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WO1994009148A1 - Procede pour produire une proteine d'antigenes majeurs d'hystocompatibilite classe ii et materiau sur lequel elle est immobilisee - Google Patents

Procede pour produire une proteine d'antigenes majeurs d'hystocompatibilite classe ii et materiau sur lequel elle est immobilisee Download PDF

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WO1994009148A1
WO1994009148A1 PCT/JP1993/001480 JP9301480W WO9409148A1 WO 1994009148 A1 WO1994009148 A1 WO 1994009148A1 JP 9301480 W JP9301480 W JP 9301480W WO 9409148 A1 WO9409148 A1 WO 9409148A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
major histocompatibility
class
superantigen
mhc class
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1993/001480
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English (en)
French (fr)
Inventor
Keishi Miwa
Mayumi Fukuyama
Takehiko Uchiyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
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Priority to AU51613/93A priority patent/AU674891B2/en
Priority to ES93922634T priority patent/ES2182832T3/es
Priority to DE69332268T priority patent/DE69332268T2/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing major histocompatibility antigen class I protein (hereinafter abbreviated as MHC class I) found on the surface of antigen-presenting cells and the like, and the MHC class I or II C class III ⁇ and / or subunits.
  • MHC class I major histocompatibility antigen class I protein
  • the present invention relates to an MHC class II immobilization material characterized by being covalently bonded to materials such as beads, fibers, hollow fibers, and the like, and a superantigen removal module using the same.
  • the present invention also relates to a method of detecting or quantifying a superantigen using MHC class I or a part of the HC class II having an affinity for superantigen, and a measuring kit therefor.
  • MHC class I is a glycoprotein that exists on the surface of cells such as ⁇ cells, macrophages, and vascular endothelial cells, and is used to distinguish between self and nonself when presenting antigen.
  • MHC class I is a binding protein to a group of proteins called superantigens such as bacterial toxins, and that there is a bias in the subclass of ⁇ ⁇ C class ⁇ in autoimmune diseases. Medicine ⁇ Immunological importance has begun.
  • a superantigen binds to and forms a complex with MHC class I on antigen-presenting cells without undergoing a processing step in antigen-presenting cells unlike conventional antigens.
  • Staphylococcus aureus toxin Staphylococcus aureus toxin, streptococcal toxin, Yersinia toxin, and certain viral and heat shock proteins have been identified, but may continue to be identified.
  • MHC class I can be isolated and obtained by introducing and expressing MHC class I genes in mammalian cells or insect cells, or by transducing naturally occurring MHC class I into ⁇ cells, macrophages, vascular endothelial cells, etc. It must be purified from the cell membrane.
  • MHC class I can be isolated and obtained by introducing and expressing MHC class I genes in mammalian cells or insect cells, or by transducing naturally occurring MHC class I into ⁇ cells, macrophages, vascular endothelial cells, etc. It must be purified from the cell membrane.
  • a large amount of native MHC class I is obtained from the cell membrane, a large amount of cells are required due to the low expression level on the membrane surface, and even if cultured cells are used, much time and cost are required.
  • MHC class III immobilization materials have been synthesized by expressing MHC class III on the cell surface and adsorbing the cells together with the plate, or by synthesizing partial amino acid sequences of MHC class III subunits. Materials adsorbed and immobilized on materials have been reported (JK Russell et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 168, 696 (1990)).
  • a material for adsorbing a superantigen a material in which an antibody against a superantigen has been immobilized has already been reported, and is used for immunoassay of a superantigen.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing MHC Class II, wherein productivity and operability are facilitated by using bacteria.
  • Bacteria differ from cells derived from insects and mammals in that they have a high growth rate, do not require expensive compositions such as fetal calf serum and growth factors, and do not require operations such as subculture and medium exchange.
  • proteins derived from mammals are often not expressed in bacteria such as Escherichia coli due to problems such as bacterial toxicity.
  • the present inventors have studied various expression vectors for improvement, and as a result, succeeded in expressing MHC class I in bacteria such as Escherichia coli, yeast, and Bacillus subtilis, and to produce proteins efficiently and in large quantities. Was made possible.
  • the present invention also relates to the development of a blood purification system for pathogens, which is medically MHC class III-affinity containing superantigen. It is intended to provide a material capable of binding the above-mentioned pathogens in general for use in the isolation and purification of pathogenic substances having an MHC class II affinity and enzyme immunoassay.
  • proteins and the like other than MHC class II are also immobilized on the material immobilized for each cell, which may have unknown activity, and the immobilization density may be changed arbitrarily.
  • the material obtained by synthesizing the partial amino acid sequence of the MHC class I subunit and adsorbing and immobilizing it on the material can be used for the purpose of detecting high-concentration superantigens in a buffer solution, but it can be used for the purpose of detecting superantigen in blood.
  • adsorption and immobilization cannot be used because the release of ligand is considered.
  • the ability to bind to the superantigen is low only with the partial sequence, and sufficient performance cannot be obtained when detecting and quantifying the superantigen.
  • the antibody-immobilized material a material in which a different antibody is immobilized for each type of superantigen is required.
  • the present invention is intended to solve the problems of the related art, and has the following configuration. That is, the present invention
  • a method for producing a major histocompatibility class ⁇ protein which comprises transforming a microorganism with a gene encoding a major histocompatibility class ⁇ protein;
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an expression vector for expressing MHC class I ⁇ -subunit in E. coli.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of an expression vector for expressing the MHC class I subunit in E. coli.
  • FIG. 3 shows the relationship between the amount of TSS ⁇ -1 removed from the buffer solution by the MHC class I immobilized beads and the reaction time.
  • FIG. 4 shows the relationship between the amount of TSS ⁇ -1 removed from serum and the reaction time when a hollow fiber having MHC class I immobilized thereon was used.
  • Figure 5 shows the S ⁇ concentration in enzyme immunoassay (sandwich method) using plates immobilized with MHC class I, MHC glass I ⁇ subunits, and 9 partial subsequence peptides. The relationship with the absorbance at 50 nm is shown.
  • the gene encoding MHC class I used in the present invention is a DNA sequence which has already been reported (LJ Stern et al., Cel I, vol. 68, p465, (1992), DA We 11stein et al., J. Exp. Med., Vol. 174, p219, (1991)), DNA primers for PCR were prepared and used in human cells such as B cells. , Enzyme Extra Edition) vol. 35 No. ⁇ (1990) ”, which was reproduced by PCR.
  • Examples of a method for preparing the protein encoded by DN ⁇ include a method using a gene recombination technique to express it in Escherichia coli, yeast, insect cells, and mammalian cells.
  • Escherichia coli, yeast or Bacillus subtilis is more preferable in view of high production efficiency such as high growth rate and good operability such as culture conditions.
  • the expression method is to add a protein synthesis initiation signal and a termination signal to the DNA encoding the present protein or a part thereof, or to add a secretion signal when secreting the protein out of the cells, and then to various known expression vectors.
  • a method for directly expressing the protein of the present invention or a part thereof, and other peptides such as interleukin 2 and maltose binding Fusion protein, ⁇ -galactosidase, trp E protein, etc.). If the activity of MHC class I is maintained in consideration of the ease of protein purification after expression, a histidine hexamer or the like may be added.
  • MHC class I Considering the toxicity of MHC class I against bacteria, it is possible to form insoluble granules in the form of a fusion protein during expression, or to have a high ability to control transcription initiation such as T7 ribonuclease promoter and heat shock promoter. It is preferable to use a promoter.
  • a protease eg, activated blood coagulation tenth factor (FitorXa), IgA protease
  • chemical reagent eg, cyanogenpromide
  • equimolar amounts of both subunits are mixed4. Leave at a temperature of C to 60 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C, for 5 minutes or more, more preferably 60 minutes or more.
  • the material immobilized with MH C class ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the present invention can be used to transform natural MH C class ⁇ ⁇ ⁇ obtained from a biological membrane or its ⁇ and Z or / 8 subunits or a part thereof, or transform cells or bacteria.
  • the resulting recombinant MHC class ⁇ or its ⁇ and ⁇ or) 3 subunits or a part thereof are covalently bonded to materials such as beads, fibers, hollow fibers, woven fabrics, plates, tubes, etc. Is obtained by
  • MHC class I is a recombinant type, Particularly, those produced by Escherichia coli or yeast are more preferable.
  • MHC class I is a natural type MHC class I or a CHO cell, L cell, or other mammal that is isolated and purified directly from the cell membrane of antigen-presenting cells such as B cells and mononuclear cells, or stimulated with gamma interferon.
  • An MHC class obtained by transforming a cell of origin or an insect cell ⁇ a recombinant MHC class purified from a production cell ⁇ can be used.
  • a recombinant type particularly one produced by Escherichia coli, yeast or Bacillus subtilis is more preferable because it can be efficiently obtained in a large amount.
  • the binding ability can be obtained by fixing only the MHC class I subnet or a partial sequence thereof, it is preferable to have a molecular weight of 40 amino acids or more, more preferably from the viewpoint of the binding strength. Use the ⁇ complex.
  • the immobilization method can be obtained by binding or adsorbing using a covalent bond, an ionic bond, a coordination bond, a hydrophobic bond, or an encapsulation method, but a covalent bond is more preferable to prevent the immobilization of the immobilized protein. .
  • protein immobilization uses amino, carboxyl, or sulfide groups of proteins.However, considering that there is a superantigen binding site at the ⁇ -terminal of MHC class III, An immobilization method using a sil group is more preferable.
  • Carriers for immobilizing MHC class I are polymethyl methacrylate, polystyrene, polysulfone, polyallylamine, polyvinyl alcohol or derivatives thereof such as natural polymers such as cellulose, chitosan or derivatives thereof.
  • Beads, fibers, hollow fibers, plates, tubes, etc. composed of polymers, inorganic materials such as ceramics and metals can be used.
  • MHC class I or MHC class II ⁇ -subunit or ⁇ subunit or their partial sequence peptides allows the use of one type of immobilized material to convert all superantigens. It became possible to capture.
  • the number of amino acid residues is preferably 30 mer or more, more preferably 4 Omer or more, and more preferably the entire subunit.
  • the MHC class II composed of ⁇ and the subunit is more preferable.
  • the cr subunit of MHC class I was prepared as follows.
  • the MHC class I ⁇ subunit gene was inserted between the EcoRl site and the Xbal site of pUEF, which has a heat shock promoter and has a sequence encoding a recognition site for galactosidase and blood factor Xa.
  • Figure 1 E. coli transformed with the base Kuta one, the 3 0 ° C, P after induction medium temperature to apply the induced for 15 minutes increased the 8-hour culture after medium temperature 4 2 in L medium After culturing at 37 ° C for another 2 hours, Escherichia coli was recovered from the culture solution.
  • fusion protein with galactosidase by making it a fusion protein with galactosidase, it can be purified using a para-aminophenyl 1-1,000-size ⁇ -D-galactopyranoside immobilized column, and FactorXa between galactosidase and MHC class I Is digested with FactorXa after expression of the protein.
  • a MHC class II ⁇ -subunit that does not contain zeolites can be obtained.
  • The; 9 subunit of MHC class I was prepared as follows.
  • An MHC class II subunit gene is inserted between the EcoRl site and the Hindlll site of the PTI vector, which has a tributophan promoter and has a sequence coding for the recognition site of the trp E protein and IgA protease. Inserted ( Figure 2). Transform Escherichia coli using this vector, culture in M9 medium at 37 ° C for 8 hours, and induce with indoleacrylic acid. After induction, the cells were cultured for 2 hours, and then E. coli was recovered from the culture solution.
  • the target protein is precipitated in an insoluble fraction by forming a fusion protein with the trpE protein. After washing the insoluble fraction with Tris buffer containing 2 M urea, solubilize the target fusion protein using Tris buffer containing 8 M urea. At the time of solubilization, it is more preferable to add ImM dithiothreitol or 2% mercaptoethanol as a reducing agent since the recovery rate is improved. Immediately after solubilization, molecular weight fractionation is performed by gel filtration to separate from contaminating lipids and other strongly insoluble proteins. Then, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 OmM sodium chloride buffer Dialyze in the solution.
  • the target protein can be obtained as a solubilized component, but most of the protein precipitates in an insoluble fraction after dialysis.
  • MHC class II subunit which does not contain the trp E protein, which is a protective protein, by methods such as hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration. Can be. It is also possible to carry out the target protein by hydrophobic chromatography or ion-exchange chromatography before digestion of the purified protease.
  • the MHC class II ⁇ and the subunits prepared in Examples 1 and 2 were treated with 8M urea, 10 mM magnesium chloride, 1 M so that the respective concentrations would be 5 mg / m1.
  • the protein solution is dialyzed at 4 ° C in Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1 M urea-containing 1 OmM magnesium chloride and 100 mM sodium chloride.
  • the MHC class II complex was further dialyzed at 30 ° C in Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10 mM magnesium chloride and 10 OmM sodium chloride without urea. Can be obtained.
  • MHC class I produced using E. coli was immobilized on beads. Immobilization was performed by adding 1 ml of chitosan beads having a succinimide group to an aqueous solution prepared by dissolving 5 ml of 5 OmM borate buffer (pH 8.0) so that the concentration of MHC class I was 1 mg / ml. The reaction was performed at ° C for 8 hours. After the reaction, unreacted functional groups were inactivated and unreacted proteins were washed with 5 Oml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.0). From the result of amino acid analysis of the immobilized beads, the amount immobilized was 2.3 mg protein per ml of beads.
  • MHC class I produced using E. coli was immobilized on a hollow fiber membrane. Immobilization was performed by adding 1 g of polysulfone hollow fiber having an amino group to an aqueous solution of 5 MmM borate buffer (pH 8.0) dissolved in 5 ml of MHC Class I to a concentration of lmg / ml. The reaction was performed at ° C for 8 hours.
  • Partial amino acid sequence of 9 subunits of MHC class I extracted from B cells and MHC class II expressed by Escherichia coli and MHC class II synthesized by peptide synthesizer (binding to superantigen Is dissolved in PBS at a concentration of 10 // g / m 1, and 0.1 ml is added to each well of a 96-well microplate having amino groups.
  • Carbodiimide was added as a catalyst and allowed to stand at 4 ° C for 1 ⁇ to immobilize proteins. Blocking was performed with a PBS solution containing 0.5% bovine serum albumin (BSA), and then each well was washed with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20).
  • This MHC class II immobilized plate was reacted with SEA, a Staphylococcus aureus exotoxin and a superantigen.
  • SEA was similarly reacted using a rate in which only BSA was immobilized.
  • an anti-SEA monoclonal antibody biotin-labeled
  • avidinated peroxidase avidinated peroxidase
  • 3,3 ′, 5,5′-tetramethylpentidine were sequentially reacted, and the color development was measured. The results are shown in FIG. Although little color development was observed on the plate on which BSA was immobilized, MH C class ⁇
  • ⁇ indicates ⁇ subunit partial sequence (30 amino acid residues)
  • the detection sensitivity is improved as the number of amino acid residues is increased.
  • 1 // gZm ⁇ SEA can be detected.
  • the SEA concentration was in the range of 0 to 1 gZm1.
  • tissue-compatible antigen class I protein that has been produced using mammalian cells or insect cells by using bacteria.
  • the present invention also relates to the adsorption and separation of substances having an affinity for MHC class II, such as superantigens such as Staphylococcus aureus exotoxin, from aqueous solutions, body fluids such as blood and urine, foodstuffs, beverages, etc. It provides effective materials for the detection, quantification, and quantification, and is useful in the construction of treatment systems for medical science, immunology, biochemistry research and clinical practice, such as sepsis and autoimmune diseases. Can be leveraged.
  • MHC class II such as superantigens such as Staphylococcus aureus exotoxin

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Description

明糸田 β
主要組織適台性抗原クラス Π蛋白質の製造方法及びそれを固定化した材料
技術分野
本発明は、 抗原提示細胞表面などに見られる主要組織適合性抗原クラス Π蛋白 質 （以下 M H Cクラス Πと略す） の製造方法および M H Cクラス Πあるいは Μ Η Cクラス Πの αおよび Ζまたは サブュニッ トをビーズ、 繊維、 中空糸、 などの 材料に共有結合させることを特徵とする M H Cクラス Π固定化材料およびそれを 用いるスーパー抗原除去モジュールに関する。
本発明はまた、 M H Cクラス Πをあるいはスーパー抗原に親和性を有する該 Μ H Cクラス Πの一部分を用いたスーパー抗原を検出あるいは定量する方法および そのための測定キッ 卜に関する。
従来の技術
M H Cクラス Πは、 Β細胞やマクロファージ、 血管内皮細胞などの細胞表面に 存在し、 抗原提示の際に自己非自己を識別するために用いられる糖夕ンパク質で ある。 近年になり、 M H Cクラス Πが細菌毒素等のスーパー抗原と称する一群の 蛋白質に対する結合蛋白質であることが判明し、 且つ自己免疫疾患において Μ Η Cクラス Πのサブクラスに偏りがみられることなどから、 医学 ·免疫学的に重要 視され始めている。
スーパー抗原とは、 従来の抗原と異なり抗原提示細胞内におけるプロセッシン グ過程を経ることなく、 抗原提示細胞上の M H Cクラス Πに結合し、 さらにはこ の M H Cクラス Πとの複合体を形成することにより特定の V領域を有する Τ細胞 を刺激し免疫系を異常に活性化させる一群の蛋白質である。
これまでに、 黄色ブドウ球菌毒素や連鎖球菌毒素、 エルシニア菌毒素、 あるい はある種のウィルス蛋白質やヒートショック蛋白質が確認されているが、 以後も 特定化されていく可能性がある。
現在、 M H Cクラス Πを単離し入手するには、 哺乳類細胞や昆虫細胞に M H C クラス Πの遺伝子を導入し発現させるか、 あるいは天然に存在する M H Cクラス Πを Β細胞やマクロファージ、 血管内皮細胞などの細胞膜中から精製してくる必 要がある。 しかし、 天然型 M H Cクラス Πを細胞膜中より大量に得る場合、 膜表面の発現 量が少ないために、 大量の細胞を必要とし、 培養細胞を用いたとしても多くの時 間と費用を要する。
また、 哺乳類細胞や昆虫細胞に遣伝子技術を用いて組換え型 M H Cクラス Πを 産生させる場合にも、 細胞の培養に費用と時間が多く必要である。
これまでに、 主要組織適合性抗原クラス Iに関しては大腸菌を用いた発現系に よる大量発系が報告されている （K . C . パーカー ら、 モレキュラー イミュノ ロジ一、 2 9巻、 3 7 1頁 （1 9 9 2 ) ) 力く、 M H Cクラス Πについては知られ ていなかった。
これまで、 M H Cクラス Π固定化材料としては、 M H Cクラス Πを細胞表面上 に発現させ、 細胞ごとプレー卜上に吸着したものや、 M H Cクラス Πのサブュニ ッ トの部分ァミノ酸配列を合成し、 材料上に吸着固定した材料は報告されている ( J . K . ラッセルら、 バイオケミカル アンド バイオフィ ジカル リサーチ コミュニケ一ションズ、 1 6 8巻、 6 9 6頁 （1 9 9 0 ) 。
また、 スーパー抗原を吸着する材料としては、 スーパ一抗原に対する抗体を固 定化した材料が既に報告されており、 スーパー抗原の免疫学的測定等に用いられ ている。
本発明は、 細菌類を用いることにより生産性 ·操作性を容易にしたことを特徴 とする M H Cクラス Πの製造方法を提供するものである。
細菌類は昆虫や哺乳類由来の細胞と異なり、 増殖速度も速く、 かつ培地組成も 牛胎児血清や増殖因子等の高価な組成を必要とせず、 植え継ぎや培地交換などの 操作を必要としない。
しかし、 大腸菌などの細菌類中において哺乳類由来の蛋白質は細菌毒性等の問 題により発現しない場合が多い。
本発明者らは、 種々の発現ベクターを改良検討した結果、 大腸菌や酵母菌、 枯 草菌等の細菌内において M H Cクラス Πを発現させることに成功し、 効率よく大 量に蛋白質を製造することを可能とした。
本発明はまた、 医学的にはスーパ一抗原を含む M H Cクラス Π親和性の、 病因 物質を対象とした血液浄化システムの開発を、 また、 免疫学的にはスーパー抗原 を含む M H Cクラス Π親和性の病因物質の単離精製や酵素免疫学的測定に用いる 上記病因物質全般を結合できる材料を提供するものである。
ここで、 上述したように、 細胞ごと固定化した材料では M H Cクラス Π以外の 蛋白質等も固定されてしまい、 未知の活性を持つ可能性があり、 また、 固定化密 度も任意に変えることには限界がある。 M H Cクラス Πのサブュニッ 卜の部分ァ ミノ酸配列を合成し、 材料上に吸着固定した材料は、 緩衝液中から高濃度のスー パー抗原を検出する目的には使用できるが、 血液中からのスーパー抗原の除去等 の目的には吸着固定はリガンドの遊離が考えられ、 使用できない。
また、 部分配列のみではスーパー抗原に対する結合能が低く、 スーパー抗原の 検出および定量を行う場合に十分の性能が得られない。 また、 抗体固定化材料で は、 スーパー抗原 1種類毎に異なった抗体を固定化した材料が各々必要になる。
発明の開示
本発明は、 かかる従来技術の問題点を解消しょうとするものであり、 下記の構 成を有する。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質をコードする遺伝子を用いて微生物を 形質転換することを特徴とする主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の製造方法、
( 2 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質またはその一部分を共有結合により固 定化した材料、
( 3 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の αサブュニッ トまたはその一部分を 共有結合により固定化した材料、
( 4 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の サブュニッ トまたはその一部分を 共有結合により固定化した材料、
( 5 ) 上記 （2 ) ないし （4 ) のいずれかに記載の材料を含むスーパ—抗原除去 モジユール、
( 6 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質、 またはスーパー抗原との親和性を有 する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の 4 0ァミノ酸残基以上の長さを有す る部分を用いることを特徴とする、 スーパ一抗原を検出する方法、
( 7 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質、 またはスーパー抗原との親和性を有 する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の 4 0ァミノ酸残基以上の長さを有す る部分を用いることを特徴とする、 スーパー抗原を定量する方法、
に関する。
図面の簡単な説明
図 1は、 MH Cクラス Π αサブュニヅ トを大腸菌内で発現させるための発現用 ベクターの概略図を示す。
図 2は、 MH Cクラス Π サブュニッ トを大腸菌内で発現させるための発現用 ベクタ一の概略図を示す。
図 3は、 MH Cクラス Π固定化ビーズによる T S S Τ- 1の緩衝溶液中からの 除去量と、 反応時間との関係を示す。
図 4は、 MH Cクラス Πを固定化した中空糸を用いた場合における、 血清中か らの T S S Τ— 1の除去量と、 反応時間との関係を示す。
図 5は、 MH Cクラス Π、 MH Cグラス Π ^サブュニッ トおよび； 9サブュニッ 卜の部分配列べプチドを固定化したプレートを用いた酵素免疫測定 （サン ドィッ チ法） における S Ε Α濃度と 4 5 0 nmの吸光度との関係を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いた MH Cクラス Πをコードする遺伝子は既に報告されている D N A配列 （L. J. Stern et al. , Cel I, vol.68, p 465, (1992), D. A. We 11 s t e i n et al. , J . Exp. Med. , vol. 174, p219, (1991) ) をもとに P C R用の D N Aプライマーを作成 し B細胞等の人細胞中より常法、 例えば 「遺伝子増幅 P C R法 （蛋白質 ·核酸， 酵素臨時増刊） vol. 35 No. Π ( 1 9 9 0) 」 に記載の方法、 に従い P C R法によ り複製して得た。 この DN Αのコードする蛋白質の調製法としては、 遺伝子組換 え技術を利用して大腸菌、 酵母菌、 昆虫細胞や哺乳類細胞内で発現させる方法が 挙げられる。
このうち、 増殖速度の速さなどの生産効率の高さ ·培養条件等の操作性の良さ から考えると大腸菌や酵母菌あるいは枯草菌を用いることがより好ましい。 発現 方法としては、 本蛋白質をコードする DNAあるいはその一部に蛋白質合成開始 信号と終結信号、 また、 菌体外へ分泌させるときは分泌信号を付加した後、 種々 の公知の発現べクタ一に結台させ、 直接本発明の蛋白質あるいはその一部を発現 させる方法、 また、 他のぺプチド、 例えば、 インターロイキン 2、 マルト一ス結 合蛋白質、 βガラク トシダーゼ、 t r p E蛋白質等） との融合蛋白質として発現 させる方法がある。 また、 発現後の蛋白質の精製のしゃすさを考慮して、 MH C クラス Πの活性が保たれるならば、 ヒスチジンの 6量体等を付加しても良い。
MH Cクラス Πの細菌に対する毒性を考慮すると、 発現の際に融合蛋白質など の形で不溶性の顆粒体を形成させるか、 T 7 リボヌクレア一ゼ ·プロモーターや ヒートショックプロモーター等の転写開始制御能の高いプロモーターを用いるこ とが好ましい。 ここで、 融合蛋白質と MH Cクラス Πの間にプロテアーゼ （例え ば活性化血液凝固第十因子 （Fi torXa)、 I g Aプロテアーゼ） の認識サイ トゃ 化学試薬 （例えばシァノゲンプロマイ ド） による切断部位を導入することにより、 発現後にプロテアーゼゃ化学試薬を用いて消化 ·分離することも可能である。 発 現後の MH Cクラス Πあるいはその一部の精製には公知の手法が用いられ、 例え ば、 硫安沈澱法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラ フィ一、 ゲルろ過、 疎水クロマトグラフィ一等が挙げられ、 また、 メソッ ド ィ ン ェンザィモロジ一 （アカデミ ックプレス社 1 980) に記載の方法が適応 できる。 また、 プロテインジスルフィ ドイソメラーゼ、 チォレドキシン、 プロチ ォニン、 ダル夕チオンや メルカプトエタノールなどを添加しサブュニッ トのジ スルフィ ド結合を矯正してもよい。
また、 αサブュニッ トおよび； 9サブュニッ トを別々に発現させた後に再構成す るには、 両サブュニッ トを等モル量ずつを混合し 4。C〜 60°Cより好ましくは 2 0°C~40°Cの温度で 5分以上より好ましくは 60分以上放置する。
また、 混合するときに若干の変性剤 （例えば 1M尿素， 10%ァセトニトリル 等） を添加し、 前述の温度範囲内で透析しつつ再構成することも可能である。 本発明における MH Cクラス Πを固定化した材料は、 生体膜中より得られる天 然型 MH Cクラス Πあるいはその αおよび Zまたは /8サブュニッ トあるいはそれ らの一部分、 あるいは細胞や細菌を形質転換し得られる組換え型 MH Cクラス Π あるいはその αおよび Ζまたは )3サブユニッ トあるいはそれらの一部分をビーズ、 繊維、 中空糸、 織物、 プレート、 チューブなどの材料上に共有結合を用いて結合 することにより得られる。
この中で、 MH Cクラス Πは、 大量に効率よく入手できることから、 組換え型、 特に大腸菌あるいは酵母菌により産生されたものがより好ましい。
このように、 M H Cクラス Πの発現、 固定化法、 担体の検討を進めることによ り M H Cクラス Πの活性を損なわない固定化材の開発に成功し本発明に至った。 以下に詳細を説明する。
( 1 ) M H Cクラス Π
M H Cクラス Πは、 B細胞 ·単核球などの抗原提示細胞をそのままあるいはガ ンマ一インターフェロン等により刺激したものの細胞膜上から直接単離精製した 天然型 M H Cクラス Πあるいは C H O細胞、 L細胞等の哺乳類由来の細胞や昆虫 細胞を形質転換して得られる M H Cクラス Π産生細胞より精製する組換え型 M H Cクラス Πを用いることができる。 この中で、 大量に効率よく入手できることか ら、 組換え型、 特に大腸菌や酵母菌あるいは枯草菌により産生されたものがより 好ましい。 また、 M H Cクラス Πのサブュニッ 卜のみ、 あるいはその部分配列の 固定でも結合能はあるが、 結合の強さから考えると、 アミノ酸 4 0残基以上の分 子量を有することが好ましく、 より好ましくは α 複合体を用いる。
( 2 ) 固定化法
固定化方法としては、 共有結合、 イオン結合、 配位結合、 疎水結合あるいは包 括法を用いて結合あるいは吸着することにより得られるが、 固定した蛋白質の遊 離を防ぐためには共有結合がより好ましい。
また、 蛋白質の固定にはタンパク質のアミノ基、 カルボキシル基、 スルフィ ド 基を用いる方法が一般的であるが、 M H Cクラス Πの Ν末端側にスーパー抗原の 結合部位があることを考慮すると、 カルボキ 'シル基を用いた固定化方法がより好 ましい。
( 4 ) 固定化担体
M H Cクラス Πを固定化する担体はポリメチルメタァクリ レート、 ポリスチレン、 ポリスルホン、 ポリアリルァミ ン、 ポリビニルアルコールあるいはそれらの誘導 体等の台成高分子やセルロース、 キ卜サンあるいはそれら誘導体等のような天然 高分子、 セラミ ックスや金属などの無機材料、 で構成されるビーズ、 繊維、 中空 糸、 プレート、 チューブなどを用いることができる。 このうち、 固定化材料とし ては官能基の挿入が容易な高分子化合物を用いることがより好ましく、 形態とし ては操作性や表面積の大きさから中空糸、 ビーズ、 繊維、 織物等がより好ましい。 このようにしてにして得られる MH Cクラス Π固定化材料において、 MH Cク ラス Πの活性を最大に用いることの出来得る結合法を検討した結果、 血液中に置 いてもスーパー抗原を特異的に捕捉結合し得る血液浄化モジュールを確立し、 本 発明の成功に至った。
また、 スーパー抗原を検出定量する方法として MH Cクラス Πあるいは MH C クラス Π αサブュニッ 卜あるいは ^サブュニッ トあるいはそれらの部分配列ぺプ チドを用いることにより 1種類の固定化材料で、 スーパー抗原全てを捕捉できる ことが可能となった。
スーパー抗原に対する結合性は蛋白質の 3次構造に影響されるため、 スーパ一 抗原をより強く結合させるためにはァミノ酸残基数 3 0m e r以上より好ましく は 4 Om e r以上より好ましくはサブュニッ 卜全配列さらに好ましくは αおよび サブュニヅ 卜より構成された MH Cクラス Πが良い。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。 但し、 本発明が実施例に 限定されるものではない。
実施例
実施例 1
MH Cクラス Π αサブュニッ 卜の大腸菌内での発現
MH Cクラス Πの crサブュニッ トは以下のように作製した。
ヒートショックプロモーターを有し、 ガラク トシダーゼおよび血液凝固因子 の FactorXaの認識部位をコードする配列を持つ pUEFの EcoRl サイ トと Xbalサイ ト の間に MH Cクラス Π αサブユニッ ト遺伝子を挿入した。 （図 1) このべクタ一 を用いて大腸菌を形質転換し、 L培地中で 3 0°C、 8時間培養後培地温度を 4 2 に上昇させ 1 5分間誘導をかける P 誘導後培地温度を 3 7°Cにしさらに 2時間 培養した後培養液より大腸菌を回収した。
また、 ガラク トシダーゼとの融合蛋白質にすることでパラァミノフヱニル 1 - 千大 β- D- ガラク トピラノシド固定化カラムを用いて精製可能であり、 ガ ラク トシダーゼと MH Cクラス Πの間に FactorXaの認識部位が存在するので、 蛋 白質発現後に FactorXaにより消化することで保護蛋白質である ガラク トシダー ゼを含まない MHCクラス Π αサブュニッ 卜を得ることができる。
実施例 2
MH Cクラス Πの サブュニッ 卜の不溶性蛋白質としての発現
M H Cクラス Πの ;9サブユニッ トは以下のように作製した。
トリブトファ ンプロモーターを有し、 t r p E蛋白質および I g Aプロテア一 ゼの認識部位をコードする配列を持つ P T Iベクタ一の EcoRl サイ トと Hindlll サイ 卜の間に MH Cクラス Π サブュニッ ト遣伝子を挿入した （図 2) 。 このべ クタ一を用いて大腸菌を形質転換し、 M9培地中で 37°C、 8時間培養後イ ン ド ールアクリル酸を用いて誘導をかける。 誘導後、 2時間培養した後培養液より大 腸菌を回収した。
また、 t r p E蛋白質と融合蛋白質にすることで目的の蛋白質は不溶性画分に 沈澱してくる。 不溶性画分を 2 M尿素を含むトリス緩衝液で洗浄後、 8M尿素を 含むトリス緩衝液を用いて目的の融合蛋白質を可溶化する。 可溶化の際に、 還元 剤として ImMジチオスレィ トールや 2% メルカプトエタノールを添加すると 回収率が向上しより好ましい。 可溶化後直ちに、 ゲルろ過法により分子量分画を 行い、 混入している脂質や他の不溶性の強い蛋白質と分離した後に、 20mMト リス塩酸緩衝液 （pH 7. 4) 、 5 OmM塩化ナトリウム緩衝液中で透析する。 透析後も沈澱物は得られず、 融合蛋白質は 100%回収可能である。 ここで、 分 子量分画を行わずに透析しても可溶化成分に目的蛋白質は得られるが、 その大半 は透析後に不溶性画分に沈澱してくる。
得られた可溶性画分を IgA プロテアーゼ消化後、 疎水クロマ トグラフィ ー、 ィ オン交換クロマトグラフィ一、 ゲルろ過、 等の方法により、 保護蛋白質である t r p E蛋白質を含まない MH Cクラス Π サブュニッ トを得ることができる。 疎 水クロマトグラフやイオン交換クロマトグラフによる目的蛋白質を精製のプロテ ァーゼ消化前に行うことも可能である。
実施例 3
MH Cクラス Πの α及び ;3サブュニッ トからの再構成
実施例 1及び 2で作成した MH Cクラス Πの α及び サブュニッ トをそれぞれ の濃度が 5 m g/m 1になるように、 8M尿素、 10 m M塩化マグネシウム、 1 00 mM塩化ナトリゥムを含む卜リス塩酸緩衝液 （p H 7. 4) に溶解する。 溶 解後、 蛋白質溶液を 4°Cで 1M尿素を含む 1 OmM塩化マグネシウム、 100m M塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液 （p H 7. 4) 中で透析する。 透析後 さらに 30°Cで尿素を含まない 10 mM塩化マグネシウム、 10 OmM塩化ナ卜 リウムを含む卜リス塩酸緩衝液 （p H 7. 4) 中で透析することにより MH Cク ラス Π複合体を得ることが出来る。
実施例 4
大腸菌を用いて産生した MH Cクラス Πをビーズ上に固定化した。 固定化は M H Cクラス Πを lmg/ml の濃度になるように 5 OmMほう酸緩衝液 （p H 8. 0) 5 mlで溶解した水溶液中にスクシンイ ミ ド基を有するキトサンビーズを 1 ml加え、 4°Cで 8時間反応させた。 反応後、 0. 5Mトリス塩酸緩衝液 （p H 8. 0) 5 Omlにより、 未反応の官能基の不活化と未反応蛋白質の洗浄を行った。 固定化ビ ーズのアミノ酸分析の結果より固定化量はビーズ lml当り 2. 3 mg蛋白であった。 このようにして作成した MH Cクラス Π固定化ビーズおよびトリス塩酸緩衝液と のみ反応させたスクシンイミ ド基を有するキトサンビーズを各々 0. 5mlずつを lng/ml の濃度で黄色ブドウ球菌外毒素 （T S ST— 1) を含む水溶液中に添加 したところ図 3に示すように、 MH Cクラス Π固定化ビーズにおいてのみ毒素の 吸着が観察され、 MHCクラス Πが毒素との結合活性を有したまま材料上に共有 結合により固定化されたことが示された。 図 3中、 〇は MH Cクラス Π固定化ビ ーズ、 鲁は未反応ビーズを示す。 MH Cクラス Π固定化ビーズにおいてのみ T S S T— 1濃度の低下が観察された。
実施例 5
大腸菌を用いて産生した MH Cクラス Πを中空糸膜上に固定化した。 固定化は MH Cクラス Πを lmg/ml の濃度になるように 5 OmMほう酸緩衝液 （pH 8. 0) 5 mlで溶解した水溶液中にァミノ基を有するポリスルホン中空糸を 1 gを加え、 4 °Cで 8時間反応させた。
反応 は触媒としてカルポジイミ ドを添加した。 固定化中空糸のアミノ酸分析 の結果より固定化量は中空糸 1 g当り 2. Omg蛋白であった。 このようにして作 成した MH Cクラス Π固定化中空糸および未反応中空糸各々 0. 5 gずつを用い てモジュールを作製し 1 ng/ral の濃度で黄色ブドウ球菌外毒素 （T S S T— 1) を含む血清を循環させたところ図 4に示すように、 MH Cクラス Π固定化中空糸 においてのみ毒素の吸着が観察され、 MH Cクラス Π固定化中空糸により毒素の 血液中からの除去が可能なことが示された。 図 4中、 〇： MH Cクラス Π固定化 中空糸、 ·は未反応中空糸を示す。 MH Cクラス Π固定化中空糸においてのみ T S S T— 1の濃度低下が観察された。 実施例 6
B細胞より抽出した MH Cクラス Π及び大腸菌により発現した MH Cクラス Π サブュニッ ト及びべプチド合成機により合成した MH Cクラス Πの ;9サブュニ ッ 卜の部分ァミノ酸配列 （スーパー抗原との結合性があるとされる 30アミノ酸 残基部分） を 1 0 // g/m 1の濃度で P B S中に溶解した後、 ァミノ基を有する 96穴のマイクロプレートの各ゥエルに 0. 1m lずつ入れ、 触媒としてカルボ ジイミ ドを添加し、 4°Cで 1晚放置し蛋白質の固定化を行った。 0. 5%牛血清 アルブミン （B SA) を含む P B S溶液でブロッキングを行い、 その後各ゥエル を洗浄液 （0. 05%Tw e e n 20を含む P B S) で洗浄した。
この MH Cクラス Π固定化プレー卜に黄色ブドウ球菌外毒素であり、 スーパ一 抗原である S E Aを反応させた。 対照として、 B S Aのみを固定化した レート を用いて同様に S E Aを反応させた。 その後、 抗 S E Aモノクローナル抗体 （ビ ォチン標識） 、 アビジン化ペルォキシダーゼ、 3, 3' , 5, 5' —テトラメチ ルペンジジンを順次反応させ、 その発色を測定した結果を図 5に示した。 B SA を固定化したプレートでは発色がほとんど認められなかったが、 MH Cクラス Π
(約 400アミノ酸残基長） 、 サブュニッ ト （約 200アミノ酸残基長） 、 β サブュニッ 卜の部分配列べプチド （50アミノ酸残基と 30アミノ酸残基長） に おいて発色が認められ、 S Ε Αの結合が確認された。 〇は MH Cクラス Π固定化 プレート、 △は サブュニッ ト固定化プレー卜、 攀は^サブュニッ 卜部分配列
(50アミノ酸残基） 、 ▲は ^サブュニッ ト部分配列 （30アミノ酸残基） 、 園 はコン トロール （B S Aプレート） を示す。
また、 アミノ酸残基数の増加に従って検出感度も向上し、 50m e r以上では 1 // gZm〗の S E Aが検出可能になる。 MH Cクラス Πを固定化したプレート においては S E A濃度が 0〜1 gZm 1の範囲において、 また、 MH Cクラス Π βサブュニッ トを固定化したプレートでは S Ε Α濃度が 1 03 〜1 06 ng/ml の範囲において、 発色と S E A濃度の間に良好な直線性を示し、 S EAの定量も 可能であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、 これまでは哺乳類細胞や昆虫細胞を利用して製造していた主要組 織適合性抗原クラス Π蛋白質を細菌を用いることで効率よく且つ安価に大量調整 できるようになつた。
本発明はまた、 MH Cクラス Πに親和性のある物質、 例えば黄色ブドウ球菌外毒 素などのスーパー抗原などを水溶液や血液、 尿などの体液、 食料品、 飲料物中な どから吸着、 分離、 検出、 定量する際に、 有効な材料を提供するものであり、 医 学 ·免疫学 ·生化学の研究や臨床、 例えば、 敗血症や自己免疫疾患等における治 療システムを構築するうえで有効に活用され得る。

Claims

言青求の範囲
(1) 主要組織適合性抗原クラス π蛋白質をコ一ドする遺伝子を用いて微生物を 形質転換するこ とを特徴とする主要組織適合性抗原クラス π蛋白質の製造方法。
(2) 微生物が大腸菌、 酵母菌および枯草菌から選ばれることを特徵とする請求 項 1記載の主要組織適合性抗原クラス π蛋白質の製造方法。
(3) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質をコ一ドする遺伝子を宿主細胞内で発 現させる際に不溶性蛋白質として発現させた後、 可溶性蛋白質に改質することを 特徵とする請求項 1記載の主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の製造方法。
(4) 主要組織適台性抗原クラス Π蛋白質の αおよび^サブュニッ トを個別に作 製した後に再構成することを特徴とする請求項 1記載の主要組織適合性抗原クラ ス Π蛋白質の製造方法。
( 5 ) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質またはその一部分を共有結合により固 定化した材料。
(6) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の αサブュニッ トまたはその一部分を 共有結合により固定化した材料。
(7) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の; 9サブュニッ トまたはその一部分を 共有結合により固定化した材料。
(8) 固定化用の担体として中空糸膜あるいは繊維あるいはビーズあるいは織物 を用いることを特徴とする請求項 5〜 7に記載の材料。
(9) 請求項 5〜 7のいずれかに記載の材料を内蔵したスーパー抗原除去モジュ ール。
(10) 血液浄化用モジュールである請求項 9記載のモジュール
(11) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質、 またはスーパー抗原との親和性を 有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の 40アミノ酸残基以上の長さを有 する部分を用いることを特徴とする、 スーパ一抗原を検出する方法。
(12) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質 aサブュニッ ト、 またはスーパー抗 原との親和性を有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質 αサブュニッ 卜の 4 0アミノ酸残基以上の長さを有する部分を用いることを特徴とする、 スーパー抗 原を検出する方法。
(1 3) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質; 9サブュニッ ト、 またはスーパー抗 原との親和性を有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質 /9サブュニッ 卜の 4 0ァミノ酸残基以上の長さを有する部分を用いることを特徴とする、 スーパ一抗 原を検出する方法。
(14) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質、 またはスーパー抗原との親和性を 有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質の 40アミノ酸残基以上の長さを有 する部分を用いることを特徴とする、 スーパー抗原を定量する方法。
(15) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質なサブュニッ 卜、 またはスーパー抗 原との親和性を有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質 αサブユニッ トの 4 0アミノ酸残基以上の長さを有する部分を用いることを特徴とする、 スーパ一抗 原を定量する方法。
(16) 主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質 3サブュニッ ト、 またはスーパ一抗 原との親和性を有する該主要組織適合性抗原クラス Π蛋白質^サブユニッ トの 4
0アミノ酸残基以上の長さを有する部分を用いることを特徴とする、 スーパ一抗 原を定量する方法。
(17) 請求項 11〜16の方法を用いるスーパー抗原の検出および または定 fiするキヅ ト .o
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