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WO1993017108A2 - Peptides analogues de l'image interne d'une proteine virale - Google Patents

Peptides analogues de l'image interne d'une proteine virale Download PDF

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WO1993017108A2
WO1993017108A2 PCT/FR1993/000171 FR9300171W WO9317108A2 WO 1993017108 A2 WO1993017108 A2 WO 1993017108A2 FR 9300171 W FR9300171 W FR 9300171W WO 9317108 A2 WO9317108 A2 WO 9317108A2
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WO
WIPO (PCT)
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peptides
antibodies
peptide
sequence
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1993/000171
Other languages
English (en)
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WO1993017108A3 (fr
Inventor
Vélibor KRSMANOVIC
Irena Cosic
Jean-Michel Biquard
Milton T. W. Hearn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monash University
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Monash University
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Monash University, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Monash University
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Priority to US08/290,736 priority patent/US6294174B1/en
Priority to AU36361/93A priority patent/AU682304B2/en
Priority to DE0728203T priority patent/DE728203T1/de
Priority to EP93905412A priority patent/EP0728203A1/fr
Publication of WO1993017108A2 publication Critical patent/WO1993017108A2/fr
Publication of WO1993017108A3 publication Critical patent/WO1993017108A3/fr
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
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    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the invention is peptides immunologically related to the proteins of a viral agent, that is to say constituting, with regard to their immunological properties, analogues of the proteins involved in a viral pathology or of the antibodies formed against these proteins. .
  • infectious agent as used in the description and the claims, is meant viral pathogens, this term covering retroviral agents, or even cells infected with these.
  • This immunological approach is based on the use of antibodies capable of specifically recognizing the infectious antigen, or on the induction of the body's immune responses, also including autoantibodies.
  • the production of antibodies is done by immunization of animals against the infectious agent previously inactivated or against proteins purified from this agent.
  • the antibodies must exert a neutralizing effect in vivo with respect to the infectious agent.
  • HIV denotes the retroviruses of the HIV-1 and HIV-2 type isolated to date in humans and the retroviruses of the SIV type isolated in the monkey, which are different from HIV-1 and HIV-2 as well than their many variants.
  • the effectiveness of such vaccines is far from established and the development of an AIDS vaccine raises many problems.
  • the major problem resides in the fact that in seropositive subjects, as well as in patients, most of the circulating antibodies are not capable of neutralizing the virus and / or of eliminating the cells carrying it in the body of patients. Although some circulating antibodies are neutralizing in vitro, their protective effect in the body has been shown to be ineffective.
  • Another immunological approach consists in generating the internal image of the antigen, namely the anti-idiotype antibody, then using this new structure as an immunizing agent, rather than the antigen itself (see (1) and (2) in the Bibliographical references given at the end of the description).
  • Immunization with the antigen must first be carried out, which allows the induction of AC1 antibodies, or idiotypic antibodies, directed against this antigen.
  • immunization with the idiotype AC1 antibody should be carried out for the purpose of induction of anti-idiotype AC2 antibodies, carrying the internal image of the initial antigen.
  • This internal image of the antigen corresponds to the region of contact between it and the antibody AC1.
  • anti-idiotype AC2 makes it possible to induce anti-anti-idiotype AC3 antibodies.
  • These AC3 antibodies are capable of reacting with the original antigen (1, 2).
  • the anti-idiotype AC2 can activate the lymphocytes which would thus become capable of recognizing the initial antigen, as in the case of direct activation of these cells by the antigen.
  • the induction of the anti-idiotype AC2 can also be obtained against the receptors of sensitized T cells, responsible for cellular immunity. It is indeed possible to generate T lymphocytes whose receptors are capable of recognizing the foreign determinants expressed on the surface of a virus or of infected cells, at the same time as cellular determinants of the MHC type (major hystocompatibility complex). . They are therefore sensitized lymphocytes.
  • the R1 receptors of these lymphocytes express the structures corresponding to the idiotype, in fact performing a function similar to that of the antibody AC1.
  • lymphocytes or their membrane-bound IR receptor
  • Immunization by lymphocytes thus sensitized then allows the induction of anti-idiotype AC2 antibodies, as well as that of lymphocytes to R2 receptors, equivalent to the antibody AC2, directed against, or recognizing, the domain of the R1 lymphocyte receptor involved in contact with the antigen.
  • the R2 receptors of lymphocytes or the anti-idiotypic antibodies AC2 are capable of inducing a new response of lymphocyte cells, whose R3 receptors recognize the initial antigen (1).
  • This processing of the internal image of the antigen is particularly interesting for influencing the lymphocyte sensitization mechanism.
  • the major advantage that emerges is that the recognition of the antigen by the lymphocytes sensitized with the internal image does not depend on the genetic nature of the immunized host, since the restrictive control of identity of MHC of infected target cells, or of the virus no longer represents obstacles to their destruction (2).
  • the antibodies directed against the anti-idiotype having the ability to cross-react with the initial antigen, are capable of inducing the immunity in which both B and T lymphocytes are involved.
  • the use of anti-idiotype lymphocyte receptors or antibodies as vectors of the internal image of the antigen in the prevention or treatment of immunodeficient diseases is not without danger.
  • AIP also known as "Resonant Recognition Model” RRM
  • FFT Fast Fourier Transform
  • This AIP method as described in particular in (3) is based on a representation of the primary structure of a protein in the form of a numerical series, in assigning to each amino acid a defined parameter describing a physicochemical property involved in the biological activity of the protein.
  • Such a frequency has been detected for example in peptide hormones and their receptors.
  • the object of the invention is therefore to provide such peptides, constituting in particular analogs of the proteins of viral agents, or analogs of the antibodies formed against these proteins, that is to say capable of mimicking these proteins and antibodies in terms immunogenicity.
  • the invention also aims to provide a process for obtaining these peptides making it possible to develop a peptide sequence according to the desired immunogenicity with respect to a target antigen and to easily obtain it by synthesis.
  • the invention also relates to the biological applications of these peptides, and more particularly their use in diagnosis, prevention and therapy.
  • the invention in particular opens up possibilities for the treatment of autoimmunity by providing peptides capable of inducing antibodies, or lymphocytes capable of recognizing autoimmune antibodies and, by destroying them, autoimmune lymphocytes.
  • peptides according to the invention which are, in particular, immunologically related to the proteins of a viral agent, are characterized in that they comprise, or that they consist of an amino acid sequence
  • the peptides as ordered by the AIP method are artificial peptides whose sequences are established on the basis of that of a target antigen and so as to present in common with this antigen, one (or more) frequency (s) characteristic (s) of a biological activity.
  • target antigen designates both the protein expressed by the viral agent, or a fragment of this protein, as well as an antibody formed against this protein or a fragment of the latter, or even the antigen to be protected in the case of an autoimmune pathology, or even a peptide whose amino acid sequence was itself ordered using the digital method AIP.
  • characteristic frequency means that it is the frequency (or frequencies) in the Fourier spectra considered, which appears (appear) related to the immunoreactivity with the target antigen or to the antigen to be protected (in opposite phase) and includes (s) information relevant to the antigenicity properties.
  • the invention relates in particular to a group of peptides whose frequency (s) in their Fourier spectrum is (are) in reverse phase relative to that (s) characteristic (s) of the target antigen.
  • the invention also relates to another group of peptides, the frequency (s) of which in their Fourier spectrum is (are) in phase with that (s) characteristic (s) of the target antigen.
  • the target antigen may consist of a viral protein or a fragment of such a protein containing at least the antigenic site.
  • a group A of peptides as ordered with respect to this viral protein is characterized in that said peptides present in their Fourier spectrum, in common with the viral protein, the frequency (s) characteristic (s) of this protein, but in reverse phase, and that they are capable of inducing antibodies to cross-reactivity with members of the same group.
  • the antibodies induced by these group A peptides are analogues of the internal image of the viral protein, more precisely of the domain of this protein involved in an antigen-antibody type reaction.
  • analogs of the internal image of a protein refers to the data obtained by the AIP method used as a modeling means according to the invention.
  • the target antigen with respect to which a peptide sequence is ordered, consists of peptides of group A.
  • a group B of peptides as ordered with respect to peptides of group A is characterized in that said peptides present in their Fourier spectrum one or more frequencies common with that (s) characteristic (s) of peptides A, in phase inverse compared to that (s) of peptides A, but in phase with that (s) of the target antigen with respect to which the peptides of group A were ordered.
  • these group B peptides are capable of inducing antibodies capable of forming an immune complex, as demonstrated by the Western Blot techniques, with the protein or proteins the same (s) frequency (s) expressed by the infectious agent.
  • These antibodies may correspond to the antibodies induced by type A peptides.
  • Group B peptides are also capable of inducing antibodies, or lymphocytes, recognizing autoantibodies, or autoimmune lymphocytes, directed against CD4.
  • the peptides B described above more specifically constitute analogs of proteins expressed by negative RNA viruses, positive RNA viruses, double-stranded RNA viruses or even DNA viruses such as herpes or cytomegalovirus, and their variants.
  • the invention relates specifically to the peptides mentioned above, analogues of retrovirus proteins or of antibodies formed against these proteins.
  • retroviruses mention will be made of lentiviruses with cytopathogenic power, and very especially HIV, in particular HIV-1 and HIV-2 (responsible for pathologies in humans), SIV (in monkeys), Visna (in sheep) CAEV ( in goats), ELAV (in horses), FLV (in cats), BLV (in cattle), and their variants.
  • retroviruses include oncornaviruses such as HTLV-1 and HTLV-2, isolated from humans, and animal retroviruses associated with leukemias and cancers.
  • the invention relates to peptides comprising or consisting of an amino acid sequence as ordered according to the AIP method with respect to the sequence of a protein chosen from the proteins expressed by HIV-1.
  • proteins encoded by the GAG, POL and ENV genes common to retroviruses and more particularly gp160 (envelope precursor, ENV); gpl10 / 120 (ENV); p66 / 68 (POL reverse transcriptase), p55 (internal protective precursor, GAG); p51 / 52 (POL-protease); gp41 (ENV); p40 (GAG, internal prot. precursor), p31 / 34 (POL endonuclease), p24 / 25 (GAG, internal prot.); pl7 / 18 (GAG, internal prot.).
  • gp glycoprotein
  • p is used for the term protein
  • the figures mentioned correspond to the molecular weight established by migration of the proteins in a gel and confirmed and specified by the analysis of the sequences of the corresponding genes.
  • the amino acid sequence of the peptides of the invention as ordered by the AIP method with respect to one of the sequences of the HIV proteins above, present in common with these proteins at minus a characteristic frequency.
  • Peptides of great interest have an amino acid sequence with a Fourier spectrum with at least a frequency equal to, or close to, this value, corresponding to that which the expressed target proteins gp160 / 120 and p55 have in common. respectively by the ENV and GAG genes of HIV-1 (as well as the POL protein, p66 / 68, such as that of the LAVbru strain), or the proteins which are derived therefrom, as well as their fragments.
  • peptides also have a frequency equal to or substantially equal to 0.2188, as expressed by the fragment of gp120 involved in the binding to the CD4 receptor, hereinafter designated by the expression fragment gp120cD4. More specifically, the invention relates to peptides comprising an amino acid sequence as ordered according to the AIP method with respect to the sequence of this fragment, as illustrated in the examples.
  • Advantageous peptides are peptides of group A above and exhibit Fourier spectra with a frequency characteristic of the gp120cD4 fragment, the if necessary two frequencies, but in reverse phase with respect to that (s) of this fragment.
  • peptides are from group B and exhibit Fourier spectra whose characteristic frequency (s) is (are) in reverse phase to that of the group A peptides.
  • Such peptides have the same phase as that of gp120cD4 or frequencies characteristic of the fragment.
  • they are capable of inducing antibodies recognizing certain parts of the region of the gp120cD4 fragment under the conditions of the Elisa and / or Western Blot test as described in the examples below.
  • This viral agent can be, for example, the feline leukemia virus (FLV for short, for Feline Leukemia virus), precursors of the envelope polyprotein (10), (14), this polyprotein (11), (12 ), (13), (15), or fragments, or else the T-cell leukemia virus, HTLV-I or HTLV-II, the envelope polyprotein of these viruses (16), (17) or their fragments, or the Visna virus, especially the envelope polyprotein, its precursor (18), or fragments thereof.
  • FLV feline leukemia virus
  • precursors of the envelope polyprotein (10), (14), this polyprotein (11), (12 ), (13), (15), or fragments or else the T-cell leukemia virus, HTLV-I or HTLV-II, the envelope polyprotein of these viruses (16), (17) or their fragments, or the Visna virus, especially the envelope polyprotein, its precursor (18), or fragments thereof.
  • the invention therefore makes it possible to have group A artificial peptides, ordered according to the AIP method, with respect to a given sequence of proteins or fragments of one of the viral agents above, and group B artificial peptides, ordered compared to peptides A, as well as antibodies directed against these peptides.
  • the invention provides peptides capable of inducing antibodies against autoimmune antibodies and autoimmune lymphocytes, or also provides peptide sequences analogous to these antibodies.
  • Peptides of this type are characterized in that they comprise or are constituted by an amino acid sequence as ordered according to the AIP method with respect to the viral sequences analogous to those of HLA-DR or even to those of interleukin 2, with the phase reversed with respect to those of these sequences and that they are capable of inducing antibodies (or lymphocytes) recognizing the antibodies (or the lymphocytes) directed respectively against these HLA-DR sequences and interleukin 2.
  • the peptides of the invention may exhibit immunogenicity oriented towards the proteins of an infectious agent capable of developing pathogenicity in the context of an infection caused by a first agent.
  • HHV6 viruses which belong to the Herpes family, or mycoplasmas (bacteria without walls) have been detected in subjects infected with HIV.
  • the invention therefore especially relates to peptides, as defined above, capable of inducing antibodies capable of forming an immunological complex with the proteins of such infectious agents, or capable of reacting themselves with these proteins. It also targets the above artificial peptides capable of inducing lymphocytes capable of reacting with the proteins of infectious agents.
  • peptides of the invention are as expressed by the nucleotide sequences deduced from specific amino acid sequences, as ordered by the AIP method.
  • the invention therefore relates to polynucleotide fragments characterized in that they comprise or are constituted by a sequence coding for a peptide as defined above. It should be noted that these sequences may differ due in particular to the degeneracy of the genetic code and the coding of the same amino acid by different codons.
  • polynucleotide fragments of the invention correspond to or consist of sequences complementary to the above sequences, or nucleotide sequences capable of hybridizing with one of the nucleotide sequences complementary to those of the sequences deduced from the peptide sequences.
  • Nucleotide sequences particularly targeted by the invention correspond to those coding for sequences of group A peptides.
  • sequences specially targeted by the invention correspond to those coding for sequences of group B. Mention will in particular be made of those coding for sequences having an immunological relationship with HIV proteins.
  • nucleotide sequences complementary to the sequences capable of coding for the peptides of group A or of group B.
  • the peptides coded by these complementary sequences are new products and are also targeted by the invention.
  • peptides are designated in the description and the claims by the letter c, cA and cB thus respectively denoting peptides whose sequences are deduced from the RNA sequence complementary to that of the RNA sequence corresponding to the group peptides A or B respectively and ordered using the genetic code.
  • peptides cA constitute a subgroup of the peptides B and the peptides cB a subgroup of the peptides A.
  • peptides of type A and B coded by the sequences complementary to those which can code respectively for the peptides cA and cB are also targeted by the invention. Peptides of this type are given in the examples and designated as peptides A11 and B11.
  • nucleotide fragments further comprise a or several sequences capable of coding for one or more proteins having a biological activity of particular interest for a given application.
  • expression vectors in particular plasmid or phage, and their transformed or transfected cell hosts, commonly used in genetic engineering techniques, and which comprise the coding nucleotide sequence as defined above.
  • the peptides of the invention are capable of inducing cross-reactive antibodies between members of the same group.
  • the invention also relates to a process for obtaining the peptides defined above.
  • This process is characterized in that a synthesis of amino acids is carried out synthetically as ordered according to the AIP method, as a function of the amino acid sequence of a target antigen and of a parameter, more particularly one or the periodic element (s) characteristic (s) of the target antigen.
  • the frequency (s) common (s) to several proteins in the Fourier spectrum As a characteristic parameter, it is advantageous to determine the frequency (s) common (s) to several proteins in the Fourier spectrum.
  • a numerical analysis of the amino acid sequences of the target antigen is carried out, replacing each amino acid in the sequence with an appropriate numerical value, the FFT (to be removed from Fourier) transformation of this series of values, and multiply between them the Fourier spectra, obtained for the target antigen and proteins of the same group or family or of the same biological activity as that of the antigen, which makes it possible to identify one or more common frequencies , characteristics of a group of proteins or of a given biological activity.
  • a value representing the assortment of the energy of the delocalized electrons from each amino acid residue more specifically a value corresponding to the potential for interactions between electrons and ions.
  • the sequence of the peptide sought is ordered on the basis of the sequence of a protein or of a protein fragment of a viral agent and taking into account the characteristic frequency (s) of this protein or its fragment, which determines (s) immunoreactive recognition.
  • sequence of an ordered peptide as indicated above is used as a reference.
  • group A peptides that is to say analogs of antibodies directed against the target antigen
  • the phase of the characteristic frequency or frequencies retained is reversed compared to that of the frequency or frequencies of the target antigen.
  • a new phase inversion is carried out to prepare the group B peptides analogous to the image of the target antigen, whose sequences are ordered relative to those of the group A peptides.
  • the invention it is possible to have peptides analogous to idiotypic antibodies directed against the target antigen, or alternatively, peptides analogous to anti-anti-idiotypic antibodies, vis-à-vis the target antigen .
  • the invention provides peptides analogous to the images of the target antigens, that is to say analogues of anti-idiotypic antibodies.
  • peptide sequences are advantageously carried out according to conventional techniques. As mentioned above, these peptides are capable of inducing cross-reactive antibodies against members of the same group.
  • nucleic acid fragments of the invention are advantageously obtained in a conventional manner by synthesis, for example using commercial synthesizers involving the phosphoramide method. They can also be obtained by the PCR amplification method using primers of appropriate sequences and lengths.
  • the primers prepared from the nucleotide fragments of the invention can be used for the synthesis of the artificial peptides defined in the above.
  • such a method for synthesizing the peptides of the invention comprises the chemical synthesis of nucleotide sequences, or the amplification of nucleotide sequences capable of coding for a given peptide by bringing these sequences into contact with at least one pair appropriate primers, followed by the translation of the sequences thus amplified by operating in the usual manner.
  • This last step is advantageously carried out by transformation of the host cells used with the aid of vectors containing the amplified sequences, and recovery of the peptides produced in the host cells.
  • the invention thus makes it possible, on the one hand, to have families of peptides and antibodies capable of specifically recognizing the antibodies formed against the proteins of viral agents and, on the other hand, families of peptides and antibodies capable of specifically recognizing proteins of viral agents.
  • the first family includes antibodies induced against group A peptides, and group peptides
  • This first family also includes the peptides cA which constitute a subgroup of the peptides
  • the group A peptides against which the antibodies are formed are as ordered according to the method
  • AIP as defined above, with respect to the sequence of a protein of the viral agent involved in the pathology to be studied.
  • Group B peptides have amino acid sequences as ordered with respect to those of group A peptides above. Their common frequencies are in phase with that of the viral agent protein.
  • This first family can advantageously be used as a reagent for the diagnosis of a pathology by allowing the detection of the presence of antibodies, or of lymphocytes, capable of recognizing infectious proteins.
  • a biological sample such as a biological fluid such as serum or lymphocytes from the circulating blood into contact, or a biological tissue extract taken from the patient under study, or the animal, with antibodies induced against group A peptides, or with group B peptides as indicated above, including the peptide subgroup cA, and
  • lymphocyte reaction on contact with the antigen it is demonstrated either a reactivity of the lymphocytes of the sample with the peptides or the antibodies used as reagents, or a reactivity of the peptides or antibodies with the lymphocytes of a subject previously immunized with the peptides of the invention.
  • the lymphocytes thus sensitized constitute reagents.
  • Such immunization is carried out, for example, with the peptides cA.
  • the artificial antibodies or peptides are free or fixed on a non-immunogenic support during the contacting step.
  • lymphocytes use is made of a method conventionally used in immunology such as immunofluorescence, Elisa, Western Blot, or even lymphocyte stimulation, and possibly the test of the presence CTL ("cytotoxic T lymphocytes").
  • a method conventionally used in immunology such as immunofluorescence, Elisa, Western Blot, or even lymphocyte stimulation, and possibly the test of the presence CTL ("cytotoxic T lymphocytes").
  • the detection of a selective interaction between the antibodies in the sample and the artificial peptides or induced antibodies used, or even the reactivity of the lymphocytes, is significant for the existence of the pathology.
  • This detection method makes it possible to reveal with great sensitivity, and quickly, the presence, in a biological sample, of antibodies formed against the proteins expressed by a viral agent.
  • the second family mentioned above comprises group A peptides including the cB peptides, and antibodies or lymphocytes induced against group B peptides, the sequences of these peptides and their frequencies being as defined above.
  • This family can advantageously be used to detect the presence of proteins of a viral agent.
  • a biological sample such as a biological fluid such as serum or lymphocytes from the circulating blood, or a biological tissue extract taken from the patient under study, or the animal, into contact with antibodies or lymphocytes induced against group B peptides, or with group A peptides, as defined above, including the cB peptide subgroup and
  • said antibodies or said artificial peptides are brought into contact with the antigens of the infectious agent attached to a support and the reaction is inhibited by competition by adding the biological sample to be tested, when it contains the proteins of the viral agent.
  • lymphocytes To reveal the complex possibly formed or the reactivity of the lymphocytes, one uses one of the current methods for the detection of antibodies, or the revelation of the presence of antigen (s) stimulating the lymphocytes of the animal immunized against group B peptides.
  • the detection of a selective interaction between the proteins in the sample and the induced antibodies (or test lymphocytes) or the artificial peptides used is indicative of the existence of the pathology.
  • the proteins expressed by a viral agent can thus be easily detected and in particular localized and quantified, for example at the level of biopsies of pathological tissue, or of peripheral blood cells.
  • the invention also relates to kits for the in vitro diagnosis of viral pathologies in humans or animals.
  • the kit of the invention will advantageously include lymphocytes, for example in frozen form, from the animal immunized against given peptides.
  • the antibodies and peptides used are immobilized in a conventional manner on beads, for example latex beads, microtitration plates or even strips.
  • the invention further relates to the application of the peptides defined above for the preparation of immunogenic compositions.
  • Preferred immunogenic compositions comprise at least one group A peptide whose characteristic frequency (s) in the Fourier spectrum are in opposite phase with that (s) of the responsible antigenic sequence autoimmune pathology.
  • the amino acid sequence of these group A peptides is as ordered according to the AIP method by reference to that of the antigen to be treated.
  • peptides capable of inducing antibodies capable of neutralizing autoimmune antibodies and destroying autoimmune lymphocytes are peptides capable of inducing antibodies capable of neutralizing autoimmune antibodies and destroying autoimmune lymphocytes.
  • compositions are characterized in that they comprise at least one group B peptide, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle for the constitution of vaccines.
  • the immunogenic peptide can also be expressed by corresponding nucleotide sequences incorporated into an infectious agent whose safety has been previously established, such as a recombinant virus such as those produced from poxvirus family.
  • a virus of this type which is widely used is constituted by vaccinia, used in living form, attenuated or killed.
  • the immunogenic composition is administered in an amount and according to a protocol allowing the host to be immunized with respect to the antigens of the infectious agent.
  • Such a composition can be used for the development of vaccines capable of inducing sensitized lymphocytes and antibodies directed against the infectious agent.
  • compositions include a group B peptide as ordered according to the AIP method with respect to a group A peptide itself, ordered with respect to the proteins of a virus, more particularly with respect to those of a retrovirus , including HIV.
  • this group includes the peptides cA.
  • a single peptide proves capable of inducing antibodies which recognize all the proteins of the viral agent which express a significant periodic element in common.
  • Such an immunogenic composition vis-à-vis HIV is dosed in antigenic peptide so as to allow the administration of a dose of 10 to 100 ⁇ g / kg.
  • the lymphocytes sensitized by artificial group B peptides, analogues of the image of the target protein correspond to the category of immune lymphocytes carrying receptors involved in the destruction of the infectious agent or the cell infected by it, thanks to the ability of its receptors to recognize the antigen.
  • the activity of CTL (“Cytotoxic T Lymphocytes”) or other types of lymphocytes not requiring the mediation of antibodies, sensitized with the antiidiotype is not subject to restrictive control of genetic identity of MHC, and therefore should not represent obstacles to the destruction of infected target cells, or of the infectious agent (2).
  • the antibodies induced by the peptide analog of the internal image can intervene as well in the function of the complement as in the activity called ADCC ("Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity") of the cytotoxic lymphocytes (K lymphocytes) destroying the cells carrying on their surfaces the antibodies captured by the antigens.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • K lymphocytes cytotoxic lymphocytes
  • the peptides of the invention and the antibodies against these peptides can also be used in therapy, in particular as vectors for drugs or antigens.
  • antigens coupled to the peptides of the invention any bacterial or viral antigen can be used, provided that the organism is immunized (or vaccinated) beforehand against it (e.g. diphtheria toxoid, polio etc.).
  • Vectors must be designed with respect to the molecular domains of target proteins (viral antigens) that do not interact with the elements cells in the process of virus / cell recognition.
  • This provision is essential to avoid the induction by the vector of antibodies which could recognize the cellular structures with which the target protein interacts.
  • the invention relates to the use of type A peptides as drug vectors and type B peptides as inducers of antibodies or cytotoxic lymphocytes capable of intercepting antibodies / lymphocytes directed against CD4.
  • the apparent potential, or pseudopotential potential, of each of the amino acids of a given protein sequence is calculated according to the following general formula (4):
  • W 0.25Z * sin (1.04 ⁇ Z *) / 2 ⁇ , (1)
  • Z * represents the average of the number of quasivalences determined by where Zi represents the number of valence electrons of the ith atom of the molecule and N the total number of atoms in the molecule.
  • the digital series used for the Fourier transformation therefore represents discrete "determining" signals of finite length.
  • the absolute values of the Fourier transform coefficients define the amplitude of the spectrum, while their phases define the phase spectrum as follows:
  • the information spectrum which is defined as follows:
  • the minimum number of points required for an analysis is determined according to the desired resolution of the spectrum (that is to say according to the number of peaks to be highlighted).
  • the algorithm procedures are applied to the sequences of HIV gp160 (ENV), of HIV p55 (GAG), of a 44 amino acid fragment of gp120 involved in the recognition of CD4 (7) and to the murine and human CD4 protein.
  • the analysis procedure comprises the following steps:
  • each amino acid sequence is transformed into a corresponding numerical series by representing each amino acid with the corresponding value of the ion-electron interaction potential
  • the peptides obtained in this way have the same spectral characteristics as those associated with the bio-recognition of gp160 / 120 and of CD4 and can be proposed to present a similar set of properties-functional motifs.
  • the polyclonal (or monoclonal) antibodies generated against these analogs of synthetic peptides should be capable of cross-reactions with the surface region of the gp160 / 120 molecule responsible for binding to CD4.
  • This frequency f1 is also distinguished as an average signal in the spectrum of the proteins gp160 and p55 from isolates such as LAVbru as shown in Figures le and
  • This characteristic frequency f1 also appears in the fragment of gp 120 corresponding to amino acids 418 to 461 (numbering according to Neosystem Laboratory-1990, HIV-peptides, SlV-peptides) responsible for the binding to CD4 (7) of various HIV isolates and the LAVbru isolate.
  • a frequency f2 0.2188 as it appears respectively in the figures le (8 HIV isolates) and lf (LAVbru isolate).
  • sequence of the peptide A1 was ordered by following the AIP method of example 1.
  • the sequence developed responds to the following sequence:
  • Sequence A1 KQQYYWYAWCQPPQDQLIMD
  • sequence of the peptide A2 was ordered by reversing the phase of the frequency f1, but without taking account in this case of the frequency f2, this peptide being established, as regards the frequencies, only by compared to f1.
  • Sequence A2 LKRDQEPMDFHIWDDYLKRD
  • A1 and A2 have no homology at the level of their sequence, although they have the frequency f1 in common.
  • This peptide was developed so as to present the same frequencies f1 and f2 as the peptide A1 but with phases opposite to these frequencies, and therefore of the same phases as the frequencies f1 and f2 of the fragment of the sequence S.
  • Sequence B1 DDALYDDKNWDRAPQRCYYQ
  • This peptide was developed by analogy with peptides A1 and A2, and has a unique frequency f1, in the opposite phase to that of A1 and A2.
  • the AIP spectrum of peptide B2 is shown in Figure 2d. This peptide, which responds to the sequence
  • Sequence B2 DFHIWDDYLKRDQEPMDFHI
  • Example 4 Synthesis of the artificial peptides of Example 3.
  • Protected peptide resins were synthesized by the multiple peptide synthesis method developed by HOUGHTEN (8) using a methyl benzhydrylamine resin (100 to 200 mesh, 0.4 to 0.8 meq / g), and the amino acids N- ⁇ -t-butoxy carbonyl (t-boc) such as those marketed by Bachem inc (Torrence, CA).
  • the peptides were separated from the resin according to the usual method of hydrogen fluoride and anisole (9). After the synthesis, the purity of the peptides was evaluated by reverse phase HPLC on a column of PepRPC HR5 (Pharmacia).
  • the peptides represent approximately 85% of the absorbent material at DO 214 .
  • the peptide sequences were checked.
  • Example 1 Application of the method of Example 1 to the analysis of the retroviral feline leukemia virus (Feline Leukemia Virus or FLV).
  • the FLV-kn20 peptide corresponds, from the point of view of motif characteristics, to the knob-gp70 peptide. In other words, it has been found to correspond to a peptide of 20 amino acids of the knob type gp70 with the sequence:
  • the FLV-knob20 peptide corresponds to a peptide of
  • the FLV-sp73 peptide corresponds, for the characteristics of these motifs, to spike p15; it's about of a 73 amino acid peptide of the spike p15 type, having the sequence:
  • the FLV-spop50 polypeptide is in reverse phase with spike 15. It is a 50 amino acid peptide of the anti-spike p15 type, having the sequence RRRDDDDDDD 10 DDDDDDDDDR 20 RRRTCMQQQW 30 WYYAKHHPPP 40
  • the FLV-spkn90 peptide is a 90 amino acid peptide of the spike p15 protein and knob gp70 type.
  • the FLV-spknop50 peptide is a peptide of 50 amino acids whose characteristics correspond to a peptide of the anti-spike 15 and anti-knob gp70 type. This peptide has the following sequence:
  • Example 6 Nucleotide fragments capable of coding for artificial peptides related to HIV proteins and expression of these peptides.
  • nucleotide sequences deduced from the peptide sequences are synthesized.
  • the cohesive ends which frame the coding sequence are chosen so as to include the restriction sites for BamH1 (5 'end of a strand and 3' of the complementary strand) and EcoR1 (3 'and 5' ends respectively of each strand) at know :
  • the chain “+” represents the messenger RNA when the base T is replaced by the base U.
  • the messenger RNA is the result of the transcription of the chain "-" (the complementary RNA of chain "-").
  • sequences of the peptides A11 and B11, illustrated below, have been deduced from the chains complementary to those which can code for the peptides cA1 and cB1 (indicated between brackets above).
  • nucleotide fragments are inserted into the plasmid pGEX-2T, the restriction map of which is shown in FIG. 3, using the GST gene fusion system from Pharmacia (Uppsala, Sweden).
  • This system includes a tac promoter, an internal lac i7 gene and thrombin cleavage sites.
  • the expressed peptide is fused to the carboxyl end of the glutathione S-transferase from Schistosoma japonicum and purified from bacterial lysates by affinity chromatography using a column of glutathione Sepharose 4B R
  • Example 7 Study of the immunological properties of the pairs of artificial peptides.
  • Two month old rabbits (New Zealand) are immunized with peptides obtained as described above.
  • the rabbits are injected on day zero with 100 ⁇ g of peptide in the complete Freund's adjuvant.
  • the sera are tested 3 days after the last inoculation according to the ELISA test to determine the presence of antibodies against the inoculated peptide.
  • the sera titers are expressed in logarithms of the highest dilution for which the serum shows significant reactivity for an antigen.
  • Standard 96-well microtiter plates are covered with the various synthetic peptides to be studied.
  • peptide solution 100 ⁇ l are used per well of a peptide solution at 1 ⁇ g / ml in a PBS solution (saline solution buffered with phosphate), pH 7.4.
  • PBS solution saline solution buffered with phosphate
  • an anti-rabbit IgG anti-serum conjugated with horseradish peroxidase (diluted to 1/1000) is added, then the plates are incubated for another hour at 37 ° C.
  • the enzymatic activity is determined using o-phenylene diamine as a substrate.
  • the absorbance is measured at 492 nm.
  • the results obtained are reported in Table 2 according to: TABLE 2
  • the values represent the logarithms of the highest dilutions for which the serum shows significant reactivity.
  • Peptides A1 and A2 are only weakly recognized by rabbit anti-B1 polyclonal antibodies in the ELISA test.
  • the specificity of the cross-reactivity of the anti-B1 and anti-B2 sera is in agreement with the concept of a common frequency f1 for the two peptides B1 and B2, as demonstrated above with the cross-reactivity of the anti-A1 sera. and anti-A2, with the peptides respectively
  • the anti-A1 serum does not give rise to a marked cross-reaction with the peptides B1 or B2 which have opposite phases, this parameter therefore also intervening in biomolecular recognition.
  • the anti-B2 serum does not give a cross-reaction with the peptide A1.
  • the anti-B2 serum gives a weak cross-reaction with the peptide A2, while the polyclonal antibodies of the anti-A2 serum significantly recognize the peptide B2 in the ELISA test.
  • This cross-reactivity must be attributable to the homology of the sequences of A2 and B2 which have two fragments in common, namely DFHIWDDYLKRD and QEPMDFHI, although the position of these sequences is reversed.
  • the anti-B1 serum recognizes the recombinant glycoprotein (Baculovirus) gp120 of HIV-1, while the anti-A1, anti-A2 and anti-B2 sera do not react with gp120 under the conditions of the experiment.
  • Example 8 - STUDY OF THE REACTIVITY OF SERUMS WITH HIV PROTEINS IN THE IMMUNOBLOT TEST:
  • results obtained with an anti-rabbit anti-B1 serum are reported below using a commercial immunoblot kit such as that marketed by Diagnostic Pasteur containing LAVbru HIV-1 proteins.
  • the serum is diluted and incubated with the immunoblot strips with anti-rabbit goat IgG labeled with alkaline phosphatase.
  • the bands are developed using a phosphatase substrate system (Diagnostic Pasteur).
  • FIG. 5 Examination of this figure shows that the antibodies induced by the peptide B1 and present in the anti-B1 serum are capable of reacting with several proteins of HIV-1.
  • the antibodies in this serum were captured by the POL p68 protein (encoded by the virus reverse transcriptase gene), by the GAG protein p55 (the precursor of the GAG proteins), as well as by the proteins derived from this protein. precursor: p18, p24 / 25 and p40.
  • the component having a clear band of 43 kDa located in the region corresponding to the diffuse band of gp41 gives rise to a cross-reaction.
  • the p15 protein is the only protein among the GAG proteins which does not seem to be recognized by the antiB1 serum. Finally, the binding of anti-B1 antibodies to gp120 does not appear significantly in the Immunoblot test.
  • HIV-1 IgG Western blot kit marketed by Ortho Diagnostic Systems.
  • the gene containing the information for the peptide B1 was synthesized and inserted into the plasmid pGEX-2T (as described in Example 7), and then introduced into the bacterium.
  • the presence of the peptide B1 (fused with glutathione S-transferase) is revealed by the anti-B1 serum using the immunoblot, after a migration of the proteins on electrophoresis gel and their transfer to nitrocellulose.
  • the rabbits were immunized with the peptide cA1, the sequence of which is as follows: VHNQLVLRRLAPSVPWLLF. It is recalled that the peptide cA1 is part of the group of peptides B, since its chain of amino acids has been deduced from the nucleotide sequence complementary to that of the peptide A1, the latter belonging to group A (as described in Example 5). THE PROTOCOL IS AS FOLLOWS:
  • 300 ⁇ g of peptide are administered to rabbits by ID or SC injection with Freund's adjuvant (complete and incomplete).
  • One injection is given every 10 days, with at least 8 injections.
  • the antibody level is tested by the ELISA method one week after the last injection.
  • Samples are taken from the ear of the immunized rabbit (20 ml of blood are necessary). The same sample is taken from a control rabbit (not immunized).
  • One volume of whole blood is diluted in two volumes of HANKS solution, then placed on a FICOLL cushion and centrifuged at 1300 rpm for 30 minutes.
  • lymphocyte ring is removed, then rinsed twice in a HANKS solution and resuspended in 1 ml of RPMI 1640 medium.
  • lymphocytes are then counted in the MALASSEZ cell, then their number is adjusted so as to have at least 250,000 cells per well.
  • the culture is carried out in 96-well flat-bottom plates, treated for cell culture (Falcon No. 3072).
  • the culture medium is RPMI 1640 with antibiotics, glutamine and 10% rabbit serum in question, taken before immunization and decomplemented.
  • Each well receives 250,000 cells and increasing quantities of immunogenic peptide (from 10 to 75 ⁇ g per well).
  • the plates are placed in an incubator at 37 ° C. containing 5% of CO 2 for 5 days.
  • the contents of the wells are collected on glass fiber filters using a suction collector, the filters are then dried counted in a scintillating liquid.
  • Bibliographical references 1 / Hay, F.C. et al, (1984), pp 117-138. Academy Presss, Inc., Orlando, Florida.

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Abstract

L'invention concerne des peptides immunologiquement apparentés aux protéines exprimées par un agent viral, ayant une séquence d'acides aminés ordonnée à l'aide de la méthode d'analyse informationnelle des protéines à l'aide de la méthode de transformation de Fourier par référence à la séquence d'acides aminés d'un antigène cible contre lequel on souhaite former des anticorps, ou diriger les lymphocytes, cette séquence présentant dans le spectre de Fourier, une ou plusieurs fréquences sensiblement de même valeur que la ou les fréquences caractéristiques de l'antigène cible. Application de ces peptides pour le diagnostic de pathologies virales chez l'homme ou l'animal ou comme compositions immunogènes.

Description

PEPTIDES IMMUNOLOGIQUEMENT APPARENTES AUX PROTEINES D'UN AGENT VIRAL ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention a pour objet des peptides immunologiquement apparentés aux protéines d'un agent viral, c'est-à-dire constituant, au regard de leurs propriétés immunologiques, des analogues des protéines impliquées dans une pathologie virale ou des anticorps formés contre ces protéines.
Elle vise également les applications biologiques de ces peptides, plus particulièrement à des fins de diagnostic, de prévention et thérapeutiques.
On sait que l'approche immunologique est largement utilisée pour traiter ou établir un diagnostic des pathologies humaines ou animales dans lesquelles sont impliquées des agents infectieux ou encore des constituants cellulaires et extra-cellulaires de l'organisme responsable de l'auto-immunité.
Par l'expression agent infectieux, telle qu'utilisée dans la description et les revendications, on entend les agents pathogènes viraux, ce terme recouvrant les agents rétroviraux, ou encore les cellules infectées par ceux-ci.
Cette approche immunologique repose sur l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement l'antigène infectieux, ou sur l'induction de réponses immunitaires de l'organisme, comprenant aussi les auto-anticorps.
De manière générale, la production d'anticorps se fait par immunisation des animaux contre l'agent infectieux préalablement inactivé ou contre des protéines purifiées de cet agent.
Toutefois ce processus est souvent coûteux et exige la mise en oeuvre d'installations importantes pour la production et l'isolement de l'agent infectieux ainsi que pour la purification des protéines.
En outre, dans le cas d'agents particulièrement virulents, ces opérations requièrent une logistique de laboratoire répondant à des normes sévères de sécurité, ce qui rend les opérations encore plus coûteuses.
Pour être utilisables en thérapeutique, on postule que les anticorps doivent exercer un effet neutralisant in vivo vis-à-vis de l'agent infectieux.
Or, dans de nombreuses situations pathologiques, les anticorps circulants ou induits n'exercent pas un tel effet sur les protéines antigéniques.
Ce problème se pose actuellement de manière particulièrement aiguë dans le cas de la ou des pathologie(s) induite(s) par le virus HIV chez l'homme, communément appelée(s) par le sigle SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise). Les différents stades cliniques de l'infection par HIV s'accompagnent en effet d' importantes altérations du système immunitaire résultant de la très grande affinité du virus pour le récepteur CD4 des lymphocytes T4 entraînant la mort des cellules infectées. Par ailleurs d'autres types de cellules sont infectées par HIV.
On rappelle que de manière courante HIV désigne les rétrovirus du type HIV-1 et HIV-2 isolés à ce jour chez l'homme et les rétrovirus de type SIV isolés chez le singe, qui sont différents de HIV-1 et HIV-2 ainsi que leurs nombreux variants.
Les travaux concernant l'élaboration des vaccins contre HIV sont principalement orientés vers l'utilisation des antigènes viraux, ou de leurs fragments dérivant des protéines de HIV. L'intérêt a été porté surtout sur la glycoprotéine de l'enveloppe du virus codée par le gène ENV, la gp160 (gp120/41), ou un fragment de celle-ci. Plus récemment, la vaccination expérimentale a été abordée à l'aide de constituants internes du virus tels que les protéines codées par le gène GAG (et POL).
Divers modèles animaux sont utilisés dans ces essais, y compris les primates.
Un certain effet protecteur contre l'infection par HIV a été observé dans le cas de singes inoculés avec ce virus. Ces résultats doivent être cependant considérés avec prudence étant donné que ces animaux ne peuvent pas développer le SIDA.
Des essais de vaccinations expérimentales chez l'homme sont également en cours, principalement avec les protéines, ou les peptides dérivant du gène ENV.
Cependant, l'efficacité de tels vaccins est loin d'être établie et la mise au point d'un vaccin contre le SIDA soulève de nombreux problèmes. Ainsi par exemple, le problème majeur réside dans le fait que chez les sujets séropositifs, ainsi que chez les malades, la plupart des anticorps circulants ne sont pas capables de neutraliser le virus et/ou d'éliminer les cellules véhiculant celui-ci dans le corps de patients. Bien que certains anticorps circulants soient neutralisants in vitro, leur effet protecteur dans l'organisme s'est montré inefficace.
Une autre approche immunologique consiste à générer l'image interne de l'antigène à savoir l'anticorps anti-idiotype, puis à utiliser cette nouvelle structure comme agent d'immunisation, plutôt que l'antigène lui-même (voir (1) et (2) dans les références bibliographiques données à la fin de la description).
Une telle immunisation via l'image interne de l'antigène nécessite plusieurs étapes.
On doit effectuer tout d'abord une immunisation avec l'antigène, ce qui permet l'induction d'anticorps AC1, ou anticorps idiotypes, dirigés contre cet antigène.
Ensuite, on doit procéder à l'immunisation avec l'anticorps idiotype AC1 aux fins d'induction d'anticorps anti-idiotypes AC2, porteurs de l'image interne de l'antigène initial. Cette image interne de l'antigène correspond à la région de contact entre celui-ci et l'anticorps AC1.
Enfin, l'immunisation avec l'anti-idiotype AC2 permet d'induire les anticorps AC3 anti-anti-idiotypes. Ces anticorps AC3 sont capables de réagir avec l'antigène initial (1, 2). Par ailleurs, l'anti-idiotype AC2 peut activer les lymphocytes qui deviendraient ainsi capables de reconnaître l'antigène initial, comme dans le cas d'activation directe de ces cellules par l'antigène. L'induction de l'anti-idiotype AC2 peut être obtenue aussi contre les récepteurs des cellules T sensibilisées, responsables de l'immunité cellulaire. Il est possible en effet de générer les lymphocytes T dont les récepteurs sont capables de reconnaître les déterminants étrangers exprimés à la surface d'un virus ou des cellules infectées, en même temps que les déterminants cellulaires du type CMH (complexe majeur d'hystocompatibilité). Il s'agit donc de lymphocytes sensibilisés.
Lors de cette première étape, les récepteurs R1 de ces lymphocytes expriment les structures correspondant à l'idiotype, effectuant en fait une fonction similaire à celle de l'anticorps AC1.
L'immunisation par les lymphocytes (ou leur récepteur RI membrannaire) ainsi sensibilisés permet ensuite l'induction d'anticorps anti-idiotype AC2, ainsi que celle des lymphocytes aux récepteurs R2, équivalents de l'anticorps AC2, dirigés contre, ou reconnaissant, le domaine du récepteur lymphocytaire R1 impliqué dans le contact avec l'antigène. Enfin, les récepteurs R2 des lymphocytes ou les anticorps anti- idiotypes AC2, sont capables d'induire une nouvelle réponse des cellules lymphocytaires, dont les récepteurs R3 reconnaissent l'antigène initial (1).
Ce traitement de l'image interne de l'antigène est particulièrement intéressant pour influencer le mécanisme de sensibilisation des lymphocytes. L'avantage majeur qui s'en dégage réside dans le fait que la reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes sensibilisés avec l'image interne ne dépend pas de la nature génétique de l'hôte immunisé, car le contrôle restrictif de l'identité de CMH de cellules cibles infectées, ou du virus ne représente plus d'obstacles à leur destruction (2).
En conclusion, les anticorps dirigés contre l'anti-idiotype, ayant la capacité de réaction croisée avec l'antigène initial, sont capables d'induire l'immunité dans laquelle sont impliqués aussi bien les lymphocytes B que les lymphocytes T. Toutefois, l'utilisation d'anticorps ou de récepteurs lymphocytaires anti-idiotypes en tant que vecteurs de l'image interne de l'antigène dans la prévention ou le traitement de maladies immunodéficientes n'est pas sans danger.
En effet, une prudence particulière doit être observée au sujet des traitements qui impliquent l'injection d' anti-idiotypes dans l'organisme (2). Ainsi par exemple chez le cobaye, la présence de certaines fractions d'anticorps anti-idiotypes (AC2), telle que la sous-classe IgG2, capable de fixer le complément, exerce plutôt un effet suppresseur sur l'induction d'anticorps anti-anti-idiotypes (AC3) par les IgGl ne fixant pas le complément, les deux sous-classes d'IgG étant présentes dans le même sérum. A côté de l'inconvénient lié à l'effet immunosuppresseur des anticorps AC2, des doses extrêmement faibles d'anticorps, qui sont de l'ordre de 10 ng chez la souris, doivent être administrées, et ceci par voie sous-cutanée, et non par voie intraveineuse, pour éviter les perturbations immunologiques.
L'approche immunologique classique des problèmes de vaccination et de thérapeutique ne s 'avérant pas satisfaisante, les inventeurs ont recherché une voie différente pour obtenir des molécules immunogènes, basée sur un traitement physico-mathématique de la séquence d'acides aminés d'un antigène.
Des travaux basés sur la méthode d'analyse informationnelle des protéines, en abrégé AIP (connue aussi sous le nom "Résonant Récognition Model" RRM), à l'aide de la méthode de transformation de Fourier en particulier à l'aide de la "Fast Fourier Transform", (en abrégé FFT) ont en effet montré qu'un groupe de protéines interagissant avec le même récepteur, exprime une fréquence ou une période commune à ce groupe ainsi qu'au récepteur.
Toute référence dans la suite de la description et dans les revendications à la transformation de Fourier, et aux spectres de Fourier, englobe la FFT et les spectres FFT.
Cette méthode AIP telle que décrite notamment dans (3) est basée sur une représentation de la structure primaire d'une protéine sous forme d'une série numérique, en assignant à chaque acide aminé un paramètre défini décrivant une propriété physico-chimique impliquée dans l'activité biologique de la protéine.
Les meilleures corrélations ont été obtenues avec les paramètres liés à l'énergie des électrons délocalisés de chaque acide aminé. Cette énergie peut être calculée suivant divers paramètres physico-chimiques caractéristiques des acides aminés tel que le pseudo-potentiel d'interaction électron-ion (PIEI) des électrons délocalisés (4,5).
En appliquant à ces valeurs la transformation de
Fourier, il est possible d'obtenir des spectres portant la même information que la séquence numérique d'origine (6).
Cette approche théorique s'est révélée de grand intérêt pour analyser la corrélation existant entre la distribution de l'énergie des électrons délocalisés le long de la structure primaire d'une macromolécule et ses fonctions de bioreconnaissance et biologiques.
Ainsi, en utilisant une telle méthode, il a été démontré en comparant plusieurs centaines de protéines, que les différentes fréquences de leurs spectres de Fourier pouvaient être reliées à leurs différentes fonctions biologiques, et que des séquences impliquées dans la même fonction biologique présentent les mêmes caractéristiques périodiques.
En multipliant les spectres de Fourier de protéines ayant une même fonction biologique, on observe un ou plusieurs éléments périodiques communs ou une ou plusieurs fréquences communes, caractéristiques de cette activité biologique, se traduisant par un ou plusieurs pics.
Une telle fréquence a été détectée par exemple chez des hormones peptidiques et leurs récepteurs.
L'utilisation de ce concept théorique par les inventeurs pour rechercher de nouvelles molécules étrangères à l'organisme de l'homme ou de l'animal, mais susceptibles d'induire des anticorps qui reconnaissent des antigènes viraux a montré que les éléments périodiques caractéristiques ou majeurs, communs à plusieurs protéines, peuvent être utilisés comme base pour l'élaboration de peptides immunologiquement actifs vis-à-vis de ladite réaction de reconnaissance.
L'invention a donc pour but de fournir de tels peptides, constituant notamment des analogues des protéines d'agents viraux, ou des analogues des anticorps formés contre ces protéines, c'est-à-dire capables de mimer ces protéines et anticorps en termes d'immunogénicité.
Elle vise en particulier à fournir des peptides constituant des analogues d'images internes des protéines antigéniques de ces agents, correspondant au, ou incluant le site de liaison avec l'anticorps.
L'invention a également pour but de fournir un procédé d'obtention de ces peptides permettant d'élaborer une séquence peptidique selon l'immunogénicité souhaitée par rapport à un antigène cible et de l'obtenir aisément par voie de synthèse.
L'invention vise également les applications biologiques de ces peptides, et plus particulièrement leur utilisation en diagnostic, prévention et thérapeutique. L'invention ouvre notamment des possibilités de traitements de l'auto-immunité en fournissant des peptides capables d'induire des anticorps, ou des lymphocytes susceptibles de reconnaître des anticorps auto-immuns et, en les détruisant, des lymphocytes auto-immuns.
Les peptides selon l'invention, qui sont, notamment, immunologiquement apparentés aux protéines d'un agent viral, sont caractérisés en ce qu'ils comprennent, ou qu'ils sont constitués par une séquence d'acides aminés
telle qu' ordonnée à l'aide de la méthode numérique AIP par référence à la séquence d'acides aminés d'un antigène cible contre lequel on souhaite former des anticorps, ou diriger les lymphocytes,
. différente de la séquence de la ou des protéines de l ' agent viral,
. présentant, dans le spectre de Fourier, une ou plusieurs fréquences sensiblement de même valeur que la ou les fréquences caractéristiques de l'antigène cible.
On observera que les peptides tels qu'ordonnés par la méthode AIP sont des peptides artificiels dont les séquences sont établies sur la base de celle d'un antigène cible et de manière à présenter en commun avec cet antigène, une (ou plusieurs) fréquence(s) caractéristique(s) d'une activité biologique.
L'expression "antigène cible" désigne aussi bien la protéine exprimée par l'agent viral, ou un fragment de cette protéine, qu'un anticorps formé contre cette protéine ou un fragment de cette dernière, ou encore l'antigène à protéger dans le cas d'une pathologie auto-immune, ou encore un peptide dont la séquence en acides aminés a été elle-même ordonnée à l'aide de la méthode numérique AIP.
L'expression "fréquence caractéristique" signifie qu'il s'agit de la (ou des fréquences) dans les spectres de Fourier considérés, qui apparaît (apparaissent) liée(s) à l'immunoréactivité avec l'antigène cible ou de l'antigène à protéger (en phase opposée) et comporte(nt) l'information pertinente par rapport aux propriétés d' antigénicité.
La référence à des fréquences communes, telle qu'utilisée dans la description et les revendications, signifie que les fréquences des séquences considérées ont une même valeur ou des valeurs voisines.
L'invention vise en particulier un groupe de peptides dont la (ou les) fréquence(s) dans leur spectre de Fourier est (sont) en phase inverse par rapport à celle(s) caractéristique(s) de l'antigène cible.
L'invention vise également un autre groupe de peptides, dont la (ou les) fréquence(s) dans leur spectre de Fourier est (sont) en phase avec celle(s) caractéristique(s) de l'antigène cible.
On observera que les peptides d'une même famille présentent, entre eux, même(s) fréquence(s) et même phase. En revanche, leurs séquences protéiques sont différentes et ce aussi bien entre elles, que par rapport à celles des antigènes cibles.
L'antigène cible peut être constitué par une protéine virale ou un fragment d'une telle protéine renfermant au moins le site antigénique.
Un groupe A de peptides tel qu'ordonnés par rapport à cette protéine virale est caractérisé en ce que lesdits peptides présentent dans leur spectre de Fourier, en commun avec la protéine virale, la (ou les) fréquence(s) caractéristique(s) de cette protéine, mais en phase inverse, et qu'ils sont capables d'induire des anticorps à réactivité croisée avec les membres du même groupe.
Ces anticorps s'avèrent donc capables de reconnaître, en opérant, comme décrit notamment dans les exemples, selon les techniques Elisa ou Western Blot, des structures peptidiques différentes de celles contre lesquelles ils ont été formés, mais qui présentent avec ces dernières des caractéristiques spectrales en commun. Réciproquement une structure peptidique donnée d'un groupe de peptides est capable de donner un complexe de type antigène-anticorps avec les anticorps formés contre d'autres peptides de la famille.
On remarquera que les anticorps induits par ces peptides du groupe A sont des analogues de l'image interne de la protéine virale, plus précisément du domaine de cette protéine impliqué dans une réaction du type antigèneanticorps.
L'expression "analogues de l'image interne d'une protéine" telle qu'utilisée dans la description et les revendications se réfère aux données obtenues par la méthode AIP utilisée comme moyen de modélisation selon l'invention.
Dans une autre variante de l'invention, l'antigène cible, par rapport auquel est ordonnée une séquence peptidique, est constitué par des peptides du groupe A.
Un groupe B de peptides tels qu'ordonnés par rapport à des peptides du groupe A est caractérisé en ce que lesdits peptides présentent dans leur spectre de Fourier une ou des fréquences communes avec celle(s) caractéristique(s) des peptides A, en phase inverse par rapport à celle(s) des peptides A, mais en phase avec celle(s) de l'antigène cible par rapport auquel les peptides du groupe A ont été ordonnés.
On observera que ces peptides du groupe B sont des analogues de l'image interne de l'antigène cible utilisé comme référence pour ordonner les peptides A. On rappelle que le terme analogue tel qu' utilisé dans la description et les revendications signifie que les produits concernés sont immunologiquement apparentés.
Selon un aspect présentant un intérêt fondamental au regard des applications biologiques envisagées, ces peptides du groupe B sont capables d' induire des anticorps susceptibles de former un complexe immun, tel que mis en évidence par les techniques de Western Blot, avec la ou les protéines de même(s) fréquence(s) exprimées par l'agent infectieux. Ces anticorps peuvent correspondre aux anticorps induits par les peptides de type A.
Les peptides du groupe B sont également capables d'induire des anticorps, ou des lymphocytes, reconnaissant les auto-anticorps, ou les lymphocytes auto-immuns, dirigés contre le CD4.
Dans un mode de réalisation de l'invention, les peptides B décrits ci-dessus constituent plus spécialement des analogues de protéines exprimées par des virus à ARN négatif, des virus à ARN positif, des virus à ARN bicaténaires ou encore des virus à ADN comme l'herpès ou le cytomégalovirus, et leurs variants.
L'invention vise spécialement les peptides évoqués plus haut, analogues des protéines des rétrovirus ou des anticorps formés contre ces protéines. Comme rétrovirus, on citera les lentivirus à pouvoir cytopathogène, et tout spécialement HIV, en particulier HIV-1 et HIV-2 (responsables de pathologies chez l'homme), SIV (chez le singe), Visna (chez le mouton) CAEV (chez la chèvre), ELAV (chez le cheval), FLV (chez le chat), BLV (chez les bovins), et leurs variants.
D'autres rétrovirus comprennent les oncornavirus tels que HTLV-1 et HTLV-2, isolés chez l'homme, et les rétrovirus animaux associés à des leucémies et à des cancers.
De manière particulièrement préférée, l'invention vise les peptides comportant ou constitués par une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par rapport à la séquence d'une protéine choisie parmi les protéines exprimées par HIV-1. Il s'agit en particulier des protéines codées par les gènes GAG, POL et ENV communs aux rétrovirus, et plus spécialement de la gp160 (précurseur d'enveloppe, ENV) ; gpllO/120 (ENV) ; p66/68 (transcriptase inverse POL), p55 (précurseur prot. interne, GAG) ; p51/52 (POL-protéase) ; gp41 (ENV) ; p40 (GAG précurseur prot. interne), p31/34 (POL endonucléase), p24/25 (GAG, prot. interne) ; pl7/18 (GAG, prot. interne).
Selon la désignation habituelle gp signifie glycoprotéine, p est utilisé pour le terme protéine, et les chiffres mentionnés correspondent au poids moléculaire établi par migration des protéines dans un gel et confirmés et précisés par l 'analyse des séquences des gènes correspondants.
Conformément à l'invention, la séquence d'acides aminés des peptides de l'invention, telle qu'ordonnée par la méthode AIP par rapport à l'une des séquences des protéines de HIV ci-dessus, présente en commun avec ces protéines au moins une fréquence caractéristique.
Des peptides de grand intérêt comportent une séquence d'acides aminés présentant un spectre de Fourier avec au moins une fréquence égale à 0,1855, ou voisine de cette valeur, correspondant à celle que présentent en commun les protéines cibles gp160/120 et p55 exprimées respectivement par les gènes ENV, et GAG de HIV-1 (ainsi que la protéine POL, p66/68, telle que celle de la souche LAVbru), ou les protéines qui en dérivent ainsi que leurs fragments.
D'autres peptides présentent en outre une fréquence égale ou sensiblement égale à 0,2188, telle qu'exprimée par le fragment de la gp120 impliqué dans la liaison au récepteur CD4, désigné ci-après par l'expression fragment gp120cD4. Plus spécialement, l'invention vise les peptides comportant une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par rapport à la séquence de ce fragment, comme illustré dans les exemples.
Des peptides avantageux sont des peptides du groupe A ci-dessus et présentent des spectres de Fourier avec une fréquence caractéristique du fragment gp120cD4, le cas échéant deux fréquences, mais en phase inverse par rapport à celle(s) de ce fragment.
D'autres peptides avantageux sont du groupe B et présentent des spectres de Fourier dont la (ou les) fréquence(s) caractéristique(s) est (sont) en phase inverse de celle(s) des peptides du groupe A.
De tels peptides présentent la même phase que celle de la gp120cD4 ou des fréquences caractéristiques du fragment.
En outre, ils s'avèrent capables d'induire des anticorps à réactivité croisée avec les membres du même groupe.
En particulier, ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant certaines parties de la région du fragment gp120cD4 dans les conditions du test Elisa et/ou Western Blot tel que décrit dans les exemples ci-après.
D'autres modes de réalisation de l'invention seront aisément mis en oeuvre par l'homme de l'art en fonction de l'agent viral avec lequel on souhaite une reconnaissance immunologique. Cet agent viral peut être, par exemple, le virus de la leucémie féline (FLV en abrégé, pour Féline Leukemia virus), des précurseurs de la polyprotéine d'enveloppe (10), (14), cette polyprotéine (11), (12), (13), (15), ou des fragments, ou encore le virus de la leucémie des cellules T, HTLV-I ou HTLV-II, la polyprotéine d'enveloppe de ces virus (16), (17) ou leurs fragments, ou le virus Visna, notamment la polyprotéine d'enveloppe, son précurseur (18), ou des fragments de ceux-ci.
L'invention permet donc de disposer de peptides artificiels du groupe A, ordonnés selon la méthode AIP, par rapport à une séquence donnée des protéines ou fragments de l'un des agents viraux ci-dessus, et des peptides artificiels du groupe B, ordonnés par rapport aux peptides A, ainsi que des anticorps dirigés contre ces peptides.
Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention fournit des peptides capables d'induire des anticorps dirigés contre les anticorps auto-immuns et les lymphocytes auto-immuns, ou encore fournit les séquences peptidiques analogues de ces anticorps. Des peptides de ce type sont caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par rapport aux séquences virales analogues de celles de HLA-DR ou encore à celles de l'interleukine 2, avec la phase inversée par rapport à celles de ces séquences et qu'ils sont capables d'induire des anticorps (ou des lymphocytes) reconnaissant les anticorps (ou les lymphocytes) dirigés respectivement contre ces séquences de HLA-DR et de l'interleukine 2.
On remarquera avec intérêt que les peptides de l'invention peuvent présenter une immunogénicité orientée vers les protéines d'un agent infectieux susceptible de développer une pathogénicité dans le cadre d'une infection provoquée par un premier agent.
Il en est ainsi fréquemment lors d'infections par HIV où les malades deviennent sensibles à des infections dites opportunistes. Par exemple, des virus HHV6 qui appartiennent à la famille des Herpès, ou des mycoplasmes (les bactéries dépourvues de paroi) ont pu être détectés chez les sujets infectés par HIV.
L'invention vise donc tout spécialement les peptides, tels que définis ci-dessus, capables d'induire des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec les protéines de tels agents infectieux, ou capables de réagir eux-mêmes avec ces protéines. Elle vise également les peptides artificiels ci-dessus capables d'induire des lymphocytes susceptibles de réagir avec les protéines des agents infectieux.
Selon un autre aspect, d'autres peptides de l'invention sont tels qu'exprimés par les séquences de nucléotides déduites de séquences d'acides aminés spécifiques, telles qu'ordonnées par la méthode AIP.
Ces séquences de nucléotides sont des produits nouveaux qui font également partie de l'invention.
L'invention vise donc des fragments polynucleotidiques caractérisés en ce qu'ils comportent ou sont constitués par une séquence codant pour un peptide tel que défini ci-dessus. Il est à noter que ces séquences peuvent différer en raison en particulier de la dégénérescence du code génétique et du codage d'un même acide aminé par des codons différents.
D'autres fragments polynucleotidiques de l'invention correspondent ou sont constitués par des séquences complémentaires des séquences ci-dessus, ou des séquences de nucléotides susceptibles de s'hybrider avec l'une des séquences nucléotidiques complémentaires de celles des séquences déduites des séquences peptidiques.
Des séquences de nucléotides particulièrement visées par l'invention correspondent à celles codant pour des séquences des peptides du groupe A.
D'autres séquences spécialement visées par l'invention correspondent à celles codant pour des séquences du groupe B. On citera en particulier celles codant pour des séquences ayant une parenté immunologique avec les protéines de HIV.
D'autres séquences préférées correspondent aux séquences de nucléotides complémentaires des séquences capables de coder pour les peptides du groupe A ou du groupe B. Les peptides codés par ces séquences complémentaires sont des nouveaux produits et sont également visés par l'invention.
Ces peptides sont désignés dans la description et les revendications par la lettre c, cA et cB désignant ainsi respectivement des peptides dont les séquences sont déduites de la séquence de l'ARN complémentaire de celle de la séquence de l ' ARN correspondant aux peptides du groupe A ou B respectivement et ordonnée à l'aide du code génétique.
On observera que les peptides cA constituent un sous-groupe des peptides B et les peptides cB un sous-groupe des peptides A. Enfin, les peptides du type A et B codés par les séquences complémentaires de celles pouvant coder respectivement pour les peptides cA et cB sont également visés par l'invention. Des peptides de ce type sont donnés dans les exemples et désignés comme peptides A11 et B11.
Dans un mode de réalisation avantageux, les fragments nucléotidiques ci-dessus comprennent en outre une ou plusieurs séquences susceptibles de coder pour une ou plusieurs protéines ayant une activité biologique présentant un intérêt particulier pour une application donnée.
Entrent également dans le cadre de l'invention les vecteurs d'expression, notamment plasmide ou phage, et leurs hôtes cellulaires transformés ou transfectés, utilisés couramment dans les techniques de génie génétique, et qui comportent la séquence nucléotidique codante telle que définie ci-dessus.
Comme indiqué plus haut, les peptides de l'invention sont capables d'induire des anticorps à réactivité croisée entre les membres d'un même groupe.
Ces anticorps sont des produits nouveaux et sont également visés par l'invention.
L'invention vise également un procédé d'obtention des peptides définis ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'on réalise par voie de synthèse un enchaînement d'acides aminés tel qu'ordonné selon la méthode AIP, en fonction de la séquence d'acides aminés d'un antigène cible et d'un paramètre, plus particulièrement un ou les élément(s) périodique(s) caractéristique(s) de l'antigène cible.
Comme paramètre caractéristique, on détermine avec avantage la (ou les) fréquence(s) commune(s) à plusieurs protéines dans le spectre de Fourier. Pour effectuer cette détermination, on procède à l'analyse numérique des séquences d'acides aminés de l'antigène cible en remplaçant chaque acide aminé de la séquence par une valeur numérique appropriée, on effectue la transformation FFT (à enlever de Fourier) de cette suite de valeurs, et on multiplie entre eux les spectres de Fourier, obtenus pour l'antigène cible et des protéines de même groupe ou famillle ou de même activité biologique que celle de l'antigène, ce qui permet de dégager une ou plusieurs fréquences communes, caractéristiques d'un groupe de protéines ou d'une activité biologique donnée.
Comme valeur numérique, on utilise avantageusement une valeur représentant l'assortiment de l'énergie des électrons délocalisés de chaque résidu d'acides aminés, plus spécialement une valeur correspondant au potentiel d' interactions entre les électrons et les ions.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence du peptide recherché est ordonnée en se basant sur la séquence d'une protéine ou d'un fragment de protéine d'un agent viral et en tenant compte de la ou des fréquences caractéristiques de cette protéine ou de son fragment, qui détermine(nt) la reconnaissance immunoréactive.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise, comme référence, la séquence d'un peptide ordonné comme indiqué ci-dessus.
Pour préparer des peptides du groupe A, c'est-à-dire des analogues d' anticorps dirigés contre l'antigène cible, la phase de la ou des fréquences caractéristiques retenues est inversée par rapport à celle de la ou des fréquences de l'antigène cible.
Une nouvelle inversion de phase est effectuée pour préparer les peptides du groupe B analogues de l'image de l'antigène cible, dont les séquences sont ordonnées par rapport à celles des peptides du groupe A.
Grâce à l'invention, il est possible de disposer de peptides analogues d'anticorps idiotypes dirigés contre l'antigène cible, ou encore, de peptides analogues d'anticorps anti-anti-idiotypes, vis-à-vis de l'antigène cible. En variante, l'invention fournit des peptides analogues des images des antigènes cibles, c'est-à-dire des analogues d'anticorps anti-idiotypes.
On notera avec intérêt que cette voie d'obtention des analogues d' anticorps permet d'éviter l'élaboration consécutive d'anticorps idiotypes AC1 et anti-idiotypes AC2, tels qu'évoqués plus haut, et, lors de leurs administrations, les inconvénients relatifs aux immunosuppressions ou à d'autres perturbations immunolσgiques liées aux injections des anticorps.
La synthèse des séquences peptidiques est réalisée avantageusement selon les techniques classiques. Comme évoqué plus haut, ces peptides sont capables d'induire des anticorps à réactivité croisée vis-à-vis des membres d'un même groupe.
Le procédé d'obtention de ces anticorps fait également partie de l'invention. De manière classique, on peut avoir recours à l'immunisation des animaux à l'aide des peptides artificiels définis ci-dessus, puis on récupère les antisérums formés renfermant les anticorps polyclonaux. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus si on le souhaite en utilisant avec avantage la technique de Kôhler et Milstein décrite dans Nature 1975, vol. 256 p 295.
Les fragments d'acides nucléiques de l'invention sont obtenus, avantageusement, de manière classique par voie de synthèse, par exemple en utilisant des synthétiseurs du commerce mettant en jeu la méthode au phosphoramide. Elles peuvent être obtenues également par la méthode d'amplification PCR en utilisant des amorces de séquences et de longueurs appropriées.
Cette technique d'amplification génique est notamment décrite dans les brevets US 4683195 et 4683202.
Les amorces élaborées à partir des fragments nucléotidiques de l'invention sont utilisables pour la synthèse des peptides artificiels définis dans ce qui précède.
A titre illustratif, un tel procédé de synthèse des peptides de l'invention comprend la synthèse chimique de séquences nucléotidiques, ou l'amplification de séquences de nucléotides capables de coder pour un peptide donné par mise en contact de ces séquences avec au moins un couple d'amorces appropriées, suivie de la traduction des séquences ainsi amplifiées en opérant de manière habituelle.
Cette dernière étape est avantageusement réalisée par transformation des cellules hôtes utilisées à l'aide de vecteurs contenant les séquences amplifiées, et récupération des peptides produits dans les cellules hôtes.
L'analyse des peptides et anticorps de l'invention selon les méthodes immunologiques classiques, telles qu'Elisa ou Western blot, a montré leur spécificité élevée dans la bioreconnaissance de molécules de même fréquence et même phase.
L'invention permet ainsi de disposer d'une part de familles de peptides et d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement les anticorps formés contre les protéines d'agents viraux et d'autre part de familles de peptides et d'anticorps capables de reconnaître spécifiquement les protéines des agents viraux.
La première famille comprend des anticorps induits contre des peptides du groupe A, et des peptides du groupe
B, analogues par rapport à l'image interne des protéines d'un agent viral. Cette première famille comprend également les peptides cA qui constituent un sous-groupe des peptides
B.
Les peptides du groupe A contre lesquels sont formés les anticorps sont tels qu'ordonnés selon la méthode
AIP, comme défini ci-dessus, par rapport à la séquence d'une protéine de l'agent viral impliquée dans la pathologie à étudier.
Les fréquences communes qu'ils présentent avec la protéine considérée de l'agent infectieux sont en phase opposée.
Les peptides du groupe B présentent des séquences d'acides aminés telles qu'ordonnées par rapport à celles des peptides du groupe A ci-dessus. Leurs fréquences communes sont en phase avec celle de la protéine de l'agent viral.
Cette première famille est avantageusement utilisable comme réactif pour le diagnostic d'une pathologie en permettant la mise en évidence de la présence d'anticorps, ou de lymphocytes, capables de reconnaître les protéines infectieuses.
Cette méthode de diagnostic in vitro de la présence de tels anticorps ou de lymphocytes est caractérisée par :
- la mise en contact d'un échantillon biologique tel qu'un fluide biologique comme le sérum ou les lymphocytes du sang circulant, ou encore un extrait tissulaire biologique prélevé chez le patient à l'étude, ou l'animal, avec des anticorps induits contre des peptides du groupe A, ou avec des peptides du groupe B comme indiqué ci-dessus, y compris le sous-groupe de peptides cA, et
la mise en évidence d'une réaction du type antigène-anticorps, ou d'une réactivité avec les lymphocytes, entre respectivement les anticorps et les lymphocytes de l'échantillon et les peptides ou anticprps de l'invention.
On remarquera que, dans le cas d'une réaction lymphocytaire au contact avec l'antigène, on met en évidence soit une réactivité des lymphocytes de l'échantillon avec les peptides ou les anticorps utilisés comme réactifs, soit une réactivité des peptides ou des anticorps avec les lymphocytes d'un sujet préalablement immunisé avec les peptides de l'invention. Les lymphocytes ainsi sensibilisés constituent des réactifs. Une telle immunisation est réalisée, par exemple, avec les peptides cA.
Les anticorps ou peptides artificiels sont libres ou fixés sur un support non immunogène lors de 1 ' étape de mise en contact.
Pour révéler le complexe, éventuellement formé, ou la réactivité des lymphocytes, on a recours à une méthode utilisée de manière classique en immunologie telle que l'immunofluorescence, Elisa, Western Blot, ou encore la stimulation lymphocytaire, et éventuellement le test de la présence de CTL ("cytotoxic T lymphocytes").
La détection d'une interaction sélective entre les anticorps de l'échantillon et les peptides artificiels ou anticorps induits utilisés, ou encore la réactivité des lymphocytes, est significative de l'existence de la pathologie.
Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité, et rapidement, la présence, dans un échantillon biologique, des anticorps formés contre les protéines exprimées par un agent viral.
Elle permet également la mise en évidence de la présence d'anticorps auto-immuns, formés contre des séquences antigéniques du soi, et de lymphocytes autoimmuns. La deuxième famille évoquée plus haut, comprend des peptides du groupe A y compris les peptides cB, et des anticorps ou des lymphocytes induits contre des peptides du groupe B, les séquences de ces peptides et leurs fréquences étant telles que définies ci-dessus.
Cette famille est avantageusement utilisable pour détecter la présence de protéines d'un agent viral.
La méthode de l'invention de diagnostic in vitro d'une pathologie virale chez l'homme ou l'animal est caractérisée par :
- la mise en contact d'un échantillon biologique tel qu'un fluide biologique comme le sérum ou les lymphocytes du sang circulant, ou encore un extrait tissulaire biologique prélevé chez le patient à l'étude, ou l'animal, avec des anticorps ou des lymphocytes induits contre des peptides du groupe B, ou avec des peptides du groupe A, tels que définis plus haut, y compris le sousgroupe de peptides cB et
- la mise en évidence d'une réaction de type antigène-anticorps ou d'une réactivité lymphocytaire entre les protéines de l'agent viral présentes dans l'échantillon et les anticorps ou peptides, ou les lymphocytes utilisés comme réactifs.
Avantageusement, on met en contact lesdits anticorps ou lesdits peptides artificiels avec les antigènes de l' agent infectieux fixés à un support et on provoque une inhibition de la réaction par compétition en ajoutant l'échantillon biologique à tester, lorsqu'il renferme les protéines de l'agent viral.
Pour révéler le complexe éventuellement formé ou la réactivité des lymphocytes, on a recours à l'une des méthodes courantes pour la détection d'anticorps, ou la révélation de la présence d'antigène(s) stimulant les lymphocytes de l'animal immunisé contre les peptides du groupe B.
La détection d'une interaction sélective entre les protéines de l'échantillon et les anticorps induits (ou des lymphocytes test) ou les peptides artificiels utilisés est significative de l'existence de la pathologie. Les protéines exprimées par un agent viral, peuvent être ainsi aisément détectées et notamment localisées et quantifiées par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique.
L ' invention vise également des kits pour le diagnostic in vitro de pathologies virales chez l'homme ou l'animal.
A titre d'exemple, un kit de diagnostic selon l'invention comporte
- des anticorps induits contre des peptides artificiels du groupe A ou des peptides artificiels du groupe B ou bien des peptides artificiels du groupe A et des anticorps induits contre des peptides artificiels du groupe B, tels que définis ci-dessus, avantageusement immobilisés sur un support, le cas échéant en mélange afin de détecter plusieurs infections,
- des réactifs appropriés à la réalisation de la réaction immunologique entre lesdits anticorps induits ou peptides artificiels et respectivement les anticorps formés contre ces protéines et les protéines antigéniques, et à sa mise en évidence, et le cas échéant,
- un milieu biologique de référence à titre de contrôle.
En vue de détecter une réactivité lymphocytaire, le kit de l'invention comprendra avantageusement des lymphocytes, par exemple sous forme congelée, de l'animal immunisé contre des peptides donnés.
Les anticorps et peptides utilisés sont immobilisés de manière classique sur des billes, par exemple des billes de latex, des plaques de microtitration ou encore des bandelettes.
L'invention concerne en outre l'application des peptides définis ci-dessus pour l'élaboration de compositions immunogènes.
Des compositions immunogènes préférées comprennent au moins un peptide du groupe A dont la ou les fréquences caractéristiques dans le spectre de Fourier sont en phase opposée avec celle(s) de la séquence antigenique responsable de la pathologie auto-immune. La séquence d'acides aminés de ces peptides du groupe A est telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par référence à celle de l'antigène à traiter.
Il s'agit de peptides capables d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser les anticorps autoimmuns et de détruire les lymphocytes auto-immuns.
D'autres compositions immunogènes préférées sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide du groupe B, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour la constitution de vaccins. Conformément à des techniques classiques, le peptide immunogène peut-être exprimé également par des séquences de nucléotides correspondantes incorporées dans un agent infectieux dont l'innocuité a été au préalable établie, tel qu'un virus recombinant comme ceux élaborés à partir de virus de la famille des poxvirus. Un virus de ce type largement utilisé est constitué par la vaccine, mise en oeuvre sous forme vivante, atténuée ou tuée.
La composition immunogène est administrée en une quantité et selon un protocole permettant de conférer à l'hôte une immunité à l'égard des antigènes de l'agent infectieux.
Une telle composition est utilisable pour l'élaboration de vaccins capables d'induire des lymphocytes sensibilisés et des anticorps dirigés contre l'agent infectieux.
Des compositions particulièrement visées comprennent un peptide du groupe B tel qu'ordonné selon la méthode AIP par rapport à un peptide du groupe A lui-même, ordonné par rapport aux protéines d'un virus, plus particulièrement par rapport à celles d ' un rétrovirus , notamment de HIV.
Comme indiqué plus haut, ce groupe comprend les peptides cA.
Selon un aspect de grand intérêt, un seul peptide s'avère capable d'induire des anticorps qui reconnaissent toutes les protéines de l'agent viral qui expriment un élément périodique significatif en commun. Une telle composition immunogène vis-à-vis de HIV est dosée en peptide antigenique de manière à permettre l'administration d'une dose de 10 à 100 μg/kg.
Les lymphocytes sensibilisés par les peptides artificiels du groupe B, analogues de l'image de la protéine cible, correspondent à la catégorie de lymphocytes immuns porteurs de récepteurs impliqués dans la destruction de l'agent infectieux ou la cellule infectée par celui-ci, grâce à la capacité de ses récepteurs à reconnaître l'antigène. Dans ce cas, l'activité des CTL ( "Cytotoxic T Lymphocytes") ou d'autres types de lymphocytes ne requérant pas la médiation des anticorps, sensibilisés avec l' antiidiotype, n'est pas assujettie au contrôle restrictif de l'identité génétique de CMH, et par conséquent ne devrait pas représenter d'obstacles à la destruction de cellules cibles infectées, ou de l' agent infectieux ( 2 ) .
Par ailleurs, les anticorps induits par le peptide analogue de l'image interne peuvent aussi bien intervenir dans la fonction du complément que dans l'activité appelée ADCC ( "Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity") des lymphocytes cytotoxiques (lymphocytes K) détruisant les cellules portant à leurs surfaces les anticorps captés par les antigènes. Contrairement à la réponse immunitaire à médiation cellulaire, les lymphocytes K n'ont aucune spécificité vis-à-vis de l'antigène, mais ils possèdent un récepteur pour le fragment Fc des IgG et leur activité lytique ne requiert pas le complément.
Les peptides de l'invention et les anticorps contre ces peptides sont également utilisables en thérapeutique, en particulier comme vecteurs de drogues ou d ' antigènes. Dans le cas d' antigènes couplés aux peptides de l'invention, n'importe quel antigène bactérien ou viral peut être utilisé, pour autant que l'organisme soit immunisé (ou vacciné) au préalable contre celui-ci (p. ex. le toxoïde de la diphtérie, la polio etc.).
Les vecteurs doivent être conçus par rapport aux domaines moléculaires des protéines cibles (des antigènes viraux) qui n'interagissent pas avec les éléments cellulaires dans le processus de la reconnaissance virus/cellule.
Cette disposition est indispensable pour éviter l'induction par le vecteur d'anticorps qui pourraient reconnaître les structures cellulaires avec lesquelles interagit la protéine cible.
L'invention vise l'utilisation des peptides de type A comme vecteurs de drogue et des peptides de type B comme inducteurs des anticorps ou des lymphocytes cytotoxiques pouvant intercepter les anticorps/lymphocytes dirigés contre le CD4.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, les figures la à If représentant les spectres de Fourier de protéines de HIV, les figures 2a à 2d ceux de peptides artificiels de l'invention, les figures 3a à 3e ceux de protéines de FLV, la figure 4, la carte de restriction du plasmide pGEX-2, et la figure 5, une photo d'un immunoblot illustrant la réaction de protéines de HIV-1 avec des (un) anticorps dirigés contre un peptide artificiel de l'invention.
Exemple 1
ANALYSE DES PROTEINES D'UN AGENT VIRAL PAR LA METHODE AIP
. Etablissement d'une série numérique.
Selon la méthode AIP, on calcule le potentiel apparent, ou pseudopotentiel, de chacun des acides aminés d'une séquence protéique donnée d'après la formule générale suivante (4) :
W = 0.25Z*sin(1,04πZ*)/2π, (1) où Z* représente la moyenne du nombre de quasivalences déterminée par
Figure imgf000026_0001
où Zi représente le nombre d'électrons de valences du ième atome de la molécule et N le nombre total d'atomes dans la molécule.
Les valeurs de PIEI ( 5 ) ainsi calculées pour les 20 acides aminés naturels sont représentées sur le TABLEAU I. La valeur attribuée à un acide aminé reste inchangée quelle que soit sa position dans la séquence d'une protéine.
TABLEAU I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Acide aminé PIEI (Ry*)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Leu (L) 0,0000
Ile (I ) 0,0000
Asn (N) 0,0036
Gly (G ) 0,0050
Val (V) 0,0057
Glu (E ) 0,0058
Pro (P ) 0,0198
His ( H ) 0,0242
Lys (K) 0,0371
Ala (A ) 0,0373
Tyr (Y ) 0,0516
Trp (W) 0,0548
Gln ( Q ) 0,0761
Met (M) 0,0823
Ser (S) 0,0829
Cys (C) 0,0829
Thr (T) 0,0941
Phe (F) 0,0946
Arg (R) 0,0959
Asp (D) 0,1263
*Ry* = unité Rydberg . Transformation de Fourier
La transformation de Fourier est effectuée comme suit :
Figure imgf000028_0001
où x(m) est le même membre de la série numérique analysée, N est le nombre total de points de la série et X (n) est le nème coefficient de la tranformation de Fourier (6).
La série numérique utilisée pour la transformation de Fourier représente donc des signaux "déterminants" discrets de longueur finie. Les valeurs absolues des coefficients de la transformation de Fourier définissent l'amplitude du spectre, alors que leurs phases définissent le spectre de phase comme suit :
X(n)=|X(n)|e-jՓ(n) n=1,2...N/2 (4)
Ainsi, l'information complète de la séquence originale est contenue dans les deux fonctions spectrales.
Toutefois, dans le cas de la séquence d'une protéine l'information peut être contenue seulement dans l'une de ces deux fonctions spectrales. Dans ce cas il est plus pratique d'analyser la densité énergétique du spectre nommé spectre informationnel et qui est définie comme suit:
S(n) = X(n)X*(n) = |X(n)|2 n=1,2......N/2 (5) Les séquences analysées en tant que signaux discrets sont assumées aux points équidistants d'une distance d=1, ce qui amène à considérer que la fréquence maximum est F=l/2d=0.5. L'étendue de la fréquence est indépendante du nombre de points dans la séquence ; celui-ci n'a d'influence que sur la résolution du spectre. A un point
N de la séquence la résolution r est égale à 1/N (6) et le nème point d'une fonction spectrale correspond à une fréquence fn=n/N. Le nombre minimum de points requis pour une analyse est déterminé suivant la résolution souhaitée du spectre (c'est-à-dire suivant le nombre de pics à mettre en évidence).
. Multiplication des spectres
La mise en évidence de périodes caractéristiques communes pour deux ou plusieurs protéines ayant une fonction similaire s'effectue par la multiplication mutuelle de leurs spectres de Fourier (produit de convolution) afin de dégager une fonction spectrale dite croisée. Cette fonction spectrale croisée qui fait apparaître une fréquence commune aux deux signaux est définie comme suit :
S(n) = X(n)Y*(n) n=1,2....... N/2 (6)
où X(n) représente les coefficients de la transformation de Fourier de la série x(m) alors que Y(n)* représente les coefficients complexes conjugués de la transformation de Fourier de la série y(m). La délimitation de pics, dans le spectre croisé, pour certaine(s) fréquence(s) définit la fréquence commune aux deux composés. Par ailleurs, une fonction spectrale croisée multiple est obtenue à partir d'un groupe de séquences comme suit :
M(n) = X1(n).X2(n) ......XM(m) n=1,2..... N/2 (7) Exemple 2 :
Application de la méthode de l'exemple 1 à l'analyse de protéines de HIV :
Les procédures d'algorithmes sont appliquées aux séquences de la gp160 (ENV) de HIV, de la p55 (GAG) de HIV, d'un fragment de 44 acides aminés de la gp120 impliqué dans la reconnaissance du CD4 (7) et à la protéine CD4 murine et humaine.
Selon la méthode de l'exemple 1, la procédure d'analyse comprend les étapes suivantes :
1) chaque séquence d'acides aminés est transformée en une série numérique correspondante en représentant chaque acide aminé avec la valeur correspondante du potentiel d'interaction ion-électron ;
2) cette série numérique est transformée en un spectre numérique en utilisant la FFT ;
3) les spectres sont mutuellement comparés en utilisant l'analyse spectrale croisée afin d'extraire les composants ayant une fréquence commune ;
4) l'analyse multiple de spectres croisés est appliquée à chaque groupe de séquences de protéines [gp120 (ENV), p55 (GAG), fragment de 44 acides aminés de la gp120] pour extraire les composants de fréquence caractéristique commune pour la bioreconnaissance de CD4 par la protéine gp120.
Une fois la fréquence caractéristique spectrale de Fourier identifiée pour la famille de protéines de HIV-1, on peut prédire, par une procédure inverse, les acides aminés spécifiques dans la séquence particulière qui contribuent de manière prédominante à cette fréquence et qui apparaissent cruciaux pour le modèle de protéine étudié.
Une fois déterminées les fréquences de Fourier caractéristiques des protéines de HIV-1 et du fragment de la gp120 reconnaissant le CD4, il est également possible en utilisant des méthodes analogues d'identifier de nombreux peptides analogues qui possèdent les mêmes caractéristiques spectrales désirées. Ces peptides sont élaborés de novo ou comme fragments apparentés aux protéines du variant HIV-1 bru.
Avec les peptides conçus de novo, des critères rigoureux sont employés pour s'assurer que chacun des peptides de novo possède la (ou les) fréquence(s) et phase caractéristique(s) de Fourier.
Les procédures et critères pour l'élaboration de ces peptides impliquent les étapes suivantes :
5) la détermination des fréquences caractéristiques pour le groupe analysé des protéines de HIV-1 comme décrit ci-dessus dans les étapes 1-4 ;
6) la définition des phases aux fréquences caractéristiques pour l'isolât de la gp120 de HIV-1 bru, choisi comme protéine pour l'élaboration du peptide ;
7) la dérivation d'une nouvelle séquence numérique à partir de la connaissance de ces fréquences et phases caractéristiques en utilisant les procédures inverses discrètes de transformation de Fourier ;
8) la détermination de l'acide aminé correspondant à chaque élément de cette nouvelle séquence numérique à partir des valeurs PIEI (voir tableau 1).
Les peptides obtenus de cette façon ont les mêmes caractéristiques spectrales que ceux associés à la bioreσonnaissance de la gp160/120 et du CD4 et peuvent être proposés pour présenter un jeu similaire propriétés-motifs fonctionnels. Par exemple, les anticorps polyclonaux (ou monoclonaux) générés contre ces analogues de peptides synthétiques devraient être capables de réactions croisées avec la région en surface de la molécule de la gp160/120 responsable de la liaison à CD4.
On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les séquences en acides aminés des glycoprotéines d'enveloppe gp160/120 et, celles codées par le gène GAG p55.
L'analyse des spectres croisés de glycoprotéines gp160 obtenues à partir de différents isolats de HIV-1 a permis de dégager une fréquence caractéristique commune dans leurs spectres de Fourier. Ainsi, comme le montre l'examen de la figure la, les spectres croisés de la gp160 provenant de 21 isolats de
HIV permettent de détecter une fréquence commune
f1 = 0,1855.
La même fréquence constitue la caractéristique spectrale majeure pour les protéines p55 du gène GAG de 11 isolats de HIV-1 ( figure 1b).
On distingue également cette fréquence f1 comme signal moyen dans le spectre des protéines gp160 et p55 d'isolats tels que LAVbru comme le montre les figures le et
1d.
Cette fréquence caractéristique f1 apparaît également dans le fragment de la gp 120 correspondant aux acides aminés 418 à 461 (numérotation selon Neosystem Laboratoire-1990, HIV-peptides, SlV-peptides) responsable de la fixation au CD4 (7) de différents isolats de HIV et de l'isolât LAVbru. On note en outre une fréquence f2 = 0,2188 ainsi qu'il apparaît respectivement sur les figures le (8 isolats de HIV) et lf (isolât LAVbru).
L'analyse des spectres croisés de la séquence complète de la gp120, de même que celle de la gp160, montre la fréquence caractéristique f1 mais la fréquence f2 n'apparaît pas présenter notablement l'amplitude caractéristique.
Exemple 3 :
Elaboration de peptides artificiels de type A et de type B par référence à un fragment de la gp160/120.
On rapporte ci-après des exemples d'élaboration de séquences peptidiques de 20 acides aminés, en se basant sur un fragment de 44 acides aminés de la gp160/120, provenant d'un isolât de HIV-1, à savoir le clone nl43 LAVbru, qui présente les fréquences caractéristiques f1 et f2 dans les spectres AIP (voir figure 1f).
Ce fragment répond à la séquence S d'acides aminés suivante (7) :
S = TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTR
. Elaboration de peptides du groupe A. - peptide A1 :
En se basant sur la séquence S du fragment ci-dessus, mais en inversant les phases des fréquences f1 et f2, on a ordonné la séquence du peptide A1 en suivant la méthode AIP de l'exemple 1. La séquence élaborée répond à l'enchaînement suivant :
Séquence A1 = KQQYYWYAWCQPPQDQLIMD
Le spectre de Fourier de ce peptide A1 est représenté sur la figure 2a.
- peptide A2 :
De la même manière, la séquence du peptide A2 a été ordonnée en inversant la phase de la fréquence f1, mais sans tenir compte dans ce cas de la fréquence f2, ce peptide n'étant établi, en ce qui concerne les fréquences, que par rapport à f1.
Le spectre de Fourier du peptide A2 est représenté sur la figure 2b.
Son enchaînement d'acides aminés est le suivant : Séquence A2 = LKRDQEPMDFHIWDDYLKRD
On notera que A1 et A2 ne présentent aucune homologie au niveau de leur séquence, bien qu'ils présentent la fréquence f1 en commun.
. Elaboration de peptides du groupe B
- peptide B1
Ce peptide a été élaboré de manière à présenter les mêmes fréquences f1 et f2 que le peptide A1 mais avec des phases opposées à ces fréquences, et donc de même phases que les fréquences f1 et f2 du fragment de la séquence S.
Le spectre AIP du peptide B1 est représenté sur la figure 2c.
Sa séquence répond à l'enchaînement suivant :
Séquence B1 = DDALYDDKNWDRAPQRCYYQ
On remarquera qu'elle ne présente aucune homologie avec les peptides A1 ou A2.
- peptide B2 :
Ce peptide a été élaboré par analogie avec les peptides A1 et A2, et présente une fréquence unique f1, en phase opposée à celle de A1 et de A2. Le spectre AIP du peptide B2 est représenté sur la figure 2d. Ce peptide, qui répond à l'enchaînement
Séquence B2 = DFHIWDDYLKRDQEPMDFHI
présente la même phase que le peptide B1 à la fréquence caractéristique f1.
Exemple 4 : Synthèse des peptides artificiels de l'exemple 3.
Les résines de peptides protégés ont été synthétisées par la méthode de synthèse de peptide multiple développée par HOUGHTEN (8) en utilisant une résine de pmêthyl-benzhydrylamine (100 à 200 mesh, 0,4 à 0,8 meq/g), et les acides aminés N-α-t-butoxy carbonyl (t-boc) tels que ceux commercialisés par Bachem inc (Torrence, CA).
Les peptides ont été séparés de la résine selon le procédé habituel au fluorure d'hydrogène et à l' anisole (9). Après la synthèse, la pureté des peptides a été évaluée par HPLC en phase inverse sur colonne de PepRPC HR5 (Pharmacia).
Les chromatogrammes ont été développés avec un gradient de 0,1 % de CF3COOH/H2O et 0,1 % de CF3COOH/CH3 CN
(v/v). Les peptides représentent environ 85 % du matériau absorbant à DO214. Les séquences peptidiques ont été contrôlées.
Exemple 5 :
Application de la méthode de l'exemple 1 à l'analyse du virus de la leucémie féline rétrovirale (Féline Leukemia Virus ou FLV).
Les résultats obtenus à partir des analyses de séquences d'acides aminés des glycoprotéines de la polyprotéine d'enveloppe de FLV obtenues à partir de différents isolats, à savoir les glycoprotéines appelées knob, knob gp70, les protéines appelées spike (spike p15), et la protéine de FLV récepteur des cellules T, ont permis de déterminer les fréquences caractéristiques à partir des spectres de Fourier. Ces résultats sont représentés sur les figures 3a à 3f.
On constate que la spike p15 (5 isolats) présente une fréquence caractéristique f2 = 0,0137 (fig. 3a), alors que la fréquence caractéristique prédominante de knob gp70 (6 isolats) est f = 0,4434 (fig. 3b), et la fréquence caractéristique prédominante de la polyprotéine d'enveloppe de FLV (5 isolats) est f = 0,0303 (fig. 3c).
En accord avec le concept qu 'une augmentation de l'amplitude de la fréquence caractéristique commune à la polyprotéine rétrovirale et à son récepteur ressort de manière évidente des spectres croisés multiples, une fréquence caractéristique prédominante f = 0,1289 est observée pour la polyprotéine d' enveloppe de FLV ( 5 isolats), le fragment ENV (3 isolats), et le récepteur des cellules T (figure 3d), une fréquence caractéristique prédominante f2 = 0,0137 pour la protéine spike p15 (5 isolats) et la protéine récepteur des cellules T (fig. 3e), et une fréquence caractéristique prédominante f = 0,1289 pour la protéine knob gp70 ( 6 isolats) et la protéine récepteur des cellules T (figure 3f).
Elaboration de peptides immunologiquement apparentés aux protéines d'enveloppe de FLV, knob-gp70 et spike p15 :
Le peptide FLV-kn20 correspond, du point de vue des caractéristiques de motifs, au peptide knob-gp70. En d'autres termes, on a trouvé qu'il correspondait à un peptide de 20 acides aminés du type du knob gp70 avec la séquence :
KDLRWHDIRW10 HDIRWHDNRQ20
On retrouve la même fréquence (f1 = 0,3984) et la même phase que pour la knob-gp70, associées à la reconnaissance de la spike p15.
Le peptide FLV-knob20 correspond à un peptide de
20 acides aminés du type anti-knob gp70 et présente la séquence :
RNDHWRIDKW10 RIDKWDLDKY20
Sa fréquence est la même que celle observée avec knob gp70, (f1 = 0,3984), mais en phase inverse avec knob gp70.
Le peptide FLV-sp73 correspond, pour les caractéristiques de ces motifs, à la spike p15 ; il s'agit d'un peptide de 73 acides aminés du type de la spike p15, présentant la séquence :
PPPEEGNNII10 LIINNEEEPP20 HHKKAYYWWQ30 QQCTTRRRRD40
DDDDDDDDD50 DDDDDDRRRR60 TCMQQQWWYYA70 KHH
Ce peptide est en phase avec la spike p15 et possède la même fréquence (f2 = 0,0137).
On notera que la longueur de la séquence est une conséquence directe de la faible valeur de la fréquence.
Le polypeptide FLV-spop50 est en phase inverse avec la spike 15. Il s'agit d'un peptide de 50 acides aminés du type anti-spike p15, présentant la séquence RRRDDDDDDD10 DDDDDDDDDR20 RRRTCMQQQW30 WYYAKHHPPP40
EEGNIIILII50
Sa fréquence est la même que celle de la protéine spike 15 (f2 = 0,0137), mais en phase inverse avec cette protéine. Dans ce cas également, la longueur de la séquence entraîne une faible valeur de la fréquence.
Le peptide FLV-spkn90 est un peptide de 90 acides aminés du type de la protéine spike p15 et de la protéine knob gp70.
Sa séquence est la suivante :
AMPQKHQGWK10 PWIYKEWGWA20 PQPQWKTKMQ30 YRYRTWDWRR40
QDQRRQDWFF50 WRYQMKTKWW60 PQPAYEWEKY70 IWEAYGQPKW80
PMKWMKRWQR90
Ce peptide est en phase avec spike p15 et knob gp70, et possède les mêmes fréquences (f1 = 0,3984 et f2 = 0,0137).
Le peptide FLV-spknop50 est un peptide de 50 acides aminés dont les caractéristiques correspondent à un peptide du type anti-spike 15 et anti-knob gp70. Ce peptide présente la séquence suivante :
FWDWTRWDQR10 DQDQRDWDQT20 RWDWQRARYW30 CHCAYQPQHK40
WGWHHWLWPH50.
Il possède les mêmes fréquences que spike p15 et knob gp70, mais ces fréquences sont en phase inverse de celle de ces deux protéines.
Exemple 6 : Fragments nucléotidiques capables de coder pour des peptides artificiels apparentés aux protéines de HIV et expression de ces peptides.
. Séquences portant l'information codante pour les peptides A1 et B1 :
En opérant selon les techniques classiques, on synthétise les séquences de nucléotides déduites des séquences peptidiques.
Les extrémités cohésives qui encadrent la séquence codante sont choisies de manière à comporter les sites de restriction pour BamH1 (extrémité 5' d'un brin et 3' du brin complémentaire) et EcoR1 (extrémités 3' et 5' respectivement de chaque brin) à savoir :
BamH I EcoR I
I I
5 ' G G A T C C A T G . . . - - - - - - - - - - - - . . . T A G A A T T C 3 '
3 ' C C T A G G T A C . . . - - - - - - - - - - - - . . . A T C T T A A G 5 '
I I Les fragments de nucléotides obtenus sont indiqués ci-dessous avec mention de leur brin complémentaire et de la séquence peptidique codée. Les codons sélectionnés sont parmi ceux le plus fréquemment utilisés dans le cas de gènes hautement exprimés chez E. coli (19). Plusieurs codons étant capables de coder pour un même acide aminé, les séquences nucléotidiques déduites des peptides A1 et B1 peuvent correspondre respectivement aux enchaînements suivants. Peptide A1
K Q Q Y Y W Y A W C Q P P Q D Q L I M D
lys gln gln tyr tyr trp tyr ala trp cys gln pro pro gln asp gln leu ile met asp
5'(+) GA TCC ATG AAA CAG CAG TAC TAC TGG TAC GCT TGG TGC CAG CCG CCG CAG GAC CAG CTG ATT ATG GAC TAG 3'
[AAG CAA CAA TAT TAT TGG TAT GCG TGG TGT CAA CCA CCA CAA GAT CAA CTC ATC ATG GAT]
cA1> 3'(-) G TAC TTT GTC GTC ATG ATG ACC ATG CGA ACC ACG GTC GGC GGC GTC CTG GTC GAC TAA TAC CTG ATC TTA A 5'
K Q Q Y Y W Y A W C Q P P Q D Q L I M D
lys gln gln tyr tyr trp tyr ala trp cys gln pro pro gln asp gln leu ile met asp
5' (+ ) GA TCC ATG AAG CAA CAA TAT TAT TGG TAT GCG TGG TGT CAA CCA CCA CAA GAT CAA CTC ATC ATG GAT TAG 3' cA11> 3' (-) G TAC TTC GTT GTT ATA ATA ACC ATA CGC ACC ACA GTT GGT GGT GÎT CTA GTT GAG TAG TAC CTA ATC TTA A 5' Peptide B1
D D A L Y D D K N W D R A P Q R C Y Y Q
asp asp ala leu tyr asp asp lys asn trp asp arg ala pro gln arg cys tyr tyr gln
5' (+) GA TCC ATG GAC GAC GCT CTG TAC GAC GAC AAA AAC TGG GAC CGT GCT CCG CAG CGT TGC TAC TAC CAG TAG 3'
[GAT GAT GCG CTC TAT GAT GAT AAG AAT TGG GAT CGC GCG CCA CAA CGC TGT TAT TAT CAA]
cB1> 3' (-) G TAC CTG CTG CGA GAC ATG CTG CTG TTG ACC CTG GCA CGA GGC GTC GCA ACG ATG ATG GTC ATC TTA A 5'
D D A L Y D D K N W D R A P Q R C Y Y Q
asp asp ala leu tyr asp asp lys asn trp asp arg ala pro gln arg cys tyr tyr gln
5' (+) GA TCC ATG GAT GAT GCG CTC TAT GAI GAT AAG AAT TGG GAT CGC GCG CCA CAA CGC TGT TAT TAT CAA TAG 3' cB11> 3' (-) G TAC CTA CTA CGC GAG ATA CTA CTA TTC TTA ACC CTA GCG CGC GGT GTT GCG ACA ATA ATA GTT ATC TTA A 5'
On remarquera que la chaîne "+" représente l'ARN messager lorsqu'on remplace la base T par la base U. In vivo, l'ARN messager est le résultat de la transcription de la chaîne "-" (l'ARN complémentaire de la chaîne "-").
On représente ci-après les séquences nucléotidiques complémentaires, utilisées en tant que séquences codantes, et leurs séquences peptidiques correspondantes cA1, cA11, cB1 et cB11.
Peptide cA1
V H N Q L V L R R L A P S V P V V L L F
val his asn gln leu val leu arg arg leu ala pro ser val pro val val leu leu phe
5'(t) GA TCC ATG GTC CAT AAT CAG CTG GTC CTG CGG CGG CTG GCA CCA AGC GTA CCA GTA GTA CTG CTG ITT TAG 3'
[GTT CAC AAC CAA CTC GTT CTC CGT CGT CTC GCT CCG TCT GTT CCG GTT GTT CTC CTT TTC]
3'(-) G TAC CAG GTA TTA GTC GAC CAG GAC GCC GCC GAC CGT GGT TCG CAT GGT CAT CAT GAC GAC AAA ATC TTA A 5' Peptide cA11
I H D E L I L W W L T P R I P I I L L L
ile his asp glu leu ile leu trp trp leu thr pro arg ile pro ile ile leu leu leu 5'(+) GA TCC ATG ATC CAT GAT GAG TTG ATC TTG TGG TGG TTG ACA CCA CGC ATA CCA ATA ATA TTG TTG CTT TAG 3'
[ATT CAC GAC GAA CTG ATT CTG TGG TGG CTG ACC CCG CGT ATC CCG ATC ATC CTG CTG CTG] 3' (-) G TAC TAG GTA CTA CTC AAC TAG AAC ACC ACC AAC TGT GGT GCG TAT GGT TAT TAT AAC AAC GAA ATC TTA A 5'
Peptide cB1
L V V A T L R S T V P V F 7 V V Q S V V leu val val ala thr leu arg ser thr val pro val phe val val val gln ser val val
5'(+) GA TCC ATG CTG GTA GTA GCA ACG CTG CGG AGC ACG GTC CCA GTT ITT GTC GTC GTA CAG AGC GTC GTC TAG 3'
[CTC GTT GTT GCT ACT CTC CGT TCT ACT GTT CCG GTA TTC GTT GTT GTT CAA TCT GTT GTT]
3'(-) G TAC GAC CAT CAT CGT TGC GAC GCC TCG TGC CAG GGT CM AAA CAG CAG CAT GTC TCG CAG CAG ATC TTA A 5'
Peptide cB11
L I I T A L W R A I P I L I I I E R I I
leu ile ile thr ala leu trp arg ala ile pro ile leu ile ile ile glu arg ile ile 5'(+) GA TCC ATG TTG ATA ATA ACA GCG TTG TGG CGC GCG ATC CCA ATT CTT ATC ATC ATA GAG CGC ATC ATC TAG 3'
[CTG ATC ATC ACC GCT CTG TGG CGT GCT ATT CCG ATC CTG ATT ATT ATC GAA CGT ATT ATT]
3' (-) G TAC AAC TAT TAT TGT CGC AAC ACC GCG CGC TAG GGT TAA GAA TAG TAG TAT CTC GCG TAG TAG ATC TTA A 5'
Les séquences des peptides A11 et B11, illustrées ci-après, ont été déduites à partir des chaînes complémentaires de celles pouvant coder pour les peptides cA1 et cB1 (indiquées entre paranthèses ci-dessus).
Peptide A11
5' A ATT CTA GTT CAC MC CAA CTC GTT CTC CGT CGT CTC GCT CCG TCT GTT CCG GTT GTT CTC CTT TTC CAT G 3' 3' GAT CAA GTG TTG GTT GAG CAA GAG GCA GCA GAG CGA GGC AGA CAA GGC CAA CAA GAG GAA AAG GTA CCT AG 5'
asn val val leu glu asn glu thr thr glu ser arg arg asn arg asn asn glu lys glu UH2 N V V L E N E T T E S R R N R N N E K E
Peptide B11
5' A ATT CTA CTC GTT GTT GCT ACT CTC CGT TCT ACT GTT CCG GTA TTC GTT GTT GTT CAA TCT GTT GTT CAT G 3'3' GAT GAG CAA CAA CGA TGA GAG GCA AGA TGA CAA GGC CAT AAG CAA CAA CAA GTT AGA CAA CAA GTA CCT AG 5'
COOH glu asn asn ser ser glu thr arg ser asn arg tyr glu asn asn asn leu arg asn asn NH2
E N N S S E T R S N R Y E N N N L R N N
Ces fragments de nucléotides sont insérés dans le plasmide pGEX-2T dont la carte de restriction est représentée sur la figure 3, en utilisant le système de fusion de gène GST de Pharmacia (Uppsala, Suède).
Ce système comporte un promoteur tac, un gène interne lac i7 et des sites de clivage par la thrombine.
Le peptide exprimé est fusionné à l'extrémité carboxyle de la glutathione S-transférase de Schistosoma japonicum et purifié à partir de lysats bactériens par chromatographie d'affinité en utilisant une colonne de glutathione Sépharose 4B R
Exemple 7 : Etude des propriétés immunologiques des pairs de peptides artificiels.
- Induction d'anticorps à l'aide des peptides de L'exemple 3.
On immunise des lapins âgés de deux mois (Nouvelle- Zélande) à l'aide de peptides obtenus comme décrit ci-dessus. On injecte aux lapins au jour zéro 100 μg de peptide dans l'adjuvant complet de Freund. Ensuite, on administre tous les 10 jours à chaque lapin encore 100 μg de peptide dans l'adjuvant incomplet de Freund, avec un total de 6 inoculations au moins.
Les sérums sont testés 3 jours après la dernière inoculation selon l'essai ELISA pour déterminer la présence d'anticorps contre le peptide inoculé. Les titres des sérums sont exprimés en logarithmes de la dilution la plus élevée pour laquelle le sérum montre une réactivité significative pour un antigène.
- ETUDE DES REACTIVITES CROISEES DES ANTICORPS
DANS LE TEST ELISA :
On recouvre des plaques de microtitrage standards à 96 puits avec les différents peptides synthétiques à étudier.
On utilise 100 μl par puits d'une solution de peptide à 1 μg/ml dans une solution de PBS ( solution saline tamponnée à l'aide de phosphate), de pH 7,4.
Les sites de liaison non occupés sont bloqués durant 14 h environ à 4ºC avec une solution à 1 % (p/v) d'albumine de sérum bovin (BSA) dans un tampon phosphate de pH 7,4. Les plaques sont ensuite lavées intensément.
Les sérums de lapins immunisés et de lapins non immunisés sont ajoutés dans les puits après dilution dans une solution de PBS 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, BSA 1 % et Tween 20 0,1 %, puis les plaques sont incubées pendant 1 h à
37°C.
Après plusieurs lavages, on ajoute un anti-sérum d'IgG de chèvre anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort (dilué à 1/1000), puis les plaques sont incubées encore 1 h à 37°C.
L'activité enzymatique est déterminée en utilisant de l'o-phénylène-diamine comme substrat. L'absorbance est mesurée à 492 nm. On rapporte dans le tableau 2 suivant les résultats obtenus : TABLEAU 2
Anti-A1 Anti-A2 Anti-B1 Anti-B2
A1 5,1 3,3 2,4 0,9
A2 3,6 5,1 2,1 2,7
B1 0 0 3,6 2,4
B2 0,9 3,6 3,9 5,4
gp120 1,5 1,2 5,4 1,8
Les valeurs représentent les logarithmes des dilutions les plus élevées pour lesquelles le sérum montre une réactivité significative.
L'examen de ces résultats montre que les animaux immunisés avec le peptide A1 génèrent des anticorps polyclonaux qui donnent lieu à une réaction croisée avec le peptide A2 et qu'à l'inverse les animaux immunisés avec le peptide A2 produisent des anticorps qui réagissent de manière croisée avec le peptide A1.
Ces résultats démontrent la réactivité croisée des sérums anti-A1 et anti-A2 dirigés respectivement contre les peptides A1 et A2, qui ne sont pas homologues du point de vue de leur structure, mais possèdent la fréquence f1 en commun et sont de même phase.
La reconnaissance croisée des sérums anti-A1 et anti-A2 avec respectivement les peptides A2 et A1 apparaît donc bien associée au composant fréquence f1.
Les peptides A1 et A2, ne sont que faiblement reconnus par les anticorps polyclonaux anti-B1 de lapin dans le test ELISA.
Le peptide B2 qui présente la même phase que le peptide B1 à la fréquence caractéristique f1 = 0,1855, réagit de manière croisée avec le sérum anti-Bl, et, de leur côté, les anticorps polyclonaux du sérum dirigé contre le peptide B2 reconnaissent le peptide B1 et forment un complexe du type antigène-anticorps. Ainsi, la spécificité de la réactivité croisée des sérums anti-B1 et anti-B2 est en accord avec le concept d'une fréquence commune f1 pour les deux peptides B1 et B2, comme démontré plus haut avec la réactivité croisée des sérums anti-A1 et anti-A2, avec respectivement les peptides
A2 et Al. Le sérum anti-A1 ne donne pas lieu à une réaction croisée marquée avec les peptides B1 ou B2 qui ont des phases opposées, ce paramètre intervenant donc également dans la reconnaissance biomoléculaire. De même, le sérum anti-B2 ne donne pas de réaction croisée avec le peptide Al.
Le sérum anti-B2 donne une faible réaction croisée avec le peptide A2, tandis que les anticorps polyclonaux du sérum anti-A2 reconnaissent de manière significative le peptide B2 dans le test ELISA. Cette réactivité croisée doit pouvoir être attribuée à l'homologie des séquences de A2 et B2 qui présentent deux fragments en commun, à savoir DFHIWDDYLKRD et QEPMDFHI , bien que la position de ces séquences soit inversée.
De même, aucune réactivité croisée n'est observée entre le peptide B1 et les sérums anti-A1 et anti-A2, le peptide B1 présentant la phase inversée à la (ou aux) fréquence(s) commune(s) avec les peptides A1 et A2.
Enfin, le sérum anti-B1 reconnaît la glycoprotéine recombinante (Baculovirus) gp120 de HIV-1, alors que les sérums anti-A1, anti-A2 et anti-B2 ne réagissent pas avec la gp120 dans les conditions de l'expérience.
Exemple 8 :- ETUDE DE LA REACTIVITE DES SERUMS AVEC DES PROTEINES DE HIV DANS LE TEST DE L' IMMUNOBLOT:
On rapporte ci-après les résultats obtenus avec un sérum anti-B1 de lapin en utilisant un kit d' immunoblot du commerce tel que celui commercialisé par Diagnostic Pasteur contenant les protéines de HIV-1 de LAVbru. Le sérum est dilué et incubé avec les bandes d' immunoblot avec des IgG de chèvre anti-lapin marquées à l'aide de phosphatase alcaline. Les bandes sont développées en utilisant un système avvc substrat de phosphatase (Diagnostic Pasteur). Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 5. L'examen de cette figure montre que les anticorps induits par le peptide B1 et présents dans le sérum anti-B1 sont capables de réagir avec plusieurs protéines de HIV-1. En effet, les anticorps de ce sérum ont été captés par la protéine POL p68 (codée par le gène de la transcriptase inverse du virus), par la protéine GAG p55 (le précurseur des protéines GAG), ainsi que par les protéines dérivant de ce précurseur : p18, p24/25 et p40. De même le composant présentant une bande nette de 43 kDa localisé dans la région correspondant à la bande diffuse de la gp41 donne lieu à une réaction croisée.
La protéine p15 est la seule protéine parmi les protéines GAG qui ne semble pas reconnue par le sérum antiB1. Enfin, la liaison des anticorps anti-B1 à la gp120 n'apparaît pas de manière significative dans le test de l'Immunoblot.
La reconnaissance de plusieurs protéines de HIV (dont celles dérivées des gènes POL et GAG) par les anticorps anti-B1 est confirmée en utilisant la trousse HIV-1 IgG Western blot commercialisée par Ortho Diagnostic Systems.
Le gène contenant l'information pour le peptide B1 a été synthétisé et inséré dans le plasmide pGEX-2T (comme décrit dans l'Exemple 7), et ensuite introduit dans la bactérie. Parmi les protéines bactériennes, la présence du peptide B1 (fusionné à la glutathione S-transférase) est révélée par le sérum anti-B1 à l'aide de l'immunoblot, après une migration des protéines sur gel d' electrophorese et leur transfert sur nitrocellulose.
Exemple 9 : TEST DE LA STIMULATION DE LA CROISSANCE DES LYMPHOCYTES :
Les lapins ont été immunisés par le peptide cA1 dont la séquence est la suivante: VHNQLVLRRLAPSVPWLLF. On rappelle que le peptide cA1 fait partie du groupe de peptides B, étant donné que son enchaînement d'acides aminés a été déduit de la séquence nucléotidique complémentaire de celle du peptide A1, celui-ci appartenant au groupe A (comme décrit dans l'Exemple 5). LE PROTOCOLE EST LE SUIVANT :
1) IMMUNISATION DES LAPINS
300 μg de peptide sont administrés aux lapins par injection ID ou SC avec de l'adjuvant de Freund (complet et incomplet).
On procède à 1 injection tous les 10 jours, en effectuant au mininum 8 injections.
On recherche le taux d'anticorps par la méthode ELISA une semaine après la dernière injection.
2) RECOLTE DES LYMPHOCYTES
On effectue les prélèvements à l'oreille du lapin immunisé ( 20 ml de sang sont nécessaires). Le même prélèvement est réalisé chez un lapin témoin (non immunisé). Un volume de sang total est dilué dans deux volumes de solution de HANKS, puis placé sur un coussin de FICOLL et centrifugé à 1300 tours/minute durant 30 minutes.
L'anneau lymphocytaire est prélevé, puis rincé deux fois dans une solution de HANKS et remis en suspension dans 1 ml de milieu RPMI 1640.
Les lymphocytes sont ensuite comptés à la cellule de MALASSEZ, puis leur nombre est ajusté afin d'avoir au minimum 250 000 cellules par puits.
3) MISE EN CULTURE
La culture s ' effectue en plaques à fond plat de 96 puits, traitées pour culture cellulaire (Falcon N° 3072).
Le milieu de culture est le RPMI 1640 avec antibiotiques, glutamine et 10 % de sérum du lapin en question, prélevé avant immunisation et décomplémenté.
Chaque puits reçoit 250 000 cellules et des quantités croissantes de peptide immunogène (de 10 à 75 μg par puits).
Les plaques sont mises dans un incubateur à 37°C renfermant 5 % de C02 durant 5 jours.
4) INCORPORATION DE THYMIDINE TRITIEE
On incorpore 1 μCi de 3H thymidine par puits au cinquième jour. 5) RECOLTE ET COMPTAGE DE LA RADIOACTIVITE
INCORPOREE
Après l'incubation durant 1 nuit (15 heures), on récolte le contenu des puits sur filtres en fibres de verre à l'aide d'un collecteur à aspiration, les filtres sont ensuite séchês comptés dans un liquide scintillant.
Les expériences montrent que la prolifération des lymphocytes des animaux immunisés avec le peptide cA1 est stimulée aussi bien en présence de ce peptide qu'en présence de la glycoproteine gp120 de HIV-1. De plus, on remarque une stimulation significative des mêmes lymphocytes par le peptide B1.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Peptides immunologiquement apparentés aux protéines exprimées par un agent viral, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou qu'ils sont constitués par une séquence d'acides aminés
. telle qu'ordonnée à l'a'de de la méthode d'analyse informationnelle des protéines (en abrégé AIP) à l'aide de la méthode de transformation de Fourier (en abrégé MTF) par référence à la séquence d'acides aminés d'un antigène cible contre lequel on souhaite former des anticorps, ou diriger les lymphocytes,
. différente de la séquence de la ou des protéines exprimées par l'agent viral, et
. présentant dans le spectre de Fourier, une ou plusieurs fréquences sensiblement de même valeur que la ou les fréquences caractéristiques de l'antigène cible.
2/ Peptides selon la revendication 1, caractérisés en qu'il s'agit de peptides dont la (ou les) fréquence(s) (sont) en phase inverse de celle(s) caractéristique(s) de l'antigène cible.
3/ Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides dont la (ou les) fréquence(s) est (sont) en phase avec celle(s) caractéristique(s) de l'antigène cible.
4/ Peptides selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que
. l'antigène cible est une protéine virale ou un fragment de cette protéine,
. il s'agit des peptides du groupe A, ayant une ou plusieurs fréquences caractéristiques communes avec l'antigène cible, mais en phase inverse,
. ils sont capables d'induire des anticorps à réactivité croisée avec les membres du même groupe, ces anticorps constituant des analogues de l'image interne de l'antigène cible.
5/ Peptides selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que - l'antigène cible par rapport auquel a été ordonnée leur séquence est du type des peptides A de la revendication 4,
- il s' agit des peptides du groupe B dont la ( ou les) fréquence(s) caractéristique(s) est (sont) en phase inverse de celle(s) qu'ils présentent en commun avec les peptides A selon la revendication 4, mais en phase avec celle (s) de l'antigène viral cible,
. ils sont capables d'induire des anticorps susceptibles de reconnaître la ou les protéines de même(s) fréquence(s) caractéristique(s) exprimée(s) par l'agent viral, ces anticorps ayant en outre des réactivités croisées vis-à-vis des membres du même groupe,
- ils sont vecteurs de l'analogue de l'image interne de la protéine virale cible.
6/ Peptides selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont capables d' induire des anticorps, ou des lymphocytes, reconnaissant les (auto-) anticorps, ou les lymphocytes auto-immuns, dirigés contre le CD4 ou des protéines de surface d'autres types cellulaires interagissant avec les glycoprotéines ou protéines des HIV.
7/ Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'il s'agit d'analogues de protéines virales, notamment de protéines rétrovirales, ou d'anticorps ainsi que des lymphocytes induits contre ces protéines.
8/ Peptides selon la revendication 7, caractérisés en ce que la protéine virale est une protéine exprimée par un rétrovirus, en particulier par un lentivirus et tout spécialement HIV, notamment HIV-1 et HIV-2, et leurs variants.
9/ Peptides selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP à l'aide de la méthode de transformation de Fourier par rapport aux séquences virales homologues des séquences HLA-DR ou de l'interleukine 2, avec la phase inversée par rapport à celle de ces séquences, qu' ils sont capables d' induire des anticorps ou des lymphocytes reconnaissant les anticorps ou les lymphocytes dirigés contre les séquences de HLA-DR et/ou de l'interleukine 2.
10/ Peptides selon l'une des revendications 8 ou
9, caractérisés en ce qu' ils comportent une séquence d'acides aminés présentant un spectre de Fourier avec au moins une fréquence égale, ou sensiblement égale à 0,1855, correspondant à celle que présentent en commun la protéine CD4 ainsi que les protéines cibles gp 160/120, p66/68 et la protéine p55 exprimées respectivement par les gènes ENV, POL et GAG de HIV-1, les protéines qui en dérivent ainsi que leurs fragments, en particulier celles de l'isolât nl43 LAVbru.
11/ Peptides selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils expriment en outre une fréquence égale à 0,2188, ou sensiblement voisine de cette valeur, telle que présentée par la protéine CD4 et le fragment de la gp120 qui reconnaît le récepteur CD4.
12/ Peptides selon la revendication 9 ou 10, caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par rapport à la séquence S de la gp 120 qui reconnaît le CD4, cette séquence S répondant à l'enchaînement suivant :
TITLPCRIKQFIΝMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSΝITGLLLTR
13/ Peptides selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides du groupe A avec des spectres de Fourier ayant la ou les fréquences communes avec le fragment de la gp120 qui reconnaît le CD4, en phase inverse.
14/ Peptides selon la revendication 12, caractérisés en ce que :
- il s'agit de peptides du groupe B,
- ils présentent des spectres de Fourier dont la (ou les) fréquence(s) est (sont) en phase inverse de celle des peptides selon la revendication 13,
- ces fréquences sont en phase avec celles caractéristiques du fragment de la gp120 qui reconnaît le CD4, - ils sont capables d'induire des anticorps à réactivité croisée avec les membres du même groupe,
- ils sont capables d'induire des anticorps ou des lymphocytes reconnaissant les régions ou les fragments de la gp120 en établissant une réaction de type antigène-anticorps ou en stimulant les lymphocytes par la gp120.
15/ Peptides selon la revendication 13, caractérisés en ce qu'ils présentent la séquence A1 :
KQQYYWYAWCQPPQDQLIMD, ou la séquence A2 :
LKRDQEPMDFHIWDDYLKRD
16/ Peptides selon la revendication 14, caractérisés en qu'ils présentent
- la séquence B1 : DDALYDDKNWDRAPQRCYYQ, ou
- la séquence B2 : DFHIWDDYLKRDQEPMDFHI
17/ Peptides selon la revendication 2, caractérisés en ce qu' ils présentent une séquence ordonnée par rapport à une protéine virale présentant des séquences homologues aux HLA-DR ou à l ' interleukine 2 ayant la ou les mêmes fréquences, mais en phase inverse.
18/ Peptides selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'il s'agit d'analogues d'une protéine exprimée par FLV, Visna ou HTLV-1 et HTLV-2.
19/ Peptides selon la revendication 18, caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence d'acides aminés telle qu'ordonnée selon la méthode AIP par rapport à la séquence de glycoprotéines de la polyprotéine d'enveloppe de FLV, en particulier par rapport à la séquence de la protéine knob gp70, ces peptides étant choisis notamment dans le groupe comprenant :
le peptide KDLRWHDIRW10 HDIRWHDNRQ20 ayant une fréquence commune avec la protéine knob gp70, égale ou sensiblement égale à 0,3984, en phase avec celle de la protéine knob gp70;
le peptide RNDHWRIDKW10 RIDKWDLDKY20 ayant la même fréquence que knob gp70, mais en phase inverse :
PPPEEGNNII10 LIINNEEEPP20 HHKKAYYWWQ30 QQCTTRRRR40
le peptide DDDDDDDDDD50 DDDDDDRRRR60 TCMQQQWWYYA70 KHH possédant la même fréquence et phase que la protéine spike p15 ; le peptide RRRDDDDDDD10 DDDDDDDDDR20 RRRTCMQQQW30
WYYAKHHPPP40 EEGNIIILIl50 présentant la même fréquence que la protéine spike p15, mais en phase inverse.
le peptide AMPQKHQGWK10 PWIYKEWGWA20 PQPQWKTKMQ30 YRYRTWDWRR40 QDQRRQDWFF50 WRYQMKTKWW60 PQPAYEWEKY70
IWEAYGQPKW80 PMKWMKRWQR90 présentant des fréquences communes et en phase avec les protéines spike 15 et knob gp70, et le peptide FWDWTRWDQR10 DQDQRDWDQT20 RWDWQRARYW30
CHCAYQPQHK40 WGWHHWLWPH50, présentant des fréquences communes avec les protéines spike p15 et knob gp70, mais en phase inverse de celles de ces deux protéines
20/ Fragments de séquences de nucléotides, caractérisés en ce qu'ils comportent ou sont constitués par
. une séquence codant pour les peptides selon l'une des revendications 1 à 19, et, le cas échéant, une ou plusieurs séquences codant pour des protéines ayant une activité que l'on souhaite conférer au peptide à exprimer, ou
. les séquences complémentaires desdites séquences ou,
. des séquences de nucléotides susceptibles de s'hybrider avec l'une des séquences nucléotidiques complémentaires de celles des séquences déduites de celles des peptides,
en particulier les fragments de séquence
(5') AAA CAG CAG TAC TAC TGG TAC GCT TGG TGC CAG CCG CCG CAG
GAC CAG CTG ATT ATG GAC (3'), ou encore
(5') AAG CAA CAA TAT TAT TGG TAT GCG TGG TGT CAA CCA CCA CAA
GAT CAA CTC ATC ATG GAT (3')
ces séquences renfermant l'information pour coder pour le peptide Ai de la revendication 15 :
ceux de séquence
(5') GAC GAC GCT CTG TAC GAC GAC AAA AAC TGG GAC CGT GCT CCG
CAG CGT TGC TAC TAC CAG (3'), ou encore
(5') GAT GAT GCG CTC TAT GAT GAT AAG AAT TGG GAT CGC GCG CCA CAA CGC TGT TAT TAT CAA (3')
ces séquences renfermant l'information pour coder pour le peptide B1 de la revendication 16 ;
les séquences complémentaires (3') TTT GTC GTC ATG ATG ACC ATG CGA ACC ACG GTC GGC GGC GTC
CTG GTC GAC TAA TAC CTG (5')
(3') TTC GTT GTT ATA ATA ACC ATA CGC ACC ACA GTT GGT GGT GTT
CTA GTT GAG TAG TAC CTA (5')
(3') CTG CTG CGA GAC ATG CTG CTG TTT TTG ACC CTG GCA CGA GGC
GTC GCA ACG ATG ATG GTC (5')
(3') CTA CTA CGC GAG ATA CTA CTA TTC TTA ACC CTA GCG CGC GGT
GTT GCG ACA ATA ATA GTT (5')
ces séquences complémentaires, lorsqu'elles sont utilisées en tant que séquences codantes, conduisant à l'expression de peptides du type cA et de type cB respectivement, en particulier
au peptide cA1 de séquence
NH2 V H N Q L V L R R L A P S V P V V L L F -COOH
au peptide cA11 de séquence :
NH2 I H D E L I L W W L T P R I P I I L L L -COOH
au peptide cB1 de séquence :
NH2 L V V A T L R S T V P V F V V V Q S V V -COOH
au peptide cB11 de séquence :
NH2 L I I T A L W R A I P I L I I I E R I I -COOH, et les séquences de nucléotides complémentaires de ces séquences codantes; notamment des séquences pouvant coder pour les peptides de type cA ou de type cB.
21/ Peptides tels qu'exprimés par les séquences de nucléotides déduites des séquences d'acides aminés telles qu'ordonnées selon l'une des revendications 1 à 19, ou par les séquences complémentaires de ces séquences de nucléotides comme défini dans la revendication 20.
22/ Vecteurs d'expression, notamment plasmides ou phages, caractérisés en ce qu'ils renferment un fragment de séquence de nucléotides selon la revendication 20, et hôtes cellulaires transformés par ces vecteurs.
23/ Anticorps dirigés contre les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 et 21.
24/ Procédé d'obtention de peptides selon la revendication 1 immunologiquement apparentés aux protéines exprimées par un agent viral, caractérisé en ce qu'on réalise par voie de synthèse un enchaînement d' acides aminés tel qu'ordonné selon la méthode AIP à l'aide de la méthode de transformation de Fourier, en fonction de la séquence d'acides aminés d'un antigène cible et d'un ou des élément(s) périodique(s) caractéristique(s) de l'antigène cible, correspondant à la ou aux fréquences dominantes caractéristiques de l'antigène cible, la séquence du peptide étant ordonnée en fonction de celle d'une protéine de l'agent viral,
- ou en variante en fonction de celle d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 19 ou 21, et que,
- pour préparer des peptides du groupe A, la phase de la (ou des) fréquence(s) caractéristique(s) que doit (doivent) présenter le peptide est en phase inverse par rapport à celle de la ou des fréquences de l'antigène cible et
- pour préparer des peptides du groupe B, on effectue une nouvelle inversion de phase, de telle sorte que la (ou les) fréquence(s) sont en phase avec celle(s) de la protéine ou des protéines de l'agent viral.
25/ Méthode de diagnostic in vitro d'une pathologie virale chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique tel qu'un fluide biologique comme le sérum ou les lymphocytes du sang circulant, ou encore un extrait tissulaire biologique prélevé chez le patient à l'étude, ou l'animal, avec,
. pour déterminer la présence d'anticorps ou de lymphocytes capables de reconnaître les protéines impliquées dans la pathologie virale à étudier,
soit des anticorps induits contre des peptides du groupe A selon la revendication 4, soit des peptides du groupe B selon la revendication 5, y compris le sous-groupe de peptides cA selon la revendication 21, cette mise en contact étant suivie de la mise en évidence d'une réaction du type antigène-anticorps ou d'une réactivité avec les lymphocytes, entre respectivement les anticorps et les lymphocytes de l'échantillon et les peptides ou anticorps de l'invention ; ou
. pour déterminer la présence des protéines de l'agent viral,
soit des peptides du groupe A, y compris les peptides cB,
soit des anticorps ou des lymphocytes induits contre des peptides du groupe B, cette mise en contact étant suivie de la mise en évidence d'une réaction de type antigène-anticorps ou d'une réactivité lymphocytaire entre les protéines de l'agent viral présents dans l'échantillon et les anticorps ou peptides, ou les lymphocytes utilisés comme réactifs.
26/ Kits pour le diagnostic in vitro d'infections par des agents viraux, caractérisés en ce qu'ils comportent:
- des anticorps induits contre des peptides artificiels du groupe A ou des peptides artificiels du groupe B, y compris le sous-groupe cA, ou bien des peptides artificiels du groupe A, y compris le sous-groupe cB, et des anticorps induits contre des peptides artificiels du groupe B, avantageusement immobilisés sur un support, le cas échéant en mélange, afin de détecter plusieurs infections,
- des réactifs appropriés à la réalisation et à la mise en évidence de la réaction immunologique entre lesdits anticorps induits ou peptides artificiels et, respectivement, les anticorps formés contre ces protéines ou les lymphocytes induits et les protéines antigéniques, et le cas échéant,
- un milieu biologique de référence à titre de contrôle et, en vue de détecter une réactivité lymphocytaire, des lymphocytes d'un animal immunisé contre des peptides artificiels de l'invention.
27/ Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend
- soit au moins un peptide du groupe B selon la revendication 5, plus particulièrement un peptide du groupe B tel qu'ordonné selon la méthode AIP par rapport aux protéines d'un virus, et plus spécialement d'un rétrovirus tel que HIV, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour la constitution de vaccins,
- soit au moins un peptide du groupe A selon la revendication 4,
28/ Utilisation des peptides du groupe B selon la revendication 5 pour l'activation des lymphocytes pu des anticorps induits par ces peptides ainsi que pour l'interception des anticorps ou des lymphocytes anti-CD4.
29/ Utilisation des anticorps selon la revendication 23 ou des peptides selon l'une des revendications 1 à 19 et 21 comme réactifs pour le diagnostic d'une pathologie virale chez l'homme ou l'animal.
30/ Utilisation de peptides de type A selon la revendication 4 comme vecteurs de drogue ou d'antigène ordonnés par rapport à l'antigène viral en dehors de la région qui interagit avec la cellule cible.
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