WO1993012131A1

WO1993012131A1 - Derives de 2',3'-didesoxy-3'-aminothymidine, leur preparation et leur application en therapeutique

Info

Publication number: WO1993012131A1
Application number: PCT/FR1992/001173
Authority: WO
Inventors: Jean-Louis Imbach; Gilles Gosselin
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1991-12-12
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 1994-06-12
Also published as: FR2684996A1

Abstract

Dérivés de 2',3'-didesoxy-3'-aminothymidine répondant à la formule (I) dans laquelle R est NH4+ ou HO(CH2)2-S-S-(CH2)2-. Application thérapeutique.

Description

DERIVES DE 2' ,3'-DIDESOXY-3'-AMINOTHYMIDINE, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE La présente invention a pour objet des dérivés de 2' ,3'-didésoxy-3'-aminothymidine (ou amino-dT), leur préparation et leur application en thérapeutique.

Les composés de 1'invention répondent à la formule donnée e annexe 1 dans laquelle

R est NH₄ ⁺ ou HO(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-.

La préparation des composés de l'invention est indiquée ci-après.

Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées sur plaques de silice Merck 60F 254 (art.5554). Les chromato¬ graphies sur colonne de gel de silice ont été effectuées av de la silice Merck 60 H (art. 7736) ou avec de la silice silanisée RP2 Merck (art. 7719).

Les analyses CLPH ont été effectuées sur colonne Waters Radial-Pak (diam. : 8 mm, 1 : 100 mm) C₁₈ de granulométrie sphérique de 10 μm. Cette colonne est protégée par une préco lonne Guard-Pak. Le système CLHP est composé d'un injecteur U₆K, de deux pompes M-6000 A, d'un programmateur M-720

(Waters), d'un détecteur UV multicanal Pye Unicam PU 4021 et d'un centre de contrôle vidéo PU 4850 (Philipps). L'élution été réalisée avec une solution d'acétonitrile dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 5,9) à un débit de 2 ml par minute (TR temps de rétention).

Les purifications CLHP ont été effectuées sur colonne SFCC Nucléosil (diam.: 19 mm, 1 : 150 mm) de granulométrie sphérique de 10 μm. Le système CLHP est composé d'un injec¬ teur U₆K, de deux pompes M-510 EF, d'un programmateur M-720, d'un détecteur UV M-481 et d'un enregistreur Data Module 746 (Waters). L'élution est réalisée avec une solution d'acétoni trile dans l'eau à un débit de 6,25 ml par minute. Avant analyse, purification CLHP ou lyophilisation, les solutions ont été filtrées sur filtre Millex HV-4 (Millipore).

Les spectres UV ont été enregistrés sur un spectrophotomètre

UVIKON 810.

Les spectres de masse ont été pris sur un appareil JEOL JMS DX 300 par la méthode d'ionisation FAB dans une matrice de glycérol (G), glycérol/thioglycérol (GT) ou d'alcool 3-nitrobenzylique (NBA) .

Les spectres RMN du proton ont été enregistrés sur un appareil Varian EM 360 ou sur appareil Brϋker AC 250.

Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS).

La multiplicité et l'allure des signaux observés par RMN son indiquées par une (ou plusieurs) lettre(s) : s (singulet), d (doublet), t (triplet), m (multiplet), 1 (large).

Les spectres RMN du phosphore ont été enregistrés sur un appareil Brϋker WP 200 SY avec découplage du proton. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal de H₃P0₄ pris comme référence externe.

5'-O-Tertiobutyldimêthylsilyl 3'-amino 2',3'-didésoxythy- midine 2.

A une solution de 8,35 g (34,6 mol.) de 3'-amino-2' ,3'-di- desoxythymidine 1_ dans 250 ml de pyridine sont ajoutés 6,26 (41,5 m ol.) de chlorure de tertiobutyldimétylsilyle. La réaction est laissée 24 h. Le mélange est dilué avec du CH_gCl_g, lavé avec une solution aqueuse de ΝaHC0₃ puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na₂S0₄ et concentrée L'huile obtenue est chromatographiée sur gel de silice

(éluant MeOH (0-10%) dans CH₂C1₂) pour conduire à 11,8 g (96%) de 2 sous forme de mousse.

2UV (EtOH) :max 266 nm (ε 10600) min 233 nm (ε 1700)

SM (FAB positif, GT) : 711 (2M+H)⁺, 356 (M+H)⁺, 127 (BH₂)⁺ RMNΗ (DMSO-?_e) : δ = 0,07 (s; 6H, (CH₃)₂Si) ; 0,88 (s, 9H, (CH₃)₃CSi) ; 1,77 (s, 3H, CH₃) ; 2,03 (m, 2H, H-2',2'¹) ; 3,38 (m, 1H, H-3*) ; 3,58 (m, 1H, H-4' ) ; 3,72 (dd, 1H, H-5¹, J = 3,9 et 10,4 Hz) ; 3,83 (dd, 1H, H-5'*, J = 2,8 et 10,4 Hz) ; 6,11 (t, 1H, H-1 ' , J = 6,2 Hz), 7,48 (s,-1H, H-6) ppm.

5'—O- ertiobutyldiméthylsilyl 3'—(__—(4-méthoxytrityl)—amino) 2* ,3'—didésoxythymidine 3.

Le composé 2 (11,7 g ; 32,9 mmol.) est traité par 15,2 g (49,2 mmol.) de chlorure de 4-méthoxytrityle dans 295 ml de pyridine durant 20 h. Le mélange est repris avec du CH₂C1₂ (1 Et₃N) , lavé avec une solution aqueuse de NaHC0₃ puis à l'eau. La phase organique est séchée sur Na₂S0₄, évaporée et coévap rée avec du toluène. Une purification sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-3%), Et₃N (1%) dans CH₂C1₂) conduit 17,5 g (85%) de 3 sous forme de mousse.

3UV (EtOH) :λ max 266 nm (ε 11300) λ min 254 nm (ε 10200) λ inflex 232 nm (ε 15800)

SM (FAB positif, GT) : 628 (M+H)⁺, 127 (BH₂)⁺

RM^H (OMSO-d₆) : δ = -0,08 et -0,04 (s et s, 3H et 3H, (CH₃)₂Si) ; 0,79 (s, 9H, (CH₃)₃CSi) ; 1,10-1,37 (m, 2H, H-2',2'') ; 1,69 (s, 3H, CH₃) ; 3,17 (m, 1H, H-3') ; 3,50 (m, 2H, H-4', NH) ; 3,70 (m, 1H, H-5') ; 3,71 (s, 3H, CH₃OTr) ; 3,85 (m, 1H, H-5'') ; 6,09 (t, 1H, H-1 ' ; J = 6,9 Hz) ; 6,82-7,47 (m, 14H, Tr), 7,20 (s, 1H, H-6) ppm.

3'-(N-(4-Methoxytrityl)-amino) 2* ,3'-didésoxythymidine 4.

Le traitement de 17,4 g (27,7 mmol.) de 3_ par 83 ml (91 mmol.) d'une solution 1,1 M de fluorure de tetrabutylammoniu dans le THF conduit à 10,2 g (72%) de après évaporation du solvant et 4 chromatographies sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-15%), Et₃N (0,5%) dans CH₂C1₂) pour chasser les sels de butylaπunonium.

4UV (EtOH) :λ max 265 nm (ε 9900) X min 255 nm (ε 8600) λ inflex 231 nm (ε 14000)

SM (FAB positif, GT) : 514 (M+H)⁺, 127 (BH₂)⁺ R ^H (DMSO-d₅): δ = 1,02-1,19 (m, 1H, H-2') ; 1,19-1,37 (m, 1H, H-2'') ; 1,68 (s, 3H, CH₃) ; 2,8 (si, 1H, NH) ; 3,19 (m, 1H, H-3') ; 3,44 (m, 1H, H-5') ; 3,64 (m, 1H, H-5") ; 3,71 (s, 3H, CH₃0) ; 3,72 (m, 1H, H-4') ; 4,90 (t, 1H, OH, J = 4, Hz) ; 5,97 (t, 1H, H-1', J = 6,5 Hz) ; 6,81-7,55 (m, 14H, Tr) ; 7 , 55 (s, 1H, H-6 ) ; 1 1 , 2 ( si, 1 H, NHCO) ppm.

O-(3'-(N-(4-méthoxy rityl)-amino) 2',3'-didésoxy- thymidin-5'-y1)-hydrogenophosphonate 5.

Une solution de 6,65 g (97,7 mmol.) d'imidazole dans 69 ml d'acétonitrile est traitée à 0°C par 2,60 ml (29,8 mmol.) de trichlorure de phosphore et 15,3 ml (110 mmol. ) de triéthyl- a ine durant 30'. Ce mélange est additionné à 5,12 g (9,99 mmol. ) de 4 dans 69 ml d'acétonitrile. La phosphorylation est laissée 7 h puis 5 ml d'eau sont additionnés. La solution est alors concentrée sous pression réduite, reprise avec une solution de bicarbonate de triéthylammonium et extraite avec du CH₂Cl2_* La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium et évaporée. Le brut est purifié sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-20%), Et₃N (0,05%) dans CH₂Cl2) pour conduire à 5,1 g (75%) de 5.

J5UV (EtOH) :λ max 265 nm (ε 8700) λ min 254 nm (ε 7600) λ inflex 231 nm (ε 12300)

SM (FAB négatif, GT) : 576 (M)^"

RMN¹H (DMS0-d ) : δ = 1,00-1,50 (m, 2H, H-2',2''), 1,18 (t,

9H, (CH₃CH₂)₃N, J = 7,3 Hz) ; 1,75 (s, 3H, CH₃) ; 3,04 (quadruplet, 6H, (CH₃CH₂)₃N, J = 7,3 Hz), 3,21 (m, 1H, H-3') ;

3,60-3,95 (m, 3H, H-4' ,5' ,5' ' ) ; 3,72 (s, 3H, CH₃OTr) ; 6,00

(t, 1H, H-V, J = 6,3 Hz) ; 6,61 (d, 1H, HP, J = 585 Hz) ;

6,80-7,55 (m, 14H, Tr) ; 7,66 (s, 1H, H-6) ; 10,5 (si, 1H,

NH) ; 10,8 (si, 1H, NH) ppm RMN³¹P (DMS0-d_$) : δ = 2,055 ppm.

0-0'-bis (3*-N- 4-méthoxy ri yl)-amino) 2',3*didésoxy- thymidin-5'-yl)-phosphate 6. Au mélange de 2,19 g (3,23 mmol.) d'hydrogenophosphonate 5 et de 1,49 g (2,90 mmol.) du nucléoside A dans 42 ml de pyridine sont ajoutés 1,20 ml (9,74 mmol.) de chlorure de pivaloyle. Après 2 h de réaction, le milieu est dilué avec du CH₂Cl2, lavé avec une solution aqueuse de NaHC0₃ puis à l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SÛ4, concentrée et coéva- porée avec du toluène. Le brut est repris avec 82 ml d'une solution d'iode à 2% dans le mélange pyridine, eau (98:2). Après 30', le milieu réactionnel est dilué avec du CH₂Cl2 contenant 1% de Et₃N et avec une solution aqueuse de NaHC0₃, puis est traité avec une solution aqueuse de thiosulfate de sodium jusqu'à disparition de la coloration due à l'iode. La phase organique est séparée, lavée avec de l'eau, séchée sur Na₂S0₄, concentrée et coévaporée au toluène. Le diester 6 (2,27 g, 66%) est obtenu après chromatographie sur colonne d gel de silice (éluant : MeOH (0-10%), Et₃N (0,5%) dans CH₂C1₂).

6UV (EtOH) :λ max 265 nm (ε 12300) λ min 254 nm (ε 9200) λ inflex 231 nm (ε 15300)

SM (FAB négatif, GT) : 1088 (M)^", 816 (MH-MTr)^"

RMN¹H (DMSO-d₆) : δ = 1,08-1,50 (m, 2H, H-2',2'') ; 1,19 (t,

9H, (CH₃CH₂)₃N, J = 7,3 Hz) ; 1,75 (s, 3H, CH₃) ; 3,05 (quadruplet, 6H, (CH₃CH₂)₃N, J = 7,3 Hz) ; 3,20 (m, 1H, H-3') ; ≈ 3,4 (m, H-4' masqué par l'eau) ; 3,70 (s, 3H, CH₃OTr) ; 3,78 (m, 2H, H-5',5'') ; 6,04 (t, 1H, H-1 ' , J = 6,1 Hz) ; 6,80-7,52 (m, 14H, Tr) ; 10,3 (si, 1H, NH) ; 10,9 (si, 1H, NH) ppm RMN³¹P (DMSO-d₅) : δ = -1,126 ppm.

0,0^,-bis(3^,-amino-2' ,3'-didésoxy hymidin-5'-yl) phosphate (sel d'ammonium) 7, (composé 1). Le composé 6 (300 mg, 0,252 mmol.) est déprotégé par réactio avec 7,6 ml d'une solution à 2% d'acide benzène sulfonique dans le méthanol pendant 2 h. L'acide est neutralisé par addition d'une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium. La phase aqueuse est extraite avec du CH₂Cl puis concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographie .2 fois sur couche mince de gel de silice (éluant : ammoniaque (10%), eau (10%) dans l'isopropanol) pour conduire, après filtration sur filtre Millipore et lyophilisation dans l'eau, à 41 mg (31%) du diester 1_ sous forme de sel d'ammonium.

7CLHP : TR : 510 S (99, 4%) (5% CH₃CH/Ac ONH₄ 0,1M) UV (H₂0) :λ max 266 nm (ε 15000) λ min 235 nm (ε 4000)

SM (FAB négatif, GT) : 543 (M)^"; (FAB positif, GT) : 589 (M+2Na)⁺, 567 (MH+Na)⁺, 545 (M+2H)⁺

RMN¹H (DMSO-d₅) : δ = 1 ,77 (s, 6H, 2CH₃) ; 2,00-2,29 (m, 4H, 2H-2',2") ; 3,46 (m, 2H, 2H-3*) ; 3,70 (m, 2H, 2H-4') ; 3,9 (m, 4H, 2H-5*,5'') ; 6,07 (t, 2H, 2H-1 ' , J = 5,4 Hz) ; 7,64 (s, 2H, 2H-6) ppm RMN³¹P (DMS0-d₅) :δ = -0,627 ppm.

0,0'-bis(3'-amino-2*,3*-didésoxy hymidin-5*-yl) 0-(S-(2-hydr xyéthylsulfidyl) 2-thioêthyl) phosphate 8 (composé 2). Un mélange de 300 mg (0,252 mmol.) de diester 6, de 3 5 mg (2,52 mmol.) de 4-méthoxypyridine N-oxyde et de 1,07 g (2,51 mmol.) de 0-mono-(4-méthoxytrityl) dithiodiéthanol (préparé par réaction d'un grand excès de dithiodiéthanol avec du chlorure de 4-méthoxytrityle) en solution dans 63 ml de CH₂C1 est traité avec 373 mg (1,26 mmol.) de 1-(2-mésitylène-sul- fonyl) 3-nitro 1 ,2,4-triazole. Après 3 h de réaction, le milieu réactionnel est dilué avec du CH₂Cl2. lavé avec une solution aqueuse de NaHC0₃ puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na₂S0₄, concentrée et coévaporée au toluène. Le brut est directement déprotégé par réaction avec 7,5 ml d'une solution à 2% d'acide benzène sulfonique dans le MeOH en 2 h. L'acide est neutralisé par addition d'une solu- tion 1 M de bicarbonate de triethylammonium. La phase aqueuse est lavée avec du CH₂Cl2 et concentrée sous pression réduite. Le brut obtenu est purifié par CLHP semi préparative (colonne nucléosil C₁5, éluant : 12% CH₃CN dans une solution 0,05 M d'acétate de triethylammonium). Les fractions appropriées sont évaporées et lyophilisées 4 fois dans l'eau. Après filtration, sur filtre Millipore, une dernière lyophilisation donne 50 mg (25%) de triester 8_ associé à deux molécules d'acide acétique. 8CLHP : TR 320s (94% ; 7 : 4%) (15% CH₃CN/AcONH₄0,1 M) UV (H₂0) :λ max 265 nm (ε 15700) λ min 234 nm (ε 4100)

SM (FAB positif, GT) : 681 (M+H)⁺, 545 (M-(OCH₂CH₂S)₂+ H)⁺ RMN¹H (DMS0-d₅) :δ = 1,78 (s, 6H, 2CH₃) ; 1,89 (s, 6H, 2CH₃COO^") ; 1,95-2,19 (m, 4H, 2H-2',2") ; 2,77 (t, 2H, CH₂CH₂OH, J = 6,4 Hz) ; 2,96 (t, 2H, (CH₂CH₂OP, J = 6,5 Hz) ; 3,40 (m, 2H, 2H-3') ; 3,59 (t, 2H, (CH₂CH₂)OH, J = 6,4 Hz) ; 3,71 (m, 2H, 2H-4') ; 4,10-4,22 (m, 6H, 2H-5',5'\ CH₂CH₂OP) 6,14 (dd, 2H, 2H-1 * , J = 5,7 et 6,7 Hz) ; 7,47 et 7, 46 (s e s, 2H, 2H-6) ppm RMN³¹P (DMSO-d₆, D₂0) :δ = -0,504 ppm.

TABLEAU

Les composés de l'invention ont été soumis à des essais pharmacologiques montrant leur intérêt dans le traitement de maladies virales.

- Evaluation de l'activité anti VIH 1 dans les cellules MT4 MT4 = cellule T humaine transformée par HTLV1 HTLV = human T ly photropic virus.

La multiplication du VIH-1 (souche HTLV IIIB) dans les cellules MT4 est suivie par l'effet cytopathogène induit par le virus.

Les cellules sont infectées avec une dose de VIH-1 produisan après 5 jours une diminution de 90 % du nombre de cellules vivantes.

Les composés testés sont ajoutés, après l'adsorption du . virus, dans le milieu de culture à différentes concentrations. La concentration la plus élevée utilisée est 10 M. La viabilité des cellules est mesurée par une réactio colorimétrique basée sur leur capacité à réduire le bromure de 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl-tetrazolium en formazan, propriété due aux deshydrogenases mitochondriales. La quantité de formazan produit est appréciée par la mesure de la D.O. à 540 nm : cette D.O. est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le pourcentage de protection des cellules infectées par le traitement avec les composés est calculé en appliquant la formule proposée par Pauwels et col.

D.O. 540 des cellules D.O. 540 des cellules infectées infectées traitées non traitées

D.O. 540 des cellules D.O. 540 des cellules infectées non infectées non traitées

Les composés de l'invention présentent une activité anti VIH,

L'effet toxique des composés sur les cellules MT4 non infectées est mesuré par la même réaction colorimétrique. La dose cytotoxique 50 % (CD50) est la concentration de composé provoquant une diminution de moitié de la D.O. 540 par _* - rapport à celle des cellules témoins.

ANNEXE 1

-O-aminodT

Claims

Revendications

1. Dérivés de 2' ,3'-didésoxy-3'-amino-thymidine répondant à la formule

dans laquelle

R est NH₄ ⁺ ou H0(CH₂ )2-S-S- (CH₂) 2- -

2. Médicament contenant un dérivé selon la revendication 1.

3. Composition pharmaceutique contenant un dérivé selon la revendication 1 en association avec tout excipient pharmaceutique acceptable.