique, par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Les hypercholestérolémies peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro- vasculaires, etc. π est donc particulièrement important de pouvoir disposer rapidement de traitements permettant de diminuer, dans certaines situations pathologiques, les taux de cholestérol plasmatique voire de stimuler l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol) au niveau des tissus périphériques afin de décharger les cellules ayant accurnulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athéro e. (Le cholestérol est véhiculé dans le sang par diverses lipoprotéines dont les lipoprotéines de faible densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Les LDL sont synthétisées au niveau du foie et permettent d'approvisionner les tissus périphériques en cholestérol. Au contraire, les HDL captent le cholestérol au niveau des tissus périphériques et le transportent vers le foie où il est stocké et ou dégradé).

Dans cette perspective, il serait intéressant de disposer d'un modèle animal capable d'exprimer une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. Un tel modèle animal serait particulièrement avantageux pour la compréhension de ces pathologies et plus particulièrement des mécanismes de régulation qu'elles initient. Il permettrait de tester, in vivo et rapidement, un nombre important d'agents thérapeutiques pour détecter une activité potentielle au niveau de l'expression desdites protéines. Un tel modèle serait en outre intéressant pour développer de nouvelles méthodes thérapeutiques pour le traitement de ce type de pathologies telles des méthodes basées sur la thérapie génique par exemple.

La présente invention a précisément pour objet de proposer un lapin génétiquement modifié dans ce sens.

D'une manière générale, les murins à savoir les souris, rats et cobayes sont les modèles animaux les plus répandus. Ils sont facilement manipulables et de faible coût. Malheureusement, ces petits mammifères ne sont pas toujours compatibles avec l'application visée. C'est ainsi qu'ils ne sont pas toujours représentatifs du modèle humain et de ses métabolismes. Plus proche de l'homme, le chimpanzé est un animal témoin qui est surtout utilisé pour détecter des agents thérapeutiques et des vaccins dirigés contre le sida et le cancer. Toutefois, son coût très important constitue un handicap majeur et contraignant au niveau de son utilisation.

Le lapin s'est avéré dans le cadre de la présente invention, le modèle animal approprié. Le métabolisme et les pathologies liées aux lipoprotéines sont connues, chez le lapin, de façon exhaustive. C'est un animal qui est classé 'mammifère à LDL", c'est-à-dire que les LDL sont les transporteurs majoritaires du cholestérol plasmatique comme chez l'homme, contrairement aux rats et souris qui sont des animaux classés "mammifères à HDL". De plus, il existe de nombreuses variations génétiques des niveaux des lipoprotéines parmi les lignées de lapins tels que les lapins WHHL, déficients en récepteur LDL (Watanabe heritable hyperlipidaemic rabbit) ou bien les lapins "St Thomas Hospital" qui surproduisent les LDL (Rosenfeld et al, 1990, Arteriosclerosis _, 680-687 ; Sedon et al; 1987, Arteriosclerosis 7, 113-124).

Plus précisément, la présente invention concerne un lapin transgénique dans le génome duquel est insérée au moins une séquence d'ADN génomique exogène codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

Un lapin transgénique selon l'invention peut intégrer la séquence d'ADN génomique dans toutes ses cellules ou seulement dans un certain pourcentage de cellules, il sera alors dit mosaïque. En général, la séquence d'ADN génomique est intégrée au niveau de toutes les cellules.

Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous la désignation "protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies", les apolipoprotéines et tout produit protéique ayant une activité liée aux pathologies cardiovasculaires. De préférence le terme produit protéique désigne tout mutant, fragment ou peptide possédant au moins une propriété biologique d'une apolipoprotéine, ainsi que tout variant naturel des apolipoprotéines.

Par séquence d'ADN génomique, on entend désigner selon l'invention, l'ADN génomique ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns.

De préférence, il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humaine. Avantageusement, l'utilisation d'ADN génomique comparativement à l'ADN complémentaire conduit à des taux d'expression nettement plus élevés. La séquence d'ADN génomique insérée selon l'invention, code pour tout ou une partie active d'au moins une protéine impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. Il peut s'agir:

-d'une apolipoprotéine choisie par exemple parmi les apolipoprotéines A-I, A-ϋ, A-IV, B, C-I,

C-π. C-III, D, E, F, G, H, J et aρo(a),

-d'une enzyme telle la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique ou la lécithine cholestérol acyltransférase,

-d'une protéine de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides,

-d'une protéine de liaisons des HDL ou encore

-d'un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons- remnants et les récepteurs scavenger.

Bien entendu, cette liste est présentée à titre non limitatif du domaine de l'invention.

Cette séquence d'ADN génomique peut égalment comprendre plusieurs gènes, organisés le cas échéant sous forme de cluster.

Parmi les séquence d'ADN insérées au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour tout ou une partie active des apolipoprotéines AI,

B, AIV ou E ou d'un variant ou d'un dérivé de celles-ci.

L'apolipoprotéine AI est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une préproprotéine de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et l'intestin et elle constitue la protéine essentielle des particules HDL (70% de leur masse en protéines). Elle est abondante dans le plasma (1.0-1.2 g/1). Son activité la mieux caractérisée sur le plan biochimique est l'activation de la lécithine-cholestérol acyl-transférase (LCAT), mais de nombreuses autres activités lui sont attribuées, comme notamment la stimulation de l'efflux de cholestérol cellulaire. Le rôle physiologique de l'apolipoprotéine AI semble contrebalancé par l'apolipoprotéine AH puisque chez l'homme, le rapport des deux concentrations plasmatiques (AII/AI) est très étroitement corrélé avec le risque coronarien. L'apolipoprotéine AI joue un rôle majeur dans la résistance à l'athérosclérose, probablement lié au transport inverse du cholestérol, puisque la seule expression de cette apolipoprotéine dans des souris transgéniques permet de réduire de 40 fois la surface des dépôts lipidiques au niveau de l'aorte par rapport à des souris contrôles (Rubin et al. 1993 Science, vol 365 p 762). Son gène, long de 1863 bp, a été clone et séquence (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine AI, on peut citer notamment les variants naturels décrits dans l'art antérieur (tableau ci- après).

. L'apolipoprotéine B-100 est le constituant protéique majeur des lipoprotéines de très basses densité (VLDL), des lipoprotéines de basse densité (LDL) et de la lipoprotéine Lp(a). Cette protéine est le ligand physiologique du récepteur LDL, et sa concentration plasmatique est positivement corrélée avec le développement de l'athérosclérose (Brunzell et al. 1984 Arterioscerosis 4, 79-93). L'apoB- 100 est une des plus grosses protéines connues avec une masse de 550 kDa et elle contient 4536 acides aminés (Chen et al. 1986 J; biol, Chem, 261, 12919-21). Cette apolipoprotéine est synthétisée uniquement dans le foie. Sa concentration plasmatique est de 1,0-1,2 g/1. L'apoB-100 est le transporteur plasmatique majeur du cholestérol synthétisé dans le foie vers les autres cellules de l'organisme. Une autre version de l'apoB, l'apoB-48, est présente dans les chylomicrons. Chez l'homme, l'apoB-48 est synthétisée dans l'intestin. L'apoB-48 a une masse de 260kDa et contient 2152 acides aminés qui correspondent de façon linéaire à 48% du côté N-terminal de l'apoB-100 (Powell et al, 1987, Cell 50, 831-40). Sachant que la moitié C-terminale de l'apoB-100 contient la zone de liaison de l'apoB-100 au récepteur LDL, l'apoB-48 ne se fixe pas sur ce dernier et se comporte métaboliquement différemment.

L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, synthétisée spécifiquement dans l'intestin sous la forme d'un précurseur de 396 résidu. La protéine plasmatique, est relativement abondante (0.16 g/1) et a une masse moléculaire de 46.000 daltons. Elle est un composant majeur des chylomicrons sécrétés dans la lymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associée avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24 : 52-59). Par ailleurs, l'apoAIV plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257 : 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol. Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 : 4171-4178). Ces deux activités indiquent que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol. Le gène de l'apoAIV a été clone et décrit dans l'art antérieur (voir notamment WO 92/05253 et Elshourbagy et col, J. Biol. Chem., 1987, 26.2(17), 7973-7981). Parmi les produits protéiques à activité de type apolipoprotéine ATV, on peut citer notamment les fragments et dérivés décrits dans la demande de brevet FR 92 00806.

L'apolipoprotéine E comprend 317 résidus dont 18 correspondent au peptide signal. Il n'y a pas de propeptide. Le gène de l'apoE a été clone et séquence (environ 3600bp) et code pour un ARNm de 1163bp, [Das et coll, J. Biol. Chem., 1985, 260, 6240-6247). L'apoE est répartie dans le plasma entre les particules VLDL et HDL. Elle représente environ 10-20% des protéines des VLDL et 2% des protéines des HDL. Les HDL-E constituent une sous-classe distincte de HDL. La concentration plasmatique de l'apoE est d'environ 0.05 g/1. L'apoE est synthétisée sous la forme d'une sialo-protéine qui est ensuite désialilée dans le plasma. La synthèse de l'apoE est réalisée par le foie et faiblement par l'intestin. Cependant, contrairement aux autres apolipoprotéines, l'apoE est également synthétisée dans de nombreux autres tissus (cerveau, rein, surrénales, cellules réticulo-endothéliales...). L'apoE reconnaît avec une très forte affinité le récepteur aux LDL (apoB/E receptor) mais également un autre récepteur sur les cellules hépatiques ne reconnaissant pas l'apoB (chylomicron/remnant receptor). Un polymorphisme a été mis en évidence sur la base de mobilités electrophorètiques différentes. Six phénotypes majeurs (E2/2, E2/3, E2/4, E3/4, E3/3, E4/4) ont ainsi été décrits. Selon les études menées sur de grandes populations caucasiennes, la prévalence des allèles correspondants serait de 14-15% pour e4, de 74-78% pour e3 et 8-12% pour e2. Un écart est trouvé chez les Finlandais pour lesquels e4 est plus abondant (23%) et e2 moins abondant(4%). L'allèle normal est e3. L'allèle e2 correspondrait à la dyslipoprotéinémie de type HI (phénotype E2/2), maladie associée à une augmentation du cholestérol et des triglycérides, des xanthomes et à une athérosclérose précoce. Une association entre l'allèle e4 et la maladie d'Alzheimer familiale a été rapportée récemment (Strittmatter et al. P.N.A.S. 99 (1993) 1977). Plus récemment la destruction du gène de l'apoE dans la souris a montré l'apparition d'une hypersusceptibilité à l'athérosclérose (E. Rubin et al. Cell 1992).

Généralement, la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule la contenant. Il peut s'agir de séquences qui sont naturellement responsables de l'expression dudit gène lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans ladite cellule. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Les séquences promotrices non virales préférentiellement utilisées sont les promoteurs ApoAI ou les enhancers hépatiques de l'ApoE ou intestinaux de l'apo CIIL Bien entendu, ces séquences d'expression peuvent en outre, être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. L'ADN génomique peut également être inclut dans un vecteur d'expression de grande capacité comme les vecteur PI ou encore les YAC

La présente invention vise également la protection d'un lapin transgénique selon l'invention susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du lapin transgénique revendiqué. Plus précisément, elle se rapporte à un procédé d'obtention du lapin transgénique selon l'invention mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, le transfert de l'embryon à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN génomique dans le génome du lapin nouveau-né. Le procédé d'obtention selon l'invention est décrit plus en détail dans l'exemple 2 présenté ci-après. La mise en oeuvre d'un tel procédé ne pose aucune difficulté à l'homme de l'art familiarisé aux techniques de micro-injection, de prélèvement et d'implantation d'embryons. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du lapin transgénique revendiqué pour détecter l'activité d'agents thérapeutiques ou de méthodes thérapeutiques en vu de prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies ainsi qu'aux procédés de détection de nouveaux composés mettant en oeuvre ce lapin et aux composés ainsi caractérisés. La présente invention offre ainsi un modèle animal particulièrement avantageux pour détecter des agents thérapeutiques spécifiques au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies. en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires. ou dans le domaine des affections neurologiques où certaines apolipoprotéines comme l'apoE semblent jouer un rôle important (maladies du viellissement neuronal. Alzheimer familial, régénération neuronale).

La présente invention est plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

- Figure 1 : Représentation de l'ADN génomique codant pour l'apolipoprotéine AI.

- Figure 2: Concentration du cholestérol des fractions VLDL et LDL au cours d'un régime riche en cholestérol.

- Figure 3: Concentration plasmatique en cholestérol de la fraction HDL au cours d'un régime riche en cholestérol.

- Figure 4: Evaluation de la surface lésée contenant des stries lipidiques chez les lapins transgéniques et lapins témoins.

- Figure 5: Comparaison de l'accumulation de cholestérol dans l'aorte thoracique des lapins transgéniques et témoins après un régime de 14 semaines. - Figure 6: Comparaison de l'accumulation d'esters de cholestérol dans l'aorte thoracique des lapins transgéniques et témoins après un régime de 14 semaines. EXEMPLE 1

PREPARATION DU FRAGMENT GENOMIQUE D'APO-Al

Un fragment d'ADN contenant le gène codant pour l'apolipoprotéine AI humaine, sous contrôle de son propre promoteur, a été obtenu par criblage d'une banque génomique humaine.

Pour cela, une banque de fragments partiels EcoRI d'ADN chromosomique issu des cellules K562 a été construite dans le bactériophage Charon 4a. Cette banque a été ensuite criblée par hybridation avec une sonde d'ADN complémentaire de l'apolipoprotéine AI humaine.

Le clone K 3-5-10 a été isolé dans ce criblage et analysé par rapport aux cartes de restriction publiées pour le complexe génomique AI/CH/AIV (S.K. Karathanasis et al, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6147-6151, 1983. S.K. Karanthanasis, Proc Natl. Acad. Sci. USA,

82, 6374-6378, 1985). Il contient en particulier un fragment EcoRI d'environ 12,5 kbases qui hybride avec l'ADN complémentaire de l'Apo-AI (cf. figure 1).

Le phage K3-5-10 a été amplifié en milieu solide et son ADN préparé par des techniques classiques. Le fragment de restriction EcoRI-BamHI (la digestion BamHI permet de bien séparer ce fragment sur un gel d'agarose) contenant le gène de l'ApoAI a ensuite été purifié à partir d'un gel d'agarose préparatif et dialyse contre une solution de tris 10 mM pH 7- 5 EDTA 0.1 nM avant injection.

EXEMPLE 2

GENERATION DES LAPINS TRANSGENIQUES SELON L'INVENTION

La superovulation de 28 lapines de la race néozélandaise et âgées de 5 mois a été induite par injection de 0,375 g de FSH (folliculine stimulating hormone) de porc matin et soir pendant 1 jour, puis de 0,782 mg de FSH de porc matin et soir le jour suivant et enfin de 0,375 mg de FSH de porc le 3ème jour au matin. Vers 16 heures le même jour, les 16 lapines, en état de superovulation, ont été mises en présence de mâles de la même race, pour être fécondées. A l'issue de la fécondation, 0,33 mg de LH (luteising hormone) sont injectées à chaque lapine. Le 4ème jour au matin, les femelles ont été séparées des mâles, puis sacrifiées. Les embryons sont prélevés par lavage de l'utérus de chaque lapine.

Les oeufs, encore agglutinés par un tissu folliculeux sont trempés pendant 20 minutes, environ dans une solution de hyaluronidase. Puis ils sont lavés deux fois dans la solution de Brinster. Pour les manipuler ensuite sous le microscope, les oeufs ont été déposés dans une goutte de solution Brinster-Hépès additionnée de cytochalasine. Cette solution permet à l'oeuf d'avoir une meilleure résistance à l'injection.

Par observation au microscope (grossissement xlOO x 200) les oeufs ont été sélectionnés et mis en culture dans du milieu B2 Menezo. Environ 500 embryons ont été retenus pour la microinjection.

Ce même quatrième jour, dans un délai très court de l'ordre de 30 minutes après leur prélèvement, les embryons reçoivent par micro-injection dans le pronucléus mâle 2 picolitres d'une solution de l'ADN obtenu selon l'exemple 1. L'ADN est à la concentration de 2,5 pg/ml dans lOmM Tris pH 7,5-0,1 mM EDTA.

Ces embryons microinjectés ont été ensuite répartis entre 24 lapines de la race néozélandaise en état de pseudo-gestation. Sur ces 24 lapines seulement 3 d'entre elles n'ont pas mené leur gestation à terme. 41 lapereaux sont nés pour 3 mort-nés.

Pour l'identification des transgéniques, les 41 lapereaux ont été analysés de la façon suivante : L'ADN, extrait à partir d'un fragment de queue prélevé sur chaque lapereau, est analysé par PCR pour la présence de l'ADN génomique humain codant pour l'ApoAI. Les amorces suivantes, 5'-TGGCTTTCTCGCCAAGTGTCTTCAGGTGG-3' et 5'-GACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTTGAA-3', sont spécifiques de la séquence de l'ApAI humaine et permettent d'amplifier un fragment de 800pb chez les animaux transgéniques.

6 lapereaux transgéniques sur les 41 analysés, ont de cette manière été identifiés.

Ultérieurement, il a été vérifié que les lapins transgéniques transmettaient le gène Apo-AI à leur descendance.

EXEMPLE 3

CONTROLE DE L'EXPRESSION DE L'APOLIPOPROTEINE A-I HUMAINE DANS LE PLASMA DES LAPINS TRANSGENIQUES

Des échantillons de sang frais des lapins transgéniques, âgés de 5 mois, et des lapins témoins ont été obtenus par prélèvement à l'oreille après une nuit à jeun, et introduits dans des tubes contenant de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique à la concentration finale de 1,5 g 1.

Après le prélèvement, ces tubes ont été mis directement dans de la glace pillée. Le plasma a été obtenu par centrifugation lente de 30 minutes à 4°C.

La concentration d'apolipoprotéine A-I humaine a été quantifiée par le kit HYDRAGEL APOAIB(SEBIA, réf. N°4050), kit de gels d'agarose contenant 2 anticorps polyclonaux monospécifiques : anti apoA-I et anti apoB. Ces anticorps sont faits chez le lapin, ce qui exclue les réactivités croisées homme-lapin.

Les résultats des dosages d'apolipoprotéine A-I humaine obtenus chez les six lapins transgéniques A-I figurent dans le tableau I ci-après.

Lapin ApoA-I humaine (g/1)

N° 1 (mâle) 1,00

N° 2 (mâle) 1,21

N° 3 (mâle) 0,73

N° 4 (mâle) 0,17

N° 5 (mâle) 0,30

N° 6 (femelle) 0,92

Témoins (5 mâles et 5 femelles) 0,00

Tableau I

EXEMPLE 4

MODIFICATIONS DES PROFII-S LIPOPROTEIOUES CHEZ LES LAPINS TRANSGENIQUES

Les dosages de cholestérol total, triglycérides et du cholestérol HDL (high density lipoprotéines) ont été réalisés avec des kits commerciaux (Boehringer Mannheim, Allemagne). Les différentes fractions de lipoprotéines ont été séparées par ultracentrifugation selon la méthode de Havel et al. (RJ. Havel, H.A. Eder et J.H. Bragon, 1955, J. Clin. Invest, vol 34, 1345).

Les résultats des dosages de lipides obtenus chez les 6 lapins transgéniques A-I et lapins témoins, tous âgés de 5 mois, sont représentés dans les tableaux II et III.

Lapin Triglycérides (mg. dl)

N° 1 (mâle) 39,10

N° 2 (mâle) 11,80

N° 3 (mâle) 15,10

N° 4 (mâle) 09,80

N° 5 (mâle) 29,40

N° 6 (femelle*) 09,50

Témoins (5 mâles et 5 femelles) 25,20 (8)

Tableau II

Tableau III

* = femelle gestante. Entre parenthèse = écart-type **=Very Low Density Lipoprotein. EXEMPLE 5

PROTECTION DES LAPINS TRANSGENIQUES EXPRIMANT L'APOLIPOROTEINE

A-I CONTRE LE DEVELOPPEMENT DE L'ATHEROSCLEROSE

Pour évaluer la protection obtenue par l'apoA-I chez les lapins transgéniques issus de la lignée n°20, nous avons mis ces lapins et des lapins témoins en régime riche en cholestérol, et nous avons ajusté leur niveaux de cholestérol athérogène, VLDL et LDL-cholestérol (Figure 2). Les concentrations de cholestérol ont augmenté progressivement jusqu'à environ 10-12 g/1 entre la 6^,eme semaine de régime et la fin du régime (14 semaines).

Le taux plasmatique du cholestérol-HDL a aussi été évalué. Les concentrations du HDL-C ont approximativement été 2 fois plus élevées chez les lapins transgéniques par rapport aux témoins tout au long de l'expérience (Figure 3).

En fin d'expérience, nous avons évalué les lésions obtenues. Ces lésions se situent notamment au niveau de l'aorte, surtout de la crosse aortique et au départ des artères. L'utilisation de lapins nous permet ici d'avoir une quantification plus précise des lésions et de connaître leur nature. Les résultats de cette expérience montrent que la surface contenant les lésions chez les lapins transgéniques correspond à environ 50% de celle observée chez les lapins témoins (Figure 4).

L'accumulation de cholestérol dans l'aorte est aussi significativcment plus faible chez les lapins transgéniques que chez les témoins (Figure 5).

Cette différence concerne notamment la quantité d'esters de cholestérol retrouvé au niveau de l'aorte. On observe en effet, une accumulation des CE chez les lapins témoins qui n'est pas retrouvée chez les lapins transgéniques (Figure 6).

En utilisant le lapin comme modèle, nous avons donc mis en évidence le rôle protecteur de l'apoA-I dans le phénomène d'athérosclérose.

EXEMPLE 6

OBTENTION DE LAPINS TRANSGENIQUES EXPRIMANT L'APOLIPOROTEINE A-I DANS UN FOND GENETIQUE WATANABE Le lapin transgénique n°20 a été croisé avec des femelles WHHL (Watanabe Heritable HyperLipemic). Chez 8 des 15 descendants, tous hétérozygotes pour la déficience en récepteur LDL. nous avons détecté la présence du transgène. Ces 8 lapins sont donc transgéniques pour l'apoA-I et hétérozygotes pour la déficience en récepteurs LDL. Les concentrations en HDL-C sont de 70±10 mg/Dl chez les lapins transgéniques apoA-I humaine (n=8) contre 35±10 md/DL chez les lapins témoins (n=7). La concentration plasmatique d'apoA-I chez les transgéniques est l.OO±O.15 mg/DL (n=7).

Un lapin mâle transgénique pour l'apoA-I humaine et hétérozygote WHHL a ensuite été croisé avec des femelles WHHL. Les lapins issus de ce croisement sont pour la moitié hétérozygotes WHHL et pour l'autre moitié homozygote WHHL. Ces lapins se différencient par leur niveaux plasmatiques de cholestérol total, entre 100 et 300 mg/DL pour le premier groupe et entre 400 et 800 mg/Dl pour le second groupe. Nous avons obtenus 14 lapins issus de ce croisement dont plusieurs possèdent le transgène apoA-I humaine et ceci dans les deux groupes de lapins. hétérozygotes WHHL et homozygote WHHL.

En utilisant des croisement successifs, nous avons donc obtenu des lapins transgéniques exprimant l'apoA-I humaine dans un fond génétique homozygote WHHL.

Claims

REVENDICATIONS

1. Lapin transgénique dans le génome duquel est insérée au moins une séquence d'ADN exogène génomique codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

2. Lapin transgénique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN génomique humain.

3. Lapin transgénique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la séquence d' ADN code pour au moins une apolipoprotéine ou un produit protéique ayant une activité liée aux pathologies cardiovasculaires.

4. Lapin transgénique selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que la séquence d' ADN code pour tout ou une partie active de l'apolipoprotéine AI, de l'apolipoprotéine B, de l'apolipoprotéine AIV, de l'apolipoprotéine E ou d'un variant ou d'un dérivé naturel de celles-ci.

5. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN génomique insérée comprend également des séquences permettant son expression dans la cellule la contenant.

6. Lapin transgénique selon la revendication 5 caractérisé en ce que ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation et/ou de régulation.

7. Lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 6 caractérisé en ce qu'il exprime au moins une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

8. Procédé d'obtention d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 mettant en oeuvre l'injection dans un embryon de lapin, d'au moins une séquence d'ADN exogène génomique, codant pour une protéine susceptible d'interférer dans les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, le transfert de l'embryon à une lapine receveuse et après la naissance, le contrôle de la présence de ladite séquence d'ADN génomique dans le génome du lapin nouveau- né.

9. Utilisation d'un lapin transgénique selon l'une des revendications de 1 à 7 pour détecter l'activité d'agents thérapeutiques ou de méthodes thérapeutiques en vu de prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies.

10. Procédé pour détecter des composés utiles pour prévenir et/ou traiter les pathologies liées aux dyslipoprotéinémies caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un lapin selon l'une des revendications de 1 à 7.

11. Composés mis en évidence selon le procédé de la revendication 10.