[go: up one dir, main page]

WO1993013218A1 - Peptide antagoniste de l'endotheline - Google Patents

Peptide antagoniste de l'endotheline Download PDF

Info

Publication number
WO1993013218A1
WO1993013218A1 PCT/JP1992/001731 JP9201731W WO9313218A1 WO 1993013218 A1 WO1993013218 A1 WO 1993013218A1 JP 9201731 W JP9201731 W JP 9201731W WO 9313218 A1 WO9313218 A1 WO 9313218A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
trp
phe
tyr
compound
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1992/001731
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takeo Tanaka
Yoshikazu Morishita
Mika Nozawa
Shigeru Chiba
Isao Kawamoto
Eiji Tsukuda
Mayumi Yoshida
Chieko Shimazaki
Kazuo Yamaguchi
Yuzuru Matsuda
Shigeto Kitamura
Toshihide Ikemura
Tatsuhiro Ogawa
Keiichi Yano
Toshiyuki Suzawa
Kenji Shibata
Motoo Yamasaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to EP93900411A priority Critical patent/EP0603399B1/en
Priority to DE69232771T priority patent/DE69232771T2/de
Publication of WO1993013218A1 publication Critical patent/WO1993013218A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US09/181,083 priority patent/US6194195B1/en
Priority to US09/750,754 priority patent/US6642355B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide having an endothelin antagonistic activity and a synthetic intermediate thereof.
  • This peptide has an excellent endothelin antagonism and is useful as a therapeutic agent for hypertension, asthma, stroke, angina, acute renal failure, myocardial infarction, cerebral vasospasm, etc.
  • Endoselin is a cyclic peptide with potent and sustained vasoconstriction, one of the substances involved in hypertension, asthma, acute renal failure, myocardial infarction, stroke, angina pectoris and cerebral vasospasm. It is considered. Therefore, substances that antagonize endothelin and inhibit this action are expected to be useful in the treatment and prevention of these diseases.
  • R 1 is a hydrogen or amino protecting group, and is a hydrogen or carboxyl protecting group).
  • the present inventors have conducted research on a large number of microbial products with the aim of finding a bioactive substance exhibiting endocerin antagonism in nature, and as a result, streptomime newly isolated from soil.
  • a culture of a microorganism belonging to the genus Cesaceae a substance having an endothelin antagonistic effect, an inhibitory effect of endoselin on an increase in intracellular calcium concentration and an inhibitory effect on intracellular guanosine 13 ′, 5′-cyclic monophosphate concentration, is isolated from They were named S—7011, RES—701—2 and RES—701-1-3. Sa As a result of repeated studies, the structures of these substances were determined, and novel derivatives of these compounds were also synthesized, thereby completing the present invention.
  • A represents As n or As p
  • E represents Al a or S e r
  • G represents A la or P ro
  • X represents X 1 — Gly or X 3 —Cys
  • Y represents hydroxy, lower alkoxy, amino, AspZ or Cys-Z
  • Y ' is hydroxy, or represents a lower alkoxy or amino, or X 1, Y 1 and X 2, Y "and the X'-Y 1 Contact respectively become one ⁇ 2 - represents Upsilon 2 force ⁇ single bond,
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is hydroxy, lower alkoxy, benzyloxy, benzhydryloxy,
  • G 1 yZ ′ (wherein Z 1 represents hydroxy, lower alkoxy, benzyloxy or benzhydryloxy, or together with X 1 , x′—z 1 represents a single bond),
  • A-1 a— Z ′ (wherein ⁇ ′ is as defined above), V a 1 -Z 1 (wherein Z 1 is as defined above),
  • Tr p—Z 1 wherein Z ′ is as defined above,
  • Tr p-As n-Ty r-Ty r-Tr -Z 1 (wherein, Z 1 is as defined above),
  • Trp-I1e-I1eTrp-Z ' (wherein Z' is as defined above),
  • Tr p-Va l -Ty r Ph e— W— H is— L eu— As p— I 1 e— I 1 e— T rp Z 1 (where Z ′ is as defined above, and W is A 1 represents a, Ser or Cys),
  • Tr p-Va 1 -Ty r-Ty r -WH is—; L eu— As p— lie— lie—T rp— Z 1 (wherein Z ′ and W are as defined above),
  • Tr p-Le u-Ty r 1 Ph e— W— H is— G in— As p—Val—lie— Tr p—Z ′ (wherein, Z 1 and W are as defined above),
  • Tr p-Ph e-Ph e-As n-Ty r-Ty r -WH is-L eu— As p— I 1 e-I 1 e— Tr p— Z ′ (where Z 1 and W are Is synonymous with),
  • J is Trp or single bond
  • M is P he or a single bond
  • Q is As n or a single bond
  • R is Tyr or a single bond
  • T Trp
  • Trp As n—Ty r—Ty r—Trp
  • the present invention provides an intermediate represented by the following formula (H), which is useful for synthesizing the peptide compound represented by the formula (I): X 4 -JP he -MQ-Tyr-RTZ J ( ⁇ ) (wherein, X 4 represents hydrogen, benzyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, and Z 2 is hydroxy, lower alkoxy, benzyloxy or benzylhydroxy) And J, M, Q, R and T are as defined above. «) ⁇
  • the peptide compound represented by the above formula (I) is referred to as compound (I), and the same applies to compounds having other formula numbers.
  • the alkyl portion of lower alkyl and lower alkoxy is a straight-chain or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, iso- Butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl and the like.
  • the lower alkanoyl is a straight-chain or branched i-6 carbon atom, for example, formyl, acetyl , Propionyl, butyryl, valeryl, bivaloyl, pentanoyl, etc.
  • Pharmaceutically acceptable salts of compound (I) include acid addition salts, metal salts, and organic base addition salts.
  • pharmacologically acceptable acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, phosphate, etc., acetate, maleate, fumarate, tartrate, citrate, etc.
  • Organic salts are listed, and pharmacologically acceptable metal salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt, zinc salt and the like.
  • Pharmacologically acceptable organic bases include secondary amines such as primary amines such as methylamine, ethylamine, aniline, dimethylamine, getylamine, pyrrolidine, piperidine, morpholine and piperazine, trimethylamine, triethylamine, and the like.
  • Secondary amines such as N, N-dimethylaniline and pyridine; and ammonia.
  • RES-701-1-1, RES-701--2 and RES-701-13 having the following structures belong to the genus Streptomyces and RES-701 — 1 Production ability, RES— 70 1 1 2 Production ability and RES-70 1—3 Microorganisms with productivity are cultured in a culture medium, and RES— 70 1—1, RES— 70 1— 2 And RES-70 1-3 are produced and accumulated, and RES-7
  • the mycological properties of the Streptomyces sp. RE-701 strain are as follows:
  • the RE-701 strain is a commonly used agar medium, has a partition wall, and forms branched aerial hyphae and basal hyphae. It should be noted that no special division of the base hypha was observed. No spores and sclerotium were found.
  • the spores are formed in the form of more than 10 long chains in a spore stalk that is simply branched from the aerial hyphae, and the shape is bent or spiral.
  • the mature spores are elliptical with a size of 0.4-0.5 / z m x 0.6-0.8 ⁇ m and their surface is smooth and without flagella.
  • Strain RE-701 shows normal or vigorous growth on commonly used synthetic and natural media and forms aerial hyphae of the gray strain. On the other hand, the substrate hypha shows grayish white to brown. Little soluble dye is produced. The characteristics of growth and color when cultured on various media at 28 ° C for 10 days are shown below. The color display was based on the Color Hormony Manual (Container Corporation of Ameri ca).
  • Aerial hyphae Normal, white (a)
  • Soluble pigment None 4. Starch and inorganic salt agar
  • Aerial mycelium slightly poor, white (a)
  • strain RE-701 The physiological properties of strain RE-701 are shown below.
  • the growth temperature range is 6 days, the others are 28 ° C, and the observation results after 2 weeks are described.
  • the RE-701 strain assimilates D-glucose, D-fructose, sucrose, inositol, raffinose, and D-mannitol, but does not assimilate D-arabinose or L-rhamnose. D—Utilization of Kiss Is unknown.
  • this strain Based on the spore chains formed on aerial mycelium and the stereotype of diaminopimelic acid, this strain is classified into the genus Streptomyces among actinomycetes.
  • Streptomyces sp. RE-701 This strain has been deposited with the Research Institute of Microbial Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on October 29, 1991, as No. 3624 (FERM BP-3624).
  • the mycological properties of Streptomyces' SP RE-629 strain are as follows.
  • the RE-629 strain is a commonly used agar medium, has a partition wall, and forms branching aerial hyphae and basal hyphae. No characteristic fragmentation of the underlying hypha was observed. No spores and sclerotium were found.
  • the spores are formed in the form of more than 10 long chains in a spore stalk that is simply branched from the aerial hyphae, and the shape is bent or spiral. Mature spores are elliptical with a size of 0.7-0.8 z m x 0.7-1.0 jum and their surface is smooth and without flagella.
  • the physiological characteristics of the strain RE-629 are shown below.
  • the growth temperature range is 5 days, the others are 28 ° C, and the observation results after 2 weeks are described.
  • this strain Based on the spore chains formed on aerial mycelium and the stereotype of diaminopimelic acid, this strain is classified into the genus Streptomyces among actinomycetes.
  • Streptomyces sp. RE-629 Streptomyces sp. RE-629. This strain has been deposited with the Research Institute of Microbial Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 17, 1992 as FERM BP-4126.
  • the usual culture methods used for culturing actinomycetes are applied. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, and the like that can be used by bacteria.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, stabilose, starch, dextrin, mannose, maltose, molasses, etc., organic acids such as citric acid, malic acid, acetic acid, fumaric acid, and methanol.
  • examples include alcohols such as ethanol, ethanol, etc., hydrocarbons such as methane, ethane, propane, n-paraffin, amino acids such as glutamic acid, and glycerol.
  • Nitrogen sources include ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium salts such as ammonium phosphate, amino acids such as aspartic acid, glutamine, cystine, alanine, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, Corn 'Steep' Jamaica, soybean flour, cottonseed meal, soybean casein, casamino acid, Pharmamedia (procter and gambling) and the like are used.
  • Inorganic substances include phosphate monophosphate, diphosphate phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, cobalt sulfate, zinc sulfate, calcium pantothenate, ammonium molybdate, Potassium aluminum sulfate, barium carbonate, calcium carbonate, cobalt chloride, salt and the like are used.
  • a substance that promotes the growth of cells such as vitamins such as thiamine or the production of RES-701-1, RES-701-1-2 and RES-701-l3 can be added to the medium if necessary. .
  • microorganism used requires specific substances, it is, of course, necessary to add what is needed for growth.
  • the cultivation is carried out by shaking culture, aeration-agitation culture, or the like, at a temperature of 20 to 40 ° C and near neutral pH. After 3-7 days of culture, the accumulation of RE S-701- 1, RES-701- 2 and RES-701- 3 has reached a maximum, and the culture is completed.
  • the biologically active substance can be isolated from the normal culture.
  • the method of sampling is applied.
  • isolating and collecting RES-701-1, RES-701-2 and RES-710-1-3 accumulated in the cells collect normal physiologically active substances from the cells.
  • the method is applied. For example, cells are obtained from the culture by filtration, centrifugation, etc., and extracted using an organic solvent such as methanol or acetone.
  • the extract is distributed, adsorption resin, silica gel, chemically modified silica gel, Purified by reversed-phase silica gel, alumina, cellulose, diatomaceous earth, magnesium silicate, ion-exchange resin, or column chromatography such as gel filtration, or thin-layer chromatography.
  • RES-7001, RES7-101-2 and RES710-3 in the above process was carried out by using an iodine reaction or 50 It is carried out by spraying with sulfuric acid and coloring by heating, or by measuring the absorption at a wavelength of 253.7 nm by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HP LC) using a C-18 reverse phase silica gel column.
  • HP LC high performance liquid chromatography
  • Compounds (I) and (II) include RES-701--1, RES-701--2, and RES-701-13 produced by culturing the above microorganism. It can also be produced by synthetic means.
  • the compounds (I) and ( ⁇ ) of the present invention were appropriately side-chain protected on a peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems, Inc., USA (ABI) or a peptide synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation. Synthesize according to the same company's synthesis program using N-t-butyloxycarbonylamino acid or the like, or using N-191-fluorenylmethyloxycarbonyl-2-amino acid or the like appropriately protected with a side chain. Is obtained by
  • the cyclic peptide in compound (I) can be obtained by converting the partial peptide appropriately protected in the side chain into the above-mentioned synthesizer or a general liquid-phase peptide synthesis method (“Basic and experimental methods for peptide synthesis” by Nobuo Izumiya et al., Maruzen ) To obtain a cyclized partial peptide by using a condensing agent such as benzotriazo-l-yl-l-okistris-pyrrolidinephosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).
  • a condensing agent such as benzotriazo-l-yl-l-okistris-pyrrolidinephosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).
  • the compounds (I) and (II) thus obtained can be purified by HPLC using a reversed-phase column or the above-mentioned various chromatography methods.
  • the acid addition salt and the organic base addition salt of the compound (I) can be obtained by dissolving the compound (I) in an aqueous solution of the corresponding acid or organic base, and freeze-drying.
  • the metal salt of compound (I) can be obtained by dissolving compound (I) in an aqueous solution containing the corresponding metal ion and purifying the solution by gel filtration or HP LC.
  • Trp Phe — Phe -Asn -Tyr
  • Tyr -7Hyt-0H
  • Tr p-H is — G 1 y-Th r-(38)
  • Rat thoracic aortic smooth muscle derived cell line A10 (ATCC CRL 1476) was added to 10% fetal bovine serum (manufactured by Hyclone) and modified Dulbecco's Eagle's medium.
  • the obtained suspension was centrifuged at 8,000 g for 10 minutes at 4 ° C, and the resulting supernatant was centrifuged for 60 minutes at 40,000 g at 4 ° C to obtain a solid.
  • the obtained solid was suspended in buffer A and centrifuged again at 4 ° C at 40,000 g for 60 minutes.
  • the obtained solid was prepared as a suspension solution so that the protein content was 2 mgZ, and used as a membrane fraction.
  • Buffer B 50 mM Tris-HCl
  • the radioactivity on the glass filter was measured, and the amount of the receptor and non-specifically bound endoselin was measured.
  • the endoselin receptor was calculated according to the following formula. The binding inhibition rate was calculated.
  • Endothelin-1 (final concentration InM) was added to the experimental solution containing (final concentration 3 pg / ⁇ ) or to the experimental solution without any addition.
  • the change was measured by measuring the intracellular guanosine 13 ', 5'-cyclic phosphate concentration using Cyclic GM P Assay Kit (manufactured by Yamasa Oil).
  • Cyclic GM P Assay Kit manufactured by Yamasa Oil.
  • the increase in intracellular guanosine 13 ', 5' by 1 nM endoserin and the increase in cyclic phosphoric acid concentration was due to intracellular guanosine 13 ', 5'
  • the increase in cyclic monophosphate concentration was 0%.
  • the bovine lung tissue in Test Example 2 was changed to bovine cerebellar tissue, and the endocrine receptor binding inhibition rate was determined in the same manner as in Test Example 2, except that the compounds shown in Table 2 were used as test compounds.
  • Compound (I-11) was intraperitoneally administered to an administration group consisting of three ddy mice weighing 20 ⁇ 1 g. 7 days after administration, observed deaths and determined the minimum lethal dose (MLD) I asked. The result was more than 300 mg / kg.
  • Amino acids and protecting groups have the following meanings.
  • V a 1 L-varine
  • G 1 X L-glutamic acid or L-glutamine
  • Tr p L— tryptophan
  • a s X L-aspartic acid or L-asparagine
  • Trt Trityl
  • the side chain protected amino acids are represented as follows:
  • t-Bo c-Ty r N-t-Butyloxycarbo-nore 0- 2-Flomobenzinoleoxycanoleboninole L-tyrosine t-Bo c-His (Bom ): N one t one-butyl O butoxycarbonyl one N 'm - benzyl O carboxymethyl over L- histidine
  • Fmo c— H is (Tr t) -OH: ⁇ -9—Fluorenylmethyl carboxy N im —Trityl-L—Histidine
  • the following Examples 1, 3, 6 to 10 and Reference Examples 1 and 2 The peptide was synthesized using a peptide synthesizing machine manufactured by BI, Inc., type A, using a reagent and a solvent, manufactured by ABI, according to a synthesis program of ABI.
  • the condensation reaction of amino acids was carried out under standard conditions as a symmetric acid anhydride.
  • Examples 16 and 17, 21 to 40, and Reference Examples 3 and 4 the peptide synthesis machine PS SM 8 of Shimadzu Corporation was used, and the reagents and solvents of Shimadzu Corporation were used for the synthesis of the company.
  • the peptide was synthesized by operating the synthesizer based on the mouth gram. Amino acid condensation reactions were performed under standard conditions by the Fmoc method [Basics of peptide synthesis and experiments Nobuo Izumiya et al. (Maruzen)]. .
  • Streptomyces sp. RE-701 strain was used as the inoculum, glucose 10 gZ ⁇ as the first seed medium, beef extract (Kokuto Pharmaceutical Industries) 3 g ⁇ , powdered yeast extract S (Nippon Pharmaceutical) 5 gZ, Totripton (manufactured by Difco) 5/1, potassium monophosphate 1 gZ 1 Magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g /, calcium carbonate 2 gZ £, pH 7.2 are used.
  • One platinum loop of the inoculum was inoculated into the above medium in a 50-inch thick test tube, and cultured with shaking at 28 ° C for 5 days.
  • the first type culture solution 9 was inoculated into a 300 type II medium in an Erlenmeyer flask with a 2 ⁇ volume baffle.
  • the composition of the type 2 medium was the same as that of the type 1 medium.
  • the second seed culture was performed at 28 ° C for 2 days.
  • This second species culture solution 300 0 was inoculated into a third species medium 9.7i in a 30 ⁇ volume stainless steel jar fermenter.
  • the composition of the type 3 medium was the same as the composition of the type 1 medium.
  • the third seed culture was carried out at 28 ° C for 3 days by aeration and stirring (rotation speed 250 rpm, aeration volume 10 ⁇ Zmin).
  • This third species culture solution 10 ⁇ was inoculated into a main fermentation medium 90 in a 200-volume stainless steel jar fermenter.
  • Glucose 40 /! As the main fermentation medium ⁇ , soluble starch 40 g ha, soy flour 10 g / £, corn 'steep' li A culture medium of Kerr 5 gZ, dried yeast 5 / monolithium phosphate 0.5 gZ, cobalt chloride 1, nickel sulfate 1 Z ⁇ , zinc sulfate 10 g, magnesium phosphate 0.5 gZ, ⁇ 7.0 was used.
  • the main fermentation culture was carried out at 28 ° C. for 4 days by aeration and stirring (rotation speed: 200 rpm, aeration rate: 10 ( ⁇ / min)).
  • the obtained culture broth was continuously centrifuged to separate the cells, and acetone was added to the obtained cells, stirred, and filtered.
  • the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to remove acetone, and then passed through a Diaion HP-20 column (5 £) to be adsorbed.
  • the column was washed with 50% methanol 25 and then eluted with methanol.
  • the fractions containing RES—701-1—1 were collected, diluted with water, and adsorbed by passing through a Diaion HP—20SS column (2.5, packed with 50% methanol. 70% methanol).
  • the physicochemical properties were measured by the following instruments.
  • Amino acid analysis was performed by the method of Bidlingmeyer. B.A. et al. [J. Chromatogr., 336, 93 (1984)].
  • the hydrolysis was carried out in hydrochloric acid vapor at 110 ° C. for 22 hours.
  • the amino acid composition of the hydrolyzate was analyzed using a Waters Pico Tag TM amino acid analyzer.
  • Tributophan alone was hydrolyzed by the method of Matsubara et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun., 35, 175 (1969)] and analyzed with a JLC-300 amino acid analyzer by JEOL. Note that the measured values are expressed assuming that the value of Ala is 1.00:
  • the primary structure of amino acids was partially hydrolyzed in 0.05 N hydrochloric acid at 8 ° C for 2 hours for 2 hours, followed by automated edman degradation of partially hydrolyzed peptides obtained by HPLC (470 A protein sequencer). , 120A online PTH amino acid analyzer, manufactured by ABI), and FAB-MS spectrum analysis. Tributophan at the C-terminal was identified by the hydrazine decomposition method [Akahori et al., Bull. Chem. Soc. Jap., _25 ⁇ 214 (1967)]. The Rf value of RES-7001-1 was measured by developing it with thin layer chromatography using various developing agents. Detection was performed by iodine reaction, sulfuric acid coloring, or UV irradiation at 253.7 nm.
  • Thin layer and unfolding method are same as unfolding condition 1.
  • the expansion method is the same as expansion condition 1.
  • the expansion method is the same as expansion condition 1.
  • Streptomyces sp. RE-701 strain was used as the inoculum, and a platinum loop of the inoculum was placed in four 250 Erlenmeyer flasks.Type 1 medium (10 g glucose, soluble starch) 10 /, Beef Extract (Kyokuto Pharmaceutical) 3 g ⁇ , Powdered Yeast Ex S (Nippon Pharmaceutical) 5, Pact Tripton (Difco) 5 Monopotassium phosphate 1 gZ £, Magnesium sulfate 7 Hydrate
  • the composition of the third medium was the same as that of the first medium.
  • the third seed culture was performed at 28 ° C. for 27 hours by aeration and stirring (rotation speed: 22 Orpm, aeration amount: 60 i / min).
  • This third seed culture 100 is inoculated into the main fermentation medium 1,000 i in a jar fermenter made of stainless steel having a volume of 200,000 ⁇ .
  • As the main fermentation medium a medium of soluble starch 50 g / ⁇ , dried yeast 30 g /, monopotassium phosphate 0.5 gZ_g, magnesium phosphate 0.5 g LG-109 (Shin-Etsu Chemical) 0.5 gZ, pH 7.0 Using.
  • the main fermentation culture was performed at 28 ° C. for 3 days by aeration and agitation (rotation speed: 140 rpm, aeration rate: 400 Zmin).
  • N-Propyl alcohol 400 and a filter aid were added to the obtained culture solution 1,000 ⁇ , sufficiently stirred, and filtered with a filter press.
  • Water was added to the filtrate to adjust the n-propyl alcohol concentration to 20%, and the mixture was passed through a 50 column filled with Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.).
  • RES-701-2 was adsorbed, washed with 60% methanol 200, and eluted with 80% methanol 250 ⁇ .
  • Water and ammonium peracid are added to the fraction 150 containing RES-701--2, adjusted to pH 7.0 with 30% methanol containing 50 mM ammonium acetate, and 30% containing 30% methanol and 5 OmM ammonium acetate.
  • Sepabeads FP-DA13 Mitsubishi Chemical Industries
  • RE S-701-2 The physicochemical properties of RE S-701-2 are shown below.
  • the physicochemical properties were measured by the following instruments.
  • Amino acid analysis was performed by the method of Bidlingmeyer. B. A. et al. [J. Chromat pgr., 336, 93 (1984)].
  • the hydrolysis was carried out in hydrochloric acid vapor at 110 ° C. for 22 hours.
  • the amino acid composition of the hydrolyzate was analyzed with a Waters Pico Tag amino acid analyzer. Only tryptophan was hydrolyzed by the method of R. J. Simpson et al. [J. Biol. Cheni., 251, 1936 (1976)] and analyzed by the amino acid analyzer described above.
  • the actual measurement value represented the value of A1a as 1.00.
  • Mass spectrometry measured value 2058.8496
  • the amino acid configuration was derivatized with 1- (9-fluorenyl) ethyl chloroformate after hydrolysis and analyzed by reversed-phase HP LC. All were in L-form.
  • the primary structure other than the C-terminal amino acid was partially hydrolyzed in 0.1 N hydrochloric acid at 108 ° C for 2 hours, followed by automated Edman degradation of the partially hydrolyzed peptide obtained by Separation HPLC (470A protein sequencer). 1, 120A online PTH amino acid analyzer, manufactured by ABI), and FAB-MS spectrum analysis.
  • C-terminal amino acids are digested by hydrazinolysis (Akahori et al., BulL Chem. Soc. Jap., 25, 214 (1964)) and carboxypeptidase A (Sigma). 7-Hydroxytributophan was identified by the FAB-MS spectrum analysis and NMR spectrum analysis (Bruker, AM500, lH-500 MHz) described above. The amino acid configuration was determined to be L-type by a polarimeter (JASCO DIP-370).
  • a streptomyces sp. RE-629 strain was used as the inoculum, and a platinum loop of the inoculum was placed in four 250 Erlenmeyer flasks.
  • a first-class medium [glucose 10 gZ, soluble starch 10 g / ⁇ , beef extract (Kyokuto Pharmaceutical) 3 /! ⁇ , Powdered yeast extract S (Nippon Pharmaceutical) 5 gZ, Bactotripton (Difco) 5 gZ ⁇ , phosphoric acid Inoculated into 1/1 magnesium sulphate heptahydrate 0.5 / ⁇ , calcium carbonate 2 gZ £, LG-109 (Shin-Etsu Chemical) 0.5 gZ ⁇ , ( ⁇ 7.2)] 40 2 8.
  • the cells were cultured with shaking for 3 days. 1 OJ ⁇ of the first-class culture was inoculated into 300 second-class media in six Erlenmeyer flasks with baffles each having a capacity of 2 pounds.
  • the composition of the second type medium was the same as the composition of the first type medium.
  • the second seed culture was performed at 28 ° C for 2 hours. This second-species culture solution 180.000 was inoculated into a main fermentation medium 100 in a 200-volume stainless steel jar fermenter.
  • the main fermentation medium is soluble starch 50 /, dried yeast 30 monopotassium phosphate 0.5 gZ, magnesium phosphate 0.5 g / &, LG-109 (manufactured by Shin-Etsu Chemical) 0.5 / a, H7.0 medium was used.
  • the main fermentation medium was subjected to aeration and agitation at 28 ° C. for 3 days (rotational speed: 140 rpm, ventilation rate: 400 / min).
  • the physicochemical properties were measured by the following instruments.
  • the amino acid configuration was confirmed to be all L-form by hydrolyzing (+)-11- (9-fluorenyl) ethyl chloroformate and derivatizing with reversed-phase HPLC.
  • the primary structure was determined by automated Edman degradation of peptides obtained by partial hydrolysis in 0.1 N hydrochloric acid at 108 ° C for 2 hours and separation by KAGAKU HP LC (470A protein sequencer, 120A online PTH amino acid analyzer, AB I And FABMS spectrum analysis (manufactured by JEOL Ltd., JMS—HX110A).
  • the C-terminal amino acid was analyzed by hydrazinolysis [Akahori et al., Bull. Chem. Soc. Jap., 25, 214 (1964)], and was identified as tributofan.
  • t-Boc-Tyr (Br-Z) -Trp (CHO) was synthesized on the carrier.
  • the symmetric acid anhydride of t-Boc-Tyr (Br-Z) -OH is added in step (f).
  • the condensation reaction was performed, and then, through the washing step (g), t-Boc-Tyr (Br-Z) -Tyr (Br-Z) -Trp (CHO) was synthesized on the carrier resin. .
  • Insolubles were removed by centrifugation (15000 rpm 5 min, 0 ° C), and the supernatant was purified by reversed-phase HP LC.
  • YMC Pack ODS-AM312 150 ⁇ 6 mml.D. manufactured by YMC was used. Elution was performed with a linear gradient using 0.1% TFA and 0-90% acetonitrile. Detection was performed at 220 nm, and a fraction containing 5% of compound (I-1) and 95% of compound (I-15) was detected. Got a minute. The solvent of this fraction was distilled off under reduced pressure to obtain 0.0 lmg of the residue.
  • t-Bo c-Trp force-bonded carrier resin and N-protected amino acids sequentially t-B0c-Tyr (Br-Z) -OH, t-Boc-Tyr (BrZ) -OH , t-Boc-A sn-OH, t-Boc-Phe-OH, t-Boc-Phe-OH, and t-Boc-Trp (CHO) -OH
  • a carrier resin to which the protective peptide was bound was obtained.
  • the obtained compound was subjected to a linear concentration gradient of 0.1% TFA and 0 to 90% acetonitrile using reverse-phase HPLC equipped with a YMC ODS-AQ column (250 ⁇ 30 mm l.D.). It was purified and freeze-dried to obtain 5 mg of a condensate.
  • ester was dissolved in DMF800 ⁇ , added with piperidine 201, stirred, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • Acetic acid 3001 and methanol 450I were added to neutralize, purified by reverse phase HPLC in the same manner as described above, and lyophilized to obtain 1.5 mg of the de-Fmoc-esterified ester.
  • benzyl ester compound was dissolved in methanol 150 1501 and acetic acid 501, hydrogen gas was added in the presence of about 1 mg of 10% Pd / C, and catalytic reduction was performed with stirring at room temperature for 2 hours. . Purification by reverse-phase HPLC as described above and freeze-drying gave 1 mg of compound (1-14).
  • Step 2 H-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-A1 -Pro-Asp-Trp-OBz1
  • Example 14 10 g of the compound (1-14) obtained in Example 14 was dissolved in DMF 10 ⁇ I, and HOB t 4.3 ⁇ , Py BOP 16.7 g and NMM 4.9 tig were added sequentially under ice cooling. Let stand for minutes. H—G 1 y-0Me ⁇ H Add 4.0 zg of C1 and leave it at 4 ° C for 1 ⁇ . Attach a YMC Pack OD S—AM312 column (150 X6mml. D.) manufactured by YMC in the same manner as in Example 15. The residue was purified by reverse-phase HPLC and freeze-dried to obtain 6 g of the compound (I-16).
  • Step 1 H—Asn-Tyr—Tyr—Trp-OBzl
  • Fmo c—Ty r (t-Bu) 66 Using 110 mg of carrier resin to which zmo 1 is bound, Fmo c—Ty r (t—Bu) monoOH, Fmo c—As n (Tr t) — OH was used to synthesize a peptide in the same manner as in Reference Example 3, and the peptide was cut out from the resin to obtain 89 mg of the crude peptide Fmoc—Asn—Tyr—Tyr—OH Was.
  • Fmo c-Va l— Ty r— Phe— A la— H is— L eu— As (OB z 1)-I 1 e- I 1 e— OH 1 e force ⁇ N-protected amino acid Fmoc-IIe -OH, Fmoc -Asp (OBzl) -OH, Fmoc —Leu -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc- Ala -OH , Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Tyr (t-Bu) -OH, and Fmoc-Val-OH were sequentially condensed for synthesis.
  • the fraction containing the target substance is lyophilized, and Fmo c-Va 1-Ty r-Phe -A 1 a-His-; Leu-Asp (OB z 1)-I 1 e-I 1 e-T 2.7 mg of rp-OB z1 was obtained.
  • HG 1 yA s nT r pH is—G 1 y—Th r -A 1 aP r o-As p-Tr p-Va 1 -Ty r-Phe -A 1 a—Hi s- Synthesis of LeuAsp-I1e-I1e—Trp—OH
  • Fmo c— G ly— OH, Fmo c— H is (Tr t) -OHs Fmo c— Tr OH, Fmo c— As n (T rt)
  • Fmo c— lie— lie— Tr p—OH was prepared in the same manner as in Reference Example 3, using a carrier resin to which Fmo c—T rp was bound, and sequentially as N-protected amino acids, Fmo c—I 1 e—OH And Fmoc-I1e-OH, and the resulting peptide was cleaved from the resin to obtain the above crude peptide.
  • Add 200 11 methanol and 200/1 methylene chloride to 26 zg of this peptide and dissolve them.Methylene chloride containing 7.8 mg / m1 diphenyldiazomethane 301 and 28.6 ⁇ 1 / m1
  • a methanol containing hydrochloric acid 301 was added under ice cooling.
  • Example 20 The mixture was allowed to stand under ice-cooling for a while, returned to room temperature, and left overnight.
  • the insoluble material was filtered, and reversed-phase HP LC (column: YMS—Pack 008_8 ⁇ —32) was used as in Example 20.
  • This was lyophilized Fmo c- I 1 e- I 1 e- T rp- OCHPh 2 to give 7 5 g.
  • 100 ml of dry DMF containing a 20% piperidine solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • insolubles were removed by filtration and purified by reversed-phase HP LC in the same manner as described above.
  • the solvent of the fraction containing the target substance was distilled off under reduced pressure to obtain 32 g of H—I 1 e—I 1 e—T rp—OCH Ph 2 .
  • the compound (I-15) 64 ⁇ g obtained in Example 15 was dissolved in 40 ⁇ 1 dry DMF and prepared with dry DMF under ice-cooling.
  • the mixture was allowed to stand under ice cooling for 2 hours, and the reaction solution was purified by Sakagaya HP LC in the same manner as in Example 15.
  • the solvent of the obtained fraction was distilled off under reduced pressure to obtain 37 g of a benzohydryl ester of a lig compound (1-27).
  • Amino acid analysis A sx l. 7 (2), Gly 2.1 (2), H is O. 9 (1), Thr 1.0 (1), A1a1.0 (1), P ro l. 3 (1), I 1 e 2.0 (2), (T r is not analyzed)
  • Example 15 The compound (I-15) obtained in Example 15 was dissolved in 1001 of dry DMF, and HOB t of 0.72 mg / m 1, PyBOP of 2.8 mg / ml, 1.0 ⁇ 1 / m 1 NMM and 2.5 mgZml of the above peptide were added in order of 50 1 under ice cooling. The mixture was left overnight at 4 ° C., the insolubles were removed by filtration, and the mixture was purified by reversed-phase HPLC in the same manner as in Example 15. The obtained fraction was freeze-dried to obtain 66 g of a benzyl ester of the compound (1-28).
  • Step 1 (1) H—Val—Ty r—Ph—Al a—Ph—Ph—As n—Ty r—Ty r—Tr p—OBz 1
  • Example 15 1001 g of the compound (I-15) obtained in Example 15 was added with 100 1 of dry DMF, and HOB t of 0.72 mg / m 1, PyBOP of 2.8 mg Zml, 1 fi 1 Zm 1 of NMM was added in an order of 501 in a water-cooling order, and 50 1 of a 3.0 mg / m1 dry DMF solution of the partial peptide obtained in the above step 1 was further added.
  • the reaction solution was allowed to stand under ice cooling for 3 hours, insolubles were filtered off, and purified by reversed-phase HP LC (column: YMC 0DS-AM-212).
  • the solvent of the fraction containing the condensate was distilled off under reduced pressure to obtain 110 g of a benzyl ester of the compound (1-33). Then, 50 I of dried 01 ⁇ ? And 50 fi 1 of a methanol solution saturated with ammonium formate were added to the benzyl ester body 110, a small amount of 10% PdZC was further added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 2 hours. . Thereafter, the catalyst was removed by filtration and purified by reverse-phase HPLC in the same manner as described above. The solvent of the fraction containing the desired compound was distilled off under reduced pressure to obtain 2.0 / g of compound (I-33).
  • Step 1 H_Va l— Ty r— Ty r_A l a— H i s— L e u— As p
  • the fraction containing the target substance is lyophilized, and Fmo c-Va 1 -Ty r -Ty rA la—His -L eu -A sp (OB z 1)-1 16_ 1 16- 2.95111 was obtained.
  • Example 15 To the compound obtained in Example 15 (I-15) was added 1001 of dry DMF to 100 zg, and HOBt of 0.72 mgZm1 prepared by dry DMF, PyB ⁇ of 2.8 mg / m1 was prepared. P, l IXml of NMM were added in 50 H1 increments under ice-cooling, and further, 501 of a dry DMF solution of the compound 2.2 mgZm1 obtained in the above step 1 was added. The reaction solution was allowed to stand under ice cooling for 4 hours, and insolubles were filtered and purified by reversed-phase HP LC. The column used was ODS-AM-312 manufactured by YMC.
  • the solvent of the fraction containing the condensate was distilled off under reduced pressure to obtain 74.5 g of a benzyl ester of the compound (I-34). Then, 304.5 g of dry DMF and 30 IL 1 of a methanol solution saturated with ammonium formate were added to 74.5 g of this compound, and a small amount of 10% PdZC was further added, followed by vigorous stirring at room temperature for 2 hours. Thereafter, the catalyst was removed by filtration and purified by reversed-phase HP LC in the same manner as described above. The solvent of the fraction containing the desired compound was distilled off under reduced pressure to obtain 0.74 g of compound (I-34).
  • Step 1 H-Ala-His-Leu—Asp (OBz1) -I1e-I1e-Trp-OBz1
  • the reaction was allowed to proceed at room temperature for 3 hours, the insolubles were filtered off, and the product was purified by reversed-phase HPLC using the same method as in Example 17.
  • the peptide-containing fraction was lyophilized, and Fmoc—A1a—His—Leu—As (OBz1) -I1e-I1e-Trp-OBz1 was added to 5.7. mg.
  • Step 2 Compound (I-35) Embodiment the compound obtained in Example 15 (1-15) 100 / zg in dry DMF 1 30 n 1
  • HOB t of 0.72MgZm 1 prepared in dry DMF, the 2.8111 / / 1111? 780? And 11 Zm 1 were sequentially added under ice-cooling at 50 ⁇ 1 each, and a 6 mg Zml dry DMF solution of the compound obtained in the above step 1 was added in 19/1.
  • the reaction solution was left under ice-cooling for 5 hours, insolubles were filtered off, and purified by reverse phase HPLC in the same manner as in Example 15.
  • the solvent of the fraction containing the condensate was distilled off under reduced pressure to obtain 172 ⁇ g of a benzyl ester of compound (I-35). Then, to 172 g of this compound was added 501 of a methanol solution saturated with 50 / K ammonium formate in dry DMF, a small amount of 10% Pd—C was further added, and the mixture was vigorously stirred at room temperature. Thereafter, the catalyst was removed by filtration and purified by reversed-phase HP LC in the same manner as described above. The solvent of the fraction containing the desired compound was distilled off under reduced pressure to obtain 56 g of the compound (I-35).
  • Step 1 H—Asp (Ot—Bu) -Tr p-Phe-Phe-As n-Tyr-Tyr-Tr p-OBz 1
  • Step 2 HGly-Asn-Tr pH is—Gly—Thr—A1a—A1a—Asp—Trp—Phe—Phe—Asn—Tyr— Ty r— T rp— OB z I
  • step 2 A 500 ⁇ 1 DMF solution containing the compound 600; zg obtained in the step 2 was cooled to 0 ° C., 0.2 ppm of DEPC and 0.41 of TEA were added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 3 days. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by the same method as in step 2 (a) using HPC HPLC to obtain 420 g of a benzyl ester of compound (1-36).
  • Fmoc-Tyr (t-Bu) One OH, Fmoc—Va1—OH, Fmoc—Trp—OH, Fmoc-As p (O t — Bu) — OH, Fmo c — Pro — OH, Fmo c -A 1 a -OH. Fmo c —Th r (t -Bu) -OH. Fmo c — G 1 y -OH. Synthesis was performed using Fmoc—Tis-OH. Fmoc—Trp-OH. Fmoc—Asn (Trt) —OH and Fmoc—Gly—OH.
  • Fmo c— H is (T rt) —OH, Fmo c—Al a— OH , Fmo c—P he—OH, Fmo c—Tyr (t—Bu) -OH, Fmo c—Leu—OH, Fmo c—Trp—OH, Fmo c—A sp (Ot—Bu) -OH.
  • Step 1 H—As n—I 1 e—I 1 e-Trp—OB z 1
  • N-protected amino acids Fmo c—I 1 e and Fmo c—As n (Trt) —OH are sequentially bonded using a carrier resin to which Fmo c—I 1 e is bonded.
  • a protected peptide was synthesized and cleaved from the resin to obtain a crude peptide Fmoc-Asn-I1e-I1e-OH. 5.8 mg of the obtained present peptide was dissolved in 1 ml of DMF, 10.4 mg of PyB0P, 2.7 mg of HOBt, and NMM4.4 ⁇ 1 were added, and the mixture was allowed to release at room temperature for 5 minutes.
  • Step 1 Fmo c-G 1 y-As p (OBz I)-Tr p-His-G 1 y-Th r-A 1 a-OH
  • Fmo c—A ia 60 ⁇ mol was formed in the same manner as in Reference Example 3.
  • N-protected amino acids are sequentially used as Fmo c—Th r (t—Bu) —0H, Fmo c—Gly—0H, and Fmo c—His (T rt) -0H, Fmoc-Tr p-0H, Fmoc-Asp (OB zl)-0H, Fmoc-Gly-0H to synthesize a protected peptide, cut out from the resin, and Purification by HPLC in the same manner as described above gave 40.5 mg of the title compound.
  • Step 2 HG 1 y—As p (OB z 1) -Tr p—His—Gly—Th r—A 1 a—P ro—A sp—T rp—OB z 1 (N0 2 )
  • the precipitate formed by adding 1 is collected by filtration, dried, and subjected to H—Trp-OBz 1
  • Step 1 Synthesis of Fmo c—G 1 y—A s n—T rp—Lys (Z) -G 1 y -Thr -A 1 a—OH
  • Fmoc-Thr (t-Bu) was used as an N-protected amino acid sequentially using 10 Omg of a carrier resin to which Fmoc—A1a60 ⁇ mo1 was bound.
  • a carrier resin to which Fmoc—A1a60 ⁇ mo1 was bound.
  • Fmoc—Gly—0H The peptide was cleaved from the resin and purified by HPLC in the same manner as in Example 17 to obtain 9.9 mg of the title compound.
  • Step 2 H_Gly-Asn—Trp-; Lys (Z) -G1y-ThhrAlaPro-Asp-Trp-OBz1 (NO2)
  • HGlyAsp-Tr pH is—Gly—Thr—Ala—Pro—Asp—Trp—Val—Tyr—Phe-Ala—His- Synthesis of L e uA sp-I 1 e-I 1 e -T r -OH
  • Fmo c— G ly— 0H, Fmo c—H is (Tr t) -OH.
  • Fmo c— Tr p— 0H, Fmo c— As p (0 t—Bu) — 0H, Fmo c—G 1 y—OH was used to synthesize a protected peptide, and only the final step was different from that in Reference Example 3 in that the piperidine treatment (b) was performed.
  • the peptide was cut out from the resin in the same manner as in Reference Example 3 to obtain 19.2 mg of crude peptide.
  • 6.2 mg was purified by reverse phase HP LC in the same manner as in Example 17 and lyophilized to obtain 1.24 mg of a purified product.
  • I 1 e— OH, Fmo c-As p (O t—Bu) — OH, Fmo c— Le u— OH, Fmo c— H is (Tr t) _OH, Fmo c— A la— OH, Fmo c— Ph e—OH, Fmo c—Ty r (t-Bu) -OH, Fmo c_Va l—OH, Fmo c—Tr p— ⁇ H, Fmo c—As p (O t—Bu) —OH, Fmo c — P ro— OH, Fmo c— A la— OH, Fmo c— Th r (t -B u) -OH.
  • step (e) The carrier resin was washed with DMF for 1 minute, and this was repeated 5 times. Thus, Fmoc—A1a—A1a was synthesized on the carrier. Next, after performing the washing and deprotection steps of (a) to (: c) above, a condensation reaction is performed in step (d) using Fmoc—Thr (t—Bu) —OH. Then
  • step (d) Fmo c—G 1 y—OH and Fmo c—H is (T rt) —OH, Fmo c—T rp—OH, and Fmo c—A sn (Tr t) —OH And Fmo c—G 1 y—OH were used.
  • the piperidine treatment in step (b) was not performed only in the final step of condensing Gy.
  • the obtained carrier resin was washed with methanol and butyl ether, and then dried under reduced pressure for 3 hours. To this was added 200 £ of a mixed solution of 90% TFA, 5% thioanisole and 5% 1,2-ethanedithiol containing 2-methylindole in the ratio of SmgZmf, and the mixture was left at room temperature for 2 hours. Peptides were cut out of the resin. The resin was then filtered off, approximately 1 Omi of ether was added to the resulting solution, and the resulting precipitate was filtered off as 23 mg of crude peptide by filtration. This crude product was applied to a column (column; Chemc o Pack, NUCLEO SIL 5C18 250 x 20 mml.
  • Fmoc—Ile31 1 ⁇ mol was combined with 7 Omg of the carrier resin, and as N-protected amino acids, Fmoc—Val_OH and Fmoc-Asp (OB z 1) — OH, Fmo c Gin (T rt) -OH.
  • Fmo c— H is (Tr t) -OH.
  • Amino acid analysis A la 1.0 (1), As 1.0 (1), His 0.9 (1), G 1 x 1.0 (1), I 1 e 0.8 (1), Le eu 0.8 (1), P he 0.9 (1), T yr 1.0 (1), Va 10.7 (1)
  • Rooster ij type amino acid Number of chains: single strand
  • HG 1 y-Asn-Trp-Hi sG 1 y-Th r- Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Phe —A 1 a— H is -L eu— As p— I 1 e-I 1 e— Tr p— OH Rooster Number: 1 o

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
エン ドセリ ン拮抗べプチド
技術分野
本発明は、 ェンドセリン拮抗作用を有する新規べプチドおよびその 合成中間体に関する。 本べプチドは優れたェンドセリン拮抗作用を有 し、 高血圧、 喘息、 脳卒中、 狭心症、 急性腎不全、 心筋梗塞、 脳血管 攣縮などの治療剤として有用である。
背景技術
ェン ドセリ ンは強力かつ持続的な血管収縮作用を有する環状べプチ ドであり、 高血圧、 喘息、 急性腎不全、 心筋梗塞、 脳卒中、 狭心症お よび脳血管攣縮に関与する物質の一つと考えられている。 したがって、 ェンドセリンに拮抗しこの作用を阻害する物質はこれらの病気の治療 ならびに予防において有用と期待される。
従来式 （A) で表わされる環状ペプチドは、 エン ドセリ ン拮抗作用 を示すことが知られている （特開平 3— 130299号公報） ：
U-Leu — D -Trp(R') -D -Glu(0R2) -Ala
(A)
(式中、 Uは D- Val または D- alio- Ile、 R1は水素またはァミノ保護基、 は水素またはカルボキシル保護基を意味する） 。
発明の開示
本発明者らはェン ドセリ ン拮抗作用を示す生理活性物質を天然界ょ り見いだすことを目的に、 数多くの微生物の生産物について研究を重 ねた結果、 土壌より新たに分離したストレブトマイセス属に属する微 生物の培養物からェンドセリン拮抗作用、 ェンドセリンによる細胞内 カルシウム濃度上昇抑制作用および細胞内グアノシン一 3 ' ， 5 ' — 環状一リン酸濃度抑制作用などを有する物質を単離し、 RE S— 7 0 1 1、 RE S— 7 0 1— 2および RE S— 7 0 1 - 3と命名した。 さ らに研究を重ねた結果、 これらの物質の構造を決定するとともに、 こ れらの化合物の新規誘導体も合成し、 本発明を完成した。
本発明によれば、 下記式 （I ) で表わされるペプチド化合物または その薬理学的に許容される塩が提供される ：
X— A— Trp— B— G l y— Th r— E— G— Y ( I ) 中、
Aは As n または As p を表わし、
Bは Hi s または Ly s を表わし、
Eは Al a または S e r を表わし、
Gは A l a または P r o を表わし、
X2
I
Xは X1 — Gl yまたは X3 —Cysを表わし、
Y1 Y2
I
Yはヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ァミノ、 As p Zまたは C y s 一 Zを表わし、
〔ここで、 X1 および X:' は水素、 ベンジルォキシカルボニル、 t一 ブチルォキシカルボニル、 9—フルォレニゾレメチノレオキシカルボニル またはカルボニル置換もしくは非置換の低級アル力ノィルを表わし、 2 および Y2 は水素を表わし、
Y' はヒドロキシ、 低級アルコキシまたはアミノを表わすか、 または X1 、 Y1 および X2 、 Y" はそれぞれ一緖になって X'-Y1 お よび 2 - Υ2 力 ί単結合を表わし、
Ζはヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジルォキシ、 ベンズヒドリル ォキシ、
G 1 y-Z' (式中、 Z1 はヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジル ォキシまたはべンズヒドリルォキシを表わすか、 X1 と一緒になつて x' — z1 が単結合を表わす） 、
A-1 a— Z' (式中、 Ζ' は前記と同義である） 、 V a 1 -Z 1 (式中、 Z1 は前記と同義である） 、
Tr p— Z1 (式中、 Z' は前記と同義である） 、
T r p-G 1 y-Z' (式中、 Z' は前記と同義である） 、
Tr p-As n-Ty r-Ty r-Tr -Z1 (式中、 Z 1 は前記 と同義である） 、
Tr p-Ph e-Ph e-As n-Ty r-Ty r-7Hy t -Z' , (式中、 Z1 は前記と同義であり、 7 Hy tは 7—ヒドロキシトリプ トファンを表わす） 、 .
T r p - I 1 e - I 1 e Tr p— Z' (式中、 Z' は前記と同義で ある） 、
Tr p-Va l -Ty r Ph e— W— H i s— L e u— As p— I 1 e— I 1 e— T r p Z1 (式中、 Z' は前記と同義であり、 Wは A 1 a、 S e rまたは C y sを表わす） 、
T r p -W-H i s-L e u-As p- I 1 e - I 1 e— Tr p— Z' (式中、 Z' および Wは前記と同義である） 、
Tr p-Va 1 -Ty r-Ty r -W-H i s—; L e u— As p— l i e— l i e—T r p— Z1 (式中、 Z ' および Wは前記と同義で ある） 、
Tr p-Le u-Ty r一 Ph e— W— H i s— G i n— As p— Va l— l i e— Tr p— Z' (式中、 Z 1 および Wは前記と同義で ある） 、
Tr p-Va 1 -Ty r-Ph e -W- Ph e— Ph e— As n— Ty r-Ty r-Tr p-Z1 (式中、 Z1 および Wは前記と同義で ある） 、
Tr p-Ph e-Ph e-As n-Ty r-Ty r -W-H i s - L e u— As p— I 1 e - I 1 e— Tr p— Z' (式中、 Z 1 および Wは前記と同義である） 、
Tr p— Ph e— Ph e— As n— Ty r— Ty r— As n— I 1 e - I 1 e-Tr ρ-Ζ' (式中、 Z' は前記と同義である） 、 または J-P h e -M-Q-Ty r一 R— T一 Z 1
(式中、
Jは Trpまたは単結合、
Mは P heまたは単結合、
Qは As nまたは単結合、
Rは Ty rまたは単結合、
Tは Trp、
A 1 a、
Ph e、
Ty r,
T r p— T r p、
As n— Tyr— Ty r— Trp、
Trp— As n— Ty r— Ty r— Trp、
Trp -V a 1 -Tyr-Phe -W- Hi s -L e u -
As p— l i e— l i e— Tr p (式中、 Wは前記と同義であ る） 、
または単結合を表し、
J、 M、 Q、 Rおよび Tの少なくとも 2つ以上が同時に単結合を表わ すことはなく、 Ζ1 は前記と同義である） 〕 } 。
また、 本発明により式 （I) で表わされるペプチド化合物を合成す るために有用な、 下記式 （H) で表わされる中間体が提供される： X4 - J-P h e -M-Q-Ty r - R-T-ZJ (Π) (式中、 X4 は水素、 ベンジルォキシカルボニル、 tーブチルォキ シカルボニルまたは 9一フルォレニルメチルォキシカルボニルを表わ し、 Z2 はヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジルォキシまたはベン ズヒドリルォキシを表わし、 J、 M、 Q、 Rおよび Tは前記と同義で あ «) ο 以下上記式 （I) で表わされるペプチド化合物を化合物 （I) とい い、 他の式番号の化合物についても同様である。
上記式 （I) および （Π) の定義において、 低級アルキルおよび低 級アルコキシのアルキル部分は、 直鎖もしくは分岐状の炭素数 1〜6 の、 例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソ ブチル、 sec-ブチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 ネオペンチル、 へキ シル、 イソへキシル等が挙げられ、 低級アルカノィルは、 直鎖もしく は分岐状の炭素数 i〜6の、 例えば、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオ ニル、 ブチリル、 バレリル、 ビバロイル、 ペンタノィル等が挙げられ o
化合物 （I) の薬理学的に許容される塩としては、 酸付加塩、 金属 塩、 有機塩基付加塩が挙げられる。 具体的には、 薬理上許容される酸 付加塩としては、 塩酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩等の無機酸塩、 酢酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 酒石酸塩、 クェン酸塩等の有機酸塩が挙 げられ、 薬理上許容される金属塩としてはナトリウム塩、 カリウム塩 等のアルカリ金属塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩等のアルカリ土 類金属塩、 アルミニウム塩、 亜鉛塩等が挙げられる。 薬理上許容され る有機塩基としてはメチルァミ ン、 ェチルァミ ン、 ァニリン等の一級 ァミン、 ジメチルァミ ン、 ジェチルァミン、 ピロリジン、 ピぺリジン 、 モルホリン、 ピペラジン等の二級ァミ ン、 トリメチルァミン、 トリ ェチルァミン、 N， N—ジメチルァニリン、 ピリジン等の三級アミン およびアンモニア等が挙げられる。
次に化合物 （I) および （Π) の製造法について説明する。
化合物 （ I ) 中、 下記の構造を有する R ES- 70 1 - 1, RES— 70 1— 2および RES— 70 1一 3については、 ストレプトマイセ ス （Streptomyces) 属に属し、 RES— 7 0 1— 1生産能、 RES— 70 1一 2生産能および RE S -70 1 - 3生産能を有する微生物を 培地に培養し、 培養液中に RE S— 70 1— 1、 RES— 70 1— 2 および RE S— 70 1 - 3を生成蓄積させ、 該培養物から RES— 7
0 1— 1、 RES— 70 1— 2および RES— 7 0 1一 3を採取する
ことによって製造される。
RES- 70 1 - 1
- Gly-Asn -Trp -His -Gly -Thr -Ala -Pro -Asp
Trp -Phe — Phe -Asn -Tyr 一 Tyr -Trp -OH
RE S - 7 0 1 - 2
- Gly-Asn -Trp -His -Gly -Thr -Ala -Pro 一 Asp
Trp -Phe -Phe -Asn -Tyr -Tyr -7Hyt-0H
RE S - 7 0 1 - 3
Gly-Asn -Trp -His -Gly -Thr -Ser -Pro -Asp
-Trp -Phe -Phe -Asn 一 Tyr -Tyr —Trp -OH 具体的に好適な例として、 本発明者らにより愛知県北設楽郡付近の
土壌より新たに採取したストレブトマイセスに属する放線菌ストレブ
トマイセス ·エスピー RE— 7 0 1株および山口県都濃郡付近の土壌 ¾ より新たに採取した RE— 6 2 9株が挙げられる。
ストレブトマイセス · エスピー RE— 7 0 1株の菌学的性質は以下の
通りである。 I . 形態
RE- 7 0 1株は、 一般に使用されている寒天培地で、 隔壁を有し、 分岐する気中菌糸および基生菌糸を形成する。 なお、 基生菌糸の特徵 的な分断はみられない。 また、 胞子 ΐおよび菌核の形成は見いだされ ない。
胞子は気中菌糸より単純分枝した胞子柄に 10個以上の長い鎖状に形 成され、 その形態は屈曲状あるいは螺旋状である。 成熟した胞子は大 きさが 0. 4〜0. 5 /z m x 0. 6〜0. 8〃mの楕円形であり、 その表面は 平滑で鞭毛を持たない。
I I. 各種培地上での生育状態
RE— 701株は、 一般に使用されている合成および天然培地で普通も しくは旺盛な生育を示し、 灰色系統の気中菌糸を形成する。 一方、 基 生菌糸は灰白色から茶色を示す。 可溶性色素はほとんど生産されない。 各種培地上での 28°C、 10日間培養したときの生育および色の特徴を 下記に示す。 なお、 色の表示は Color Hormony Manual (Container Corporat i on of Ameri ca) (こよる色の分類 ίこ従った。
1. グルコース · ァスパラギン寒天培地
生育、 裏面の色：普通、 パティ一 （1 l/2ec)
気中菌糸：普通、 ホワイ ト (a)
可溶性色素：無し
2. グリセロール ' ァスパラギン寒天培地
生育、 裏面の色：貧弱、 オイスターホワイ ト (b)
気中菌糸：やや貧弱、 ホワイ Ma)
可溶性色素：無し
3. シュクロース ·硝酸塩寒天培地
生育、 裏面の色：普通、 パティ一 （1 l/2ec)
気中菌糸：普通、 グレーば）
可溶性色素：無し 4. スターチ ·無機塩寒天培地
生育、 裏面の色：普通、 ライ 卜アンティークゴールド （1 1/2 ic) 気中菌糸：豊富、 グレー (g)
可溶性色素：無し
5. チロシン寒天培地
生育、 裏面の色：貧弱、 ライ 卜タン （3gc)
気中菌糸：貧弱、 ライ トベージュ（3ec)
可溶性色素：無し .
6. 栄養寒天培地
生育、 裏面の色：普通、 ハニーゴールド（2i c)
気中菌糸：やや貧弱、 ホワイ ト (a)
可溶性色素：無し
7. 麦芽エキス ·酵母エキス寒天培地
生育、 裏面の色：良好、 マスタ一ゴールド（2ne)
気中菌糸：普通、 ホワイト (a)
可溶性色素：無し
8. オートミ一ル寒天培地
生育、 裏面の色：やや良好、 ホワイ ト（1 l/21g)
気中菌糸：貧弱、 チヤコールグレー (0)
可溶性色素：無し
III. 生理的性質
RE - 701株の生理的諸性質を以下に示す。 生育温度範囲は 6日間、 そ の他は 2 8 °C、 2週間後の観察結果を記述する。
(1) 炭素源の利用性；基礎培地としてプリ ドハム · ゴッ 卜リーブ無機 培地 （ISP9号） を使用した。
RE - 701株は、 D—グルコース、 D—フラク トース、 シュクロース、 イノシトール、 ラフイノース、 D—マンニトールを資化するが、 D— ァラビノース、 L一ラムノ一スは資化しない。 D—キシ口一スの資化 は不明である。
(2) ミルクに対する作用：凝固あり、 液化無し
(3) 澱粉の加水分解作用：あり
(4) 生育温度範囲： 7 ~ 4 1 °C
(5) メラノィ ド色素の生成：無し
(6) ゼラチンの液化作用：無し
IV. 細胞壁辑成
全菌体加水分解によるジアミ.ノピメリン酸の分析では、 LLージアミ ノビメリン酸のみが検出された。
以上気中菌糸上に形成される胞子鎖およびジァミノピメリン酸の立 体型などから、 本菌株は放線菌の中でス卜レブトマイセス属に分類さ れる。
従って、 本菌株をストレプトマイセス 'エスピー RE- 701 (Streptomyces sp. RE- 701) と命名した。 本菌株は、 平成 3年 1 0月 2 9日付で工業 技術院微生物工業技術研究所に微ェ研条寄第 3624号 （FERM BP- 3624) として寄託してある。
ストレブトマイセス 'エスピー RE— 6 2 9株の菌学的性質は以下の 通りである。
I . 形態
RE- 6 2 9株は、 一般に使用されている寒天培地で、 隔壁を有し、 分岐する気中菌糸および基生菌糸を形成する。 なお、 基生菌糸の特徴 的な分断はみられない。 また、 胞子囊および菌核の形成は見いだされ ない。
胞子は気中菌糸より単純分枝した胞子柄に 10個以上の長い鎖状に形 成され、 その形態は屈曲状あるいは螺旋状である。 成熟した胞子は大 きさが 0. 7〜0. 8 z m x 0. 7〜1. 0 ju mの楕円形であり、 その表面は 平滑で鞭毛を持たない。
I I. 各種培地上での生育状態 R E— 6 2 9株は、 一般に使用されている合成および天然培地で普 通もしくは旺盛な生育を示し、 灰色系統の気中菌糸を形成する。 一方、 基生菌糸は灰白色から茶色を示す。 培地により茶色系統の可溶性色素 が産生されることもある。
各種培地上での 28°C、 14日間培養したときの生育および色の特徵を 下記に示す o なお、 色の表示は Color Hormony Manual (Container Corporation of America) による色の分 ¾に従った。
1. グリセロール ·ァスパラギン寒天培地
生育、 裏面の色：良好、 バンブー （2gc)
気中菌糸：良好、 ナチユラル (2dc)
可溶性色素：無し
2. スターチ ·無機塩寒天培地
生育、 裏面の色：良好、 ダルゴールド（2ng)
気中菌糸：豊富、 シルバーグレー（3fe)
可溶性色素：有
3. 麦芽エキス ·酵母エキス寒天培地
生育、 裏面の色：良好、 オークブラウン（4pi)
気中菌糸：良好、 シルバーグレー（3fe)
可溶性色素：有
4. オートミール寒天培地
生育、 裏面の色：普通、 ォリーブ（1 1/¾)1)
気中菌糸：普通、 ランプブラック (ひ）
可溶性色素：有
I I I. 生理的性質
R E - 6 2 9株の生理的諳性質を以下に示す。 生育温度範囲は 5日 間、 その他は 2 8 °C、 2週間後の観察結果を記述する。
(1) 炭素源の利用性；基礎培地としてプリ ドハム · ゴッ トリーブ無機 培地 （ISP9号） を使用した。 R E - 6 2 9株は、 D—グルコース、 D—フラク トース、 シュクロ ース、 イノシトール、 ラフイノ一ス、 D—マンニトールおよび D—キ シロースを資化する力く、 L一ラムノースは資化しない。 Lーァラビノ 一スの資化は不明である。
(2) 生育温度範囲： 1 3〜 4 3 °C
(3) メラノィ ド色素の生成：
(a)ぺプトン · イースト ·鉄寒天培地：無し
(b)チロシン寒天培地：無し
IV. 細胞壁組成
全菌体加水分解によるジァミノピメリン酸の分析では、 LL—ジァミ ノビメ リン酸のみが検出された。
以上気中菌糸上に形成される胞子鎖およびジァミノピメリン酸の立 体型などから、 本菌株は放線菌の中でス卜レブトマイセス属に分類さ れる。
従って、 本菌株をストレプトマイセス ·エスピー R E— 6 2 9 (Strepto- myces sp. R E— 6 2 9 ) と命名した。 本菌株は、 平成 4年 1 2月 1 7日付で工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研条寄第 4126号 （FE RM BP- 4126) として寄託してある。
R E - 7 0 1株および R E— 6 2 9株の培養に際しては、 放線菌の 培養に用いられる通常の培養方法が適用される。 用いられる培地は菌 の資化しうる炭素源、 窒素源、 無機物等を程よく含有する培地であれ ば天然培地、 合成培地いずれでも用いうる。
炭素源としては、 グルコース、 フラク ト一ス、 シュクロース、 スタ ビロース、 澱粉、 デキストリン、 マンノース、 マルト一ス、 糖蜜等の 炭水化物、 クェン酸、 リンゴ酸、 酢酸、 フマール酸などの有機酸、 メ タノール、 エタノール等のアルコール、 メタン、 ェタン、 プロパン、 n—パラフィン等の炭化水素、 グルタミン酸等のアミノ酸あるいはグ リセロール等が用いられる。 窒素源としては塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモ 二ゥム、 リン酸アンモニゥ厶等のアンモニゥム塩、 ァスパラギン酸、 グルタミン、 シスチン、 ァラニン等のアミノ酸、 尿素、 ペプトン、 肉 エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 コーン ' スチープ ' リカ一、 大豆粉、 綿実粕、 大豆カゼイン、 カザミノ酸、 ファーマメディア （プロクター アンド ギャンブル社製） 等が用いられる。
無機物としてはリン酸一力リゥム、 リン酸ニ力リゥム、 リン酸ニナ トリウム、 硫酸マグネシウム.、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 硫酸コバルト、 硫酸亜鉛、 パントテン酸カルシウム、 モリブデン酸ァ ンモニゥム、 硫酸アルミニウムカリウム、 炭酸バリウム、 炭酸カルシ ゥ厶、 塩化コバルト、 食塩等が用いられる。
その他必要に応じて培地にサイアミンなどのビタミン等菌体の增殖 あるいは RES— 70 1— 1、 RES— 7 0 1一 2および RES— 7 0 1一 3の生産を促進する物質を加えることができる。
用いられる微生物が特定の物質を要求する場合は、 もちろん生育に 必要な物を加えることが必要である。
培養は振盪培養法、 通気攪捽培養法等により、 20〜40°Cの温度 で中性付近の pHで行われる。 3〜7日の培養によって RE S— 70 1— 1、 RES— 70 1— 2および RES— 7 0 1 - 3の蓄積量が最 大に達し、 培養は完了する。
培養物中に蓄積した RES— 7 0 1— 1、 RES— 7 0 1— 2およ び RES— 7 0 1— 3を培養液から単離採取するに際しては、 通常の 培養液から生理活性物質を採取する方法が適用される。 菌体内に蓄積 した RES— 701- 1、RES— 7 0 1—2および RES— 7 0 1—3を 菌体から単離採取する際には、 通常の生理活性物質を菌体から採取す る方法が適用される。 例えば培養物から濾過、 遠心分離などにより菌 体を取得し、 メタノール、 アセトンなどの有機溶媒を用いて抽出する。 ついで、 抽出物を分配、 吸着樹脂、 シリカゲル、 化学修飾シリカゲル、 逆相シリカゲル、 アルミナ、 セルロース、 珪藻土、 珪酸マグネシウム、 イオン交換樹脂、 あるいはゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーも しくは薄層クロマトグラフィーにより精製して RES— 7 0 1— 1、 RE S— 7 0 1— 2および RE S— 7 0 1— 3を得ることができる。 上記工程中の RE S— 7 0 1— 1、 RE S— 7 0 1— 2および RE S - 7 0 1 - 3の検出は、 シリカゲル薄層クロマトグラフィ一上で展 開後、 ヨウ素反応または 5 0 %硫酸を噴霧し加熱により呈色すること によるか、 あるいは、 C— 18逆相シリカゲルカラムを用いた高速液体 クロマトグラフィー （以下 HP LCという） で波長 253.7nm の吸収を 測定することにより行う。
また、 化合物 （I) および （Π) は上記微生物を培養することによ り製造される RES— 7 0 1— 1、 RE S— 7 0 1— 2および RE S - 7 0 1一 3を含め、 合成的手段により製造することもできる。
すなわち、 本発明の化合物 （I ) および （Π) は Applied Biosy- stems, Inc., U.S. A (ABI 社） 製ペプチド合成機又は島津製作所製べ プチド合成機上にて、 適当に側鎖保護した N 一 t—プチルォキシカ ルポ二ルーァミノ酸等を用いるか、 あるいは適当に側鎖保護した N 一 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルーァミノ酸等を用い、 同 社の合成プログラムに従い、 合成することにより得られる。
また化合物 （ I ) 中の環状ペプチドは、 適当に側鎖保護した部分べ プチドを上述の合成機あるいは一般的な液相べプチド合成法 （ "ぺ プチド合成の基礎と実験" 泉屋信夫ら、 丸善） にしたがって下記のよ うに合成し、 ベンゾトリァゾ一ルー 1ーィルーォキシートリス一ピロ リジノーフォスフォニゥムへキサフルオロフォスフェート （PyBOP)等 の縮合剤を用い、 環化部分ペプチドを得て、 さらにペプチド合成機あ るいは液相合成法を用い、 あるいは両法を適宜組合わせて得られる C 末側ペプチドを縮合することにより得られる。 なお、 C末側ペプチド としては、 例えば化合物 （Π) が有効に使用できる。 部分べプチド
環化反応
H-X,-X2-X3 --Xn-2-X„ i- .-OH ' X2 + C末側ペプチド
' X.
Xn 2-X„. !-Xn-OH Η-Υ,-Υ2-Υ3 --Υ„-Ζ-Υη .-Υη-ΟΗ 縮合反応
Figure imgf000016_0001
Xn -- 2~Xn 1 - Xn - Y〗 - Y2-丫3 Yn 2-Yn ,-Yn-OH 化合物 （I) および （Π) の原料となる保護アミノ酸は、 AB I社、 島津製作所、 国産化学㈱、 Nova biochem社およびペプチド研究所㈱か ら入手することができる。
この様にして得られる化合物 （I) および （Π) は、 逆相系カラム を用いた H PLCあるいは前記した各種クロマトグラフィ一により精 製することができる。
化合物 （I) の薬理上許容しうる塩を取得するときは常法に従う。 すなわち、 化合物 （I) の酸付加塩および有機塩基付加塩は、 対応す る酸あるいは有機塩基の水溶液に化合物 （I) を溶解し、 凍結乾燥す ることによって得られる。 また化合物 （I) の金属塩は、 対応する金 属イオンを含む水溶液に化合物 （I) を溶解しゲル濾過もしくは HP LCで精製することによって得られる。
次に化合物 （I) および （Π) の具体例を第 1表に示す。 化合物番号
(実施例 No. )| ァ ミ ノ酸配列
配列番号
I一 1
RES- 701- 1
(1) · (5) Gly - Asn — Trp -His 一 Gly -Thr -Ala -Pro -Asp
-Trp -Phe -Phe -Asn -Tyr —Tyr -Trp 一 OH
I - 2
RES- 701- 2
(2) - Gly— Asn -Trp -His -Gly -Thr -Ala -Pro -Asp
Trp —Phe — Phe -Asn -Tyr 一 Tyr -7Hyt-0H
I - 3
RES- 701 - 3
(3) Gly— Asn -Trp -His -Gly -Thr —Ser -Pro -Asp
-Trp —Phe -Phe -Asn -Tyr —Tyr -Trp 一 OH
I一 4 H-G 1 y— As n— Tr p— H i s— G l y -Th r - (4)
配列番号 1 A 1 a— P r o— As p— Tr p— Ph e— Ph e— As n
一 Ty r— Ty r— Tr p— OH
I一 5 c y c l o (G l y— As n— Tr p— H i s— G l y—
(5)
配列番号 2 Th r— A l a— P r o— As p— T r p— Ph e— Ph e
一 As n— Ty r— Ty r— Tr p)
I - 6 H— Cy s— As n— Tr p— H i s— G l y— Th r—
(6)
配列番号 3 A l a— P r o— Cy s— Tr p— Ph e— Phe— As n
-Ty r-Ty r-Tr p-OH
.7 H -Cys -Asn -Trp —His -Gly —Thr -Ala -Pro —Cys — (7) I I
Trp -Phe -Phe 一 Asn -Tyr -Tyr -Trp -OH
8 CHaCO -Cys -Asn —Trp -His -Gly -Thr -Ala -Pro 一 Cys
(8) 一 Trp -Phe —Phe -Asn -Tyr -Tyr -Trp —OH
I [一 9 H-T r p— Ph e— Phe— As n— Ty r -Ty r
.· (9) -Tr - OH
配列番号 4 - _ I化合物番号
(実施例 Ν )| ァ ミ ノ酸配列
配u J 1列番号
Π— 10 H-Tr -Phe-As n-Ty r-Tyr-Tr p -OH (10)
配列番号 5
Π— 11 H-Trp-Phe-Phe-As n-Ty r-Tr 一 OH (11)
配列番号 6
1-12 H-Trp-Phe-Phe-Ty r-Tyr-Tr 一 OH ひ2>
配列番号 7
Π— 13 H-Phe-Phe-As n-Ty Ty r-T r p -OH Q3)
配列番号 8
I -14
(14)
L-GIy-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-OH
I一 15
(151
•-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-OH
■16
Q6)
L-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Gly-OCH.-,
I -17
(17)
LGly-Asn-Trp-His-Gly-T r-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe- Asn-Tyr-Tyr-OH
Kily-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe- Asn-Tyr-Tyr-Trp-Trp-OH
Figure imgf000018_0001
LGly- Asn-Trp- His- Gly-Thr- Ala- Pro-Asp- Trp-Phe- Phe- Asn-Tyr-Tyr-Trp-Asn-Tyr-Tyr-Trp-OH
I -20
(20)
L-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe- Asn-Tyr-Tyr-Trp-Va 1 -Tyr-Phe- Ala- Hi s- Leu- Asp- 11 e- Ile-Trp-OH
OShe Gv PAlaHlnAa-—l- if er AsnT AaroAsTrli}>l-lI—- 圑
へ I
CO CO t Γ t tNO t Γ
CO oo 哪 CO CO 3 tv
離 郝
CO • jn π p TrH Ala roAS-l- t 一
^3
•a
Figure imgf000019_0001
CD pypPprh GlAsTH ≥roASTnrapl------ yys AnTTArrla--- pypPrGAs AroASTlnTrHlap L-l--l-
r
Figure imgf000020_0001
化合物番号
(実施例 No. )| ァ ミ ノ酸配列
配列番号
I -38 H-G 1 y— As n— Tr p - H i s— G 1 y-Th r - (38)
配列番号 11 A 1 a— P r o— As p— Tr p—； L e u— Ty r— Ph e
-A 1 a— H i s— G l n— As p— Va 1 - I 1 e— T r p -OH
I一 39
(39)
LGly- Asn- Trp- His- Gly- Thr-Ala- Pro- Asp- Trp- Phe- Phe- Asn-Tyr-Tyr-Asn-I le-I le-Trp-OH
I一 40
(40)
Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe- Asn- Tyr- Tyr- Ala- His- Leu- Asp- lie- lie- Trp - OH
I -41
(41)
LGly- Asp- Trp- His- Gly- Thr- Ala- Pro- Asp- Trp- Va卜 Tyr- Phe-Ala-His-Leu-Asp- I le-I le-Trp-OH
I一 42
(42)
Gly- Asn- Trp- Lys- Gly- Thr- Ala- Pro- Asp- Trp- Va卜 Tyr - Phe- Ala- His- Leu- Asp- lie- lie- Trp- OH
I -43 H-G 1 y— As p— Tr p— H i s -G 1 y-Th r (43)
配列番号 12 -A 1 a-P r o-As p-T r p-Va 1一 Ty r—
Ph e— A l a— H i s—； Le u— A s p— I 1 e
I 1 e -T r p -OH
I一 44 H-G 1 y— A s n— Tr p— Ly s— G l y -Th r (44)
配列番号 13 一 A l a— P r o— As p - Tr p— Va 1— Ty r—
Ph e— A l a— H i s— L e u— As p— I 1 e— I 1 e— T r p— OH 次に代表的な化合物 （I ) の薬理作用について試験例で説明する。 試験例 1. ェンドセリンによる細胞内カルシウム濃度上昇に対する化 合物 （ I ) の抑制作用
ラッ 卜胸部大動脈平滑筋由来の細胞株 A10(ATCC CRL 1476)を 1 0 % 牛胎児血清 （ハイクローン社製） 入りダルベッコ変法イーグル培地
(日水製薬株式会社製） を用いて、 底がカバーガラスのデイシュに接 着培養し実験に用いた。 培養細胞を生理的実験液 〔NaCl 130mM, KCI 2. 5mM, CaCU ImM, MgS04 Im , NaH2P04 lmM, N— （2—ヒ ドロキシ ェチル） 一ピペラジン一 — 2—エタンスルホン酸 (HBPES) lOmM, グルコース 15mM，牛血清ァルブミン BSA(シグマ社製） 2 xas/id, p H 7. 4} で洗浄後、 fura-2/ΑΜ (カルシウム蛍光指示薬、 同仁化学研究 所製） 10 Mを加え 1時間ィンキュベ一トした。
生理的実験液で洗浄後、 化合物 （ I一 1 ) (最終濃度 1 を 含む実験液 1 τ ^あるいは化合物 （I一 1 ) を含まない実験液 1 ^でデ ィッシュを満たし、 エンドセリン （最終濃度 0. 3 nM) を添加した。 励 起波長 340nmおよび 380nmの紫外光による 510nmの蛍光強度を ARGUS2 00システム （浜松ホ卜ニタス社製） で測定することにより、 個々の細 胞の細胞内カルシゥム濃度およびその変化を測定した。
^口
化合物 （ I一 I ) 無添加群 （細胞数 2 0 1個） と試験化合物 （ I一 1 ) 添加群 （最終濃度 1
Figure imgf000022_0001
細胞数 1 7 1假） でェンドセリン (最終濃度 0. 3 n ) 添加による細胞内カルシウム濃度の増加量を測定 したところ、 化合物 （I一 1 ) 存在下での細胞内カルシウム濃度の増 加量は化合物 （ I一 1 ) が存在しない場合の細胞内カルシウム濃度の 增加量の 4 6 %であつた。
試験例 2. ェンドセリン受容体拮抗作用
4 °Cにて牛肺臓組織を緩衝液 A ( 1 m NaHC03、 5mM エチレンジァ ミン 4酢酸、 5 /gZm ロイぺプチン、 5 /igZ ぺプスタチン A、 4 0 Μ フヱニルメチルスルフォニルフルォリ ド、 ρΗ 8.3) 中ポリ トロン （タイプ PT10/35 Kinematica Gmbh 社製） を用いて均質化し o
得られた懸濁液を 4 °Cにて 8 000 gで 10分間遠心分離し、 得られた 上清液を 4°C 40 000 gで 60分間遠心分離し、 固形物を得た。 得られ た固形物を緩衝液 Aに懸濁し、 再び 4 °Cにて 40, 000 gで 60分間遠心分 離した。 得られた固形物をタンパク質含量が 2 mgZ となるように懸 濁溶液として調製し、 膜画分液とした。 緩衝液 B (50mMトリス—塩酸、
1 エチレンジァミン 4酢酸、 0.2%牛血清アルブミ ン、 pH7.6) 1 ^ あたり膜画分液 7 ^を加えて膜画分溶液を調製した。
非標識ェンドセリン一 1 (最終濃度 ΙΟΟηΜ)添加または化合物 （ I一
1 ) 添加または化合物 （I一 2) 添加またはいずれも無添加の膜画分 溶液に ' 25 I—エンドセリン一 1 (約 30 OOOcpm)を加えた。 これら混 合物を 2 5 °Cにて 2時間静置した後、 グラスフィルター GF/B (Whatman 社製） にてろ過した。 フィルターを緩衝液 C (50m トリスー塩酸、
1 mM エチレンジァミン 4酢酸、 PH7.6)にて洗浄後、 グラスフィルタ 一上の放射活性を測定し、 受容体および非特異的に結合した — ェンドセリン量を測定し、 以下の式にしたがってェンドセリン受容体 結合阻害率を計算した。
阻害率 = (C- A/C-B) 1 0 0 (%)
A： RES- 701- 1 または RES- 701- 2 存在下の放射活性
B ：非標識ェンドセリン一 1存在下の放射活性
C ： RES- 701- 1 RES-701-2 、 非標識ェンドセリンー 1いずれも無添 加での放射活性
±±ロ 里术
ェンドセリンー 1の結合を 50%阻害する RES- 701- 1 の濃度（IC5。）は 25nMであり、 エンドセリン一 1の結合を 5 0 %阻害する RE S— 701 一 2の濃度 （I ,。） は 55nMであった。 試験例 3. エンドセリ ンによる細胞内グアノシン一 3'， 5'—環状一リ ン酸濃度上昇に対する化合物 （I ) の抑制作用
Ishi i ら CT e Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 259, 3 , 1102- 1108 (1991) 〕 の文献記載の方法により評 価を ί亍つた。
化合物 （ I一 1 ) (最終濃度 3 または化合物 （ I一 2 )
(最終濃度 3 pg/τπί) を含む実験液あるいはいずれも無添加の実験液 に、 エンドセリ ン一 1 (最終嬝度 I nM) を添加した。 Cycl ic GM P Assay Ki t (ャマサ醬油製） で細胞内グアノシン一 3'， 5'—環状ーリ ン酸濃度を測定することとにより、 その変化を測定した。 化合物 （ I— 1 ) 3 存在下でのェンドセリン 1 nMによる細胞 内グアノシン一 3'， 5'—環状ーリン酸濃度の增加量はェンドセリ ン 1 nM単独添加による細胞内グアノシン一 3'， 5'—環状一リン酸濃度の増 加量の 0 %であつた。 化合物 （ I一 2 ) 3 Ζτ^存在下でのェンドセ リン Ι ηΜによる細胞内グアノシン一 3'， 5'—環状一リン酸濃度の増加 量はェンドセリン I nM単独添加による細胞内グアノシン一 3'， 5 —環 状一リン酸濃度の増加量の 1 7 %であった。 化合物 （ I一 1 ) 3 Z および化合物 （ I一 2 ) 3 の投与によってェンドセリン 1 nM による細胞内グアノシン一 3'， 5f—環状一リン酸濃度の上昇が抑制さ れた。
試験例 4. エンドセリンレセプタ一拮抗作用
試験例 2における牛肺臓組織を牛小脳組織に変え、 試験化合物とし て、 第 2表に示す化合物を使う以外は試験例 2と同様の方法により、 ェンドセリン受容体結合阻害率を求めた。
結果を第 2表に示す。 2 表
Figure imgf000025_0001
*エンドセリン— 1結合を 5 0 %阻害する濃度
試験例 5. エンドセリンによる気道収縮に対する化合物 （ I ) の抑制 作用
本発明化合物の ^における気道収縮抑制作用を C. トウべィ ら 〔 Touvay et. al. , European Journal of Pharmacology, 176 23- 33(1990)〕 の文献記載の方法を一部改変した方法により評価した。 即 ち、 予めプロプラノロール （3ingZkg) を静脈内投与し /3遮断状態に した Hartley 系雄モルモッ トを用い、 麻酔した後気管力ニューレを揷 入固定し人工呼吸器に接続した。 次に Gallamine triethiodideCSigma 社製） で自発呼吸を停止した後、 一定流量で人工呼吸を行った。 気管 力ニューレの側路に呼吸用量の測定装置を接続し、 気道の収縮によつ て変化する空気流出量を測定し気道収縮の指標とした。 ェンドセリン -3 (1.5 jttmol / i ；ペプチド研究所製） を体重 1 00 g当たり 0.1； ^静脈内に注入した。 注入直後から気道収縮 （空気流出量が増加） が認められ、 30秒および 3分をピークとする初期と遅発の二相性の 気道収縮反応が惹起された。 この気道収縮反応に対し、 化合物 （I一 1) の溶解液 （ジメチルスルホキシド：生理食塩水 =1 ： 1) をェン ドセリン一 3を注入する前に静脈内に投与しておくと、 溶解液のみを 投与したコント口一ルに比べ気 _道収縮反応が抑制された。
化合物 （ I— 1 ) の気道収縮抑制作用の評価は、 ェンドセリンー 3 注入後 30秒 （初期相） および 3分 （遅発相） の 2点で行い、 抑制率 は以下の式に従って算出した。
抑制率 （％) = (a— b) /b X 100
a ：化合物 （ I一 1 ) 非投与群 （コントロール） の気道収縮 b ：化合物 （ I一 1 ) 投与群の気道収縮
抑制率 （％)
初斯栢 遅発相
m Zkg， L V. ) (30秒） (3分） ィ匕合物 (1-1) 0.1 12.5 44.0
0.3 46.0 52.7
1.0 91.8 78.2 この結果により、 化合物 （1— 1) 力《生体内においてもエンドセリ ンー 3に对する拮抗作用を有し、 気道収縮を抑制することが確認され 試験例 6. 急性毒性
体重 20±1 gの ddy系マウス 3匹からなる投与群に化合物 （I一 1) を腹腔内投与した。 投与後七日間死亡例を観察し最小致死量 （MLD)を 求めた。 結果は 30 0 mg/kg以上であった。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例で、 使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号 は生化学命名に関する I UP AC— I UB委員会 （IUPAC- IUB Co画卜 ssion on Biochemical Nomenclature)の勧告 [Biochemistry, 11， 1726(1972)3 に従った。
ァミノ酸及び保護基は以下の意味を有する。
G 1 y： グリ シン
V a 1 ： L一バリ ン
I 1 e ： L一イソ crイシン
Leu ： L—ロイシン
G 1 X ： L—グルタミン酸あるいは L一グルタミン
G i n : L—グルタ ミ ン
S e r ： L—セリ ン
T h r ： Lースレオニン
As p : Lーァスパラギン酸
A s n： L—ァスパラギン
L y s ： ； L一リ ジン
T y r ： Lーチロシン
C y s ： L—システィン
P h e ： L一フヱニルァラニン
Tr p : L— トリプトファン
H i s ： L—ヒスチジン
P r o : L一プロリ ン
A s X ： L—ァスパラギン酸あるいは Lーァスパラギン
t一 Bo c ： t一ブチルォキシカルボニル
Me ： メチル
B ·ζ 1 ： ベンジル Bz l (N02 ) : 4—ニトロべンジル
C 1一 Z： 2—クロロべンジルォキシカルボニル
B r— Z： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
4 -CH3B z 1 ： 4一メチルベンジル
t— B u ： t e r t—フ"チノレ
Bom:ベンジノレオキシメチル
T r t ： トリチル
Fmo c ： 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル
Z；ベンジルォキシカルボニル
CHO：ホルミル
A c：ァセチル
CHPh2 ：ベンズヒドリル
側鎖保護ァミノ酸は次のように表す。
Trp (CHO) ： Ν'π—ホルミル一 L—トリプ卜ファン
t-Bo c-Ty r (B r—Z) ： N 一 t—ブチルォキシカルボ二 ノレ一 0— 2ーフロモベンジノレォキシカノレボニノレー Lーチロシン t一 Bo c— Hi s (Bom) ： N 一 t一ブチルォキシカルボニル 一 N'm—ベンジルォキシメチルー L—ヒスチジン
Asp (O t—Bu) ：ァスパラギン酸一y3— t一ブチルエステル t -B o c -Th r (Bz l) ： N α— t一ブチルォキシカルボニル 一 0—べンジルー L—スレオニン
t— Bo c—As p (OB z 1 ) ： t—ブチルォキシカルボ二 ルー Lーァスパラギン酸一 —ベンジルエステル
t-Bo c-Cy s (4一 CH3Bz l) ： N α— t一ブチルォキシ カルボ二ルー S— 4一メチルベンジル一 L一システィン
Fmo c -A s p (O t—Bu) — 0 H： Nび一 9一フルォレニルメ チルォキシカルボニル一 L—ァスパラギン酸一 3— t一ブチルエステ ル -. Fmo c-Ty r ( t -B u) — 0 H : Nな 一 9—フルォレニルメチ ルォキシシカルボ二ルー 0— t—ブチルー L—チロシン
Fmo c-As n (Tr t) — 0 H： Nひ一 9 _フルォレニルメチル カルボ二ルー Nアー トリチル一L—ァスパラギン
Fmo c— H i s (Tr t) -OH： Να - 9—フルォレニルメチル カルボ二ルー Nim—トリチル一 L—ヒスチジン
Fmo c-Th r ( t - B u) 一 0 H： Ν α— 9 _フルォレニルメチ ルォキシカルボ二ルー 0— t—ブチルー L—スレオニン
Fmo c - G I n (Tr t) —OH : N 一 9一フルォレニルメチル カルボ二ルー N 5—トリチル _L—グルタミ ン
Fmo c— Ly s (Z) — 0H : Nひ一 9—フルォレニルメチルォキ シ力ルボニルー N ε—力ルボベンゾキシー L—リジン
Fmo c— Ly s (t— Bo c) — ΟΗ : Να— 9—フルォレニルメ チルカルボ二ルー N e - t一ブチルォキシカルボ二ルー L—リジン 反応溶媒及び反応試薬の略号は以下の意味を有する。
DCC ： ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド
D E P C ： ジェチルフォスフォ口シァニデート
HONS u ： N—ヒ ドロキシスクシンイ ミ ド
P y B 0 P ：ベンゾトリアゾ一ルー 1一ィル—ォキシ一 卜リス一ピロ リジノ一フォスフォニゥムへキサフルオロフォスフヱート
HOB t ： N—ヒ ドロキシベンゾトリアゾール
NMM： N—メチルモルホリン
DMF： N, N—ジメチルホルムアミ ド
TF A： トリフルォロ酢酸
T 0 s 0H： ρ—トルエンスルホン酸
Pd/C ：パラジウム一炭素触媒
TEA： トリエチルァミン
なお， 以下の実施例 1、 3、 6〜 1 0、および参考例 1および 2は A B I社のぺプチド合成機 4 3 0 A型を用い、 AB I社の試薬及び溶媒 を用いて A B I社の合成プログラムにより合成機を運転してぺプチド を合成した。 了ミノ酸の縮合反応は対称酸無水物として標準の条件で 行った。
また、実施例 1 6、 1 7、 2 1〜4 0、 および参考例 3および 4は 島津製作所のぺプチド合成機 P S SM 8を用い、 島津製作所の試薬及 び溶媒を用いて同社の合成プ口グラムにより合成機を運転してべプチ ドを合成した。 アミノ酸の縮合反応は Fmo c法 [ペプチド合成の基 礎と実験 泉屋信夫ら （丸善） ] により標準の条件で行った。 。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1. 化合物 （1— 1) (RE S— 7 0 1— 1)
種菌として、 ストレプトマイセス 'エスピー RE- 701株を用い、 第一 種培地としてグルコース 10gZ^、 ビーフエキストラク ト （極東製薬 工業製） 3 g ^、 粉末酵母エキス S (日本製薬製） 5 gZ 、 パク トトリプトン （ディフコ社製） 5 / 1、 リン酸一カリウム 1 gZ 1 硫酸マグネシウム 7水和物 0.5 g / 、 炭酸カルシウム 2 gZ£、 p H7.2の培地を用いる。 種菌 1白金耳を、 50^太型試験管に入れた上 記培地 に植菌し、 28°Cで 5日間振盪培養した。
この第一種培養液 9 を 2 ^容バッフル付きエルレンマイヤ一フラ スコに入った 3 0 0 ^の第二種培地に植菌した。 第二種培地の組成は 第一種培地の組成と同じであった。 第二種培養は 28°Cで 2日間行った。 この第二種培養液 3 0 0^を 3 0 ^容のステンレス製ジャーファーメ ンタ一中の第三種培地 9.7 iに植菌した。 第三種培地の組成は第一種 培地の組成と同じであった。 第三種培養は 28°Cで 3日間通気攪拌方式 (回転数 250rpm， 通気量 lO^Zmin)により行った。 この第三種培養液 1 0 ^を 2 0 0 容ステンレス製ジャーファーメンタ一中の主発酵培 地 9 0 に植菌した。 主発酵培地としてはグルコース 4 0 /！ ί、 可 溶性デンプン 4 0 gハ、 大豆粉 1 0 g/ £、 コーン ' スチープ ' リ カー 5 gZ 、 乾燥酵母 5 / リン酸一力リウム 0.5 gZ 、 塩 化コバルト 1 、 硫酸ニッケル 1 Z^、 硫酸亜鉛 1 0 ノ 、 リン酸マグネシウム 0.5 gZ 、 ρΗ7· 0の培地を用いた。 この主発酵 培養は 2 8°Cで 4日間通気攪拌方式 （回転数 200rpm 、 通気量 10(Π /min)により行った。
得られた培養液 1 0 0 ^を連続遠心分離して菌体を分別し、 得られ た菌体にアセトン 7 0 を添加し攪拌後、 濾過した。 得られた濾液を 減圧下濃縮してアセトンを除去後、 ダイヤイオン HP— 20カラム （5 £) に通塔し、 吸着させた。 カラムを 5 0 %メタノール 2 5 で洗浄 後、 メタノールで溶出を行った。 RE S— 7 0 1— 1を含む画分を集 め、 水で希釈後、 5 0 %メタノールで充填したダイヤイオン HP— 2 0SSカラム （2.5 に通塔し、 吸着させた。 7 0 %メタノール 7.5 ^で洗浄後、 8 0 %メ夕ノールで溶出を行い、 RE S— 7 0 1— 1を 含む画分を集めて減圧下で濃縮乾固することにより 2.2 gの淡褐色固 体を得た。 得られた固体をメタノールに溶解し、 メタノールで充填し た HP— 2 0カラム （2 £) に通塔後、 メタノールで溶出した。 RE S- 7 0 1 - 1を含む画分を集め、 減圧下濃縮乾固することにより 3 5 Omgの白色固体を得た。 得られた固体をメタノールに溶解した後、 下記の条件で分取 HP LC (L C— 8 システム、 島津製作所製） を用 いて分取精製を行った。 得られた RE S— 7 0 1一 1を含む画分をセ ップパック C一 1 8 (ウォーターズ社製） で処理することにより TF Aを除去し、 減圧下濃縮乾固することにより、 RE S— 7 0 1— 1の 乾燥粉末 2 0 mgを得た。
HP L C分取条件
カラム： SH- 363- 10(C- 18逆相シリカゲル、 ヮイエムシィ社製） 溶離液： 0. 1 %TFA溶液—ァセ卜二トリル（30Γ65¾ί) 直線状濃度勾配 分離時間： 2 0分
流速： 2 5
Figure imgf000031_0001
RES- 7 0 1 - 1の理化学的性質を以下に示す。
なお理化学的性質は以下の機器により測定した。
マススぺク トル： 日本電子 JMS- SX102A(FAB法により測定）
アミノ酸分析は Bidlingmeyer. B.A.等 〔J. Chromatogr. , 336, 93(1984)〕 の方法で実施した。 加水分解は塩酸蒸気中 1 1 0°Cで 2 2時間実施し た。 加水分解物のァミノ酸組成は Waters Pico Tag Ύミノ酸分析計で 分折した。 なおトリブトファンのみは松原等 〔Biochem. Biophys. Res. Commun. , 35, 175(1969) 〕 の方法で加水分解し日本電子製 JLC一 300 ァミノ酸分折計で分析した。 なお、 実測値は Alaの値を 1.0 0として 表わしす：。
質量分折 〔匪 S〕 ：
測定値 2042.8722、 計算値 2042.8614(12C,。 ，， 5N23023+Hとして) アミノ酸分析：実測値 （理論値） ： Asx 2.54(3)、 G 2.13(2)、 His 0.93(1) 、 Thr 1.00(1) 、 Ala 1.00(1) 、 Pro 1.15(1) 、 Tyr 1.95 (2) 、 Phe 2.06(2)、 Trp 2.54(3)
アミノ酸の立体配置は、 加水分解後 （+ ) — 1一 （9一フルォレニ ル） ェチルクロ口ホルメートで誘導体化し、 逆相 HP LCで分析した ところすベて L型であった。
ァミノ酸の一次構造は、 0.0 5 N塩酸中 1 ひ 8 °Cで 2時間部分加水 分解し、 H P L Cで分離して得た部分加水分解べプチドの自動ェドマ ン分解 （ 4 7 0 Aプロテインシーケンサ—、 1 2 0 Aオンライン PT Hアミノ酸分析計、 AB I社製） 、 及び FAB— MSスペク トル分析 により決定した。 また、 C末端の卜リブトフアンはヒドラジン分解法 〔赤堀等， Bull. Chem. Soc. Jap. ,_25^ 214(1967)] により同定した。 また、 RES— 7 0 1— 1の R f 値を各種展開剤により薄層クロマ トグラフィ一で展開し測定した。 検出は、 ヨウ素反応、 硫酸発色、 ま たは 2 53.7 nmの紫外線照射法により行った。
展開条件 1 薄層；キーセルゲル 6 0 F 2 r, . (メルク社製、 Art.5629)
展開溶媒； クロロホルム ： メタノ一ル：ェタノール：水 = 10:4:4:2 展開方法；室温、 上昇法、 1 5〜 6 0分
R f 値； 0.4
展開条件 2
薄層および展開方法は展開条件 1と同様
展開溶媒； 1 0 0 %メタノール
R f 値； 0.6
展開条件 3
展開方法は展開条件 1と同様
薄層； RP— 1 8 (メルク社製、 Art.13724)
展開溶媒； 8 0 %メタノール
R f 値； 0.3
展開条件 4
展開方法は展開条件 1と同様
薄層； RP— 1 8 (メルク社製、 Art.13724)
展開溶媒； 9 0 %了セトニト リル
R f 値； 0.4
実施例 2. 化合物 （1— 2) (RE S— 7 0 1— 2)
種菌として、 ストレブトマイセス 'エスピー RE— 7 0 1株を用い、 種菌 1白金耳を、 4本の 2 5 0 エルレンマイヤーフラスコに入れた 第一種培地 〔グルコース 1 0 gハ、 可溶性でんぷん 1 0 / 、 ビーフエキストラク ト （極東製薬工業製） 3 g ^、 粉末酵母ェキ ス S (日本製薬製） 5 、 パク ト トリプトン （ディフコ社製） 5 リン酸一カリウム 1 gZ£、 硫酸マグネシウム 7水和物
0.5 g/i、 炭酸カルシウム 2 g/^、 LG— 1 0 9 (信越化学製） 0.5 g/β (pH7.2) ) 4 にそれぞれ植菌し、 2 8 °Cで 3日間振 盪培養した。 この第一種培養液 1 Oz^を 6本の 2 ^容バッフル付きエルレンマイ ヤーフラスコに入れた 3 0 0 ^の第二種培地にそれぞれ植菌した。 第 二種培地の組成は第一種培地の組成と同じであつた。 第二種培養は 28 °Cで 2日間行った。 この第二種培養液 1 8 0 0 ^を 2 0 0 容のステ ンレス製ジャーファーメンタ一中の第三種培地 1 0 0 £に植菌した。 第三種培地の組成は第一種培地の組成と同じであつた。 第三種培養は 2 8°Cで 27時間通気攪拌方式 （回転数 22 Orpm、 通気量 6 0 i/ min)により行った。 この第三種培養液 1 0 0 を 2, 0 0 0 ^容ステン レス製ジャーファーメンタ一中の主発酵培地 1,0 0 0 iに植菌する。 主発酵培地としては可溶性デンプン 5 0 g/ ί、 乾燥酵母 3 0 g / 、 リン酸一カリウム 0.5 gZ_g、 リン酸マグネシウム 0.5 g LG- 1 0 9 (信越化学製） 0.5 gZ 、 pH 7.0の培地を用 いた。 この主発酵培養は 2 8°Cで 3日間通気攪拌方式 （回転数 140 rpm、 通気量 40 0 Zmin)により行った。
得られた培養液 1,0 0 0 ^に n—プロピルアルコール 4 0 0 およ び濾過助剤を添加し、 充分攪拌し、 フィルタ一プレスによる濾過を行 つた。 濾液に水を添加し、 n—プロピルアルコール濃度 2 0 %とし、 ダイヤイオン HP— 2 0 (三菱化成工業㈱製） を充填した 50 カラ ムに通塔した。 RES— 70 1—2を吸着させ、 6 0 %メタノール 2 0 0 で洗浄し、 8 0 %メタノール 2 50 ^で溶出した。 RES— 7 0 1— 2を含む画分 1 50 に水および酔酸アンモニゥムを加え、 50 mM酢酸アンモニゥムを含む 3 0 %メタノールで pH 7.0とし、 3 0 % メタノール、 5 OmM酢酸アンモニゥムを含む 3 0%メタノ一ル （pH7.0) で充塡したセパビーズ FP— DA 1 3 (三菱化成工業㈱製） カラム
(1 5 ) に通塔し、 5 Οπβ酸アンモニゥムを含む 3 0 %メタノ一 ル （ρΗ7· 0) 1 5 、 次に、 1 Μ酢酸アンモニゥムを含む 3 0 %メタ ノール （ρΗ7.0) 45 で洗浄し、 0.6 M酢酸を含む 5 0 %メタノー ル 6 0 ^で溶出する。 RE S— 7 0 1— 2を含む画分を集め、 5 0 % メタノールで充填した HP— 2 0 S Sカラム （ 1 0 £) に通塔し、 5
0 %メタノ一ル、 次に 7 0 %メタノールで洗浄し、 7 5 %メタノール で溶出した。 R E S— 7 0 1 — 2を含む画分を集め、 減圧乾固し、 褐 色固体を得た。 これを 2 5 %ァセトニトリルに溶解し、 下記の条件下 で分取 HP L C (綜研化学製） を用いて分取を繰り返し行った。
担体： OD S AQ S— 5 0 (YMC社製）
溶離液：ァセトニ卜リル （2 5 %— 5 0 %) 直線状勾配
分離時間： 2 5 0分
サンプル量： 5 0 0 mgZ回
流速 : 2 5 0 id/mn
保持時間 3.5時間から 4.5時間の画分を分取し、 減圧乾固することに より、 RE S— 7 0 1— 2の乾燥粉末を 8 0 0 mgを得た。
RE S- 7 0 1 - 2の理化学的性質を以下に示す。
なお理化学的性質は以下の機器により測定した。
マススぺク トル： 日本電子 JMS- HX110A(FAB法により測定）
アミノ酸分析は Bidlingmeyer. B. A. 等 〔J. Chroma t pgr. , 336, 93(1984)〕 の方法で実施した。 加水分解は塩酸蒸気中 1 1 0°Cで 2 2時間実施し た。 加水分解物のァミノ酸組成は Waters Pico Tag ァミノ酸分析計で 分析した。 なおトリプトファンのみは R. J. Simpson 等 〔J. Biol. Cheni.， 251， 1936(1976) 〕 の方法で加水分解し上記アミノ酸分析計で分析し た。 なお、 実測値は A 1 aの値を 1.0 0として表わした。
質量分析：測定値 2058.8496
ァミノ酸分析：実測値 （理論値） ： Asx 2.61 (3)、 Gly 2.25(2)、 His 0.92(1)、 Thr 1.02(1)、 Ala 1.00(1)、 Pro 1.14(1)、 yr 1.74(2)、 Phe 1. 90(2)、 Trp 2.15(2)
アミノ酸の立体配置は、 加水分解後ひ）-1- (9一フルォレニル） ェチ ルクロロホルメ一トで誘導体化し、 逆相 HP L Cで分析したところす ベて L型であった。 C末端ァミノ酸以外の一次構造は、 0.1 N塩酸中 1 0 8 °Cで 2時間 部分加水分解し逆栢 H P L Cで分離して得た部分加水分解べプチドの 自動エドマン分解 （470Aプロテインシークェンサ一、 120Aオンライン PTHアミノ酸分析計、 AB I社製） 、 及び FAB— MSスぺク トル 分析により決定した。
C末端アミノ酸はヒドラジン分解法 〔赤堀等、 BulL Chem. Soc. Jap., 25, 214(1964) 〕 及びカルボキシぺプチダーゼ A (シグマ社製） 消化 後、 逆相 HP LCで C末端アミノ酸を分離し、 前述 FAB— MSスぺ クトル分折ならびに NMRスぺク トル分析 （Bruker社製， AM 5 0 0， lH— 500MHz) により 7—ヒドロキシトリブトファンと同定した。 アミ ノ酸配置は旋光度計 （日本分光 D I P- 3 7 0 ) により L型であるこ とが判明した。
実施例 3. 化合物 （1—3) (RES— 7 0 1— 3)
種菌として、 ストレブトマイセス 'エスピー RE— 6 2 9株を用い、 種菌 1白金耳を、 4本の 2 5 0 エルレンマイヤ一フラスコに入れた 第一種培地 〔グルコース 1 0 gZ 、 可溶性でんぷん 1 0 g/^、 ビ —フエキストラク ト （極東製薬工業製） 3 /! ί、 粉末酵母エキス S (日本製薬製） 5 gZ 、 バク ト卜リプトン （ディフコ社製） 5 gZ ίί、 リン酸一力リゥ厶 1 / 1ヽ 硫酸マグネシウム 7水和物 0.5 / ^、 炭酸カルシウム 2 gZ£、 LG- 1 0 9 (信越化学製） 0.5 gZ ί、 (ρΗ7.2) ] 4 0 にそれぞれ植菌し、 2 8。Cで 3日間振盪培 養した。 この第一種培養液 1 O J^を 6本の 2 £容バッフル付きエルレ ンマイヤ一フラスコに入れた 3 0 0 の第二種培地にそれぞれ植菌し た。 第二種培地の組成は第一種培地の組成と同じであった。 第二種培 養は 2 8°Cで 2曰間行った。 この第二種培養液 1 8 0 0 を 2 0 0 容のステンレス製ジャーファーメンタ一中の主発酵培地 1 0 0 に植 菌した。 主発酵培地としては可溶性デンプン 5 0 / 、 乾燥酵母 3 0 リン酸一カリウム 0.5 gZ 、 リン酸マグネシウム 0. 5 g/ &、 L G- 1 0 9 (信越化学製） 0. 5 も/ a、 H7. 0の培地を 用いた。 この主発酵培地は 2 8 °Cで 3日間通気攪拌方式 （回転数 1 4 0 rpm、 通気量 4 0 0 /min)により行った。 得られた培養液 1 0 0 に n—プロピルアルコール 4 0 £および濾過助剤を添加し、 充分攪 拌し、 フィルタ一プレスによる濾過を行った。 濾液に水を添加し、 n 一プロピルアルコール濃度を 2 0 %とし、 ダイヤイオン HP— 2 0
(三菱化成工業㈱製） を充塡した 5 カラムに通塔した。 RE S— 7 0 1 — 3を吸着させた後、 6 0 %メタノール 2 0 で洗浄し、 8 0 % メタノール 2 5 で溶出した。 R E S— 7 0 1 — 3を含む画分 1 5 i に水および酢酸アンモニゥムを加え、 5 OmM酢酸アンモニゥムを含む 3 0 %メタノールで p H 7. 0とし、 5 OmM酢酸アンモニゥムを含む 3 0 %メタノール （p H 7. 0 ) で充填したセパビーズ F P— D A 1 3
(三菱化成工業㈱製） カラム （1.5 £) に通塔し、 5 OmM酢酸アンモ 二ゥムを含む 3 0 %メタノ一ル （pH7.0) 1. 5 £、 次に、 1 M酢酸アン モニゥムを含む 3 0 %メタノール （ρΗ7.0)4· 5 ^で洗浄し、 0. 6 Μ酢 酸を含む 5 0 %メタノ一ル 6 ^で溶出した。 RE S— 7 0 1 — 3を 含む画分を集め、 5 0 %メタノールで充塡した HP— 2 0 S Sカラム
( 1 に通塔し、 5 0 %メタノール、 次に 7 0 %メタノールで洗浄 し、 7 5 %メタノールで溶出した。 RE S— 7 0 1 _ 3を含む画分を 集め、 減圧乾固し、 褐色固体を得た。 これを 2 5 %了セトニトリルに 溶解し、 下記の条件下で分取 H P L C (島津製作所製） を用いて分取 を繰り返し行った。
カラム： OD S (径 5 cm、 長さ 5 0 cm) (YMC社製）
溶離液： ァセ卜二トリノレ （2 5 5 0 %) 直線状勾配
分離時間： 2 5 0分
サンプル量： 1 0 mg "回
流速： 3 0 v / n
保持時間から 1 8 0から 2 1 0分の画分を繰り返し分取し、 減圧乾固 することにより、 RES— 7 0 1— 3の乾燥粉末を 7 nig得た。
RES-70 1-3の理化学的性質を以下に示す。
なお理化学的性質は以下の機器により測定した。
マススペク トル： 日本電子 JMS— HX1 1 0A
ァミノ酸分折は実施例 2と同様に行った。 なお実測値は P h eの値を 2.00として表わした。
a) 質量分析：測定値 2059.4626
b) アミノ酸分折 実測値 （理論値） ： Asx 3.16(3)、 Ser 0.90(1)、 Gly 1.97は)、 His 0.96(1)、 Thr 0.89(1)、 Pro 1.12(1)、 Tyr 1.92(2)、 Phe 2.00(2)、 Trp 2.91(3)
アミノ酸の配置は、 加水分解後 （+ ) — 1一 （9—フルォレニル） ェチルクロ口ホルメートで誘導体化し逆相 H P L Cで分離することに よりすべて L型であること力判明した。
一次構造は、 0.1 N塩酸中 1 08 °Cで 2時間部分加水分解し逆栢 HP LCで分離して得たぺプチドの自動ェドマン分解 （470Aプロティ ンシークェンサ一、 120Aオンライン PTHアミノ酸分析計、 AB I社製） 、 及び FABMSスぺクトル分析 （日本電子製、 JMS— HX 1 1 0 A) により決定した。
C末端アミノ酸はヒドラジン分解法 〔赤堀等， Bull. Chem.Soc. Jap.， 25, 214(1964) ] により分折したところ、 トリブトファンと確認され た。
実施例 4.
化合物 （1— 4) ： H-G l y-Asn-Tr p-H i s-G l y — Th r— A 1 a— P r o— As p— Trp— Phe— Phe— As n-Ty r-Ty r-T r p— OHの合成
AB I社の合成プログラムに従い、 t—Bo c— Tr p (CHO) 0.5mmo 1が結合した担体樹脂 0.73 gを自動合成機の反応器に入 れ、次の操作を行った。 (a) 33 %T FAを含む塩化メチレン溶液を加えて混合物を 1分 20 秒間撹拌し、 該溶液を排出した。
(b) 5 0%T FAを含む塩化メチレン溶液を加えて混合物を 18分 30 秒間撹拌し、 該溶液を排出した。
(c) 塩化メチレンで担体樹脂を 3回洗浄した。
(d) 1 0 %ジイソプロピルェチルァミンを含む塩化メチレン溶液を 加えて混合物を 1分間撹拌し、 該溶液を排出し、 この操作をもう 1回 くり返した。
(e) DMFで担体樹脂を 5回洗浄した。
こうして Tr p (CHO) の結合した担体樹脂を得た。
(f ) この担体樹脂に t— Bo c -Ty r (B r— Z) の対称酸無水 物 2. Ommo 1を含む DMF溶液 4 m 1を加え、 混合物を 1 8分間攪 拌し、 該溶液を排出した。
(g) 塩化メチレンで担体樹脂を 5回洗浄した。
このようにして、 t— Bo c— Ty r (B r— Z) -Tr p (C HO) が担体上に合成された。 次に、 上記 （a) 〜 （e) の脱保護ェ 程を行った後、 （f ) の工程で t一 Bo c -Ty r (B r一 Z) —O Hの対称酸無水物を加えて縮合反応を行い、 次いで （g) の洗浄工程 を経て、 t一 Bo c— Ty r (B r— Z) — Ty r (B r— Z) -T r p (CHO) を担体樹脂上に合成した。 以下、 工程 （f) には順次 t-Bo c-As n-OH, t-Bo c-Ph e -OH, t— Bo c -P h e -OH, t -Bo c-Tr p (CHO) -OH, t一 Bo c -As p (OB z 1 ) -OH, t -B o c -P r o -OH, t— Bo c -A 1 a -OH, t-Bo c-Th r (B z l) -OH, t一 Bo c一 G l y— OH， t -B o c -H i s (Bom) -OH, t— Bo c— Tr p (CHO) -OH, t— B o c— A s n - 0 Hおよび t— B o c— G 1 y— OHを用い、 工程 （a) 〜 （g) を順次繰り返して 保護べプチドの結合した担体樹脂 2.0 gを得た。 得られた担体樹脂のうち 8 gを用い、 これにし 2—エタンジチ オール 0.8 ml， ジメチルスルフイ ド 0.8 m 1， ァニソール 0.2ml を加え 3時間放置し、 フッ化水素 1 8mlを加えて 70分間氷冷下攪 拌した。 次いでフッ化水素を減圧除去し、 担体樹脂に酢酸ェチル 100 m 1を加え 0.5時間攪拌した。 濾過して得られた担体樹脂に DM F
100mlを加えて 1時間攪拌した。 担体樹脂を全自動高速冷却遠心 機 （RS— 20型、 トミ—精ェ） にかけ、 10， 000 r pmで 1 0分 間遠心分離し上清液を得た。 この上清液の DMFを濃縮機 （ROTARY VACUUM EVAPORATOR N— 2型 東京理化器機） で 除去し、 2M 酢酸で界溶解し粗生成物を得た。 この粗生成物を逆相 カラム （CAPCELL PACK C 1 8 SG— 120 30 x
250mm 資生堂製） を用いた H P L Cにて精製した。 0.1%TFA と 0〜90%ァセトニトリルを用いた直線濃度勾配で溶出し 220 nm にて検出し化合物 （I一 4) を含む画分を得た。 この画分を凍結乾燥 して 18.2 m gの化合物 （ I一 4 ) を得た。
化合物 （1—4) の質量分折は日本電子 JMS— HX 1 10 Aを用 いて行ない、 アミノ酸分析は実施例 2と同様に行った。
以下の実施例においても質量分析およびアミノ酸分析は実施例 4と 同様に行なった。
質量分析 〔FABMS〕 : 2062 (M + H)
アミノ酸分折： As x2. 5 (3) ， G 1 y 2. 2 (2) ， Hi s l . 1 (1) ， T h r 1. 1 (l) A l a l. 1 (1) ， P r o l. 1 (1) ， Ty r 2. 1 (2) ， Phe l. 9 (2) , (Trpは分析 せず） 実施例 5.
化合物 （ I一 1 )
L- Gly -Asn -Trp -His — Gly — Thr -Ala -Pro -Asp -Trp -Phe-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Trp-OH
化合物 （ I一 5 )
c y c 1 o (G l y— As n— Tr p— H i s— G l y— Th r— A 1 a— P r o— As p— Tr p— Ph e— Ph e— As n— Ty r — Ty r— Tr p) の合成
実施例 4に従って合成した化合物 （ I一 4) の TF A塩 1.84mgを 0.35 m 1のメタノールに溶解し、 次いで 5 %塩酸一メタノール溶液 を 1.7〃 1加え、 室温で 1時間放置した。 その後、 ゲル濾過カラム
〔セフアデックス G— 1 5 (フアルマシア社製） ， 44 X 9 mmI.D.〕 を用 いメタノールで溶出し、 化合物 （1— 4) を含む画分を得た。 次に、 溶媒を減圧留去し、 化合物 （ I— 4 ) の塩酸塩 1.25 m gを得た。 化合物 （I一 4) の塩酸塩 0.2 mgを乾燥 DMF 0.3 m 1に溶解し、 乾燥 DM Fで調製した 0.4mg/mlの HOB t、 0.6 1 mg/m 1 の D C Cを氷冷下それぞれ順に 0.1 m 1ずつ加えた。 反応溶液を氷冷 下 2時間放置し、 室温に戻し一昼夜放置した。 不溶物を遠心分離 （1 5000 r pmx 5分、 0°C) により除去し、 上清液を逆相 HP LC で精製した。 逆相カラムは、 YMC社製 YMC P a c k ODS- AM312 ( 1 50 X 6 mml.D.) を用いた。 0. 1 %TFAと 0〜90 %のァセトニトリルを用いた直線濃度勾配で溶出し、 220 nmにて 検出し、 化合物 （ I— 1 ) を 5 %、 化合物 （ I一 5 ) を 95 %含む画 分を得た。 この画分の溶媒を減圧下留去し、 0.0 lmgの残渣を得た c これをエタノール 5 0 fi 1に溶解し、 イオンペア剤を用いた逆相 HP L Cにより精製した。 逆相カラムは、 YMC社製 YMC P a c k ODS-AM3 1 2 ( 1 50 X 6 mml. D. ) を用い、 36%ァセトニ トリルを含む 1 mMテ卜ラエチルアンモニゥムヒドロキシド、 0.1 M リン酸ーナトリウム水溶液 （p H = 3.3 ) で溶出した。 化合物 （ I一 1) を含む画分を減圧下溶媒留去し、 再び 0.1 %TFAと 0〜90%の ァセトニトリルを用いた直線濃度勾配による逆相 HP L Cで精製し、 減圧下溶媒を留去し、 化合物 （ I— 1 ) を 0.5 g得た。
同様にして、化合物 （ I一 5 ) を 25 g得た。
化合物 (1-1)
質量分析 〔FABMS〕 : 2044 (M + H)
アミノ酸分析： As X 2. 5 (3) ， G 1 y 2. 2 (2) ， H i s l . 1 (1) , Th r 1. 1 (1) ， A 1 a 1. 1 (1) ， P ro l. 1 (1) ， Ty r 2. 1 (2) ， Ph e 1. 9 (2) ， （Tr pは分 析せず）
化合物 （ I一 5 )
質量分析 〔FABMS〕 : 2044 (M + H)
アミノ酸分析： As x 2. 5 (3) ， G 1 y 2. 2 (2) ， Hi s l . I (1) ， Th r 1. 1 CI) , A 1 a 1. 1 (1) ， P r o l. 1 (1) ， Ty r 2. 1 (2) ， Phe l. 9 (2) ， （Tr pは分 析せず）
実施例 6.
化合物 （1— 6) ： H-Cy s-As n-Trp-H i s-G l y -Th r -A 1 a— P r o— Cy s— Trp— Phe— Phe— As n-Ty r-Ty r-T r p— OHの合成
t-Bo c-Tr p (CHO) が結合した担体樹脂及び保護アミノ 酸として順次 t一 Bo c— Ty r (B r— Z) -OH, t一 Bo c— Ty r (B r— Z) —OH, t— B o c— A s n— 0 H， t一 Bo c -Ph e - OH, t一 B o c— P h e— OH， t一 Bo c— Trp (CHO) -OH, t -B o c-Cy s (4一 CH:, B z l) -OH, t-Bo c-P r o -OH, t— B o c— A 1 a— O H， t一 Bo c -Th r (B z 1 ) -OH, t _ B o c— G 1 y— 0 H， t一 Bo c — H i s (Bom) -OH, t -B o c -T r p (CHO) -O^ . t— B o c - A s n— OHおよび t— Bo c— Cy s (4 - CH:iB z 1) —OH, を用い、 実施例 4と同様にして保護ペプチドの結合し た担体樹脂 2.0 gを得た。 この得られた担体樹脂のうち 0, 8 gを実施 例 4と同様にフッ化水素処理から HPLCによる精製に至る処理をし て 298.4 m gの化合物 （ I _ 6 ) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2096 (M + H)
ァミノ酸分析： As x l. 7 (2) ， G 1 y 1. 0 (1) ， H i s l . 0 (1) ， T h r 1. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 0 (1) ， Ty r 2. 0 (2) ， Ph e 2. 0 (2) , C y s 1. 9 (2) ， (T r pは分析せず）
実施例 7.
化合物 （ I— 7 ) ：
H-Cys-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Cys-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr-
Tyr- Trp- OHの合成
実施例 6で得られた化合物 （I一 6) 3 mgを無水メ夕ノール 1 0 m 1に溶解し、 50 mMトリス塩酸緩衝液 （pH7.5) 0.2 m 1を氷 冷下加えた。 次いで、 1.6 mMのグルタチオン酸化型を含む含水メタ ノール溶液 （V/V ： 5/1) 1 m 1を添加した、室温下 16時間撹拌した。 次いで、反応液を塩酸で pH 4に調整し、 実施例 5と同様な方法によ り逆相 HPLCで精製し化合物 （I— 7)を 1.5 mg取得した。
質量分析 [FABMS]: 20 94 (M+H)
ァミノ酸分析： As x l. 8 (2) ， G 1 y 1. 0 (1) ， H i s l . 0 (1) ， Th r O. 9 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 0 (1) , Ty r 2. 0 (2) ， Ph e l. 9 (2) , ( C y s , T r pは分析せず） 実施例 8.
化合物 （I一 8 ) ：
Ac-Cys-Asn-Trp-His-Gly-T r-Ala-Pro-Cys-Trp-Phe-P e-Asn-Tyr-
Tyr- Trp- OHの合成
化合物 （1— 7) 0.2 mgを DMF 0. 2mlに溶解し、 40 ίΜ ED ΤΑを含む 2 OmMナトリウム憐酸緩衝液 （pH7.2) 100 1を添加し、氷冷下 N—ァセチルコハク酸イミ ド 50 zgを加え、 10 °C下 16時間撹拌した。 得られた反応液を塩酸で PH 4に調整し、 実 施例 5と同様な方法により逆相 H PLCで精製し化合物 （I一 8) を 1 1 0 A£ g取得した。
質量分析 [PABMS]: 2 136 (M + H)
アミノ酸分析： As x l. 8 (2) ， G l y l. 0 (1) ， H i s l . 0 (1) ， Th r 0. 9 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 0 (1) , T y r 2. 0 (2) ， P h e 1. 9 (2) ， （Cys， T r pは分析せず）
実施例 9.
化合物 （H— 9) ： H-Trp-Phe-Phe-As n-Tyr- Ty r— Tr p— OHの合成
t-Bo c-Trp (CHO)力結合した担体樹脂および N—保護 アミノ酸として順次 t一 B 0 c— Ty r (B r— Z) — OH, t— Bo c-Tyr (B r-Z) -OH, t一 B o c— A s n— OH， t -B o c -P h e -OH, t-Bo c-Ph e -OH, および t一 B o c—Trp (CHO) —OHを用い、 実施例 4と同様な方法により 保護べプチドの結合した担体樹脂 1- 35 gを得た。 このうち 0.8 gを 実施例 4と同様な方法よりに合成べプチドをフッ化水素処理して樹脂 から切り出し、 2 M酢酸に溶解し、凍結乾燥することにより、 46.2 mgの粗生成物を得た。 このうち 4. Omgを実施例 4と同様の方法によ り HPLCで精製し、 2.4mgの化合物 （Π— 9) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 1 26 (M+H)
ァミノ酸分析： As x l. 0 (1) ， P h e 2. 0 (2) ， T y r 2. 0 (2) , (Tr pは分析せず）
実施例 10.
化合物 （Π— 10) ： H-Tr p-Ph e-As n-Ty r-Ty r- T r p— OHの合成
t -B o c -T r p (CHO) が結合した担体樹脂および N—保護 アミノ酸として順次 t _B o c—Ty r (B r— Z) -OH, t -B o c-Ty r (B r-Z) -OH, t - B o c - A s n -OH, t - B o c— P h e— OHおよび t— B o c— T r p (CHO) —OHを 用い、 実施例 4と同様な方法により保護べプチドの結合した担体樹脂 1.3 gを得た。 このうち 0.8 gを実施例 4と同様な方法によりフッ化 水素処理して樹脂から切り出し、 2 M酢酸に溶解し、凍結乾燥するこ とにより、 2 15.2 mgの粗生成物を得た。 このうち 4. Omgを実施例 4と同様な方法により HP LCで精製し、 2. Omgの化合物 （Π—10) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 ： 979 (M + H)
アミノ酸分析： As χ θ. 9 (1) ， Ty r 2. 1 (2) ， Ph e 1 . 0 (1) ， （Tr pは分析せず）
実施例 11.
化合物 （Π— 11) ： H-Tr p-Ph e-Ph e-As n-Ty r- T r p— OHの合成
t -B o c -T r p (CHO) が結合した担体樹脂および N—保護 アミノ酸として順次 t— B 0 c— Ty r (B r-Z) -OH, t— B o c-As n-OH, t -Bo c-Ph e -OH, t - B o c - P h e.._OHおよび t _B o c -T r p (CHO) —OHを用い、 実施例 4と同様な方法により保護べプチドの結合した担体樹脂 1· 2 gを得た。 このうち 0.8 gを実施例 4と同様に合成な方法によりフッ化水素処理 により樹脂から切り出し、 2 M酢酸に溶解し、凍結乾燥することによ り、 264.7 m gの粗生成物を得た。 このうち 8.0 mgを実施例 4と同 様な方法により HP LCで精製し、 4.7 mgの化合物 （I一 11) を得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 963 (M + H)
ァミノ酸分折： Asx O. 8 (1) , Ty r 1. 1 (1) ， Ph e 2 . 2 (2) , (Tr pは分析せず）
実施例 12.
化合物 （Π— 12) ： H-Tr p-Phe-Phe-Ty r-Tyr- Tr p— OHの合成
t一 Bo c— Trp (CHO) が結合した担体樹脂および N—保護 アミノ酸として順次 t— B o c— Ty r (B r— Z) — OH， t -B o c-Tyr (B r-Z) -OH, t-Bo c-Ph e -OH, t - B o c— P h e— OHおよび t—B o c—T r p (CHO) 一 OHを 用い、 実施例 4と同様な方法により保護べプチドの結合した担体樹脂 1.3 gを得た。 このうち 0.8 gを実施例 4と同様な方法によりフッ化 水素処理して樹脂から切り出し、 2 M酢酸に溶解し、凍結乾燥するこ とにより 243. 4 mgの粗生成物を得た。 このうち 78.0 mgを実 施例 4と同様な方法により HP LCで精製し、 12.2 mgの化合物
(1-12) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 10 1 2 (M + H)
アミノ酸分析： Ty r 2. 0 (2) , P h e 2. 0 (2) ， （Trp は分析せず）
実施例 13.
化合物 （E— 13) ： H-Phe-Phe-Asn-Ty r-Ty r- Tr p— OHの合成
.t一 Bo c— Trp (CHO) が結合した担体樹脂および N—保護 アミノ酸として順次 t— B o c— Ty r (B r— Z) -OH, t— B o c -Ty r (B r -Z) -OH, t— B o c— A s n— 0 H， t - B o c— P h e— OHおよび t—B o c— P h e—OHを用い、 実施 例 4と同様な方法により保護べプチドの結合した担体樹脂 1.2 gを得 た。 このうち 0.8 gを実施例 4と同様な方法によりフッ化水素処理し て樹脂から切り出し、 2 M酢酸に溶解し、凍結乾燥し、 2 8 5.5 mg の粗生成物を得た。 このうち 1 50. O mgを実施例 4と同様な方法に より HP L Cで精製し、 3 9. 1 mgの化合物 （Π— 13) を得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 9 4 0 (M+H)
ァミノ酸分析： A s x O. 8 ( 1 ) ， Ty r 2. 0 (2) ， P h e 2 . 2 (2) ， （T r pは分析せず）
実施例 14.
化合物 （I一 14) ： ヒ Gly- Asn- Trp- His- Gly- Thr- Ala- Pro- Asp- 0Hの合成
参考例 1で得た化合物 （a) 1 1.3 mgを DMF 1 2.3 m 1に溶解 し、 一 1 0 °Cで冷却しながら D E P C 5.2 m gと T E A 6.4 m gを加 え 3 0分間撹拌した。 得られた反応液に、 実施例 27と同様にしてジフ ェニルジァゾメタンとァスパラギン酸のベンジルエステルを反応させ て得た、 ァスパラギン酸 α—ベンジル S—ジフヱニルメチルエステル 4.0 mgを加え、 4°Cでさらに 7日間撹拌した。 得られた化合物を、 YMC社製 OD S—AQカラム （2 5 0 x 3 0 mm l . D. ) を装着 した逆相 H P L Cを用い、 0.1 %TFAと 0〜90%ァセトニトリルの 直線濃度勾配により精製し、 凍結乾燥することにより縮合物 5 m gを 得た。
この縮合物に氷冷下、 塩化メチレン 5 0 0〃 1、 ァニソ一ル 1 0〃 1、 エタンジチオール 1 ju 1、 TF A 5 0 0 // 1を順次加え、 撹拌後 3 0分間放置した。 減圧下溶媒を留去し、 上記と同様に逆相 HP L C で精製し、 凍結乾燥することにより縮合物の脱ジフエニルメチルエス テル体 2 m gを得た。
得られたエステル体を DMF 8 0 0 \に溶解し、 ピペリジン 20 0 1を加えて撹拌し、 室温で 10分間放置した。 酢酸 3 00 1と メタノール 450 Iを加えて中和し、 上記と同様に逆相 HPLCで 精製し、 凍結乾燥することにより脱 Fmo c化されたエステル体 1.5 m gを得た。
得られた脱 Fmo c化エステル体を DMF 1.9 m 1に溶解し、 一1 0 °Cで冷却しな力《ら D EPC 0.47mgと TFAO.59mgを加え て 30分間静置し、 4°Cに戻して 3日間撹拌した。 上記と同様に逆相 HPLCで精製し、 凍結乾燥することにより化合物 （I一 14) のべ ンジルエステル体 1 mgを得た。
得られたベンジルエステル体をメタノール 150 Κ 1と酢酸 50 1に溶解し、 10 %P d/C約 1 mgの存在下、 水素ガスを添加し、 室温で 2時間撹拌しながら接触還元を行つた。 上記と同様に逆相 H P LCで精製し、 凍結乾燥することにより化合物 (1-14) lmgを得 た。
質量分析 〔FABMS〕 : 936 (M+H)
アミノ酸分析： As x l. 9 (2) ， G 1 y 2. 3 (2) ， Hi s l . 0 (1) , Th r 0. 7 CI) , A 1 a 0. 9 (1) , P r o 1.
0 (1) , Tr p 0. 4 (1) .
実施例 15.
化合物 （I一 15) ： kuy- Asn- Trp- His- Gly- Thr-Ala- Pro- Asp- Trp- OHの合成
工程 I ： H-A s p (0 t -B u) 一 Trp— OB z l
(a) Fmo c— As p (O t—Bu) -OH lmgを塩化メチレ ン lmlに溶解し、 0°Cに冷却し、 HONSu l 2mg， DCC21 mgを加えて 0°Cで 30分間撹拌した。 ここに、 H— Tr p— 0Βζ1 · HC 1 331« を含む1 m Γ塩化メチレン溶液と T E A 1 4〃 1を加 え、 0°Cで 3時間撹拌した。 不溶物を濾別し、 冷塩化メチレンで洗浄 し、 濾液を回収した。 減圧下溶媒を留去し、 残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー （和光純薬工業社製、 ヮコーゲル C一 200、 5 0 g、 クロ口ホルム/メタノール二 25ノ 1で溶出） で精製し、 Fm o c— As p (O t—Bu) -Tr p-OB z 1 67 mgを白色粉末 として得た。 質量分析 〔FABMS〕 ; 688 (M + H)
(b) (a) で得られたジペプチド 1 0 mgを DMF 3 m 1に溶かし、 ピぺリジン 0. 7 5mlを加えて、 室温で 1 0分間放置した。 反応液 にエーテル、 へキサンを加え析出する白色結晶を濾取し、 減圧下乾燥 して、 H— As p (Ot—Bu) -Tr p-OB z 1 2mgを得た。 質量分析 〔FABMS〕 ; 466 (M + H)
工程 2 ： H-G l y-As n-Tr p-H i s-G l y-Th r-A 1 -P r o-As p-Tr p-OB z 1
(a) 参考例 1で得られた化合物 （a) 4.4mgに、 工程 1で得られ たジぺプチド 1.7mgを含む 5.5ml D M F溶液を加え 0 °Cに冷却し た。 ここに、 DEPC 0. 5〃 1と TE A 1.0 1を順次加え、 0 °C で 5日間撹拌した。 溶媒を減圧下留去し、 残渣を再び DMF 1ml に溶解し、 逆相カラム （YMC社製、 YMC— P a c kODS— AM 3 1 2 1 50 x 6 mm I. D. ) を用いた H P L Cで精製し、 Fmo c-G l y-A s n-Tr p-H i s— G l y— Th r— A l a— P r o-As p (O t-Bu) -Tr p-OB z 1 320 //gを白色 粉末として 'た。
(b) (a) で得られた保護べプチド 250〃 gに、 TFA900/Z 1、 1， 2—エタンジチオール 50 1、 ァニソール 50〃 1、 2—メチ ルインドール 5 mgからなる混合液のうち 50 1を加え、 室温で 1.5 時間放置した。 エーテルを加えて生成した白色沈澱を濾取し、 乾燥さ せ、 20%ピペリジンを含む DMF 1 00 ^ 1を加え、 室温で 15分 間放置した。 再びエーテルを加えて生成する白色沈澱を濾取し乾燥さ せ、 H— Gl y— Asn— Tr p— Hi s— G l y— Th r— Al a — P ro—Asp— Trp— OBz 1 200 ji gを得た。
工程 3 ：化合物 （I一 15)
(a) 工程 2で得られたぺプチド 66 β gを DMF 60〃 1に溶解し、 室温において P y BOPの 0.1Mを含んだ DMF溶液 1.6 I、 HO B tの 0.1 Mを含んだ DMF溶液 1.6 £ K NMMの 1 %含有 DMF 溶液 3 1を加え、 室温で 3時間撹拌した。 減圧下溶媒を留去し、 生 成物を逆相カラム （YMC社製、 YMC— P a c k ODS一 AM
312 150 X 6 mm I. D. ) を用いた HPLCにより、 化合物 (I—15) のべンジルエステル体 20 gを得た。
(b) (a) で得られたベンジルエステル体 250 gをメタノール Z酔酸 = 3/1の混合液 80 a 1に溶解し、 窒素雰囲気下、 10 %P dZC約 0.5mgを加え、 系を水素雰囲気下にし、 室^ _で 1時間撹拌 した。 PdZCを濾別し、 濾液にエーテルを加えて生成する白色沈澱 を濾取し、 乾燥し、 化合物 （1—15) 100 £gを得た。
質量分析 [MBMS]: 1 123 (M + H)
アミノ酸分析； G l y 2. 3 (2) ， Asx l. 6 (2) , Hi s O . 9 (1) ， Th r 1. 0 (1) , A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. I (1) (Trpは分析せず）
実施例 16.
化合物 （I一 16) ： i-Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Gly-O eの合成
実施例 14で得られた化合物 （1—14) 10 gを DMF 10〃 Iに 溶解し、 氷冷下 HOB t 4.3 ^ , P y BOP 16· 7〃 g、 NMM 4. 9 tigを順次加え 30分間放置した。 反応液に H— G 1 y-0Me · H C 1 4.0 z gを加えて 4°Cで 1晚放置し、 実施例 1 5と同様の方法に より YMC社製 YMC P a c k OD S—AM 3 1 2カラム （1 50 X6mml. D. )を装着した逆相 H P L Cで精製し、 凍結乾燥 することにより化合物 （I—16) 6〃 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 0 0 8 (M + H)
ァミノ酸分析： A s X 1.8 (2) , G 1 y 3.2 (3) , H i s 1. 0 (1 ) ， Th r 1. 0 ( 1 ) ， A 1 a 0.9 ( 1 ) ， P r o l.0 ( 1 ) (T r pは分析せず）
実施例 17.
化合物 （I一 17) ： 一 Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- OHの合成
7. 1 mgの化合物 （ I— 1 ) をメタノール 2.8 4 m lに溶解し、 0. 1 M トリス塩酸緩衝液 （p H 8.0 ) 2 5.5 6 m 1を添加し、 さらに 約 0.3 mgのカルボキシぺプチダ一ゼ A (シグマ社製 C- 9 7 6 2 ) を加え 3 7°Cで 1晚撹捽した。 反応液に適量の塩酸を加えて酸性にし- NUC LEOS I L 5 C 1 8 (Chemco社製、 2 5 0 x 2 0難 I. D. ) を装着した逆相 HPL Cを用いて、 毎分 1 0m lの流速で 0.1 %ΎΥ Α溶液中ァセトニトリル濃度を 0 %から 5 0 %に 3 0分で上昇させる 直線濃度勾配により、 3.5 m gの化合物 （I一 17) を得た。 質量分析
[FABMS] : 1 8 5 8 (M+H)
ァミノ酸分析： A s x 2. 6 (3) ， G 1 y 2. 2 (2) ， H i s 0 . 9 (1 ) ， Th r 1. 0 ( 1 ) ， A 1 a 1. 0 ( 1 ) ， P r o l . 1 (1 ) ， Ty r 1. 8 (2 ) , P h e 1. 9 (2) , (T r pは分 析せず） 実施例 18.
化合物 (I一 18) ヒ Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Piie-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Trp- Trp- OHの合成
化合物 （I— 1) 0.49mgを含む 2 Ί 0 β \ DMF溶液に PyB OP375 g、 HOB t 97 g：、 NMM 12 1 gを加え、 室温 で 1時間攪摔した。 H— Tr p-OB z 10.16mgを含む 80 β 1 の DMF溶液を加え 4°Cで 4日間攪拌した。 溶媒を減圧下留去し、 残 渣を再び 80 1の DMF溶液に溶解し逆相カラム （YMC社製、 YMC— Pa ck OD S -AM3 1 2 150 X 6 mm I . D. ) を装着した H PLCで、 毎分 1 m 1の流速で 0. 1 % TFA溶液中 ァセトニトリル濃度を 0 %から 90 %に 6 0分で上昇させる直線濃度 勾配により、 化合物 （1—18) のべンジルエステル体を 70 g得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 2320 (M + H)
ついで、 上記べンジルエステル体 70 a gを DMF 3 5 il lに溶解 し、 蟻酸アンモニゥムの飽和メタノール溶液を 35 1、 10 %P d /C約 0.1 mgを加えて、 室温で 1時間攪拌した。 反応液を遠心分離 にかけ上澄みを採取し、 逆相カラム （YMC社製、 YMC— Pa ck
ODS-AM3 12 150 X 6 mml. D. ) を用いて、上記と同様 に分取精製し、 化合物 （1—18) 25 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2230 (M+H)
ァミノ酸分析； Gl y 2. 2 (2) ， A s X 2. 8 (3) ， Hi s O . 9 (1) ， Th r 0. 9 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 3 (1) ， Phe 1. 9 (2) ， Tyr l. 7 (2) (T r pは分析 せず）
実施例 19.
化合物 （I一 19) ： ― Gly- Asn- Trp- His- Gly- Thr- Ala- Pro- Asp- Trp- Phe- Phe- Asn- Tyr - Tyr- Trp- Asn- Tyr- Tyr- Trp- OHの合成
工程 1 ： H— As n - Ty r— Ty r— T r p - OB z l
Fmo c— Ty r ( t -B u) 66 zmo 1が結合した担体樹脂 110 mgを用い、 N—保護アミノ酸として順次、 Fmo c— Ty r (t— B u) 一 OH，Fmo c— As n (Tr t) — OHを用いて参考例 3 と同様にしてぺプチド合成を.行い、 樹脂からぺプチドを切り出して、 粗ぺプチド Fmo c— As n— Ty r— Ty r— OH 89mgを得 た。
実施例 15と同様の方法により、 上記べプチドのうち 8.2111 と^1ー T r p— OB z l 7.6 mgを縮合させ、 実施例 15と同様な方法によ り脱 Fmo c化し、 H— As n— Ty r— Ty r— Tr p— OB z 1 1 mgを得た。
工程 2 ：化合物 （I一 19)
実施例 1 8と同様の方法により、 化合物 （1— 1) 0.29 mgと上 記ぺプチド H— As n— Ty r— Ty r— Tr p— OB z l 0.1 0 mgとを縮合させてベンジルエステル体を得た。 実施例 18と同様な方 法により、 脱ベンジル化を行い、化合物 （1—19) 1 9 /gを得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 267 1 (M+H)
ァミノ酸分析； G l y 2. 3 (2) ， A s X 3. 6 (4) ， H i s O . 9 (1) ， Th r 1. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 1 (1) ， Ph e 2. 1 (2) , Ty r 3. 7 (4) ， （Tr pは分 析せず）
実施例 20.
化合物 （I一 20) ：
Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr-Trp-Val -Tyr-Phe-Ala-Hi s -Leu-Asp- 11 e_ 11 e-Trp- OHの合成 工程 1 ： H— Va l— Ty r— Phe— A l a— Hi s -L e u - As (OB z 1) — I 1 e— I 1 e-Tr p-OB z 1
Fmo c-Va l— Ty r— Phe— A l a— H i s— L e u— As (OB z 1) - I 1 e- I 1 e— OHは、参考例 3と同様にし て、 Fmo c— I 1 e力《結合した担体樹脂を用い、 N—保護アミノ酸 Fmoc-IIe -OH, Fmoc -Asp(OBzl) -OH, Fmoc —Leu -OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc— Ala -OH, Fmoc一 Phe — OH, Fmoc -Tyr(t-Bu) -OH, Fmoc -Val 一 OHを順次縮合して合成 を行った。 榭脂からの切り出しも同様に行い、 上記粗ペプチドを得た。 得られたぺプチド 2.0 mgを 200 1の乾燥 DMFに溶解し、 氷 冷下にて乾燥 DMFで調製した 42mgXm 1の HOB tを含む乾燥 DMF 10〃 1、 162mgZm Iの PyBOPを含む乾燥 DMF
10m 1、 34.3 ^ 1 /m 1の NMMを含む乾燥 DMF 10 1、 6 2111 1111の11ー丁 p -OB z 1塩酸塩を含む乾燥 DMF 10 β 1を順に加えた。 4 °Cで一昼夜放置し、 不溶物を濾過し逆相 H P L Cで精製した。 カラムは、 Ch emc 0 Pa ck NUCLEOS I L 5 C 1 8 250 x 20 mml. D. (Chemco社製） を用い、 0· 1 % TFAと 0〜90%ァセトニトリルを用いた直線濃度勾配で溶出した。 目的物を含む画分を凍結乾燥し、 Fmo c-Va 1一 Ty r-Ph e -A 1 a— Hi s—； Leu— As p (OB z 1) 一 I 1 e - I 1 e— T r p -OB z 1を 2.7 m g得た。
ついで、 20 %ピペリジンを含む乾燥 DMF 1 00 1を加え、 室 温で 5分間放置し、 ジェチルエーテルを加え、晶出させ、 エーテル洗 浄、 減圧乾燥を行い、 H— Va 1 -Ty r-P h e -A 1 a-H i s -Leu-As (OB z 1 ) 一 I l e— I l e— Tr p— OB z l を 467 g得た。
(2) 化合物 （I一 20) 実施例 18と同様にして、 化合物 （I一 1) 0.1 4mgと上記工程 1で 得られたぺプチド 1 0 mgとを縮合させてベンジルエステル体を得、 脱ベンジル化を行い、 化合物 （1—20) 10.5 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 3303 (M + H)
ァミノ酸分析； G l y 2. 3 (2) , A s x 4. 0 (4) ， H i s l . 8 (2) ， Th r 1. 0 (1) ， A 1 a 2. 0 (2) , P r o l. 2 (1) , P h e 2. 7 (3) ， Ty r 2. 6 (3) , V a 1 0. 9 ( 1 ) ， L e u 1. 0 ( 1 ) ， I 1 e 1. 7 (2) ， （T r pは分 析せず）
実施例 21.
化合物 （I一 21) ：
- Gly- Asn-Trp- Hi s-Gly-Thr- Ala- Pro-Asp- Trp-Phe-Phe-Asn- Tyr-Tyr- Ala- OHの合成
実施例 Πで得られた化合物 （ I一 17) 0.22 mgを含む 0.2 m 1 D MF溶液に、 PyBOP 1 87〃g、 HOB t 49〃g、 NMM61 gを加え、 室温で 1時間攪拌した。 ついで、 H— A l a— OB z l • To sOH 0· 1 2mgとNMM 35〃 gを含む 35 1 D M F 溶液を加え 4 °Cで 2日間攪拌した。 溶媒を減圧下留去し、 得られた残 渣を DMF 1mlに溶解して実施例 1 5と同様な方法により HPLCで 分取精製して、 化合物 （I一 21) のべンジルエステル体を 36 gを得 た。
質量分析 〔FABMS〕 : 20 1 9 (M + H)
得られたベンジルエステル体 36〃gをDMF 2 () /z lに溶解し、 蟻酸アンモニゥムの飽和メタノール溶液を 20〃 1、 1 0 %P d/C 約 0.1 mgを加えて、 室温で 1時間攪拌した。 反応液を遠心分離にか け上澄み液を採取した。 実施例 18と同様な方法により逆相 HP L Cに かけ粗生成物を分取精製し、 化合物 （I一 21) 7 /gを得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 1 929 CM+H)
ァミ ノ酸分析： G l y 2. 2 (2) , A s x 2. 6 (3) , H ί s 1 . 0 (1) ， Tii r l. 1 (1) ， A 1 a 2. 0 (2) , P r o l. 1 (1) ， Ph e 2. 0 (2) ， Ty r l. 9 (2) , (Tr pは分 析せず）
実施例 22.
化合物 C I -22) ：
― Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Phe-OHの合成
実施例 1 5と同様の方法により、 化合物 （1—17) 0.22mgと H -Ph e-OB z 1 · To s OH 0. 15 m gとを縮合させてベン ジルエステル体を得、 脱ベンジル化を行い化合物 （ 1—22) 27 g を得た。
質量分折 〔PABMS〕 : 2005 (M + H)
ァミ ノ酸分析： Gl y2. 1 (2) , A s X 2. 6 (3) , Hi s l . 0 (1) ， Thr l. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) , P r o l. 0 (1) ， P h e 3. 0 (3) , Ty r 2. 0 (2) ， （Tr pは分 折せず）
実施例 23.
化合物 （I一 23) ： し Gly-Asn-Trp-His-Gly-T r-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Tyr-OHの合成
実施例 15と同様の方法により、 化合物 （I一 17) 0.22mgと H -Ty r-OBz l - To sOH 0. 16 mgとを縮合させてベン ジルエステル体を得、 脱ベンジル化を行い、化合物 （1—23) 3 O^r を得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 202 1 (M+H)
了ミノ酸分析： G l y 2. 2 (2) , A s x 2. 6 (3) ， H i s l . 0 (1) ， Th r l. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) , P r o 1. 1 (1) ， P h e 2. 0 (2) ， Ty r 2. 9 (3) ， （Tr pは分 析せず）
実施例 24.
化合物 （I一 24) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Asn- Tyr- Tyr- Trp- OHの合成
実施例 1 5と同様の方法により、 化合物 （I—17) 22mgと、 H — As n— Ty r— Ty r— Tr p— OB z 1 0.1 7 mgとを縮合さ せてベンジルエステル体を得、 脱ベンジル化を行い化合物 （1—24) 36 // gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2 4 8 5 (M+H)
ァミノ酸分析： G l y 2. 1 (2) ， A s 4. 0 (4) , H i s l . 0 (1) ， Th r l. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 1 (1) ， P h e 1. 9 (2) ， Ty r 3. 9 (4) ， （Tr pは分 析せず）
実施例 25.
化合物 （I一 25) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala- His-Leu- Asp- lie- lie- Trp- OHの合成
化合物 （ I一 15) 1 50〃 gに乾燥 DMFを 1 1 3〃 1加え、 氷冷 下乾燥 DM Fで調製した 0.53mg/m lの HOB t、 2.0 mg/m 1の PyBOP、 0.7 1〃 1 /m 1の NMMを順に 1 0 0 1ずつ加 えた。 得られた混合物に、 実施例 20で得られた H— Va 1— Ty r 一 Phe— Al a— Hi s— Leu— As p (OB z l) — l i e— I 1 e-T r p-OB z I 2.4mg/m 1を含む乾燥 DMF溶液 8
7 β 1を加えた。 得られた混合物を氷冷下で 5時間放置し、 実施例 15 と同様の方法により逆相 H P L Cで精製した。 縮合物を含む画分を凍 結乾燥して化合物 （I—25) のべンジルエステル体 140〃 gを得た。 ついで、 窒素雰囲気下で 25%酢酸を含むメタノール溶液を 200 II 1、 乾燥 DMFを 50 n 1加え、 さらに 10%PdZCを 0.5mg加 え、 水素ガスを導入し室温で 1時間激しく撹拌した。 触媒を瀘去し、 実施例 15と同様な方法により逆相 HP LCで精製した。 目的物を含む 画分の溶媒を減圧下留去し化合物 （I一 25) を 6.5 g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2472 (M + H)
ァミノ酸分析： Asx2. 6 (3) ， G 1 y 2. 0 (2) ， H i s i . 6 (2) ， T r 0. 9 (1) ， A 1 a 1. 6 (2) ， P r o O.
8 (1) ， Va 1 0. 7 (1) , Ty r 0. 9 (1) ， P h e 0. 8 (1) ， （Tr pは分析せず）
実施例 26.
化合物 （I一 26) ： H-G 1 y-A s n-T r p-H i s—G 1 y— Th r -A 1 a-P r o-As p-Tr p-Va 1 -Ty r-Phe -A 1 a— Hi s -L e u-A s p - I 1 e - I 1 e— Trp— OH の合成
参考例 3と同様にして、 Fmo c— Tr p l 0.4 mo lが結合し た担体樹脂 2 Omgを用い、 N—保護アミノ酸として順次、 Fmo c一 l i e— OH、 Fmo c— l i e— OH、Fmo c— As p (O t一 Bu) —OH、 Fmo c—L e u—OH、 Fmo c— H i s (T r t) —OH、 Fmo c -A 1 a -OH. Fmo c— Phe— OH、 Fmo c— Tyr (t— Bu) -OH. Fmo c— Va l— OH、 F o c— Trp— OH、 Fmo c— As p (0 t -B u) — OH、 F o c— P ro— OH、 Fmo c— A l a— OH、 Fmo c— Th r ( t -B u) -OH. Fmo c— G l y— OH、 Fmo c— H i s (Tr t) -OHs Fmo c— Tr p— OH、 Fmo c— As n (T r t) 一 OHおよび Fmo c— G l y— O Hを用いて合成を行う。 最 終工程のみ参考例 3とは異なり、 （b) のピペリジン処理も行った。 樹脂からのぺプチドの切り出しは参考例 3と同様に行い、 粗生成物 2 5mgを得た。 このうち 4. Omgを実施例 4と同様な方法により HP LCで精製し、 1.8mgの化合物 （I一 26) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 24 00 (M + H)
ァミノ酸分析： G l y 2. 4 (2) ， A 1 a 2. 0 (2) ， A s x 2 . 9 (3) , H i s 1. 9 (2) ， I 1 e 1. 0 (2) ， L e u 0. 9 (1) ， Ph e O. 9 (1) ， P r o l. 1 (1) ， Th r 1. 1 (1) ， T y r 0. 9 (1) ， V a 1 0. 7 (1) ， （T r pは分析 せず）
実施例 27.
化合物 （I一 27) ： ヒ Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp- Ile-Il e- Trp- OHの合成 工程 1 ： H - I 1 e - I 1 e— Tr p— OCHPh2
Fmo c— l i e— l i e— Tr p— OHは、参考例 3と同様にし て、 Fmo c— T r pが結合した担体樹脂を用い、 N—保護ァミノ酸 として順次、 Fmo c— I 1 e— OHおよび Fmo c— I 1 e -OH を用いて合成を行い、 樹脂から切り出して、 上記粗ペプチドを得た。 本ぺプチド 1 26 zgに 200〃 1メタノール及び 200 / 1の塩化 メチレンを加えて溶解し、 7.8 mg/m 1のジフヱニルジァゾメタン を含む塩化メチレン 30 1および 28.6〃 1 /m 1の塩酸を含むメ タノ一ル 30 1を氷冷下に加えた。 氷冷下 時間静置し、 室温に戻し 一昼夜放置した。 不溶物を濾過し、 実施例 20と同様に逆相 HP LC ( カラムは YMC社製 YMS— Pa ck 008_八^—3 1 2を使 用） にて精製した。 これを凍結乾燥し Fmo c— I 1 e— I 1 e— T r p— OCHPh2を 7 5 g得た。 ついで、 2 0 %ピペリジン溶液 を含む乾燥 DMFを 1 0 0 II 1加え、 室温で 5分間放置した後、 不溶 物を濾去し、 上記と同様に逆相 H P LCで精製した。 目的物を含む画 分の溶媒を減圧下にて留去し、 H— I 1 e— I 1 e— T r p—OCH P h2 を 3 2 g得た。
工程 2 ：化合物 （1—27)
実施例 15で得られた化合物 （I -15) 6 4 ^ gを 4 0 ^ 1の乾燥 D MFに溶解し、 氷冷下乾燥 DM Fで調製した 1. lmg m 1の HOB t、 4. l mg/m 1の P y BOP、 1.5 ^ 1 /m 1の NMM、 H- I 1 e - I I e-T r p -OCHP h2 3 1.7 mg/m 1を順に 2 0 1 ずつ加えた。 氷冷下 2時間放置し、 反応溶液を実施例 1 5と同様にし て逆栢 HP LCで精製した。 得られた画分の溶媒を減圧下留去し、 ィヒ 合物 （1—27) のべンズヒドリルエステル体を 3 7 g得た。 ついで、 TF A 9 0 0 1、 ァニソ一ル 5 0 ; 1、 1， 2—エタンジチオール 5 0 1、 2—メチルインドール 5 m gの混合溶液を 2 5 1加え、 室温にて 1時間撹拌した。 反応液にジェチルエーテル 0.5 m 1を加え、 化合物 （I一 27) を晶出させ、 エーテル洗浄、 減圧乾燥を行い化合物
( I -27) を 1 0· 1 g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 5 3 5 (M + H)
アミノ酸分析： A s x l. 7 (2) ， G l y 2. 1 (2) ， H i s O . 9 (1) ， Th r 1. 0 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o l. 3 (1) ， I 1 e 2. 0 (2) , (T r は分析せず）
実施例 28.
化合物 （I一 28) ： し Gly-Asn-Trp-His-GIy-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Leu-Tyr-Phe-Ala- His- Gin- Asp-Val-Ile-Trp-OHの合成 工程 1 ： H— Le u— Ty r— Ph e— A l a— H i s— G i n— A s p (OB z 1 ) - V a 1 - I l e— Tr p— OB z l
参考例 4で得られた化合物 （d) 555〃 を200〃 1の乾燥 D MFに溶解し、 乾燥 DM Fで調製した 15.9 mg/m 1の HOB t , 61. SmgZmlの PyBOP、 21.5 z 1 /m 1の NMMを氷冷下 順次 1 0 ^ 1ずつ加え、 更に 7.8 mg/m 1の H— Tr p— OB z 1 塩酸塩を 20 1加えた。 反応溶液を 4 °Cにて一昼夜放置し、不溶物 を濾過し濾液を参考例 3と同様な方法により逆相 H P L Cで精製した c この際、 カラムはケムコ （株） 製の Ch emc o— Pa c k NUC LEOS I L 5 C 1 8C250 X 2 Omml.D. )を用い、 凍結乾燥 した。 ついで、 本凍結乾燥品に乾燥 DMFで調製した 20%ピベリジ ン溶液を 1 00 1加え、 室温で 5分間放置した後、 減圧下溶媒を 5 0 a 1まで濃縮し、 ジェチルエーテルを加えて析出させ、 更にエーテ ル洗浄減圧乾燥を行い、 H— L e u— Ty r— Ph e— A l a— H i s— G i n— As p (OB z 1 ) - V a 1 - I 1 e-Tr p-OB z 1を 250〃 g得た。
工程 2 ：化合物 （I一 28)
実施例 15で得られた化合物 （ I一 15) を 1 00 1の乾燥 DMFに 溶解し、 乾燥 DMFで調製した 0.72 mg/m 1の HOB t、 2.8 m g/mlの PyBOP、 1.0〃 1 /m 1の NMM、 2.5mgZmlの 上記べプチドを氷冷下順次 50 1ずつ加えた。 混合液を 4 °Cにて一 昼夜放置し、 不溶物を濾去し、 実施例 1 5と同様にして逆相 HPLC で精製した。 得られた画分を凍結乾燥し化合物 （1—28) のべンジル エステル体を 66 g得た。 ついで、 乾燥 DMF 30 Z 1、 蟻酸アン モニゥムで飽和したメタノール溶液 30 a 1を加え、 更に小量の 1 0 %P d/Cを加え室温で 1時間激しく撹拌した。 その後触媒を濾去し、 実施例 15と同様な方法により逆相 HP L Cで精製した。 カラムは YM C社製 YMC Pa c k OD S - AM 3 1 2 (1 50 x 6 mml. D.) を用いた。 目的物を含む画分の溶媒を減圧下留去し、 化合物 （I
— 28) を 1.2 jt g得た。
質量分析 〔MBMS〕 : 2 3 9 7 (M+H)
アミノ酸分折： As X 2. 6 (3) , G 1 X 1. 0 (1 ) ， G 1 y 2 . 2 (2) ， H i s 2. 0 (2) ， Th r 1. 0 (1 ) ， A 1 a 2. 0 (2) ， P r o 1. 2 (1 ) ， Ty r 1. 1 (1 ) ， V a 1 0. 9 (1) ， I 1 e 0. 7 (1 ) ， L e u 1. 1 (1) ， P h e 1. 3 (1) ， （T r pは分析せず）
実施例 29.
化合物 （I一 29) ：
- Gl y-Asn-Trp-His-Cl y-Thr-Al a-Pro- Asp- Ala- OBz 1の合成
実施例 14で得られた化合物 （ I一 14) 1 0.0 gを DMF 1 0 I に溶解し、 氷冷下 H OB t 4.3 g、 P yBOP 1 6.7 g、 NMM 4.9 /z gを加え 3 0分間放置した。 反応液に H— A 1 a— OB z 1 · To s OH 1 1.3 / gを加えて 1 5°Cで 1晚放置し、 実施例 14と同 様な方法により YMC社製 YMC P a c k OD S-AM3 1 2 カラム （1 5 0 X 6 mm l. D. ) を装着した逆栢 H P L Cで精製し、 凍結乾燥することにより化合物 （I一 29) 5.0 ^ gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 0 9 8 (M+H)
アミノ酸分析： A s x l. 6 (2) ， G 1 y 2. 2 (2) ， H i s l . 0 (1) ， Th r 0. 9 (1) ， A 1 a 1. 8 (2) ， P r o. 1. 2 (1) ， （T r pは分析せず）
実施例 30.
化合物 (1 -30) ：
I— Gly- Asn- Trp- His-Giy-Thr- Ala- Pro- Asp- 卜 OBzlの合成
実施例 14で得られた化合物 （ I一 14) 1 0.0 gを DMF 1 0 ^ 1 に溶解し、 氷冷下 HOB t 4.3 ^ g . P y BOP 1 6.7〃 g、 MM 4.9 a gを加え 3 0分間放置した。 反応液に H— V a 1 _OB z 1 · T o s OH4.0〃 gを加えて 1 5 °Cで 1晚放置し、 実施例 1 4と同様 な方法により YMC社製 YMC P a c k 003—八]^3 1 2カ ラム （1 5 0 X 6 mm I . D. )を装着した逆相 H P L Cで精製し、 凍結乾燥することにより化合物 （I一 30) 7.0 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 1 2 6 (M+H)
アミノ酸分析： A s x l . 8 (2) ， G 1 y 2. 2 (3) ， H i s l . 0 ( 1 ) ， Th r l . 0 ( 1 ) , A 1 a 1. 1 ( 1 ) ， P r o l . 0 ( 1 ) ， V a i l . 2 ( 1 ) ， （T r pは分析せず）
実施例 31.
化合物 （I一 31) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Gly-OMe の合成 実施例 15で得られた化合物 （1—15) 3 0 /Z gに乾燥 DMFを 3 0 μ. 1加え、 乾燥 DMFで調製した 0.5 3 mg/m 1の HOB t、 2.0 mg/m 1の P y BOP、 0, 7 1〃 I /m 1の NMMを氷冷下順次 10// 1ずつ加えた。 さらに 0.0 6 4 mg/m 1の H— G 1 y— OM eを含 む乾燥 DMFを 4 0 fi 1加えた。 反応液を氷冷下 1時間放置し、 室温 に戻しさらに 2時間反応させた。 次に， 不溶物を濾過し実施例 15と同 様な方法により、 逆相 H P L Cで精製した。 縮合物を含む画分の溶媒 を減圧下留去し化合物 （I一 31) を 8.0 g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 1 9 4 (M + H)
ァミノ酸分析： A s x l . 8 (2) ， G 1 y 2. 4 (2) , H i s O . 9 ( 1 ) ， Th r l. 1 ( 1 ) ， A 1 a 1. 0 (1 ) ， P r o l . 2 ( 1 ) , (T r pは分析せず） 実施例 32.
化合物 （ I一 32) し Gl y-Asn-Trp-Hi s-Gl y-Thr-AI a-Pro- Asp- Trp-Asn-Tyr-Tyr-Trp- OH の合成
参考例 3と同様の方法により Fmo c-Ty rが結合した担体樹脂 を出発物質として用い、 N—保護アミノ酸 Fmo c— Ty r (t— B u) -OHおよび Fmo c— A s n (Tr t) — OHを順次結合して 保護ペプチドを合成し、 担体樹脂から切り出して粗ペプチド Fmo c — A s n— Ty r— Ty r— OHを得た。 ついで、 得られたペプチド 8.2mgを 5m 1の乾燥 DMFに溶解し、 乾燥 DMFで調製した 1 5. 4mg/m 1の HOB t、 5 9.6 mgZm 1の P y B 0 P、 2 1〃 1 /m 1の NMM、 1 5.2 mgZm 1の H— Tr p— OB z 1塩酸塩を 氷冷下にて順に 2 5 0 1ずつ加えた。 4 °Cで 5時間反応させ、 不溶 物を濾過し逆栢 H PLCで精製した。 カラムは、 ケムコ （株） 製の C em c o P a c k NUCLEO S I L 5 C 1 8 ( 2 5 0 X 2 Omml.D.) を用いた。 目的物を含む画分を凍結乾燥し F m o c— A s n— Ty r— Ty r— Tr p—OB z 1を 6.7 5 m g得た。
次に、 この化合物 2.7 mgに 2 0 %ピぺリジンを含む乾燥 DMF 1 0 0 1を加え、 室温で 5分間放置し、 ジェチルエーテルを加え晶 出させ、 エーテル洗浄、 減圧乾燥を行い H— A s n— Ty r— Ty r — T r p— OB z 1を 2. 2 5mg得た。
次に、 実施例 15で得られた化合物 （I一 15) 1 0 0 // gに乾燥 DM Fを 1 0 0 z 1加え、 乾燥 DMFで調製した 0.7 2 mgZm lの HO B t 2.8mg m 1の PyBOP、 l z l/m lのNMM、 0.4 5 // 1の11ー八5 11—丁71"—丁71"—丁 ー082 1を氷冷 下順に 5 0 1ずつ加えた。 反応溶液を氷冷下で 3時間放置した後、 不溶物を濾去し実施例 2 5と同様の方法により逆相 HP L Cで精製し た。 得られた画分の溶媒を減圧下留去して化合物 （I一 32) のべンジ ルエステル体を 80 g得た。
次に、 このべンジルエステル体 80 gに乾燥 DMF 30〃 1、 蟻 酸アンモニゥムで飽和したメタノ一ル溶液 30 1を加え、 更に 1 0 %PdZCを少量加え室温で 1時間激しく攪拌した。 その後、 触媒を 濾去し、 上記と同様にして、 逆相 HPLCで精製した。 カラムは YM C社製 ODS—AM3 1 2を用いた。 目的物を含む画分の溶媒を減 圧下留去し、 化合物 （I—32) を 42 a g得た。
質量分析 〔FABMS〕 ： 1 750 (M+H)
ァミノ酸分析： As x 2. 0 (2) ， G 1 y 2. 4 (2) ， H i s 1 . 1 (1) ， Th r 0. 9 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， P r o 1. 4 (1) ， Ty r 2. 0 (2) ， （Tr pは分析せず）
実施例 33.
化合物 （I一 33) ：
― Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala- Phe- Phe- Asn- Tyr- Tyr- Trp- OHの合成
工程 1 ： (1) H— Va l—Ty r— Ph e— A l a— Ph e— Ph e— As n— Ty r— Ty r— Tr p— OBz 1
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— Ty rが結合した担体樹 脂を出発物質として用い、 N—保護アミノ酸 Fmo c— Ty r (t— B u) -OH, Fmo c - A s n (T r t ) 一 OH, Fmo c— Ph e -OH, Fmo c - P h e -OH, Fmo c - A 1 a -OH, Fm o c— Ph e— OH， Fmo c— Ty r ( t - B u) —OHおよび F mo c-Va 1一 OHを順次結合し、 担体樹脂から切り出して粗ぺプ チド Fmo c— Va 1 -Ty r-Ph e-A l a— Ph e— Ph e— As n— Ty r— Ty r— OHを得た。
ついで、 得られたぺプチド 4.9 mgを 2 m 1の乾燥 DMFに溶解し、 乾燥 DMFで調製した 2.8mgZm 1の HOB t、 10.6mg/ml の PyBOP、 4〃 lZmIの NMM、 2. 7mgZmlの H— Tr p-OB z I塩酸塩を氷冷下順に 0. 5mlずつ加えた。 4 °Cで一昼 夜放置し、 不溶物を瀘過し逆相 H PLCで精製した。 カラムは、 ケム コ （株） 製の C heme o Pa ck NUCLEOS I L 5 C 1 8 (250 X 20 mm I. D.) を用い、 0.1 %TFAと 0〜90% ァセトニトリルを用いた直線濃度勾配で溶出した。 縮合物を含む画分 を凍結乾燥し、 Fmo c— Va l— Ty r-Phe— Al a— Phe — Phe— Asn— Tyr— Ty r— Trp— OB z lを 5.4mg得 た。
この化合物 5. 4mgに 20 %ピペリジンを含む乾燥 DMF 1 00 Iを加え、 室温で 5分間放置し、 ジェチルエーテルを加え晶出させ、 ェ一テルで洗浄し、 減圧乾燥を行い、 H— Va l— Tyr— Phe— A 1 a-Phe-P e-As n-Ty r-Ty r-Trp-OBz 1を 3. Omg得た。
工程 2 ：化合物 （I一 33)
実施例 15で得られた化合物 （I一 15) 100 ^ gに乾燥 DMFを 1 00 1加え、 乾燥 DMFで調製した 0.72mg/m 1の HOB t、 2.8mgZmlの PyBOP、 1 fi 1 Zm 1の NMMを水冷下順に 5 0 1ずつ加え、 さらに上記工程 1で得られた部分べプチドの 3.0 m g/m 1の乾燥 DMF溶液を 50 1加えた。 反応溶液を氷冷下で 3 時間放置し、 不溶物を濾過し逆相 HP LC (カラムは YMC社製 0 DS-AM-3 12を使用) で精製した。 縮合物を含む画分の溶媒を 減圧下留去し、 化合物 （1—33) のべンジルエステル体を 1 10 g 得た。 ついで、 このべンジルエステル体 1 10 に乾燥01^?を5 0 I、 蟻酸アンモニゥムで飽和したメタノ一ル溶液を 50 fi 1加え、 さらに少量の 1 0%PdZCを加え、 室温で 2時間激しく撹拌した。 その後、 触媒を濾去し、 上記と同様にして逆相 HPLCで精製した。 目的物を含む画分の溶媒を減圧下留去し、 化合物 （I一 33) を 2.0 / g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 252 5 (M + H)
ァミノ酸分析： As x 0 (3) , G 1 y 2. 5 (2) ， H i s l . 1 (1) ， Th r 1. 3 (1) ， A 1 a 2. 0 (2) ， P r o l.
1 (1) ， Ph e 3. 0 (3) , Ty r 2. 9 (3) ， V a 1 1.
0 (1) ， （Tr pは分析せず）
実施例 34.
化合物 （I一 34) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Tyr-Ala- His_Leu- Asp- Ile_Ile- Trp- OHの合成
工程 1 ： H_Va l— Ty r— Ty r_A l a— H i s— L e u— As p
(OB z 1) — I 1 e— I 1 e-Tr p-OB z 1
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— I 1 eが結合した担体樹 脂を用い、 N—保護ァミノ酸 Fmo c— l i e— OH， Fmo c— A s p (OBz 1 ) -OH, Fmo c— L e u— OH， Fmo c— H i s (T r t ) -OH, Fmo c— A l a— OH， Fmo c— Ty r
( t - B u) -OH, Fmo c— Ty r (t— Bu) —OHおよび F mo c-Va 1一 OHを順次結合して保護ペプチドを合成し、 担体樹 脂から切り出して、 粗ペプチド F mo c-Va 1 -Ty r-Ty r- A l a-H i s-L e u-As p (OB z 1 ) — I 1 e - I 1 e -0 Hを得た。 得られたぺプチド 4.1 mgを 1 m 1の乾燥 DMFに溶解し、 乾燥 DMFで調製した 3 mg m 1の HOB t、 1 2 mg/m 1の P yBOP、 4〃 1 Zm 1の NMM、 3 m g/m 1の H— T r p— 0 B z 1塩酸塩を氷冷下順に 0.5 m 1ずつ加えた。 4 °Cで一昼夜放置し、 不溶物を濾過し逆相 H PLCで精製した。 カラムはケムコ （株） 製の Ch emc o Pa c k NUCLEOS I L 5 C 1 8 ( 250 x 20mm I. D. ) を用い、 0· 1 %T F Aと 0〜90%のァセトニトリ ルを用いた直線濃度勾配で溶出した。 目的物を含む画分を凍結乾燥し、 Fmo c-Va 1 -Ty r -Ty r-A l a— H i s -L e u -A s p (OB z 1 ) ー 1 1 6_ 1 1 6—丁 ー082 1を2.95111 得 た。
得られたぺプチド 2.9 5 mgに 2 0 %ピペリジンを含む乾燥 DM F I 0 0 β Iを加え、 室温で 5分間放置し、 ジェチルエーテルを加え目 的物を晶出させ、 エーテルで洗浄し、 減圧下乾燥し、 H— Va 1一 T y r-Ty r-A l a-H i s-L e u-As p (OB z 1 ) - I 1 e - I I e—Tr p— OB z lを 1.8 7 m g得た。
工程 2 ：化合物 （I一 34)
実施例 15で得られた化合物 （I一 15) 1 0 0 z gに乾燥 DMFを 10 0 1加え、 乾燥 DMFで調製した 0.7 2mgZm 1の HOB t、 2. 8 mg/m 1の P y B◦ P、 l IXm lの NMMを氷冷下順に 5 0 H 1ずつ加え、 さらに上記工程 1で得られた化合物 2.2 mgZm 1の 乾燥 DMF溶液を 5 0 1加えた。 反応液を氷冷下で 4時間放置し、 不溶物を濾過し逆相 HP LCで精製した。 カラムは YMC社製 OD S— AM— 312 を使用した。 縮合物を含む画分の溶媒を減圧下留去し 化合物 （I一 34) のべンジルエステル体を 74.5 g得た。 ついで、 この化合物 74.5 gに乾燥 DMFを 3 0〃 1、 および蟻酸アンモニ ゥムで飽和したメタノール溶液を 3 0 IL 1加え、 さらに少量の 1 0 % PdZCを加え、 室温で 2時間激しく撹拌した。 その後、 触媒を濾去 し、 上記と同様にして逆相 HP LCで精製した。 目的物を含む画分の 溶媒を減圧下留去し、 化合物 （ I一 34) を 0.7 4 g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2 3 9 8 CM+H)
アミノ酸分析： A s x 2.8 (3) ， G 1 y 2.8 (2) ， H i s 1.9 ( 2 ) ， T h r 1.1 ( 1 ) , A l a 2.0 ( 2 ) , P r o 1.3 (l ) , Va l I.0 CI ) , T y r 1.6 (2) ， L e u 1.0 (1 ) ， l i e 2.4 (2) ， （T r pは分析せず）
実施例 35.
化合物 （ I一 35) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Ala-His-Leu-Asp- Ile-Ile- Trp- OHの合成
工程 1 ： H - A l a - H i s - L e u— A s p (OB z 1 ) - I 1 e 一 I 1 e-T r p-OB z 1
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c - I 1 eが結合した担体樹 脂を出発物質として用い、 N—保護ァミノ酸 Fmo c - I 1 e -OH, Fmo c - A s p (OB z 1 ) -OH, Fmo c -L e u -OH, Fmo c— H i s (T r t ) —OHおよび Fmo c - A 1 a— OHを 順次結合し、 担体樹脂から切り出して粗べプチド Fmo c— A 1 a— H i s— L e u— A s p (OB z 1 ) — I l e— I 1 e— OHを得た c 得られたぺプチド 9.9 mgを 1 m 1の乾燥 DMFに溶解し、 室温にて HOB t 2.7 mg, Py BOP 40.4mg, NMM4.4 z 1を加え、 5分間攪拌し、 乾燥 DMFで調製した 3.3 mg/m 1の H— T r p- OB z 1塩酸塩を l m〗加えた。 室温で 3時間反応させ、 不溶物を濾 過し、 実施例 1 7と同様の方法により逆相 H PL Cで精製した。 ぺプ チドを含む画分を凍結乾燥し、 Fmo c— A 1 a— H i s— L e u— A s (O B z 1 ) 一 I 1 e - I 1 e -T r p-OB z 1を 5.7mg 得た。
この化合物 5.7 mgに 2 0 %ピペリジンを含む乾燥 DMF 1 5 0 /1 1を加え、 室温で 5分間放置し、 ジェチルェ一テルを加え晶出させ、 エーテル洗浄および減圧乾燥を行い、 H— A 1 a -H i s— L e u— A s p (0 B z 1 ) 一 I l e— I l e— T r p— OB z lを 9 6 4〃 g得た。
工程 2 ：化合物 （I一 35) 実施例 15で得られた化合物 （1—15) 100 /zgに乾燥 DMFを 1 30 n 1加え、 乾燥 DMFで調製した 0.72mgZm 1の HOB t、 2.8111 //1111の？ 780?、 1 1 Zm 1の ΝΜΜを氷冷下順次 50 β 1ずつ加え、 さらに上記工程 1で得られる化合物の 6 m gZmlの 乾燥 DMF溶液を 1 9 / 1加えた。 反応溶液を氷冷下で 5時間放置し、 不溶物を濾過し実施例 15と同様の方法により逆相 H PLCで精製し た。 縮合物を含む画分の溶媒を減圧下留去し、 化合物 （I一 35) のべ ンジルエステル体を 172 ^ g得た。 ついで、 この化合物 172 g に乾燥 DMFを 50 / K 蟻酸アンモニゥムで飽和したメタノール溶 液を 50 1加え、 さらに少量の 1 0 % P d— Cを加え、 室温で激し く撹挣した。 その後、 触媒を濾去し、 上記と同様にして逆相 HP LC で精製した。 目的物を含む画分の溶媒を減圧下留去し、 化合物 （I一 35) を 56 g得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1973 (M+H)
アミノ酸分析： As x2. 7 (3) ， G 1 y 2. 1 (2) ， H i s 2 . 1 (2) ， Th r 1. 1 CI) , A 1 a 2. 0 (2) ， P r o l. 0 (1) ， P e 1. 0 (1) ， I 1 e 1. 9 (2) ， Le u 1. 1 (1) ， （Tr pは分析せず)
実施例 36.
化合物 （ I一 36) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Ala-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Trp- OHの合成
工程 1 ： H— As p (O t—Bu) -Tr p-Phe-Phe-As n-Tyr-Tyr-Tr p-OBz 1
(a) 参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— Ty r (t -B u) が結合した担体樹脂を出発物質として用い、 N—保護ァミノ酸を順次 結合し担体樹脂から切り出して粗べプチド Fmo c— Tr p— Phe -Ph e-As n-Ty r-Ty r一 OHを得た。 得られたぺプチド 12.75mg及び PyBOP l 0.4mgを DMFO.5mlに溶解し， MM4.4 [11を含む 0· 5 m 1 DMF溶液 0.5 m 1と、 H 0 B t 3.1 mgを含む 0.5 ml DMF溶液をそれぞれ加え、 室温で 5分間撹拌し た。 この混合物に、 予め NMM1.1 β 1を加えた H— T r p-OB z 1 · H C 13.3 mgを含む 0.5 m 1 DM F溶液を加え室温で 2時間 撹拌した。 反応液を 0.5 m 1まで濃縮し、 エーテルを加えて生成する 白色沈澱を濾取し、 乾燥し、 Fmo c_Tr p— Ph e— Ph e—A s n-Ty r-Ty r-Tr p-OB z 1 9 m gを得た。
(b) (a) で得られた保護ペプチド 9 mgを 20%ピぺリジンを含 む DMF 300 // 1に溶解し、 室温で 1 5分間放置した。 エーテルを 加えて生成する白色沈澱を濾取し、 乾燥し、 H— Tr p— Ph e— P h e-As n-Ty r-Ty r-Tr p-OB z 16.6 m gを得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 1 2 1 6 (M + H)
(c) Fmo c -A s p (O t -B u) — OH 3.4 m g及び P y B O P 8.4 mgを DMF 0.5 m 1に溶解し、 NMM2.7〃 1、 HOB t
3.1 mgの 0.5 m 1 DMF溶液をそれぞれ加えて室温で 5分間撹拌 した。 ここに、 （b) で得られたペプチド 6.6 mgを含む 1 m 1 DM F溶液を加え、 室温で 2時間撹拌した。 生成物を実施例 1 7と同様の 方法により逆相 HP L Cで分取精製し、 Fmo c— As p (O t— B u) -Tr p-Ph e-Ph e-As n-Ty r-Ty r-Tr p- OB z 1を 3.6 mg得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 6 1 0 (M + H)
(d) (c) で得られた保護ペプチド 3. 6mgを， （b) と同様の 処理をして、 工程 1で標記された化合物 2 m gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 1 3 8 6 (M + H)
工程 2 ： H-G l y-As n-Tr p-H i s—G l y— Th r— A 1 a— A 1 a— As p— Tr p— Ph e— Ph e— As n— Ty r— Ty r— T r p— OB z I
参考例 3で得られた化合物 （c) 4.2 mgを DMF 56 1に溶解 し、 PyBOPの 0. SmgZm 1 DMF溶波 8.1 1、 HOB tの 0.2 MDMF溶液 8.1 1、 NMMの 1 %DMF溶液 1 5 / 1を加え、 0°Cで 30分間撹拌した。 得られた混合物に、 上記工程 1で得られた H— As p (0 t -B u) -Trp-Phe-Ph e-As n-Ty r-Ty r -T r p -OB z 1 0.27 z m o 1の 0.1 m 1 DMF 溶液を加え、 4°Cで 24時間、 室温で 6時間撹拌した。 溶媒を減圧下 留去し、 残渣を再び DM Fに溶解して、 生成物を実施例 15と同様の 方法により逆栢 H P L Cで分取精製し， 工程 2で標記された化合物 Fmo c-GI y-Asn-Trp-Hi s -G 1 y-Th r -A 1 a— Al a— Asp (O t -B u) -Trp-Phe-Phe-As n-Tyr-Ty r-Trp-OBz I 0.1 8 ragを得た。
(b) (a) で得られた保護ペプチド 180 gに 98%蟻酸 20 fi 1を加え、 室温で 2時間放置し、 エーテルを加えて析出する沈澱を濾 取し、 乾燥し、 20 %ピぺリジンを含む DMF 20 /^ 1を加え、 室 温で 15分間放置した。 再びエーテルを加えて析出する沈澱を濾取し、 乾燥し、 標記化合物 140 ^ gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 21 26 CM + H)
工程 3 ··化合物 (1-36)
(a)工程 2で得られた化合物 600 ;zgを含む 500〃 1 DMF 溶液を 0 °Cに冷却し、 D E P C 0.2〃 1および T E A 0.4 1を加 え、 4°Cで 3日間撹拌した。 溶媒を減圧下留去し、 工程 2 (a) と同 様の方法により逆栢 HP LCで精製し、 化合物 （1—36) のべンジル エステル体 420 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2 108 (M + H)
(b) (a) で得られた化合物 1 50 を DMF 50 ^ 1に溶解し、 蟻酸アンモニゥムの飽和メタノール溶液 50〃 1、 1 0 %P d/C約 0.1 mgをそれぞれ加え、 室温で 1.5時間撹拌した。 反応物を遠心分 離し、 上澄み液を採取し、 （a) と同様の方法により逆相 HPLCで 精製し、 化合物 （I一 36) 52 /z gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 20 1 6 (M+H)
了ミノ酸分析： G l y 2. 1 (2) ， A s X 2. 7 (3) , H i s l . 0 (1) ， Th r 1. 1 (1) ， A 1 a 2. 0 (2) ， P h e 2. 3 (2) , Ty r 2. 4 (2) , (T r pは分析せず）
実施例 37.
化合物 （1—37) ： H— G l y— As n_Tr p— H i s— G l y_ T h r - A 1 a— P r o— As p— Tr p— Va 1 -Ty r-Ty r -A 1 a— H i s -; Le u— As p— I 1 e— I 1 e— Tr p— OH の合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— T r p l 5. 6 mo l が結合した担体樹脂 3 Omgを出発物質として用い、 N—保護ァミノ 酸として順次、 Fmo c— I 1 e -OH. Fmo c— I 1 e -OH. Fmo c— As p (0 t - B u) -OH. Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— H i s (Tr t) — OH、 Fmo c— A l a— OH、Fm o c -T y r ( t - B u) -OH.Fmo c -Ty r ( t - B u) 一 OH、Fmo c— V a 1— OH、 Fmo c— Tr p— OH、 Fmo c -As p (O t— Bu) — OH、 Fmo c— P r o— OH、 Fmo c -A 1 a -OH. Fmo c—Th r (t -B u) -OH. Fmo c— G 1 y -OH. Fmo c— H i s (Tr t) -OH. Fmo c— Tr p -OH. Fmo c— As n (Tr t) —OH、 Fmo c— G l y— OHを用いて合成を行った。 最終工程のみ参考例 3とは異なり、 （b) のピペリジン処理も行った。 樹脂からのぺプチドの切り出しは参考例 3と同様に行い、 粗ペプチド 63.5 mgを得た。 このうち、 1.7mg を参考例 3と同様の方法により逆相 HP L Cで精製後凍結乾燥し、 0.44 mgの精製品を得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 2 4 1 5 (M + H)
ァミノ酸分折： Gl y2. 3 (2) ， A 1 a 2. 0 (2) , A s χ 2 . 6 (3) ， H i s 2. 0 (2) ， I 1 e 1. 6 (2) ， L e u 0. 9 (1) , P r o l. 1 (1) , Th r 1. 1 (1) ， Ty r 1 . 6 (2) ， Va l 0. 7 (1) ， （Tr pは分析せず）
実施例 38.
化合物 （I一 38) ： H— G l y— Asn— Tr p— Hi s— G l y— Thr— Al a— P r o— As p— Tr p— ; Leu— Ty r— Phe -A 1 a— Hi s -G 1 n-A s -V a 1一 I 1 e— Trp— OH の合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— Trp l 5. 6 /xmo l 力結合した担体樹脂 3 Omgを出発物質として用い、 N—保護ァミノ 酸として順次、 Fmo c-I 1 e-OHv Fmo c— Va l— OH、 Fmo c— As p (0 t -Bu) 一 OH、 Fmo c— G i n (T r t ) -OH. Fmo c— H i s (T r t) —OH、 Fmo c—Al a— O H、 Fmo c— P h e— OH、 Fmo c—Tyr (t— Bu) -OH 、 Fmo c— Leu— OH、 Fmo c— Trp— OH、 Fmo c— A s p (Ot— Bu) -OH. Fmo c— Pr o— OH、 Fmo c— A 1 a— OH、 Fmo c— Th r (t—Bu) — OH、 Fmo c— Gl y— OH、 Fmo c—Hi s (Tr t) —OH、 Fmo c— Tr p— OH、 Fmo c— As n (Tr t) — 0 Hおよび Fm o c— G 1 y— OHを用いて合成を行った。 最終工程のみ参考例 3とは異なり、 （b) のピペリジン処理も行った。 樹脂からのぺプチドの切り出しは参考例 3と同様に行い、 粗ペプチド 56.0 mgを得た。 このうち、 2.5m gを参考例 3と同様の方法により逆相 HP L Cで精製後凍結乾燥し、 精製品 0.42mgを得た。
質量分折 〔FABMS〕 : 241 4 (M + H)
ァミノ酸分析： Gl y2. 2 (2) ， A 1 a 2. 0 (2) ， A s x 2 . 7 (3) ， H i s 2. 0 (2) , I 1 e 0. 6 (1) ， L e u 1. 1 (1) ， P r o l. 1 (1) ， Th r l. 0 (1) , Ty r 1. 0 (1) ， V a 1 0. 6 (1) ， G 1 1. 2 (1) ， P h e 1. 1 (1) ， （Tr pは分析せず）
実施例 39.
化合物 （I一 39) ：
- Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr- Asn- lie- lie- Trp- OHの合成
工程 1 ： H— As n— I 1 e— I 1 e - Tr p—OB z 1
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— I 1 eが結合した担体樹 脂を用い、 N—保護ァミノ酸 Fmo c— I 1 eおよび Fmo c— As n (Tr t) —OHを順次結合して保護ペプチドを合成し、 樹脂から 切り出して粗べプチド Fmo c— As n— I 1 e - I 1 e— OHを得 た。 得られた本べプチド 5.8 mgを 1 m 1 DMFに溶解し、 P y B 0 P 10.4mg、 HOB t 2.7mg、 NMM4.4 β 1を加え、 室温で 5 分間放 gした。 反応液に H— T r p— OB z l « HC 13.3mgの 1 ml DMF溶液を加えて室温で 3時間撹拌した。 溶媒を減圧下留去 し、 残渣を実施例 36工程 1と同様の方法により逆相 H PLCで精製 し工程 1で標記された化合物の Fmo c体 5.4 m gを得た。 この化合 物を、 20 %ピペリジンを含む DMF 1 m 1に溶解し室温で 1 0分間 放置した。 エーテルを加えて生成する沈澱を濾取し、 逆相 HPLCで 精製し、 工程 1で標記された化合物 5 m gを得た。
工程 2 ：化合物 （I一 39)
実施例 21と同様に、 化合物 （I—17) 0.1 9mgと、 H— A s n— I l e- I l e-Tr p-OB z l O.1 m gとを縮合させてベンジル エステル体を得て、 脱ベンジル化を行い標記化合物 1 を得た。 質量分析 〔FABMS〕 : 2385 (M+H) ァミノ酸分析； Gl y2.2 (2) , A s x 3.3 (4) ， Hi s O.9 ( 1 ) ， T h r 0.9 ( 1 ) ， A 1 a 1.0 ( 1 ) ， P r o 1.0 ( 1 ) ，
P h e 1.8 (2) ， T y r 1.7 (2) ， I 1 e 1.4 (2) ， (T r p は分析せず）
実施例 40.
化合物 （I一 40) ： し Gly-Asn-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Phe-Phe-Asn-Tyr- Tyr-AIa- His- Leu- Asp_Ile- Ile-Trp- OHの合成
実施例 21と同様の方法により、 実施例 1 7で得られた化合物 （I -17) 0.1 9mgと、 実施例 35工程 1で得られた H— A l a-H i s—： Leu— Asp (OB z 1 ) 一 I 1 e - I 1 e— Trp— OBz 10. lm gとを縮合させてベンジルェステル体を得た。 得られた生成物 を実施例 1 8と同様の方法により脱べンジル化して標記化合物 9.5 gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2708 (M + H)
アミノ酸分折； Gl y2.3 (2) ， A s x 3.4 (4) ， H i s 1.9 (2) , T r 1. I ( 1 ) ， A 1 a 2.0 (2) , P r o 1.2 ( 1 ) ， P e 1.8 (2) ， T y r 1.8 (2) ， l i e 2.5 (2) , Leu 1.0 ( I ) , (Trpは分析せず）
実施例 41.
化合物 （ I一 41) ：
- Gly-Asp-Trp-His-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala- His- Leu-Asp-IIe- lie- Trp-OHの合成
工程 1 ： Fmo c-G 1 y-As p (OBz I) - Tr p - Hi s— G 1 y-Th r一 A 1 a— OH
参考例 3と同様な方法により、 Fmo c— A i a 60 ^mo lが結 合した担体樹脂 1 0 Omgを出発物質として用い、 N—保護アミノ酸 として順次、 Fmo c— Th r (t— Bu) — 0H、 Fmo c—G l y - 0H、 Fmo c - H i s (T r t) - 0H、 Fmo c - Tr p— 0H、 Fmo c— As p (OB z l) - 0H、 Fmo c— G l y - 0 Hを用いて保護ペプチドを合成し、 樹脂から切り出して、 実施例 1 5 と同様の方法により HPLCで精製し、 標記化合物 40.5mgを得た。 質量分析 〔FABMS〕 ： 1 056 (M + H)
アミノ酸分析： As χ θ. 6 (1) ， G 1 y 1. 6 (2) ， H i s i . 0 (1) ， Th r O. 9 (1) ， A 1 a 1. 0 (1) ， （Tr pは 分析せず）
工程 2 ： H-G 1 y—As p (OB z 1 ) -Tr p— H i s— G l y — Th r— A 1 a— P r o— A s p— T r p— OB z 1 (N02)
(a) H— P r o— As p (O t - Bu) — Tr p— OB z l (NOz) t-Bo c-Tr p (CHO) 一 OH 0.33 gを、 DMF 5mlに 溶解し、 炭酸水素ナトリウム 0.1 7 gを加え撹拌した。 ここに、 臭化 p—二トロべンジル 1.08 g (5 mmo 1 ) を加えて、 室温で 24時 間撹拌した。 反応液に、 水と酢酸ェチルを加えて振盪し、 有機相を回 収し、 溶媒を留去した。 残渣をシリカゲルカラム （メルク社製 キー ゼルゲル 60、 50 g、 へキサン Z酢酸ェチル = 6/4で溶出） で精 製し、 t— Bo c— Tr p (CHO) -OB z l (N02) 0.2 gを 得た。 これを 5 m 1の DMFに溶解し、 ピぺリジン 0.5 m 1を加えて 0°Cで 1.5時間撹拌した。 溶媒を減圧下留去し、 98%蟻酸 0.5ml を加えて、 室温で 4時間撹拌した。 この反応液に、 エーテル約 30 m
1を加えて生じる沈澱を濾取し、 乾燥させて、 H— T r p-OB z 1
(NO 2) 0.1 6 gを得た。
Fmo c— As p (O t— Bu) — OH4 1mgを 2mlの塩化メ チレンに溶解し 0 °Cに冷却した。 PyBOP 78mg、 HOB t 20 mg、 NMM22 1を順次加えて 0°Cのまま 5分間撹拌した。 上記 で得られた H— T r p— OB z 1 (N02) 34ingの 2ml塩化メ チレン溶液を 0 °Cに冷却し、 得られた反応液に加えた。 4°Cで 4時間 室温で 1時間撹拌し、 減圧下溶媒を留去し、 残渣をシリカゲルカラム
(メルク社製 キーゼルゲル 60、 50 g、 クロ口ホルム/メタノ一 ル= 25Z1で溶出） で精製し、 Fmo c— As p (O t—Bu) — Tr p-OB z 1 (N02) 53 m gを得た。 得られた生成物を、 D MF 1 00 ^ 1に溶解し、 ピぺリジン 25 / 1を加えて室温で 10分 間放置し、 シリ力ゲル力ラム （メルク社製 キーゼルゲル 60、 50 g、 へキサン Z酢酸ェチル =2/1で溶出） で精製し、 H— As p
(Ot— Bu) — Trp— OB z l (N02) 1 mgを得た。
Fmo c— P r o— OH3.4mgを 0.5ml DMFに溶解し、 P y BOP 5.2m g、 HOB t l.4m ：、 NMM 1.7 1を順次加えて、 室温で I 0分間撹拌した。 得られた反応液に工程 2で得られた H— A sp (O t—Bu) — Trp— OBz l (N02) lmgの 0.5ml DMF溶液を加えて、 室温で 1.5時間撹拌した。 得られた反応液を 0. 2ml程度まで濃縮した。 残渣を実施例 17と同様の方法により逆相 H PLCで精製し、 Fmo c— P r o— As p (Ot—Bu) — Trp
— OBz l (NO 2) 1.5mgを得た。
これを、 160 i 1の DMFに溶解し 40 1のピペリジンを加え て、 室温で 12分間放置し、 減圧下溶媒を留去した。 残渣を、 上記と 同様に、 HP LCで精製し、 H— P r o— As p (Ot—Bu) — T rp— OBz l (N02) 1.4mgを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 608 (M+H)
工程 1で得られたぺプチド 2· 4mgを 0· 5 m 1の DMFに溶解し， PyBOP4.8mg、 HOB t l.2mg、 NMM1.2 μ, 1を加えて、 室温で 1 5分間携拌し、 0°Cに冷却した。 ここに、 上記で得られた H
— P ro— As p (Ot— Bu) —Trp— OB z l CN02) 0.7 mgの 0.5m 1 DMF溶波を加えて、 混合物を 4°Cで 1 8時間、 室温
7 & で 3時間撹拌した。 溶媒を減圧下留去し、 残渣を上記と同様に逆相 H PLCで精製し、 得られた化合物を、 98%蟻酸で室温 2時間、 続い て 20 %ピペリジン ZDMFを加えて室温 1 5分間攪拌し、 H— G 1 y— As p (0 B z 1 ) -Tr p-H i s-G l y-Th r-A l a 一 P r o— As p— Tr p— OB z l (NO2) 400〃gを得た。 工程 3
— Gly 一 Asp(OBzl) -Trp 一 His — Gly -Thr -Ala -Pro —Asp— Trp- OHの合成
工程 2で得られたぺプチド 200〃gの 1 00 / l 01^ 溶液に？ yBOP 468〃g、 HOB t l 22〃g、 NMM 1 52 gを 0°C で加え、 0°Cで 1時間、 室温で 3.5時間撹拌した。 溶媒を減圧下留去 し、 残渣を上記と同様に逆相 H PLCで精製して、 標記化合物の 4一 二トロべンジルエステル 40 β gを得た。 得られた生成物を 9 0 %酢 酸 50 / 1に溶解し、 0°Cで冷却し、 亜鉛末約 0.1 mgを加えて 0°C で 30分間撹拌した。 遠心分離により亜鉛末を除去し、 上澄み液を実 施例 1 5と同様の方法により逆相 HPLCで精製して、 標記化合物 2 7 u gを得た。
工程 4 ：化合物 （I一 41)
工程 3で得られた化合物 25 /zgを 23 fi 1の DMFに溶解し 0°C に冷却し、 PyBOP 68 g、 HOB t l 8〃g、 NMM 2 1 fi gを、 それぞれ 0.2MDMF溶液として加え、 0°Cで 1 0分間放置し た。 反応液に、 実施例 20工程 1で得られた H— V a 1 -Ty r -P h e— A l a— H i s— L e u— As p (OBz 1) — I 1 e— I 1 e-Tr p-OB z 1 44〃 の27〃 1 DMF溶液を加え、 4。Cで 24時間撹拌した。 溶媒を減圧下留去し、 残渣を工程 3と同様に逆相 HPL Cで精製して、 化合物 （ I一 41) の側鎖、 C末保護体 1 5 g を得た。 このうち 1 3 gを DMF 1 0 1に溶解し、 蟻酸アンモニ ゥムの飽和メタノ一ル溶液 1 0 a 1及び 1 0 %P dZC約 0.1 mgを 加えて室温で 1.5時間撹拌した。 遠心分離により P dZCを除去し、 上澄みを上記と同様に逆相 H PLCで精製し、 化合物 （I一 41) 2 II gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 2383 (M + H)
アミノ酸分析： As x2.1 (3) ， G 1 y 2.3 (2) ， Hi s 1.4 (2) ， Th r L 1 (1) ， A 1 a 2.0 (2) ， P r o 1.0 (1) , TyrO.9 (1) ， V a 11.3 (1) ， l i e 2.5 (2) ， Leu I.3 ( 1 ) , P h e 0.9 ( 1 ) ， (T r は分折せず）
実施例 42.
化合物 ( I -42) ： し Gly-Asn-Trp-Lys-Gly-Thr-Ala-Pro-Asp-Trp-Val-Tyr-Phe-Ala- H i s- Leu- Asp- Ile-U e- Trp- OHの合成
工程 1 : Fmo c— G 1 y— A s n— T r p— Ly s (Z) -G 1 y -Th r -A 1 a— OHの合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— A 1 a 60〃mo 1が結 合した担体樹脂 1 0 Omgを用い、 N—保護アミノ酸として順次、 F mo c -Th r (t -B u) 一 OH、 Fmo c— G l y— OH、 Fm o c -L y s (Z) -OH. Fmo c— Trp— OH、 Fmo c— A s n (Tr t) -OH. Fmo c— G l y— 0 Hを用いて保護べプチ ドを合成し、 樹脂からペプチドを切り出して、 実施例 1 7と同様の方 法により H P L Cにより精製し、 標記化合物 9.9 m gを得た。
質量分析 〔FABMS〕 ： 1090 (M + H)
アミノ酸分析： As χθ. 6 (1) , G 1 y 1. 5 (2) ， Th r 0 . 8 (1) ， A 1 a 1. 0 CI) , Ly s O. 9 (1) ， （Trpは 分折せず） 工程 2 : H_G l y - As n— Tr p -； Ly s (Z) -G 1 y -T h r-A l a-P r o-As p-Tr p-OB z 1 (NO2)
工程 1で得られたぺプチド 2.5 mgを 0.5 m 1 DM Fに溶解し、 P yBOP 2.4 mgs HOB t O.6 mg、 NMMO.8 1を加えて、 室 温で 1 5分間撹拌し、 0°Cに冷却した。 得られた反応液に実施例 4 1 で得られた H— P r o— As p (0 t -B u) -Tr p-OB z 1
(N02) 0.7 mgの 0.5 m 1 DMF溶液を加えて、 4 °Cで 6時間撹 拌した。 溶媒を減圧下留去し、 残渣を上記と同様に逆相 H PLCで精 製した。 得られた化合物に、 98%蟻酸 70mlを加えて室温で 2時間、 続いて 20 %ピぺリジン 1 0〃 1ノ DM F 40〃 1を加えて室温で 1 5 分間静置し、 エーテル 3 mlで晶出させて、 エーテルで洗浄し、 減圧 乾燥を行い工程 2に標記の化合物 420 n gを得た。
工程 3 ：
— Gly 一 Asn -Trp — Lys(Z) -Gly — Thr -Ala -Pro — Asp- Trp- OH
工程 2で得られたぺプチド 200 ; gの 1 00 // 1 DMF溶液に P yBOP 4 68 g. HOB t l 22〃g、 NMM152 // gを 0°Cに おいて加え、 0°Cで 1時間、 室温で 3.5時間撹拌した。 溶媒を減圧下 留去し、 残渣を上記と同様に逆相 HPLCで精製して、 標記化合物の 4一二トロべンジルエステル 43 gを得た。 得られた生成物を、 9 0 %酢酸 5 0 1に溶解し、 0 °Cに冷却し、 亜鉛末約 0.1 mgを加え て 0°Cで 30分間撹拌した。 遠心分離により亜鉛末を除去し、 上澄み 液を実施例 1 5と同様の方法により逆相 HPLCで精製して、 工程 3 に標記の化合物 59 f gを得た。
工程 4 ：化合物 （ I一 42)
工程 3で得られた化合物 59〃 gを 32〃 1の DMFに溶解し 0°C に冷却した。 混合物に 0.2 m 1の DMF溶液で調製した P y BOP 1 5 6 ^ g、 HOB t 4 1 g、 NMM5 1〃 gを、 それぞれ加え、 0°Cで 1 0分間放置した。 得られた反応液に、 実施例 2 0工程 1で得 られた H— Va 1— Ty r— P h e— A l a— H i s— L e u— A s p (OB z l) - I l e- I l e-T r p-OB z l 1 0 9 gを 含む 6 8 ill DMF溶液を加え、 4°Cで 1 3時間撹拌した。 溶媒を減 圧下留去し、 残渣を工程 3と同様の方法により逆相 H PLCで精製し て、 化合物 （I一 42) の衡鎖、 C末保護体 3 1 fi gを得た。 得られた 生成物の 2 8 gを DMF 1 5 μΛ に溶解し、 蟻酸アンモニゥムの飽 和メタノール溶液 1 5 U.1及び 1 0 %P dZC約 0.1 mgを加えて室 温で 2時間撹挣した。 遠心分離により P dZCを除去し、 上澄み液を 上記と同様に逆相 H PLCで精製し化合物 （1—42) を 10.6 g得 た。
質量分析 CPABMS) : 2 3 7 3 (M + H)
了ミノ酸分折： A s X 2.8 (3) , G 1 y 2.6 (2) ， H i s 1.0 (1) ， T h r 0.9 (1 ) , A l a 2.0 (2) ， P r o 1.2 (1) ， Ty r l. O (1) ， Va i l.1 (1) ， l i e 2.4 (2) ， Ph e 1.0 (1) ， Ly s O.9 ( 1) ， （T r pは分折せず）
実施例 43.
化合物 （I一 43) ： H-G l y-A s p-Tr p-H i s— G l y— Th r— A l a— P r o— A s p— T r p— Va l— Ty r— Ph e 一 A l a— H i s -L e u-A s p - I 1 e - I 1 e -T r -OH の合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— T r p l O. 4 ^mo 1 が結合した担体樹脂 2 O mgを用い、 N—保護アミノ酸として順次、 Fmo c— I 1 e— OH、 Fmo c— I 1 e -OH. Fmo c— As p (O t— B u) — OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— H i s (T r t) — OH、 Fmo c— A l a— OH、 Fmo c— Ph e— OH、 Fmo c— Ty r (t— B u) -OH. Fmo c— V a l— OH、 Fmo c - Tr p— 0H、 Fmo c-As p (0 t - B u) —0H、 Fmo c— P r o— 0H、 Fmo c— A l a— 0H、 Fmo c— Th r ( t - B u) -OH. Fmo c— G l y— 0H、 Fmo c -H i s (Tr t) -OH. Fmo c— Tr p— 0H、 Fmo c— As p (0 t -B u) — 0H、 Fmo c—G 1 y— OHを用いて保護ペプチドを 合成し、 最終工程のみ参考例 3とは異なり、 （b) のピペリジン処理 を行った。 樹脂からペプチドを参考例 3と同様に切り出し、 粗べプチ ド 19.2mgを得た。 この生成物のうち、 6.2mgを実施例 1 7と同 様な方法により逆相 HP LCで精製し凍結乾燥し、 1.24mgの精製 品を得た。
質量分析 〔FABMS〕 : 240 0 (M+H)
ァミノ酸分析： G l y 2.1 (2) , A l a 2.0 (2) ， A s x 2.1 (3) ， H i s 1.4 (2) ， l i e 2.5 (2) ， L e u 1.3 (1) ， P r o l.0 (1) ， T h r 1.1 (1) ， P h e 0.9 (1) ， T y r 0. 9 ( 1 ) , V a 1 1.3 ( 1 ) , (Tr pは分析せず）
実施例 44.
化合物 （1—44) ： H-G l y-As n-Trp-Ly s-G l y- T h r - A 1 a-P r o-As p-Tr p-Va 1 -Ty r-Ph e -A 1 a -H i s— Le u— As p— I 1 e— I 1 e— Tr p— OH の合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— Tr p l O.4 /imo lが 結合した担体樹脂 2 Omgを用い、 N—保護アミノ酸として順次、 F mo c— I 1 e— OH、 Fmo c— I 1 e— OH、 Fmo c-As p (O t—Bu) — OH、 Fmo c— Le u— OH、 Fmo c— H i s (Tr t) _OH、 Fmo c— A l a— OH、 Fmo c— Ph e— O H、 Fmo c— Ty r ( t - B u) -OH, Fmo c_Va l— OH、 Fmo c— Tr p—〇H、 Fmo c— As p (O t—Bu) —OH、 Fmo c— P r o— OH、 Fmo c— A l a— OH、 Fmo c— Th r ( t -B u) -OH. Fmo c— G l y— 0H、 Fmo c— Lys (t一 Bo c) -OH. Fmo c— Trp— OH、 Fmo c— As n (T r t) — OH、 Fmo c— G 1 y— OHを用いて保護ペプチドを 合成し、 最終工程のみ参考例 3とは異なり、 （ b ) のピベリジン処理 も行った。 樹脂からペプチドを参考例 3と同様に切り出し、 粗べプチ ド 30. Omgを得た。 得られた生成物のうち、 6.9mgを実施例 17 と同様な方法により逆柜 H P L Cで精製後凍結乾燥し、 精製品 1.30 mgを得た o
質量分折 〔FA S〕 : 2390 (M+H)
アミノ酸分析： G 1 y2.6 (2) ， A 1 a 2.0 (2) ， A s x 2.8 (3) ， Hi s l.0 (1) ， l i e 2.4 (2) , L e u 1.1 (1) ， Pr o l.2 (1) ， T h r 0.9 (1) ， Tyrl. O (1) ， Va i l. 1 (1) ， P h e 1.0 (1) ， L y s 0.9 (1) ， （T r pは分析せ ず）
参考例 1.
化合物 （a) ： Fmo c— Gl y— Asn— Tr p— H i s— G l y -Th r-A 1 a— P r o— OHの合成
実施例 4と同様の方法により t一 Bo c— P r oが結合した担体樹 脂および保護アミノ酸として順次 t一 B 0 c— A 1 a— OH, t—B o c-Th r (B z 1 ) -OH, t一 B o c— G 1 y— O H， t— B o c-H i s (Bom) -OH, t一 B o c— T r p (CHO) — 0 H， t一 Bo c— As n— OHおよび Fmo c— G 1 y— OHを用い、 保護べプチドの結合した担体樹脂 1.2 gを得た。 この担体樹脂 1.2 g を実施例 4と同様の方法により合成ぺプチドをフッ化水素により樹脂 から切り出し、 2M酢酸に溶解し、 凍結乾燥することにより、 464. Omgの粗生成物を得た。 実施例 4と同様の方法により HP LCで精 製し 1 31.9mgの化合物 （a) を得た。
質量分析 〔PABMS〕 : 1 06 1 (M + H) ァミノ酸分析： As x O. 7 (1) ， G 1 y 2. 1 (2) ， H i s 1 . 0 (1) ， Th r 1. 0 (1) ， P r o l. 1 (1) ， A 1 a 1. 1 (1) ， (T r pは分析せず）
参考例 2.
化合物 （b) ： H— Va l— Ty r— Ph e— S e r— H i s— Le u— As p— I 1 e— I 1 e -T r p— OHの合成
実施例 4と同様の方法により t— B o c— T r p (CHO) が結合 した担体樹脂および N—保護アミノ酸として順次 t— Bo c- I 1 e -OH, t -B o c - I 1 e -OH, t-Bo c-As p (OB z ^) -OH, t-Bo c-L e u -OH, t一 Bo c—H i s (Bom) -OH, t -Bo c-S e r -OH, t -B o c - P h e -OH, t — Bo c—Ty r (B r— Z) —011ぉょび1;ー80 <2— & 1ー0 Hを用い、 保護ペプチドの結合した担体樹脂 1.5 gを得た。 このうち 0.8 gをフッ化水素により樹脂から切り出し、 2 M酢酸で溶解し、凍 結乾燥することにより 243.3 mgの粗生成物を得た。 このうち 1 0 lmgを実施例 4と同様の方法により HPLCで精製し、 7.0mgの 化合物 （b) を得た。
質量分析 〔FABMS〕 ： 1 293 (M+H)
ァミノ酸分析： As x l. 1 (1) ， S e r l. 1 (1) ， H i s l . 2 (1) ， Ty r 1. 0 (1) ， Va i l. 0 (1) ， I 1 e 1. 5 (2) ， L e u 1. 2 (1) ， Ph e l. 1 (1)
参考例 3.
化合物 c ： Fmo c -G 1 y-As n-Tr p-H i s—G l y-T h r— A i a -A 1 a— OHの合成
Fmo c - A 1 a 30 /zmo 1が結合した担体樹脂 5 Omgを自動合 成機の反応器に入れ島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行 つた。
(a) 担体樹脂を DMFにより 3分間洗浄し、 該溶液を排出した。 (b) 30%ピぺリジンを含む DMF溶液を加えて混合物を 4分間撹 拌し、 該溶液を排出し、 この操作をもう 1回操り返した。
(c) 担体樹脂を DMFにて 1分間洗浄し、 該溶液を排出し、 この操 作を 5回操り返した。
こうして、 Fmo cを除去した A 1 aの結合した担体樹脂を得た。
(d) Fmo c - A 1 a -OH 300 zmo KPy BOP 300 πιο Κ ΗΟΒ ί δ Ο Ο , ιηο Κ NMM 45 0 A m o 1を含む 1.0 5 m 1の DMFを加え 3分間撹 f して得た溶液を樹脂に加え、 混合物 を 30分間攪拌し溶液を排出した。
(e)担体樹脂を DMFで 1分間洗浄し、 これを 5回繰り返した。 こ うして、 Fmo c— A 1 a— A 1 aが担体上に合成された。 次に、 上 記 （a) 〜 （： c) の洗浄、 脱保護工程を行った後、 （d) の工程で F mo c—Thr (t— Bu) — OHを用いて縮合反応を行い、 次いで
(e) の洗淨工程を得て Fmo c— Thr (t— Bu) — A l a— A 1 aを担体樹脂上に合成した。 以下、 工程 （a) 〜 （e) を順次繰り 返して保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 尚、 工程 （d) には 順次、 Fmo c— G 1 y— OHおよび Fmo c -H i s (T r t) ― OH、Fmo c— T r p—OH、 Fmo c -A s n (Tr t) -OH および Fmo c— G 1 y— OHを用いた。 G 1 yを縮合する最終工程 に限り、 工程 （b) のピペリジン処理は行わなかった。 得られた担体 樹脂をメタノール、 ブチルエーテルで洗浄した後、 減圧下 3時間乾燥 した。 これに、 2—メチルインド一ルを SmgZmf の割合で含む 9 0%TFA、 5%チオア二ソ一ル、 5%1， 2—エタンジチオールの 混合溶液 200 £を加え室温で 2時間放置し、 樹脂よりぺプチドを 切り出した。 次いで樹脂を濾別し、 得られた溶液におよそ 1 Omiの エーテルを加えて、 生じる沈澱を粗ペプチドとして 23mg濾取した。 この粗生成物を逆栢カラム （カラム； Chemc o社製、 Ch emc o Pa ck NUCLEO S I L 5 C 1 8 250 x 20 mml. D. ) を 用いた HP L Cにて精製した。 0.1 %TF Aと 0〜90%ァセトニトリ ルを用いた直線濃度勾配で溶出し 220 nmにて検出し標記化合物を 含む画分を得た。 この画分を凍結乾燥して化合物 （c) を 16m g得た ( 質量分析 〔FABMS〕 ： 1 03 6 (M+H)
ァミノ酸分析： G l y l. 9 (2) ， A s X 0. 7 (1) ， H i s l . 0 (1) ， Th r 0. 9 (1) ， A 1 a 2. 0 (2) ， （T r pは 分析せず）
参考例 4.
化合物 （d) ： Fmo c-L e u-Ty r-Ph e-A l a— H i s -G i n-As p (OB z 1)-Va l - I 1 e— OHの合成
参考例 3と同様の方法により、 Fmo c— I l e 3 1〃mo lが結 合した担体樹脂 7 Omgを用い N—保護アミノ酸として順次、 Fmo c—Va l _OH、 Fmo c-As p (OB z 1 ) — OH、 Fmo c 一 G i n (T r t) -OH. Fmo c— H i s (Tr t) -OH. F mo c— A l a— OH、 Fmo c— Ph e— OH、 Fmo c— Ty r
( t -B u) —OHおよび Fmo c— L e u— OHを用いて合成を行 つた。 樹脂からのペプチドの切り出しは、 90%TFA、 5%チオア ニソール、 5%1， 2—エタンジチオールの混合溶液 300〃 ίを用 い、 室温で 2時間放置することにより行った。 得られた粗ペプチド 2
5 mgを参考例 3と同様の方法により HP LCで精製して、 化合物
(d) 3.6 mgを得た。
質量分析 〔FABMS〕 ： 1 4 1 9 (M+H)
ァミノ酸分析： A l a 1.0 (1) ， A s 1.0 (1) ， H i s 0.9 ( 1 ) ， G 1 x 1.0 ( 1 ) ， I 1 e 0.8 ( 1 ) ， L e u 0.8 ( 1 ) ， P h e 0.9 ( 1 ) ， T y r 1.0 ( 1 ) ， V a 10.7 ( 1 )
産業上の利用可能性
本発明によれば、 ェンドセリン拮抗作用を有するぺプチドが提供さ れる。 配 列 表
删番号： 1
觀の長さ： 16
の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：麵状
の觀：ぺプチド
翻 .
H-Gl y-Asn-Trp-Hi s-Gly-Thr- A 1 a— Pro— Asp— Trp— P he— P he— As n -Ty r-Ty r-Trp-OH 麵番号： 2
酬© ^さ： 16
の型：アミノ酸
鎖の数：—本鎮 トポロジー：^^
画の麵：ぺプチド
顏
cyclo (G 1 y-As n-Tr p-Hi s-Gl y- Thr-Al a-Pr o-As -Trp-Phe-Phe -A s n-Ty r-Ty r-Tr p)
番号： 3
顾の長さ： I 6
@^【Jの型：アミノ酸
鎖の数：—本鎖
トポロジー:直鎖状 の観：ぺプチド
H-Cy s-Asn-Trp-Hi s— Gl y-Th r- A 1 a— Pro— Cy s— Tr p— Ph e— Ph e— As n -Ty r-Ty r-Tr p-OH
酉 J番号： 4
酉 の長さ： 7
ffi ^の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：庭鎖状
酉 の觀：ぺプチド
酉
H-Tr p-Ph e-Phe-As n-Ty r-Ty r -Tr p-OH 酉 番号： 5
酉 の長さ： 6
の型：アミノ酸
鎖の数：—本鎖
トポロジー：虐鎖状
酉 の蘭：ぺプチド
酉
H-Tr p-P he -As n-Ty r-Ty r-Tr p-OH
酉 号： 6
鋼の長さ： 6
酉 ijの型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：窗禁状
顧の観：ぺプチド
剛
H-T rp-Phe-Phe -As n-Ty r-Tr p-OH 丽番号： 7
顧の長さ： 6
の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
卜ポロジ-：葡状
麵の^ ：ぺプチド
顧
H-Trp-Phe-P e-Ty r-Ty r-Tr p-OH 麵番号： 8
副 ®gさ： 6
ISiJの型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直 ϋ
鋼の麵：ぺプチド
隨
Η— P he— P he— Asn—Tyr—Tyr—Trp—OH
5 謂番号： 9
ie^【jの長さ： 20
の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：窗崖状
酉 の顧：ぺプチド
删
H-G 1 y-Asn-Trp-Hi s-G 1 y-Th r- Al a-Pro-Asp-Trp-Va l-Tyr-Phe —A 1 a— H i s -L e u— As p— I 1 e - I 1 e— Tr p— OH 酉 番号： 1 o
副の長さ： 20
酉 ijの型：アミノ酸
鎖の数：一摘
トポロジー： nil状
酉 の觀：ぺプチド
副
H-G 1 y-Asn-Trp-Hi s-G 1 y-Th r- Al a-Pro-Asp-Trp-Va 1 -Ty r-Ty r —A 1 a— Hi s— L e u—A s p— I 1 e― I 1 e— Tr p - OH 酉麵号： 11
鋼の長さ： 20
酉 リの型：アミノ酸
鎖の数：一相
トポロジー： ϋΐι状
酉 jの種類：ぺプチド
H-G 1 y-As n-Tr -H i s-G 1 y-Th r- A 1 a— P r o— As p-Tr p-Le u-Ty r-Ph e 一 Al a— Hi s-Gl n-As p-Va 1 - I 1 e— Trp-OH 顾番号： 12
麵の長さ： 20
@^|Jの型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖 - トポロジー：窗遒状
觀の觀：ぺプチド
翻
H-Gl y-As p-Tr p-Hi s-Gl y-Thr —A 1 a— P r o— A s p— T r — Va 1— Ty r一 Ph e— A 1 a— Hi s-Le u-As p— I 1 e— I 1 e-Trp-OH 鋼番号： 13
顾の長さ： 20
11の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
腿の觀：ぺプチド
麵
H-Gl y-Asn-Tr -Ly s-G 1 y-Thr -Al a-P r o-Asp-Tr ρ-Va 1一 Tyr— Ph e-A 1 a— H i s-L e u— As p— I 1 e— I I e-Trp-OH

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 下記式 （I) で表わされるペプチドまたはその薬理上許容される
X-A-Tr p-B-G l y-Th r-E-G-Y (I) ί式中、
Aは A s n または As p を表わし、
Bは H i s または Ly s を表わし、
Eは A l a または S e r を表わし、
Gは A l a または P r o を表わし、
X2
Xは X G 1 yまたは X:l — Cy sを表わし、
γ,
I I
Yはヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ァミノ、 As p— Zまたは Cy s — Zを表わし、
〔ここで、 X' および Χ:' は水素、 ベンジルォキシカルボニル、 t— ブチルォキシカルボニル、 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル またはカルボニル置換もしくは非置換の低級アル力ノィルを表わし、 X2 および Y2 は水素を表わし、
Υ' はヒ ドロキシ、 低級アルコキシまたはアミノを表わすか、 または X1 、 Y' および X2 、 Υ2 はそれぞれ一緒になつて Xに Y' お よび X2- が単結合を表わし、
Ζはヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジルォキシ、 ベンズヒドリル ォキシ、
G 1 y-Z 1 (式中、 Z1 はヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジル ォキシまたはべンズヒ ドリルォキシを表わすか、 X' と一緒になつて X' — Z1 が単結合を表わす） 、
A 1 a-Z' (式中、 Z' は前記と同義である） 、 Va 1 -Zl (式中、 Z1 は前記と同義である） 、
Tr ρ-Ζ' (式中、 Z' は前記と同義である） 、
Tr p-G 1 y-Z' (式中、 Z1 は前記と同義である） 、
Trp-Asn-Ty r-Ty r-Tr p-Z1 (式中、 Z1 は前記 と同義である） 、
Trp-Phe-Phe-As n-Ty r-Tyr-7Hy t-Z' , (式中、 Z' は前記と同義であり、 7Hy tは 7—ヒドロキシトリプ トファンを表わす） 、 .
Trp-I I e-I l e-Trp-Z1 (式中、 Z' は前記と同義で ある） 、
T r - V a 1-Tyr-Ph e -W-H i s -L e u -A s p - I 1 e- I 1 e-Trp-Z1 (式中、 Zl は前記と同義であり、 Wは Al a、 S e rまたは Cy sを表わす） 、
T r p— W— Hi s— Leu— As p— I 1 e- I 1 e— T r p - Z ! (式中、 Ζ' および Wは前記と同義である） 、
T r ρ - V a 1 -Tyr-Ty r -W-H i s-Le u-As p- I 1 e- I 1 e-Tr p-Z' (式中、 Z' および Wは前記と同義で ある） 、
Trp-Leu-Ty r-Ph e -W-H i s— G l n— As p— Va 1 - I 1 e-Tr p-Zl (式中、 Z' および Wは前記と同義で ある） 、
T r -Va 1 -Ty r P h e -W-P h e— Phe— As n— Ty r-Ty r -T r p Z 1 (式中、 Z' および Wは前記と同義で ある） 、
Trp-Phe-Phe-As n -Ty r Ty r -W-H i s一 Leu— Asp— I 1 e— I 1 e— T r p Ζ' (式中、 Ζ1 および Wは前記と同義である） 、
Trp— Phe— Phe— As n— T y r Ty r -A s n - I 1 e - I 1 e-Tr ρ-Ζ' (式中、 Z' は前記と同義である） 、
または J一 Ph e— M— Q— Ty r— R— T— Z1
(式中、
Jは Tr pまたは単結合、
Mは Pheまたは単結合、
Qは A s nまたは単結合、
Rは Ty rまたは単結合、
Tは Tr p、
A 1 a、
Ph e,
Ty r,
T r p—T r p、
As n— Ty r— Ty r— Tr p、
Trp— As n -T y r -T y r一 Tr p、
Tr p— Va l— Ty r— Ph e -W-H i s - L e u -
As p— l i e— l i e—Tr p (式中、 Wは前記と同義であ る） 、
または単結合を表わし、
J、 M、 Q、 Rおよび Tの少なくとも 2つ以上が同時に単結合を表 わすことはなく、 Ζ1 は前記と同義である） 〕 } 。
(2) 下記式 （ I— 1 ) で表わされる、 請求項 （ I ) のべプチド：
Gly-Asn 一 Trp —His — Gly — Thr -Ala -Pro -Asp (I— 1) -Trp -Phe -Phe —Asn -Tyr -Tyr -Trp —OH
(3) 下記式 （Π) で表わされるぺプチド：
X" -J-Ph e-M-Q-Ty r-R-T-Z2 (Π)
(式中、 X4 は水素、 ベンジルォキシカルボニル、 t—ブチルォキ シカルボニルまたは 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルを表 わし、 Z2 はヒドロキシ、 低級アルコキシ、 ベンジルォキシまたは ベンズヒドリルォキシを表わし、 J、 M、 Q、 Rおよび Tは前記と 同義である） 。
(4) ストレブ卜マイセス属に属し、 RES— 70 1— 1、 RES— 7 0 1—2または RES— 7 0 1一 3を生産する能力を有する微生物 を培地中に培養し、 RES— 70 1— 1、 RES— 7 0 1— 2また は RES— 70 1— 3を培養液に蓄積せしめ、 該培養液より RES 一 7 0 1— 1、 RES— 7.0 1—2または RE S - 7 0 1—3を採 取することを特徵とする、 RES— 70 1— 1、 RE S— 70 1— 2または RES— 7 0 1—3の製造方法。
(5) ストレプトマイセス 'エスピー RE— 7 0 1 (FERM BP— 3 624 ) o
(6) ストレプトマイセス 'エスピー RE— 6 29 (F ERM B P— 4 1 26 ) o
PCT/JP1992/001731 1991-12-27 1992-12-28 Peptide antagoniste de l'endotheline Ceased WO1993013218A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93900411A EP0603399B1 (en) 1991-12-27 1992-12-28 Endothelin-antagonizing peptide
DE69232771T DE69232771T2 (de) 1991-12-27 1992-12-28 Peptide als antagonisten von endothelin
US09/181,083 US6194195B1 (en) 1991-12-27 1998-10-27 Strains of streptomyces producing endothelin antagonistic peptides
US09/750,754 US6642355B2 (en) 1991-12-27 2001-01-02 Endothelin-antagonizing peptide

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP34729391 1991-12-27
JP3/347293 1991-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993013218A1 true WO1993013218A1 (fr) 1993-07-08

Family

ID=18389232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1992/001731 Ceased WO1993013218A1 (fr) 1991-12-27 1992-12-28 Peptide antagoniste de l'endotheline

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0603399B1 (ja)
CA (1) CA2104952A1 (ja)
DE (1) DE69232771T2 (ja)
WO (1) WO1993013218A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0626174A2 (en) 1993-04-21 1994-11-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Methods and compositions for the prophylactic and/or therapeutic treatment of organ hypofunction
WO1995000546A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
EP0698613A1 (en) 1994-07-25 1996-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
EP0698614A1 (en) 1994-07-25 1996-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
EP0672680A4 (en) * 1993-09-21 1999-04-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk NEW PEPTIDE.
US6872803B1 (en) 1993-09-21 2005-03-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptides

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19652374A1 (de) * 1996-12-04 1998-06-10 Schering Ag Verwendung von Endothelin-Konjugaten in der Therapie, neue Endothelin-Konjugate, diese enthaltende Mittel, sowie Verfahren zu deren Herstellung

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03130299A (ja) * 1989-08-31 1991-06-04 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd ペプチド化合物とその製造法および用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2032559C (en) * 1989-12-28 2001-11-06 Kiyofumi Ishikawa Endothelin antagonistic cyclic pentapeptides
US5284828A (en) * 1990-05-14 1994-02-08 Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd. Peptide compound and its preparation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03130299A (ja) * 1989-08-31 1991-06-04 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd ペプチド化合物とその製造法および用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 178(1), 1991, p. 132-137. *
J. ANTIBIOT., 44(12), 1991, p. 1342-1347. *
See also references of EP0603399A4 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0626174A2 (en) 1993-04-21 1994-11-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Methods and compositions for the prophylactic and/or therapeutic treatment of organ hypofunction
EP0626174A3 (en) * 1993-04-21 1996-01-03 Takeda Chemical Industries Ltd Method and composition for the prophylaxis and / or treatment of underactive organs.
US6147051A (en) * 1993-04-21 2000-11-14 Takeda Chemical Industries Ltd. Methods and compositions for the prophylactic and/or therapeutic treatment of organ hypofunction
WO1995000546A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
EP0672680A4 (en) * 1993-09-21 1999-04-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk NEW PEPTIDE.
US6872803B1 (en) 1993-09-21 2005-03-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptides
EP0698613A1 (en) 1994-07-25 1996-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
EP0698614A1 (en) 1994-07-25 1996-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide

Also Published As

Publication number Publication date
EP0603399B1 (en) 2002-09-11
CA2104952A1 (en) 1993-06-28
EP0603399A1 (en) 1994-06-29
DE69232771D1 (de) 2002-10-17
DE69232771T2 (de) 2003-01-23
EP0603399A4 (en) 1997-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1998018763A1 (en) Tetrahydroisoquinoline derivatives
Matsunaga et al. Nonribosomal peptides from marine sponges
US6784283B2 (en) Peptide antibiotics
Morita et al. Structures and conformation of antitumour cyclic pentapeptides, astins A, B and C, from Aster tataricus
US5571892A (en) Polypeptide and anti-HIV drug prepared therefrom
Taniguchi et al. Structure of YM-254890, a novel Gq/11 inhibitor from Chromobacterium sp. QS3666
JPH10182613A (ja) テトラヒドロイソキノリン誘導体
Kingsbury et al. Transport of antimicrobial agents using peptide carrier systems: anticandidal activity of m-fluorophenylalanine-peptide conjugates
WO1993013218A1 (fr) Peptide antagoniste de l&#39;endotheline
US5028590A (en) Derivatives of A54145 cyclic peptides
EP2271665B1 (en) Highly bridged peptides from actinomadura namibiensis
JPH03130299A (ja) ペプチド化合物とその製造法および用途
US5639860A (en) Endothelin-antagonizing peptide
Dmitrenok et al. New cyclic depsipeptides from the green alga Bryopsis species; application of a carboxypeptidase hydrolysis reaction to the structure determination
US5631222A (en) Endothelin-antagonizing peptide
Fusetani et al. Tokaramide A, a new cathepsin B inhibitor from the marine sponge Theonella aff. mirabilis
US6194195B1 (en) Strains of streptomyces producing endothelin antagonistic peptides
JPH075638B2 (ja) Ａ―２１９７８ｃ環状ペプチド誘導体
Kurome et al. Syntheses of antifungal aureobasidin A analogs with alkyl chains for structure-activity relationship
JP2778831B2 (ja) エンドセリン拮抗ペプチド
US20100216973A1 (en) Methods for the specific preparation of lysobactin fragments
MXPA06002741A (es) Nuevos compuestos antitumorales.
Akaji et al. Efficient synthesis of peptaibol using a chloroimidazolidium coupling reagent, CIP
JPH10500580A (ja) 高生産性細胞融合変異株によるサイクロスポリンａの製造方法
Mulder et al. Synthesis and evaluation of novel macrocyclic antifungal peptides

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2104952

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993900411

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993900411

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1993900411

Country of ref document: EP