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WO1993011232A1 - Cytokine antagoniste de l'ifn-gamma - Google Patents

Cytokine antagoniste de l'ifn-gamma Download PDF

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Publication number
WO1993011232A1
WO1993011232A1 PCT/FR1992/001123 FR9201123W WO9311232A1 WO 1993011232 A1 WO1993011232 A1 WO 1993011232A1 FR 9201123 W FR9201123 W FR 9201123W WO 9311232 A1 WO9311232 A1 WO 9311232A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cytokine
cells
dna sequence
minutes
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1992/001123
Other languages
English (en)
Inventor
Patricia Henriette Krief
Bruno Azzarone
Yvette Augery-Bourget
Claude Boucheix
Claude Jasmin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US08/244,557 priority Critical patent/US5612195A/en
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority to JP5509893A priority patent/JPH07501695A/ja
Priority to EP93901040A priority patent/EP0618967A1/fr
Publication of WO1993011232A1 publication Critical patent/WO1993011232A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a new cytokine, a specific antagonist of the induction of expression of class 11 istocompatibility antigens on the surface of cells, by gamma interferon. 5 All the cells of the organism express on their surface glycoproteins called class I histocompatibility antigens.
  • glycoproteins expressed only by immunocompetent cells class II histo ⁇ compatibility antigens. These antigens are coded by a family of
  • CM. H. major histocompatibility complex
  • Class II anti histocompatibility genes play an important role during the immune response, in particular in the context of interactions between B and T cells or between presenting cells
  • Interferon gamma promotes the functions of immunocompetent cells by inducing the expression of antigens of the major histo-compatibility complex (C.M.H.) by many cell types (Becker, 1985).
  • the capacity to present the antigen is proportional to the quantity of molecules (H.L.A.) class II present on the
  • Interferon gamma therefore allows these cells to express enough class II molecules (HLA) to present the antigen.
  • HLA class II molecules
  • Class II antigens (H.L.A.) are also considered.
  • class II antigens are constitutive on cells B. Accolla et Coll. (1985) and De Préval et al. (1,985) have shown that this expression is under the control of a factor which acts in trans at the gene level. 35 A model for regulating class II antigens has been proposed by Boss and Strominger (1986). In this model, there exist at the genomic level in the 5 'flanking region of the gene, successive regions controlling the expression of the histocompatibility antigens: a negative regulatory element, 2 ⁇ positive control regions, and another negative control region.
  • the induction efficiency is different depending on the cell system concerned. Indeed, certain cell lines (leukemic line 562, embryonic fibroblasts, etc.) are difficult to duct, or even not inducible, while other lines (adult fibroblasts, colon carcinoma cells, etc.) express H.L.A. antigens. class II after induction with low doses of gamma interferon.
  • cytokine which is a specific antagonist of the induction of expression of class II histocompatibility antigens on the surface of cells by gamma interferon, and which - comprises all or part the peptide sequence as described in FIG. 1, as well as the variants retaining the biological activity previously described, and
  • the present invention also relates to the variants of this cytokine in particular the variants obtained by deletion in particular of the N or C terminal ends, the variants obtained by substitution of a or more amino acids and the addition variants obtained by adding one or more amino acid (s), for example the amino acid methionine at the N-terminus when the cytokine is expressed in a bacterium.
  • the variants of this cytokine in particular the variants obtained by deletion in particular of the N or C terminal ends, the variants obtained by substitution of a or more amino acids and the addition variants obtained by adding one or more amino acid (s), for example the amino acid methionine at the N-terminus when the cytokine is expressed in a bacterium.
  • the present invention also relates to the compounds comprising the active epitopes of the cytokine which may or may not be linked together by different sequences, and which are also hereinafter called variants.
  • the cytokine can be glycosylated, so as to be able to undergo post-translational modifications, which are of interest for its biological activity in mammalian cells, or non-glycosylated.
  • the natural protein has, in addition to the characteristics described above, a molecular weight of the order of 19,000 on SDS polyacrylamide gel, and its inhibitory activity is sensitive to heat and to trypsin.
  • the protein is precipitable in a 50% ammonium sulfate solution.
  • the protein can be obtained naturally, as a secretion product in the cell culture supernatant. It can also result from the expression of an exogenous DNA sequence in prokaryotic or more advantageously eukaryotic cells.
  • the exogenous DNA sequence may in particular be a complementary DNA sequence or else a genomic DNA sequence.
  • the DNA sequences according to the invention include the sequences which allow the expression of new cytokines in prokaryotic and eukaryotic host cells.
  • the sequences according to the invention relate more precisely to those chosen from: a) the DNA sequence of FIG. 1 or its complementary strands; b) a DNA sequence which hybridizes with the DNA sequences of a) or a part thereof; and c) a sequence which, taking into account the degeneracy of the genetic code codes for a cytokine having the same amino acid sequence as a) or b). d) a sequence which codes for a variant of said cytokine and which retains the biological activity described above.
  • the present invention also relates to DNA sequences coding for the expression of variants as described above.
  • the invention also relates to hybridizing DNA sequences. to the DNA sequences previously described, or to one or more of their fragments.
  • sequences according to the invention may or may not be covenantly associated with a labeled molecule, in particular by isotopic labeling (I 125, etc.) or by non-isotopic labeling (biotin, etc.) so as to be easily detected.
  • isotopic labeling I 125, etc.
  • biotin biotin, etc.
  • the present invention also relates to host cells, eukaryotic or prokaryotic, having undergone a transformation or a transfection with a DNA sequence as previously described, so as to ensure the expression in the host cell of said cytokine.
  • the invention also relates to a cloning vector, bioiogically functional, comprising a DNA sequence as described above, as well as the eukaryotic or prokaryotic host cells, transformed or transfected, in a stable manner, by such a cloning vector.
  • bioiogically functional cloning vector is intended to denote any vector capable of allowing the expression of the sequence in question in the transformed or transfected host, or else capable of allowing the chromosomal integration of said sequence, and its expression under the control of '' a homologous or heterologous promoter.
  • This type of vector is known in the field of recombinant DNAs. It may be a self-replicating plasmid or not, comprising an origin of replication effective in the host, for example the origin of replication of pBR322 for E. coli as well as the elements ensuring the expression of the sequence :
  • These plasmids may also include marker genes ensuring selection in particular, or integration sequences comprising homologous sequences ensuring integration by recombination.
  • viruses may also be recombinant viruses, for example vector viruses of the vaccinia type.
  • the methods of transformation and trans ⁇ fection are known and must be adapted to the host.
  • Host cells may also have been modified through vectors to excrete the protein in mature and / or fused form.
  • the present invention also relates to a process for preparing the new protein, characterized in that said cytokine is purified from the cell culture supernatant or the cytokine is made to express by prokaryotic or eukaryotic host cells described above, then isolates the desired cytokine.
  • the cells are preferably cultivated in an appropriate nutritive medium devoid of the proteins contaminating the serum, the latter being contained in a dialysis bag permeable to molecular weights of less than 50 kD .
  • This method can also be used when the host cell is a cell having been treated with a vector as described above, and the culture of which requires the use of serum, although it is preferred to use hosts which grow on a simple medium.
  • the cells capable of producing a cytokine according to the invention are quite numerous; among these is the line K562 available from the National Institute of General Medical Sciences under the number GM05372D. However, it is possible to use other cells, in particular carcinomas, or hepatoma cells.
  • cell lines such as 562 and its subclones no longer expressing said cytokines are particularly advantageous as host cells.
  • the invention also relates to the antibodies, in particular the monoclonal antibodies, directed against the cytokines according to the invention. These antibodies can in particular be used in the context of a diagnosis of the presence of said proteins.
  • the invention also relates to an immuno-serum directed against the cytokines previously described.
  • cytokines according to the present invention can be used as active principle in a therapeutic composition, in the case where it is desired to increase the antagonistic effect of these proteins with respect to gamma interferon.
  • compositions are especially usable in all states requiring modulation of the activity of gamma interferon.
  • the compositions according to the present invention can be used in the treatment and / or prevention of certain types of autoimmune diseases, but also during certain surgical procedures such as certain transplants.
  • compositions according to the invention may also comprise other monokynes and / or cytokines.
  • the invention also relates to a therapeutic composition containing, as active principle, an antibody or an immuno-serum, directed against said cytokine or even antisense corresponding to the coding sequences, this in particular in order to limit the quantities of circulating cytokine.
  • the invention also relates to a diagnostic kit for detecting the protein, and comprising at least one antibody directed against it.
  • FIG. 1 represents: the nucleotide sequence of complementary DNA corresponding to the inhibitor, and the deduced peptide sequence.
  • FIG. 2 represents: 1) on the right: the histograms obtained on a flow cytometer (EC Coulter) for expression of the HLA DR (b) and HLA class I (c) antigens on the K562 cells after induction by gamma interferon glycosylated, at 1000 IU / ml.
  • EC Coulter flow cytometer
  • HLA class I antigens on the K562 cells after induction by gamma interferon glycosylated, at 1000 IU / ml.
  • negative controls without gamma interferon, with or without specific antibodies the curves overlapping).
  • FIG. 3 represents: the histograms obtained on a flow cytometer (EC Coulter), for the expression of the HLA DR (b) and HLA class I (d) antigens on the ICIG-7 cells after induction by glycosylated gamma interferon, YES / ml.
  • a negative controls without gamma interferon with or without specific antibodies (the curves overlap).
  • the figure represents the purification steps: in (A) cell culture, in (B) the curve obtained after MonoQ column, and in (C) the curve obtained after Superose 12.
  • the active fractions are located in the hatched parts.
  • 562 cells from the pleural effusion of a patient with chronic myeloid leukemia in blast crisis, are grown in complete RPMI-160 medium. The cells are placed in an oven at 37 ° C and 5% CO ... They are seeded at a concentration of 250,000 cells / ml every 72 hours.
  • ICIG-7 cells normal human embryonic fibroblast cells (these cells were cultured in our laboratory from normal human embryonic lung), are cultured in a humid oven at 37 ° C and 5% CO-, in full MEM medium. The adherent cells which have reached confluence (at 72 h) are detached from their support by the action of trypsin (0.25% in MEM) 2 to 3 minutes and returned to culture at a density of 80,000 cells / cm 2 .
  • 562 cells are grown under the conditions described above; the culture medium is removed after 72 h, centrifuged, filtered through a 0.22 ⁇ m filter and supplemented with 10% of FCS and 2 mM of gluta ine.
  • Interferon gamma IFN-Gamma
  • the non-glycosylated recombinant gamma interferon produced from E. bacteria. Coli is obtained from the company Biogen (GENEVA, SWITZERLAND) and its specific activity is 2.10 IU / rng.
  • the cells (562 or ICIG-7) are grown in
  • ICIG-7 cells are induced under the conditions described in the previous paragraph, but, in the presence of conditioned medium or purification fractions which are diluted in complete MEM medium (see purification).
  • histocountability antigens on the cell surface was determined by the indirect immunofluorescence technique.
  • the cells are washed 3 times in Hanks medium, then resuspended at the cell density of 5.10 cells / ml. 200 ⁇ l of this suspension are distributed in wells of a round bottom microplate (96 wells). The plate is centrifuged for 5 minutes at 800 g, the supernatant is removed.
  • the cells are then incubated for 30 minutes at 4 ° C. in a humid chamber with 20 ⁇ l of antibody at 10 ⁇ g / ml: Dl-12 (Carrel and Coll, 1981), for the HLA class II and 10T2 antigens (Immunotech, France ) for HLA class I antigens
  • the cells After three washes in Hanks medium by centrifugation for 5 minutes at 800 g and removal of the supernatant, the cells are incubated for 30 minutes at 4 ° C. in a humid chamber with 20 ⁇ l of goat anti mouse immunoglobulin antibodies coupled to fluorescein (FITC). (Immunotech, France) at the dilution prescribed by the manufacturer. The cells are washed 3 times in Hanks medium and analyzed by flow measurement (ATC Qdam
  • the analysis is performed on 5,000 or 10,000 cells at a wavelength of 488nm.
  • the results are represented in the form of cell distribution histograms with, on the abscissa, the fluorescence intensity (logarithmic scale) and, on the ordinate, the number of cells. 5
  • the K562 cells are washed 3 times in RPMI-1640 (without phenol red) in order to remove the traces of SVF, then resuspended in RPMI-1 40 (without phenol red) added with 2 mM of glutamine.
  • a dialysis bag with a porosity of 50Kd (Spec ⁇ rapor 7 Spectrum) containing 10 ml of pure fetal calf serum is introduced into a culture flask containing 5 ml containing 90 ml of RPMI-1640 (without phenol red or SVF) and
  • the cells are cultured for 72 hours at 37 ° C., the medium is centrifuged at 800 g for 15 minutes; the pellet is removed and the supernatant is again centrifuged at 800 g for 15 minutes, then filtered through a 0.22 ⁇ m filter. PMSF J is added to the supernatant at a final concentration of ImM.
  • the supernatant is concentrated 100 times on an AMICON YM10 membrane, then dialyzed against a large volume of IOmM Phosphate buffer / pH 7.4 containing PMSF ImM.
  • An anion exchange column (Mono Q Pharmacia SUEDE) is balanced with 10 ml of 10 mM Phosphate buffer / pH 7.4.
  • the sample is deposited on the column and then eluted using 20 ml of a NaCl gradient from 0 to 0.25 M in 10 mM buffer / pH 7.4.
  • 0.5 ml fractions are collected at the column outlet and analyzed on polyacrylamide gel (gradient from 8 to 25%) in the presence of SD5.
  • the gel is then stained with silver nitrate as prescribed by the manufacturer (Phast System, Pharmacia SUEDE).
  • the biological activity of each fraction is then tested, at several dilutions in complete R PMI-1640 medium, according to the protocol described above.
  • fractions containing the biological activity are combined and concentrated 10 times on an AMICON YM 10 membrane, the sample is placed on a gel filtration column (Superose 12, Pharmacia SUEDE), then the filtration is carried out using with a 10 mM phosphate buffer / 0.15 M NaCl / pH 7.4.
  • the column had previously been calibrated with a set of proteins of known molecular weights (Kit Pharmacia) and equilibrated with 10 mM phosphate buffer / 0.15 M NaCl / pH 7.4.
  • a Balb / C mouse is immunized according to the following protocol:
  • a final subcutaneous injection is carried out 5 days before cell fusion with a solution containing 10 ⁇ g of purified protein 0 in 0.5 ml of PBS without Freund's adjuvant.
  • the NSI mouse myeloma cells are resuspended in complete RPM1-1640 medium, at a concentration of 250,000 cells / ml.
  • the peritoneal macrophages of a Balb / C mouse are removed by washing the peritoneal cavity using 5 ml of cold 0.15 M NaCl.
  • the macrophages are centrifuged for 10 minutes at 800 g, then resuspended in HAT medium at a concentration of 5.10 cells / ml and distributed in 5 culture microplates (96 wells), at the rate of 100 ⁇ l per well.
  • the micropiacs are then placed in a C02 incubator (37 ° C, 7% C0 2)
  • the NSI cells are washed 4 times in RPMI-1640 by centrifugation at 800 g for 10 minutes, then the last pellet is taken up in RPMI-1640 at the concentration of 10 cells / ml.
  • the spleen of the immunized mouse is removed, diacerated in RPMI-1640, the cells obtained are centrifuged for 10 minutes at 800 g and 7 the pellet taken up in RPMI-1640 at the concentration of 10 cells / ml.
  • cell fusion is carried out by mixing, in a 50 ml tube, 5 ml of spleen cells (5.10 cells), 3 ml of NSI cells (3.10 cells) and 42 ml of RPMI-1640.
  • the tube is centrifuged for 10 minutes at 800 g, and the pellet is taken up in 1 ml of fusion solution, added in 1 minute, maintaining constant agitation. Then the tube is immersed, 90 seconds, in a water bath at 37 ° C while maintaining agitation.
  • the fusion is stopped by introducing 50 ml of complete RPMI-1640 medium according to the following protocol:
  • the tube is left for 5 minutes at room temperature, centrifuged for 10 minutes at 200 g and the pellet obtained is washed twice in complete RPMI-1640 medium, per centnf ugation 10 minutes at 200 g. After each centrifugation the cells are taken up as gently as possible. The cells are resuspended in 50 ml of HAT medium and distributed, at a rate of 100 ⁇ l / well, in the microplates containing the macrophages. These are replaced in the CO ⁇ incubator
  • the medium is renewed after 6 days of culture, by aspirating the supernatant and replacing it with fresh medium. During the second and third weeks of culture, colonies, made up of hybrid cells selected by the medium, appear in certain wells.
  • the culture supernatants are removed to test the presence of antibodies and the reactivity thereof; the clones of interest are removed and transferred to 24-well culture macroplates containing 2 ml of complete RPMI-1640 medium and 2.10 splenic cells originating from a normal Balb / C mouse.
  • the purified protein is fixed on microELlSA microplates, by incubation for 1 hour at 37 ° C., with 100 ⁇ l per well, of a protein solution at 0.1 ⁇ g / ml in a carbonate / bicar buffer. 0.5 M bonate pH 9.6. The excess protein is removed by 5 washes in NaCl / Tween buffer. Then the plate is saturated for 1 hour at 37 ° C. using a solution of PBS / SAB (Bovine Albumin Serum) 3%.
  • PBS / SAB Bovine Albumin Serum
  • the revelation of the mouse immunoglobulins fixed to the plate is carried out by incubation with 100 ⁇ l / well of goat anti mouse immunoglobulin antibodies labeled with peroxidase and diluted (at the dilution prescribed by the manufacturer) in PBS / 0.05% Tween 20/3% SAB. The plates are incubated for 30 minutes at 37 ° C. and then washed 5 times in NaCl / Tween buffer.
  • the level of peroxidase-labeled antibodies attached to the plate is evaluated by determining the peroxidase activity using a solution of orthophenylene Diamine (OPD) in an OPD buffer in the presence of hydrogen peroxide (HO ( 40 mg of OPD per 100 ml of Buffer and 20 ⁇ i of H ⁇ O-, 110 volumes are added extemporaneously).
  • OPD orthophenylene Diamine
  • ICIG-7 cells are cultured in 6-well culture macroplates (9 cmV well) at a cell density of 5.10 cells / well / 2 ml, for 72 h in the presence of 1000 IU / ml of recombinant IFN-gamma (CHO) , purified protein and hybridoma supernatants diluted 1/2, in complete MEM medium, containing the antibodies.
  • CHO recombinant IFN-gamma
  • the nitrocellulose is cut into strips to test the reactivity of the various monoclonal antibodies vis-à-vis the molecule.
  • Each strip is incubated overnight at 4 ° C. with 2 ml of each hybridoma culture supernatant diluted 1/2 in a PBS / 0.1% Tween 20 solution. After 3 washes of 5 minutes in NaCl / buffer Tween, the bands are incubated for 1 h 30 min at room temperature with rabbit anti-mouse immunoglobulin antibodies (Rabbit anti Mouse DAKO 24 1 2) diluted to 1/500 in NaCl / Tween buffer.
  • the strips are incubated with the APAAP complex (Sera Lab) diluted 1/400 in NaCl / Tween buffer, 1 h 30 min at room temperature. The strips are again washed 4 times in NaCl / Tween buffer.
  • the fixed antibodies are revealed according to the following protocol: 400 ⁇ l of NBT (50 mg / ml) are added to 60 ml of NBT buffer, after dissolution, 200 ⁇ l of BCIP (50 mg / ml) are added to the solution. The strips are left in this solution for approximately 5 minutes: then washed with water and dried on a hatman paper 3MM Chr.
  • An isolated colony is removed and incubated at 37 ° C. with shaking for 3 to 4 hours in 1 ml of LB, then the bacteria are transferred into 50 ml of LB and incubated overnight at 37 ° C with shaking. The bacteria are centrifuged for 20 minutes at 1200 g and the pellet is taken up in 20 ml of SM buffer.
  • 300 ⁇ l of bacteria Y 1090 are added to 100 ⁇ l of phages diluted to 1/500000, in SM buffer: the phage bacteria mixture is incubated for 25 minutes at 37 ° C. 7.5 ml of soft agar (Top Agar) are added and immediately spread on a 150 mm dish containing LB / agar / ampicillin. The dish is incubated at 42 ° C for 4 h, then the lysis ranges are counted to determine the titer of the bank.
  • the filters are transferred into a mixture of 4 antibodies, chosen from those produced, in the form of ascites and diluted 1/500 in NaCl / Tween buffer.
  • the filters are incubated overnight at 4 ° C., washed 4 times 5 minutes in NaCl / Tween buffer, then incubated for 1 h 30 min at laboratory temperature, with diluted rabbit anti Mouse immunoglobulin antibodies (Rabbit anti Mouse DAKO Z 12). 1/500 in NaCI / Tween buffer. After 4 washes of 5 minutes in NaCI / Tween buffer, the filters incubated with the ⁇ P P Complex (Sera Lab) diluted 1/400 in NaCI / Tween buffer, 1 h 30 at room temperature.
  • the filters are again washed 4 times in NaCl / Tween buffer.
  • the positive lysis ranges are revealed according to the following protocol: 400 ⁇ l of NBT (50 mg / ml) are added to 60 ml of NBT buffer, after dissolution, 200 ⁇ l of BC IP (50 mg / ml) are added to the solution.
  • the filters are left in this solution in the dark until the appearance of a positive lysis range (approximately 5 minutes); the filters are then washed with water and dried on a whatman 3 MM Chr paper for a few minutes.
  • the positive lysis ranges in the first round are taken using an inverted Pasteur pipette, each carrot thus taken is put to diffuse overnight in 1 ml of SM / MgSO buffer. 10 m ⁇ 1.
  • the phages are titled horn described for the titration of the bank.
  • the positive lysis ranges in the second round are taken using a Pasteur pipette, each carrot thus taken is put to diffuse overnight in 1 ml of SM / MgSO buffer. 10 mM
  • the phages are titrated as described for the titration of the bank. For each lysis range, a suspension of 50 phages in 100 ⁇ l of SM / MgSO buffer, l ⁇ mM is added to 100 ⁇ l of bacteria Y 1090 freshly prepared in SM.
  • a suspension of 5.10 phages to be amplified in 100 ⁇ l of SM / MgSO ⁇ 10 m.M buffer is added to 300 ⁇ l of bacteria Y 1090 freshly prepared in SM, the mixture is incubated for 25 minutes at 37 ° C. 7.5 ml of Top Agar are added to each tube and immediately spread on a 150 mm box containing LB / Agar / Ampicillin. The dishes are incubated at 42 ° C for 4 h, then overnight at 4 ° C in 10 ml of SM. The diffusion product is recovered, and the box rinsed with 5 ml of SM buffer. The phages are titrated as described for the titration of the bank.
  • An isolated colony of bacteria Y1090 is removed and incubated at 37 ° C. with shaking for 3 to 4 hours in 1 ml of LB, then transferred to 50 ml of
  • the mixture is incubated for 20 minutes at 37 ° C. with shaking. After a 30-minute centnfugation at 10,000 RPM at 4 ° C., the supernatant is recovered, DNAse and RNAse at the final concentration of 2.5 ⁇ g / ml are added.
  • the preparation is incubated for 45 minutes at 37 ° C. with shaking, 24 g of NaCl (for 400 ml) and ⁇ g of PEG 6000 (for 400 ml) are successively added. After precipitation for 1 hour (or overnight) at 0 ° C, the mixture is centrifuged at 1 000 RP.M 30 minutes at 4 ° C. 5 The supernatant is removed and the tube was drained on absorbent paper. The pellet is taken up in 1 ml of SM buffer, then 10 ⁇ l of 10% SDS and 10 ⁇ l of 0.5 M EDTA pH8 are added. The tube is incubated for 15 minutes at 68 ° C.
  • the insert is recovered after digestion with the restriction enzyme J EcoRI:
  • RNAse 10 ⁇ g / ml
  • the digestion is controlled on 1% agarose gel in TAE IX buffer; for this 8 ⁇ l of the solution are removed and 2 ⁇ l of 0 loading buffer are added.
  • the migration takes place at 80 volts in a mini eiectrophoresis tank in the presence of TAE I X buffer and BET at 0.5 ⁇ g / ml.
  • the supernatant is carefully removed and the pellet washed in 500 ⁇ l of 80% ethanol and centrifuged for 1 5 minutes at 12000 g at 4 ° C., then dried. The pellet is taken up in 10 ⁇ l of distilled water.
  • the plasmid is digested with EcoRI:
  • the mixture is incubated for 1 hour at 37 ° C., the digestion is checked on 1% agarose gel as described above.
  • 100 ⁇ l of the digestion solution are transferred to an Eppendorf tube and 100 ⁇ l of Phenol / Chloroform V / V are added. After shaking the tube and centrifuging for 5 minutes at 12000 g and at 4 ° C, the upper aqueous phase is transferred to a new tube. 100 ⁇ l of 4 M ammonium acetate and 500 ⁇ l of cold absolute ethanol are added and the tube left for 15 minutes in the carbo ice, reheated for a few seconds and centrifuged for 15 minutes at 12000 g at 4 ° C. The supernatant is carefully removed and the pellet washed in
  • a 0.8% SeaPlaque GTG agarose gel (FMC BioProducts) is produced in TAE I X buffer. 2 ⁇ l of loading buffer are added in either 10 ⁇ l of plasmid or 10 ⁇ l of phage DNA. The samples are deposited on the gel and the migration is carried out at 20 volts in a TAE IX buffer in the presence of BET at 0.5 ⁇ g / ml final; until the migration front reaches 10 cm.
  • the agarose bands corresponding to the plasmid and to the insert are cut under UV and recovered in Eppendorf tubes, the tubes are heated to 65 ° C. and the volume of molten agarose measured.
  • the supernatant is removed and the bacteria resuspended in 50 ml of CaCl-50 mM / 20% glycerol.
  • the bacteria are either used immediately, or frozen at -80 ° C, in aliquots.
  • the tubes are incubated for 15 minutes at 4 ° C, then 2 minutes at 42 ° C and finally 10 minutes at room temperature.
  • 1 ml of LB is added and these are incubated for 1 hour at 37 ° C., 300 ⁇ l of this suspension are spread on a 90 nm dish containing LB / Agar / Ampi ⁇ cillin.
  • the dishes are incubated overnight at 37 ° C.
  • Colonies are removed from the dishes using toothpicks and placed in tubes containing 3 ml of LB, then incubated overnight at 37 ° C. with shaking. 1.2 ml of each suspension are transferred into Eppendorf tubes, the bacteria are recovered by centrifugation for 15 minutes at 12000g (4 ° C). The supernatant is removed, the pellet taken in 1 00 ⁇ l of TELT buffer and 10 ⁇ l of lysozy me. The tubes are placed for 1 minute at 1,00 ° C. and 5 minutes in ice, then centrifuged for 10 minutes at room temperature. The pellet is removed using a toothpick, then 220 ⁇ l / tube of cold absolute ethanol are added and the tubes put in dry ice for 1 minute.
  • the tubes are reheated then centrifuged for 1 5 minutes at 4 ° C. and at 1,200 g, the supernatants eliminated and the pellets washed with 500 ⁇ l / tube of 80% cold ethanol, centrifuged 1 0 m inutes at 1,2000g at 4 ° .
  • the pellets are dried and then each pellet is taken up in 30 ⁇ l of 10 mM Tris HC1 pH 7.5.
  • One of the plasmids containing the insert is amplified; for this, 50 ⁇ l of bacteria containing the plasmid of interest are incubated overnight at 37 ° C. and with shaking in 10 ml of LB containing Ampicillin.
  • the optical density is measured at 600 nm and the bacteria are diluted in LB, containing Ampicillin, to obtain 500 ml of culture having an optical density of 0.1.
  • the bacteria are incubated overnight at 37 ° C. and with stirring in a 2 liter Erlen Meyer.
  • the bacteria are centrifuged for 20 minutes at 4 ° C. and at 2000 g, and the purification of the plasmid is carried out, according to the manufacturer's instructions, on a Quiagen column.
  • oligonucleotides The synthesis of oligonucleotides is carried out using an automatic synthesizer (Applied biosystem), the oligonucleotide obtained is fixed on a column. It is eluted from this column with 3 25% ammonia passages (300 .mu.l, 300 .mu.l and 400 .mu.l) using a syringe "of 1 ml and recovered at the other end with the aid of another syringe Each introduction of ammonia is accompanied by a 15-minute incubation at room temperature The oligonucleotide is recovered in a tube which is placed at 65 ° C. overnight.
  • Applied biosystem automatic synthesizer
  • the oligonucleotide is precipitated in 1 volume of 4 M ammonium sulphate and two and a half volumes of cold absolute ethanol, the tube is placed in the dry ice for 15 minutes, warmed, centrifuged for 15 minutes at 12000 g at 4 ° C. The supernatant removed and the residue washed in 500 ⁇ l of cold 80% ethanol. The pellet is dried and taken up in 500 ⁇ l of distilled water. A measurement of the optical density is carried out at 260 nm and the concentration of oligonucleotide is adjusted to 0.8 ⁇ M which can be used for the sequence.
  • the sequencing was carried out using the T7 sequencing kit from Pharmacia, according to the technique described by the manufacturer.
  • the reaction product is electrophoresed on 8% polyacrylamide gel 0.4 mm thick, in the presence of 46% urea and in TBE IX buffer. Two deposits of each sequence reaction are carried out 2 hours apart.
  • the sequence was determined by several reactions. The first two sequence reactions were carried out using two oligonucleotides corresponding to the site of insertion of the insert into the plasmid. The two following sequence reactions were carried out using 2 15mer oligonucleotides corresponding to the last bases which can be read on the insert. The following sequence reactions were carried out in the same way, that is to say that 2 new oligonucleotides were chosen and synthesized. Successive reactions were carried out until the complete sequence was obtained. 4. Amplification of the phage insert by PCR
  • Amplification of the insert by PCR was carried out on a Perkin Elmer Cetus device.
  • the PCR product is used for sequencing according to the Maxam and Gilbert technique on pieces of paper (for Maxam and Gilbert Amersham RPN 1500 sequence).
  • Reaction A + G the paper is incubated for 10 minutes at room temperature in 1 ml of 66% aqueous formic acid.
  • Reaction C the paper is incubated for 10 minutes at room temperature in 1 ml of hydroxylamine / hydrochloride 275 mg / ml pH 6.
  • Reaction G the paper is incubated for 5 minutes at room temperature in 1 ml of 50 mM ammonium formate pH 3.5 containing 7 ⁇ l of DMS.
  • T + C reaction the paper is incubated twice 10 minutes at room temperature in twice l ml of potassium permanganate 2 mg / ml.
  • Each fragment is washed 3 times 30 seconds in distilled water and once 30 seconds in 96% ethanol, the paper is air dried 2 minutes between each wash.
  • the fragments are then transferred to Eppendorf tubes containing 300 ⁇ l of piperidine; after 30 minutes at 90 ° C the fragments are removed and the tubes allowed to dry.
  • pellets are taken up in 40 ⁇ l of distilled water per tube and then dried. This operation is repeated 3 times. Each base is included in
  • the insert purified from the phage is treated with the enzyme of
  • DNA is precipitated by adding one volume of 4 M ammonium acetate and 2.5 volumes of cold absolute ethanol; the tube is placed for 15 minutes in the dry ice, heated, centrifuged at 12000g 15 minutes at 4 ° C. After removal of the supernatant, the pellet is washed in 500 ⁇ l of cold 80% ethanol, centrifuged for 15 m inutes at 12,000 g at 4 ° C., dried and taken up in 10 ⁇ l of distilled water.
  • the tube is incubated at 15 ° C. overnight, the non-removed adapters are eliminated on a column of sephadex S400 from Pharmacia according to the protocol described by the manufacturer.
  • the recovered DNA is precipitated as described above and the pellet is taken up in 21 ⁇ l of distilled water.
  • CDM8 vector cut with BstXl In vitrogen 0.2 ⁇ g / ⁇ l
  • 3 ⁇ l of ligation buffer supplied by the manufacturer
  • 2 ⁇ l of T4 DNA ligase 2.5 IU / ⁇ l
  • the tube can be stored at -20 ° C.
  • An isolated colony of bacteria is removed and cultured in 50 ml of LB with stirring at 37 ° C overnight.
  • the density is measured at 600 nm diluted in LB to obtain 500 ml of bacteria at o, l optical density.
  • the bacteria are returned to culture at 37 ° C. with stirring until an optical density of 0.4 to 0.5 at 600 nm is obtained; the bacteria are cooled as quickly as possible to 0 ° C. and left for 15 minutes at 0 ° C.
  • 2 ⁇ l of the ligation product and 50 ⁇ l of competent bacteria are mixed in a 0.2 cm electroporation cuvette, the device is adjusted to 2470 mV, 400 Ohms, 25 ⁇ F.
  • the bacteria are taken up in l ml of SOC medium and then incubated for 1 h with shaking at 37 ° C.
  • the bacteria are spread at a rate of 10 ⁇ l, 100 ⁇ l or 500 ⁇ l on 3 boxes of LB / Agar / Ampicillin / Tetracycline.
  • the dishes are incubated overnight at 37 ° C. Mini preparations are made to check the insertion as described above.
  • One of the plasmids having the direction of insertion allowing the synthesis of the protein, is used for the electrophoresis of COS cells.
  • the COS cells are seeded in complete DMEM medium and are collected after 24 hours (50 to 70% confluence). The cells are washed twice in cold PBS by centrifugation at 800 g for 5 minutes and resuspended at 10 cells / ml in electroporation buffer.
  • 0.8 ml of cell suspension and 60 ⁇ g of plasmid / insert are mixed in a 0.4 cm electroporation cuvette.
  • the cuvette is placed in the ice for 10 minutes, the device is set to 380 mV, 25 ⁇ F.
  • the cuvette is placed in ice for 10 minutes, then the cells returned to culture in a 75 cm 2 flask. The supernatant is removed 48 hours later for testing.
  • the supernatant of COS cells, electroporated, is used in an induction test for ICIG7 cells, the supernatant is used at different dilutions in complete MEM medium, and the test is carried out as described above.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle cytokine qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules, par l'interféron gamma, et qui comporte tout ou partie de la séquence peptidique telle que décrite dans la figure (I), ainsi que ses variants conservant l'activité biologique précédemment décrite, et est naturellement secrétée par les cellules, ou est le produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène dans des cellules procaryotes ou eucaryotes.

Description

CYTOKINE ANTAGONISTE DE L' IFN-GAMMA
La présente invention concerne une nouvelle cytokine, antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d' istocompatibilité de classe 11 à la surface des cellules, par l'interféron gamma. 5 Toutes les cellules de l'organisme expriment à leur surface des glycoprotéines appelées antigènes d'histocompatibilité de classe I.
Il existe également une catégorie de glycoprotéines exprimées uniquement par les cellules immunocompétentes, les antigènes d'histo¬ compatibilité de classe II. Ces antigènes sont codés par une famille de
1 J gènes situés chez l'homme sur le chromosome 6, et appelée complexe majeur d'histocompatibilité (CM. H.), ou (H.L.A.) chez l'homme.
Les anti gènes d'histocompatibilité de classe II jouent un rôle important au cours de la réponse immunitaire, en particulier dans le cadre des interactions entre cellules B et T ou entre cellules présentatrices
- ^ d'antigènes et cellules T. L'interféron gamma favorise les fonctions des cellules immunocompétentes en induisant l'expression des antigènes du complexe majeur d'histo-compatibilité (C.M.H.) par de nombreux types cellulaires (Becker, 1985). La capacité à présenter l'antigène est proportionnelle à la quantité de molécules (H.L.A.) classe II présentes sur la
2J surface des cellules accessoires. L'interféron gamma permet donc à ces cellules d'exprimer suffisamment de molécules (H.L.A.) classe II pour présenter l'antigène. Le mécanisme de régulation, interféron gamma dépenαante, n'a pas encore été élucidé.
Les antigènes (H.L.A.) classe II sont également considérés
- ^ comme des marqueurs de différenciation : ceci a été démontré pour les cellules des lignées myéloïdes (Radka et Coll., 1986) ou du foie foetal (Natali et Coll., 1 984), mais leur fonction au cours de la différenciation cellulaire n'est pas encore établie. En outre, la présence des antigènes de classe II pourrait jouer un rôle au cours du phénomène de tumoπgénèse ^ ' (Festenstein et Garπdo, 1986).
L'expression des antigènes de classe II est constitutive sur les celiules B. Accolla et Coll. ( 1985) et De Préval et Coll. ( 1 985) ont montré que cette expression est sous le contrôle d'un facteur qui agit en trans au niveau génique. 35 Ln modèle de régulation des antigènes de classe II a été proposé par Boss et Strominger (1986). Dans ce modèle il existe au niveau genomique dans la région 5' flanquante du gène, régions successives contrôlant l'expression des antigènes d'histocompatibilité : un élément de régulation négative, 2β régions de contrôle positif, et une autre région de contrôle négatif. Des travaux plus récents sur la régulation au niveau genomique des antigènes H.L.A. classe II ont abouti à la mise en évidence d'un promoteur, appelé E dans la région 5' des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité, et de 2 protéines capables de se fixer sur le promoteur E^((Dorn et Coll., 1988 ; Dorn et Coll., 1989 ; Koch et Coll., 1989).
L'efficacité d'induction est différente suivant le système cellulaire concerné. En effet, certaines lignées cellulaires (lignée leucémique 562, fibroblastes embryonnaires...) sont difficilement ductibles, voire non inductibles, alors que d'autres lignées (fibroblastes adultes, cellules de carcinomes coliques...) expriment les antigènes H.L.A. classe II après induction par des doses faibles d'interféron gamma.
II a été montré dans le cadre de la présente invention que la difficulté à obtenir l'induction des antigènes H.L.A. classe II par l'interféron gamma sur des cellules dites réfractaires, était due à la production spontanée d'un inhibiteur endogène soluble.
C'est pourquoi la présente invention concerne une cytokine, qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, et qui - comporte tout ou partie de la séquence peptidique telle que décrite dans la figure 1, ainsi que les variants conservant l'activité biologique précédemment décrite, et
- est naturellement sécrétée par les cellules, ou
- est le produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène, chez les cellules procaryotes ou eucaryotes. Bien que le composé préféré selon la présente invention corresponde à la formule de la figure 1 , la présente invention concerne également les variants de cette cytokine notamment les variants obtenus par délétion notamment des extrémités N ou C terminales, les variants obtenus par substitution d'un ou plusieurs acides aminés et les variants d'addition obtenus en ajoutant un ou plusieurs acide(s) aminé(s) par exemple l'acide aminé méthionine à l'extrémité N-terminale lorsque la cytokine est exprimée dans une bactérie.
La présente invention concerne également les composés comportant les epitopes actifs de la cytokine reliés ou non entre eux par des séquences différentes, et qui sont également dénommés ci-après variants.
Selon la nature des cellules hôtes utilisées, la cytokine peut être giycosyiée, de façon à pouvoir subir les modifications post-traduction- nelles, intéressantes pour son activité biologique dans les cellules de mammifères, ou non giycosyiée.
La protéine naturelle présente outre les caractéristiques décrites précédemment un poids moléculaire de l'ordre de 19 000 sur gel de polyacrylamide SDS, et son activité inhibitrice est sensible à la chaleur et à la trypsine.
La protéine est précipitable dans une solution de sulfate d'ammonium à 50%.
La protéine peut être obtenue naturellement, comme produit de sécrétion dans le surnageant de culture de cellules. Elle peut également résulter de l'expression d'une séquence d'ADN exogène chez les cellules procaryotes ou plus avantageusement eucaryotes. Dans ce cas, la séquence d'ADN exogène peut être notamment une séquence d'ADN complémentaire ou bien une séquence d'ADN genomique.
Les séquences d'ADN selon l'invention comprennent les séquences qui permettent l'expression des nouvelles cytokines dans les cellules hôtes procaryotes et eucaryotes. Les séquences selon l'invention concernent plus précisément celles choisies parmi : a) la séquence d'ADN de la figure 1 ou ses brins complé¬ mentaires ; b) une séquence d'ADN qui s'hybride avec les séquences d'ADN de a) ou une partie de celles-ci ; et c) une séquence qui, compte-tenu de la dégénérescence du code génétique code pour une cytokine ayant la même séquence d'acides aminés que a) ou b). d) une séquence qui code pour un variant de ladite cytokine et qui conserve l'activité biologique précédemment décrite.
Ainsi la présente invention concerne également des séquences d'ADN codant pour l'expression de variants tels que décrits précédemment.
L'invention concerne également les séquences d'ADN s'hybridant . aux séquences d'ADN précédemment décrites, ou à l'un ou plusieurs de leurs fragments.
Les séquences selon l'invention peuvent être associées de façon covaiente ou non à une molécule marquée, notamment par un marquage isotopique (I 125 , etc.) ou par un marquage non isotopique (biotine, etc.) de façon à être facilement détectées.
La présente invention concerne également les cellules hôtes, eucaryotes ou procaryotes, ayant subi une transformation ou une transfection avec une séquence d'ADN telle que précédemment décrite, de façon à assurer l'expression dans la cellule hôte de ladite cytokine. L'invention concerne également un vecteur de clonage, bioiogiquement fonctionnel, comprenant une séquence d'ADN telle que précédemment décrite, ainsi que les cellules hôtes eucaryotes ou procaryotes, transformées ou transfectées, de façon stable, par un tel vecteur de clonage. Par vecteur de clonage bioiogiquement fonctionnel on entend désigner tout vecteur susceptible de permettre l'expression de la séquence en cause dans l'hôte transformé ou transfecte, ou bien susceptible de permettre l'intégration chromosomique de ladite séquence, et son expression sous le contrôle d'un promoteur homologue ou hétérologue. Ce type de vecteur est connu dans le domaine des ADN recombinants. Il peut s'agir d'un plasmide auto-réplicatif ou non, comportant une origine de replication efficace dans l'hôte, par exemple l'origine de replication de pBR322 pour E. coli ainsi que les éléments assurant l'expression de la séquence :
- promoteur,
- site de fixation des ribosomes,
- terminateur éventuel pour les levures par exemple, ainsi que divers éléments de contrôle.
Ces plasmides peuvent également comporter des gènes marqueurs assurant la sélection notamment, ou des séquences d'intégration comportant des séquences homologues assurant l'intégration par recombi¬ naison.
Il peut également s'agir de virus recombinés, par exemple des virus vecteurs du type vaccine. Les méthodes de transformation et de trans¬ fection sont connues et doivent être adaptées à l'hôte. Les cellules hôtes peuvent également avoir été modifiées par le biais de vecteurs afin d'excréter la protéine sous forme mature et/ou sous forme fusionnée.
La présente invention concerne également un procédé de préparation de la nouvelle protéine, caractérisé en ce que l'on purifie ladite cytokine à partir du surnageant de culture de cellules ou on fait exprimer la cytokine par des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes décrites précédemment, puis on isole la cytokine souhaitée.
Dans le cas où la cytokine est sécrétée naturellement par des cellules en culture, les cellules sont cultivées de préférence dans un milieu nutritif approprié dépourvu des protéines contaminatrices du sérum, ce dernier étant contenu dans un sac à dialyse perméable aux poids moléculaires inférieurs à 50 kD.
Ce procédé est également utilisable lorsque la cellule hôte est une cellule ayant été traitée par un vecteur tel que décrit précédemment, et dont la culture nécessite l'emploi de sérum, bien que l'on préfère utiliser des hôtes qui poussent sur un milieu simple.
Les cellules susceptibles de produire une cytokine selon l'invention sont assez nombreuses ; parmi celles-ci il faut citer la lignée K562 disponible auprès du National Institute of General Médical Sciences sous le n° GM05372D. Mais il est possible d'utiliser d'autres cellules notamment des carcinomes, ou des cellules d'hépatomes.
Lorsque l'on prépare les cytokines selon la présente invention par la technique des ADN recombinants, des lignées cellulaires telles que 562 et ses sous-clones n'exprimant plus lesdites cytokines sont particu¬ lièrement intéressantes comme cellules hôtes.
L'invention concerne également les anticorps, en particulier les anticorps monoclonaux, dirigés contre les cytokines selon l'invention. Ces anticorps peuvent être notamment utilisés dans le cadre d'un diagnostic de présence desdites protéines.
L'invention concerne également un Immuno-serum dirigé contre les cytokines précédemment décrites.
Les cytokines selon la présente invention, peuvent être utilisées à titre de principe actif dans une composition thérapeutique, dans l cas où l'on voudra augmenter l'effet antagoniste de ces protéines vis-à-vis de l'interféron gamma.
Ces compositions thérapeutiques sont surtout utilisables dans tous les états nécessitant une modulation de l'activité de l'interféron gamma. En particulier les compositions selon la présente invention sont utilisables dans le traitement et/ou la prévention de certains types de maladies auto-immunes, mais également lors de certains actes chirurgicaux tels que certaines transplantations.
Les compositions selon l'invention pourront comporter également d'autres monokynes et/ou cytokines. L'invention concerne également une composition thérapeutique contenant à titre de principe actif un anticorps ou un immuno-serum, dirigé contre ladite cytokine ou même des anti-sens correspondant aux séquences codantes, ceci notamment afin de limiter les quantités de cytokine circulantes. L'invention concerne également un kit de diagnostic permettant de détecter la protéine, et comportant au moins un anticorps dirigé contre celle-ci.
Les exemples et figures ci-après sont destinés à mettre en lumière d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention, sans pour autant en limiter la portée. Sur les figures ci-annexées : La figure 1 représente : la séquence nucléotidique de l'ADN complémen¬ taire correspondant à l'inhibiteur, et la séquence peptidique déduite.
La figure 2 représente : 1 ) à droite : les histogrammes obtenus sur un cytomètre de flux (E.C. Coulter) d'expression des antigènes HLA DR (b) et HLA classe I (c) sur les cellules K562 après induction par l'interféron gamma glycosyié, à 1000 Ul/ml. En (a) les contrôles négatifs sans interféron gamma, avec ou sans les anticorps spécifiques (les courbes se superposant).
2) à gauche : l'immunoprécipitation des chaînes alpha (32kD) et bêta (28kD) des antigènes HLA DR induits par l'interféron gamma sur les cellules K562 (A), le contrôle négatif (B).
La figure 3 représente : ies histogrammes obtenus sur un cytomètre de flux (E.C. Coulter), d'expression des antigènes HLA DR (b) et HLA classe I (d) sur les cellules ICIG-7 après induction par l'interféron gamma glycosyié, à l OOUI/ml. En (a) les contrôles négatifs sans interféron gamma avec ou sans les anticorps spécifiques (les courbes se superposent). Expression des antigènes HLA DR (c) et HLA classe I (e) sur les cellules ICIG-7 après induction par l'interféron gamma glycosyié, à l OOUI/ml et en présence du milieu conditionné des cellules K 562.
La figure représente les étapes de purification : en (A) culture des cellules, en (B) la courbe obtenue après colonne MonoQ, et en (C) la courbe obtenue après Superose 12. Les fractions actives se situent dans les parties hachurées. Exemple 1 ; Mise en évidence de la cytokine
1. Culture cellulaire
Les cellules 562, provenant de l'épanchement pleural d'un malade atteint d'une leucémie myéloîde chronique en crise blastique, sont cultivées dans du milieu RPMI- 16 0 complet. Les cellules sont placées dans une étuve à 37°C et 5% de CO... Elles sont ensemencées à la concentration de 250 000 cellules/ml toutes les 72h.
Les cellules ICIG-7, cellules fibroblastiques embryonnaires humaines normales, (ces cellules ont été mises en culture dans notre laboratoire à partir de poumon embyronnaire humain normal), sont cultivées dans une étuve humide à 37°C et 5% en CO-, dans du milieu MEM complet. Les cellules adhérentes parvenues à confluence (à 72h) sont détachées de leur support par l'action de la trypsine (0,25% dans du MEM) 2 à 3 minutes et remises en culture à une densité de 80000 cellules/cm2.
2. Milieu conditionné
Les cellules 562 sont cultivées dans les conditions décrites plus haut ; le milieu de culture est prélevé après 72h, centrifugé, filtré sur filtre 0,22 μm et supplémenté par 10% de SVF et 2mM de gluta ine.
3. Interféron gamma (IFN-Gamma)
L'interféron gamma recombinant non glycosyié, produit à partir de bactéries d'E. Coli, est obtenu auprès de la société Biogen (GENEVE, SUISSE) et son activité spécifique est de 2.10 Ul/rng. L'interféron gamma recombinant glycosyié (DEVOS et Coll,
1984), produit dans les cellules CHO de Hamster possède une activité spécifique de 1,3.10 8 Lil/ml. 4. Induction par l'interféron gamma
Les cellules ( 562 ou ICIG-7) sont cultivées dans des
5 macroplaques de culture à 6 puits (9cm2/puits) à une densité cellulaire de
5.10 celluies/puits/2ml, pendant 72h en présence de l OOOUI/ml d'IFN-
-gamma recombinant glycosyié (CHO) ou lOOOOUI/ml d'IFN-ga ma recombinant non glycosyié (E. Coli).
! 0 5. Test de l'activité biologique
Les cellules ICIG-7 sont induites dans les conditions décrites au paragraphe précédent mais, en présence de milieu conditionné ou des fractions de purification qui sont diluées dans du milieu MEM complet (voir purification).
L'expression des antigènes d'histocomptabilité à la surface cellulaire a été déterminée par la technique d'immunof luorescence indirecte. Les cellules sont lavées 3 fois en milieu de Hanks, puis resuspendues à la densité cellulaire de 5.10 celiules/ml. 200 μl de cette suspension sont distribués dans des puits d'une microplaque à fond rond (96 puits). La plaque est centrifugée 5 minutes à 800g, le surnageant est éliminé.
Les cellules sont ensuite incubées, 30 minutes à 4°C en chambre humide avec 20 μl d'anticorps à 10 μg/ml : Dl- 12 (Carrel et Coll, 1981 ), pour les antigènes HLA classe II et 10T2 (Immunotech, France) pour les antigènes HLA classe I.
Après trois lavages en milieu de Hanks par centrifugation 5 minutes à 800g et élimination du surnangeant, les cellules sont incubées 30 minutes à 4°C en chambre humide avec 20 μl d'anticorps de chèvre anti immunoglobulines de souris couplés à la fluorescéine (FITC) (Immunotech, France) à la dilution prescrite par le fabriquant. Les cellules sont lavées 3 fois en milieu de Hanks et analysées en cvtométrie de flux (ATC Qdam
5 Brucker France). L'analyse est réalisée sur 5000 ou 10000 cellules à la longueur d'onde de 488nm. Les résultats sont représentés sous forme d'histogrammes de distribution des cellules avec, en abscisse, l'intensité de fluorescence (échelle logarithmique) et, en ordonnée, le nombre de cellules. 5
Exemple II : Purification de la cytokine
1. Culture cellulaire
Les cellules K562 sont lavées 3 fois en RPMI-1640 (sans rouge de phénol) afin d'éliminer les traces de SVF, puis remises en suspension dans du RPMI- 1 40 (sans rouge de phénol) additionné de 2mM de glutamine. Un sac de dialyse de porosité 50Kd (Specτrapor 7 Spectrum) contenant 10ml de sérum de veau foetal pur est introduit dans un flacon de 5 culture contenant 90ml de RPMI- 1640 (sans rouge de phénol ni SVF) et
2,5.10 cellules. Pour la purification, 2 litres de culture ont été nécessaires.
Les cellules sont cultivées 72h à 37°C, le milieu est centrifugé à 800g 15 minutes ; le culot est éliminé et le surnageant est à nouveau centrifugé à 800g 15 minutes, puis filtré sur filtre 0,22 μm. Du PMSF est J rajouté au surnageant à la concentration finale de ImM.
2. Première étape de purification
Le surnageant est concentré 100 fois sur une membrane AMICON YM10, puis dialyse contre un grand volume de tampon Phosphate IOmM/pH 7,4 contenant du PMSF ImM. Une colonne échangeur d'anions (Mono Q Pharmacia SUEDE) est équilibrée par 10 ml de tampon Phosphate 10 mM/pH 7,4. L'échantillon est déposé sur la colonne puis élue grâce à 20 ml d'un gradient de NaCl de 0 à 0,25 M en Tampon 10 mM/pH 7,4. Des fractions de 0,5 ml sont collectées en sortie de colonne et analysées sur gel de polyacrylamide (gradient de 8 à 25%) en présence de SD5. Le gel est ensuite coloré au nitrate d'argent comme prescrit par le fabricant (Phast System, Pharmacia SUEDE). L'activité biologique de chaque fraction est ensuite testée, à plusieurs dilutions dans du milieu R PMI- 1640 complet, selon le protocole décrit précédemment.
5 3. Deuxième étape de purification
Les fractions contenant l'activité biologique sont réunies et concentrées 10 fois sur membrane AMICON YM 10, l'échantillon est déposé sur une colonne de filtration sur gel (Superose 12, Pharmacia SUEDE), puis 1 0 la filtration est effectué à l'aide d'un tampon phosphate 10 mM/NaCl 0, 15 M/pH 7,4. La colonne avait prélalablement été calibrée avec un ensemble de protéines de poids moléculaires connus (Kit Pharmacia) et équilibrée avec le tampon phosphate 10 mM/NaCl 0, 1 5 M/pH 7,4.
Des fractions de 0,25 ml sont collectées en sortie de colonnes ' 5 et analysées selon le protocole décrit précédemment.
Exemple III ; Production d'anticorps monoclonaux
1. Immunisation 0
Une souris Balb/C est immunisée selon le protocole suivant :
- une injection sous-cutanée de 0,5 ml d'une solution contenant 10 μg de la protéine purifiée dans 0,250 ml de PBS et 0,250 ml d'adjuvant de Freund complet. 5 - g jours et 21 jours plus tard une deuxième et une troisième injection sous cutanée d'une solution contenant 10 μg de la protéine purifiée dans 0,5 ml de PBS sans adjuvant de Freund.
- une dernière injection sous-cutanée est effectuée 5 jours avant la fusion cellulaire avec une solution contenant 10 μg de la protéine 0 purifiée dans 0,5 ml de PBS sans adjuvant de Freund.
2. Fusion
5 a) le jour précédant la fusion
- Le milieu HAT et la solution de fusion sont préparés.
- Les cellules de myélome de souris NSI sont remises en suspension dans du milieu RPM1- 1640 complet, à la concentration de 250000 cellules/ml.
- Les macrophages péritonéaux d'une souris Balb/C sont prélevés en lavant la cavité péritonéale à l'aide de 5 ml de NaCl 0, 15 M froid. Les macrophages sont centrifugés 10 minutes à 800g, puis remis en suspension dans du milieu HAT à la concentration de 5.10 cellules/ml et distribués dans 5 microplaques de culture (96 puits), à raison de 100 μl par puits. Les micropiaques sont ensuite placées dans un incubateur à C02 (37°C, 7% de C02)
b) le jour de la fusion
- Les cellules NSI sont lavées 4 fois dans du RPMI-1640 par centrifugation à 800g 10 minutes, puis le dernier culot est repris dans du RPMI-1640 à la concentration de 10 cellules/ml.
- La rate de la souris immunisée est prélevée, diiacérée dans du RPMI-1640, les cellules obtenues sont centrifugées 10 minutes à 800g et 7 le culot repris dans du RPMI- 1640 a la concentration de 10 cellules/ml.
- Hybridation : la fusion cellulaire est réalisée en mélangeant, dans un tube de 50 ml, 5 ml de cellules de rate (5.10 cellules), 3 ml de cellules NSI (3.10 cellules) et 42 ml de RPMI-1640. Le tube est centrifugé 10 minutes à 800g, et le culot est repris dans 1 ml de solution de fusion, ajoutée en I minute, en maintenant l'agitation constante. Puis le tube est immergé, 90 secondes, dans un bain-marie à 37°C en maintenant l'agitation.
La fusion est stoppée en introduisant 50 ml de milieu RPMI-1640 complet selon le protocole suivant :
1 ml en 30 secondes
3 ml en 30 secondes
16 ml en 1 minute
30 ml ensuite.
Le tube est laissé 5 minutes à température ambiante, centrifugé 10 minutes à 200g et le culot obtenu est lavé deux fois dans du milieu RPMI- 1640 complet, par centnf ugation 10 minutes à 200 g. Après chaque centrifugaτion les cellules sont reprises le plus doucement possible. Les cel lules sont resuspendues dans 50 ml de milieu HAT et distribuées, à raison de 100 μl/puits, dans les microplaques contenant les macrophages. Celles-ci sont replacées dans l'incubateur à CO^
- Préservation des clones : le milieu est renouvelé après 6 jours de culture, en aspirant le surnageant et en le remplaçant par du milieu frais. Au cours des deuxième et troisième semaines de culture, des colonies, constituées de cellules hybrides sélectionnées par le milieu, apparaissent dans certains puits.
Les surnageants de culture sont prélevés pour tester la présence d'anticorps et la réactivité de ceux-ci ; les clones intéressants sont prélevés et transférés dans des macroplaques de culture 24 puits contenant 2 ml de milieu RPMI- 1640 complet et 2.10 cellules spleniques provenant d'une souris Balb/C normale.
Il est nécessaire de sous-cloner pour s'assurer du maintien, au cours de la culture, d'un clone sécréteur. Le sous-clonage se fait par dilution limite ; pour cela, 200 cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu RPMI- 1640 complet, et la suspension est distribuée dans une microplaque de culture 96 puits, le milieu est renouvelé après 6 jours de culture, en aspirant le surnageant et en le remplaçant par du milieu frais. Au cours des deuxième et troisième semaines de culture, des colonies apparaissent dans certains puits et les surnageants de culture des clones sont testés.
3. Criblage des anticorps
a) ELISA
La fixation de la protéine purifiée, sur des microplaques microELlSA, est réalisée par incubation l h à 37°C, avec 100 μl par puits, d'une solution de la protéine à 0, 1 μg/ml dans un tampon carbonate/bicar- bonate 0,5 M pH 9,6. L'excès de protéines est éliminé par 5 lavages en tampon NaCI/Tween. Puis la plaque est saturée lh à 37°C à l'aide d'une solution de PBS/SAB (Sérum Albumine Bovine) 3%. Après 5 lavages en tampon NaCI/Tween, 100 μl/puits de surnageants de culture, des différents clones, préalablement dilués au 1 /2 dans du PBS/0,1% Tween 20 sont ajoutés et incubés pendant l h30 à 37°C.
Après 5 lavages en tampon NaCI/Tween, la révélation des immunoglobulines de souris fixées à la plaque, est effectuée par incubation avec 100 μl/puits d'anticorps de chèvre anti immunoglobulines de souris marqués à la peroxydase et dilués (à la dilution prescrite par le fabriquant) dans du PBS/0,05% Tween 20/3% SAB. Les plaques sont incubées ih30 à 37°C puis lavées 5 fois en tampon NaCI/Tween.
Le taux d'anticorps marqués à la peroxydase fixés à la plaque est évalué par détermination de l'activité peroxydase à l'aide d'une solution d'orthophénylène Diamine (OPD) dans un tampon OPD en présence d'eau oxygénée (H-O (40 mg d'OPD pour 100 ml de Tampon et 20 μi d'H^O-, 110 volumes sont ajoutés extemporanément).
200 μl de cette solution d'OPD sont introduits dans chaque puits, la coloration apparaît après quelques minutes à l'obscurité, la réaction est alors stoppée en ajoutant 50 μl/puits d'H-SO^ 0, 1N. La densité optique est mesurée à 492 nm sur un spectrophotomètre automatique pour lecture de plaques.
b) Blocage de l'activité inhibitrice
Les cellules ICIG-7 sont cultivées dans des macroplaques de culture à 6 puits (9 cmVpuits) à une densité cellulaire de 5.10 cellules/puits/2 ml, pendant 72h en présence de 1000 Ul/ml d'IFN-gamma recombinant (CHO), de la protéine purifiée et de surnageants d'hybridomes dilués au 1/2, dans du milieu MEM complet, contenant les anticorps.
c) immunoblot Le surnageant des cellules K562 est concentré 100 fois sur une membrane AMICON YM 10, puis dialyse contre un grand volume de tampon Phosphate l OmM/pH 7,4. 1 0 μl de cette solution sont dilués dans 40 μl de tampon d'échantillon Laemm . L'échantillon est porté à 100°C pour 2 minutes, puis déposé sur un gel de poiyacrylamide en gradient de 8 à 25% (Pharmacia), après migration et transf ert sur une membrane de Nitro- celiulose 0,45 μm (selon le protocole prescrit par le frabπquant, PhastSystem et PhastTransfer Pharmacia), la membrane est incubée 30 minutes à température ambiante dans une solution de PBS/SAB 3%. La nitrocellulose est découpée en bandes pour tester la réactivité des différents anticorps monoclonaux vis-à-vis de la molécule. Chaque bande est incubée toute la nuit à 4°C avec 2 ml de chaque surnageant de culture d'hybπdome dilue au 1 /2 dans une solution de PBS/0, 1 % Tween 20. Après 3 lavages de 5 minutes en tampon NaCI/Tween, les bandes sont incubées l h30, à température ambiante, avec des anticorps de lapin anti imunoglobulines de souris (Rabbit anti Mouse DAKO 24 1 2) dilués au 1/500 en tampon NaCI/Tween.
Après 4 lavages en tampon NaCI/Tween, les bandes sont incubées avec le Complexe APAAP (Sera Lab) dilué au 1 /400 en tampon NaCI/Tween, l h30 à température ambiante. Les bandes sont à nouveau lavées 4 fois en tampon NaCI/Tween. Les anticorps fixés sont révélés selon le protocole suivant : 400 μl de NBT (50 mg/ml) sont ajoutés à 60 ml de tampon NBT, après dissolution, 200 μl de BCIP (50 mg/ml) sont ajoutés à la solution. Les bandes sont laissées dans cette solution environ 5 minutes : puis lavées à l'eau et séchées sur un papier hatman 3MM Chr.
Exemple 4 ; Clonage d'un ADN complémentaire
1. Criblage d'une banque d'expression en lambda gt l l
a) Préparation des bactéries Y 1 090
Une colonie isolée est prélevée et incubée à 37°C sous agitation 3 à 4h dans 1 ml de LB, puis les bactéries sont transférées dans 50 ml de LB et incubées toute la nuit à 37°C sous agitation. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 1200g et le culot est repris dans 20 ml de tampon SM.
b) Titrage de la banque K562 Lambda gτl 1 (Clonτech)
300 μl de bactéries Y 1090 sont ajoutés à 100 μl de phages dilués au 1/500000, en tampon SM : le mélange phages bactéries est incubé 25 minutes à 37°C. 7,5 ml de gélose molle (Top Agar) sont ajoutés et immédiatement étalés sur une boîte de 150 mm contenant du LB/agar/Am- picilhne. La boîte est incubée à 42°C pour 4h, puis les plages de lyse sont comptées pour déterminer le titre de la banque.
c) Premier tour de criblage
6 tubes sont préparés pour le test ; 100 μl de suspension contenant 3.10 phages, provenant de la banque, dans du tampon SM/MgS04
10 mM, sont ajoutés à 300 μl de bactéries Y1090 en SM fraîchement préparées ; le mélange est incubé 25 minutes à 37°C. 7,5 ml de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de
150 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boîtes sont incubées à 42°C pendant 4h. 6 filtres de Nitrocellulose 0,45 μm sont trempés dans une solution d'IPTG lOmM et séchés quelques minutes avant d'être déposés sur les boîtes. Les boîtes sont alors incubées à 37°C pendant 2h. Les filtres sont prélevés puis incubés 30 minutes à température du laboratoire dans du tampon PBS/BSA 3%, (les boîtes sont conservées à 4°C pendant le reste du test).
Les filtres sont transférés dans un mélange de 4 anticorps, choisis parmi ceux produits, sous forme d'ascites et diluées au 1/500 dans du tampon NaCI/Tween. Les filtres sont incubés toute la nuit à 4°C, lavés 4 fois 5 minutes en tampon NaCI/Tween, puis incubés lh30 à la température du laboratoire, avec des anticorps de lapin anti immunoglobulines de souris (Rabbit anti Mouse DAKO Z 12) dilués au 1/500 en tampon NaCI/Tween. Après 4 lavages de 5 minutes en tampon NaCI/Tween, les filtres incubés avec le Complexe ΛP P (Sera Lab) dilué au 1 /400 en tampon NaCI/Tween, l h30 à température ambiante. Les filtres sont à nouveau lavés 4 fois en tampon NaCI/Tween. Les plages de lyse positiv es sont révélées selon la protocole suivant : 400 μl de NBT ( 50 mg/ml) sont ajoutés à 60 ml de tampon NBT, après dissolution, 200 μl de BC IP (50 mg/ml) sont ajoutés à la solution. Les f iltres sont laissés dans cette solution dans l'obscurité jusqu'à l'apparition d'une plage de lyse positive (environ 5 minutes) ; les filtres sont alors lav és à l'eau et séchés sur un papier whatman 3 MM Chr quelques minutes.
d) Deuxième tour de purification
Les plages de lyse positives au premier tour sont prélev ées à l'aide d'une pipette Pasteur retournée, chaque carotte ainsi prélevée est mise à diffuser toute la nuit dans 1 ml de tampon SM/MgSO . 10 m\1. Les phages sont titrés corne décrit pour le titrage de la banque.
Pour chaque plage de lyse, une suspension de 200 phages dans 1 00 μl de tampon SM/MgSO . 10 mM sont ajoutés à 100 μi de bactéries Y1090 fraîchement préparées en SM. Le mélange est incubé 25 minutes à 37°C. 3,5 mi de Top Agar sont ajoutes dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de 90 mm contenant du LB/Agar/Ampicilhne. Les boîtes sont incubées à 42°C et traitées comme au premier tour.
e) Troisième tour de purification
Les plages de lyse positives au deuxième tour sont prélev ées à l'aide d'une pipette Pasteur, chaque carotte ainsi prélevée est mise a diffuser toute la nuit dans 1 mi de tampon SM/MgSO . 10 m.M. Les phages sont titrés comme décrit pour le titrage de la banque. Pour chaque plage de lyse, une suspension de 50 phages dans 1 00 μl de tampon SM/MgSO , l ϋmM est ajoutée à 100 μl de bactéries Y 1090 fraîchement préparées en SM. Le I S
—.éiange est incubé 25 minutes à 37°C. 3,5 ml de Top Agar sont ajoutés cans chaque tube et immmédiatement étalés sur une boîte de 90 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boîtes sont incubées à 42°C et traitées comme au premier tour.
f) Amplification des phages sur boîte
L,
Une suspension de 5.10 phages a amplifier dans 100 μl de tampon SM/MgSO^ 10 m.M est ajoutée à 300 μl de bactéries Y 1090 fraîchement préparées en SM, le mélange est incubé 25 minutes à 37°C. 7,5 ml de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de 150 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boîtes sont incubées à 42°C pour 4h, puis toute la nuit à 4°C dans 10 ml de SM. Le produit de la diffusion est récupéré, et la boîte rincée avec 5 ml de tampon SM. Les phages sont titrés comme décrit pour le titrage de la banque.
g) Préparation de phages purifiés
Une colonie isolée de bactéries Y1090 est prélevée et incubée à 37°C sous agitation 3 à 4h dans l ml de LB, puis tranférées dans 50 ml de
LB et incubées toute la nuit à 37°C sous agitation. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 1200g et le culot est repris dans 20 ml de tampon S.M. La concentration des bactéries est estimée (une unité de D.O. à 600 mm correspond à 8.10 S bacteπes/ml). Les bactéries et les phages sont mis en présence à la
9 multiciplicité 20 : 12.10 bactéries dans 100 μl de SM/MgSO^ 10 mM sont incubés 25 minutes à 37°C, puis 400 ml de LB/MgSO. 10 mM ajoutés au mélange. La préparation est incubée 3 à 4h à 37°C sous agitation, la densité optique à 600 nm est mesurée toutes les heures ; elle doit atteindre 1.5 et redescendre à 0,5. Du chloroforme est ajouté (2 ml pour 400 ml).
Le mélange est incubé 20 minutes à 37°C sous agitation. Après une centnfugation de 30 minutes à 10000 RPM à 4°C, le surnageant est récupéré, de la DNAse et de la RNAse à la concentration finale de 2.5 μg/ml sont ajoutées. La préparation est incubée 45 minutes à 37°C sous agitation, 24 g de NaCl (pour 400 ml) et ^ g de PEG 6000 (pour 400 ml) sont successivement ajoutés. Après précipitation l h (ou toute la nuit) à 0°C, le mélange est centrifugé à 1 0000 RP.M 30 minutes à 4°C. Le surnageant est 5 éliminé, et le tube est égoutté sur un papier absorbant. Le culot est repris dans 1 ml de tampon SM, puis 10 μl de SDS 10% et 10 μl d'EDTA 0,5 M pH8 sont ajoutés. Le tube est incubé 1 5 minutes à 68°C.
Des extractions successives sont effectuées : 1 ) Chloroforme, 2) 2 extractions Phénol, 3) 2 extractions Phénol/Chloroforme, 4) Chloro- ' J forme, 5) 4 extractions à l'Ether. La dernière phase aqueuse est incubée 40 minutes à 65°C, puis précipitée par 1 volume d'Isopropanol froid et centrifugée 15 minutes à 4°C à 1 2000g. Le surnageant est éliminé et le culot lavé dans 500 μl d'Ethanol à 80% puis centrifugé 1 5 minutes à 4°C et à 12000g. Le culot est repris dans 50 μl de tampon TE pH8 et après mesure 1 de la DO à 260 nm, la concentration ajustée à 100 μg/ml.
h) Purification de l'insert à partir du phage
L'insert est récupéré après digestion par l'enzyme de J restriction EcoRI :
25 μl de phages purifiés (2,5 μg)
50 μl de tampon d'enzyme 1 0X (fourni par le fabriquant) 415 μl d'eau distillée MilliQ (Millipore) 10 μl d'enzyme EcoRI (9UI/μl) 5 Le mélange est incubé l h30 à 37°C, puis 30 minutes à 37°C après addition de 10 μl de RNAse ( 10 μg/ml). (La RNAse est portée à 100°C 20 minutes puis refroidie dans la glace avant utilisation).
La digestion est contrôlée sur gel d'agarose 1 % dans un tampon TAE IX ; pour cela 8 μl de la solution sont prélevés et 2 μl de 0 tampon de charge sont ajoutés. La migration s'effectue à 80 Volts dans une mini cuve d'éiectrophorèse en présence de tampon TAE I X et de BET à 0,5 μg/ml.
5 500 μl de la solution de digestion sont transférés dans un tube Eppendorf et 500 μl de Phénol/Chloroforme V/V sont ajoutés. Après agitation du tube et centnfugation 5 minutes à 12000g la phase aqueuse supérieure est transférée dans 2 nouveaux tubes pour être précipitée. 250 μl d'acétate d'Ammonium 4 M et 1 ml d'éthanol absolu froid sont ajoutés. Les tubes sont laissés 15 minutes dans la carboglace, réchauffés quelques secondes et centrifugés 15 minutes à 12000g à 4°C.
Le surnageant est éliminé soigneusement et le culot lavé dans 500 μl d'éthanol 80 % et centrifugé 1 5 minutes à 12000g à 4°C, puis séché. Le culot est repris dans 10 μl d'eau distillée.
2. Sous clonage de l'insert purifié dans le plasmide pBLSCR
a) Préparation du plasmide pBLSCR KS (Stratagene)
Le plasmide est digéré par EcoRI :
20 μl de plasmide (1 μg/μl)
10 μl de tampon d'enzyme I0X (fourni par le fabriquant)
60 μl d'eau distillée 10 μl d'EcoRI (9UI/μl)
Le mélange est incubé lh à 37°C, la digestion est vérifiée sur gel d'agarose 1% comme décrit précédemment.
100 μl de la solution de digestion sont transférés dans un tube Eppendorf et 100 μl de Phénol/Chloroforme V/V sont ajoutés. Après agitation du tube et centrifugation de 5 minutes à 12000g et à 4°C, la phase aqueuse supérieure est transférée dans un nouveau tube. 100 μl d'acétate d'Ammonium 4 M et 500 μl d'éthanol absolu froid sont ajoutés et le tube laissé 15 minutes dans la carbo glace, réchauffé quelques secondes et centrifugé 15 minutes à 12000g à 4°C. Le surnageant est éliminé soigneusement et le culot lavé dans
500 μl d'éthanol 80% et centrifugé 15 minutes à 12000g à 4°C, puis séché. Le culot est repris dans 10 μl d'eau distillée. Le plasmide est traité à la phosphatase : 10 μl plasmide
10 μl Tampon 10X
5 μl phosphatase O UI)
75 μl d'eau distillée Le tube est incubé l h30 à 37°C puis le plasmide précipité commme décrit précédemment le culot est repris dans 10 μl de tampon TE pHS. b) Purification du plasmide et de l'insert sur gel
Un gel d'agarose SeaPlaque GTG (FMC BioProducts) à 0,8% est réalisé dans un tampon TAE I X. 2 μl de tampon de charge sont ajoutés dans, soit 10 μl de plasmide, soit 10 μl d'ADN phagique. Les échantillons sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 20 volts dans un tampon TAE IX en présence de BET à 0,5 μg/ml final ; jusqu'à ce que le front de migration atteigne 10 cm.
Les bandes d'agarose correspondant au plasmide et à l'insert sont découpées sous UV et récupérées dans des tubes Eppendorf, les tubes sont chauffés à 65°C et le volume d'agarose fondu mesuré.
c) Ligation
Pour la ligation, un tube contenant : 2 μl de vecteur purifié (200 ng), 2 μl d'insert purifié (200 ng), 2 μl de tampon de ligase 10X (fourni par le fabriquant),
12 μl d'eau distillée, et 2 μl de T4 DNA ligase est incubé toute la nuit à 1 5°C. Un tube est également préparé en omettant l'insert.
d) Transformation calcique
1 ) Préparation des bactéries compétentes Une colonie isolée de bactéries HB 101 est prélevée et mise ne culture dans 50 ml de LB sous agitation à 37°C toute la nuit. La densité est mesurée à 600 nm et les bactéries diluées dans du LB pour obtenir 500 ml de bactéries à 0,1 de densité optique. Les bactéries sont remises en culture à 37°C sous agitation jusqu'à obtenir une densité optique de 0.6 ; puis refroidies le plus vite possible à 0°C et centrifugées, à 0°C, à 1500g 5 minutes ; le surnageant est éliminé et le culot repris dans 500 ml de Cad-, 50 mM froid et incubé l h à 0°C. Après centrifugation 5 minutes à 1200g à 0°C, le surnageant est éliminé et les bactéries resuspendues dans 50 ml de CaCI- 50 mM/20% glycérol. Les bactéries sont soit utilisées immédiate¬ ment, soit congelées à -80°C, en aliquoτes.
2) Transformation
Dans un tube stérile de 5 ml, pour chaque ligation, maintenu dans de la glace :
20 μl Tris HC1 10 m.M pH8 5 μl du produit de la ligation 10 μl de tampon TMC I 0X 65 μi de bactéries compétentes (fraîchement préparées ou congelées).
Les tubes sont incubés 15 minutes à 4°C, puis 2 minutes à 42°C et enfin 10 minutes à température ambiante. Dans chaque tube 1 ml de LB est ajouté et ceux-ci sont incubés lh à 37°C, 300 μl de cette suspension sont étalés sur une boîte de 90 nm contenant du LB/Agar/Ampi¬ cilline. Les boîtes sont incubées toute la nuit à 37°C.
e) Mini préparation de plasmide
Des colonies sont prélevées dans les boîtes à l'aide de cure-dents et déposées dans des tubes contenant 3 ml de LB, puis incubées toute la nuit à 37°C sous agitation. 1.2 ml de chaque suspension sont transférés dans des tubes Eppendorf, les bactéries sont récupérées par centrifugation de 15 minutes à 12000g (4°C). Le surnageant est él i mine, le culot re pris dans 1 00 μl de tampon TELT et 10 μl de lysozy me. Les tubes sont placés 1 minu te à 1 00°C et 5 minutes dans la glace, puis centri f ugés 10 minutes à température amDiante. Le culot est élim iné à l 'aide d'un cure-dent, puis 220 μl/tube d'éthanol absolu froid sont ajoutés et les tubes mis dans la carboglace pour 1 minutes. Les tubes sont réchauf fés puis centrifugés 1 5 minutes à 4°C et a 1 200g, les surnageants éliminés et les culots lavés avec 500 μl/tube d'éthanol 80% froid, centrifugés 1 0 m inutes à 1 2000g à 4°C. Les culots sont séchés puis chaque culot est repris dans 30 μl de Tris HC1 10 mM pH 7,5.
f) Vérification de la présence de l'insert
1 0 μl de mini préparation 2 μl de tampon d'enzy me EcoRI 6 μl d'eau distil lée
2 μl d'EcoRI 50UI/μi. Les tubes sont incubés l h à 37°C. 10 μl de chaque préparation digérée ou non sont déposés sur gel d'agarose, 1 % du tampon TAE I X. et la migration s'effectueà 80 Volts, dans du tampon TAE IX contenant du BET à 0,5 μg/ml final.
3. Séquençage de l'ADNc obtenu
a) Amplification et purification du plasmide
Un des plasmides contenant l'insert est amplifié ; pour cela 50 μl de bactéries contenant le plasmide intéressant sont incubées toute la nuit à 37 °C et sous agitation dans 10 ml de LB contenant de l'Ampicilline.
La densité optique est mesurée à 600 nm et les bactéries sont diluées dans du LB, contenant de l'Ampicilline, pour obtenir 500 ml de culture ayant une densité optique de 0, 1. Les bactéries sont incubées toute la nuit à 37°C et sous agitation dans un Erlen Meyer de 2 litres. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 4°C et à 1 2000g, et la purification du plasmide s'effectue, selon la notice du fabriquant, sur colonne Quiagen. b) Synthèse d'oligonucléotides
La synthèse d'oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique (Applied biosystem), l'oligonucléotide obtenu est fixé sur une colonne. Il est élue de cette colonne par 3 passages d'ammoniaque 25%, (300 μl, 300 μl et 400 μl) à l'aide d'une seringue "de 1 ml et récupéré à l'autre extrémité à l'aide d'une autre seringue. Chaque introduction d'ammoniaque est accompagnée d'une incubation de 15 minutes à température ambiante. L'oligonucléotide est récupéré dans un tube qui est placé à 65°C pour toute la nuit.
L'oligonucléotide est précipité dans 1 volume de sulfate d'ammonium 4 M et deux volumes et demi d'éthanol absolu froid, le tube est placé dans la carboglace pour 15 minutes, réchauffé, centrifugé 15 minutes à 12000g à 4°C. Le surnageant éliminé et le culot lavé dans 500 μl d'éthanol 80% froid. Le culot est séché et repris dans 500 μl d'eau distillée. Une mesure de la densité optique est réalisée à 260 nm et la concentration d'oligonucléotide est ajustée à 0,8 μM utilisable pour la séquence.
c) Séquençage
Le séquençage a été réalisé à l'aide du kit de séquençage T7 de Pharmacia, selon la technique décrite par le fabriquant. Le produit de la réaction subit une électrophorèse sur gel de polyacrylamide 8% et 0,4 mm d'épaisseur, en présence d'urée 46% et dans du tampon TBE IX. Deux dépôts de chaque réaction de séquence sont réalisés à 2h d'intervalle.
La séquence a été déterminée par plusieurs réactions. Les deux premières réactions de séquence ont été réalisées en utilisant deux oligonucléotides correspondant au site d'insertion de l'insert dans le plasmide. Les deux réactions de séquences suivantes, ont été réalisées en utilisant 2 oligonucléotides de 15mer correspondant aux dernières bases pouvant être lues sur l'insert. Les réactions de séquences suivantes ont été réalisées de la même façon, c'est-à-dire que 2 nouveaux oligonucléotides ont été choisis et synthétisés. Des réactions successives ont été réalisées jusqu'à obtention de la séquence complète. 4. Amplification de l'insert phagique par P.C.R.
L'amplification de l'insert par PCR a été réalisée sur un appareil Perkin Elmer Cetus.
De la solution stock contenant 3.10 phages/ml, 10 μl sont prélevés et 40 μl d'eau distillée ajoutés. L'échantillon est porté 2 minutes à 100°C et centrifugé à 12000g 10 minutes ; le surnageant est récupéré (- ADN pour PCR).
Réaction de PCR :
10 μl ADN pour PCR
10 μl de tampon d'enzyme Î OX
2 μl de dNTP's 124 μM
1 μl Oligonucléotides 1 (50pM)
1 μl Oligonucléotides 2 (50pM)
1 μl Oligonucléotides 1 (ou 2) marqués à l'ATP P32 (3pM) 0,5 μl d'enzyme Taq (0,5UI/μl) 75,5 μl d'eau distillée. 30 cyles :
Dénaturation : 30 secondes à 94°C Fixation des oligonucléotides : 40 secondes à 55°C Extension : 40 secondes à 72°C. L'extension du dernier cycle dure 10 minutes.
5. Séquençage après P.C.R.
Le produit de la PCR est utilisé pour le séquençage selon la technique de Maxam et Gilbert sur des morceaux de papier (pour séquence Maxam et Gilbert Amersham RPN 1500).
Réaction A + G : le papier est incubé 10 minutes à température ambiante dans 1 ml d'acide formique aqueux 66%.
Réaction C : le papier est incubé 10 minutes à température ambiante dans 1 ml d'hydroxylamine/hydrochloryde 275 mg/ml pH 6. Réaction G : le papier est incubé 5 minutes à température ambiante dans 1 ml d'ammonium formate 50 mM pH 3,5 contenant 7 μl de DMS.
Réaction T + C : le papier est incubé deux fois 10 minutes à température ambiante dans deux fois l ml de permanganate de potassium 2 mg/ml.
Chaque fragment est lavé 3 fois 30 secondes dans l'eau distillée et une fois 30 secondes dans l'éthanol 96%, le papier est séché à l'air 2 minutes entre chaque lavage. Les fragments sont ensuite transférés dans des tubes Eppendorf contenant 300 μl de pipéridine ; après 30 minutes à 90°C les fragments sont éliminés et les tubes mis à sécher.
Les culots sont repris dans 40 μl d'eau distillée par tube puis séchés. Cette opération est renouvelée 3 fois. Chaque culot est repris dans
15 μl de tampon de charge pour arrêt de séquence (kit Pharmacia) et les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide 8% comme décrit précédemment.
6. Sous clonage dans le vecteur CDM8 de l'insert purifié
L'insert purifié à partir du phage est traité par l'enzyme de
Kleenow :
20 μl d'insert (200 ng) 2 μl de dATP (0,5 mM) 2 μl de dCTP (0,5 mM) 2 μl de dGTP (0.5 mM)
2 μl de dTTP (0,5 mM) 4 μl de tampon d'enzyme 10X 6 μl d'eau distillée 2 μl d'enzyme de Kleenow (2UI/μl) Le tube est incubé 30 minutes à 37°C, puis l'ADN est précipité en ajoutant un volume d'acétate d'ammonium 4 M et 2,5 volumes d'éthanol absolu froid ; le tube est placé 15 minutes dans la carboglace, réchauffé, centrifugé à 12000g 15 minutes à 4°C. Après élimination du surnageant, le culot est lavé dans 500 μl d'éthanol 80% froid, centrifugé 15 m inutes à 12000g à 4°C, séché et repris dans 10 μl d'eau distillée.
Ligation : 5 μl de cette solution
3 μi d'adaptateurs BstX l (3 μg)
1 μl de tampon d'enzyme 10X
1 μl de T4 DNA ligase (2,5UI/μl).
Le tube est incubé à 1 5°C toute la nuit, les adaptateurs non és sont éliminés sur une colonne de sephadex S400 de Pharmacia selon le protocole décrit par le fabriquant. L'ADN récupéré est précipité comme décrit précédemment et le culot est repris dans 21 μl d'eau distillée.
Puis 4 μl de vecteur CDM8 coupé par BstXl (In vitrogen 0,2 μg/μl), 3 μl de tampon de ligation (fourni par le fabriquant), 2 μl de T4 DNA ligase (2,5 Ul/μl) sont ajoutés et le tube incubé à 1 5°C toute la nuit. Le tube peut-être conservé à -20°C.
7. Vérification du sens d'insertion de l'insert
a) Préparation de bactéries compétentes
Une colonie isolée de bactéries est prélevée et mise en culture dans 50 ml de LB sous agitation à 37°C toute la nuit. La densité est mesurée à 600 nm diluées dans du LB pour obtenir 500 ml de bactéries à o, l densité optique. Les bactéries sont remises en culture à 37°C sous agitation jusqu'à obtenir une densité optique de 0,4 à 0,5 à 600 nm ; les bactéries sont refroidies le plus vite possible à 0°C et laissées 15 minutes à 0°C.
Les bactéries sont centrifugées à 0°C à 1200g 20 minutes, le surnageant est éliminé et le culot repris dans 1 /2 volume initial d'eau distillée froide, l'opération est renouvelée 4 fois. Le surnageant est élimine et le culot est repris dans 1 volume de glycérol 30% ; les bactéries sont soit utilisées immédiatement soit congelées à -80°C, en aliquotes. b) Electroporaτion
2 μl du produit de ligation et 50 μl de bactéries compétentes sont mélangés dans une cuvette d'electroporation 0,2 cm, l'appareil est réglé sur 2470 mV, 400 Ohms, 25 μF.
Immédiatement après électroporation les bactéries sont reprises dans l ml de milieu SOC puis incubées lh sous agitation à 37°C. Les bactéries sont étalées à raison de 10 μl, 100 μl ou 500 μl sur 3 boîtes de LB/Agar/Ampicilline/Tétracycline. Les boîtes sont incubées toute la nuit à 37°C. Des mini préparations sont réalisées pour vérifier l'insertion comme décrit précédemment.
A partir de colonies possédant l'insert, des préparations de plasmides plus importantes sont réalisées comme décrit précédemment. Puis un séquençage est effectué pour déterminer le sens d'insertion.
8. Transformation de cellules COS
Un des plasmides, ayant le sens d'insertion permettant la synthèse de la protéine, est utilisé pour l'électrophorèse des cellules COS. Les cellules COS sont ensemencées dans du milieu DMEM complet et sont recueillies au bout de 24h (50 à 70% de confluence). Les celluies sont lavées deux fois en PBS froid par centrifugation à 800g 5 minutes et resuspendues à 10 cellules/ml dans du tampon d'electroporation.
0,8 ml de suspension cellulaire et 60 μg de plasmide/insert sont mélangés dans une cuvette d'electroporation 0,4 cm. La cuvette est placée dans la glace 10 minutes, l'appareil est réglé sur 380 mV, 25 μF. Immédiatement après électroporation, la cuvette est placée dans la glace 10 minutes, puis les cellules remises en culture dans un flacon de 75cm2. Le surnageant est prélevé 48h plus tard pour être testé.
9. Vérification de l'activité de la protéine recombinante
Le surnageant des cellules COS, électroporées, est utilisé dans un test d'induction des celluies ICIG7, le surnageant est utilisé à différentes dilutions dans du milieu MEM complet, et le test est réalisé comme décrit précédemment. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Cytokine qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, et qui
- comporte tout ou partie de la séquence peptidique telle que décrite dans la figure 1, ainsi que ses variants conservant l'activité biologique précédemment décrite, et
- est naturellement sécrétée par les cellules, ou
- est le produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène dans des cellules procaryotes ou eucaryotes.
2/ Cytokine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire déterminé en gel de polyacrylamide SDS, d'environ 19 000. 3/ Cytokine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que elle est obtenue par expression d'une séquence d'ADN exogène dans une cellule eucaryote.
4/ Séquence d'ADN qui code lors de l'expression dans une cellule hôte, pour une cytokine, qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, ladite séquence étant choisie parmi : a) la séquence d'ADN de la figure 1 ou ses brins complé¬ mentaires ; b) une séquence d'ADN qui s'hybride avec les séquences d'ADN de a) ou une partie de celles-ci ; et c) une séquence qui, compte-tenu de la dégénérescence du code génétique code pour une cytokine ayant la même séquence d'acides aminés que a) ou b). d) une séquence qui code pour un variant de ladite cytokine et qui conserve l'activité biologique précédemment décrite.
5/ Séquence d'ADN selon la revendication 4, codant pour l'expression de tout ou partie de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ainsi que ses analogues et/ou dérivés, qui conservent l'activité précédemment décrite de ladite cytokine. 6/ Séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5, caractérisée en ce qu'elle est associée de façon covalente à une molécule marquée détectable.
7/ Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marquage est un marquage isotopique.
8/ Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marquage est un marquage non isotopique.
9/ Cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée ou ayant subi une transformation ou une transfection avec une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5, de façon à assurer l'expression dans la cellule hôte de ladite cytokine.
10/ Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote.
11 / Vecteur de clonage bioiogiquement fonctionnel compre- nant une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5.
12/ Cellules hôtes transformées ou transfectées de façon stable par un vecteur de clonage selon la revendication 1 1.
13/ Procédé de préparation de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on purifie ladite cytokine à partir du surnageant de culture de cellules.
14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif approprié, dépourvu des protéines contaminatrices du sérum.
15/ Procédé selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que le sérum est contenu dans un sac à dialyse perméable aux poids moléculaires inférieurs à 50 kD.
16/ Procédé de préparation d'une cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on met en culture dans un milieu approprié une cellule hôte selon l'une des revendications 9 et 10 ou 12 de façon à ce qu'elle exprime ladite cytokine et en ce que l'on isole la cytokine souhaitée. 17/ Anticorps monoclonaux dirigés contre la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3.
18/ Immuno-sérum dirigé contre la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenue par le procédé selon l'une des revendi¬ cations 13 à 16.
19/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif une cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenue par le procédé selon l'une des revendications 13 à 16.
20/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 8.
21/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif un anticorps selon la revendication 17, ou un immuno-serum selon la revendication 18.
22/ Kit de diagnostic de présence de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un anticorps selon la revendication 17.
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